KR100458009B1 - 감자 특이 ｄｎａ를 증폭하는 단일 ｐｃｒ 프라이머 및이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 ｐｃｒ 판별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머 및 이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 PCR (duplex PCR) 판별방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 변형된 감자를 판별하기 위하여, 다양한 감자 품종의 RAPD 밴드 패턴으로부터 모든 감자 품종에서 동일한 크기의 DNA 밴드를 증폭하는 한 개의 올리고머 프라이머를 합성·개발한 다음, 이 프라이머와 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머중 어느 하나의 프라이머를 혼합하여 이중 PCR을 실시함으로써 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터가 포함된 운반체로 형질전환된 유전자 변형 감자를 특이적으로 용이하게 판별할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머 및 이를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 PCR (duplex PCR) 판별방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전자 변형된 감자를 판별하기 위하여, 다양한 감자 품종의 RAPD 밴드 패턴으로부터 모든 감자 품종에서 동일한 크기의 DNA 밴드를 증폭하는 한 개의 올리고머 프라이머를 합성·개발한 다음, 이 프라이머와 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머중 어느 하나의 프라이머를 혼합하여 이중 PCR을 실시함으로써 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터가 포함된 운반체로 형질전환된 유전자 변형 감자를 특이적으로 용이하게 판별할 수 있는 방법에 관한 것이다.
인간을 비롯한 지구상의 다양한 동식물들의 DNA 구조와 생화학적 기능 및 메커니즘, DNA 합성의 메커니즘이 밝혀짐에 따라, 특정 기능을 수행하는 단백질을 생산하는 유용한 DNA를 다양한 품종의 식물체에 도입함으로써 형질이 도입된 형질전환 식물체 (transgenic plant)를 개발하기 위한 다양한 시도가 전세계적으로 행해지고 있다.
유전자 변형 농산물 (Genetically Modified Organism: GMO)이란 일반적으로 작물의 생산량 증대 또는 유통 가공상의 편의를 위하여 유용한 외래 유전자를 유전공학적 기술을 이용하여 분리한 다음 작물의 유전자 중에 도입함으로써, 기존의 번식방법 또는 고유의 품종에서는 나타날 수 없는 형질 또는 유전적 특성을 나타내도록 유전자를 인위적으로 조작하여 개발한 농작물을 의미한다. 생물체에 외래 유전자가 도입되면, 원래는 존재하지 않던 단백질을 합성할 수 있게 되고, 이러한 단백질이 특정의 기능을 수행하게 되는데, 통상적으로는 제초제 저항성, 병·해충 저항성, 저장성 향상, 고영양분 성분 함유 등의 특성을 확보하고자 개발되고 있다.
처음 유전자 변형 농산물이 개발되었을 때에는 질병 및 병해충에 강하여 농작물의 생산량을 증대시킬 수 있다는 장점 때문에 미래의 식량난을 해결할 수 있는 방법으로 각광을 받았다. 이에 따라, 다양한 유전자 변형 작물이 개발되었는데, 1994년에 미국에서 최초로 유전자 변형 토마토가 개발되어 유통된 이후로, 콩, 옥수수, 벼, 감자, 토마토 등 50여 종의 GMO 품목이 유통되고 있으며, 우리나라에서도 콩, 벼, 보리, 고추 등의 GMO가 유통되고 있는 실정이다.
그러나, 최근 GMO 작물의 재배 면적이 급속히 증가하고 GMO 식품에 대한 위해성이 보고되면서 GMO식품의 안전성에 대한 사회적 논란이 촉발되고 있다. 특히, 유전자 조작 식품 속의 항생제 내성 유전자 및 조작된 DMA가 사람에게 전이될 수 있다는 가능성이 제시되면서, 유전자 변형된 대상 작물의 유해성은 아직 검증된 바없으나 GMO 여부를 상품에 표기하여 소비자로 하여금 구매 여부를 선택하게 하는 단계에 이르게 되었다.
최근까지 개발된 GMO 판별 기술은 가장 많은 유전자 변형 품종의 재배 면적을 가진 옥수수와 콩을 대상으로 한 것이 대부분이다. 이에, 우리나라에서도 2001년 3월 1일자로 콩, 옥수수, 콩나물 등에 대하여 유전자 변형 농산물 여부를 표기하도록 의무화하였다.
감자의 경우에는 주요 감자 수입국인 미국, 캐나다, 호주 등이 GMO 감자의 주요 재배국이고, 국내에서 다량 소비되는 품종인 Russet Burbank, Atlantic 등이 유전자 조작되어 1996년 New Leaf 품종으로 재배 및 시판이 이루어진 이후, 그 재배 면적이 매년 증가하고 있으며, 이에 따라 매년 일정량 이상이 가공품으로 국내에 수입될 가능성이 매우 높은 실정이다. 이에, 정부에서는 2002년 3월 1일부터 GMO 농산물 표시 대상 작물에 감자를 포함시켜 이를 의무화하였으나, 현재 일부 국내외 관련 회사에서 제조 판매하는 판별 기술은 주로 콩과 옥수수를 대상으로 한 것으로, 다양한 감자 품종으로부터 유전자 변형 감자를 판별할 수 있는 기술의 개발이 시급한 실정이다.
현재 이용 가능한 검사방법으로는 외래 유전자 및 유전자 운반체의 DNA를 분석하는 PCR (Polymerase Chain Reaction)과 단백질을 분석하는 ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)가 있다. 그러나, 단백질을 검출하는 ELISA법은 검출 감도가 PCR법에 비해 떨어지고, 열처리 등으로 단백질이 변성될 수 있는 식품류에서의 검출에 있어서는 한계가 있어 주로 형질전환에 이용된 운반체에 특이적인 유전자 프라이머를 이용한 다중 PCR (multiplex PCR) 방법이 사용되고 있다.
이에, 국내특허공개 제 2001-100456호에는 35S 프로모터의 특정부위와 하이브리드화할 수 있는 검사용 프라이머를 사용한 PCR법에 의하여 GMO의 검정을 실시하는 과정이 공지되어 있다. 그러나, 상기와 같은 방법은 높은 아닐링 온도에서 PCR을 수행함으로써 비특이적 반응이 억제되는 장점이 있으나, 작물별 특이성이 없고 실험시 오염에 의한 밴드의 출현에 대한 오류의 보정 기능이 전혀 없다는 단점이 있다.
또한, 일본의 TaKaRa사에서는 Round-Up-Ready soybean screening Kit (TaKaRa RR201A), GM Maize screening Kit (TaKaRa RR202A)를 이용한 PCR 방법을 개발한 바 있으나, 이는 옥수수 및 콩의 유전자 변형 여부를 판별하기 위한 이중 PCR 방법에 관한 것으로 감자를 대상으로 한 방법이 아니다. 또한, 이 방법은 PCR 반응의 internal control로 각각의 해당 작물이 가지는 특이적 유전자를 증폭하기 위한 한 쌍, 즉 2종의 프라이머를 사용하여야 하는데 프라이머를 2종 사용함에 따라 비특이적 증폭 DNA 산물이 증가한다는 단점이 있고, 작물별 특이 유전자를 이용하므로 개발과정이 어렵다는 단점이 있다.
상기와 같이 최근 유전자 변형 여부의 표기가 의무화된 감자의 유전자 변형 여부를 판별하기 위한 기술에 대한 필요성이 증가함에 따라, 본 발명자들은 다양한 감자 품종의 genetic DNA에 대하여 생물종의 변이판별용 범용성 RAPD 프라이머인 UniPrimer를 이용한 PCR을 실시함으로써 모든 감자 품종에서 동일한 크기의 DNA 밴드를 증폭하는 프라이머 URP-4를 확인한 다음 이를 이용하여 감자 특이적인 DNA 밴드를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 합성 및 개발하기에 이르렀다. 또한, 일반적으로 외래 유전자를 운반하는 유전자 운반체 중에 필수적으로 포함되어 있는 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하기 위한 프라이머중 어느 하나의 프라이머를 상기 개발한 단일 PCR 프라이머와 혼합하여 이중 PCR (duplex PCR)을 실시함으로써, CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터가 포함된 운반체로 형질전환된 유전자 변형 감자를 특이적으로 용이하게 판별할 수 있음을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 모든 감자 품종에서 동일한 크기의 감자 특이 DNA 밴드를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 합성 및 개발하여 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머와 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머 중 너느 하나의 프라이머를 혼합하여 이중 PCR을 실시함으로써 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터가 포함된 운반체로 형질전환된 유전자 변형 감자를 특이적으로 용이하게 판별할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
도 1은 감자 품종의 판별을 위한 DNA 마커를 선발하기 위하여 감자의 genetic DNA에 대하여 범용성 RAPD 프라이머인 UniPrimer를 이용하여 RAPD을 실시한 결과이다.
도 2는 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 합성하기 위하여 UniPrimer의 3' 말단에 G를 첨가 결합시켜 제조한 합성 프라이머를 이용하여 주요 감자 품종에 대한 PCR 증폭을 실시한 결과이다.
도 3은 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 합성하기 위하여 UniPrimer의 3' 말단에 T를 첨가 결합시켜 제조한 합성 프라이머를 이용하여 주요 감자 품종에 대한 PCR 증폭을 실시한 결과이다.
도 4는 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 합성하기 위하여 UniPrimer의 3' 말단에 A를 첨가 결합시켜 제조한 합성 프라이머를 이용하여 주요 감자 품종에 대한 PCR 증폭을 실시한 결과이다.
도 5는 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머와 유전자 운반체에 포함되어 있는 CaMV 35S 프로모터에 특이적인 프라이머를 이용하여 유전자 변형된 감자와 일반감자를 판별한 이중 PCR 결과이다.
도 6은 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머와 유전자 운반체에 포함되어 있는 NOS 터미네이터에 특이적인 프라이머를 이용하여 유전자 변형된 감자와 일반감자를 판별한 이중 PCR 결과이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다양한 감자 품종의 RAPD 밴드 패턴으로부터 모든 감자 품종에서 동일한 크기의 DNA 밴드를 증폭하는 한 개의 올리고머 프라이머를 합성·개발한 다음, 이 프라이머와 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머 중 어느 하나의 프라이머를 혼합하여이중 PCR (duplex PCR)을 실시함으로써 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터가 포함된 운반체로 형질전환된 유전자 변형 감자를 특이적으로 용이하게 판별할 수 있는 방법을 제공함을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 감자 특이적인 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머는 하기와 같은 특징을 갖는다.
단일 PCR 프라이머의 염기서열 : 5'-GACTCGATAACAGGCTCCA-3' (19mer)
(SEQ. ID. NO. 2)
Tm : 49.5 ℃
Purine : Pyrimidine = 9 : 10 (GC content 52.6 %)
감자 특이 DNA를 증폭하는 상기와 같은 단일 PCR 프라이머는 RAPD 프라이머인 UniPrimer를 이용한 PCR을 통하여, 모든 감자 품종에서 같은 크기의 DNA를 증폭하는 프라이머로 밝혀진 URP-4의 3' 말단에 염기 A를 결합시켜 개발한 것이다.
본 발명에 따른 상기 단일 PCR 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 증폭되는 감자 특이 DNA는 약 553bp 크기의 유전자 부위로, -TC- 또는 -CT-의 서열구조가 많은 감자의 repeatative genomic DNA의 일부 서열이다 (SEQ. ID. NO. 1).
본 발명에 따른 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별방법에서는 유전자 변형 감자를 스크리닝하기 위하여 작물의 형질전환시 도입 유전자의 정확한 발현을 위하여 필수적인 프로모터들 중에서 일반적으로 가장 많이 사용되고 있는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (Cauliflower Mosaic Virus)의 35S 프로모터 부위 (CaMV 35Spromoter)를 증폭하는 프라이머를 이용하여 유전자 변형 감자를 판별하는 것을 특징으로 한다. CaMV 35S 프로모터는 특히 쌍자엽 작물에서 매우 높은 수준의 발현을 유도하는 프로모터로 알려져 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별 방법에서는 유전자 변형 감자를 스크리닝하기 위하여 작물의 형질전환시 도입 유전자 발현의 종결을 의미하는 터미네이터로 일반적으로 가장 많이 사용되고 있는 아그로박테리움의 NOS 터미네이터 (NOS terminator) 유전자 부위를 증폭하는 프라이머를 이용하여 유전자 변형 감자를 판별하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 CaMV 35S 프로모터 및 NOS 터미네이터 부위를 증폭하는 프라이머는 통상적으로 본 기술분야에 널리 알려져 있는 것들을 아무런 제한 없이 사용할 수 있으나, 하기 서열의 프라이머를 이용하는 것이 바람직하다.
〔CaMV 35S 프로모터〕
Sense 방향 : 5'-GCTCCTACAAATGCCATCA-3'
Anti-sense 방향 : 5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3'
〔NOS 터미네이터〕
Sense 방향 : 5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3'
Anti-sense 방향 : 5'-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3'
본 발명에 따른 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별 방법에서는 유전자 변형 감자를 스크리닝하기 위하여 감자 특이적인 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머와; CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머 중 어느하나의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하는 것임을 특징으로 하는 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별 방법이다. 그러나, 상기와 같은 이중 PCR 판별 방법에 제한되지 않으며, 본 발명에 따른 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 이용한 방법이라면 모두 이용가능하다. 또한, 상기와 같은 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 이외에 유전자 변형의 지표가 될 수 있는 기타 영역에 대한 프라이머를 이용하여 본 발명을 실시할 수 있다. 이는 본 기술분야에 널리 알려진 통상의 기술을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별방법에 따른 PCR은 전-변성 (pre-denaturation) (94 ℃, 3분) 1회, 증폭 (amplification) (94 ℃/20초→54 ℃/40초, 72 ℃/1분) 40회 증폭, 총 연장 (full extension) (72 ℃/5분) 1회로 PCR을 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니고, 주지한 본 발명 기술분야로부터 다양한 변형이 가능할 것이다.
유전자 변형 콩 또는 옥수수를 판별하는 PCR 키트를 이용한 기존의 이중 PCR 방법에서는 작물 특이 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 한 쌍을 이용하는 반면에, 본 발명에 따른 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별방법은 감자 특이적 DNA를 증폭하기 위해 하나의 프라이머만을 사용해도 동일한 결과를 얻을 수 있어 간편하고 편리한 장점이 있다.
또한, 운반체 특이 유전자만을 증폭하여 검정하는 기존의 방법은 작물에 대한 특이성이 없어 결과의 신빙성이 적은 단점이 있고, 다중 프라이머를 이용한 기존의 유전자 변형 콩 또는 옥수수를 검정하는 기술에서는 2쌍 4개의 프라이머를 이용하는 단점이 있는 반면, 본 발명에 따른 감자 특이 DNA를 증폭하는 단일 PCR 프라이머를 이용한 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별 방법은 유전자 운반체 중에 포함되어 있는 두 개의 프라이머 중 어느 하나와 한 개의 올리고머 프라이머를 이용함으로써 비용 절감과 비특이적 증폭 산물 생성 가능성을 줄일 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시 예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리 범위가 이들에 한정하는 것은 아니고, 본 분야의 통상의 당업자들에 의한 변형 또한 본 발명의 권리범위에 속한다 할 것이다.
〔실시예 1〕RAPD 프라이머를 이용한 감자 특이 DNA 증폭 단편의 획득
모든 감자 품종에 대하여 공통적인 감자 특이 DNA를 획득하기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.
Teresa 등의 방법〔M.F., C. Julapark, and S.D. Tanksley. (1995). Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous palnts. PMBR. 13:207-209〕에 따라 감자 품종 수미, 대지, 남작, 대서, 조풍, 남서, 자심, Desiree, Spunta, Russet Burbank, Snowden 및 Kenebec (농촌진흥청 고령지농업시험장) 등의 DNA를 분리하였다. 이 DNA를 이용하여 서 등의 방법〔Seo.H.W., Yi, J.Y., Cho, H.M., Park, Y.E. and Oh, S.E. (2001) Discrimination of Potato Varieties by Random Amplified Polymorphic DNA Analysis. Kor. J. Hort. Sci.& technol. 19(1):29-32〕에 따라 RAPD를 수행하였다. PCR 기기로는 GeneAmp PCR System (Applied Biosystem, USA)을 이용하였으며, PCR 반응액으로는 AccuPower PCR PreMix (Bioneer K2010)을 이용하였다.
Taq DNA 폴리머라제 1 unit, dNTPs 250 uM, Tris-HCl (pH 8.3) 50 mM, KCl 40 mM, MgCl21.5 mM, 감자 Template DNA 200 ng이상에 프라이머를 100 nmol 첨가하여 총 20 ㎕의 부피로 맞춘 반응액을 변성 온도 (denaturation temperature) 94 ℃에서 5분동안 1 사이클, 변성 온도 94 ℃에서 1분, 어닐링 온도(annealing temperature) 55 ℃에서 1분, 연장 온도 (elongation temperature) 72 ℃에서 2분인 사이클을 40회 반복하여 DNA를 증폭시키고, 마지막으로 최종 연장 온도 72 ℃에서 5분동안 1 사이클을 수행하였으며, 이를 4 ℃에서 저장하였다. 이때, PCR 프라이머로는 생물종의 변이판별용 범용성 RAPD 프라이머인 UniPrimer (서린과학, ss4101)를 이용하였다.
상기와 같은 PCR 증폭산물로 전기영동을 실시하였다. Mupid-2 (Cosmo Bio, Japan)를 이용하여 1.5% 아가로스 (D-1, Hispanlab, Spain)에 1% TBE 완충액을 이용하여 100V 하에서 약 30분간 전개하였다. 전개가 끝난 DNA를 EtBr (sigma E8751, USA)로 염색한 다음 UV transilluminator 상에서 확인한 다음 폴라로이드 필름(Sigma F4638, USA)에 기록하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
감자품종 판별을 위한 DNA 마커를 선발하는 상기 과정을 통하여, 생물종의 변이판별용 범용성 RAPD 프라이머인 UniPrimer 중 URP-4 프라이머가 모든 감자 품종으로부터 같은 크기의 DNA를 증폭한다는 것을 알 수 있다.
〔실시예 2〕모든 감자 품종에 대하여 동일한 크기의 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머의 합성
상기 실시예 1에서 확인된 바와 같이, 모든 감자 품종에서 같은 크기의 DNA를 증폭하는 프라이머 URP-4를 이용하여 모든 감자 품종에서 확인되는 동일 크기의 DNA 증폭산물 (목표 DNA 밴드)을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 합성하기 위하여, 상기 프라이머의 3'쪽 말단에 염기 G, T, A를 각각 결합시키되, 특히 A를 결합시키는 경우에는 5'쪽 말단의 AG를 제거하여 통상의 프라이머 제조방법에 따라 합성 프라이머를 제작한 후 OPC 컬럼으로 정제하였다 (주식회사 바이오니아에 제작 의뢰).
그 서열은 각각 다음과 같다.
5'-GACTCGATAACAGGGTCCA-3'(rAG/URP4+A)(SEQ. ID. NO. 2)
5'-AGGACTCGATAACAGGGTCCT-3'(URP4+T)(SEQ. ID. NO. 3)
5'-AGGACTCGATAACAGGGTCCG-3'(URP4+G)(SEQ. ID. NO. 4)
이 때, A를 결합시키는 경우는 URP-4 프라이머 5' 말단에 있는 AG 염기를 제거하였는데, 이는 PCR 과정에서 생길 수 있는 프라이머들 간의 dimer 또는 hair pin 구조의 형성 가능성을 줄이기 위한 것이다. 즉, URP-4 프라이머의 5' 쪽 염기서열 AG를 제거함으로써 3' 부근에 있는 TC와의 반응으로 생길 수 있는 프라이머 간의 dimer 또는 hair pin 구조의 형성을 줄일 수 있기 때문이다.
상기 서열의 합성 프라이머를 각각 이용하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR을 실시하였다.
그 결과, 상기 세 경우의 합성 프라이머 중 염기 A를 결합시킨 합성 프라이머가 목표 DNA를 증폭하는 감자 DNA 특이적 프라이머임을 확인하였다 (도 2∼도 4).
〔실시예 3〕일반 GMO 판별용 프라이머를 혼합한 다중 PCR법에 의한 GMO 감자의 판별
다양한 감자 품종에서의 GMO 감자를 판별하기 위하여, 모든 품종의 감자에서 동일한 크기의 DNA 밴드를 증폭할 수 있는 상기 실시예 2의 감자 특이적 DNA 프라이머와 형질전환체에서 흔히 발견되는 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자에 특이적인 프라이머중 어느 하나의 프라이머를 혼합하여 이중 PCR을 수행하였다. 이때, PCR을 수행하는 반응물의 조성은 하기 표 1과 같다.
| 성분 | Taq DNA polymerase | dNTPs | Tris-HCl(pH 8.3) | KCl | MgCl2 | Template(감자 DNA) |
| 농도 및 함량 | 1 unit | 250 uM | 50 mM | 40 mM | 1.5 mM | 200 ng 이상 |
상기와 같은 조건으로 반응물을 혼합한 다음, 전-변성 (pre-denaturation) 온도 94 ℃에서 3분동안 1 사이클, 변성 온도 94 ℃에서 20초, 어닐링 온도 54 ℃에서 40초, 연장 온도 72 ℃에서 1분인 사이클을 40번 반복하여 DNA를 증폭한 다음 최종 연장 온도 72 ℃에서 10분동안 1 사이클로 PCR을 수행한 다음 그 반응물을 4 ℃에서 저장하였다.
그 다음, 상기 PCR로 증폭된 DNA 산물을 확인하기 위하여, 1.5 % (w/v) 아가로즈 겔 상에서 전기영동한 다음 EtBr로 염색하여 UV 하에서 관찰하였다.
상기와 같이 이중 PCR을 수행한 결과, 모든 감자 품종에 동일한 크기로 나타나는 공통의 DNA 증폭산물 (약 500 bp, SEQ. ID. NO. 2)과 함께 특히 유전자 변형 감자의 경우 CaMV 35S 프로모터 (195 bp) 또는 NOS 터미네이터 (180 bp) 유전자 부위가 특이적으로 증폭되었음이 확인되었다 (도 5 및 도 6).
따라서, 본 발명의 방법을 이용하는 경우 CaMV 35S 프로모터와 NOS 터미네이터가 포함된 유전자 운반체를 이용하여 형질전환된 유전자 변형 감자와 형질전환되지 않은 일반 감자를 그 품종에 관계없이 손쉽고 정확하게 판별할 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이, 다양한 감자 품종의 RAPD 밴드 패턴으로부터 모든 감자 품종에서 동일한 크기의 DNA 밴드를 증폭할 수 있는 단일 PCR 프라이머와 CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머를 혼합하여 이중 PCR을 실시함으로써 유전자 변형 감자를 판별하는 방법에 관한 본 발명은 운반체 특이 유전자를 증폭하는 프라이머만을 이용하여 검정하는 방법과 비교했을 때 감자 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하므로 결과의 신빙성이 뛰어날 뿐만 아니라, 다중 프라이머를 이용한 기존의 유전자 변형 콩과 옥수수 검정기술에는2쌍 4개의 프라이머를 이용하는 것과 비교했을 때 한 쌍의 프라이머와 한 개의 올리고머를 이용하여 동일한 결과를 얻을 수 있어 비용절감 효과와 비특이적 증폭산물 생성 가능성을 줄일 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Single PCR primer amplifying the potato specific DNA and duplex PCR method for the screening of genetically-modified potato using thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 553 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220> <221> repeat_region <222> (1)..(553) <223> This is the sequence of potato specific repeatative genomic DNA <400> 1 taggactcga taacaggctc cacaactatc tctataagat cttgcagatc tctgaatatg 60 ccctcatctc tgccctcatg tgtctcctca gcatgtactg ctatgaactc ctcgtcggtc 120 tctacatccg actctacatg ttgctatgcc atcctcctac acatctccgg tggtagccgg 180 aggaatgccc gaggtcttag gagcatcctc atcatctgca tcccgcatca gtgaagtgaa 240 gtccgttgac tttcaaatag tctacatctt tccttaaact ctgctacttc ggctttgcaa 300 gaagaacttt ggatgtcgtc cctcgtcaga tctcacaagt agtgactttg gtatccatat 360 tatcaatata ggccctaaga ggggtcagtg ccgccaagat ggcactgtca atcattcccg 420 agatggatct ctctaatcgg gtagctctca catcagttga ataggccaac tgccccatct 480 tcaggatcat ggcctgatga atcctgccat actgggagga tgagaagcac ctggagcctg 540 ttatcgagtc cta 553 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This single PCR primer can amplify the potato specific DNA <400> 2 gactcgataa cagggtcca 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This single primer is the degenerate primer of UniPrimer-4 <400> 3 aggactcgat aacagggtcc t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This single primer is the degenerateprimer of UniPrimer-4 <400> 4 aggactcgat aacagggtcc g 21
Claims (5)
- 감자 특이 DNA를 증폭하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 단일 PCR 프라이머.
- 제 1항에 있어서, 상기 감자 특이 DNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단일 PCR 프라이머.
- 감자 특이 DNA를 증폭하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 단일 PCR 프라이머를 이용함을 특징으로 하는 유전자 변형 감자의 판별 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 감자 특이 DNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자 변형 감자의 판별 방법.
- 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 유전자 변형 감자의 판별 방법은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 단일 PCR 프라이머와; CaMV 35S 프로모터 또는 NOS 터미네이터 유전자 부위를 증폭하는 프라이머 중 어느 하나의 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하는 유전자 변형 감자의 이중 PCR 판별 방법인 것을 특징으로 하는 유전자 변형 감자의 판별 방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR101720582B1 (ko) | 2015-03-19 | 2017-03-29 | 대구대학교 산학협력단 | 엽록체 염기서열을 이용한 Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ과 감자（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）를 포함한 다른 Ｓｏｌａｎｕｍ 종의 구별 마커 및 구별 방법 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20040021215A (ko) | 2004-03-10 |
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