JP2023528434A - トウモロコシイベントｄｐ－９１５６３５－４及びその検出方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に開示される実施形態は、植物分子生物学の分野に関し、具体的には、植物に昆虫抵抗性を付与するためのＤＮＡコンストラクトに関する。本明細書に開示される実施形態は、イベントＤＰ－９１５６３５－４を含む昆虫抵抗性コーン植物並びに試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４の存在を検出するためのアッセイ及びその組成物に関する。

Description

電子的に提出された配列表の参照
本配列表の正式な写しは、ファイル名を「８４２５＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」とする、２０２０年１１月１３日に作成された２０２キロバイトのサイズのＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂから電子的に提出され、本明細書と共に提供される。このＡＳＣＩＩ形式の書類に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、全体として参照により本明細書に援用される。

本明細書に開示される実施形態は、植物に昆虫抵抗性を付与するためのＤＮＡコンストラクトを含む植物分子生物学の分野に関する。本明細書に開示される実施形態は、イベントＤＰ－９１５６３５－４を含む昆虫抵抗性コーン植物並びに試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４の存在を検出するためのアッセイ及びその組成物も含む。

コーンは、重要な作物であり、世界の多くの地域の主要な食料源である。害虫によって引き起こされる被害は、化学農薬などの防護対策が講じられているにもかかわらず、世界のコーン作物損失の主な要因である。このような事情を踏まえて、虫害の防除及び従来の化学農薬の必要性の低減を目的として、コーンなどの作物に昆虫抵抗性をもたらす遺伝子操作が行われている。トランスジェニック昆虫抵抗性作物の作製に利用されている遺伝子の一群は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（Ｂｔ）由来のδ－エンドトキシン群である。δ－エンドトキシンは、綿、ジャガイモ、コメ、ヒマワリ並びにコーンなどの作物植物における発現が成功しており、状況によっては、害虫に対する優れた防除を提供することが判明している（Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：９３９－９４３；Ｐｅｒｌａｋ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：３１３－３２１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１５１－１１５５；Ｔｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１１０１－１１０４；国際公開第０１／１３７３１号パンフレット；及びＢｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｃｒｙ１Ｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍａｉｚｅ，１４^ｔｈ Ｂｉｅｎｎｉａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｉｎｓｅｃｔｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）。

植物におけるトランス遺伝子の発現は、個々の目的遺伝子の発現をドライブするカセットの向き及び組成並びに植物ゲノム中での位置（恐らくクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）又は組込み部位の近くにある転写調節エレメント（例えば、エンハンサー）の近接性が原因となる）を含め、多くの異なる要因に影響されることが公知である（Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１－４７７）。

有性交配の後代が目的のトランス遺伝子を含むかどうかを決定するため、特定のイベントの存在を検出することが可能であれば有利となるであろう。

トランス遺伝子の存在の検出は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は核酸プローブを用いたＤＮＡハイブリダイゼーションによる核酸検出方法によって可能である。これらの検出方法では、概して、多くのＤＮＡコンストラクトについてコード領域が交換可能であるという理由で、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子など、使用頻度の高い遺伝子エレメントに焦点が置かれている。結果として、かかる方法は、異なるイベント間、特に同じＤＮＡコンストラクト又は極めて類似したコンストラクトを使用して作られたイベント間を区別するには、挿入された異種ＤＮＡに隣接するフランキングＤＮＡのＤＮＡ配列が既知でない限り、有用でないこともある。

本実施形態は、昆虫抵抗性コーン（ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ））植物イベントＤＰ－９１５６３５－４、別名「トウモロコシ系統ＤＰ－９１５６３５－４」、「トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４」及び「ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ」、コーン植物イベントＤＰ－９１５６３５－４のＤＮＡ植物発現コンストラクト並びにコーン植物イベントＤＰ－９１５６３５－４及びその後代におけるトランス遺伝子コンストラクト、フランキング及び挿入（標的遺伝子座）領域を検出するための方法及び組成物に関する。

一態様において、組成物及び方法は、昆虫抵抗性の単子葉作物植物を作製及び選択する方法に関する。組成物は、植物細胞及び植物で発現したときに昆虫に対する抵抗性を付与するＤＮＡコンストラクトを含む。一態様において、宿主細胞に導入され、そこで複製する能力のある、植物細胞及び植物で発現したときに植物細胞及び植物に昆虫抵抗性を付与するＤＮＡコンストラクトが提供される。トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４は、アグロバクテリウムによるプラスミドＰＨＰ８３１７５の形質転換によって産生された。本明細書に記載されるとおり、これらのイベントは、ＩＰＤ０７９Ｅａ（ポリヌクレオチド配列番号４及びアミノ酸配列番号５）カセット（表１）を含み、これは、ある種の甲虫目植物害虫に対する抵抗性を付与するものである。この昆虫防除成分は、甲虫目昆虫種、特にウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）に対する有効性が実証されている。

第１のカセットは、コブラン（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｕｍ ｐｅｎｄｕｌｕｍ）由来の殺昆虫性タンパク質遺伝子ＩＰＤ０７９Ｅａを含有する（国際公開第２０１７０２３４８６号パンフレット）。植物でのＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質の発現は、ある種の甲虫目害虫に対して有効である。ＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質は、４７９アミノ酸長であり、約５２ｋＤａの分子量を有する。ＩＰＤ０７９Ｅａ遺伝子の発現は、モロコシ（ソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））根皮層ＲＣｃ３（ｓｂ－ＲＣｃ３）遺伝子の、根特異的活性を示す３コピーのエンハンサー領域（国際公開第２０１２１１２４１１号パンフレット）、その後に続く、根特異的活性を有すると同定されているゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）ＰＣＯ１１８３６２ ｍＲＮＡ配列の上流のプロモーター領域（ｚｍ ＰＣＯａ）（国際公開第２０１７２２２８２１号パンフレット）及び予測ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）カルモジュリン５遺伝子である、コメ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））仮想タンパク質（ｚｍ－ＨＰＬＶ９）遺伝子のゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）オルソログのイントロン領域（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ遺伝子ＩＤ Ｚｍ００００８ａ０２９６８２；国際公開第２０１６１０９１５７号パンフレット）によって制御される。ＩＰＤ０７９Ｅａ遺伝子のターミネーターは、モロコシ（ソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））サブチリシン－キモトリプシンインヒビター１Ｂ（ｓｂ－ＳＣＩ－１Ｂ）遺伝子のターミネーター領域（国際公開第２０１８１０２１３１号パンフレット）である。転写干渉を防ぐため、３つの追加的なターミネーター：トウモロコシＷ６４系統２７ｋＤａ γゼイン（Ｚ２７Ｇ）遺伝子のターミネーター領域（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ユビキチン１４（ＵＢＱ１４）遺伝子のターミネーター領域（Ｃａｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５）及びトウモロコシＩｎ２－１遺伝子のターミネーター領域（Ｈｅｒｓｈｅｙ ａｎｄ Ｓｔｏｎｅｒ，１９９１）が存在する。

第２の遺伝子カセット（ｍｏ－ｐａｔ遺伝子カセット）は、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｍｏ－ｐａｔ）（Ｗｏｈｌｌｅｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を含有する。ｍｏ－ｐａｔ遺伝子は、ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）酵素を発現する。ＰＡＴタンパク質は、１８３アミノ酸長であり、約２１ｋＤａの分子量を有する。ｍｏ－ｐａｔ遺伝子の発現は、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーターの第３のコピーと併せて、オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（コメ）アクチン（ｏｓ－アクチン）遺伝子のプロモーター及びイントロン領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＣＰ０１８１５９）によって制御される。転写干渉を防ぐため、２つの追加的なターミネーター：それぞれソルガム・ビコロール（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（モロコシ）ユビキチン（ｓｂ－ｕｂｉ）遺伝子（Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ遺伝子ＩＤ Ｓｏｂｉｃ．００４Ｇ０４９９００．１）及びγ－カフィリン（ｓｂ－ｇｋａｆ）遺伝子（ｄｅ Ｆｒｅｉｔａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４）のターミネーター領域が存在する。

第３の遺伝子カセット（ｐｍｉ遺伝子カセット）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のホスホマンノースイソメラーゼ（ｐｍｉ）遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）を含有する。植物におけるＰＭＩタンパク質の発現は、マンノースを炭素源とする植物組織成長を可能にする選択マーカーとしての役割を果たす。ＰＭＩタンパク質は、３９１アミノ酸長であり、約４３ｋＤａの分子量を有する。ＰＨＰ７４６４３のＴ－ＤＮＡ領域に存在するとき、ｐｍｉ遺伝子は、プロモーターを欠いているが、それは、フリッパーゼ組換え標的部位ＦＲＴ１の隣に位置するため、適切に置かれたプロモーターによる組換え後発現が可能である。ｐｍｉ遺伝子のターミネーターは、ｐｉｎＩＩターミネーターの第４のコピーである。追加的なＺ１９ターミネーターが存在し、これは、カセット間の転写干渉を防ぐことが意図される。

一部の実施形態によれば、ＤＰ－９１５６３５－４（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２６７４６）と称される新規コーン植物を同定するための組成物及び方法が提供される。本方法は、ＤＰ－９１５６３５－４の５’及び／又は３’フランキング配列を特異的に認識するプライマー又はプローブに基づく。ＰＣＲ反応で利用されたとき、トランスジェニックイベントＤＰ－９１５６３５－４にユニークなアンプリコンを産生することになるプライマー配列を含むＤＮＡ分子が提供される。一実施形態において、こうした分子を含むコーン植物及び種子が企図される。更に、こうしたプライマー配列を利用して、ＤＰ－９１５６３５－４イベントを同定するためのキットが提供される。

一部の実施形態は、本明細書に記載されるとおりのＤＰ－９１５６３５－４の特異的フランキング配列に関し、これを使用して、生物学的試料中のＤＰ－９１５６３５－４の同定方法を開発することができる。より詳細には、本開示は、ＤＰ－９１５６３５－４の５’及び／又は３’フランキング領域に関し、これを使用して特異的プライマー及びプローブを開発することができる。更なる実施形態は、かかる特異的プライマー又はプローブの使用に基づく生物学的試料中のＤＰ－９１５６３５－４の存在の同定方法に関する。

一部の実施形態によれば、試料中のコーンイベントＤＰ－９１５６３５－４に対応するＤＮＡの存在を検出する方法が提供される。かかる方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡプライマーセットであって、イベントＤＰ－９１５６３５－４を含むコーンから抽出されたゲノムＤＮＡと共に核酸増幅反応で使用されるとき、それぞれコーンイベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となるアンプリコンを産生するＤＮＡプライマーセットに接触させること；（ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによりアンプリコンを産生すること；及び（ｃ）アンプリコンを検出することを含む。一部の態様において、プライマーセットは、配列番号６及び７と、任意選択で、配列番号８を含むプローブとを含む。

一部の実施形態によれば、試料中のＤＰ－９１５６３５－４イベントに対応するＤＮＡ分子の存在を検出する方法は、（ａ）コーン植物から抽出されたＤＮＡを含む試料を、ＤＮＡプローブ分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４から抽出されたＤＮＡとハイブリダイズし、且つストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、対照コーン植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブ分子に接触させること；（ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；及び（ｃ）コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４から抽出されたＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することを含む。より具体的には、試料中のＤＰ－９１５６３５－４イベントに対応するＤＮＡ分子の存在の検出方法は、（ａ）コーン植物から抽出されたＤＮＡを含む試料を、イベントにユニークな配列、例えばジャンクション配列を含むＤＮＡプローブ分子であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４から抽出されたＤＮＡとハイブリダイズし、且つストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、対照コーン植物ＤＮＡとハイブリダイズしないＤＮＡプローブ分子に接触させること；（ｂ）試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；及び（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを検出することからなる。

加えて、ＤＰ－９１５６３５－４特異的領域を検出するものである、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４を同定するためのキット及び方法が提供される。

ＤＰ－９１５６３５－４の少なくとも１つのジャンクション配列を含むＤＮＡ分子が提供され；ここで、ジャンクション配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、その挿入部位に隣接するトウモロコシ細胞のＤＮＡとの間に位置するジャンクションにまたがり、ＤＰ－９１５６３５－４イベントの診断指標となり得る。

一部の実施形態によれば、昆虫抵抗性コーン植物を作製する方法は、（ａ）昆虫に対する抵抗性を付与する、本明細書に開示される発現カセットを含む第１の親コーン系統と、かかる発現カセットを欠いている第２の親コーン系統とを有性交配し、それにより複数の後代植物を作製するステップ；及び（ｂ）昆虫抵抗性のある後代植物を選択するステップを含む。かかる方法は、任意選択で、後代植物を第２の親コーン系統と戻し交配することにより、昆虫抵抗性のある純種コーン植物を作製する更なるステップを含み得る。

一部の実施形態は、昆虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製する方法であって、コーン細胞をＤＮＡコンストラクトＰＨＰ７４６４３で形質転換すること、形質転換されたコーン細胞をコーン植物に成長させること、昆虫に対して抵抗性を示すコーン植物を選択すること及びコーン植物を稔性のコーン植物に更に成長させることを含む方法を提供する。この稔性のコーン植物を自家受粉するか、又は適合性のあるコーン品種と交配させることにより、昆虫抵抗性の後代を作製することができる。

一部の実施形態は、生物学的試料中のトウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４を同定するためのＤＮＡ検出キットに更に関する。このキットは、ＰＣＲ同定プロトコルでの使用のための、ＤＰ－９１５６３５－４の５’又は３’フランキング領域を特異的に認識する第１のプライマーと、ＤＰ－９１５６３５－４の非天然標的遺伝子座ＤＮＡ内にあるか又はフランキングＤＮＡ内にある配列を特異的に認識する第２のプライマーとを含む。更なる実施形態は、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４を同定するためのキットに関し、このキットは、イベントＤＰ－９１５６３５－４の特異的領域と約８０％～１００％の配列同一性を有する配列に対応するか又はそれと相補的な配列を有する特異的プローブを含む。プローブの配列は、イベントＤＰ－９１５６３５－４の５’又は３’フランキング領域の一部を含む特異的領域に対応する。一部の実施形態において、第１又は第２のプライマーは、配列番号６～７、９～１０、１２～１３、１５～１６又は１８～１９のいずれか１つを含む。

本明細書に開示される実施形態に包含される方法及びキットは、限定はされないが、植物、植物材料又は植物材料を含むか若しくはそれに由来する生産物、限定はされないが、食品又は飼料生産物（生鮮品又は加工品）などにおいてイベントＤＰ－９１５６３５－４を同定することなど、種々の目的に使用することができ；加えて又は代わりに、本方法及びキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料との選別を目的としてトランスジェニック植物材料を同定するために使用することができ；加えて又は代わりに、本方法及びキットは、トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４を含む植物材料の品質を決定するために使用することができる。本キットは、検出方法の実施に必要な試薬及び材料も含有し得る。

更なる実施形態は、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ植物又はその一部、限定はされないが、コーン植物ＤＰ－９１５６３５－４の花粉、胚珠、栄養細胞、花粉細胞の核及び卵細胞の核並びにこれらに由来する後代に関する。別の実施形態において、ＤＰ－９１５６３５－４のトウモロコシ植物及び種子を標的とするＤＮＡプライマー分子は、特異的アンプリコン産物を提供する。

指示される遺伝子エレメントを含むプラスミドＰＨＰ８３１７５の概略図を示す。プラスミドサイズは、７４，９９７ｂｐである（配列番号１）。 Ｔ－ＤＮＡの概略図を示し、６つの遺伝子カセットを指示している。このＴ－ＤＮＡは、ＦＲＴ１及びＦＲＴ６部位を含む予め特徴付けられたトウモロコシ系統の形質転換に使用した。Ｔ－ＤＮＡにおいてＦＲＴ１部位とＦＲＴ６部位との間にあるｐｍｉ遺伝子、ｍｏ－ｐａｔ遺伝子及びｉｐｄ０７９Ｅａ遺伝子を含む領域は、トウモロコシ系統に部位特異的に組み込まれた。ｚｍ－ｗｕｓ２及びｚｍ－ｏｄｐ２発生遺伝子が存在することにより、形質転換効率が増加した。ｚｍ－ｗｕｓ２、ｚｍ－ｏｄｐ２及びｍｏ－Ｆｌｐ遺伝子は、最終産物に取り込まれなかった。 記載されるＳｂＳ分析に基づいたＤＰ９１５６３５トウモロコシにおける挿入の概略的マップを示す。フランキングトウモロコシゲノム（ｚｍ－ＳＥＱ１５８及びｚｍ－ＳＥＱ１５９領域を含む）は、水平の黒色のバーによって表される。トウモロコシゲノムには、ＰＨＰ８３１７５及びＰＨＰ７３８７８に由来する、意図される挿入の単一コピーが組み込まれる（配列番号２は、挿入Ｔ－ＤＮＡ配列である）。この挿入内では、ＰＨＰ７３８７８のランディングパッド配列及びＰＨＰ８３１７５由来の形質遺伝子を強調表示している。配列番号３は、完全な挿入配列及びフランキング領域である。ＳＳＩ過程で組換えの標的となるＦＲＴ１及びＦＲＴ６部位を強調表示している。 ＤＰ－９１５６３５－４の形質転換及び開発の概略図を示す。 収量以外の作物栽培学的形質についての基準エントリーと比較したイベントＤＰ－９１５６３５－４の交雑系の成績を示す表である。 全ての作物栽培学的形質についての基準エントリーと比較したイベントＤＰ－９１５６３５－４の近交系の成績を示す表である。

本明細書で使用されるとき、単数形「１つの（a）」、「及び（an）」及び「その（the）」には、文脈上特に明確に指図されない限り、複数の指示対象が含まれる。従って、例えば、「ある細胞」という表現は、複数のかかる細胞を含み、「そのタンパク質」という表現は、１つ又は複数のタンパク質及びその均等物を含む等となる。本明細書で使用される全ての科学技術用語は、特に明確に指示されない限り、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

本開示の組成物は、ＡＴＣＣ特許寄託番号ＰＴＡ－１２６７４６として寄託された種子並びにそれに由来する植物、植物細胞及び種子を含む。本出願人らは、２０２０年３月２７日、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０－２２０９ ＵＳＡにおいてトウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４の少なくとも２５００個の種子を寄託した（特許寄託番号ＰＴＡ－１２６７４６）。これらの寄託物は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）の条項に基づき管理されることになる。２０２０年３月２７日にＡＴＣＣに寄託されたこの種子は、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ－Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、７２５０ ＮＷ ６２^ｎｄ Ａｖｅｎｕｅ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｉｏｗａ ５０１３１－１０００によって管理されている寄託物から取られた。この寄託物の利用は、特許商標庁長官及び長官によりその権限があると決定された者に本願が係属している間も、請求に応じて可能であり得る。本願の任意の特許請求の範囲が許可され次第、本出願人らは、米国特許法施行規則第１．８０８条に準じて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０－２２０９にある交雑系トウモロコシの少なくとも６２５個の種子の寄託物の１つ又は複数の試料を一般に公開することになる。トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４の種子のこの寄託物は、公的寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年間若しくは最後に請求があったときから５年又は本特許の効力が続く間のいずれか長い期間にわたって管理されることになり、その期間中に生存不能になった場合、交換されることになる。加えて、本出願人らは、寄託時に試料の生存能力についての指示を提供することを含め、米国特許法施行規則第１．８０１～１．８０９条の全ての要件を満たしている。本出願人らには、生物学的材料の移動又はその商業的輸送に関して法律によって課されるいかなる制限も免除する権限はない。本出願人らは、本特許に基づき与えられるその権利又は植物品種保護法（Ｐｌａｎｔ Ｖａｒｉｅｔｙ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｃｔ）（合衆国法典第７巻第２３２１条以下）に基づくイベントＤＰ－９１５６３５－４に適用可能な権利のいかなる侵害も免除しない。無許可の種子増殖は禁止されている。種子は規制を受けることもある。

本明細書で使用されるとき、用語「コーン」は、ゼア・マイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ）又はトウモロコシを意味し、野生トウモロコシ種を含め、コーンと共に育種され得る全ての植物品種を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「昆虫抵抗性」及び「害虫に影響を与えること」は、限定はされないが、昆虫を死滅させること；成長を遅らせること；生殖能力を低減すること；摂餌を阻害することなどを含め、任意の発生段階にある昆虫の摂餌、成長及び／又は行動に変化を生じさせることを指す。

本明細書で使用されるとき、用語「殺害虫活性」及び「殺昆虫活性」は、適切な時間長さにわたって生物又は物質を摂餌させた後及び／又はそれに曝露した後に、限定はされないが、害虫死亡率、害虫体重減少、害虫誘引、害虫忌避並びに害虫の他の行動的及び身体的変化を含め、多くのパラメータによって測定することのできる生物又は物質（例えば、タンパク質など）の活性を指して同義語として使用される。例えば、「殺害虫タンパク質」は、単独で又は他のタンパク質との組み合わせで殺害虫活性を示すタンパク質である。

本明細書で使用されるとき、「インサートＤＮＡ」は、植物材料の形質転換に使用される発現カセット内にある異種ＤＮＡを指し、一方、「フランキングＤＮＡ」は、植物などの生物に自然に存在するゲノムＤＮＡのもの又は元のインサートＤＮＡ分子にとって異質な、形質転換法によって導入される外来性（異種）ＤＮＡのもの、例えば形質転換イベントに関連する断片のいずれも存在し得る。「フランキング領域」又は「フランキング配列」は、本明細書で使用されるとき、元の非天然インサートＤＮＡ分子の直接上流にそれと隣接して位置するか、且つ／又は直接下流にそれと隣接して位置するかのいずれかの少なくとも１０ｂｐ（一部の狭義の実施形態では、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ及び最大で少なくとも５０００ｂｐ）の配列を指す。外来性ＤＮＡの形質転換手順により、各形質転換体に特徴的でユニークな種々のフランキング領域を含む形質転換体が生じ得る。従来の交配を通じて組換えＤＮＡが植物に導入されるとき、概してそのフランキング領域は変化しないことになる。数世代の植物育種及び従来の交配を通じてフランキング領域に一塩基変化が起こる可能性もあり得る。形質転換体は、異種インサートＤＮＡ片とゲノムＤＮＡとの間若しくは２つのゲノムＤＮＡ片間又は２つの異種ＤＮＡ片間にユニークなジャンクションを含むことにもなる。「ジャンクション」は、２つの特異的ＤＮＡ断片がつながっている箇所である。例えば、ジャンクションは、インサートＤＮＡがフランキングＤＮＡにつながっているところに存在する。ジャンクション箇所は、天然の生物に見られるものと比べて修飾された形態で２つのＤＮＡ断片が一体につながっている形質転換生物にも存在する。「ジャンクションＤＮＡ」は、ジャンクション箇所を含むＤＮＡを指す。本開示に示されるジャンクション配列は、トウモロコシゲノムＤＮＡとインサートの５’末端との間に位置するジャンクション箇所を含んで、そのジャンクション箇所から少なくとも－５～＋５ヌクレオチド（配列番号２６）、そのジャンクション箇所から少なくとも－１０～＋１０ヌクレオチド（配列番号２７）及びそのジャンクション箇所から少なくとも－２５～＋２５ヌクレオチド（配列番号２８）の範囲に及ぶもの；並びにインサートの３’末端とトウモロコシゲノムＤＮＡとの間に位置するジャンクション箇所を含んで、そのジャンクション箇所から少なくとも－５～＋５ヌクレオチド（配列番号２９）、そのジャンクション箇所から少なくとも－１０～＋１０ヌクレオチド（配列番号３０）及びそのジャンクション箇所から少なくとも－２５～＋２５ヌクレオチド（配列番号３１）の範囲に及ぶものである。本開示に示されるジャンクション配列は、標的遺伝子座とインサートの５’末端との間に位置するジャンクション箇所も含む。一部の実施形態では、ＤＰ－９１５６３５－４の配列番号８又は２１は、標的遺伝子座とインサートの５’末端との間に位置するジャンクション箇所を表す。フランキング領域を伴う完全なインサートは、配列番号３に表される。

本明細書で使用されるとき、核酸配列に言及した「異種」は、性的適合性のない異なる種を起源とするか又は同じ種を起源とする場合、ヒトの意図的な介入によって組成及び／又はゲノム遺伝子座がその天然形態と比べて実質的に修飾されている核酸配列である。例えば、異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターは、そのヌクレオチド配列の由来となった種と異なる種のものであり得るか又は同じ種のものである場合、そのプロモーターが自然中でそのヌクレオチド配列に作動可能に連結されて見出されることはない。異種タンパク質は、外来種を起源とし得るか又は同じ種を起源とする場合、ヒトの意図的な介入によってその元の形態と比べて実質的に修飾されている。

用語「調節エレメント」は、遺伝子調節活性を有する核酸分子、即ち作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳発現パターンに影響を及ぼす能力を有するものを指す。従って用語「遺伝子調節活性」は、作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の発現に対し、その作動可能に連結された転写可能なポリヌクレオチド分子の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼすことによって影響を及ぼす能力を指す。遺伝子調節活性は、正及び／又は負であり得、その効果は、その時間的、空間的、発生的、組織、環境、生理学的、病理学的、細胞周期及び／又は化学的応答の質によると共に、定量的又は定性的指標によっても特徴付けられ得る。

「プロモーター」は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する能力のあるヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。これに従えば、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することのできるヌクレオチド配列であり、プロモーターの固有のエレメントであり得るか、又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、又は天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され得るか、又は更に合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。当業者によれば、異なる調節エレメントは、異なる組織又は細胞型における、又は異なる発生段階にある、又は異なる環境条件に応答した遺伝子の発現を導き得ることが理解される。ほとんどの細胞型でほぼ常に核酸断片の発現を生じさせるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義付けられていないため、異なる長さの核酸断片が同一の又は類似したプロモーター活性を有し得ることが更に認識される。

「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡでは翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物からｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性及び／又は翻訳効率を含め、多くのパラメータに影響を及ぼし得る。

「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するヌクレオチド配列を指し、ポリアデニル化認識配列及びその他の、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響を及ぼす能力のある調節シグナルをコードする配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことによって特徴付けられる。

ＤＮＡコンストラクトは、１つ以上の発現カセットを提供する一体に連結されたＤＮＡ分子の集合体である。ＤＮＡコンストラクトは、細菌細胞における自己複製が可能となるようにされた、機能性遺伝子エレメント、即ちとりわけプロモーター、イントロン、リーダー、コード配列、３’終結領域を提供するＤＮＡ分子の導入に有用な様々なエンドヌクレアーゼ酵素制限部位を含むプラスミドであり得るか；又はＤＮＡコンストラクトは、発現カセットなど、ＤＮＡ分子の線状の集合体であり得る。ＤＮＡコンストラクト内に含まれる発現カセットは、メッセンジャーＲＮＡの転写をもたらすのに必要な遺伝子エレメントを含む。発現カセットは、原核細胞又は真核細胞で発現するように設計することができる。本実施形態の発現カセットは、植物細胞で発現するように設計される。

本明細書に開示されるＤＮＡ分子は、目的の生物における発現用の発現カセットに提供される。このカセットは、コード配列に作動可能に連結された５’及び３’調節配列を含む。「作動可能に連結された」とは、連結されている核酸配列が隣接していること及び２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、隣接していて、且つ同じリーディングフレームにあることを意味する。作動可能に連結されたとは、プロモーターと第２の配列との間の機能的連結を指し示すことが意図され、ここで、プロモーター配列は、第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始させ、それを媒介する。カセットは、加えて、生物に同時形質転換しようとする少なくとも１つの追加的な遺伝子を含有し得る。代わりに、そうした１つ又は複数の追加的な遺伝子は、複数の発現カセット上又は複数のＤＮＡコンストラクト上に提供され得る。

発現カセットは、５’から３’の転写方向に、宿主としての役割を果たす生物において機能性の転写及び翻訳開始領域、コード領域並びに転写及び翻訳終結領域を含み得る。転写開始領域（例えば、プロモーター）は、宿主生物にとって未変性若しくは類似体であり得るか、又は外来性若しくは異種であり得る。加えて、プロモーターは、天然配列であり得るか、又は代わりに合成配列であり得る。発現カセットは、加えて、発現カセットコンストラクトに５’リーダー配列を含有し得る。かかるリーダー配列は、翻訳を亢進させる役割を果たし得る。

本明細書で使用されるとき、用語「トランスジェニック」には、概して、その遺伝子型が異種核酸の存在によって変化し（当初からそのように変化したもの並びに初期トランスジェニックからの有性交配又は無性繁殖によって作り出されたものを含む）、且つかかる異種核酸を保持している任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部位又は植物が含まれることが理解されるべきである。

トランスジェニック「イベント」は、目的のトランス遺伝子を含む核酸発現カセットを含めた、１つ又は複数の異種ＤＮＡコンストラクトによる植物細胞の形質転換、トランス遺伝子が植物のゲノムに挿入されることによって生じる植物集団の再生及び特定のゲノム位置への挿入によって特徴付けられる植物の選択によって作製される。イベントは、トランス遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝子レベルでは、イベントは、植物の遺伝子構造の一部である。用語「イベント」は、形質転換体と別の品種との間での有性異系交配によって作製された後代も指し、この後代は、異種ＤＮＡを含む。反復親との戻し交配後、その交配の後代には、形質転換した親からの挿入されたＤＮＡ及び連結しているフランキングゲノムＤＮＡが同じ染色体位置に存在する。後代植物は、従来の育種技法の結果として生じるインサートの配列変化を含み得る。用語「イベント」は、挿入されたＤＮＡと、その挿入されたＤＮＡに直接隣接するフランキング配列とを含む元の形質転換体からのＤＮＡであって、挿入されたＤＮＡを含む一方の親系統（例えば、元の形質転換体及び自殖によって生じる後代）と、その挿入されたＤＮＡを含まない親系統との有性交配の結果として、目的のトランス遺伝子を含め、挿入されたＤＮＡを受け取る後代に受け継がれることが期待されるであろうＤＮＡも指す。

昆虫抵抗性ＤＰ－９１５６３５－４コーン植物の育種は、初めに、昆虫抵抗性を付与する本実施形態の発現カセットによる形質転換に由来するトランスジェニックＤＰ９１５６３５－４イベント植物及びその後代を有する第１の親コーン植物と、かかる発現カセットを欠いている第２の親コーン植物とを有性交配し、それにより複数の第１の後代植物を作製すること；及び次に昆虫に対して抵抗性のある第１の後代植物を選択すること；及び第１の後代植物を自殖させて、それにより複数の第２の後代植物を作製すること；及び次に第２の後代植物から昆虫抵抗性植物を選択することによることができる。これらのステップは、第１の昆虫抵抗性の後代植物又は第２の昆虫抵抗性の後代植物を第２の親コーン植物又は第３の親コーン植物と戻し交配し、それにより昆虫に対して抵抗性のあるコーン植物を作製することを更に含み得る。用語「自殖」は、同じ生物からの配偶子及び／又は核の合体を含め、自家受粉を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「植物」には、全植物、植物の部位、植物器官（例えば、葉、茎、根等）、種子、植物細胞及びその後代への言及が含まれる。一部の実施形態において、トランスジェニック植物の部位は、本明細書に開示されるＤＮＡ分子で以前に形質転換されていて、従って少なくとも一部はトランスジェニック細胞からなるトランスジェニック植物又はその後代を起源とする、例えば、植物細胞、プロトプラスト、組織、カルス、胚並びに花、茎、果実、葉及び根を含む。

本明細書で使用されるとき、用語「植物細胞」には、限定なしに、種子、浮遊培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子が含まれる。使用し得る植物クラスは、概して、単子葉植物及び双子葉植物の両方を含めた、形質転換技法に適している高等植物クラスと同程度に広範である。

「形質転換」は、核酸断片を宿主生物のゲノムに移入する結果、遺伝的に安定して受け継がれるようになることを指す。形質転換された核酸断片を含む宿主植物は、「トランスジェニック」植物と称される。

本明細書で使用されるとき、用語「後代」は、イベントＤＰ－９１５６３５－４の文脈では、コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４を含む親植物の任意の世代の子孫を指す。

本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞への導入能及びそこでの複製能のある組換えコンストラクト、典型的にはＤＮＡコンストラクトに取り込まれ得る。かかるコンストラクトは、複製システム並びに所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード配列の転写能及び翻訳能を有する配列を含むベクターであり得る。植物細胞の安定したトランスフェクション又はトランスジェニック植物の樹立に好適な幾つものベクターが、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８５；Ｓｕｐｐ．１９８７）「クローニングベクター：実験室マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８９）「植物分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＦｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）「植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）」，（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’及び３’調節配列の転写制御下にある１つ以上のクローニングされた植物遺伝子並びに優勢選択マーカーを含む。かかる植物発現ベクターは、プロモーター調節領域（例えば、誘導性の若しくは構成的な、環境的に若しくは発生的に調節された又は細胞特異的若しくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始出発部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位及び／又はポリアデニル化シグナルも含有することができる。

インサートを植物細胞のゲノムに導入する過程では、インサート及び／又はゲノムフランキング配列の何らかの欠失又は他の変化が起こることも珍しくない。従って、本明細書に提供されるプラスミド配列の関連性のあるセグメントは、何らかの軽微な変異を含む可能性がある。本明細書に提供されるフランキング配列についても、この可能性がある。従って、本主題のフランキング及び／又はインサート配列と何らかの範囲の同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物は、本主題の開示の範囲内にある。本開示の配列との同一性は、本明細書に例示される又は記載される配列と少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の同一性又は少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であり得る。本明細書に提供されるとおりのハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション条件も、本主題の開示のかかる植物及びポリヌクレオチド配列を定義するのに用いることができる。フランキング配列＋完全インサート配列を含む配列は、寄託された種子を基準として確認することができる。

一部の実施形態において、２つの異なるトランスジェニック植物を交配することにより、２つの独立に分離する加えられた外因性遺伝子を含む子孫を作製することもできる。適切な後代の自殖により、加えられた外因性遺伝子に関してホモ接合の植物を作製することができる。親植物との戻し交配及び非トランスジェニック植物との異系交配も栄養繁殖と同じく企図される。

「プローブ」は、従来の合成の検出可能標識又はレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤又は酵素が取り付けられている単離核酸である。かかるプローブは、標的核酸の鎖、例えばイベントからのＤＮＡを含むコーン植物又は試料からであるかにかかわらず、コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４からの単離されたＤＮＡの鎖と相補的である。プローブには、デオキシリボ核酸又はリボ核酸が含まれるのみならず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、且つその標的ＤＮＡ配列の存在の検出に使用することができるポリアミド及び他の修飾ヌクレオチドも含まれる。

「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールする単離核酸であり、それによりプライマーと標的ＤＮＡ鎖との間にハイブリッドが形成され、次にはそれが標的ＤＮＡ鎖に沿ってポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより伸張される。プライマー対とは、例えばＰＣＲ又は他の従来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅へのその使用を指す。「ＰＣＲ」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的ＤＮＡセグメントの増幅に用いられる技法である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，８００，１５９号明細書を参照されたく；本明細書において参照により援用される）。

プローブ及びプライマーは、操作者が決定したハイブリダイゼーション条件又は反応条件で標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに十分なヌクレオチド長さである。この長さは、選択の検出方法において有用となるのに十分な長さである任意の長さであり得る。概して、１１ヌクレオチド以上の長さ、１８ヌクレオチド以上及び２２ヌクレオチド以上が用いられる。かかるプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズする。実施形態に係るプローブ及びプライマーは、標的配列と完全なＤＮＡ配列類似性の連続するヌクレオチドを有し得るが、標的ＤＮＡ配列と異なる、且つ標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイズ能を保持しているプローブが、従来方法によって設計され得る。プローブはプライマーとして使用されることもできるが、概して標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、増幅過程に使用されない。

特異的プライマーは、生物学的試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４を同定するための「特異的プローブ」として使用し得るアンプリコンを作製するため、組込み断片の増幅に使用され得る。プローブによる試料への結合を許容する条件下でプローブが生物学的試料の核酸にハイブリダイズすると、その結合を検出することができ、ひいては生物学的試料中にイベントＤＰ－９１５６３５－４が存在すると指示することが可能となる。本開示のある実施形態において、特異的プローブは、適切な条件下でイベントの５’又は３’フランキング領域内の領域に特異的にハイブリダイズし、且つそれに隣接する外来性ＤＮＡの一部も含む配列である。特異的プローブは、イベントの特異的領域と少なくとも８０％、８０及び８５％、８５及び９０％、９０及び９５％及び９５及び１００％同一の（又は相補的な）配列を含み得る。

プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９（以下では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５（定期改訂版を含む）（以下では「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５」）；及びＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、バージョン６（Ｉｎｆｏｒｍａｘ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；及びＰｒｉｍｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．５（登録商標）、１９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）におけるＰＣＲプライマー分析ツールなど、この目的を意図したコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列から導き出すことができる。加えて、当業者に公知の手引きを用いて配列を目視で読み取り、プライマーを手作業で同定することができる。

「キット」は、本明細書で使用されるとき、本開示の方法の実施形態の実施、より詳細には生物学的試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４の同定を目的とした一組の試薬及び任意選択で説明書を指す。キットが使用され得、その構成要素は、品質管理（例えば種子ロットの純度）、植物材料中又は限定はされないが、食品又は飼料生産物など、植物材料を含むか又はそれに由来する材料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４の検出を目的として具体的に調整することができる。「植物材料」は、本明細書で使用されるとき、植物から入手されたか又はそれに由来する材料を指す。

本明細書に開示されるフランキングＤＮＡ及びインサート配列をベースとするプライマー及びプローブを使用すると、開示される配列を従来の方法により、例えば、かかる配列のリクローニング及びシーケンシングにより確認する（及び必要に応じて修正する）ことができる。核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーション又は増幅方法を使用して、試料中のトランスジェニックイベントからのＤＮＡの存在を同定し得る。

核酸分子は、別の核酸分子の「相補体」であると、それらが完全な相補性又は最小限の相補性を呈する場合に言われる。本明細書で使用されるとき、分子は、それらの分子の一方のあらゆるヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的であるとき、「完全な相補性」を呈すると言われる。２つの分子は、それらが少なくとも従来の「低いストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたまま留まることを許容するのに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、分子は、それらが従来の「高いストリンジェンシー」条件下で互いにアニールしたまま留まることを許容するのに十分な安定性でそれらが互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９により、且つＨａｙｍｅｓ ｅｔ ａｌ．により、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）に記載されており、従って完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱によって分子が二本鎖構造を形成する能力が完全になくならない限りは許容できる。核酸分子がプライマー又はプローブとしての役割を果たすために、利用される詳細な溶媒及び塩濃度の下で配列が安定した二本鎖構造を形成することを可能とするのに十分な相補性がありさえすればよい。

ハイブリダイゼーション反応では、特異性は、典型的にはハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、決定的因子は、最終的な洗浄溶液のイオン強度及び温度である。熱的融点（Ｔ_ｍ）は、相補的標的配列の５０％が完全に一致するプローブにハイブリダイズするときの（一定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔ_ｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７－２８４の式から近似することができる：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌ；式中、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、及びＬは、塩基対単位でのハイブリッドの長さである。Ｔ_ｍは、１％のミスマッチ毎に約１℃ずつ低下する；このように、所望の同一性の配列をハイブリダイズさせるため、Ｔ_ｍ、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を調整することができる。例えば、９０％超の同一性の配列が求められる場合、Ｔ_ｍを１０℃下げることができる。概して、ストリンジェントな条件は、一定のイオン強度及びｐＨでの具体的な配列及びその相補体のＴ_ｍよりも約５℃低くなるように選択される。しかしながら、一部の実施形態では、他のストリンジェンシー条件が適用され得、重度にストリンジェントな条件は、Ｔ_ｍよりも１、２、３又は４℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；中程度にストリンジェントな条件は、Ｔ_ｍよりも６、７、８、９又は１０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ；低いストリンジェンシー条件は、Ｔ_ｍよりも１１、１２、１３、１４、１５又は２０℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができるなどが含まれる。

当業者は、式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成並びに所望のＴ_ｍを用いると、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液のストリンジェンシーの違いが固有に記載されることを理解するであろう。所望ミスマッチの程度が、４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）よりも低いＴ_ｍをもたらす場合、使用者は、より高い温度を用いることができるように、ＳＳＣ濃度を増加させることを選択し得る。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針については、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）が参照される。

一部の実施形態において、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子と同じ長さを有する。一部の実施形態において、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド長い又は短い。一部の実施形態において、相補配列は、それがハイブリダイズする核酸分子よりも１％、２％、３％、４％又は５％長い又は短い。一部の実施形態において、相補配列は、ヌクレオチド毎に見たときに相補的であり、即ちミスマッチのヌクレオチドがない（いずれのＡもＴと対合し、いずれのＧもＣと対合する）ということになる。一部の実施形態において、相補配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ未満のミスマッチを含む。一部の実施形態において、相補配列は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％又は１０％又はそれ未満のミスマッチを含む。

参照配列（対象）に対する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大限のパーセント配列同一性を実現した後に、いかなるアミノ酸保存的置換も配列同一性の一部と見なすことなく、候補配列（問い合わせ）中、参照配列のそれぞれのアミノ酸残基又はヌクレオチドと同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセンテージとして決定される。パーセント配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当技術分野の技能の範囲内にある様々な方法において、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２などの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して実現することができる。当業者は、比較下の配列の完全長にわたって最大限のアラインメントを実現するためにどのアルゴリズムが必要かを含め、配列のアラインメントに適切なパラメータを決定することができる。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（例えば、問い合わせ配列のパーセント同一性＝問い合わせ配列と対象配列との間／の同一の位置の数／問い合わせ配列の位置の総数×１００）。

特定の増幅プライマー対を使用した標的核酸配列の（例えば、ＰＣＲによる）増幅に関して、ストリンジェントな条件とは、プライマーが対応する野生型配列（又はその相補体）を有したならばＤＮＡ熱増幅反応において結合し、任意選択でユニークな増幅産物であるアンプリコンを産生するであろう標的核酸配列に限り、そのプライマー対がハイブリダイズすることを許容するものである。

本明細書で使用されるとき、「増幅されたＤＮＡ」又は「アンプリコン」は、核酸鋳型の一部である標的核酸配列の核酸増幅産物を指す。例えば、有性交配から得られたコーン植物が、本明細書に開示されるコーン植物からのトランスジェニックイベントゲノムＤＮＡを含むかどうかを決定するため、コーン植物の組織試料から抽出されたＤＮＡを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接するフランキング配列に由来する第１のプライマーと、挿入された異種ＤＮＡに由来する第２のプライマーとを含むＤＮＡプライマー対を使用した核酸増幅法に供すると、イベントＤＮＡの存在の診断指標となるアンプリコンが産生される。代わりに、第２のプライマーは、フランキング配列に由来し得る。アンプリコンは、同様にイベントの診断指標になる長さ及び配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌクレオチド塩基対の合計長さから、ＤＮＡ増幅プロトコルによって産生可能な任意の長さのアンプリコンに至るまでの範囲の長さであり得る。代わりに、プライマー対は、挿入されたＤＮＡの両側にあるフランキング配列に由来することができ、そのため、ＰＨＰ７４６４３発現コンストラクトのインサートヌクレオチド配列全体並びにトランスジェニックインサートに隣接する配列の一部分を含むアンプリコンが産生されることになる。フランキング配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ配列から離れた位置にあり得、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から最大で増幅反応の限界に至るまでの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成され得るプライマー二量体を具体的に除外する。

核酸増幅は、ＰＣＲを含め、当技術分野において公知の様々な核酸増幅方法のいずれによっても達成され得る。種々の増幅方法が当技術分野において公知であり、とりわけ米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書並びにＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）前掲に記載されている。ＰＣＲ増幅方法は、最大２２ＫｂのゲノムＤＮＡ及び最大４２ＫｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５－５６９９，１９９４）。本開示の実施形態の実施では、ＤＮＡ増幅のこれらの方法並びに当技術分野において公知の他の方法を用いることができる。具体的な実験室条件に合わせて具体的なＰＣＲプロトコルの幾つものパラメータを調整する必要があり得ること、及びわずかに変更され得、それでもなお同様の結果を集めることが可能であることが理解される。それらの調整は、当業者に明らかであろう。

これらの方法によって産生されたアンプリコンは、限定はされないが、隣接するフランキングＤＮＡ配列及び挿入されたＤＮＡ配列の両方とオーバーラップするＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：４１６７－４１７５，１９９４）を含め、複数の技法によって検出し得る。このオリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。目的の領域のＰＣＲ後（例えば、挿入された配列に１つのプライマーを使用し、隣接するフランキング配列に１つを使用する）、一本鎖ＰＣＲ産物は、固定化したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができ、ＤＮＡポリメラーゼ及び予想される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰを使用した一塩基伸長反応用の鋳型としての役割を果たす。読取り値は、蛍光又はＥＬＩＳＡベースであり得る。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が成功したことによるインサート／フランキング配列の存在を指示している。

別の検出方法は、Ｗｉｎｇｅ（２０００）Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８－２４によって記載されるとおりのパイロシーケンシング技法である。この方法では、隣接するＤＮＡとインサートＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを目的の領域からの一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせて（例えば、挿入された配列に１つのプライマー及びフランキング配列に１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸及びルシフェリンの存在下でインキュベートする。ｄＮＴＰを個別に加え、取込みの結果、光シグナルが生じ、それを測定する。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション並びに単一塩基又は多塩基伸長が成功したことによるトランス遺伝子インサート／フランキング配列の存在を指示している。

Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４９２－４９８により記載されるとおりの蛍光偏光法も、アンプリコンの検出に用いることのできる方法である。この方法を用いて、フランキングと挿入されたＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするオリゴヌクレオチドが設計される。このオリゴヌクレオチドを目的の領域の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせて（例えば、挿入されたＤＮＡに１つのプライマー及びフランキングＤＮＡ配列に１つ）、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識されたｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長の結果、ｄｄＮＴＰの取込みが起こる。取込みは、偏光の変化として蛍光光度計を用いて測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション及び一塩基伸長が成功したことによるトランス遺伝子インサート／フランキング配列の存在を指示している。

定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量化する方法として記載され、市販品製造者が提供する説明書の中で十分に理解されている。簡潔に言えば、かかるｑＰＣＲ方法の１つでは、フランキングとインサートＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列に１つのプライマー及びフランキングゲノム配列に１つ）を耐熱性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクル処理する。ＦＲＥＴプローブがハイブリダイズする結果、蛍光部分の切断及び放出が起こり、ＦＲＥＴプローブのクエンチング部分から離れる。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションが成功したことによるフランキング／トランス遺伝子インサート配列の存在を指示している。

Ｔｙａｎｇｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３－３０８に記載されるとおり、配列検出における使用のための分子ビーコンが記載されている。簡潔に言えば、フランキングとインサートＤＮＡとのジャンクションにオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。ＦＲＥＴプローブがユニークな構造である結果、それが、蛍光部分とクエンチング部分とをごく接近した状態に保つ二次構造を備えることになる。ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（例えば、インサートＤＮＡ配列に１つのプライマー及びフランキング配列に１つ）を耐熱性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクル処理する。ＰＣＲ増幅の成功後、ＦＲＥＴプローブが標的配列にハイブリダイズする結果、プローブ二次構造が取り除かれて、蛍光部分とクエンチング部分とが空間的に分離する。蛍光シグナル結果。蛍光シグナルは、増幅及びハイブリダイゼーションが成功したことによるフランキング／トランス遺伝子インサート配列の存在を指示している。

アンプリコン内に見出される配列に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応によって産生されたアンプリコンの検出に用いられるなおも別の方法である。

害虫としては、甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、ハジラミ目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、同翅亜目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、総翅目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、革翅目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）等、特に甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）及び鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）から選択される昆虫が挙げられる。

目的とするのは、ヒゲナガゾウムシ科（Ａｎｔｈｒｉｂｉｄａｅ）、マメゾウムシ科（Ｂｒｕｃｈｉｄａｅ）及び限定はされないが、アントノムス・グランディス（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）ボーマン（Ｂｏｈｅｍａｎ）（ワタミハナゾウムシ）；シリンドロコプチュルス・アドスペルスス（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃｏｐｔｕｒｕｓ ａｄｓｐｅｒｓｕｓ）ルコント（ＬｅＣｏｎｔｅ）（ヒマワリ茎ゾウムシ）；ディアプレペス・アブレビアトゥス（Ｄｉａｐｒｅｐｅｓ ａｂｂｒｅｖｉａｔｕｓ）リンネ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ディアプレペス根ゾウムシ）；ヒペラ・プンクタータ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ）ファブリキウス（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（クローバー葉ゾウムシ）；リソロプトルス・オリゾフィルス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）クシェル（Ｋｕｓｃｈｅｌ）（イネミズゾウムシ）；メタマシウス・ヘミプテルス・ヘミプテルス（Ｍｅｔａｍａｓｉｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ）リンネ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（西インドサトウキビゾウムシ）；Ｍ．ヘミプテルス・セリケウス（Ｍ．ｈｅｍｉｐｔｅｒｕｓ ｓｅｒｉｃｅｕｓ）オリビエ（Ｏｌｉｖｉｅｒ）（シルキーサトウキビゾウムシ）；シトフィルス・グラナリウス（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｇｒａｎａｒｉｕｓ）リンネ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（グラナリアコクゾウムシ）；Ｓ．オリゼ（Ｓ．ｏｒｙｚａｅ）リンネ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（ココクゾウムシ）；スミクロニクス・フルブス（Ｓｍｉｃｒｏｎｙｘ ｆｕｌｖｕｓ）ルコント（ＬｅＣｏｎｔｅ）（赤色ヒマワリ種子ゾウムシ）；Ｓ．ソルディダス（Ｓ．ｓｏｒｄｉｄｕｓ）ルコント（ＬｅＣｏｎｔｅ）（灰色ヒマワリ種子ゾウムシ）；スフェノフォルス・マイディス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）チッテンデン（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ）（トウモロコシゾウムシ）；Ｓ．リビス（Ｓ．ｌｉｖｉｓ）ボーリエ（Ｖａｕｒｉｅ）（サトウキビゾウムシ）；ラブドスケルス・オブスキュルス（Ｒｈａｂｄｏｓｃｅｌｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）ボワデュヴァル（Ｂｏｉｓｄｕｖａｌ）（カンショオサゾウムシ）を含めたゾウムシ科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ）のゾウムシ類；限定はされないが、カエトクネマ・エクチパ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｅｃｔｙｐａ）ホーン（Ｈｏｒｎ）（サバクトウモロコシノミハムシ）；Ｃ．ピュリカリア（Ｃ．ｐｕｌｉｃａｒｉａ）メルスハイマー（Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ）（トウモロコシノミハムシ）；コラスピス・ブルンネア（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ）ファブリキウス（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ブドウコラスピス）；ディアブロチカ・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｂａｒｂｅｒｉ）スミス・アンド・ローレンス（Ｓｍｉｔｈ＆Ｌａｗｒｅｎｃｅ）（北部コーンルートワーム）；Ｄ．ウンデシムプンクタータ・ホワルディ（Ｄ．ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）バーバー（Ｂａｒｂｅｒ）（南部コーンルートワーム）；Ｄ．ビルギフェラ・ビルギフェラ（Ｄ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）ルコント（ＬｅＣｏｎｔｅ）（ウエスタンコーンルートワーム）；レプチノタルサ・デセムリネアタ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）セイ（Ｓａｙ）（コロラドハムシ）；オウレマ・メラノピュス（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）リンネ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）（クビアカクビボソハムシ）；フィロトレタ・クルキフェレ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）ゲーツェ（Ｇｏｅｚｅ）（トウモロコシノミハムシ）；ジゴグラムマ・エクスクラマティオニス（Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ）ファブリキウス（Ｆａｂｒｉｃｉｕｓ）（ヒマワリ甲虫）を含めたハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）のノミハムシ類、ウリハムシ類、根切り虫、ハムシ類、コロラドハムシ類及び葉もぐり虫；限定はされないが、エピラクナ・バリベスティス（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）ミュルサン（Ｍｕｌｓａｎｔ）（インゲンテントウ）を含めたテントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）の甲虫類；限定はされないが、アンチトロギュス・パルブルス（Ａｎｔｉｔｒｏｇｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）ブリトン（Ｂｒｉｔｔｏｎ）（チルダーズサトウキビ幼虫）；シクロセファラ・ボレアリス（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）アロー（Ａｒｒｏｗ）（北部コガネモドキ、白色幼虫）；Ｃ．イムマキュラタ（Ｃ．ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）オリビエ（Ｏｌｉｖｉｅｒ）（南部コガネモドキ、白色幼虫）；デルモレピダ・アルボヒルトゥム（Ｄｅｒｍｏｌｅｐｉｄａ ａｌｂｏｈｉｒｔｕｍ）ウォーターハウス（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）（背甲が灰色のサトウキビ甲虫）；エウエテオラ・ヒュミリス・ルギセプス（Ｅｕｅｔｈｅｏｌａ ｈｕｍｉｌｉｓ ｒｕｇｉｃｅｐｓ）ルコント（ＬｅＣｏｎｔｅ）（サトウキビ甲虫）；レピディオタ・フレンキ（Ｌｅｐｉｄｉｏｔａ ｆｒｅｎｃｈｉ）ブラックバーン（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ）（フランスサトウキビ幼虫）；トマルス・ギブボスス（Ｔｏｍａｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ）デ・ギア（Ｄｅ Ｇｅｅｒ）（ニンジン甲虫）；Ｔ．スブトロピクス（Ｔ．ｓｕｂｔｒｏｐｉｃｕｓ）ブラッチリー（Ｂｌａｔｃｈｌｅｙ）（サトウキビ幼虫）；フィロファガ・クリニタ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ）バーマイスター（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ）（白色幼虫）；Ｐ．ラティフロンス（Ｐ．ｌａｔｉｆｒｏｎｓ）ルコント（ＬｅＣｏｎｔｅ）（コフキコガネ）；ポピリア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）（マメコガネ）；リゾトロギュス・マジャリス（Ｒｈｉｚｏｔｒｏｇｕｓ ｍａｊａｌｉｓ）ラズモフスキー（Ｒａｚｏｕｍｏｗｓｋｙ）（ヨーロッパコガネムシ）を含めたコガネムシ科（Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）のコガネムシ類及び他の甲虫類；カツオブシムシ科（Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ）のヒメマルカツオブシムシ類；コメツキムシ科（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）のハリガネムシ類、エレオデス属種（Ｅｌｅｏｄｅｓ ｓｐｐ．）、Ｍ．コミュニス（Ｍ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）ジレンホール（Ｇｙｌｌｅｎｈａｌ）（ハリガネムシ）を含めたクシコメツキ属種（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）；コノデルス属種（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｓｐｐ．）；リモニウス属種（Ｌｉｍｏｎｉｕｓ ｓｐｐ．）；カバイロコメツキ属種（Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｓｐｐ．）；クテニセラ属種（Ｃｔｅｎｉｃｅｒａ ｓｐｐ．）；アエオルス属種（Ａｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）；キクイムシ科（Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ）のキクイ虫；ゴミムシダマシ科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ）の甲虫類；限定はされないが、ミグドルス・フリアヌス（Ｍｉｇｄｏｌｕｓ ｆｒｙａｎｕｓ）ウェストウッド（Ｗｅｓｔｗｏｏｄ）（カミキリムシ）など、カミキリムシ科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）の甲虫類；及び限定はされないが、アファニスティクス・コキンキナエ・セミヌルム（Ａｐｈａｎｉｓｔｉｃｕｓ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎａｅ ｓｅｍｉｎｕｌｕｍ）オベンバーガー（Ｏｂｅｎｂｅｒｇｅｒ）（葉もぐりタマムシ）を含めたタマムシ科（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）の甲虫類を含めた甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）である。

一部の実施形態において、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシイベントは、追加的な形質のスタックを更に含み得る。ポリヌクレオチド配列のスタックを含む植物は、従来の育種方法によるか又は遺伝子工学的方法を介するかのいずれか一方又は両方によって入手することができる。それらの方法としては、限定はされないが、各々が目的のポリヌクレオチドを含む個別の系統を育種すること、本明細書に開示される遺伝子を含むトランスジェニック植物を後続の遺伝子で形質転換すること及び単一の植物細胞への遺伝子の同時形質転換が挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「スタックした」には、同じ植物に存在する複数の形質を有することが含まれる（即ち両方の形質とも核ゲノムに取り込まれるか、一方の形質が核ゲノムに取り込まれ、一方の形質がプラスチドのゲノムに取り込まれるか、又は両方の形質ともプラスチドのゲノムに取り込まれる）。

一部の実施形態において、単独での又は１つ以上の追加的な昆虫抵抗性形質とスタックした、本明細書に開示されるＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシイベントは、１つ以上の追加的な入力形質（例えば、除草剤抵抗性、真菌抵抗性、ウイルス抵抗性、ストレス耐性、病害抵抗性、雄性不稔、柄強度など）又は出力形質（例えば、収量の増加、加工デンプン、油プロファイルの向上、均衡のとれたアミノ酸、リジン又はメチオニン高値、消化性の増加、繊維品質の向上、耐乾性など）とスタックすることができる。このように、本実施形態を用いると、幾つもの作物栽培学的害虫を柔軟に且つコスト効率よく防除する能力のある、向上した作物品質の完全な作物栽培学的パッケージを提供することができる。

更なる実施形態において、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシイベントは、限定はされないが、米国特許第８，１０１，８２６号明細書、同第６，５５１，９６２号明細書、同第６，５８６，３６５号明細書、同第６，５９３，２７３号明細書及び国際公開第２０００／０１１１８５号パンフレットに開示されるＣｒｙ３Ｂ毒素；米国特許第８，２６９，０６９号明細書及び同第８，５１３，４９２号明細書に開示されるｍＣｒｙ３Ｂ毒素；米国特許第８，２６９，０６９号明細書、同第７，２７６，５８３号明細書及び同第８，７５９，６２０号明細書に開示されるｍＣｒｙ３Ａ毒素；又は米国特許第７，３０９，７８５号明細書、同第７，５２４，８１０号明細書、同第７，９８５，８９３号明細書、同第７，９３９，６５１号明細書及び同第６，５４８，２９１号明細書に開示されるＣｒｙ３４／３５毒素を含めた、１つ以上の追加的なＢｔ殺昆虫性毒素とスタックされ得る。更なる実施形態において、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシイベントは、これらのＢｔ殺昆虫性毒素及び他の抗甲虫目活性Ｂｔ殺昆虫性形質を含む１つ以上の追加的なトランスジェニックイベント、例えば、米国特許第７，７０５，２１６号明細書に開示されるイベントＭＯＮ８６３；米国特許第８，８８４，１０２号明細書に開示されるイベントＭＩＲ６０４；米国特許第９，１３３，４７４号明細書に開示されるイベント５３０７；米国特許第７，８７５，４２９号明細書に開示されるイベントＤＡＳ－５９１２２；米国特許第８，５７５，４３４号明細書に開示されるイベントＤＰ－４１１４；米国特許第９，４４１，２４０号明細書に開示されるイベントＭＯＮ ８７４１１；国際公開第２０１９／２０９７００号パンフレットに開示されるイベントＤＰ－２３２１１；及び米国特許第８，６８６，２３０号明細書に開示されるイベントＭＯＮ８８０１７（これらは、全て参照により本明細書に援用される）とスタックされ得る。一部の実施形態において、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシイベントは、ＭＯＮ－８７４２９－９（ＭＯＮ８７４２９イベント）；ＭＯＮ８７４０３；ＭＯＮ９５３７９；ＭＯＮ８７４２７；ＭＯＮ８７４１９；ＭＯＮ－００６０３－６（ＮＫ６０３）；ＭＯＮ－８７４６０－４；ＬＹ０３８；ＤＡＳ－０６２７５－８；ＢＴ１７６；ＢＴ１１；ＭＩＲ１６２；ＧＡ２１；ＭＺＤＴ０９Ｙ；ＳＹＮ－０５３０７－１；及びＤＡＳ－４０２７８－９とスタックされ得る。

一部の実施形態において、開示される組成物は、ゲノム編集技術を用いて植物のゲノムに導入することができるか、又は植物のゲノムに既に導入されているポリヌクレオチドが、ゲノム編集技術を用いて編集され得る。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどの二本鎖切断技術を用いて植物のゲノムにおける所望の位置に導入することができる。例えば、開示されるポリヌクレオチドは、部位特異的挿入のため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてゲノムにおける所望の位置に導入することができる。植物ゲノムにおける所望の位置は、育種に適しているゲノム領域など、挿入が所望される任意の標的部位であり得るか、又は既存の目的形質を含むゲノムウィンドウに位置する標的部位であり得る。既存の目的形質は、内因性形質又は以前に導入された形質のいずれである可能性もある。

一部の実施形態において、開示されるポリヌクレオチドが既にゲノムに導入されている場合、ゲノム編集技術を用いてその導入されたポリヌクレオチド配列を改変又は修飾し得る。開示される組成物に導入することのできる部位特異的修飾には、限定はされないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチド（例えば米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書）を利用するか、又はＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓなどの二本鎖切断技術を利用することを含め、部位特異的修飾を導入するための任意の方法を用いて作製されるものが含まれる。かかる技術を用いると、以前に導入されたポリヌクレオチドを、導入されたポリヌクレオチドの範囲内でのヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって修飾することができる。代わりに、二本鎖切断技術を用いて、導入されたポリヌクレオチドに追加的なヌクレオチド配列を付加することができる。付加し得る追加的な配列としては、エンハンサー及びプロモーター配列など、追加的な発現エレメントが挙げられる。別の実施形態において、ゲノム編集技術を用いることにより、殺昆虫性の活性があるタンパク質の分子スタックを作成するため、追加的な殺昆虫性の活性があるタンパク質を植物のゲノムの範囲内で本明細書に開示される本開示の組成物にごく近接して位置させ得る。

「改変された標的部位」、「改変された標的配列」、「修飾された標的部位」及び「修飾された標的配列」は、本明細書では同義的に使用され、非改変標的配列と比較したときに少なくとも１つの改変を含む本明細書に開示されるとおりの標的配列を指す。かかる「改変」には、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの交換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが含まれる。

一部の実施形態において、ＤＰ－９１５６３５－４イベントを含むコーン植物は、種子処理で処理され得る。一部の実施形態において、種子処理は、殺真菌剤、殺昆虫剤又は除草剤であり得る。

以下の例は、限定としてではなく、例示として提供される。

実施例１．ＩＰＤ０７９Ｅａをコードするコンストラクトを含むトランスジェニック植物のカセット設計
商業路線のイベントを生成するため分子スタックに使用されるＩＰＤ０７９Ｅａ発現用のカセット設計は、遺伝子試験形質転換実験における有効性及び発現に基づき選択した。多数の異なる調節エレメント（プロモーター、イントロン）及び他のエレメント（ターミネーター）を遺伝子試験実験で評価した。多数の異なる調節エレメントを使用して、収量及び形質有効性についての発現パターンを評価した。

選択したイベントコンストラクト、プラスミドＰＨＰ８３１７５のＴ－ＤＮＡ領域のＩＰＤ０７９Ｅａ遺伝子カセットに含まれる遺伝子エレメントを、表１に記載する。

実施例２．アグロバクテリウム形質転換によるトウモロコシの形質転換並びにＩＰＤ０７９、ＰＡＴ及びＰＭＩ遺伝子を含むトランスジェニック植物の再生
プラスミドＰＨＰ８３１７５によるアグロバクテリウム媒介性ＳＳＩ形質転換により、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシイベントを作製した。アグロバクテリウム媒介性ＳＳＩは、本質的に、米国特許出願公開第２０１７／０２４０９１１号明細書（本明細書において参照により援用される）に記載されるとおり実施した。

２７００個を超える未熟胚にＰＨＰ８３１７５を感染させた。１０５日間の選択及び再生工程の後、合計４６個のＴ０小植物が再生した。全てのＴ０小植物からＰＣＲ分析用に試料を採取し、挿入されたＩＰＤ０７９、ＰＭＩ及びｍｏ－ＰＡＴの存在及びコピー数を確かめた。この分析に加えて、Ｔ０小植物は、特定のアグロバクテリウムバイナリーベクター骨格配列の存在に関して且つ米国特許第７，５７９，５２９号明細書及び同第７，２５６，３２２号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に開示される発生遺伝子ｚｍ－ｏｄｐ２及びｚｍ－ｗｕｓ２に関して、ＰＣＲにより分析した。挿入遺伝子の単一コピーを含み、アグロバクテリウム骨格配列を含まず、且つ発生遺伝子を含まないと決定された植物を、更なる温室増殖に選択した。これらのＰＣＲ選択されたＴ０品質イベントからの試料を、サザン・バイ・シーケンシングを用いた更なる分析用に収集し、挿入された遺伝子が正しい標的遺伝子座にあり、いかなる遺伝子破壊もないことを確認した。トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４は、Ｔ－ＤＮＡの単一コピーを含むことが確認された（実施例３及び４を参照されたい）。これらの選択されたＴ０植物を形質有効性及びタンパク質発現に関してアッセイした。全ての基準を満たすＴ０植物を先に進め、近交系系統と交配させることにより、更なる試験用の種子を作製した。形質転換及びイベント開発の概略図を図４に提示する。

実施例３．トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４の同定
複数世代のトウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４に相当する葉組織、既知のコピー数の検量用対照、陰性対照供給源（遺伝子修飾されていないトウモロコシのＤＮＡ）及び鋳型無し対照（ＮＴＣ）からゲノムＤＮＡを単離し、イベント特異的及びコンストラクト特異的プライマー及びプローブを使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）増幅に供した。イベント特異的及びコンストラクト特異的アッセイを用いたＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析により、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシにおけるイベントＤＰ－９１５６３５－４並びにｉｐｄ０７９Ｅａ、ｐｍｉ及びｍｏ－ＰＡＴトランス遺伝子の定量化検出によって実証されるとおりの、試験した葉試料におけるプラスミドＰＨＰ８３１７５のＴ－ＤＮＡの単一コピーの安定した組込み及び分離が確認される。この実験を４回のレプリケートで繰り返すことにより、各イベント特異的及びコンストラクト特異的ＰＣＲ方法の信頼性を判定した。ＤＰ－９１５６３５－４からの様々な希釈度のゲノムＤＮＡを試験することにより、ＰＣＲ増幅の感度、即ち検出限界（ＬＯＤ）を評価した。

典型的な温室栽培条件下にセルに分割された平地でイベントＤＰ－９１５６３５－４を含むトウモロコシを２世代にわたって成長させた。各世代について約１００個の種子を植えた。

植物が成長段階Ｖ５～Ｖ９にあるとき、各健常植物から葉試料を収集した。試料は、各植物の輪生体から出ている最も若い葉から採取した。各植物について３片のパンチで打ち抜いた葉片について、Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ－Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）で成長させた種子からのＤＰ－９１５６３５－４イベント並びにｉｐｄ０７９Ｅａ、ｐｍｉ及びｍｏ－ＰＡＴトランス遺伝子に関するコピー数ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を通じて各イベントのゲノムジャンクション及びＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡのコピー数を分析した。葉試料からのゲノムＤＮＡ抽出は、高アルカリ抽出プロトコルを用いて実施した。標準的な臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）抽出プロトコルを用いて、葉組織からバリデート済みの実験室対照（コピー数検量用及び陰性）を調製した。

Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ゲノムＤＮＡ裏付け用の実験室対照を定量化した。ゲノム試験及び対照試料の定量化は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００／２０００ｃ Ｖ１．６．１９８ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用したＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計を使用して推定した。

ＤＰ－９１５６３５－４の葉組織から単離したゲノムＤＮＡ試料並びに対照試料を、ＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡの特異的領域並びにイベントＤＰ－９１５６３５－４の各挿入部位にわたるゲノムジャンクションにわたるイベント特異的及びコンストラクト特異的プライマー及びプローブを利用したリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。各アッセイで、各アッセイの定性的評価及び定量的評価の両方のため並びにＰＣＲ反応中に十分な質及び量のＤＮＡが存在することを実証するため、内因性参照遺伝子、高移動度グループＡ（ｈｍｇ－Ａ）（Ｋｒｅｃｈ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｇｅｎｅ ２３４：（１）４５－５０）を二重鎖で使用した。各プライマー／プローブセットのＰＣＲ標的部位及び予想されるＰＣＲ産物のサイズを表２に示す。各標的領域を裏付けるプライマー及びプローブ配列情報を表３に示す。ＰＣＲ試薬及び反応条件を表４に示す。この研究では、全てのＰＣＲ反応について、約３ｎｇのトウモロコシゲノムＤＮＡを使用した。

プラスミドＰＨＰ８３１７５からのＴ－ＤＮＡの範囲内にあるイベントＤＰ－９１５６３５－４の挿入部位並びにトランス遺伝子に相当するサイズ５７ｂｐ～１１３ｂｐの範囲のＰＣＲ産物を増幅し、イベントＤＰ－９１５６３５－４からの１００個の個別の葉試料並びに８個のコピー数検量用ゲノム対照において観察したが、８個の陰性ゲノム対照及び８個のＮＴＣ対照の各々には存在しなかった。各アッセイについて合計４回実施したが、観察された結果は同じであった。各試料及び全ての陽性対照についてＣ_Ｔ値を計算した。

トウモロコシ内因性参照遺伝子ｈｍｇ－Ａを使用して７９ｂｐのＰＣＲ産物を増幅し、イベントＤＰ－９１５６３５－４からの１００個の個別の葉試料各々並びに８個のコピー数検量用対照及び８個の陰性ゲノム対照において観察した。試験した８個の鋳型無し（ＮＴＣ）対照では、内因性遺伝子の増幅は観察されず、Ｃ_Ｔ値は求めなかった。各試料について、挿入部位及び全てのトランス遺伝子の両方を有する二重鎖で各アッセイを合計４回実施したが、各回とも、観察された結果は同じであった。各試料並びに全ての陽性及び陰性対照について、Ｃ_Ｔ値を計算した。

コンストラクト特異的ＰＣＲアッセイの感度を評価するため、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシＤＮＡを対照トウモロコシゲノムＤＮＡで希釈した結果、様々な量のイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡ（５ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、２５０ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、２０ｐｇ、１０ｐｇ、５ｐｇ）を含む合計５ｎｇのトウモロコシＤＮＡの試験試料が得られた。これらの様々な量のＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシＤＮＡは、全トウモロコシゲノムＤＮＡ中１００％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．４％、０．２％及び０．１％のＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシＤＮＡに相当する。この様々な量のＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡを、トランス遺伝子ｉｐ０７９Ｅａ、ＰＭＩ及びｍｏ－ＰＡＴに関するリアルタイムＰＣＲ増幅に供した。これらの分析に基づけば、イベントＤＰ－９１５６３５－４についての５ｎｇの全ＤＮＡにおける検出限界（ＬＯＤ）は、ｉｐ０７９Ｅａについて約２０ｐｇ、即ち０．４％、ｐｍｉについて２５０ｐｇ、即ち５％及びｍｏ－ｐａｔについて５ｐｇ、即ち０．１％（ＤＰ－９１５６３５－４）と決定された。記載される各アッセイの決定された感度は、多くのスクリーニング適用に十分である。各濃度について合計４回試験したが、各回とも、観察された結果は同じであった。

イベントＤＰ－９１５６３５－４についてのイベント特異的及びコンストラクト特異的プライマー／プローブセットを利用したイベントＤＰ－９１５６３５－４のリアルタイムＰＣＲ分析により、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシにおいてｉｐｄ０７９Ｅａ、ｐｍｉ及びｍｏ－ＰＡＴトランス遺伝子の定量化検出によって実証されるとおり、試験した葉試料におけるイベントのプラスミドＰＨＰ８３１７５のＴ－ＤＮＡの単一コピーの安定した組込み及び分離が確認される。これらの結果は、実施した全てのレプリケートｑＰＣＲ分析間で再現可能であった。ｈｍｇ－Ａを検出するためのトウモロコシ内因性参照遺伝子アッセイでは、全ての試験試料、陰性対照で予想どおり増幅され、且つＮＴＣ試料では検出されなかった。記載される条件下での各アッセイの感度は５ｐｇ～２５０ｐｇ ＤＮＡの範囲であり、いずれも、多くのＰＣＲによるスクリーニング適用に十分である。

実施例４．完全性及びコピー数に関するＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシのサザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）分析
サザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）は、プローブベースの配列捕捉、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技法及びバイオインフォマティクス手順を利用して、トウモロコシゲノム内にある挿入されたＤＮＡを単離、シーケンシング及び同定するものである。多数のユニークなシーケンシングリードをコンパイルし、それらを形質転換プラスミドと比較することにより、挿入されたＤＮＡに起因するユニークなジャンクションがバイオインフォマティクス解析で同定され、それを用いて植物ゲノム内にある挿入の数を決定することができる。ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシのＴ０植物をＳｂＳによって分析し、挿入コピー数を決定した。加えて、対照トウモロコシ系統の試料を分析した。

Ｔ０世代のＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ及び対照植物からゲノムＤＮＡを抽出した。

ＰＨＰ８３１７５プラスミド配列の選択に用いる捕捉プローブを設計し、Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）が合成した。捕捉プローブとしてのオーバーラップビオチン化オリゴヌクレオチドの設計には、プラスミド配列を包含する一連のユニークな配列を使用した。このプローブセットは、濃縮過程でＰＨＰ８３１７５形質転換プラスミド内にあるほとんどの配列を標的化するように設計した。これらのプローブをトウモロコシゲノムと比較することにより、ＰＨＰ８３１７５プラスミド配列と同時に捕捉され、シーケンシングされるであろうトウモロコシゲノム配列のレベルを決定した。

ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ植物及び対照トウモロコシ系統について、次世代シーケンシングライブラリを構築した。Ｚａｓｔｒｏｗ－Ｈａｙｅｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ（２０１５）により記載されるとおり、ＳｂＳを実施した。２ラウンドのハイブリダイゼーションを通じてシーケンシングライブラリを捕捉プローブにハイブリダイズさせることにより、標的配列を濃縮した。ＨｉＳｅｑ ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でのＮＧＳ後、シーケンシングリードを評価してトリミングし、クオリティを確かめた。トウモロコシゲノム及び形質転換コンストラクトに対してリードをアラインメントし、両方のゲノム及びプラスミド配列を含むリードをジャンクションリードと同定した。ジャンクションリードを形質転換コンストラクトとアラインメントすると、挿入されたＤＮＡの予想される挿入に対する相対的な境界が示される。

内因性トウモロコシ配列を含むジャンクションを同定するため、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ植物と同じように対照トウモロコシゲノムＤＮＡライブラリを捕捉し、シーケンシングした。これらのライブラリは、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ植物試料の深度の約５倍の平均深度までシーケンシングした。これにより、ＰＨＰ８３１７５プローブによって捕捉された内因性ジャンクションが対照試料において検出されるため、それらをＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ試料において同定し、除去することが可能となる確率が高くなった。

コンストラクトＰＨＰ８３１７５に由来するＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシにおいて、挿入の組込み及びコピー数を決定した。形質転換に使用したＰＨＰ８３１７５プラスミド及びＰＨＰ８３１７５からのＴ－ＤＮＡの概略的マップを図１及び図２に提供する。

ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシのＴ０植物に対してＳｂＳを行い、ゲノム中の挿入コピー数を決定した。ＳｂＳリードを予想挿入領域（ランディングパッドエレメントｚｍ－ＳＥＱ１５８及びｚｍ－ＳＥＱ１５９を含む；図３）とアラインメントしたところ、ゲノムフランキング配列とランディングパッドとの間に２つのユニークなジャンクションが得られた。ＦＲＴ１部位及びＦＲＴ６部位が、ＰＨＰ８３１７５からの標的形質遺伝子が部位特異的組込み（ＳＳＩ）ランディングパッドに組み込まれた２つの位置である。この植物において他にはＰＨＰ８３１７５配列とトウモロコシゲノムとの間のジャンクションは検出されなかったことから、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシに追加的なプラスミド由来の挿入は存在しないことが指摘される。加えて、ＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡの非隣接領域間のジャンクションは同定されなかったことから、挿入されたＤＮＡに検出可能な再配列又はトランケーションはないことが指摘される。更に、分析した植物にトウモロコシゲノム配列とＰＨＰ８３１７５の骨格配列との間のジャンクションはなかったことから、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシにプラスミド骨格配列が取り込まれなかったことが実証される。

ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシのＴ０植物のＳｂＳ分析により、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシにＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡからの所望の遺伝子を含む単一の挿入があること及びそれぞれのゲノムに追加的な挿入が存在しないことが実証された。

ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシのＴ０植物に対してサザン・バイ・シーケンシング（ＳｂＳ）分析を行うことにより、挿入コピー数を確認した。これらの結果からは、植物における単一のＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡ挿入が指摘される。対照植物にＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡ配列とトウモロコシゲノムとの間のジャンクションは検出されなかったことから、予想どおり、これらの植物がＰＨＰ８３１７５に由来するいかなる挿入も含まなかったことが指摘される。更に、分析した植物にプラスミド骨格配列は検出されなかった。ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシのＴ０植物のＳｂＳ分析により、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシにＰＨＰ８３１７５ Ｔ－ＤＮＡの単一の挿入があること及びそれぞれのゲノムに追加的な挿入が存在しないことが実証された。

５つの植物全てにおいて、予想される挿入配列と異なるｐｍｉカセットのｕｂｉＺＭ１プロモーターに、配列番号３２に示されるとおりの完全長インサート及びフランキング領域配列のｕｂｉＺＭ１プロモーターにおける単一のヌクレオチド変化、ｂｐ２９３１におけるＡからＣへの変化が同定された。この変化は５つの陽性植物全てにあるため、これは初期形質転換植物に存在すると決定された。配列番号３２の位置８１９９におけるＧからＡへの追加的な単一ヌクレオチド変化が、５つの植物中１つの植物のｏｓ－アクチンプロモーターに同定された；これが唯一の発生例であるため、育種過程における自然発生的な変化に起因する可能性が高い。５つの陽性植物からのリードを５つのプラスミドマップとアラインメントすると、意図される挿入に見出される遺伝子エレメントのカバー率が、挿入に取り込まれなかったプラスミド中の内因性エレメント（ｚｍ－ＳＥＱ１５８、ｚｍ－ＳＥＱ１５９、ｚｍ－Ｕ６ｐｏｌ ＩＩＩＣＨＲ８プロモーター及びターミネーター、ｚｍ－４５ＣＲ１ガイドＲＮＡ、Ｉｎ２－２プロモーター、ｚｍ－ｗｕｓ２及びｚｍ－ｏｄｐ２）のカバー率と共に示される。リードは、ＰＨＰ８３１７５、ＰＨＰ７３８７８、ＰＨＰ７０６０５及びＰＨＰ２１８７５において意図される挿入領域の外側に位置するｐｉｎＩＩターミネーターエレメントともアラインメントしたが、これらのエレメントは、挿入に取り込まれなかった。ｐｉｎＩＩターミネーターのこれらのコピーとアラインメントしたＮＧＳリードは、意図される挿入のｐｍｉカセットにｐｉｎＩＩターミネーターを含む断片からのものであるが；しかしながら、この単一コピーからのリードは、プラスミドマップ中のｐｉｎＩＩターミネーターの全てのコピーとアラインメントする。同様に、リードは、意図される挿入のｍｏ－ｐａｔカセットに同一のエレメントが存在するため、ＰＨＰ８３１７５におけるｍｏ－ＦｌｐカセットのＣａＭＶ ３５Ｓターミネーターエレメント並びにｚｍ－ｗｕｓ２カセットのｏｓ－アクチンプロモーター及びイントロン領域とアラインメントした。

実施例５．トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４の抗昆虫有効性
コーンルートワーム（ＣＲＷ）からの防御について、ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシを含めた複数のイベントを試験することにより、抗昆虫活性ＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質を含む一代雑種トウモロコシ系統を圃場で評価した。データは、線形混合モデルを用いて統計的に分析した。

北米の商業的トウモロコシ栽培地域にある１３地点で圃場試験を行った：サウスダコタ州ブルッキングズ（Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ，ＳＤ）（ＢＲ）；ミネソタ州マンケート（Ｍａｎｋａｔｏ，ＭＮ）（ＭＫ）；アイオワ州マリオン（Ｍａｒｉｏｎ，ＩＡ）（ＭＲ）；アイオワ州リードリン（Ｒｅａｄｌｙｎ，ＩＡ）（ＭＲ＿ＲＥ）；アイオワ州ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）（ＪＨ＿Ｄ２）；アイオワ州ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）（ＪＨ＿Ｄ３）；アイオワ州ギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ，ＩＡ）（ＪＨ＿ＧＢ）；ウィスコンシン州ウォータータウン（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＷＩ）（ＪＶ）；イリノイ州シャボナ（Ｓｈａｂｏｎｎａ，ＩＬ）（ＪＶ＿ＳＨ）；イリノイ州シーモア（Ｓｅｙｍｏｕｒ，ＩＬ）（ＣＩ＿ＳＥ）；インディアナ州ファウラー（Ｆｏｗｌｅｒ，ＩＮ）（ＷＮ）；ネブラスカ州ヨーク（Ｙｏｒｋ，ＮＥ）（ＹＫ）；及びネブラスカ州リンジー（Ｌｉｎｄｓｅｙ，ＮＥ）（ＹＫ＿ＬＩ）。これらの１３地点のうち、６地点では（実施場所ＪＨ＿ＧＢ、ＪＶ、ＪＶ＿ＳＨ、ＣＩ＿ＳＥ、ＹＫ及びＹＫ＿ＬＩ）、節根被害スコア（ＣＲＷＮＩＳ）が陰性対照根で０．７５未満と低かったため、有効性データは収集しなかった。

２反復の完備型乱塊法実験計画で１条植えの試験区（１０フィート長さ）に植付けを行った。植付け前に、各種子ロットからの１６８個の穀粒をＰＣＲ分析によって特徴付け、形質が存在することを確認した。トラクターに載せたＣＲＷ卵接種装置を利用して、各条４フィート長さに、植物がＶ２～Ｖ４成長段階に達したときの目標加害率を地点に応じて約７５０卵／植物又は１５００卵／植物として、手作業で加害させた。卵は、土壌中約４インチ深さで各植物の両側約２～３インチに注入した。植付け後５６～７１日に、幼虫食害による根の被害を判定した。２本のコーン根に標識を付け、手作業で地面から掘り起こし、加圧水で洗浄して土壌を落とし、約Ｒ２成長段階での幼虫による食害量を評価した。根部被害について、アイオワ州０～３節根被害尺度（ｎｏｄｅ－ｉｎｊｕｒｙ ｓｃａｌｅ）を用いて目視で評定し、各根部に含まれる幼虫による食害量を記録することにより判定した。

ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ及び対照トウモロコシの両方についてのＣＲＷによる節根被害根部評定平均値結果を表５に提供する。これらの結果から、抗昆虫活性ＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質を含むトウモロコシ系統がＣＲＷに対して有効であることが指摘される。

実施例６．トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４の作物栽培学及び収量圃場評価
ＤＰ－９１５６３５－４を含む作物栽培学圃場試験は、収量データを生成すること及び他の作物栽培学的特性を評価することであった。イベントに関して試験した全ての近交系及び交雑系材料は、単一のＴ０植物から生成した。

交雑系試験
交雑系試験について、１６地点において、各地点１反復のエントリーリストとして植付けを行った。１６地点中１２地点から穀粒を回収した。共通の背景の各エントリーを３つの試験品と交配して、試験用の交雑種子を作成した。実験は、試験品に関して枝分れにし、エントリーは各枝分れの範囲内で無作為化した。各植付け地点において、生育期全体を通じて様々な観察及びデータを収集した。野生型エントリー（ＷＴ）又は比較用基準とも称される、同じ遺伝学を有するが、ＩＰＤ０７９Ｅａのないエントリーと比較するため、以下の作物栽培学的特性を分析した（表７及び図５）：
１．）着雌穂高（ＥＡＲＨＴ）：植物上で地際から最上位にある発育した雌穂の着生節位までの測定値。着雌穂高はインチ単位で測定される。
２．）稈長（ＰＬＴＨＴ）：地際から止葉基部までのドローンによる計測値。稈長はインチ単位で測定される。
３．）水分（ＭＳＴ）：収穫時のパーセント穀粒水分の測定値。
４．）収量：各試験区から収穫された穀粒の重量記録。報告されるブッシェル／エーカー収量の計算は、各試験区の水分測定値で調整することにより行った。

近交系試験
近交系試験は、８地点において、各地点２反復のエントリーリストとして植付けを行った。分析用に７地点から穀粒を収穫した。各地点で一方の反復をコンストラクト設計に関して枝分れにした；他方の反復は、完備型乱塊法で植え付けた。近交系試験用に作物栽培学的データ及び観測を収集し、野生型エントリー（ＷＴ）又は同じ遺伝子型で形質のないバージョンとの比較のため分析した。近交系試験用に生成されたデータには、以下の作物栽培学的形質が含まれた（表８及び図６）：
１．）花粉飛散までの成長度日（ＧＤＵＳＨＤ）：測定値は、試験区の植物の５０％に花粉を飛散させている雄穂があるときの合計積算成長度日を記録する。このデータセットについて１日換算は約２．５成長度日である。
２．）着雌穂高（ＥＡＲＨＴ）：植物上の地際から最上位にある発育した雌穂の着生節位までの測定値。着雌穂高はインチ単位で測定される。
３．）稈長（ＰＬＴＨＴ）：地際から止葉基部までの測定値。稈長はインチ単位で測定される。
４．）雌穂測光法収量（ＰＨＴＹＬＤ）：各試験区から収穫された雌穂の画像からの計算上の収量推定値。示される値の単位はブッシェル／エーカーである。

試験結果
交雑系データを評価するため、混合モデルフレームワークを用いて多地点分析を実施した。この多地点分析では、主効果コンストラクト設計を固定効果と見なす。地点、背景、試験品、イベント、背景×コンストラクト設計、試験品×コンストラクト設計、試験品×イベント、地点×背景、地点×コンストラクト設計、地点×試験品、地点×背景×コンストラクト設計、地点×試験品×コンストラクト設計、地点×イベント、地点×試験品×イベントについての要因を変量効果と見なす。地点の範囲内にある範囲及び試験区を含む空間効果は変量効果と見なし、無関係な空間雑音を除去した。各地点について自己回帰相関をＡＲ１×ＡＲ１として不均一な残差を仮定した。各背景についてコンストラクト設計の推定及びイベントの予測を生成した。Ｔ検定を行うことにより、コンストラクト設計／イベントをＷＴと比較した。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。収量分析はＡＳＲＥＭＬによった（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；最良線型不偏予測；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂ．Ｒｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５４：１－１８，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００９）；ＡＳＲｅｍｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ３．０，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５１：１４４０－５０）。

近交系データを評価するため、混合モデルフレームワークを用いて多地点分析を実施した。この多地点分析では、主効果コンストラクト設計を固定効果と見なす。地点、背景、イベント、背景×コンストラクト設計、地点×背景、地点×コンストラクト設計、地点×背景×コンストラクト設計、地点×イベント及び地点内の反復数についての要因を変量効果と見なす。地点の範囲内にある範囲及び試験区を含む空間効果は変量効果と見なし、無関係な空間雑音を除去した。各地点について自己回帰相関をＡＲ１×ＡＲ１として不均一な残差を仮定した。各背景についてコンストラクト設計の推定及びイベントの予測を生成した。Ｔ検定を行うことにより、コンストラクト設計／イベントをＷＴと比較した。差のＰ値が０．０５未満であれば、その差は統計的に有意と見なした。収量分析はＡＳＲＥＭＬによった（ＶＳＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｔｄ；最良線型不偏予測；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｂ．Ｒｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５４：１－１８，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ（２００９）；ＡＳＲｅｍｌ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ３．０，Ｇｉｌｍｏｕｒ，Ａ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５１：１４４０－５０）。

実施例７．タンパク質発現及び濃度
タンパク質抽出
ＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質濃度の分析のため、処理した根組織サブ試料を２０ｍｇの目標重量で秤量した。ＰＡＴ及びＰＭＩタンパク質濃度の分析のため、処理した葉組織サブ試料を１０ｍｇの目標重量で秤量した。０．６０ｍｌのポリソルベート２０含有冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で試料を抽出した。抽出した試料を遠心し、次に上清を除去し、分析用に調製した。

ＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質濃度の決定
分析前に、試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。ＩＰＤ０７９Ｅａ特異的抗体を予めコートしたプレートにおいて、標準（典型的にはトリプリケートウェルで分析される）及び希釈した試料（典型的にはデュプリケートウェルで分析される）をインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流し、結合したＩＰＤ０７Ｅａタンパク質を、酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした別のＩＰＤ０７９Ｅａ特異的抗体と共にインキュベートした。未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＩＰＤ０７９Ｅａ－抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で有色産物を生成する基質を加えることによって達成した。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルの光学濃度（ＯＤ）を、プレートリーダーを使用して決定した。

ＰＡＴタンパク質濃度の決定
分析前に、試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。別のＰＡＴ特異的抗体を予めコートしたプレートにおいて、標準（典型的にはトリプリケートウェルで分析される）及び希釈した試料（典型的にはデュプリケートウェルで分析される）を、酵素ＨＲＰにコンジュゲートしたＰＡＴ特異的抗体とコインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＰＡＴ－抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で有色産物を生成する基質を加えることによって達成した。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルのＯＤを、プレートリーダーを使用して決定した。

ＰＭＩタンパク質濃度の決定
分析前に、試料をＰＢＳＴで適宜希釈した。ＰＭＩ特異的抗体を予めコートしたプレートにおいて、標準（典型的にはトリプリケートウェルで分析される）及び希釈した試料（典型的にはデュプリケートウェルで分析される）をインキュベートした。インキュベーション後、未結合の物質をプレートから洗い流し、結合したＰＭＩタンパク質を、酵素ＨＲＰにコンジュゲートした別のＰＭＩ特異的抗体と共にインキュベートした。未結合の物質をプレートから洗い流した。結合したＰＭＩ－抗体複合体の検出は、ＨＲＰの存在下で有色産物を生成する基質を加えることによって達成した。酸性溶液で反応を停止させて、各ウェルのＯＤを、プレートリーダーを使用して決定した。

タンパク質濃度を決定するための計算
各一組の試料ウェルについて入手されたＯＤ値をタンパク質濃度値に変換するために必要な計算は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートデータソフトウェアを使用して実施した。

各ＥＬＩＳＡプレートには、検量線を含めた。検量線の方程式をソフトウェアによって求め、このソフトウェアは二次関数の当てはめを用いて各一組の検量線ウェルについて入手されたＯＤ値をそれぞれの検量線濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関係付けるものであった。
調整後濃度＝補間した試料濃度×希釈係数

ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ＧｘＰソフトウェアによって求められた調整後試料濃度値を以下のとおりｎｇ／ｍｌからｎｇ／ｍｇ試料重量に変換した。

結果
２世代のＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシからのＶ９根組織中のＩＰＤ０７９Ｅａタンパク質並びにＶ９葉組織中のＰＡＴ及びＰＭＩタンパク質について、タンパク質濃度結果（平均値、標準偏差及び範囲）を決定した。

本開示の様々な例示される実施形態の上記の説明は、網羅的であること又は範囲を開示される詳細な形態に限定することを意図するものではない。本明細書では、具体的な実施形態及び例が例示を目的として説明されているが、当業者が認識するであろうとおり、本開示の範囲内で様々な均等な改良形態が可能である。本明細書に提供される教示は、上記に説明される例以外の他の目的に適用することができる。上記の教示に鑑みて、多くの改良形態及び変形形態が可能であり、従って、それらは、添付の特許請求の範囲内にある。

上記の詳細な説明に鑑みて、これら及び他の変更形態がなされ得る。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態にその範囲を限定するものと解釈されてはならない。

背景、詳細な説明及び実施例において引用される各文献の開示全体（特許、特許出願、ジャーナル論文、抄録、マニュアル、書籍又は他の開示を含む）は、全体として参照により本明細書に援用される。

使用される数（例えば、量、温度、濃度等）に関して、正確さを確保するように努めたが、幾らかの実験誤差及び偏差が許容されなければならない。特に指示されない限り、部数は、重量部数であり、分子量は、平均分子量であり；温度は、セルシウス度単位であり；及び圧力は、大気圧又はその近傍の圧力である。

Claims (55)

1. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型は、配列番号２６及び配列番号２９に示されるとおりのヌクレオチド配列を含む、コーン植物。
2. 前記遺伝子型は、配列番号２７及び配列番号３０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のコーン植物。
3. 前記遺伝子型は、配列番号２８及び配列番号３１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のコーン植物。
4. 作動可能に連結された第１及び第２の発現カセットを含むＤＮＡコンストラクトであって、前記第１の発現カセットは、
   １）ｓｂ－ＲＣｃ３エンハンサー
   ２）ｚｍ－ＰＣＯａプロモーター；
   ３）ｚｍ－ＨＰＬＶ９イントロン；
   ４）ｉｐｄ０７９Ｅａ；及び
   ５）ｓｂ－ＳＣＩ－１Ｂターミネーター
   を含む、ＤＮＡコンストラクト。
5. 請求項４に記載のＤＮＡコンストラクトを含む植物。
6. コーン植物である、請求項５に記載の植物。
7. 配列番号２１に示される配列を含む植物。
8. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４であって、前記コーンイベントの種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２６７４６として寄託されている、コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４。
9. 請求項８に記載のコーンイベントの植物部位。
10. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４を含む種子であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択されるＤＮＡ分子を含み、前記コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２６７４６として寄託されている、種子。
11. 請求項１０に記載の種子から成長したコーン植物又はその部位。
12. 請求項８に記載のコーン植物から作製されたトランスジェニック種子。
13. 請求項１２に記載の種子から成長したトランスジェニックコーン植物又はその部位。
14. 配列番号２１及び２６～３１並びにその完全長相補体から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
15. 配列番号２２～２５及びその完全長相補体から選択される核酸配列を含むアンプリコン。
16. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４植物、組織又は種子に由来する生物学的試料であって、配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記試料中で検出可能であり、前記コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２６７４６として寄託されている、生物学的試料。
17. トランスジェニックコーンイベントＤＰ－９１５６３５－４の植物、植物組織又は種子を含む、請求項１６に記載の生物学的試料。
18. 前記トランスジェニックコーン植物イベントＤＰ－９１５６３５－４から抽出されたＤＮＡ試料であり、前記ＤＮＡ試料は、配列番号２１～３１及びその相補体から選択されるヌクレオチド配列の１つ以上を含む、請求項１７に記載の生物学的試料。
19. コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される、請求項１６に記載の生物学的試料。
20. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４植物、組織又は種子に由来し、且つ配列番号２６及び配列番号２９から選択される配列であるか又はそれと相補的であるヌクレオチド配列を含む抽出物であって、前記コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４種子の代表的試料は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ－１２６７４６として寄託されている、抽出物。
21. 前記ヌクレオチド配列は、核酸増幅法又は核酸ハイブリダイゼーション法を使用して前記抽出物中で検出可能である、請求項２０に記載の抽出物。
22. トランスジェニックコーン植物イベントＤＰ－９１５６３５－４の植物、植物組織又は種子を含む、請求項２１に記載の抽出物。
23. コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーンオイル、コーンスターチ及び全体的又は部分的にコーン副産物を含有するように製造されたシリアルから選択される組成物であり、前記組成物は、検出可能な量の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の抽出物。
24. 交雑系コーン種子を作製する方法であって、
    ａ）配列番号２１～３１から選択されるヌクレオチドを含む第１の近交系コーン系統と、異なる遺伝子型を有する第２の近交系系統とを有性交配すること；
    ｂ）前記交配から後代を成長させること；及び
    ｃ）それにより作製された前記交雑系種子を収穫すること
    を含む方法。
25. 前記第１の近交系コーン系統は、雌親である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記第１の近交系コーン系統は、雄親である、請求項２４に記載の方法。
27. 甲虫目害虫に対して抵抗性のコーン植物を作製する方法であって、
    ａ）第１の親コーン植物を第２の親コーン植物と有性交配することであって、前記第１又は第２の親コーン植物は、イベントＤＰ－９１５６３５－４を含む、有性交配することを行い、それにより複数の第１世代後代植物を作製すること；
    ｂ）前記第１世代後代植物を自殖させ、それにより複数の第２世代後代植物を作製すること；及び
    ｃ）前記イベントＤＰ－９１５６３５－４を含み、且つ甲虫目害虫に対して抵抗性のある前記第２世代後代植物から選択すること
    を含む方法。
28. 交雑系コーン種子を作製する方法であって、
    ａ）請求項１に記載のＤＮＡコンストラクトを含む第１の近交系コーン系統を、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクトを含まない第２の近交系系統と有性交配すること；及び
    ｂ）それにより作製された前記交雑系種子を収穫すること
    を含む方法。
29. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４を含む第２世代後代植物を、前記コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡを欠く前記親植物と戻し交配し、それにより甲虫目害虫に対して抵抗性のある戻し交配後代植物を作製するステップを更に含む、請求項２８に記載の方法。
30. コーンルートワームに対して抵抗性のコーン植物を作製する方法であって、
    ａ）第１の親コーン植物を第２の親コーン植物と交配させることであって、前記第１又は第２の親コーン植物は、イベントＤＰ－９１５６３５－４を含む、交配させることを行い、それにより複数の第１世代後代植物を作製すること；
    ｂ）前記イベントＤＰ－９１５６３５－４を含む第１世代後代植物を選択すること；
    ｃ）ステップ（ｂ）の前記第１世代後代植物を、コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡを欠く親植物と戻し交配し、それにより複数の戻し交配後代植物を作製すること；及び
    ｄ）前記戻し交配後代植物から、前記イベントＤＰ－９１５６３５－４を含む植物を選択すること
    を含み、ステップ（ｄ）の前記選択された戻し交配後代植物は、配列番号２１、２６又は２９を含む、方法。
31. 前記第１の親コーン系統の前記植物は、雌親又は雄親である、請求項３０に記載の方法。
32. 請求項３０に記載の方法によって作製される交雑系種子。
33. 生物学的試料中における、イベントＤＰ－９１５６３５－４を含むコーン植物の接合性を決定する方法であって、
    ａ）前記試料を、
    １）コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡを含む核酸増幅反応において使用されるとき、イベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となる第１のアンプリコンを産生し、及び
    ２）ＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡを含む核酸増幅反応において使用されるとき、ＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡ以外のコーンゲノムＤＮＡの診断指標となる第２のアンプリコンを産生する
    ような第１のＤＮＡ分子対及び第２の別個のＤＮＡ分子対に接触させること；
    ｂ）核酸増幅反応を実施すること；及び
    ｃ）そのように産生された前記アンプリコンを検出することであって、両方のアンプリコンの存在の検出は、前記試料がコーンイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡに関してヘテロ接合性であることを指示し、前記第１のアンプリコンのみの検出は、前記試料がコーンイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡに関してホモ接合性であることを指示する、検出すること
    を含む方法。
34. 前記第１のＤＮＡ分子対は、プライマー対配列番号６及び７を含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記第１及び第２のＤＮＡ分子対は、検出可能標識を含む、請求項３３に記載の方法。
36. 前記検出可能標識は、蛍光標識である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記検出可能標識は、プライマー分子の１つ以上と共有結合的に会合される、請求項３５に記載の方法。
38. コーン核酸を含む試料中における、イベントＤＰ－９１５６３５－４にユニークな核酸分子の存在を検出する方法であって、
    ａ）前記試料を、プライマー対であって、イベントＤＰ－９１５６３５－４からのゲノムＤＮＡによる核酸増幅反応において使用されるとき、イベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となるアンプリコンを産生するプライマー対に接触させること；
    ｂ）核酸増幅反応を実施し、それによりイベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となる前記アンプリコンを産生すること；及び
    ｃ）イベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となる前記アンプリコンを検出すること
    を含む方法。
39. イベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となる前記核酸分子は、前記核酸増幅連鎖反応によって産生されるアンプリコンである、請求項３８に記載の方法。
40. プローブは、検出可能標識を含む、請求項３８に記載の方法。
41. 前記検出可能標識は、蛍光標識である、請求項４０に記載の方法。
42. 前記検出可能標識は、前記プローブと共有結合的に会合される、請求項４０に記載の方法。
43. ポリメラーゼ連鎖反応法の結果として、イベントＤＰ－９１５６３５－４の診断指標となるアンプリコンを産生するために、試料中のイベントＤＰ－９１５６３５－４ ＤＮＡ鋳型を標的化する１つ以上のポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチドプライマー。
44. ａ）第１のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号６に示されるとおりのヌクレオチド配列及びその相補体を含み；及び
    ｂ）第２のポリヌクレオチドプライマーは、配列番号７に示されるとおりのヌクレオチド配列及びその相補体を含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチドプライマー対。
45. 第１のプライマー及び第２のプライマーは、少なくとも１８ヌクレオチドである、請求項４３に記載のプライマー対。
46. 試料中における、イベントＤＰ－９１５６３５－４に対応するＤＮＡの存在を検出する方法であって、
    ａ）トウモロコシＤＮＡを含む前記試料を、ポリヌクレオチドプローブであって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、トウモロコシイベントＤＰ－９１５６３５－４からのＤＮＡとハイブリダイズし、且つ前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、非ＤＰ－９１５６３５－４トウモロコシ植物ＤＮＡとハイブリダイズしないポリヌクレオチドプローブに接触させること；
    ｂ）前記試料及びプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること；及び
    ｃ）前記ＤＮＡへの前記プローブのハイブリダイゼーションを検出すること
    を含み、ハイブリダイゼーションの検出は、イベントＤＰ－９１５６３５－４の存在を指示する、方法。
47. 核酸検出方法においてプライマー又はプローブとして機能するのに十分な長さの隣接するポリヌクレオチドの少なくとも１つの核酸分子を含む、イベントＤＰ－９１５６３５－４にユニークな核酸を検出するためのキットであって、前記核酸は、試料中の標的核酸配列の増幅又はそれとのハイブリダイゼーション、それに続くアンプリコンの検出又は前記標的配列とのハイブリダイゼーション時、前記試料中における、イベントＤＰ－９１５６３５－４にユニークな核酸配列の存在の診断指標となる、キット。
48. 前記核酸分子は、配列番号６～３１からのヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載のキット。
49. 前記核酸分子は、配列番号６～３１及びその相補体から選択されるプライマーである、請求項４７に記載のキット。
50. コーンイベントＤＰ－９１５６３５－４の遺伝子型を含むコーン植物であって、前記遺伝子型は、配列番号２６及び配列番号２９と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、コーン植物。
51. 前記遺伝子型は、配列番号２７及び配列番号３０と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載のコーン植物。
52. 前記遺伝子型は、配列番号２８及び配列番号３１と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載のコーン植物。
53. 前記遺伝子型は、配列番号２６又は配列番号２７の一方に１、２、３、４又は５ヌクレオチドの変化を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５０に記載のコーン植物。
54. シダ由来の殺昆虫性タンパク質を発現し、且つコーンルートワームに対して殺昆虫活性を呈する細菌タンパク質との組み合わせにおいて、コーンルートワームに対して少なくとも約０．１５の節根被害根部評定平均値を呈し、且つ任意選択で、コーンルートワームの内因性遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを発現するコーン植物であって、前記殺昆虫性タンパク質、前記細菌殺昆虫性タンパク質及び前記ｄｓＲＮＡは、異なる作用様式を示す、コーン植物。
55. ウエスタンコーンルートワームに対する３つの別個の作用様式を発現するコーン植物であって、少なくとも２つの様式は、細菌に由来しない殺昆虫性タンパク質に起因する、コーン植物。
    

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