KR20230019149A - 옥수수 이벤트 dp-915635-4 및 이의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에 개시된 구현예는 식물 분자 생물학 분야, 구체적으로 식물에 곤충 저항성을 부여하기 위한 DNA 구축물에 관한 것이다. 본원에 개시된 구현예는 이벤트 DP-915635-4를 함유하는 곤충 저항성 옥수수 식물, 및 샘플 및 이의 조성물에서 이벤트 DP-915635-4의 존재를 검출하기 위한 분석법에 관한 것이다.
Description
전자적으로 제출된 서열 목록의 참조
본 서열 목록의 공식 사본은 2020년 11월 13일 작성되고 크기가 202 킬로바이트이며 본 명세서와 동시에 제출된, 파일명 "8425_SeqList.txt"의 ASCII 형식의 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되었다. 이러한 ASCII 형식의 서류에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본원에 개시된 구현예는 식물에 곤충 저항성을 부여하기 위한 DNA 구축물을 포함하는 식물 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 본원에 개시된 구현예는 또한 이벤트 DP-915635-4를 함유하는 곤충 저항성 옥수수 식물 및 샘플 및 이의 조성물에서 이벤트 DP-915635-4의 존재를 검출하기 위한 분석법을 포함한다.
옥수수는 중요한 작물이며 세계 여러 지역에서 주요 식품 공급원이다. 해충에 의한 피해는 화학 살충제와 같은 보호 수단을 사용함에도 불구하고 세계 옥수수 작물 손실의 주요 요인이다. 이를 고려하여 곤충 저항성은 곤충에 의한 피해를 제어하고 전통적인 화학 살충제의 필요성을 줄이기 위해 옥수수와 같은 작물에 유전자 조작되었다. 형질전환 곤충 저항성 작물 생산에 사용되어온 유전자군 중 하나는 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis, Bt)의 델타-내독소군이다. 델타-내독소는 옥수수뿐만 아니라 목화, 감자, 벼, 해바라기와 같은 작물에서 성공적으로 발현되었으며 특정 상황에서 해충에 대한 탁월한 통제력을 제공하는 것으로 입증되었다. (Perlak, F.J et al. (1990) Bio/Technology 8:939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:313-321; Fujimoto, H. et al. (1993) Bio/Technology 11:1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18:1101-1104; PCT 공개 제WO 01/13731호; 및 Bing, J.W. et al. (2000) Efficacy of Cry1F Transgenic Maize, 14th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, CO).
식물에서 이식유전자의 발현은 관심 개별 유전자의 발현을 유도하는 카세트의 방향과 구성 및 식물 게놈의 위치를 포함한 여러 다양한 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있는데, 이는 아마도 염색질 구조(예를 들어, 이종염색질) 때문이거나 통합 부위에 가까운 전사 조절 요소(예를 들어, 인핸서)의 근접성 때문이다(Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477).
유성 교배의 자손이 관심 이식유전자를 포함하는지를 결정하기 위해 특정 이벤트의 존재를 검출할 수 있는 것이 유리할 것이다.
예를 들어, 핵산 프로브를 사용하는 DNA 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 핵산 검출 방법에 의해 이식유전자의 존재를 검출하는 것이 가능하다. 이러한 검출 방법은 일반적으로 프로모터, 터미네이터, 마커 유전자 등과 같이 자주 사용되는 유전 요소에 초점을 맞추는데, 많은 DNA 구축물의 경우 암호화 영역이 상호 교환 가능하기 때문이다. 결과적으로, 이러한 방법은 삽입된 이종 DNA에 인접한 플랭킹 DNA의 DNA 서열이 알려져 있지 않은 한, 특히 동일한 DNA 구축물 또는 매우 유사한 구축물을 사용하여 생성된 상이한 이벤트를 구별하는 데 유용하지 않을 수 있다.
구현예는 "옥수수 계통 DP-915635-4", "옥수수 이벤트 DP-915635-4" 및 "DP-915635-4 옥수수"로도 지칭되는 곤충 저항성 옥수수(제아 메이스(Zea mays)) 식물 이벤트 DP-915635-4, 옥수수 식물 이벤트 DP-915635-4의 DNA 식물 발현 구축물 및 옥수수 식물 이벤트 DP-915635-4 및 이의 자손에서 이식유전자 구축물, 플랭킹 및 삽입(표적 유전자좌) 영역의 검출을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
일 양태에서 조성물 및 방법은 곤충 저항성 외떡잎 작물을 생산하고 선택하는 방법에 관한 것이다. 조성물은 식물 세포 및 식물에서 발현될 때 곤충에 대한 저항성을 부여하는 DNA 구축물을 포함한다. 일 양태에서, 식물 세포 및 식물에서 발현될 때 식물 세포 및 식물에 곤충 저항성을 부여하는, 숙주 세포 내로의 도입 및 숙주 세포 내 복제가 가능한 DNA 구축물이 제공된다. 옥수수 이벤트 DP-915635-4는 플라스미드 PHP83175를 이용한 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질전환에 의해 생성되었다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 이벤트는 특정 딱정벌레목(Coleopteran) 식물 해충에 대한 저항성을 부여하는 IPD079Ea(폴리뉴클레오티드 서열번호 4 및 아미노산 서열번호 5) 카세트(표 1)를 포함한다. 곤충 방제 성분은 딱정벌레목 곤충 종, 특히 서부 옥수수 뿌리벌레(WCR)에 대한 효능을 입증했다.
제1 카세트는 Ophioglossum pendulum의 살충 단백질 유전자 IPD079Ea를 포함한다(국제 특허 출원 공개 제WO 2017023486호). 식물에서 발현된 IPD079Ea 단백질은 특정 딱정벌레목 해충에 대해 효과적이다. IPD079Ea 단백질은 길이가 479개 아미노산이고 분자량이 약 52 kDa이다. IPD079Ea 유전자의 발현은 수수(Sorghum bicolor) 뿌리 피질 RCc3(sb-RCc3) 유전자(국제 특허 출원 공개 제WO 2012112411호)로부터 뿌리 특이적 활성을 나타내는 인핸서 영역에 이어, 뿌리 특이적 활성을 갖는 것으로 확인된 제아 메이스 PCO118362 mRNA 서열(zm PCOa)의 상류의 프로모터 영역(국제 특허 출원 공개 제WO 2017222821호) 및 예측된 제아 메이스 칼모듈린 5 유전자인, 벼(Oryza sativa) 가설 단백질(zm-HPLV9) 유전자(Phytozome 유전자 ID Zm00008a029682; 국제 특허 출원 공개 제WO 2016109157호)의 제아 메이스 오르토로그로부터의 인트론 영역의 3개 카피에 의해 조절된다. IPD079Ea 유전자에 대한 터미네이터는 수수(Sorghum bicolor) 서브틸리신-키모트립신 억제제 1B(sb-SCI-1B) 유전자의 터미네이터 영역이다(국제 특허 출원 공개 제WO 2018102131호). 전사 간섭을 방지하기 위해 3개의 추가 터미네이터가 존재한다: 옥수수 W64 계통 27 kDa 감마 제인(Z27G) 유전자의 터미네이터 영역(Das et al., 1991; Liu et al., 2016), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유비퀴틴 14(UBQ14) 유전자의 터미네이터 영역(Callis et al., 1995), 및 옥수수 In2-1 유전자의 터미네이터 영역(Hershey and Stoner, 1991).
제2 유전자 카세트(mo-pat 유전자 카세트)는 스트렙토미세스 비리도크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes)의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(mo-pat)를 포함한다(Wohlleben et al., 1988). mo-pat 유전자는 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(PAT) 효소를 발현한다. PAT 단백질은 길이가 183개 아미노산이고 분자량이 약 21 kDa이다. mo-pat 유전자의 발현은 CaMV35S 터미네이터의 제3 카피와 함께, 오리자 사티바(Oryza sativa)(쌀) 액틴(os-actin) 유전자(GenBank 수탁번호 CP018159)의 프로모터 및 인트론 영역에 의해 제어된다. 전사 간섭을 방지하기 위해 2개의 추가 터미네이터가 존재한다: 각각 소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor)(수수) 유비퀴틴(sb-ubi) 유전자(Phytozome 유전자 ID Sobic.004G049900.1) 및 γ-카파린(sb-gkaf) 유전자(de Freitas et al., 1994)의 터미네이터 영역.
제3 유전자 카세트(pmi 유전자 카세트)는 대장균(Escherichia coli)의 포스포만노스 이성질화효소(pmi) 유전자를 포함한다(Negrotto et al., 2000). 식물에서 PMI 단백질의 발현은 만노스를 탄소원으로 하여 식물 조직 성장을 가능하게 하는 선택 마커 역할을 한다. PMI 단백질은 길이가 391개 아미노산이고 분자량이 약 43 kDa이다. PHP74643의 T-DNA 영역에 존재하는 pmi 유전자에는 프로모터가 없지만, 이는 플립파제 재조합 표적 부위인 FRT1 옆에 위치하여 적절하게 배치된 프로모터에 의한 재조합 후 발현이 가능하다. pmi 유전자의 터미네이터는 pinII 터미네이터의 제4 카피이다. 추가 Z19 터미네이터는 카세트 간의 전사 간섭을 방지하기 위한 것이다.
일부 구현예에 따르면, DP-915635-4(ATCC 수탁번호 PTA-126746)로 지정된 신규 옥수수 식물을 확인하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 방법은 DP-915635-4의 5' 및/또는 3' 플랭킹 서열을 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브를 기반으로 한다. PCR 반응에서 이용될 때 형질전환 이벤트 DP-915635-4에 고유한 앰플리콘을 생성할 프라이머 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공된다. 일 구현예에서, 이들 분자를 포함하는 옥수수 식물 및 종자가 고려된다. 또한, DP-915635-4 이벤트를 확인하기 위해 이러한 프라이머 서열을 사용하는 키트가 제공된다.
일부 구현예는 생물학적 샘플에서 DP-915635-4에 대한 확인 방법을 개발하는 데 사용될 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 DP-915635-4의 특정 플랭킹 서열에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 특정 프라이머 및 프로브의 개발에 사용될 수 있는 DP-915635-4의 5' 및/또는 3' 플랭킹 영역에 관한 것이다. 추가 구현예는 이러한 특정 프라이머 또는 프로브의 사용을 기반으로 생물학적 샘플에서 DP-915635-4의 존재에 대한 확인 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에 따르면, 샘플에서 옥수수 이벤트 DP-915635-4에 해당하는 DNA의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 (a) 각각 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 옥수수로부터 추출된 게놈 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용될 때 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 특징적인 앰플리콘을 생성하는 DNA 프라이머 세트가 있는 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 프라이머 세트는 서열번호 6과 7 및 선택적으로 서열번호 8을 포함하는 프로브를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 샘플에서 DP-915635-4 이벤트에 해당하는 DNA 분자의 존재를 검출하는 방법은 (a) 엄격한 혼성화 조건 하에서 옥수수 이벤트 DP-915635-4로부터 추출된 DNA와 혼성화하고 엄격한 혼성화 조건 하에서 대조군 옥수수 식물 DNA와 혼성화하지 않는 DNA 프로브 분자와 옥수수 식물로부터 추출된 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및 (c) 옥수수 이벤트 DP-915635-4로부터 추출된 DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 샘플에서 DP-915635-4 이벤트에 해당하는 DNA 분자의 존재를 검출하는 방법은 (a) 옥수수 식물에서 추출된 DNA를 포함하는 샘플을 이벤트에 고유한 서열, 예를 들어, 접합부 서열을 포함하는 DNA 프로브 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 상기 DNA 프로브 분자는 엄격한 혼성화 조건 하에서 옥수수 이벤트 DP-915635-4로부터 추출된 DNA와 혼성화하고 엄격한 혼성화 조건 하에서 대조군 옥수수 식물 DNA와 혼성화하지 않는 것인, 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계로 구성된다.
또한, DP-915635-4 특정 영역을 검출하는 생물학적 샘플에서 이벤트 DP-915635-4를 확인하기 위한 키트 및 방법이 제공된다.
DP-915635-4의 적어도 하나의 접합부 서열을 포함하는 DNA 분자가 제공되며; 여기서 접합부 서열은 게놈에 삽입된 이종 DNA와 삽입 부위 측면에 있는 옥수수 세포의 DNA 사이에 위치한 접합부에 걸쳐 있으며 DP-915635-4 이벤트에 대해 특징적일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 곤충 저항성 옥수수 식물을 생산하는 방법은 (a) 곤충에 대한 저항성을 부여하는 본원에 개시된 발현 카세트를 포함하는 제1 모 옥수수 계통 및 이러한 발현 카세트가 결여된 제2 모 옥수수 계통을 유성 교배시켜 복수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (b) 곤충 저항성이 있는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 선택적으로 자손 식물을 제2 모 옥수수 계통에 역교배시켜 곤충 저항성인 순수 육종(true-breeding) 옥수수 식물을 생산하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예는 곤충 저항성인 옥수수 식물을 생산하는 방법으로, 옥수수 세포를 DNA 구축물 PHP74643으로 형질전환시키고, 형질전환된 옥수수 세포를 옥수수 식물로 성장시키고, 곤충에 저항성을 나타내는 옥수수 식물을 선택하고, 옥수수 식물을 번식력이 있는 옥수수 식물로 추가로 성장시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 번식력 있는 옥수수 식물은 자가수분되거나 적합한 옥수수 품종과 교배되어 곤충 저항성 자손을 생산할 수 있다.
일부 구현예는 추가로 생물학적 샘플에서 옥수수 이벤트 DP-915635-4를 확인하기 위한 DNA 검출 키트에 관한 것이다. 키트는 각각 DP-915635-4의 5' 또는 3' 플랭킹 영역을 특이적으로 인식하는 제1 프라이머 및 DP-915635-4의 비천연 표적 유전자좌 DNA 내의 서열 또는 PCR 확인 프로토콜에 사용하기 위한 플랭킹 DNA 내의 서열을 특이적으로 인식하는 제2 프라이머를 포함한다. 추가 구현예는 생물학적 샘플에서 이벤트 DP-915635-4를 확인하기 위한 키트에 관한 것으로, 키트는 이벤트 DP-915635-4의 특정 영역과 약 80% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 서열에 상응하거나 이에 상보적인 서열을 갖는 특정 프로브를 포함한다. 프로브의 서열은 이벤트 DP-915635-4의 5' 또는 3' 플랭킹 영역의 일부를 포함하는 특정 영역에 상응한다. 일부 구현예에서, 제1 또는 제2 프라이머는 서열번호 6~7, 9~10, 12~13, 15~16, 또는 18~19 중 임의의 하나를 포함한다.
본원에 개시된 구현예에 포함되는 방법 및 키트는 다음과 같은 다양한, 그러나 이에 한정되지 않는 목적을 위해 사용될 수 있다: 식물, 식물성 물질 또는 식물성 물질을 포함하거나 식물성 물질로부터 유래된 식품 또는 사료 제품(신선 또는 가공)과 같은 제품(이에 한정되지 않음)에서 이벤트 DP-915635-4를 확인하기 위해; 추가로 또는 대안적으로, 방법 및 키트는 형질전환 및 비형질전환 물질 사이의 분리 목적을 위해 형질전환 식물 물질을 확인하는데 사용될 수 있다; 추가로 또는 대안적으로, 방법 및 키트는 옥수수 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 식물성 물질의 품질을 결정하는 데 사용될 수 있다. 키트에는 검출 방법을 수행하는 데 필요한 시약 및 물질도 포함될 수 있다.
추가 구현예는 DP-915635-4 옥수수 식물 또는 옥수수 식물 DP-915635-4의 꽃가루, 배주, 영양 세포, 꽃가루 세포의 핵 및 난 세포의 핵을 포함하나 이에 한정되지 않는 이의 부분 및 이로부터 유래된 자손에 관한 것이다. 또 다른 구현예에서, DP-915635-4의 옥수수 식물 및 종자를 표적으로 하는 DNA 프라이머 분자는 특정 앰플리콘 생성물을 제공한다.
도 1. 유전 요소가 표시된 플라스미드 PHP83175의 개략도를 도시한 것이다. 플라스미드 크기는 74,997 bp(서열번호 1)이다.
도 2. 6개의 유전자 카세트를 나타내는 T-DNA의 개략도를 도시한 것이다. T-DNA를 사용하여 FRT1 및 FRT6 부위를 포함하는 사전 특성화된 옥수수 계통을 형질전환시켰다. T-DNA에서 FRT1과 FRT6 부위 사이의 pmi 유전자, mo-pat 유전자 및 ipd079Ea 유전자를 포함하는 영역은 위치 특이적 방식으로 옥수수 계통에 통합되었다. zm-wus2 및 zm-odp2 발생 유전자는 형질전환 효율을 증가시키기 위해 존재하였다. zm-wus2, zm-odp2 및 mo-Flp 유전자는 최종 생성물에 도입되지 않았다.
도 3. 기재된 SbS 분석을 기반으로 DP915635 옥수수에서 삽입물의 개략적인 맵을 도시한 것이다. 플랭킹 옥수수 게놈(zm-SEQ158 및 zm-SEQ159 영역 포함)은 좌우 방향의 검은색 막대로 표시된다. PHP83175 및 PHP73878에서 유래된 의도된 삽입의 단일 카피가 옥수수 게놈에 통합된다(서열번호 2는 삽입 T-DNA 서열임). 삽입물 내에서, PHP73878의 랜딩 패드 서열과 PHP83175에서 유래된 형질 유전자가 강조 표시되어 있다. 서열번호 3은 완전한 삽입 서열 및 플랭킹 영역이다. SSI 공정 중 재조합 대상인 FRT1 및 FRT6 부위가 강조 표시되어 있다.
도 4. DP-915635-4의 형질전환 및 개발의 개략도를 도시한 것이다.
도 5는 비수확 작물 형질에 대한 기본 항목과 비교한 이벤트 DP-915635-4의 잡종 성능을 나타내는 표이다.
도 6은 모든 작물 형질에 대한 기본 항목과 비교한 이벤트 DP-915635-4의 근친교배 성능을 나타내는 표이다.
도 2. 6개의 유전자 카세트를 나타내는 T-DNA의 개략도를 도시한 것이다. T-DNA를 사용하여 FRT1 및 FRT6 부위를 포함하는 사전 특성화된 옥수수 계통을 형질전환시켰다. T-DNA에서 FRT1과 FRT6 부위 사이의 pmi 유전자, mo-pat 유전자 및 ipd079Ea 유전자를 포함하는 영역은 위치 특이적 방식으로 옥수수 계통에 통합되었다. zm-wus2 및 zm-odp2 발생 유전자는 형질전환 효율을 증가시키기 위해 존재하였다. zm-wus2, zm-odp2 및 mo-Flp 유전자는 최종 생성물에 도입되지 않았다.
도 3. 기재된 SbS 분석을 기반으로 DP915635 옥수수에서 삽입물의 개략적인 맵을 도시한 것이다. 플랭킹 옥수수 게놈(zm-SEQ158 및 zm-SEQ159 영역 포함)은 좌우 방향의 검은색 막대로 표시된다. PHP83175 및 PHP73878에서 유래된 의도된 삽입의 단일 카피가 옥수수 게놈에 통합된다(서열번호 2는 삽입 T-DNA 서열임). 삽입물 내에서, PHP73878의 랜딩 패드 서열과 PHP83175에서 유래된 형질 유전자가 강조 표시되어 있다. 서열번호 3은 완전한 삽입 서열 및 플랭킹 영역이다. SSI 공정 중 재조합 대상인 FRT1 및 FRT6 부위가 강조 표시되어 있다.
도 4. DP-915635-4의 형질전환 및 개발의 개략도를 도시한 것이다.
도 5는 비수확 작물 형질에 대한 기본 항목과 비교한 이벤트 DP-915635-4의 잡종 성능을 나타내는 표이다.
도 6은 모든 작물 형질에 대한 기본 항목과 비교한 이벤트 DP-915635-4의 근친교배 성능을 나타내는 표이다.
본원에서 사용되는 단수형("a", "an" 및 "the")은 달리 문맥이 명확히 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수형의 그러한 세포를 포함하며, "단백질"에 대한 언급은 하나 이상의 단백질 및 이의 균등물에 대한 언급을 포함하며, 다른 것도 마찬가지이다. 달리 명확히 표시하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 개시내용의 조성물은 ATCC 특허 수탁번호 PTA-126746으로 기탁된 종자 및 식물, 식물 세포 및 이로부터 유래된 종자를 포함한다. 출원인(들)은 2020년 3월 27일에 American Type Culture Collection(ATCC)(Manassas, VA 20110-2209 USA)에 옥수수 이벤트 DP-915635-4(특허 수탁번호 PTA-126746)의 적어도 2500개의 종자를 기탁했다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조건에 따라 유지된다. 2020년 3월 27일에 ATCC에 기탁된 종자는 Pioneer Hi-Bred International, Inc.(7250 NW 62nd Avenue, Johnston, Iowa 50131-1000)에 의해 관리되는 기탁에서 가져왔다. 이 기탁에 대한 접근은 미국 특허청장(Commissioner of Patents and Trademarks)과 요청 시 이에 대해 자격이 있다고 특허청장이 결정한 사람에게, 출원이 진행 중인 동안 가능하다. 출원의 청구범위가 허여되면, American Type Culture Collection(ATCC)(10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)에 기탁된 잡종 옥수수의 적어도 625개의 종자의 샘플(들)을 37 C.F.R. § 1.808에 따라 공중이 이용할 수 있게 할 것이다. 이 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 종자의 기탁물은 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에서 30년 또는 가장 최근 요청 후 5년 또는 특허권의 실시 가능한 수명 중 더 긴 기간 동안 유지될 것이고, 해당 기간 동안 무생육성이 될 경우 교체될 것이다. 추가로, 출원인(들)은 기탁 시 샘플의 생존능력 표시를 제공하는 것을 포함한 37 C.F.R. §§1.801 내지 1.809의 모든 요건을 충족하였다. 출원인(들)은 생물학적 물질의 이전 또는 이의 상업적 운송에 대해 법이 부과된 임의의 제한을 포기할 권한이 없다. 출원인(들)은 본 특허에 따라 부여된 권리 또는 식물품종보호법(Plant Variety Protection Act)(7 USC 2321 이하 참조)에 따라 이벤트 DP-915635-4에 적용되는 권리에 대한 임의의 침해 행위를 포기하지 않는다. 무단 종자 증식은 금지된다. 종자는 규제될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "옥수수"는 제아 메이스(Zea mays) 또는 메이즈(maize)를 의미하고 야생 옥수수 종을 포함하여 옥수수로 육종될 수 있는 모든 식물 변종을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "곤충 저항성" 및 "해충에 영향을 미치는"은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 발달 단계에서 곤충 섭식, 성장 및/또는 행동의 변화를 가져오는 것을 지칭한다: 곤충 사멸; 성장 지연; 생식 능력 감소; 섭식 억제 등.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "살충 활성"("pesticidal activity" 및 "insecticidal activity")은 적절한 시간 동안 유기체 또는 물질을 섭식한 후 및/또는 이에 노출된 후 해충의 사망률, 해충 체중 감소, 해충 유인, 해충 퇴치 및 해충의 기타 행동 및 물리적 변화를 포함한(그러나 이에 한정되지 않는), 다수의 매개변수에 의해 측정될 수 있는 유기체 또는 물질(예를 들어, 단백질)의 활성을 지칭하기 위해 동의어로 사용된다. 예를 들어, "살충 단백질"은 그 자체로 또는 다른 단백질과 조합하여 살충 활성을 나타내는 단백질이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "삽입 DNA"는 식물 물질을 형질전환하기 위해 사용된 발현 카세트 내의 이종 DNA를 지칭하는 반면, "플랭킹 DNA"는 식물과 같은 유기체에 자연적으로 존재하는 게놈 DNA 또는 원래의 삽입 DNA 분자, 예를 들어 형질전환 이벤트와 관련된 단편에 대해 외부적인 형질전환 과정을 통해 도입된 외래(이종) DNA로 존재할 수 있다. 본원에서 사용되는 "플랭킹 영역" 또는 "플랭킹 서열"은 원래의 비천연 삽입 DNA 분자의 바로 상류이고 이에 인접하여 및/또는 바로 하류이고 이에 인접하여 위치하는, 적어도 10 bp(일부 더 좁은 구현예에서, 적어도 20 bp, 적어도 50 bp 및 최대 적어도 5000 bp)의 서열을 지칭한다. 외래 DNA의 형질전환 절차는 각 형질전환체에 대해 특징적이고 고유한 상이한 플랭킹 영역을 함유하는 형질전환체를 생성할 수 있다. 재조합 DNA가 전통적인 교배를 통해 식물에 도입되면 일반적으로 이의 플랭킹 영역은 변경되지 않을 것이다. 식물 육종 및 전통적인 교배의 세대를 통해 플랭킹 영역에서 단일 뉴클레오티드 변화가 발생하는 것이 가능할 수 있다. 형질전환체는 또한 이종 삽입 DNA 조각과 게놈 DNA 조각, 또는 게놈 DNA 두 조각, 또는 이종 DNA 두 조각 사이의 고유한 접합부를 함유할 것이다. "접합부"는 두 개의 특정 DNA 단편이 결합하는 지점이다. 예를 들어, 삽입 DNA가 플랭킹 DNA와 결합하는 접합부가 존재한다. 접합 지점은 형질전환된 유기체에도 존재하는데, 여기서 두 개의 DNA 단편은 천연 유기체에서 발견되는 것에서 변형된 방식으로 함께 결합된다. "접합부 DNA"는 접합 지점을 포함하는 DNA를 지칭한다. 본 개시내용에 기재된 접합부 서열은 접합 지점의 적어도 -5 내지 +5 뉴클레오티드(서열번호 26), 접합 지점의 적어도 -10 내지 +10 뉴클레오티드(서열번호 27), 및 접합 지점의 적어도 -25 내지 +25 뉴클레오티드(서열번호 28) 범위의, 메이즈 게놈 DNA와 삽입물의 5' 말단 사이에 위치한 접합 지점; 및 접합 지점의 적어도 -5 내지 +5 뉴클레오티드(서열번호 29), 접합 지점의 적어도 -10 내지 +10 뉴클레오티드(서열번호 30), 및 접합 지점의 적어도 -25 내지 +25 뉴클레오티드(서열번호 31) 범위의, 삽입물의 3' 말단과 메이즈 게놈 DNA 사이에 위치한 접합 지점을 포함한다. 본 개시내용에 기재된 접합부 서열은 또한 표적 유전자좌와 삽입물의 5' 말단 사이에 위치한 접합 지점을 포함한다. 일부 구현예에서, DP-915635-4에 대한 서열번호 8 또는 21은 표적 유전자좌와 삽입물의 5' 말단 사이에 위치한 접합 지점을 나타낸다. 플랭킹 영역을 갖는 완전한 삽입물은 서열번호 3에 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 서열과 관련하여 "이종"은 상이한 비유성적으로 적합한 종으로부터 유래한 핵산 서열이거나, 동일한 종에서 유래한 경우 의도적인 인간의 개입에 의해 구성 및/또는 게놈 유전자좌의 자연적 형태로부터 실질적으로 변형된다. 예를 들어, 이종 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 뉴클레오티드 서열이 유래된 종과 상이한 종에서 유래할 수 있거나, 동일한 종에서 유래한 경우 프로모터는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 것으로 자연적으로 발견되지 않는다. 이종 단백질은 외래 종에서 유래할 수 있거나, 동일한 종에서 유래한 경우 의도적인 인간의 개입에 의해 원래 형태에서 실질적으로 변형된다.
용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 핵산 분자, 즉 작동 가능하게 연결된 전사 가능 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역 발현 패턴에 영향을 미치는 능력을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 따라서, 용어 "유전자 조절 활성"은 작동 가능하게 연결된 전사 가능 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미침으로써 작동 가능하게 연결된 전사 가능 폴리뉴클레오티드 분자의 발현에 영향을 미치는 능력을 의미한다. 유전자 조절 활성은 긍정적 및/또는 부정적일 수 있으며 영향은 시간적, 공간적, 발달적, 조직, 환경적, 생리학적, 병리학적, 세포 주기 및/또는 화학적 반응 특성뿐만 아니라, 정량적 또는 정성적 표시를 특징으로 할 수 있다.
"프로모터"는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터 서열은 근위의 상류 요소 및 더 원위의 상류 요소를 포함하고, 후자 요소는 종종 인핸서로 지칭된다. 따라서, "인핸서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 뉴클레오티드 서열이고, 프로모터 고유의 요소 또는 프로모터의 수준 또는 조직 특이성을 향상시키기 위해 삽입된 이종 요소일 수 있다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래할 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래한 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 뉴클레오티드 절편을 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 조절 요소가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여, 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 이해한다. 대부분의 시점에 대부분의 세포 유형에서 핵산 단편이 발현되게 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이의 핵산 단편이 동일하거나 유사한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
"번역 리더 서열"은 유전자의 프로모터 서열과 암호화 서열 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 번역 리더 서열은 번역 시작 서열의 상류의 완전히 가공된 mRNA에 존재한다. 번역 리더 서열은 mRNA에 대한 1차 전사체의 가공, mRNA 안정성 및/또는 번역 효율을 포함한 다수의 매개변수에 영향을 미칠 수 있다.
"3' 비암호화 서열"은 암호화 서열의 하류에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 폴리아데닐화 인식 서열, 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 암호화하는 기타 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 보통 mRNA 전구체 3' 말단에 대한 폴리아데닐산 영역 추가에 영향을 주는 것을 특징으로 한다.
DNA 구축물은 하나 이상의 발현 카세트를 제공하는, 함께 연결된 DNA 분자의 조립체이다. DNA 구축물은 박테리아 세포에서 자가 복제가 가능하고 특히 기능적 유전 요소, 즉 프로모터, 인트론, 리더, 암호화 서열, 3' 종결 영역을 제공하는 DNA 분자를 도입하는 데 유용한 다양한 엔도뉴클레아제 효소 제한 부위를 포함하는 플라스미드일 수 있거나; 또는 DNA 구축물은 발현 카세트와 같은 DNA 분자의 선형 조립체일 수 있다. DNA 구축물 내에 포함된 발현 카세트는 메신저 RNA의 전사를 제공하는 데 필요한 유전적 요소를 포함한다. 발현 카세트는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발현되도록 설계될 수 있다. 구현예의 발현 카세트는 식물 세포에서 발현되도록 설계된다.
본원에 개시된 DNA 분자는 관심 유기체에서의 발현을 위해 발현 카세트에 제공된다. 카세트는 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함한다. "작동 가능하게 연결된"은 연결된 핵산 서열들이 인접해 있으며, 필요한 경우 2개의 단백질 암호화 영역을 연결하기 위해, 인접하고 동일한 해독틀에 있음을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 것은 프로모터와 제2 서열 사이의 기능적 연결을 나타내기 위한 것이며, 여기서 프로모터 서열은 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시하고 매개한다. 카세트는 유기체 내로 공동 형질전환될 적어도 하나의 추가 유전자를 추가로 함유할 수 있다. 대안적으로, 추가 유전자(들)는 다중 발현 카세트 또는 다중 DNA 구축물에 제공될 수 있다.
발현 카세트는 전사의 5'에서 3' 방향으로 다음을 포함할 수 있다: 숙주 역할을 하는 유기체에서 기능하는 전사 및 번역 개시 영역, 암호화 영역 및 전사 및 번역 종결 영역. 전사 개시 영역(예를 들어, 프로모터)은 숙주 유기체에 고유하거나 유사하거나, 외래이거나 이종일 수 있다. 추가로, 프로모터는 천연 서열 또는 대안적으로 합성 서열일 수 있다. 발현 카세트는 발현 카세트 구축물에서 5' 리더 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 리더 서열은 번역을 향상시키도록 작용할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 일반적으로 초기에 그렇게 변경된 것들뿐만 아니라 초기 형질전환으로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 것들을 포함하여 이종 핵산의 존재에 의해 유전형이 변경되었고 이러한 이종 핵산을 보유하는 임의의 세포, 세포주, 캘러스, 조직, 식물 부분 또는 식물을 포함하는 것으로 이해해야 한다.
형질전환 "이벤트"는 관심 이식유전자를 포함하는 핵산 발현 카세트를 포함하는 이종 DNA 구축물(들)을 이용한 식물 세포의 형질전환, 이식유전자를 식물의 게놈에 삽입하여 생성된 식물 집단의 재생 및 특정 게놈 위치에 삽입되는 것을 특징으로 하는 특정 식물의 선택에 의해 생성된다. 이벤트는 이식유전자의 발현을 표현형적 특징으로 한다. 유전자 수준에서, 이벤트는 식물의 유전자 구성의 일부이다. 용어 "이벤트"는 또한 형질전환체와 다른 품종 간의 유성 이종교배에 의해 생성된 자손을 지칭하며, 여기서 자손은 이종 DNA를 포함한다. 반복친(recurrent parent)과 역교배 후, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 DNA와 연결된 플랭킹 게놈 DNA는 동일한 염색체 위치에서 교배의 자손에 존재한다. 자손 식물은 전통적인 육종 기술의 결과로 발생하는 삽입물에 대한 서열 변경을 포함할 수 있다. 용어 "이벤트"는 또한 삽입된 DNA를 포함하는 한 부모 계통(예를 들어, 원래의 형질전환체 및 자가수정으로 인한 자손)과 삽입된 DNA를 포함하지 않는 부모 계통의 유성 교배의 결과로서 관심 이식유전자를 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손으로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접한 플랭킹 서열을 포함하는 원래의 형질전환체로부터의 DNA를 지칭한다.
곤충 저항성 DP-915635-4 옥수수 식물은 곤충 저항성을 부여하는 구현예의 발현 카세트로 형질전환시켜 유래된 형질전환 DP-915635-4 이벤트 식물 및 이의 자손을 갖는 제1 모 옥수수 식물을, 이러한 발현 카세트가 결여된 제2 모 옥수수 식물을 먼저 유성 교배함으로써 복수의 제1 자손 식물을 생성하는 단계; 이어서 곤충 저항성인 제1 자손 식물을 선택하는 단계; 및 제1 자손 식물을 자가수정시킴으로써 복수의 제2 자손 식물을 생성하는 단계; 및 이어서 제2 자손 식물로부터 곤충 저항성 식물을 선택하는 단계에 의해 육종될 수 있다. 이들 단계는 제1 곤충 저항성 자손 식물 또는 제2 곤충 저항성 자손 식물을 제2 모 옥수수 식물 또는 제3 모 옥수수 식물로 역교배하여 곤충 저항성인 옥수수 식물을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. "자가수정"이라는 용어는 동일한 유기체로부터의 배우자 및/또는 핵의 결합을 포함하는 자가수분을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "식물"은 전체 식물, 식물의 부분, 식물 기관(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 식물 세포 및 이의 자손에 대한 언급을 포함한다. 일부 구현예에서, 형질전환 식물의 부분은 예를 들어, 식물 세포, 원형질체, 조직, 캘러스, 배아뿐만 아니라, 형질전환 식물 또는 본원에 개시된 DNA 분자로 이전에 형질전환된 이들의 자손에서 기원하며 따라서 적어도 부분적으로 형질전환 세포로 구성된 꽃, 줄기, 열매, 잎 및 뿌리를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "식물 세포"는 종자, 현탁 배양물, 배아, 분열부, 캘러스 조직, 잎, 뿌리, 어린 싹, 배우체, 포자체, 꽃가루 및 미포자를 제한 없이 포함한다. 사용될 수 있는 식물 부류는 일반적으로 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물을 포함하는, 형질전환 기술에 적합한 고등 식물 부류만큼 광범위하다.
"형질전환"은 숙주 유기체의 게놈에 핵산 단편을 전달하여 유전적으로 안정한 유전을 야기하는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 식물은 "형질전환" 식물로 지칭된다.
이벤트 DP-915635-4와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "자손"은 옥수수 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 모 식물의 임의의 세대의 자식을 나타낸다.
본원에 개시된 단리된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입 가능하고 복제 가능한 재조합 구축물, 전형적으로 DNA 구축물 내로 도입될 수 있다. 이러한 구축물은 주어진 숙주 세포에서 폴리펩티드 암호화 서열의 전사 및 해독이 가능한 복제 시스템 및 서열을 포함하는 벡터일 수 있다. 식물 세포의 안정적인 형질감염 또는 형질전환 식물의 확립에 적합한 다수의 벡터가 예를 들어, 문헌[Pouwels et al., (1985; Supp. 1987) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, (Academic Press, New York)]; 및 [Flevin et al., (1990) Plant Molecular Biology Manual, (Kluwer Academic Publishers)]에 기재되어 있다. 전형적으로, 식물 발현 벡터는 예를 들어 5' 및 3' 조절 서열 및 우성 선택 마커의 전사 제어 하에 하나 이상의 클로닝된 식물 유전자를 포함한다. 이러한 식물 발현 벡터는 또한 프로모터 조절 영역(예를 들어, 유도성 또는 구성적, 환경적 또는 발생적 조절, 또는 세포 또는 조직 특이적 발현을 제어하는 조절 영역), 전사 개시 시작 부위, 리보솜 결합 부위, RNA 프로세싱 신호, 전사 종결 부위 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
삽입물을 식물 세포의 게놈에 도입하는 과정 중에, 삽입물 및/또는 게놈 플랭킹 서열의 일부 결실 또는 다른 변경이 발생하는 것은 드문 일이 아니다. 따라서, 본원에 제공된 플라스미드 서열의 관련 절편은 약간의 작은 변이를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 플랭킹 서열에 대해서도 마찬가지이다. 따라서, 대상 플랭킹 및/또는 삽입물 서열과 일정 범위의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 본 개시내용의 서열에 대한 동일성은 본원에 예시되거나 기재된 서열과 적어도 65%의 서열 동일성, 적어도 70%의 서열 동일성, 적어도 75%의 서열 동일성, 적어도 80%의 동일성, 또는 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 본원에 제공된 교배 및 교배 조건은 또한 본 개시내용의 이러한 식물 및 폴리뉴클레오티드 서열을 정의하는 데 사용될 수 있다. 플랭킹 서열과 전체 삽입 서열을 포함하는 서열은 기탁된 종자를 참조하여 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 상이한 형질전환 식물을 또한 교배시켜 2개의 독립적으로 분리된 부가된 외인성 유전자를 함유하는 자손을 생산할 수 있다. 적절한 자손의 자가수정은 부가된 외인성 유전자 모두에 대해 동형접합성인 식물을 생산할 수 있다. 영양 번식과 마찬가지로 모 식물에 대한 역교배 및 비형질전환 식물과의 이종교배도 고려된다.
"프로브"는 통상적인 합성 검출 가능한 라벨 또는 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소가 부착된 단리된 핵산이다. 이러한 프로브는 표적 핵산의 가닥, 예를 들어 옥수수 식물로부터든 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터든, 옥수수 이벤트 DP-915635-4로부터 단리된 DNA 가닥에 상보적이다. 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 해당 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 변형된 뉴클레오티드도 포함할 수 있다.
"프라이머"는 핵산 혼성화에 의해 상보적인 표적 DNA 가닥에 어닐링되어 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이의 혼성체를 형성한 다음, 중합효소, 예를 들어 DNA 중합효소에 의해 표적 DNA 가닥을 따라 연장되는 단리된 핵산이다. 프라이머 쌍은 예를 들어 PCR 또는 기타 통상적인 핵산 증폭 방법에 의한 표적 핵산 서열의 증폭을 위해 이들을 사용하는 것을 의미한다. "PCR" 또는 "중합효소 연쇄 반응"은 특정 DNA 절편의 증폭에 사용되는 기술이다(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,800,159호 참조; 본원에 참조로 포함됨).
프로브 및 프라이머는 조작자가 결정한 혼성화 조건 또는 반응 조건에서 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하기에 충분한 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 이 길이는 선택하는 검출 방법에서 유용하기에 충분한 길이의 임의의 길이일 수 있다. 일반적으로, 11개 뉴클레오티드 이상, 18개 뉴클레오티드 이상, 22개 뉴클레오티드 이상의 길이가 사용된다. 이러한 프로브 및 프라이머는 높은 엄격성의 혼성화 조건 하에 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 표적 DNA 서열과 상이하고 표적 DNA 서열에 혼성화하는 능력을 보유하는 프로브가 통상적인 방법에 의해 설계될 수 있지만, 구현예에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과 인접한 뉴클레오티드의 완전한 DNA 서열 유사성을 가질 수 있다. 프로브는 프라이머로 사용될 수 있지만, 일반적으로 표적 DNA 또는 RNA에 결합하도록 설계되고, 증폭 과정에서 사용되지 않는다.
특정 프라이머는 생물학적 샘플에서 이벤트 DP-915635-4를 확인하기 위한 "특정 프로브"로 사용될 수 있는 앰플리콘을 생성하기 위해 통합 단편을 증폭하는 데 사용될 수 있다. 프로브가 생물학적 샘플과 결합할 수 있게 하는 조건 하에 프로브가 이러한 샘플의 핵산과 혼성화되는 경우, 이 결합을 검출함으로써 생물학적 샘플에 이벤트 DP-915635-4가 존재하는지를 표시할 수 있다. 본 개시내용의 구현예에서, 특정 프로브는 적절한 조건 하에서 이벤트의 5' 또는 3' 플랭킹 영역 내의 영역에 특이적으로 혼성화하고 또한 이와 인접한 외래 DNA의 일부를 포함하는 서열이다. 특정 프로브는 이벤트의 특정 영역과 적어도 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 및 95 내지 100% 동일한(또는 상보적인) 서열을 포함할 수 있다.
프로브 및 프라이머를 제조하고 사용하는 방법은 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989 (이하, "Sambrook et al., 1989")]; [Ausubel et al. eds., Current Protocols in Molecular Biology, , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995 (with periodic updates) (이하, "Ausubel et al., 1995")]; 및 [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990]에 기재되어 있다. PCR 프라이머 쌍은 해당 목적을 의도한 컴퓨터 프로그램, 예컨대 PCR 프라이머 분석 도구[Vector NTI 버전 6(Informax Inc., Bethesda MD)]; [PrimerSelect(DNASTAR Inc., Madison, WI)]; 및 프라이머(버전 0.5ⓒ, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.)를 사용함으로써 공지된 서열로부터 유래될 수 있다. 추가로, 서열은 시각적으로 스캐닝될 수 있고 프라이머는 당업자에게 공지된 가이드라인을 사용하여 수동으로 확인될 수 있다.
본원에서 사용된 "키트"는 본 개시내용의 방법 구현예, 보다 구체적으로 생물학적 샘플에서 이벤트 DP-915635-4의 확인을 수행하기 위한, 시약 세트 및 선택적으로 설명서를 지칭한다. 품질 관리(예를 들어, 종자 로트의 순도), 식물성 물질, 또는 식물성 물질을 포함하거나 식물성 물질에서 유래된 물질, 예컨대 식품 또는 사료 제품(그러나 이에 한정되지 않음)에서 이벤트 DP-915635-4의 검출의 목적을 위해 키트가 사용될 수 있고 이의 성분이 특이적으로 조정될 수 있다. 본원에서 사용되는 "식물성 물질"은 식물로부터 수득하거나 유래한 물질을 의미한다.
본원에 개시된 플랭킹 DNA 및 삽입 서열에 기반한 프라이머 및 프로브는 통상적인 방법, 예를 들어 이러한 서열의 재클로닝 및 서열분석에 의해, 개시된 서열을 확인(및 필요한 경우 수정)하는 데 사용될 수 있다. 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에서 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법을 사용하여 샘플에서 형질전환 이벤트로부터 DNA의 존재를 확인할 수 있다.
핵산 분자는 완전한 상보성 또는 최소한의 상보성을 나타내는 경우 다른 핵산 분자의 "상보체"라고 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 분자 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 분자는 "완전한 상보성"을 나타낸다고 한다. 2개의 분자는 적어도 통상적인 "낮은 엄격성" 조건 하에서 서로에 대해 어닐링된 상태를 유지하도록 허용하기에 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 수 있는 경우 "최소한 상보적"이라고 한다. 유사하게, 분자가 통상적인 "높은 엄격성" 조건 하에서 서로에 대해 어닐링된 상태를 유지하도록 허용하기에 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 수 있는 경우 분자는 "상보적"이라고 한다. 통상적인 엄격성 조건이 문헌[Sambrook et al., 1989] 및 [Haymes et al., In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)]에 기재되어 있고, 따라서 완전한 상보성으로부터의 일탈이 허용될 수 있는데, 단 이러한 일탈이 이중 가닥 구조를 형성할 수 있는 분자의 능력을 완전히 배제하지 말아야 한다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브 역할을 하기 위해서는 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정적인 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열상 충분히 상보적이기만 하면 된다.
혼성화 반응에서, 특이성은 전형적으로 혼성화 후 세척의 함수이며, 중요한 인자는 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도이다. 열 융점(Tm)은 상보적인 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 프로브에 혼성화하는 (정의된 이온 강도 및 pH에서의) 온도이다. DNA-DNA 하이브리드의 경우, Tm은 다음의 방정식(Meinkoth and Wahl, (1984) Anal. Biochem. 138:267-284)으로부터 근사될 수 있다: Tm = 81.5℃ + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61(% form) - 500/L; 식에서, M은 1가 양이온의 몰 농도이고, % GC는 DNA의 구아노신과 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, % form은 혼성화 용액의 포름아미드의 백분율이고, L은 염기 쌍에서의 하이브리드의 길이이다. Tm은 1%의 불일치마다 약 1℃ 감소하므로, Tm, 혼성화 및/또는 세척 조건은 원하는 동일성의 서열에 혼성화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 90% 초과의 동일성을 갖는 서열이 요구되는 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 이의 상보체에 대한 Tm보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 그러나 일부 구현예에서, 다음을 포함하는 다른 엄격성 조건이 적용될 수 있다. 매우 엄격한 조건은 Tm보다 1, 2, 3, 또는 4℃ 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 사용할 수 있고, 적당히 엄격한 조건은 Tm보다 6, 7, 8, 9, 또는 10℃ 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 사용할 수 있고, 낮은 엄격성 조건은 Tm보다 11, 12, 13, 14, 15, 또는 20℃ 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 사용할 수 있다.
방정식, 혼성화와 세척 조성, 및 원하는 Tm을 사용할 때, 당업자는 혼성화 및/또는 세척액의 엄격성의 변화가 본질적으로 기술되어 있음을 이해할 것이다. 원하는 불일치도에 의해 Tm이 45℃(수용액) 또는 32℃(포름아미드 용액) 미만이 되는 경우, 사용자는 더 높은 온도가 사용될 수 있도록 SSC 농도를 증가시키는 것을 선택할 수 있다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology―Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York)]; 및 문헌[Ausubel et al., eds. (1995)] 및 문헌[Sambrook et al. (1989)]에서 발견된다.
일부 구현예에서, 상보적 서열은 그것이 혼성화하는 핵산 분자와 동일한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 상보적 서열은 그것이 혼성화하는 핵산 분자보다 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 뉴클레오티드가 더 길거나 더 짧다. 일부 구현예에서, 상보적 서열은 그것이 혼성화하는 핵산 분자보다 1%, 2%, 3%, 4% 또는 5% 더 길거나 더 짧다. 일부 구현예에서, 상보적 서열은 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 기준으로 상보적이며, 이는 불일치 뉴클레오티드가 없음을 의미한다(각각의 A는 T와 쌍을 이루고, 각각의 G는 C와 쌍을 이룬다). 일부 구현예에서, 상보적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이하의 불일치를 포함한다. 일부 구현예에서, 상보적 서열은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이하의 불일치를 포함한다.
기준 서열(대상)과 관련하여 "서열 동일성 백분율(%)"은 서열을 정렬하고 갭을 도입하여 (필요할 경우) 최대 서열 동일성 백분율을 달성한 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 아미노산 보존적 치환을 고려하지 않고서, 기준 서열에서의 각각의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한 후보 서열(질의)에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 결정된다. 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST 또는 BLAST-2와 같은, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당해 분야에서의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자라면, 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이다(예를 들어, 질의 서열의 퍼센트 동일성 = 질의 서열과 대상 서열 사이의 동일한 위치의 수 / 질의 서열의 위치의 총 수 ×100).
특정 증폭 프라이머 쌍을 사용한 표적 핵산 서열의 (예를 들어, PCR에 의한) 증폭과 관련하여, 엄격한 조건은 프라이머 쌍이 상응하는 야생형 서열(또는 이의 상보체)을 갖는 프라이머가 결합하고 선택적으로 DNA 열 증폭 반응에서 고유한 증폭 산물인 앰플리콘을 생성하는 표적 핵산 서열에만 혼성화하도록 허용한다.
본원에서 사용되는 "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 의미한다. 예를 들어, 유성 교배로부터 생성된 옥수수 식물이 본원에 개시된 옥수수 식물로부터의 형질전환 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지를 결정하기 위해, 옥수수 식물의 조직 샘플로부터 추출된 DNA를 대상으로 하여, 삽입된 이종 DNA의 삽입 부위에 인접한 플랭킹 서열로부터 유래한 제1 프라이머 및 삽입된 이종 DNA로부터 유래한 제2 프라이머를 포함하는 DNA 프라이머 쌍을 이용하는 핵산 증폭 방법을 수행하여, 이벤트 DNA의 존재에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성할 수 있다. 대안적으로, 제2 프라이머는 플랭킹 서열로부터 유래될 수 있다. 앰플리콘은 길이가 있고 이벤트에 대해 특징적이기도 한 서열을 갖는다. 앰플리콘의 길이는 프라이머 쌍 + 1개 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합된 길이에서부터 DNA 증폭 프로토콜에 의해 생성될 수 있는 임의의 길이의 앰플리콘까지의 범위일 수 있다. 대안적으로, 프라이머 쌍은 PHP74643 발현 구축물의 전체 삽입 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 형질전환 삽입물 측면에 있는 서열의 일부를 포함하는 앰플리콘을 생성하기 위해 삽입된 DNA의 양 측면에 있는 플랭킹 서열로부터 유래될 수 있다. 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 거리를 두고 위치할 수 있으며, 이 거리는 1개 뉴클레오티드 염기 쌍에서부터 증폭 반응의 한계까지의 범위일 수 있다. "앰플리콘"이라는 용어의 사용은 특히 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 제외한다.
핵산 증폭은 PCR을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 다양한 핵산 증폭 방법에 의해 달성될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당업계에 공지되어 있고, 특히 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호, 그리고 위의 문헌[Innis et al., (1990)]에 기재되어 있다. PCR 증폭 방법은 최대 22 Kb의 게놈 DNA와 최대 42 Kb의 박테리오파지 DNA를 증폭시키기 위해 개발되었다(Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994). 이들 방법뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 다른 방법이 본 개시내용의 구현예의 실시에 사용될 수 있다. 특정 PCR 프로토콜의 다수의 매개변수는 특정 실험실 조건에 맞게 조정되어야 할 수 있으며 약간 변형될 수 있지만 유사한 결과의 수집을 허용할 수 있음을 이해한다. 이러한 조정은 당업자에게 명백할 것이다.
이들 방법에 의해 생성된 앰플리콘은 Genetic Bit 분석(Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)(인접한 플랭킹 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 둘 다와 중첩되는 DNA 올리고뉴클레오티드가 설계됨)을 포함하나 이에 한정되지 않는 복수의 기술에 의해 검출할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. (예를 들어, 삽입된 서열의 하나의 프라이머 및 인접한 플랭킹 서열의 하나의 프라이머를 사용하여) 관심 영역을 PCR한 후의 단일 가닥의 PCR 생성물은 고정된 올리고뉴클레오티드와 혼성화될 수 있고 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 라벨링된 ddNTP 및 DNA 중합효소를 이용하는 단일 염기 연장 반응용 주형으로서 기능할 수 있다. 판독값은 형광 또는 ELISA 기반일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장으로 인해 삽입/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
또 다른 검출 방법은 문헌[Winge (2000) Innov. Pharma. Tech. 00:18-24]에 기재된 바와 같은 피로(pyro)서열분석 기술이다. 이 방법에서는 인접한 DNA와 삽입 DNA 접합부와 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 올리고뉴클레오티드를 관심 영역으로부터의 단일 가닥의 PCR 생성물과 혼성화하고(예를 들어, 삽입된 서열의 하나의 프라이머 및 플랭킹 서열의 하나의 프라이머), 이를 DNA 중합효소, ATP, 설퍼릴라제, 루시페라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포설페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이션한다. dNTP는 개별적으로 부가되며, 도입에 의해 측정되는 광 신호가 생성된다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다중 염기 연장으로 인해 이식유전자 삽입/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
문헌[Chen et al., (1999) Genome Res. 9:492-498]에 기재된 형광 편광도 앰플리콘을 검출하는 데 사용할 수 있는 방법이다. 이 방법을 사용하여 플랭킹 및 삽입된 DNA 접합부와 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 올리고뉴클레오티드를 관심 영역으로부터의 단일 가닥의 PCR 생성물에 혼성화하고(예를 들어, 삽입된 DNA의 하나의 프라이머 및 플랭킹 DNA 서열의 하나의 프라이머), 이를 DNA 중합효소 및 형광 라벨링된 ddNTP의 존재 하에 인큐베이션한다. 단일 염기 연장으로 인해 ddNTP가 도입된다. 도입은 형광계를 사용하여 편광의 변화로 측정할 수 있다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장으로 인해 이식유전자 삽입/플랭킹 서열의 존재를 나타낸다.
정량적 PCR(qPCR)은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량화하는 방법으로 기재되며, 상업적으로 이용 가능한 제조업체에서 제공하는 설명서에서 완전히 이해된다. 간략하게, 이러한 qPCR 방법 중 하나에서, 플랭킹 및 삽입 DNA 접합부와 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머(삽입 DNA 서열의 하나의 프라이머 및 플랭킹 게놈 서열의 하나의 프라이머)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에서 순환된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상의 ??칭 모이어티로부터 멀리 떨어진 형광 모이어티의 절단 및 방출을 초래한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 플랭킹/이식유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
분자 비콘(beacon)은 문헌[Tyangi et al. (1996) Nature Biotech. 14:303-308]에 기재된 바와 같이 서열 검출에서의 사용에 대해 기재되었다. 간략하게, 플랭킹 및 삽입 DNA 접합부와 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브의 고유한 구조는 형광 및 ??칭 모이어티를 근접하게 유지하는 2차 구조를 포함하게 한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머(예를 들어, 삽입 DNA 서열의 하나의 프라이머 및 플랭킹 서열의 하나의 프라이머)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에서 순환된다. 성공적인 PCR 증폭 후, 표적 서열에 대한 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 및 ??칭 모이어티의 공간적 분리를 초래한다. 형광 신호 결과. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화로 인해 플랭킹/이식유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
앰플리콘 내에서 발견된 서열에 특이적인 프로브를 사용하는 혼성화 반응은 PCR 반응에 의해 생성된 앰플리콘을 검출하는 데 사용되는 또 다른 방법이다.
해충은 딱정벌레목, 쌍시목, 벌목, 나비목, 털이목, 동시아목, 반시목, 메뚜기목, 총채벌레목, 집게벌레목, 흰개미목, 이목, 벼룩목, 날도래목 등, 특히 딱정벌레목 및 나비목으로부터 선택되는 곤충을 포함한다.
관심 대상은 딱정벌레목의 유충 및 성충으로, 이에는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 소바구미과, 콩바구미과 및 바구미과의 바구미: Anthonomus grandis Boheman(목화 바구미); Cylindrocopturus adspersus LeConte(해바라기 줄기 바구미); Diaprepes abbreviatus Linnaeus(감귤 뿌리 바구미); Hypera punctata Fabricius(클로버 잎 바구미); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel(벼 물 바구미); Metamasius hemipterus hemipterus Linnaeus(서인도 사탕수수 바구미); M. hemipterus sericeus Olivier(비단 바구미); Sitophilus granarius Linnaeus(그라나리아바구미); S. oryzae Linnaeus(벼 바구미); Smicronyx fulvus LeConte(붉은 해바라기씨 바구미); S. sordidus LeConte(회색 해바라기씨 바구미); Sphenophorus maidis Chittenden(옥수수 바구미); S. livis Vaurie(사탕수수 바구미); Rhabdoscelus obscurus Boisduval(뉴기니 사탕수수 바구미); 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 잎벌레과의 벼룩 딱정벌레, 오이 딱정벌레, 뿌리벌레, 잎벌레, 감자 딱정벌레 및 잎나방벌레: Chaetocnema ectypa Horn(사막 옥수수 뜀벼룩 갑충); C. pulicaria Melsheimer(옥수수 뜀벼룩 갑충); Colaspis brunnea Fabricius(꼽추잎벌레); Diabrotica barberi Smith & Lawrence(노던 옥수수 뿌리벌레); D. undecimpunctata howardi Barber(남부 옥수수 뿌리벌레); D. virgifera virgifera LeConte(서부 옥수수 뿌리벌레); Leptinotarsa decemlineata Say(콜로라도 감자 딱정벌레); Oulema melanopus Linnaeus(곡류 잎 딱정벌레); Phyllotreta cruciferae Goeze(옥수수 뜀벼룩 갑충); Zygogramma exclamationis Fabricius(해바라기 잎벌레); 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 무당벌레과의 딱정벌레: Epilachna varivestis Mulsant(멕시칸 콩 딱정벌레); 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 풍뎅이과의 풍뎅이 및 기타 딱정벌레: Antitrogus parvulus Britton (칠더스 수수 유충); Cyclocephala borealis Arrow(북부 마스크 풍뎅이, 굼벵이); C. immaculata Olivier(남부 마스크 풍뎅이, 굼벵이); Dermolepida albohirtum Waterhouse(회색등 수수 딱정벌레); Euetheola humilis rugiceps LeConte(사탕수수 딱정벌레); Lepidiota frenchi Blackburn(프랑스 수수 유충); Tomarus gibbosus De Geer(당근 딱정벌레); T. subtropicus Blatchley(사탕수수 유충); Phyllophaga crinita Burmeister(굼벵이); P. latifrons LeConte(유월풍뎅이); Popillia japonica Newman(일본 딱정벌레); Rhizotrogus majalis Razoumowsky(유럽 풍뎅이); 수시렁이과의 수시렁이; 방아벌레과, 엘레오데스(Eleodes) spp., 멜란노투스(Melanotus) spp.의 방아벌레 유충(M. communis Gyllenhal(방아벌레 유충) 포함); 코노데루스(Conoderus) spp.; 리모니우스(Limonius) spp.; 아그리오테스(Agriotes) spp.; 크테니세라(Ctenicera) spp.; 아에올루스(Aeolus) spp.; 나무좀과의 나무좀; 거저리과의 딱정벌레; 하늘소과의 딱정벌레, 예컨대, Migdolus fryanus Westwood(하늘소)(이에 한정되지 않음); 및 비단벌레과의 딱정벌레(Aphanisticus cochinchinae seminulum Obenberger(잎굴 비단벌레)를 포함하나 이에 한정되지 않음)이다.
일부 구현예에서 DP-915635-4 옥수수 이벤트는 추가 형질의 누적을 추가로 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 누적을 포함하는 식물은 전통적인 육종 방법 또는 유전 공학 방법 중 하나 또는 둘 모두를 통해 얻을 수 있다. 이들 방법은 각각 관심 폴리뉴클레오티드를 포함하는 개개의 계통을 육종하고, 본 발명에 개시된 유전자를 포함하는 형질전환 식물을 후속 유전자로 형질전환시키고, 유전자를 단일 식물 세포로 공동 형질전환하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "누적된"은 동일한 식물에 존재하는 다중 형질을 갖는 것을 포함한다(즉, 두 형질 모두 핵 게놈에 통합되고, 하나의 형질이 핵 게놈에 통합되고, 하나의 형질이 색소체의 게놈에 통합되거나 두 형질이 색소체의 게놈에 통합됨).
일부 구현예에서, 단독으로 또는 하나 이상의 추가 곤충 저항성 형질과 함께 누적된, 본원에 개시된 DP-915635-4 옥수수 이벤트는 하나 이상의 추가 투입 형질(예를 들어, 제초제 저항성, 진균 저항성, 바이러스 저항성, 스트레스 내성, 병해 저항성, 웅성 불임성, 줄기 강도 등) 또는 산출 형질(예를 들어, 증가된 수확량, 변성된 전분, 개선된 오일 프로파일, 균형을 이룬 아미노산, 높은 라이신 또는 메티오닌, 증가된 소화력, 개선된 섬유질, 가뭄 저항성 등)로 누적될 수 있다. 따라서, 구현예는 임의의 수의 작물 해충을 유연하고 비용 효과적으로 방제할 수 있는 능력과 함께 개선된 작물 품질의 완전한 농경 패키지를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
추가 구현예에서, DP-915635-4 옥수수 이벤트는 미국 특허 제8,101,826호, 제6,551,962호, 제6,586,365호, 제6,593,273호 및 PCT 공개 제WO 2000/011185호에 개시된 Cry3B 독소; 미국 특허 제8,269,069호 및 제8,513,492호에 개시된 mCry3B 독소; 미국 특허 제8,269,069호, 제7,276,583호 및 제8,759,620호에 개시된 mCry3A 독소; 또는 미국 특허 제7,309,785호, 제7,524,810호, 제7,985,893호, 제7,939,651호 및 제6,548,291호에 개시된 Cry34/35 독소를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가 Bt 살충 독소로 누적될 수 있다. 추가 구현예에서, DP-915635-4 옥수수 이벤트는 이들 Bt 살충 독소 및 기타 딱정벌레목 활성 Bt 살충 형질, 예를 들어 미국 특허 제7,705,216호에 개시된 이벤트 MON863; 미국 특허 제8,884,102호에 개시된 이벤트 MIR604; 미국 특허 제9,133,474호에 개시된 이벤트 5307; 미국 특허 제7,875,429호에 개시된 이벤트 DAS-59122; 미국 특허 제8,575,434호에 개시된 이벤트 DP-4114; 미국 특허 제9,441,240호에 개시된 이벤트 MON 87411; 국제 특허 출원 공개 제WO 2019/209700호에 개시된 이벤트 DP-23211; 및 미국 특허 제8,686,230호에 개시된 이벤트 MON88017(이들 모두는 본원에 참조로 포함됨)로 누적될 수 있다. 일부 구현예에서, DP-915635-4 옥수수 이벤트는 MON-87429-9(MON87429 이벤트); MON87403; MON95379; MON87427; MON87419; MON-00603-6(NK603); MON-87460-4; LY038; DAS-06275-8; BT176; BT11; MIR162; GA21; MZDT09Y; SYN-05307-1; 및 DAS-40278-9로 누적될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 조성물은 게놈 편집 기술을 사용하여 식물의 게놈으로 도입될 수 있거나, 식물의 게놈에 이전에 도입된 폴리뉴클레오티드가 게놈 편집 기술을 사용하여 편집될 수 있다. 예를 들어, 개시된 폴리뉴클레오티드는 TALEN, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR-Cas 등과 같은 이중 가닥 절단 기술의 사용을 통해 식물의 게놈에서 원하는 위치로 도입될 수 있다. 예를 들어, 개시된 폴리뉴클레오티드는 부위 특이적 삽입을 위해 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 게놈에서 원하는 위치로 도입될 수 있다. 식물 게놈에서 원하는 위치는 육종에 적합한 게놈 영역과 같은 삽입을 위한 임의의 원하는 표적 부위일 수 있거나, 기존 관심 형질을 갖는 게놈 창에 위치한 표적 부위일 수 있다. 관심 있는 기존 형질은 내인성 형질이거나 이전에 도입된 형질일 수 있다.
개시된 폴리뉴클레오티드가 이전에 게놈에 도입된 일부 구현예에서, 게놈 편집 기술은 도입된 폴리뉴클레오티드 서열을 변경 또는 변형하기 위해 사용될 수 있다. 개시된 조성물 내로 도입될 수 있는 부위 특이적 변형은 유전자 복구 올리고뉴클레오티드의 사용(예를 들어, 미국 공개 제2013/0019349호), 또는 TALEN, 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, CRISPR-Cas 등과 같은 이중 가닥 절단 기술의 사용을 통한 것을 포함하는(그러나 이에 한정되지 않음) 부위 특이적 변형을 도입하기 위한 임의의 방법을 사용하여 생성된 것을 포함한다. 이러한 기술은 도입된 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 통해 이전에 도입된 폴리뉴클레오티드를 변형하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 도입된 폴리뉴클레오티드에 추가의 뉴클레오티드 서열을 부가하기 위해 이중 가닥 절단 기술이 사용될 수 있다. 부가될 수 있는 추가 서열은 인핸서 및 프로모터 서열과 같은 추가 발현 요소를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 게놈 편집 기술은 살충 활성 단백질의 분자 스택을 생성하기 위해 식물의 게놈 내에 본원에 개시된 개시 조성물에 매우 근접하게 추가 살충 활성 단백질을 위치시키는 데 사용될 수 있다.
"변경된 표적 부위", "변경된 표적 서열", "변형된 표적 부위" 및 "변형된 표적 서열"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 변경되지 않은 표적 서열과 비교하여 적어도 하나의 변경을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 표적 서열을 지칭한다. 이러한 "변경"은, 예를 들어 (i) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, (ii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, (iii) 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 또는 (iv) (i) 내지 (iii)의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, DP-915635-4 이벤트를 포함하는 옥수수 식물은 종자 처리로 처리될 수 있다. 일부 구현예에서, 종자 처리는 살진균제, 살충제 또는 제초제일 수 있다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예
실시예 1. IPD079Ea를 암호화하는 구축물을 함유하는 형질전환 식물을 위한 카세트 설계
상업적 트랙 이벤트를 생성하기 위해 분자 스택에서 사용되는 IPD079Ea 발현을 위한 카세트 설계는 유전자 테스트 형질전환 실험에서의 효능 및 발현에 기초하여 선택되었다. 유전자 테스트 실험에서 다수의 상이한 조절 요소(프로모터, 인트론) 및 기타 요소(터미네이터)를 평가했다. 산출 및 형질 효능에 대한 발현 패턴을 평가하기 위해 다수의 상이한 조절 요소를 사용하였다.
선택된 이벤트 구축물인 플라스미드 PHP83175의 T-DNA 영역의 IPD079Ea 유전자 카세트에 포함된 유전 요소가 표 1에 기재되어 있다.
표 1. 플라스미드 PHP83175의 T-DNA 영역의 유전 요소에 대한 설명
실시예 2. 아그로박테리움 형질전환에 의한 옥수수의 형질전환 및 IPD079, PAT 및 PMI 유전자를 함유하는 형질전환 식물의 재생
DP-915635-4 옥수수 이벤트는 플라스미드 PHP83175를 이용한 아그로박테리움 매개 SSI 형질전환에 의해 생성되었다. 아그로박테리움 매개 SSI는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2017/0240911호에 기재된 바와 같이 기본적으로 수행되었다.
2700개가 넘는 미성숙 배아를 PHP83175로 감염시켰다. 105일의 선택 및 재생 과정 후 총 46개의 T0 유식물체가 재생되었다. PCR 분석을 위해 모든 T0 유식물체에서 샘플을 채취하여 삽입된 IPD079, PMI 및 mo-PAT의 존재 및 카피 수를 확인하였다. 이 분석에 추가하여, T0 유식물체를 특정 아그로박테리움 바이너리 벡터 백본 서열의 존재 및 전체가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제7,579,529호 및 제7,256,322호에 개시된 발달 유전자 zm-odp2 및 zm-wus2에 대해 PCR에 의해 분석하였다. 삽입된 유전자의 단일 카피를 함유하고, 아그로박테리움 백본 서열 및 발달 유전자를 함유하지 않는 것으로 확인된 식물을 추가 온실 번식을 위해 선택했다. 이러한 PCR 선택 T0 품질 이벤트의 샘플을 Southern-by-Sequencing을 사용하여 추가 분석을 위해 수집하여, 삽입된 유전자가 유전자 파괴 없이 올바른 표적 유전자좌에 있는지 확인했다. 옥수수 이벤트 DP-915635-4는 단일 카피의 T-DNA를 함유하는 것으로 확인되었다(실시예 3 및 4 참조). 이들 선택된 T0 식물을 형질 효능 및 단백질 발현에 대해 분석하였다. 모든 기준을 충족하는 T0 식물을 추가 시험을 위한 종자를 생산하기 위해 진전시켰고, 근친교배 계통으로 교배시켰다. 형질전환 및 이벤트 발달의 개략도가 도 4에 제시되어 있다.
실시예 3. 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 확인
옥수수 이벤트 DP-915635-4의 여러 세대를 나타내는 잎 조직의 게놈 DNA, 알려진 카피 수 교정기 대조군, 음성 대조군 공급원(유전자 비변형 옥수수의 DNA) 및 주형 불포함 대조군(no template control, NTC)을 분리하고, 이벤트 특이적 및 구축물 특정 프라이머 및 프로브를 이용한 정량적 실시간 PCR(qPCR) 증폭을 수행하였다. 이벤트 특이적 및 구축물 특이적 분석을 이용한 DP-915635-4 옥수수 DNA의 실시간 PCR 분석은 DP-915635-4 옥수수에서 이벤트 DP-915635-4 및 ipd079Ea, pmi 및 mo-PAT 이식유전자의 정량화된 검출에 의해 증명된 바와 같이, 테스트한 잎 샘플에서 플라스미드 PHP83175의 T-DNA의 단일 카피의 안정적인 통합 및 분리를 확인시켜 준다. 각각의 이벤트 특이적 및 구축물 특이적 PCR 방법의 신뢰성은 실험을 4반복하여 평가하였다. PCR 증폭의 감도 또는 검출 한계(LOD)는 DP-915635-4의 게놈 DNA의 다양한 희석액을 테스트하여 평가했다.
이벤트 DP-915635-4를 포함하는 2개 세대 옥수수를 전형적인 온실 생산 조건 하에 칸이 분리된 플랫에서 성장시켰다. 각 세대에 대해 약 100개의 종자를 심었다.
식물이 V5와 V9 성장 단계 사이에 있을 때 각각의 건강한 식물에서 잎 샘플을 수집했다. 각 식물의 윤생체에서 나온 가장 어린 잎에서 샘플을 채취했다. Pioneer Hi-Bred International, Inc.(Johnston, IA)에서 성장시킨 종자로부터의 ipd079Ea, pmi 및 mo-PAT 유전자들뿐만 아니라 DP-915635-4 이벤트에 대한 카피 수 PCR(qPCR)을 통해 각 이벤트의 게놈 접합부 및 PHP83175 T-DNA의 카피 수에 대해 식물당 3개의 잎 펀치를 분석하였다. 잎 샘플로부터 게놈 DNA 추출은 높은 알칼리성 추출 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 표준 세틸 트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 추출 프로토콜을 사용하여 잎 조직에서 검증된 실험실 대조군(카피 수 교정기 및 음성)을 제조하였다.
게놈 DNA 지원 실험실 대조군은 Quant-iT PicoGreen® 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 정량화하였다. 게놈 테스트 및 대조군 샘플의 정량화는 NanoDrop 2000/2000c V1.6.198 소프트웨어(ThermoScientific, Wilmington, DE)를 사용하는 NanoDrop 2000c 분광광도계를 사용하여 추정하였다.
DP-915635-4의 잎 조직에서 분리된 게놈 DNA 샘플과 대조군 샘플을 PHP83175 T-DNA의 특정 영역과 이벤트 DP-915635-4에 대한 각 삽입 부위에 걸친 게놈 접합부에 걸쳐 있는 이벤트 특이적 및 구축물 특이적 프라이머와 프로브를 사용하여 실시간 PCR 증폭을 수행하였다. 내인성 기준 유전자인 hmg-A(High Mobility Group A)(Krech, et al. (1999). Gene 234: (1) 45-50)를, 각 분석의 정성적 및 정량적 평가를 위해, 그리고 PCR 반응 내에서 충분한 질과 양의 DNA가 존재함을 입증하기 위해, 각 분석에서 이중으로 사용하였다. 각 프라이머/프로브 세트에 대한 PCR 표적 부위와 예상되는 PCR 산물의 크기는 표 2에 제시되어 있다. 각 표적화된 영역을 뒷받침하는 프라이머 및 프로브 서열 정보는 표 3에 제시되어 있다. PCR 시약 및 반응 조건은 표 4에 제시되어 있다. 이 연구에서 약 3 ng의 옥수수 게놈 DNA가 모든 PCR 반응에 사용되었다.
표 2: PCR 게놈 DNA 표적 부위 및 예상되는 PCR 산물의 크기
표 3: PCR 게놈 DNA 표적화된 영역용 프라이머 및 프로브 서열 및 앰플리콘
표 4. PCR 시약 및 반응 조건
이벤트 DP-915635-4의 삽입 부위와 플라스미드 PHP83175의 T-DNA 내 이식유전자를 나타내는 57 bp 내지 113 bp 크기 범위의 PCR 산물이 증폭되었고, 이벤트 DP-915635-4의 100개의 개별 잎 샘플과 8개의 카피 수 교정기 게놈 대조군에서 관찰되었으나, 8개의 음성 게놈 대조군 및 8개의 NTC 대조군 각각에는 존재하지 않았다. 각 분석은 총 4회 수행되었으며 동일한 결과가 관찰되었다. CT 값을 각 샘플 및 모든 양성 대조군에 대해 계산하였다.
옥수수 내인성 기준 유전자 hmg-A를 사용하여 79 bp의 PCR 산물이 증폭되었고, 각각 이벤트 DP-915635-4의 개별 잎 샘플 100개와 8개의 카피 수 교정기 및 8개의 음성 게놈 대조군에서 관찰되었다. 내인성 유전자의 증폭은 CT 값 생성이 없는 테스트된 8개의 주형 불포함 대조군(NTC)에서 관찰되지 않았다. 각각의 샘플에 대해, 각각의 분석은 두 삽입 부위 및 모든 이식유전자로 이중으로 총 4회 수행되었으며 매번 동일한 결과가 관찰되었다. CT 값을 각 샘플 및 모든 양성 및 음성 대조군에 대해 계산하였다.
구축물 특이적 PCR 분석의 감도를 평가하기 위해, DP-915635-4 옥수수 DNA를 대조군 옥수수 게놈 DNA에 희석하여, 총 5 ng의 옥수수 DNA 중 다양한 양의 이벤트 DP-915635-4 DNA(5 ng, 1 ng, 500 pg, 250 pg, 100 pg, 50 pg, 20 pg, 10 pg, 5 pg)를 함유하는 테스트 샘플을 생성하였다. 이러한 다양한 양의 DP-915635-4 옥수수 DNA는 각각 총 옥수수 게놈 DNA 중 100%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.4%, 0.2% 및 0.1%의 DP-915635-4 옥수수 DNA에 해당한다. 다양한 양의 DP-915635-4 DNA를 이식유전자 ip079Ea, PMI 및 mo-PAT에 대해 실시간 PCR 증폭시켰다. 이러한 분석을 기반으로, 이벤트 DP-915635-4에 대한 총 DNA 5 ng의 검출 한계(LOD)는 ip079Ea의 경우 약 20 pg 또는 0.4%, pmi의 경우 250 pg 또는 5%, mo-pat의 경우 5 pg 또는 0.1%(DP-915635-4)인 것으로 결정되었다. 기재된 각 분석의 결정된 감도는 여러 스크리닝 적용에 충분하다. 각 농도는 총 4회 테스트되었으며 매번 동일한 결과가 관찰되었다.
이벤트 DP-915635-4에 대한 이벤트 특이적 및 구축물 특이적 프라이머/프로브 세트를 활용한 이벤트 DP-915635-4의 실시간 PCR 분석은 DP-915635-4 옥수수에서 ipd079Ea, pmi 및 mo-PAT 이식유전자의 정량화된 검출에 의해 증명된 바와 같이, 테스트한 잎 샘플에서 이벤트의 플라스미드 PHP83175의 T-DNA의 단일 카피의 안정적인 통합 및 분리를 확인시켜 준다. 이러한 결과는 수행된 모든 복제 qPCR 분석에서 재현 가능했다. hmg-A의 검출을 위한 옥수수 내인성 기준 유전자 분석은 모든 테스트 샘플, 음성 대조군에서 예상대로 증폭되었고, NTC 샘플에서는 검출되지 않았다. 기재된 조건 하에서 각 분석의 감도는 5 pg 내지 250 pg DNA의 범위이며, 모두 PCR에 의한 여러 스크리닝 적용에 충분하다.
실시예 4. 무결성 및 카피 수에 대한 DP-915635-4 옥수수의 Southern-by-Sequencing(SbS) 분석
Southern-by-Sequencing(SbS)은 옥수수 게놈 내에서 삽입된 DNA를 단리, 서열분석 및 확인하기 위해 프로브 기반 서열 포획, 차세대 서열분석(NGS) 기술 및 생물정보학 절차를 활용한다. 다수의 고유한 서열분석 리드를 컴파일링하고 형질전환 플라스미드와 비교함으로써, 삽입된 DNA로 인한 고유한 접합부가 생물정보학 분석에서 확인되고 식물 게놈 내의 삽입물 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. DP-915635-4 옥수수의 T0 식물을 SbS로 분석하여 삽입물 카피 수를 결정했다. 추가로, 대조군 옥수수 계통의 샘플을 분석하였다.
게놈 DNA를 DP-915635-4 옥수수 및 대조군 식물의 T0 세대에서 추출하였다.
PHP83175 플라스미드 서열을 선택하는 데 사용되는 포획 프로브는 Roche NimbleGen, Inc.(Madison, WI)에서 설계하고 합성했다. 플라스미드 서열을 포함하는 일련의 고유한 서열을 사용하여 포획 프로브로서 중첩되는 비오틴화된 올리고뉴클레오티드를 설계했다. 프로브 세트는 강화 과정 중에 PHP83175 형질전환 플라스미드 내의 대부분의 서열을 표적으로 하도록 설계되었다. 프로브를 옥수수 게놈과 비교하여 PHP83175 플라스미드 서열과 동시에 포획되고 서열분석될 옥수수 게놈 서열의 수준을 결정했다.
차세대 서열분석 라이브러리를 DP-915635-4 옥수수 식물 및 대조군 옥수수 계통에 대해 구축하였다. SbS를 문헌[Zastrow-Hayes, et al. Plant Genome (2015)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서열분석 라이브러리를 표적 서열을 강화하기 위해 2회의 혼성화를 통해 포획 프로브에 혼성화하였다. HiSeq 2500(Illumina, San Diego, CA)에서 NGS를 수행한 후 트리밍 및 품질 보증을 위해 서열분석 리드를 평가했다. 리드를 옥수수 게놈 및 형질전환 구축물에 대해 정렬시키고, 게놈 및 플라스미드 서열을 포함하는 리드를 접합부 리드로 확인하였다. 형질전환 구축물에 대한 접합부 리드의 정렬은 예상 삽입물에 대한 삽입된 DNA의 경계를 보여준다.
내인성 옥수수 서열을 포함한 접합부를 확인하기 위해, 대조군 옥수수 게놈 DNA 라이브러리를 DP-915635-4 옥수수 식물과 동일한 방식으로 포획하고 서열분석하였다. 이러한 라이브러리를 DP-915635-4 옥수수 식물 샘플에 대한 깊이의 대략 5배의 평균 깊이로 서열분석하였다. 이는 PHP83175 프로브에 의해 포획된 내인성 접합부가 대조군 샘플에서 검출될 가능성을 증가시켰고, 따라서 이들이 DP-915635-4 옥수수 샘플에서 확인 및 제거될 수 있었다.
삽입물의 통합 및 카피 수를 구축물 PHP83175로부터 유래된 DP-915635-4 옥수수에서 결정하였다. 형질전환에 사용된 PHP83175 플라스미드 및 PHP83175로부터의 T-DNA의 개략적인 맵이 도 1 및 도 2에 제공되어 있다.
DP-915635-4 옥수수의 T0 식물에서 SbS를 수행하여 게놈의 삽입물 카피 수를 결정했다. 예상된 삽입물 영역(랜딩 패드 요소 zm-SEQ158 및 zm-SEQ159 포함; 도 3)에 대한 SbS 리드의 정렬은 게놈 플랭킹 서열과 랜딩 패드 사이에 2개의 고유한 접합부를 생성하였다. FRT1 및 FRT6 부위는 PHP83175의 표적 형질 유전자가 부위 특이적 통합(SSI) 랜딩 패드로 통합된 두 위치이다. PHP83175 서열과 식물에서 검출된 옥수수 게놈 사이에 다른 접합부는 없었으며, 이는 DP-915635-4 옥수수에 존재하는 추가의 플라스미드 유래 삽입물이 없음을 나타낸다. 추가로, 확인된 PHP83175 T-DNA의 비인접 영역들 사이에 접합부가 없었으며, 이는 삽입된 DNA에서 검출 가능한 재배열 또는 절단이 없음을 나타낸다. 또한, 분석된 식물에서 옥수수 게놈 서열과 PHP83175의 백본 서열 사이에 접합부가 없었으며, 이는 플라스미드 백본 서열이 DP-915635-4 옥수수에 통합되지 않았음을 나타낸다.
DP-915635-4 옥수수의 T0 식물에 대한 SbS 분석은 DP-915635-4 옥수수에 PHP83175 T-DNA로부터의 원하는 유전자를 포함하는 단일 삽입물이 있으며 각 게놈에서 추가 삽입물은 존재하지 않음을 보여주었다.
삽입물 카피 수를 확인하기 위해 DP-915635-4 옥수수의 T0 식물에서 Southern-by-Sequencing(SbS) 분석을 수행했다. 결과는 식물에서 단일 PHP83175 T-DNA 삽입물을 나타낸다. 대조군 식물에서는 PHP83175 T-DNA 서열과 옥수수 게놈 사이의 접합부가 검출되지 않았으며, 이는 예상대로 이들 식물에 PHP83175에서 유래된 삽입물이 포함되어 있지 않음을 나타낸다. 나아가, 분석된 식물에서 플라스미드 백본 서열은 검출되지 않았다. DP-915635-4 옥수수의 T0 식물에 대한 SbS 분석은 DP-915635-4 옥수수에 PHP83175 T-DNA의 단일 삽입물이 있으며 각 게놈에서 추가 삽입물은 존재하지 않음을 보여주었다.
서열번호 32에 제시된 바와 같이 완전한 삽입물 및 플랭킹 영역 서열에서 ubiZM1 프로모터의 bp 2931에서의 단일 뉴클레오티드 변화, A에서 C로의 변화가 모든 5개의 식물에서, 예상했던 삽입물 서열과는 상이한 pmi 카세트의 ubiZM1 프로모터에서 확인되었다. 이러한 변화는 모든 5개의 양성 식물에서 나타나므로, 최초 형질전환된 식물에 존재하는 것으로 판단하였다. 서열번호 32의 위치 8199에서 G에서 A로의 추가 단일 뉴클레오티드 변화가 5개 식물 중 1개 식물의 os-액틴 프로모터에서 확인되었는데; 이것이 유일한 발생이기 때문에, 이는 번식 과정에서 자발적인 변화로 인한 것일 수 있다. 5개의 양성 식물에서 5개의 플라스미드 맵에 대한 리드의 정렬은 삽입물에 통합되지 않은 플라스미드의 내인성 요소의 범위와 함께, 의도된 삽입물에서 발견된 유전 요소의 범위를 보여준다(zm-SEQ158, zm-SEQ159, zm-U6 pol III CHR8 프로모터 및 터미네이터, zm-45CR1 가이드 RNA, In2-2 프로모터, zm-wus2 및 zm-odp2). 리드는 또한 PHP83175, PHP73878, PHP70605 및 PHP21875에서 의도된 삽입 영역 외부에 위치한 pinII 터미네이터 요소에도 정렬되지만, 이러한 요소는 삽입물에 통합되지 않았다. pinII 터미네이터의 이러한 카피에 정렬된 NGS 리드는 의도된 삽입물의 pmi 카세트에 있는 pinII 터미네이터를 포함하는 단편에서 나온 것이나; 이 단일 카피의 리드는 플라스미드 맵에서 pinII 터미네이터의 모든 카피에 정렬된다. 유사하게, 리드는 의도된 삽입물의 mo-pat 카세트에 동일한 요소가 존재하기 때문에 mo-Flp 카세트의 CaMV 35S 터미네이터 요소와 PHP83175의 zm-wus2 카세트의 os-actin 프로모터 및 인트론 영역에 정렬되었다.
실시예 5. 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 곤충 효능
DP-915635-4 옥수수를 포함하는 다수의 이벤트를 시험함으로써 옥수수 뿌리벌레(CRW)에 대한 보호에 대해 곤충 활성 IPD079Ea 단백질을 함유하는 F1 잡종 옥수수 계통을 현장에서 평가하였다. 데이터는 선형 혼합 모델을 사용하여 통계적으로 분석되었다.
현장 테스트는 북미의 상업용 옥수수 재배 지역에 위치한 13개 위치에서 수행되었다: 사우스다코타 주 브루킹스(BR); 미네소타 주 맨케이토(MK); 아이오와 주 매리언(MR); 아이오와 주 레들린(MR_RE); 아이오와 주 존스턴(JH_D2); 아이오와 주 존스턴(JH_D3); 아이오와 주 길버트(JH_GB); 위스콘신 주 워터타운(JV); 일리노이 주 샤본나(JV_SH); 일리노이 주 시모어(CI_SE); 인디애나 주 파울러(WN); 네브라스카 주 요크(YK); 및 네브라스카 주 린지(YK_LI). 음성 대조군 뿌리에서 0.75 미만의 낮은 마디 손상 점수(CRWNIS)로 인해 13개 위치 중 6개 위치(JH_GB, JV, JV_SH, CI_SE, YK 및 YK_LI 현장)에서 효능 데이터가 수집되지 않았다.
단일 이랑 시험구(길이 10피트)를 2번 반복하는 무작위 완전 블록 실험 설계로 식재하였다. 식재 전에 각 종자 로트의 168개 낟알을 PCR 분석으로 특성화하여 형질의 존재를 확인했다. 식물이 V2~V4 성장 단계에 도달했을 때 위치에 따라 약 750개의 알/식물 또는 1500개의 알/식물의 표적화된 감염률로 4피트 길이의 각 이랑을 트랙터에 장착된 CRW 알 감염기를 사용하여 수동으로 감염시켰다. 각 식물의 양쪽에 약 4인치 깊이와 약 2~3인치의 토양에 알을 주입했다. 유충의 뿌리 섭식으로 인한 손상은 식재 후 56일에서 71일 사이에 평가하였다. 2개의 옥수수 뿌리에 태그를 달고, 수동으로 땅을 파고, 가압수로 토양을 깨끗이 세척하고, 대략 R2 성장 단계에서 유충 섭식량을 평가했다. 뿌리 손상은 아이오와 주의 0~3의 마디 손상 척도를 사용하여 각 뿌리에 포함된 유충 섭식량을 시각적으로 등급을 매기고 기록하여 평가했다.
DP-915635-4 옥수수와 대조군 옥수수에 대한 CRW의 평균 마디 손상 뿌리 등급 결과가 표 5에 제공되어 있다. 이러한 결과는 곤충 활성 IPD079Ea 단백질을 포함하는 옥수수 계통이 CRW에 대해 효능이 있음을 나타낸다.
표 5. 옥수수 뿌리벌레에 대한 효능 결과
표 6. 옥수수 뿌리벌레에 대한 효능 결과
실시예 6. 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 작물학적 및 수확량 현장 평가
DP-915635-4를 포함하는 작물학적 현장 시험은 수확량 데이터를 생성하고 다른 작물학적 특성을 평가하기 위한 것이었다. 이벤트에 대해 테스트한 모든 근친교배 및 잡종 물질은 단일 T0 식물에서 생성되었다.
잡종 시험
각 위치에서 항목 목록의 단일 반복실험으로 16개 위치에 잡종 시험을 배치하였다. 곡물을 16개 위치 중 12개 위치에서 수확하였다. 공통 배경의 각 항목을 3개의 시험용 계통과 교배하여 테스트용 잡종 종자를 생성하였다. 실험은 시험용 계통에 의해 중첩되었으며 항목은 각 중첩 내에서 무작위로 지정되었다. 성장기 내내 각 식재 위치에서 다양한 관찰 및 데이터를 수집했다. 야생형 항목(WT), 또는 기본 비교기라고도 하는, 동일한 유전학을 갖지만 IPD079Ea가 없는 항목과의 비교를 위해 다음의 작물학적 특성을 분석하였다(표 7 및 도 5):
1.)
이삭 높이(EARHT): 지면에서 식물에서 가장 높게 발달한 이삭의 부착 지점까지 측정. 이삭 높이는 인치 단위로 측정된다.
2.)
식물 높이(PLTHT): 지면에서 지엽의 맨 아래 부분까지 드론으로 측정. 식물 높이는 인치 단위로 측정된다.
3.)
수분(MST): 수확 시 곡물 수분 백분율 측정.
4.)
산출량: 각 시험구에서 수확한 곡물의 기록된 중량. 보고된 부셸/에이커 수확량의 계산은 각 시험구의 측정된 수분에 대해 조정하여 이루어졌다.
근친교배 시험
각 위치에서 항목 목록의 2회 반복실험으로 8개 위치에 근친교배 시험을 배치하였다. 곡물을 분석을 위해 7개 위치에서 수확하였다. 구축물 설계에 의해 각 위치에서 1회 반복실험이 중첩되었다. 다른 반복실험은 무작위 완전 블록으로 식재하였다. 근친교배 시험을 위해 작물학적 데이터 및 관찰을 수집하고, 야생형 항목(WT) 또는 동일한 유전자형의 비형질 버전과의 비교를 위해 분석했다. 근친교배 시험을 위해 생성된 데이터는 다음의 작물학적 형질을 포함하였다(표 8 및 도 6):
1.)
방출까지의 성장도 단위(GDUSHD): 측정은 시험구에 있는 식물의 50%에 화분을 방출하는 수염이 있을 때 총 누적 성장도 단위를 기록한다. 이 데이터 세트에 대해 하루에 해당하는 값은 약 2.5 성장도 단위이다.
2.)
이삭 높이(EARHT): 지면에서 식물에서 가장 높게 발달한 이삭의 부착 지점까지 측정. 이삭 높이는 인치 단위로 측정된다.
3.)
식물 높이(PLTHT): 지면에서 지엽의 맨 아래 부분까지 측정. 식물 높이는 인치 단위로 측정된다.
4.)
이삭 측광 수확량(PHTYLD): 각 시험구에서 수확된 이삭의 이미지에서 계산된 수확량 추정치. 제시된 값의 단위는 부셸/에이커이다.
시험 결과
잡종 데이터를 평가하기 위해 혼합 모델 프레임워크를 사용하여 다중 위치 분석을 수행했다. 다중 위치 분석에서, 주효과 구축물 설계는 고정 효과로 간주된다. 위치, 배경, 시험용 계통, 이벤트, 배경-구축물 설계, 시험용 계통-구축물 설계, 시험용 계통-이벤트, 위치-배경, 위치-구축물 설계, 위치-시험용 계통, 위치-배경-구축물 설계, 위치-시험용 계통-구축물 설계, 위치-이벤트, 위치-시험용 계통-이벤트에 대한 인자는 임의 효과로 간주된다. 외부 공간 노이즈를 제거하기 위해 위치 내 범위 및 구획을 포함한 공간 효과는 임의 효과로 간주되었다. 이종 잔차는 각 위치에 대해 AR1*AR1로 자기회귀 상관관계를 갖는 것으로 추정했다. 각 배경에 대한 구축물 설계 및 이벤트 예측의 추정치가 생성되었다. T 검정은 구축물 설계/이벤트를 WT와 비교하기 위해 수행되었다. 차이의 P 값이 0.05 미만인 경우 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 수확량 분석은 ASREML(VSN International Ltd; Best Linear Unbiased Prediction; Cullis, B. Ret al (1998) Biometrics 54: 1-18, Gilmour, A. R. et al (2009); ASReml User Guide 3.0, Gilmour, A.R., et al (1995) Biometrics 51: 1440-50)에 의해 이루어졌다.
근친교배 데이터를 평가하기 위해 혼합 모델 프레임워크를 사용하여 다중 위치 분석을 수행했다. 다중 위치 분석에서, 주효과 구축물 설계는 고정 효과로 간주된다. 위치, 배경, 이벤트, 배경-구축물 설계, 위치-배경, 위치-구축물 설계, 위치-배경-구축물 설계, 위치-이벤트 및 위치 내 대표에 대한 인자는 임의 효과로 간주된다. 외부 공간 노이즈를 제거하기 위해 위치 내 범위 및 구획을 포함한 공간 효과는 임의 효과로 간주되었다. 이종 잔차는 각 위치에 대해 AR1*AR1로 자기회귀 상관관계를 갖는 것으로 추정했다. 각 배경에 대한 구축물 설계 및 이벤트 예측의 추정치가 생성되었다. T 검정은 구축물 설계/이벤트를 WT와 비교하기 위해 수행되었다. 차이의 P 값이 0.05 미만인 경우 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 수확량 분석은 ASREML(VSN International Ltd; Best Linear Unbiased Prediction; Cullis, B. Ret al (1998) Biometrics 54: 1-18, Gilmour, A. R. et al (2009); ASReml User Guide 3.0, Gilmour, A.R., et al (1995) Biometrics 51: 1440-50)에 의해 이루어졌다.
표 7.
기본 항목과 비교한 이벤트 DP-915635-4의 잡종 성능 - 수확량
표 8. 기본 항목과 비교한 이벤트 DP-915635-4의 근친교배 성능 - 수확량
실시예 7. 단백질 발현 및 농도
단백질 추출
IPD079Ea 단백질 농도 분석을 위해, 처리된 뿌리 조직 하위 샘플을 20 mg의 목표 중량으로 칭량하였다. PAT 및 PMI 단백질 농도 분석을 위해, 처리된 잎 조직 하위 샘플을 10 mg의 목표 중량으로 칭량하였다. 샘플을 폴리소르베이트 20(PBST)을 포함하는 냉각된 인산염 완충 식염수 0.60 ml로 추출하였다. 추출된 샘플을 원심분리한 다음, 상청액을 제거하고 분석을 위해 준비했다.
IPD079Ea 단백질 농도의 결정
분석에 앞서, 샘플을 경우에 따라 PBST에 희석했다. 표준물질(일반적으로 3반복실험 웰로 분석됨) 및 희석된 샘플(일반적으로 2반복실험 웰에서 분석됨)을 IPD079Ea 특이적 항체로 미리 코팅된 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 결합되지 않은 물질을 플레이트에서 세척하고 결합된 IPD07Ea 단백질을 서양고추냉이 과산화효소(HRP)에 접합된 상이한 IPD079Ea 특이적 항체와 인큐베이션했다. 결합되지 않은 물질은 플레이트에서 세척되었다. 결합된 IPD079Ea-항체 복합체의 검출은 HRP의 존재 하에 유색 생성물을 생성하는 기질의 첨가에 의해 달성되었다. 산 용액으로 반응을 정지시키고 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
PAT 단백질 농도의 결정
분석에 앞서, 샘플을 경우에 따라 PBST에 희석했다. 표준물질(일반적으로 3반복실험 웰로 분석됨) 및 희석된 샘플(일반적으로 2반복실험 웰에서 분석됨)을 상이한 PAT 특이적 항체로 미리 코팅된 플레이트에서 효소 HRP에 접합된 PAT 특이적 항체와 공동 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 결합되지 않은 물질을 플레이트로부터 세척하였다. 결합된 PAT-항체 복합체의 검출은 HRP의 존재 하에 유색 생성물을 생성하는 기질의 첨가에 의해 달성되었다. 산 용액으로 반응을 정지시키고 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰의 OD를 측정하였다.
PMI 단백질 농도의 결정
분석에 앞서, 샘플을 경우에 따라 PBST에 희석했다. 표준물질(일반적으로 3반복실험 웰로 분석됨) 및 희석된 샘플(일반적으로 2반복실험 웰에서 분석됨)을 PMI 특이적 항체로 미리 코팅된 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 결합되지 않은 물질을 플레이트에서 세척하고 결합된 PMI 단백질을 효소 HRP에 접합된 상이한 PMI 특이적 항체와 인큐베이션했다. 결합되지 않은 물질은 플레이트에서 세척되었다. 결합된 PMI-항체 복합체의 검출은 HRP의 존재 하에 유색 생성물을 생성하는 기질의 첨가에 의해 달성되었다. 산 용액으로 반응을 정지시키고 플레이트 판독기를 사용하여 각 웰의 OD를 측정하였다.
단백질 농도 결정을 위한 계산
SoftMax Pro GxP(Molecular Devices) 마이크로플레이트 데이터 소프트웨어를 사용하여 각 샘플 웰 세트에 대해 얻은 OD 값을 단백질 농도 값으로 변환하는 데 필요한 계산을 수행했다.
표준 곡선은 각 ELISA 플레이트에 포함되었다. 표준 곡선에 대한 식은 각 표준 웰 세트에 대해 얻은 OD 값을 각각의 표준 농도(ng/ml)와 연관시키기 위해 2차 적합을 사용하는 소프트웨어에 의해 유도하였다.
조정된 농도 = 보간된 샘플 농도 x 희석 계수
SoftMax Pro GxP 소프트웨어에서 얻은 조정된 샘플 농도 값은 다음과 같이 ng/ml에서 ng/mg 샘플 중량으로 변환되었다.
결과
2개 세대의 DP-915635-4 옥수수로부터의 V9 뿌리 조직의 IPD079Ea 단백질 및 V9 잎 조직의 PAT 및 PMI 단백질에 대한 단백질 농도 결과(평균, 표준 편차 및 범위)를 결정하였다.
표 9. 발현된 형질 단백질 농도 결과
본 개시내용의 다양한 예시된 구현예에 대한 위의 설명은 개시된 정확한 형태로 범위를 제한하거나 배타적인 것으로 의도되지 않는다. 특정 구현예 및 실시예가 설명의 목적으로 본원에 기재되어 있지만, 관련 분야의 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가 변형이 가능하다. 본원에 제공된 교시는 전술한 예가 아닌 다른 목적에 적용될 수 있다. 위의 교시에 비추어 다수의 변형 및 변경이 가능하며, 따라서 첨부된 청구항의 범위 내에 있다.
이러한 변경 및 기타 변경은 위의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 비추어 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 구현예의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
배경기술, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에서 인용된 각 문서(특허, 특허 출원, 저널 논문, 초록, 매뉴얼, 서적 또는 기타 공개 포함)의 전체 개시내용은 전체가 참조로 본원에 포함된다.
사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도, 농도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오차 및 편차는 허용될 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며; 온도는 섭씨 온도이고; 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.
SEQUENCE LISTING
<110> Pioneer Hi-Bred International, Inc.
Jeffrey, Klever
<120> MAIZE EVENT DP-915635-4 AND METHODS FOR
<130> 8425
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 74997
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 1
ccgctgtcgt cgatgacggc gtaatcgtgg gcaagaacgg cagctttatg gctgcctggc 60
tgtacaaggg cgatgacaac gcaagcagca ccgaccagca gcgcgaagta gtgtccgccc 120
gcatcaacca ggccctcgcg ggcctgggaa gtgggtggat gatccatgtg gacgccgtgc 180
ggcgtcctgc tccgaactac gcggagcggg gcctgtcggc gttccctgac cgtctgacgg 240
cagcgattga agaagagcgc tcggtcttgc cttgctcgtc ggtgatgtac ttcaccagct 300
ccgcgaagtc gctcttcttg atggagcgca tggggacgtg cttggcaatc acgcgcaccc 360
cccggccgtt ttagcggcta aaaaagtcat ggctctgccc tcgggcggac cacgcccatc 420
atgaccttgc caagctcgtc ctgcttctct tcgatcttcg ccagcagggc gaggatcgtg 480
gcatcaccga accgcgccgt gcgcgggtcg tcggtgagcc agagtttcag caggccgccc 540
aggcggccca ggtcgccatt gatgcgggcc agctcgcgga cgtgctcata gtccacgacg 600
cccgtgattt tgtagccctg gccgacggcc agcaggtagg ccgacaggct catgccggcc 660
gccgccgcct tttcctcaat cgctcttcgt tcgtctggaa ggcagtacac cttgataggt 720
gggctgccct tcctggttgg cttggtttca tcagccatcc gcttgccctc atctgttacg 780
ccggcggtag ccggccagcc tcgcagagca ggattcccgt tgagcaccgc caggtgcgaa 840
taagggacag tgaagaagga acacccgctc gcgggtgggc ctacttcacc tatcctgccc 900
ggctgacgcc gttggataca ccaaggaaag tctacacgaa ccctttggca aaatcctgta 960
tatcgtgcga aaaaggatgg atataccgaa aaaatcgcta taatgacccc gaagcagggt 1020
tatgcagcgg aaaagcgctg cttccctgct gttttgtgga atatctaccg actggaaaca 1080
ggcaaatgca ggaaattact gaactgaggg gacaggcgag agacgatgcc aaagagctac 1140
accgacgagc tggccgagtg ggttgaatcc cgcgcggcca agaagcgccg gcgtgatgag 1200
gctgcggttg cgttcctggc ggtgagggcg gatgtcgagg cggcgttagc gtccggctat 1260
gcgctcgtca ccatttggga gcacatgcgg gaaacgggga aggtcaagtt ctcctacgag 1320
acgttccgct cgcacgccag gcggcacatc aaggccaagc ccgccgatgt gcccgcaccg 1380
caggccaagg ctgcggaacc cgcgccggca cccaagacgc cggagccacg gcggccgaag 1440
caggggggca aggctgaaaa gccggccccc gctgcggccc cgaccggctt caccttcaac 1500
ccaacaccgg acaaaaagga tctactgtaa tggcgaaaat tcacatggtt ttgcagggca 1560
agggcggggt cggcaagtcg gccatcgccg cgatcattgc gcagtacaag atggacaagg 1620
ggcagacacc cttgtgcatc gacaccgacc cggtgaacgc gacgttcgag ggctacaagg 1680
ccctgaacgt ccgccggctg aacatcatgg ccggcgacga aattaactcg cgcaacttcg 1740
acaccctggt cgagctgatt gcgccgacca aggatgacgt ggtgatcgac aacggtgcca 1800
gctcgttcgt gcctctgtcg cattacctca tcagcaacca ggtgccggct ctgctgcaag 1860
aaatggggca tgagctggtc atccataccg tcgtcaccgg cggccaggct ctcctggaca 1920
cggtgagcgg cttcgcccag ctcgccagcc agttcccggc cgaagcgctt ttcgtggtct 1980
ggctgaaccc gtattggggg cctatcgagc atgagggcaa gagctttgag cagatgaagg 2040
cgtacacggc caacaaggcc cgcgtgtcgt ccatcatcca gattccggcc ctcaaggaag 2100
aaacctacgg ccgcgatttc agcgacatgc tgcaagagcg gctgacgttc gaccaggcgc 2160
tggccgatga atcgctcacg atcatgacgc ggcaacgcct caagatcgtg cggcgcggcc 2220
tgtttgaaca gctcgacgcg gcggccgtgc tatgagcgac cagattgaag agctgatccg 2280
ggagattgcg gccaagcacg gcatcgccgt cggccgcgac gacccggtgc tgatcctgca 2340
taccatcaac gcccggctca tggccgacag tgcggccaag caagaggaaa tccttgccgc 2400
gttcaaggaa gagctggaag ggatcgccca tcgttggggc gaggacgcca aggccaaagc 2460
ggagcggatg ctgaacgcgg ccctggcggc cagcaaggac gcaatggcga aggtaatgaa 2520
ggacagcgcc gcgcaggcgg ccgaagcgat ccgcagggaa atcgacgacg gccttggccg 2580
ccagctcgcg gccaaggtcg cggacgcgcg gcgcgtggcg atgatgaaca tgatcgccgg 2640
cggcatggtg ttgttcgcgg ccgccctggt ggtgtgggcc tcgttatgaa tcgcagaggc 2700
gcagatgaaa aagcccggcg ttgccgggct ttgtttttgc gttagctggg cttgtttgac 2760
aggcccaagc tctgactgcg cccgcgctcg cgctcctggg cctgtttctt ctcctgctcc 2820
tgcttgcgca tcagggcctg gtgccgtcgg gctgcttcac gcatcgaatc ccagtcgccg 2880
gccagctcgg gatgctccgc gcgcatcttg cgcgtcgcca gttcctcgat cttgggcgcg 2940
tgaatgccca tgccttcctt gatttcgcgc accatgtcca gccgcgtgtg cagggtctgc 3000
aagcgggctt gctgttgggc ctgctgctgc tgccaggcgg cctttgtacg cggcagggac 3060
agcaagccgg gggcattgga ctgtagctgc tgcaaacgcg cctgctgacg gtctacgagc 3120
tgttctaggc ggtcctcgat gcgctccacc tggtcatgct ttgcctgcac gtagagcgca 3180
agggtctgct ggtaggtctg ctcgatgggc gcggattcta agagggcctg ctgttccgtc 3240
tcggcctcct gggccgcctg tagcaaatcc tcgccgctgt tgccgctgga ctgctttact 3300
gccggggact gctgttgccc tgctcgcgcc gtcgtcgcag ttcggcttgc ccccactcga 3360
ttgactgctt catttcgagc cgcagcgatg cgatctcgga ttgcgtcaac ggacggggca 3420
gcgcggaggt gtccggcttc tccttgggtg agtcggtcga tgccatagcc aaaggtttcc 3480
ttccaaaatg cgtccattgc tggaccgtgt ttctcattga tgcccgcaag catcttcggc 3540
ttgaccgcca ggtcaagcgc gccttcatgg gcggtcatga cggacgccgc catgaccttg 3600
ccgccgttgt tctcgatgta gccgcgtaat gaggcaatgg tgccgcccat cgtcagcgtg 3660
tcatcgacaa cgatgtactt ctggccgggg atcacctccc cctcgaaagt cgggttgaac 3720
gccaggcgat gatctgaacc ggctccggtt cgggcgacct tctcccgctg cacaatgtcc 3780
gtttcgacct caaggccaag gcggtcggcc agaacgaccg ccatcatggc cggaatcttg 3840
ttgttccccg ccgcctcgac ggcgaggact ggaacgatgc ggggcttgtc gtcgccgatc 3900
agcgtcttga gctgggcaac agtgtcgtcc gaaatcaggc gctcgaccaa attaagcgcc 3960
gcttccgcgt cgccctgctt cgcagcctgg tattcaggct cgttggtcaa agaaccaagg 4020
tcgccgttgc gaaccacctt cgggaagtct ccccacggtg cgcgctcggc tctgctgtag 4080
ctgctcaaga cgcctccctt tttagccgct aaaactctaa cgagtgcgcc cgcgactcaa 4140
cttgacgctt tcggcactta cctgtgcctt gccacttgcg tcataggtga tgcttttcgc 4200
actcccgatt tcaggtactt tatcgaaatc tgaccgggcg tgcattacaa agttcttccc 4260
cacctgttgg taaatgctgc cgctatctgc gtggacgatg ctgccgtcgt ggcgctgcga 4320
cttatcggcc ttttgggcca tatagatgtt gtaaatgcca ggtttcaggg ccccggcttt 4380
atctaccttc tggttcgtcc atgcgccttg gttctcggtc tggacaattc tttgcccatt 4440
catgaccagg aggcggtgtt tcattgggtg actcctgacg gttgcctctg gtgttaaacg 4500
tgtcctggtc gcttgccggc taaaaaaaag ccgacctcgg cagttcgagg ccggctttcc 4560
ctagagccgg gcgcgtcaag gttgttccat ctattttagt gaactgcgtt cgatttatca 4620
gttactttcc tcccgctttg tgtttcctcc cactcgtttc cgcgtctagc cgacccctca 4680
acatagcggc ctcttcttgg gctgcctttg cctcttgccg cgcttcgtca cgctcggctt 4740
gcaccgtcgt aaagcgctcg gcctgcctgg ccgcctcttg cgccgccaac ttcctttgct 4800
cctggtgggc ctcggcgtcg gcctgcgcct tcgctttcac cgctgccaac tccgtgcgca 4860
aactctccgc ttcgcgcctg gtggcgtcgc gctcgccgcg aagcgcctgc atttcctggt 4920
tggccgcgtc cagggtcttg cggctctctt ctttgaatgc gcgggcgtcc tggtgagcgt 4980
agtccagctc ggcgcgcagc tcctgcgctc gacgctccac ctcgtcggcc cgctgcgtcg 5040
ccagcgcggc ccgctgctcg gctcctgcca gggcggtgcg tgcttcggcc agggcttgcc 5100
gctggcgtgc ggccagctcg gccgcctcgg cggcctgctg ctctagcaat gtaacgcgcg 5160
cctgggcttc ttccagctcg cgggcctgcg cctcgaaggc gtcggccagc tccccgcgca 5220
cggcttccaa ctcgttgcgc tcacgatccc agccggcttg cgctgcctgc aacgattcat 5280
tggcaagggc ctgggcggct tgccagaggg cggccacggc ctggttgccg gcctgctgca 5340
ccgcgtccgg cacctggact gccagcgggg cggcctgcgc cgtgcgctgg cgtcgccatt 5400
cgcgcatgcc ggcgctggcg tcgttcatgt tgacgcgggc ggccttacgc actgcatcca 5460
cggtcgggaa gttctcccgg tcgccttgct cgaacagctc gtccgcagcc gcaaaaatgc 5520
ggtcgcgcgt ctctttgttc agttccatgt tggctccggt aattggtaag aataataata 5580
ctcttaccta ccttatcagc gcaagagttt agctgaacag ttctcgactt aacggcaggt 5640
tttttagcgg ctgaagggca ggcaaaaaaa gccccgcacg gtcggcgggg gcaaagggtc 5700
agcgggaagg ggattagcgg gcgtcgggct tcttcatgcg tcggggccgc gcttcttggg 5760
atggagcacg acgaagcgcg cacgcgcatc gtcctcggcc ctatcggccc gcgtcgcggt 5820
caggaacttg tcgcgcgcta ggtcctccct ggtgggcacc aggggcatga actcggcctg 5880
ctcgatgtag gtccactcca tgaccgcatc gcagtcgagg ccgcgttcct tcaccgtctc 5940
ttgcaggtcg cggtacgccc gctcgttgag cggctggtaa cgggccaatt ggtcgtaaat 6000
ggctgtcggc catgagcggc ctttcctgtt gagccagcag ccgacgacga agccggcaat 6060
gcaggcccct ggcacaacca ggccgacgcc gggggcaggg gatggcagca gctcgccaac 6120
caggaacccc gccgcgatga tgccgatgcc ggtcaaccag cccttgaaac tatccggccc 6180
cgaaacaccc ctgcgcattg cctggatgct gcgccggata gcttgcaaca tcaggagccg 6240
tttcttttgt tcgtcagtca tggtccgccc tcaccagttg ttcgtatcgg tgtcggacga 6300
actgaaatcg caagagctgc cggtatcggt ccagccgctg tccgtgtcgc tgctgccgaa 6360
gcacggcgag gggtccgcga acgccgcaga cggcgtatcc ggccgcagcg catcgcccag 6420
catggccccg gtcagcgagc cgccggccag gtagcccagc atggtgctgt tggtcgcccc 6480
ggccaccagg gccgacgtga cgaaatcgcc gtcattccct ctggattgtt cgctgctcgg 6540
cggggcagtg cgccgcgccg gcggcgtcgt ggatggctcg ggttggctgg cctgcgacgg 6600
ccggcgaaag gtgcgcagca gctcgttatc gaccggctgc ggcgtcgggg ccgccgcctt 6660
gcgctgcggt cggtgttcct tcttcggctc gcgcagcttg aacagcatga tcgcggaaac 6720
cagcagcaac gccgcgccta cgcctcccgc gatgtagaac agcatcggat tcattcttcg 6780
gtcctccttg tagcggaacc gttgtctgtg cggcgcgggt ggcccgcgcc gctgtctttg 6840
gggatcagcc ctcgatgagc gcgaccagtt tcacgtcggc aaggttcgcc tcgaactcct 6900
ggccgtcgtc ctcgtacttc aaccaggcat agccttccgc cggcggccga cggttgagga 6960
taaggcgggc agggcgctcg tcgtgctcga cctggacgat ggcctttttc agcttgtccg 7020
ggtccggctc cttcgcgccc ttttccttgg cgtccttacc gtcctggtcg ccgtcctcgc 7080
cgtcctggcc gtcgccggcc tccgcgtcac gctcggcatc agtctggccg ttgaaggcat 7140
cgacggtgtt gggatcgcgg cccttctcgt ccaggaactc gcgcagcagc ttgaccgtgc 7200
cgcgcgtgat ttcctgggtg tcgtcgtcaa gccacgcctc gacttcctcc gggcgcttct 7260
tgaaggccgt caccagctcg ttcaccacgg tcacgtcgcg cacgcggccg gtgttgaacg 7320
catcggcgat cttctccggc aggtccagca gcgtgacgtg ctgggtgatg aacgccggcg 7380
acttgccgat ttccttggcg atatcgcctt tcttcttgcc cttcgccagc tcgcggccaa 7440
tgaagtcggc aatttcgcgc ggggtcagct cgttgcgttg caggttctcg ataacctggt 7500
cggcttcgtt gtagtcgttg tcgatgaacg ccgggatgga cttcttgccg gcccacttcg 7560
agccacggta gcggcgggcg ccgtgattga tgatatagcg gcccggctgc tcctggttct 7620
cgcgcaccga aatgggtgac ttcaccccgc gctctttgat cgtggcaccg atttccgcga 7680
tgctctccgg ggaaaagccg gggttgtcgg ccgtccgcgg ctgatgcgga tcttcgtcga 7740
tcaggtccag gtccagctcg atagggccgg aaccgccctg agacgccgca ggagcgtcca 7800
ggaggctcga caggtcgccg atgctatcca accccaggcc ggacggctgc gccgcgcctg 7860
cggcttcctg agcggccgca gcggtgtttt tcttggtggt cttggcttga gccgcagtca 7920
ttgggaaatc tccatcttcg tgaacacgta atcagccagg gcgcgaacct ctttcgatgc 7980
cttgcgcgcg gccgttttct tgatcttcca gaccggcaca ccggatgcga gggcatcggc 8040
gatgctgctg cgcaggccaa cggtggccgg aatcatcatc ttggggtacg cggccagcag 8100
ctcggcttgg tggcgcgcgt ggcgcggatt ccgcgcatcg accttgctgg gcaccatgcc 8160
aaggaattgc agcttggcgt tcttctggcg cacgttcgca atggtcgtga ccatcttctt 8220
gatgccctgg atgctgtacg cctcaagctc gatgggggac agcacatagt cggccgcgaa 8280
gagggcggcc gccaggccga cgccaagggt cggggccgtg tcgatcaggc acacgtcgaa 8340
gccttggttc gccagggcct tgatgttcgc cccgaacagc tcgcgggcgt cgtccagcga 8400
cagccgttcg gcgttcgcca gtaccgggtt ggactcgatg agggcgaggc gcgcggcctg 8460
gccgtcgccg gctgcgggtg cggtttcggt ccagccgccg gcagggacag cgccgaacag 8520
cttgcttgca tgcaggccgg tagcaaagtc cttgagcgtg taggacgcat tgccctgggg 8580
gtccaggtcg atcacggcaa cccgcaagcc gcgctcgaaa aagtcgaagg caagatgcac 8640
aagggtcgaa gtcttgccga cgccgccttt ctggttggcc gtgaccaaag ttttcatcgt 8700
ttggtttcct gttttttctt ggcgtccgct tcccacttcc ggacgatgta cgcctgatgt 8760
tccggcagaa ccgccgttac ccgcgcgtac ccctcgggca agttcttgtc ctcgaacgcg 8820
gcccacacgc gatgcaccgc ttgcgacact gcgcccctgg tcagtcccag cgacgttgcg 8880
aacgtcgcct gtggcttccc atcgactaag acgccccgcg ctatctcgat ggtctgctgc 8940
cccacttcca gcccctggat cgcctcctgg aactggcttt cggtaagccg tttcttcatg 9000
gataacaccc ataatttgct ccgcgccttg gttgaacata gcggtgacag ccgccagcac 9060
atgagagaag tttagctaaa catttctcgc acgtcaacac ctttagccgc taaaactcgt 9120
ccttggcgta acaaaacaaa agcccggaaa ccgggctttc gtctcttgcc gcttatggct 9180
ctgcacccgg ctccatcacc aacaggtcgc gcacgcgctt cactcggttg cggatcgaca 9240
ctgccagccc aacaaagccg gttgccgccg ccgccaggat cgcgccgatg atgccggcca 9300
caccggccat cgcccaccag gtcgccgcct tccggttcca ttcctgctgg tactgcttcg 9360
caatgctgga cctcggctca ccataggctg accgctcgat ggcgtatgcc gcttctcccc 9420
ttggcgtaaa acccagcgcc gcaggcggca ttgccatgct gcccgccgct ttcccgacca 9480
cgacgcgcgc accaggcttg cggtccagac cttcggccac ggcgagctgc gcaaggacat 9540
aatcagccgc cgacttggct ccacgcgcct cgatcagctc ttgcactcgc gcgaaatcct 9600
tggcctccac ggccgccatg aatcgcgcac gcggcgaagg ctccgcaggg ccggcgtcgt 9660
gatcgccgcc gagaatgccc ttcaccaagt tcgacgacac gaaaatcatg ctgacggcta 9720
tcaccatcat gcagacggat cgcacgaacc cgctgaattg aacacgagca cggcacccgc 9780
gaccactatg ccaagaatgc ccaaggtaaa aattgccggc cccgccatga agtccgtgaa 9840
tgccccgacg gccgaagtga agggcaggcc gccacccagg ccgccgccct cactgcccgg 9900
cacctggtcg ctgaatgtcg atgccagcac ctgcggcacg tcaatgcttc cgggcgtcgc 9960
gctcgggctg atcgcccatc ccgttactgc cccgatcccg gcaatggcaa ggactgccag 10020
cgctgccatt tttggggtga ggccgttcgc ggccgagggg cgcagcccct ggggggatgg 10080
gaggcccgcg ttagcgggcc gggagggttc gagaaggggg ggcacccccc ttcggcgtgc 10140
gcggtcacgc gcacagggcg cagccctggt taaaaacaag gtttataaat attggtttaa 10200
aagcaggtta aaagacaggt tagcggtggc cgaaaaacgg gcggaaaccc ttgcaaatgc 10260
tggattttct gcctgtggac agcccctcaa atgtcaatag gtgcgcccct catctgtcag 10320
cactctgccc ctcaagtgtc aaggatcgcg cccctcatct gtcagtagtc gcgcccctca 10380
agtgtcaata ccgcagggca cttatcccca ggcttgtcca catcatctgt gggaaactcg 10440
cgtaaaatca ggcgttttcg ccgatttgcg aggctggcca gctccacgtc gccggccgaa 10500
atcgagcctg cccctcatct gtcaacgccg cgccgggtga gtcggcccct caagtgtcaa 10560
cgtccgcccc tcatctgtca gtgagggcca agttttccgc gaggtatcca caacgccggc 10620
ggccgcggtg tctcgcacac ggcttcgacg gcgtttctgg cgcgtttgca gggccataga 10680
cggccgccag cccagcggcg agggcaacca gcccggtgag cgtcggaaag gcgctggaag 10740
ccccgtagcg acgcggagag gggcgagaca agccaagggc gcaggctcga tgcgcagcac 10800
gacatagccg gttctcgcaa ggacgagaat ttccctgcgg tgcccctcaa gtgtcaatga 10860
aagtttccaa cgcgagccat tcgcgagagc cttgagtcca cgctagatga gagctttgtt 10920
gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc 10980
gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagcca 11040
cgttgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat catcatgaac 11100
aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc atattcaacg 11160
ggaaacgtct tgctcgactc tagagctcgt tcctcgaggc ctcgaggcct cgaggaacgg 11220
tacctgcggg gaagcttaca ataatgtgtg ttgttaagtc ttgttgcctg tcatcgtctg 11280
actgactttc gtcataaatc ccggcctccg taacccagct ttgggcaagc tcacggattt 11340
gatccggcgg aacgggaata tcgagatgcc gggctgaacg ctgcagttcc agctttccct 11400
ttcgggacag gtactccagc tgattgatta tctgctgaag ggtcttggtt ccacctcctg 11460
gcacaatgcg aatgattact tgagcgcgat cgggcatcca attttctccc gtcaggtgcg 11520
tggtcaagtg ctacaaggca cctttcagta acgagcgacc gtcgatccgt cgccgggata 11580
cggacaaaat ggagcgcagt agtccatcga gggcggcgaa agcctcgcca aaagcaatac 11640
gttcatctcg cacagcctcc agatccgatc gagggtcttc ggcgtaggca gatagaagca 11700
tggatacatt gcttgagagt attccgatgg actgaagtat ggcttccatc ttttctcgtg 11760
tgtctgcatc tatttcgaga aagcccccga tgcggcgcac cgcaacgcga attgccatac 11820
tatccgaaag tcccagcagg cgcgcttgat aggaaaaggt ttcatactcg gccgatcgca 11880
gacgggcact cacgaccttg aacccttcaa ctttcaggga tcgatgctgg ttgatggtag 11940
tctcactcga cgtggctctg gtgtgttttg acatagcttc ctccaaagaa agcggaaggt 12000
ctggatactc cagcacgaaa tgtgcccggg tagacggatg gaagtctagc cctgctcaat 12060
atgaaatcaa cagtacattt acagtcaata ctgaatatac ttgctacatt tgcaattgtc 12120
ttataacgaa tgtgaaataa aaatagtgta acaacgcttt tactcatcga taatcacaaa 12180
aacatttata cgaacaaaaa tacaaatgca ctccggtttc acaggatagg cgggatcaga 12240
atatgcaact tttgacgttt tgttctttca aagggggtgc tggcaaaacc accgcactca 12300
tgggcctttg cgctgctttg gcaaatgacg gtaaacgagt ggccctcttt gatgccgacg 12360
aaaaccggcc tctgacgcga tggagagaaa acgccttaca aagcagtact gggatcctcg 12420
ctgtgaagtc tattccgccg acgaaatgcc ccttcttgaa gcagcctatg aaaatgccga 12480
gctcgaagga tttgattatg cgttggccga tacgcgtggc ggctcgagcg agctcaacaa 12540
cacaatcatc gctagctcaa acctgcttct gatccccacc atgctaacgc cgctcgacat 12600
cgatgaggca ctatctacct accgctacgt catcgagctg ctgttgagtg aaaatttggc 12660
aattcctaca gctgttttgc gccaacgcgt cccggtcggc cgattgacaa catcgcaacg 12720
caggatgtca gagacgctag agagccttcc agttgtaccg tctcccatgc atgaaagaga 12780
tgcatttgcc gcgatgaaag aacgcggcat gttgcatctt acattactaa acacgggaac 12840
tgatccgacg atgcgcctca tagagaggaa tcttcggatt gcgatggagg aagtcgtggt 12900
catttcgaaa ctgatcagca aaatcttgga ggcttgaaga tggcaattcg caagcccgca 12960
ttgtcggtcg gcgaagcacg gcggcttgct ggtgctcgac ccgagatcca ccatcccaac 13020
ccgacacttg ttccccagaa gctggacctc cagcacttgc ctgaaaaagc cgacgagaaa 13080
gaccagcaac gtgagcctct cgtcgccgat cacatttaca gtcccgatcg acaacttaag 13140
ctaactgtgg atgcccttag tccacctccg tccccgaaaa agctccaggt ttttctttca 13200
gcgcgaccgc ccgcgcctca agtgtcgaaa acatatgaca acctcgttcg gcaatacagt 13260
ccctcgaagt cgctacaaat gattttaagg cgcgcgttgg acgatttcga aagcatgctg 13320
gcagatggat catttcgcgt ggccccgaaa agttatccga tcccttcaac tacagaaaaa 13380
tccgttctcg ttcagacctc acgcatgttc ccggttgcgt tgctcgaggt cgctcgaagt 13440
cattttgatc cgttggggtt ggagaccgct cgagctttcg gccacaagct ggctaccgcc 13500
gcgctcgcgt cattctttgc tggagagaag ccatcgagca attggtgaag agggacctat 13560
cggaacccct caccaaatat tgagtgtagg tttgaggccg ctggccgcgt cctcagtcac 13620
cttttgagcc agataattaa gagccaaatg caattggctc aggctgccat cgtccccccg 13680
tgcgaaacct gcacgtccgc gtcaaagaaa taaccggcac ctcttgctgt ttttatcagt 13740
tgagggcttg acggatccgc ctcaagtttg cggcgcagcc gcaaaatgag aacatctata 13800
ctcctgtcgt aaacctcctc gtcgcgtact cgactggcaa tgagaagttg ctcgcgcgat 13860
agaacgtcgc ggggtttctc taaaaacgcg aggagaagat tgaactcacc tgccgtaagt 13920
ttcacctcac cgccagcttc ggacatcaag cgacgttgcc tgagattaag tgtccagtca 13980
gtaaaacaaa aagaccgtcg gtctttggag cggacaacgt tggggcgcac gcgcaaggca 14040
acccgaatgc gtgcaagaaa ctctctcgta ctaaacggct tagcgataaa atcacttgct 14100
cctagctcga gtgcaacaac tttatccgtc tcctcaaggc ggtcgccact gataattatg 14160
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aaatttagat caacaaccac gacatcgacc gtcgcggaag agagtactct agtgaactgg 14280
gtgctgtcgg ctaccgcggt cactttgaag gcgtggatcg taaggtattc gataataaga 14340
tgccgcatag cgacatcgtc atcgataaga agaacgtgtt tcaacggctc acctttcaat 14400
ctaaaatctg aacccttgtt cacagcgctt gagaaatttt cacgtgaagg atgtacaatc 14460
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aaccaagtat ttcaatttta tgacaaaagt tctcaatcgt tgttacaagt gaaacgcttc 14580
gaggttacag ctactattga ttaaggagat cgcctatggt ctcgccccgg cgtcgtgcgt 14640
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gccactggtt ccacctcgaa gcatcataac gggaggagac ttctttaaga ccagaaacac 15300
gcgagcttgg ccgtcgaatg gtcaagctga cggtgcccga gggaacggtc ggcggcagac 15360
agatttgtag tcgttcacca ccaggaagtt cagtggcgca gagggggtta cgtggtccga 15420
catcctgctt tctcagcgcg cccgctaaaa tagcgatatc ttcaagatca tcataagaga 15480
cgggcaaagg catcttggta aaaatgccgg cttggcgcac aaatgcctct ccaggtcgat 15540
tgatcgcaat ttcttcagtc ttcgggtcat cgagccattc caaaatcggc ttcagaagaa 15600
agcgtagttg cggatccact tccatttaca atgtatccta tctctaagcg gaaatttgaa 15660
ttcattaaga gcggcggttc ctcccccgcg tggcgccgcc agtcaggcgg agctggtaaa 15720
caccaaagaa atcgaggtcc cgtgctacga aaatggaaac ggtgtcaccc tgattcttct 15780
tcagggttgg cggtatgttg atggttgcct taagggctgt ctcagttgtc tgctcaccgt 15840
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cctggaaggc gccttgaaca acactcaaga gcatagctcc gctaaaacgc tgccagaagt 15960
ggctgtcgac cgagcccggc aatcctgagc gaccgagttc gtccgcgctt ggcgatgtta 16020
acgagatcat cgcatggtca ggtgtctcgg cgcgatccca caacacaaaa acgcgcccat 16080
ctccctgttg caagccacgc tgtatttcgc caacaacggt ggtgccacga tcaagaagca 16140
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aatttgtgtc gattgcggtt tgcaagatgc acggaattat tgtcccttgc gttaccataa 16260
aatcggggtg cggcaagagc gtggcgctgc tgggctgcag ctcggtgggt ttcatacgta 16320
tcgacaaatc gttctcgccg gacacttcgc cattcggcaa ggagttgtcg tcacgcttgc 16380
cttcttgtct tcggcccgtg tcgccctgaa tggcgcgttt gctgacccct tgatcgccgc 16440
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cctcaatcgg agctggatga aatggcttgg tgtttgttgc gatcaaagtt gacggcgatg 16620
cgttctcatt caccttcttt tggcgcccac ctagccaaat gaggcttaat gataacgcga 16680
gaacgacacc tccgacgatc aatttctgag accccgaaag acgccggcga tgtttgtcgg 16740
agaccaggga tccagatgca tcaacctcat gtgccgcttg ctgactatcg ttattcatcc 16800
cttcgccccc ttcaggacgc gtttcacatc gggcctcacc gtgcccgttt gcggcctttg 16860
gccaacggga tcgtaagcgg tgttccagat acatagtact gtgtggccat ccctcagacg 16920
ccaacctcgg gaaaccgaag aaatctcgac atcgctccct ttaactgaat agttggcaac 16980
agcttccttg ccatcaggat tgatggtgta gatggagggt atgcgtacat tgcccggaaa 17040
gtggaatacc gtcgtaaatc cattgtcgaa gacttcgagt ggcaacagcg aacgatcgcc 17100
ttgggcgacg tagtgccaat tactgtccgc cgcaccaagg gctgtgacag gctgatccaa 17160
taaattctca gctttccgtt gatattgtgc ttccgcgtgt agtctgtcca caacagcctt 17220
ctgttgtgcc tcccttcgcc gagccgccgc atcgtcggcg gggtaggcga attggacgct 17280
gtaatagaga tcgggctgct ctttatcgag gtgggacaga gtcttggaac ttatactgaa 17340
aacataacgg cgcatcccgg agtcgcttgc ggttagcacg attactggct gaggcgtgag 17400
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tgttagaatt gccatgacgt acctcggtgt cacgggtaag attaccgata aactggaact 72360
gattatggct catatcgaaa gtctccttga gaaaggagac tctagtttag ctaaacattg 72420
gttccgctgt caagaacttt agcggctaaa attttgcggg ccgcgaccaa aggtgcgagg 72480
ggcggcttcc gctgtgtaca accagatatt tttcaccaac atccttcgtc tgctcgatga 72540
gcggggcatg acgaaacatg agctgtcgga gagggcaggg gtttcaattt cgtttttatc 72600
agacttaacc aacggtaagg ccaacccctc gttgaaggtg atggaggcca ttgccgacgc 72660
cctggaaact cccctacctc ttctcctgga gtccaccgac cttgaccgcg aggcactcgc 72720
ggagattgcg ggtcatcctt tcaagagcag cgtgccgccc ggatacgaac gcatcagtgt 72780
ggttttgccg tcacataagg cgtttatcgt aaagaaatgg ggcgacgaca cccgaaaaaa 72840
gctgcgtgga aggctctgac gccaagggtt agggcttgca cttccttctt tagccgctaa 72900
aacggcccct tctctgcggg ccgtcggctc gcgcatcata tcgacatcct caacggaagc 72960
cgtgccgcga atggcatcgg gcgggtgcgc tttgacagtt gttttctatc agaaccccta 73020
cgtcgtgcgg ttcgattagc tgtttgtctt gcaggctaaa cactttcggt atatcgtttg 73080
cctgtgcgat aatgttgcta atgatttgtt gcgtaggggt tactgaaaag tgagcgggaa 73140
agaagagttt cagaccatca aggagcgggc caagcgcaag ctggaacgcg acatgggtgc 73200
ggacctgttg gccgcgctca acgacccgaa aaccgttgaa gtcatgctca acgcggacgg 73260
caaggtgtgg cacgaacgcc ttggcgagcc gatgcggtac atctgcgaca tgcggcccag 73320
ccagtcgcag gcgattatag aaacggtggc cggattccac ggcaaagagg tcacgcggca 73380
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ggaacagtac gtcgaggcgg gcatcatgac ccgcgagcaa tacgaggtca ttaaaagcgc 73560
cgtcgcggcg catcgaaaca tcctcgtcat tggcggtact ggctcgggca agaccacgct 73620
cgtcaacgcg atcatcaatg aaatggtcgc cttcaacccg tctgagcgcg tcgtcatcat 73680
cgaggacacc ggcgaaatcc agtgcgccgc agagaacgcc gtccaatacc acaccagcat 73740
cgacgtctcg atgacgctgc tgctcaagac aacgctgcgt atgcgccccg accgcatcct 73800
ggtcggtgag gtacgtggcc ccgaagccct tgatctgttg atggcctgga acaccgggca 73860
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catgcttatc agcatgcacc cggattcacc gaaacccatt gagccgctga ttggcgaggc 73980
ggttcatgtg gtcgtccata tcgccaggac ccctagcggc cgtcgagtgc aagaaattct 74040
cgaagttctt ggttacgaga acggccagta catcaccaaa accctgtaag gagtatttcc 74100
aatgacaacg gctgttccgt tccgtctgac catgaatcgc ggcattttgt tctaccttgc 74160
cgtgttcttc gttctcgctc tcgcgttatc cgcgcatccg gcgatggcct cggaaggcac 74220
cggcggcagc ttgccatatg agagctggct gacgaacctg cgcaactccg taaccggccc 74280
ggtggccttc gcgctgtcca tcatcggcat cgtcgtcgcc ggcggcgtgc tgatcttcgg 74340
cggcgaactc aacgccttct tccgaaccct gatcttcctg gttctggtga tggcgctgct 74400
ggtcggcgcg cagaacgtga tgagcacctt cttcggtcgt ggtgccgaaa tcgcggccct 74460
cggcaacggg gcgctgcacc aggtgcaagt cgcggcggcg gatgccgtgc gtgcggtagc 74520
ggctggacgg ctcgcctaat catggctctg cgcacgatcc ccatccgtcg cgcaggcaac 74580
cgagaaaacc tgttcatggg tggtgatcgt gaactggtga tgttctcggg cctgatggcg 74640
tttgcgctga ttttcagcgc ccaagagctg cgggccaccg tggtcggtct gatcctgtgg 74700
ttcggggcgc tctatgcgtt ccgaatcatg gcgaaggccg atccgaagat gcggttcgtg 74760
tacctgcgtc accgccggta caagccgtat tacccggccc gctcgacccc gttccgcgag 74820
aacaccaata gccaagggaa gcaataccga tgatccaagc aattgcgatt gcaatcgcgg 74880
gcctcggcgc gcttctgttg ttcatcctct ttgcccgcat ccgcgcggtc gatgccgaac 74940
tgaaactgaa aaagcatcgt tccaaggacg ccggcctggc cgatctgctc aactacg 74997
<210> 2
<211> 24867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2
cgtactgcac tgccaccatt caagacaagc tatggtcgtc gccgtgaacg tgagccgcgc 60
atcgttgaag gctaggtcca cgaggaggta gacaagggca catgcgctcc caagagcttg 120
ttcgtgttcg tgacccgacg accgcgcgcg tttgtccgtg ggctcgtggg acgccagcag 180
cccacgcgaa acggttcccc tgccgcgcgc gcgcgcgccc ggtgcatggc tctcctcagc 240
ctccgaatgg agtcatcacc gtcgacgcct cgacggcgcg gaggtgacca aataaggtcc 300
ggctgctcgc agccgtggca cgaaacgagg acacacggac tggtaggagg ctaggggggg 360
cacggacaag accgctccgt tccgttgcct ctcccgcgct ctgcgaggga tgatgcatgg 420
gcagcgcgcg gacacacgga ctggcagcgg ccctgtaccc acgtcgcagt gccgggatcc 480
gcgcctacca cggcacgatc agcgtcatca tggcacaatc attcacgaac ctcccagtcc 540
cagcggattg cacgccgaaa aatcgtcctc tagaagaaag ctttttctcg tcgcacatcg 600
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ttgctttctc ccgtcccggc ccattcaaac cgggccgtcg ttttagtttc tttttatgtt 780
ttacttggtt ttagcggcga ggcgatgcaa cgaagaccac agcagcaaac tactattgtt 840
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ccacagcttc gctcagagcg agaatcactc ttactgagct aaatgataaa aatcggaact 960
gcttcatgtt gagagtggag tgaatctagt ctacactatg tattagaaag tgagagaaaa 1020
aaaacatgct tcccactaca ctactcccaa catgctcccc actctttaac ccctcatgaa 1080
tcatttcaca gcctatttgc caaacaattt tcgtcaaata tattcacttc tagtagagaa 1140
tcactcagaa tcaccaatca gctctcggaa ctagagaatt gatcaaagac aaactctatt 1200
accttcaatg atatgtggtt atgattcatg ttggcaagct gtgatcctgt tgctgctgtt 1260
cccctggtac tttttttttt gtgtgccggt tgagttttta tagtttatgt tgtgctgcat 1320
atgaatgagt tttggtagtt accgtggttg ccgttcacag cggcgttgcc tgctgttcat 1380
atgttggcaa tccgtgaatt tgcatgcttc tatatatgag tttggtgttc aattgtactt 1440
atatactacc aaaaaatacc atagtttcag tgggctgaag aaattaaaac ccatgcatgc 1500
tagtaatgtc atagctaggt gtataccatg gttttccaat accaaactta gctaccaaac 1560
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tgaagcgtga aacctggtaa aaaaaaaaaa cgggggaggc aagaagcatc agggcaggca 1680
ggaggatcct agtacatatc ctacttactg gcttgcagca aggctagctg atggctgcgt 1740
gcgtgcttac atgatgatga tcatgcgtgt cgttcgtact cgtacgagga tcgaggaaag 1800
acaccataac tcaccttcaa cagacaccct tcgttaggag catgcacgga tagatggcgt 1860
ctagcatatc gataggacat gacaagtggt acgatccccg tcacatgtcc atggaggcat 1920
ctgatatgga cacggcgtgt atctatcgcg gctggaacag aaccagcgct cgcgcggcgg 1980
tcggcgggag ggacagacct tggctccgtg cgttcaggtt gtgcttgtgc cgcgcgccac 2040
gcacggtctc cgccgcctgc agctgaaatt ttagatttac atcctatccc tttatttttt 2100
ttatttgtca caattcagtt caaaaatgaa gaacggaggt agtgcatcct ttgtgagact 2160
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gagctagtta ccctatgagg tgacatgaag cgctcacggt tactatgacg gttagcttca 2340
cgactgttgg tggcagtagc gtacgactta gctatagttc cggacttacc gataacttcg 2400
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gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat 2520
tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt 2580
tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata 2640
taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac 2700
agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata 2760
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gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa 2880
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ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt 3000
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cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc 3120
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cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt cccttcctcg 3300
cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc cccaacctcg tgttgttcgg 3360
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gtacgccgct cgtcctcccc cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc 3480
atgcatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg 3540
tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct 3600
gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc 3660
agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt 3720
cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt 3780
gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg 3840
tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc 3900
atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 3960
tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg 4020
gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc 4080
tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt 4140
ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga 4200
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tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc 4320
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ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg caggtcgact 4440
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cgagattgtc tccctactcc agccggtcgc aggtgcacat ccggcgattg ctcacttttt 5040
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tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac tagttatctg 5880
aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac gtgtctttat 5940
aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat aaatattaat 6000
catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg tgttttgcga 6060
atgcgacctt cttatgtgct tctagtctcc aaatgtggtt gatagttatt ttgctctaag 6120
atcaacagta atgaagtata aatcatcgtt gtggtgtgct actcggttaa ttgagcatta 6180
acacacacaa acatgacgag gatggtataa tctccaaaaa tgtgtacttt gttaggtggg 6240
accctatagc cttgattaat gtgctatgtt aggcatgcct ggaaacgtgt gacgcatatg 6300
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atcatgctaa cttttcgtaa ttgcttgatt gaaatatgct tagaataatg cctctttgtt 6600
ctacatggca aatagggacc attatggtgt aacaccctgg gaaccacaaa caccccgaaa 6660
tgctactaaa ctacacaact aaccttcata tataaaattt cgacagcatc tcctttgaaa 6720
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tcggcttctg gcagcgcgac ttcgagctgc cggccccgcc gcgcccggtg cgcccggtga 9720
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atcgttgaag gctaggtcca cgaggaggta gacaagggca catgcgctcc caagagcttg 120
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cccacgcgaa acggttcccc tgccgcgcgc gcgcgcgccc ggtgcatggc tctcctcagc 240
ctccgaatgg agtcatcacc gtcgacgcct cgacggcgcg gaggtgacca aataaggtcc 300
ggctgctcgc agccgtggca cgaaacgagg acacacggac tggtaggagg ctaggggggg 360
cacggacaag accgctccgt tccgttgcct ctcccgcgct ctgcgaggga tgatgcatgg 420
gcagcgcgcg gacacacgga ctggcagcgg ccctgtaccc acgtcgcagt gccgggatcc 480
gcgcctacca cggcacgatc agcgtcatca tggcacaatc attcacgaac ctcccagtcc 540
cagcggattg cacgccgaaa aatcgtcctc tagaagaaag ctttttctcg tcgcacatcg 600
gcgcttctgc tcggcacggc atgtgaaact gtcagggcac aggggtaggt ttactgacaa 660
ggtttgattt cttttccggc tgctgagcac ggtccgcgac tgggagcaaa ttcaatgccc 720
ttgctttctc ccgtcccggc ccattcaaac cgggccgtcg ttttagtttc tttttatgtt 780
ttacttggtt ttagcggcga ggcgatgcaa cgaagaccac agcagcaaac tactattgtt 840
tcagggtcat ttctaataca ctctccgtcc taaaatatta ggtggcgctt ggcagagttt 900
ccacagcttc gctcagagcg agaatcactc ttactgagct aaatgataaa aatcggaact 960
gcttcatgtt gagagtggag tgaatctagt ctacactatg tattagaaag tgagagaaaa 1020
aaaacatgct tcccactaca ctactcccaa catgctcccc actctttaac ccctcatgaa 1080
tcatttcaca gcctatttgc caaacaattt tcgtcaaata tattcacttc tagtagagaa 1140
tcactcagaa tcaccaatca gctctcggaa ctagagaatt gatcaaagac aaactctatt 1200
accttcaatg atatgtggtt atgattcatg ttggcaagct gtgatcctgt tgctgctgtt 1260
cccctggtac tttttttttt gtgtgccggt tgagttttta tagtttatgt tgtgctgcat 1320
atgaatgagt tttggtagtt accgtggttg ccgttcacag cggcgttgcc tgctgttcat 1380
atgttggcaa tccgtgaatt tgcatgcttc tatatatgag tttggtgttc aattgtactt 1440
atatactacc aaaaaatacc atagtttcag tgggctgaag aaattaaaac ccatgcatgc 1500
tagtaatgtc atagctaggt gtataccatg gttttccaat accaaactta gctaccaaac 1560
acatactact gcatctgtat atataatgca ctggtgtgca gccgtcagcc gtgtgccttc 1620
tgaagcgtga aacctggtaa aaaaaaaaaa cgggggaggc aagaagcatc agggcaggca 1680
ggaggatcct agtacatatc ctacttactg gcttgcagca aggctagctg atggctgcgt 1740
gcgtgcttac atgatgatga tcatgcgtgt cgttcgtact cgtacgagga tcgaggaaag 1800
acaccataac tcaccttcaa cagacaccct tcgttaggag catgcacgga tagatggcgt 1860
ctagcatatc gataggacat gacaagtggt acgatccccg tcacatgtcc atggaggcat 1920
ctgatatgga cacggcgtgt atctatcgcg gctggaacag aaccagcgct cgcgcggcgg 1980
tcggcgggag ggacagacct tggctccgtg cgttcaggtt gtgcttgtgc cgcgcgccac 2040
gcacggtctc cgccgcctgc agctgaaatt ttagatttac atcctatccc tttatttttt 2100
ttatttgtca caattcagtt caaaaatgaa gaacggaggt agtgcatcct ttgtgagact 2160
aatgaaaatc acatctggat cctgaaatcg gcgtcgtaac ctacaaggcc acggactgga 2220
ttagatagtg gtccatggtg cataatgagg atcgaggggt acctcactga ctagctaatc 2280
gagctagtta ccctatgagg tgacatgaag cgctcacggt tactatgacg gttagcttca 2340
cgactgttgg tggcagtagc gtacgactta gctatagttc cggacttacc gataacttcg 2400
tatagcatac attatacgaa gttatggcgc cgctagcctg cagtgcagcg tgacccggtc 2460
gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat 2520
tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt 2580
tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata 2640
taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac 2700
agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata 2760
taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt tagggttaat ggtttttata 2820
gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa 2880
aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa aatagaataa cataaagtga 2940
ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt 3000
ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag 3060
cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc 3120
ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca 3180
gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct 3240
cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt cccttcctcg 3300
cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc cccaacctcg tgttgttcgg 3360
agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc gtcggcacct ccgcttcaag 3420
gtacgccgct cgtcctcccc cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc 3480
atgcatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg 3540
tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct 3600
gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc 3660
agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt 3720
cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt 3780
gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg 3840
tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc 3900
atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 3960
tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg 4020
gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc 4080
tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt 4140
ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga 4200
tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc 4260
tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc 4320
atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt 4380
ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg caggtcgact 4440
ttaacttagc ctagggaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 4500
ttcagatcca ccgggatccc cgatcatgca aaaactcatt aactcagtgc aaaactatgc 4560
ctggggcagc aaaacggcgt tgactgaact ttatggtatg gaaaatccgt ccagccagcc 4620
gatggccgag ctgtggatgg gcgcacatcc gaaaagcagt tcacgagtgc agaatgccgc 4680
cggagatatc gtttcactgc gtgatgtgat tgagagtgat aaatcgactc tgctcggaga 4740
ggccgttgcc aaacgctttg gcgaactgcc tttcctgttc aaagtattat gcgcagcaca 4800
gccactctcc attcaggttc atccaaacaa acacaattct gaaatcggtt ttgccaaaga 4860
aaatgccgca ggtatcccga tggatgccgc cgagcgtaac tataaagatc ctaaccacaa 4920
gccggagctg gtttttgcgc tgacgccttt ccttgcgatg aacgcgtttc gtgaattttc 4980
cgagattgtc tccctactcc agccggtcgc aggtgcacat ccggcgattg ctcacttttt 5040
acaacagcct gatgccgaac gtttaagcga actgttcgcc agcctgttga atatgcaggg 5100
tgaagaaaaa tcccgcgcgc tggcgatttt aaaatcggcc ctcgatagcc agcagggtga 5160
accgtggcaa acgattcgtt taatttctga attttacccg gaagacagcg gtctgttctc 5220
cccgctattg ctgaatgtgg tgaaattgaa ccctggcgaa gcgatgttcc tgttcgctga 5280
aacaccgcac gcttacctgc aaggcgtggc gctggaagtg atggcaaact ccgataacgt 5340
gctgcgtgcg ggtctgacgc ctaaatacat tgatattccg gaactggttg ccaatgtgaa 5400
attcgaagcc aaaccggcta accagttgtt gacccagccg gtgaaacaag gtgcagaact 5460
ggacttcccg attccagtgg atgattttgc cttctcgctg catgacctta gtgataaaga 5520
aaccaccatt agccagcaga gtgccgccat tttgttctgc gtcgaaggcg atgcaacgtt 5580
gtggaaaggt tctcagcagt tacagcttaa accgggtgaa tcagcgttta ttgccgccaa 5640
cgaatcaccg gtgactgtca aaggccacgg ccgtttagcg cgtgtttaca acaagctgta 5700
agagcttact gaaaaaatta acatctcttg ctaagctggg ggtggaacct agacttgtcc 5760
atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca catagtgaca 5820
tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac tagttatctg 5880
aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac gtgtctttat 5940
aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat aaatattaat 6000
catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg tgttttgcga 6060
atgcgacctt cttatgtgct tctagtctcc aaatgtggtt gatagttatt ttgctctaag 6120
atcaacagta atgaagtata aatcatcgtt gtggtgtgct actcggttaa ttgagcatta 6180
acacacacaa acatgacgag gatggtataa tctccaaaaa tgtgtacttt gttaggtggg 6240
accctatagc cttgattaat gtgctatgtt aggcatgcct ggaaacgtgt gacgcatatg 6300
ttttgtgaac ctgttgatat tatatgtgct tttatattac catattttat taaaatacta 6360
atatttatta ctagtaagat ataacattct atctagctta aaaactaacc ataaatattc 6420
cataataact agatttacca aactaatata ctaaatatac ataataaata caaaattaac 6480
aagacaataa tcaatattta tgagcttaat atatttagac attatggttg gtcgacgata 6540
atcatgctaa cttttcgtaa ttgcttgatt gaaatatgct tagaataatg cctctttgtt 6600
ctacatggca aatagggacc attatggtgt aacaccctgg gaaccacaaa caccccgaaa 6660
tgctactaaa ctacacaact aaccttcata tataaaattt cgacagcatc tcctttgaaa 6720
atttgcatag acgtggaagc aacagagtat aaacagatat catgataaga aaacatacta 6780
gacattaata atctgctaga aatgggaaga atcctaactt gacgactgcg taactgacta 6840
gagtcacact tagctgaccc tagtcactta caactgactt cgtgtcctag gcttaggcta 6900
ctgctagtcc gcggtgtatc cgtgatcgag ttggcgccag acggaatctg ttctccatcg 6960
ctgacatcct cgagtagatc acattcaagc ttgatatcga attcctgcag cccatccctc 7020
agccgccttt cactatcttt tttgcccgag tcattgtcat gtgaaccttg gcatgtataa 7080
tcggtgaatt gcgtcgattt tcctcttata ggtgggccaa tgaatccgtg tgatcgcgtc 7140
tgattggcta gagatatgtt tcttccttgt tggatgtatt ttcatacata atcatatgca 7200
tacaaatatt tcattacact ttatagaaat ggtcagtaat aaaccctatc actatgtctg 7260
gtgtttcatt ttatttgctt ttaaacgaaa attgacttcc tgattcaata tttaaggatc 7320
gtcaacggtg tgcagttact aaattctggt ttgtaggaac tatagtaaac tattcaagtc 7380
ttcacttatt gtgcactcac ctctcgccac atcaccacag atgttattca cgtcttaaat 7440
ttgaactaca catcatattg acacaatatt ttttttaaat aagcgattaa aacctagcct 7500
ctatgtcaac aatggtgtac ataaccagcg aagtttaggg agtaaaaaac atcgccttac 7560
acaaagttcg ctttaaaaaa taaagagtaa attttacttt ggaccaccct tcaaccaatg 7620
tttcacttta gaacgagtaa ttttattatt gtcactttgg accaccctca aatctttttt 7680
ccatctacat ccaatttatc atgtcaaaga aatggtctac atacagctaa ggagatttat 7740
cgacgaatag tagctagcat actcgaggtc attcatatgc ttgagaagag agtcgggata 7800
gtccaaaata aaacaaaggt aagattacct ggtcaaaagt gaaaacatca gttaaaaggt 7860
ggtataaagt aaaatatcgg taataaaagg tggcccaaag tgaaatttac tcttttctac 7920
tattataaaa attgaggatg tttttgtcgg tactttgata cgtcattttt gtatgaattg 7980
gtttttaagt ttattcgctt ttggaaatgc atatctgtat ttgagtcggg ttttaagttc 8040
gtttgctttt gtaaatacag agggatttgt ataagaaata tctttaaaaa aacccatatg 8100
ctaatttgac ataatttttg agaaaaatat atattcaggc gaattctcac aatgaacaat 8160
aataagatta aaatagcttt cccccgttgc agcgcatggg tattttttct agtaaaaata 8220
aaagataaac ttagactcaa aacatttaca aaaacaaccc ctaaagttcc taaagcccaa 8280
agtgctatcc acgatccata gcaagcccag cccaacccaa cccaacccaa cccaccccag 8340
tccagccaac tggacaatag tctccacacc cccccactat caccgtgagt tgtccgcacg 8400
caccgcacgt ctcgcagcca aaaaaaaaaa aagaaagaaa aaaaagaaaa agaaaaaaca 8460
gcaggtgggt ccgggtcgtg ggggccggaa acgcgaggag gatcgcgagc cagcgacgag 8520
gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatcg ccactatata catacccccc 8580
cctctcctcc catcccccca accctaccac caccaccacc accacctcca cctcctcccc 8640
cctcgctgcc ggacgacgag ctcctccccc ctccccctcc gccgccgccg cgccggtaac 8700
caccccgccc ctctcctctt tctttctccg tttttttttt ccgtcacggt ctcgatcttt 8760
ggccttggta gtttgggtgg gcgagaggcg gcttcgtgcg cgcccagatc ggtgcgcggg 8820
aggggcggga tctcgcggct ggggctctcg ccggcgtgga tcaggcccgg atctcgcggg 8880
gaatggggct ctcggatgta gatctgcgat ccgccgttgt tgggggagat gatggggggt 8940
ttaaaatttc cgccatgcta aacaagatca ggaagagggg aaaagggcac tatggtttat 9000
atttttatat atttctgctg cttcgtcagg cttagatgtg ctagatcttt ctttcttctt 9060
tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttcatgatt 9120
tgtgacaaat gcagcctcgt gcggagcttt tttgtaggta gaaggatcca cacgacacca 9180
tgtcccccga gcgccgcccc gtcgagatcc gcccggccac cgccgccgac atggccgccg 9240
tgtgcgacat cgtgaaccac tacatcgaga cctccaccgt gaacttccgc accgagccgc 9300
agaccccgca ggagtggatc gacgacctgg agcgcctcca ggaccgctac ccgtggctcg 9360
tggccgaggt ggagggcgtg gtggccggca tcgcctacgc cggcccgtgg aaggcccgca 9420
acgcctacga ctggaccgtg gagtccaccg tgtacgtgtc ccaccgccac cagcgcctcg 9480
gcctcggctc caccctctac acccacctcc tcaagagcat ggaggcccag ggcttcaagt 9540
ccgtggtggc cgtgatcggc ctcccgaacg acccgtccgt gcgcctccac gaggccctcg 9600
gctacaccgc ccgcggcacc ctgcgcgccg ccggctacaa gcacggcggc tggcacgacg 9660
tcggcttctg gcagcgcgac ttcgagctgc cggccccgcc gcgcccggtg cgcccggtga 9720
cgcagatctg agtcgacctg caggcatgcc gctgaaatca ccagtctctc tctacaaatc 9780
tatctctctc tataataatg tgtgagtagt tcccagataa gggaattagg gttcttatag 9840
ggtttcgctc atgtgttgag catataagaa acccttagta tgtatttgta tttgtaaaat 9900
acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc cagtggcgag ctaatgcggc 9960
ccgaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac ctggtggcgc cgctaggggc 10020
tgcaggaatt cctgcagccc gggggatcca ctagttctag agcggccgac ctcgacagat 10080
ctaagcttac tagtgccgtg ggtcgtttaa gctgccgctg tacctgtgtc gtctggtgcc 10140
ttctggtgta cctgggaggt tgtcgtctat caagtatctg tggttggtgt catgagtcag 10200
tgagtcccaa tactgttcgt gtcctgtgtg cattataccc aaaactgtta tgggcaaatc 10260
atgaataagc ttgatgttcg aacttaaaag tctctgctca atatggtatt atggttgttt 10320
ttgttcgtct cctaatattt gcctgggatc aaattttatt ggctggtgtt catttgacct 10380
ccatgttctt gctaggctcc attttttact ctacagccat aatatgtttg attgtttggt 10440
ttgttctttg ttgtacacct ggttctgtcg agcttagttt tcgacactgg cttacagctt 10500
aacatgttgc tattttattg ggttctgatt gctattttat tgggttctga ttgctagttt 10560
ttgctgaatc caaaaaccat gttatttatt taagcgatcc aggttattat tatgatggtg 10620
gctaagtttt tttttttcca agggtaaatt ttctggattc tccagtgttt ctgtggccga 10680
attcactagt gattcagatc tgatatcgat gggcccacta actatctata ctgtaataat 10740
gttgtatagc cgccggatag ctagctagtt tagtcattca gcggcgatgg gtaataataa 10800
agtgtcatcc atccatcacc atgggtggca acgtgagcaa tgacctgatt gaacaaattg 10860
aaatgaaaag aagaaatatg ttatatgtca acgagatttc ctcataatgc cactgacgac 10920
gtgtgtccaa gaaatgtatc agtgatacgt atattcacaa tttttttatg acttatactc 10980
acaatttgtt tttttactac ttatactcac aatttgttgt gggtaccata acaatttcga 11040
tcgaatatat atcagaaagt tgacgaaagt aagctcactc aaaaagttaa atgggctgcg 11100
gaagctgcgt caggcccaag ttttggctat tctatccggt atccacgatt ttgatggctg 11160
agggacatat gttcgcttaa gcttggtcac ccggtccggg cctagaaggc cagcttcaag 11220
tttgtacaaa aaagcaggct ccggccagaa tctcactgac tagctaaaca gcggccgctt 11280
ttaagtatga ccaattttta agtataaacc cctcacgatt ggttattttt ttaagtataa 11340
ccaattttta agtataaacc cctcaccaat ttttaagtat aaacctagcg actaataaac 11400
acaacttctt gccaaagtgt gagcatcacc attggatctg cgcccctcac gaacagtctt 11460
cgccggggta aaattctcca aattaaagtc atcttgatgt ccttgatcac ctgtccataa 11520
ggcccaatcc cagctccacg tatacttctg ataagattga catagtcact tgcatgccag 11580
tgtggaactc tggatgccta ggtcagaggc tagtgactgg ccttcccggc atgctagcat 11640
gtagcatgcc aaggatctgg ctgctccagg tttgttatgc ctgacatcac catagggatg 11700
agagcaagta taataatagg ctgtaagctt taaatgctca ggtggagaaa aaaaggagag 11760
gagaggagag agaaaagtgg gctataagct tatagctgtg ttagacataa gaatcagaaa 11820
cttcgtatga gagacaggtg agctatatat taataacaaa gagctaacta ttatatgagt 11880
gaaccgagag aaggctgtaa aaaaacttac acaatcaacg atcgacatta ttattaacct 11940
tgctctgtct tgcgagacct ctttgacaaa gctacatcaa tgccggccaa gtgccttggg 12000
atttgggaat ggcttctttc ctcccttcct cggttgtccc ccaaggccta ggcttgccac 12060
gctgtattca gtcgcagccg cctttacttt tgccctttgt ggaagttttg taataaatgg 12120
tctgattcta tcttcggata gatgaagccg gatgtttcat ccattatcta aaaaaaagtt 12180
ggttgctttg ctgagctaag aaagtgtaat ccagagtgcc cgtaacgtat tcatgtacat 12240
aactattatc taatataaat cttcttttgt cgcaaaaaaa ggtcggccca tcagaacaaa 12300
tgatcaatgt aaggcccaaa atttgtgtct caaatgtcat ttacgtttcc aagctaaaca 12360
aaaacacagg attcatataa ttttgctggt ggcttaggct tcgtccaata gtgcttagtt 12420
taatttgtat atacctgcac catggtattc gtctggcctt ggatcttgcg catcaattgc 12480
ctatggacga tgatcgcagc cacgccacat tcatttttaa tcgccatttg cttgacaccc 12540
aatgcctctg caccacttgc gcacgctacg caccgtctga tacgccaaga tcccgagcta 12600
aaataacacc caatcatcag atgaaaacaa gcgcgagtgc gagccagccc atggcagcga 12660
tcttggccat ttgcggagcc aactgaaagc cgtgcacaaa atattcgaca ccgtataagg 12720
gaaaacacta gttatacgag gtgggcaata atccagatct cggactcttc ctaacccggt 12780
tcacatgcat agcatatatg atggccggcc ggggttcaca tgaacgccat cccgtgccct 12840
agtgcactga tttcttaatt tcgaatttta agtatgacca atttttaagt ataaacccct 12900
cacgattggt tattttttta agtataacca atttttaagt ataaacccct caccaatttt 12960
taagtataaa cctagcgact aataaacaca acttcttgcc aaagtgtgag catcaccatt 13020
ggatctgcgc ccctcacgaa cagtcttcgc cggggtaaaa ttctccaaat taaagtcatc 13080
ttgatgtcct tgatcacctg tccataaggc ccaatcccag ctccacgtat acttctgata 13140
agattgacat agtcacttgc atgccagtgt ggaactctgg atgcctaggt cagaggctag 13200
tgactggcct tcccggcatg ctagcatgta gcatgccaag gatctggctg ctccaggttt 13260
gttatgcctg acatcaccat agggatgaga gcaagtataa taataggctg taagctttaa 13320
atgctcaggt ggagaaaaaa aggagaggag aggagagaga aaagtgggct ataagcttat 13380
agctgtgtta gacataagaa tcagaaactt cgtatgagag acaggtgagc tatatattaa 13440
taacaaagag ctaactatta tatgagtgaa ccgagagaag gctgtaaaaa aacttacaca 13500
atcaacgatc gacattatta ttaaccttgc tctgtcttgc gagacctctt tgacaaagct 13560
acatcaatgc cggccaagtg ccttgggatt tgggaatggc ttctttcctc ccttcctcgg 13620
ttgtccccca aggcctaggc ttgccacgct gtattcagtc gcagccgcct ttacttttgc 13680
cctttgtgga agttttgtaa taaatggtct gattctatct tcggatagat gaagccggat 13740
gtttcatcca ttatctaaaa aaaagttggt tgctttgctg agctaagaaa gtgtaatcca 13800
gagtgcccgt aacgtattca tgtacataac tattatctaa tataaatctt cttttgtcgc 13860
aaaaaaaggt cggcccatca gaacaaatga tcaatgtaag gcccaaaatt tgtgtctcaa 13920
atgtcattta cgtttccaag ctaaacaaaa acacaggatt catataattt tgctggtggc 13980
ttaggcttcg tccaatagtg cttagtttaa tttgtatata cctgcaccat ggtattcgtc 14040
tggccttgga tcttgcgcat caattgccta tggacgatga tcgcagccac gccacattca 14100
tttttaatcg ccatttgctt gacacccaat gcctctgcac cacttgcgca cgctacgcac 14160
cgtctgatac gccaagatcc cgagctaaaa taacacccaa tcatcagatg aaaacaagcg 14220
cgagtgcgag ccagcccatg gcagcgatct tggccatttg cggagccaac tgaaagccgt 14280
gcacaaaata ttcgacaccg tataagggaa aacactagtt atacgaggtg ggcaataatc 14340
cagatctcgg actcttccta acccggttca catgcatagc atatatgatg gccggccggg 14400
gttcacatga acgccatccc gtgccctagt gcactgattt cttaatgtcg acgggccgct 14460
tttaagtatg accaattttt aagtataaac ccctcacgat tggttatttt tttaagtata 14520
accaattttt aagtataaac ccctcaccaa tttttaagta taaacctagc gactaataaa 14580
cacaacttct tgccaaagtg tgagcatcac cattggatct gcgcccctca cgaacagtct 14640
tcgccggggt aaaattctcc aaattaaagt catcttgatg tccttgatca cctgtccata 14700
aggcccaatc ccagctccac gtatacttct gataagattg acatagtcac ttgcatgcca 14760
gtgtggaact ctggatgcct aggtcagagg ctagtgactg gccttcccgg catgctagca 14820
tgtagcatgc caaggatctg gctgctccag gtttgttatg cctgacatca ccatagggat 14880
gagagcaagt ataataatag gctgtaagct ttaaatgctc aggtggagaa aaaaaggaga 14940
ggagaggaga gagaaaagtg ggctataagc ttatagctgt gttagacata agaatcagaa 15000
acttcgtatg agagacaggt gagctatata ttaataacaa agagctaact attatatgag 15060
tgaaccgaga gaaggctgta aaaaaactta cacaatcaac gatcgacatt attattaacc 15120
ttgctctgtc ttgcgagacc tctttgacaa agctacatca atgccggcca agtgccttgg 15180
gatttgggaa tggcttcttt cctcccttcc tcggttgtcc cccaaggcct aggcttgcca 15240
cgctgtattc agtcgcagcc gcctttactt ttgccctttg tggaagtttt gtaataaatg 15300
gtctgattct atcttcggat agatgaagcc ggatgtttca tccattatct aaaaaaaagt 15360
tggttgcttt gctgagctaa gaaagtgtaa tccagagtgt tcgtaacgta ttcatgtaca 15420
taactattat ctaatataaa tcttcttttg tcgcaaaaaa aggtcggccc atcagaacaa 15480
atgatcaatg taaggcccaa aatttgtgtc tcaaatgtca tttacgtttc caagctaaac 15540
aaaaacacag gattcatata attttgctgg tggcttaggc ttcgtccaat agtgcttagt 15600
ttaatttgta tatacctgca ccatggtatt cgtctggcct tggatcttgc gcatcaattg 15660
cctatggacg atgatcgcag ccacgccaca ttcattttta atcgccattt gcttgacacc 15720
caatgcctct gcaccacttg cgcacgctac gcaccgtctg atacgccaag atcccgagct 15780
aaaataacac ccaatcatca gatgaaaaca agcgcgagtg cgagccagcc catggcagcg 15840
atcttggcca tttgcggagc caactgaaag ccgtgcacaa aatattcgac accgtataag 15900
ggaaaacact agttatacga ggtgggcaat aatccagatc tcggactctt cctaacccgg 15960
ttcacatgca tagcatatat gatggccggc cggggttcac atgaacgcca tcccgtgccc 16020
tagtgcactg atttcttaat cccatccagc atgctcttca attttggtgc tcacccttac 16080
gggtatgccc tcactgcctt ttataattgt ataagggaaa tattattcaa tataatgtcc 16140
taaaaattgg caatatcaat ctaaaaatcg ttatgaatag gatgtaaaca aagctactat 16200
ctgtccatat ataacgtcac aggaaggaca aaaaattcag tcagcgatcg agaacggcaa 16260
agaaaaacca tattattgtt gcttgccgac ataaatttaa gtataggaca aaaaaaaaag 16320
ccacatcata ttacatacta tgggcttacc agacaaaatg aaataaacgt gtgcatgcat 16380
gcatgcatgg tacgaacgtc tggatagagt ctccgagctg agtgtggtcc gacgtggaag 16440
tgtacgtctc aacacacgac gcatgtgacc gacaagggca agttgaagtc tatgcatgga 16500
tgggcctgag cgccgcgctg aatgaatctg gacgggtggt agggcatctc ggtgggcaaa 16560
acaaataact ccgtgtgctg catggctgcc tttggaatct ttgcatgcag ctgtgtgctg 16620
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tgccttggta attcatcatg tagtacgtag catcagctag tatttatctc aagtatatat 16800
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gggtagatcc gaaacaggcc ggatctggac catgtccgcg gcggggcggc gggacttgat 17160
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gctttccaca tagcatttcg aactttttga ctactattga caccccccta acttgccgaa 17760
ctatttctct cttcagctac tatttaccta gttataatta cataaatgtt tgtgtgtatc 17820
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agctggccgt gaaggtgaag ctcagcggaa gctacggcta cttcagcgct agcgtggaga 18240
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ttcctggtgt caagcaggct ctcgctacga tggacgcaac ccagctcttc gacacgttcg 18420
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gcatcgcagg aggcgaagtc agccccgaga gcaaggtcct cgccgagatg ctgcgcgaga 18600
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cgaaggcatc ccagtcgtac atccccagct acgtcactcg cccagcagtc gtgggcctcg 18840
aggtcatcat ctccgactcc aactccgaga gccctccata cggctacacc cggatcgact 18900
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gttatctcat tattgggcct cataaattca taattcttgc cagttagtga caactgtagc 19500
ttaggtttac ttctgcttgt agtacatcgc ctagatcgtg ggagtccctc ttttcagacg 19560
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gctgtttttt acggccaagt tcagagtttt ttttttcatg tacaaagtat cagcagttaa 19680
attatgttac ctttaccatg gttcttcata tttgttttcc ttccattgct caatctatgt 19740
catcttttga aatggtttgg aaggcatcct ttataggata tatagatata gatttgaagc 19800
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ctgaatatag ttgcaagact agggctctct tatagtattt ctaattatag ccgctttgca 20160
aagtactgtc atatttgatt aggggtattg gaaagaagga gaaaagggtg acaccctgct 20220
tgacaattgg aattgataag cagccagggt accaaggcgc gaaacagccc cctccggcgg 20280
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aattaaacgt tttaaccttt taataggttt atacaataat tgatatatgt tttctgtata 20520
tgtctaattt gttatcatcc atttagatat agacgaaaaa aaatctaaga actaaaacaa 20580
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cgcgtaggcg tacccaacaa ttttgatcga ctatcagaaa gtcaacggaa gcgctgcaga 20760
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atgtccttgt gagtctcttt atcatcgttt cgtctttaca ttatatgtgc tacttttgtc 21000
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cttgtcattc agtaaaatcc gagaattgtg aagctctaat tgaagctaat tcgttttata 21300
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agttccacct atatcaaacc tctatacccc accacaacaa tattatatac tttcatcttc 22080
aactaactca tgtaccttcc aatttttttc tactaataat tatttacgtg cacagaaact 22140
tagcaaggag agagagagcg gggtgaccaa gcttggcgcg ccattctatc actagctagc 22200
tgctaattat tcccgggcac ccagctttct tgtacaaagt ggccgttaca gaatcactga 22260
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tggccaaagt catcatttaa tgagctctcg ggcgcgccgt ctcactagct agctgctaac 22380
gttcccgggc aactttatta tacaaagttg atagatccta caggccagaa tggcctctgg 22440
attcagcggc ctagaaggcc gaagtacttg gtcttcctaa tatcggaccg aggaccgatt 22500
aaactttaat tcggtccgtc aatattcacc gaagcgacta attaactagc tgtcccacgg 22560
cctaactagc acttaatccc ctagcctaac ctaagagcgc taatctaggc tagtggtcac 22620
ttagggcttt aaggctagcg tatacgaagt tcctattccg aagttcctat tcttcaaaaa 22680
gtataggaac ttctgtacac ctgagctgat tccgatgact tcgtaggttc ctagctcaag 22740
ccgctcgtgt ccaagcgtca cttacgatta gctaatgatt acggcatcta ggaccgacta 22800
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gaaaactttg attgtggccg tcctaattgt gaagtttagg ccggggggaa cttcatgaac 22920
cctatcgaag cttaattagt tcttttttgt tgttagccat gtttgtattg tagtttaggt 22980
gaacaacatg acgccgcacc cgcgatctca gggctcgtcc ccacacagga gggcacgtcg 23040
tcgtcttcgc cgccgagcat cagagattca gagcacgtac acgcacatct caagcaaacg 23100
gagtagtacg tcctactcct acgtacatac ctagccgacg acctttatgt gcacaccacc 23160
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gaatggtttg agaaaagact cggtagcttc cccaccaagt ctcacaatag aaacattatg 23760
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ttctccatag cctcctggaa cccagcaagc gcaaactctt cactcttgct cccctcgacc 24000
atcatagcca aaaccaaata accaatgaat ctaaaacggt cacaattgat aataataacc 24060
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atgagttgaa tatgaagtta cactttg 24867
<210> 4
<211> 1434
<212> DNA
<213> Ophioglossum pendulum
<400> 4
atggaaccca acaaaggtgg tgctccagcc atgaaaaatg tagccaaacc ttccacaaag 60
agactcatac cgtcatccat tgctgcatca tcgcaaacat ctgcaaatgc attaaccgag 120
ccattgcctg gctctgatgc catcggccag agctacgatg cattcgggtt cttcgccaat 180
cccagaagca tcatgaagga gttgttcgag ttcagtcctc aagaggagat agtcgtggaa 240
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ctggctacca tggatgctac gcagctcttt gacacgttcg ggactcacta tgtgagcgag 600
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tctccggagt ccaaggtgct tgcggagatg ctgagagaga acagcagcac acgcctgtac 780
gctcttggcg ggagtgccct ccccaacatc acagatccag ccacgtacaa cgcctggctg 840
gagtccattg acaccatccc tgtcttctgc ggattcactc aaaacagcct caagtccatc 900
tcggagcttg ctgactccgc tcaacgccgg gacgctctgg ccaaagcctc ccaaagctat 960
atcccatcat acgtgactcg tcctgcagtg gttggcttgg aggtcataat atcggacagc 1020
aactcggaga gccctcccta tggctacacc agaatagact acgacctcaa ccgcaacgca 1080
ggaggcaaat acgtgttcct ctgctacaag cagaagaaca tttcagtggg aggggatgcc 1140
gatgccatca ccgacgtcct tgtcgtctac ggaaatgacc gaaatccatc tgtgccgtct 1200
ggctacacca agatcgacaa ggacctcaac tccggggcag gcggtaagta tatctacttc 1260
tgctactcca aggacaagcg gaagcaagag gagggactgc ccattcgtgg gcttcgtgtt 1320
gttgggcctc acccaacctc agtggcacct tacggattct ctaagatcga catagatctg 1380
aatatgggtg caggaggaga ttttatatac ctttgcaaat cacgccattt ggag 1434
<210> 5
<211> 478
<212> PRT
<213> Ophioglossum pendulum
<400> 5
Met Glu Pro Asn Lys Gly Gly Ala Pro Ala Met Lys Asn Val Ala Lys
1 5 10 15
Pro Ser Thr Lys Arg Leu Ile Pro Ser Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gln
20 25 30
Thr Ser Ala Asn Ala Leu Thr Glu Pro Leu Pro Gly Ser Asp Ala Ile
35 40 45
Gly Gln Ser Tyr Asp Ala Phe Gly Phe Phe Ala Asn Pro Arg Ser Ile
50 55 60
Met Lys Glu Leu Phe Glu Phe Ser Pro Gln Glu Glu Ile Val Val Glu
65 70 75 80
Gly Asn Thr Trp Leu Leu Ser Ser Asp Phe Val Tyr Thr Ala Ile Arg
85 90 95
Asp Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Arg Arg Thr Lys Asp Asp Tyr Ser
100 105 110
Lys Glu Leu Ala Val Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser Tyr Gly Tyr Phe
115 120 125
Ser Ala Ser Val Glu Ser Asp Phe Ser Gln Ser Ile Ser Asp Ala Thr
130 135 140
Asp Thr Thr Tyr Thr Ser Val Arg Thr His Val Asn Lys Trp Arg Leu
145 150 155 160
Ser Leu Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Arg Ser Lys Leu Leu Pro Gly
165 170 175
Val Lys Gln Ala Leu Ala Thr Met Asp Ala Thr Gln Leu Phe Asp Thr
180 185 190
Phe Gly Thr His Tyr Val Ser Glu Val Leu Val Gly Gly Arg Ala Asp
195 200 205
Tyr Val Ala Thr Thr Lys Thr Ser Ala Phe Ser Ser Ser Thr Ser Ile
210 215 220
Ser Val Ala Ala Glu Ala Ser Phe Gln Ser Ile Ala Gly Gly Glu Val
225 230 235 240
Ser Pro Glu Ser Lys Val Leu Ala Glu Met Leu Arg Glu Asn Ser Ser
245 250 255
Thr Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Ala Leu Pro Asn Ile Thr Asp
260 265 270
Pro Ala Thr Tyr Asn Ala Trp Leu Glu Ser Ile Asp Thr Ile Pro Val
275 280 285
Phe Cys Gly Phe Thr Gln Asn Ser Leu Lys Ser Ile Ser Glu Leu Ala
290 295 300
Asp Ser Ala Gln Arg Arg Asp Ala Leu Ala Lys Ala Ser Gln Ser Tyr
305 310 315 320
Ile Pro Ser Tyr Val Thr Arg Pro Ala Val Val Gly Leu Glu Val Ile
325 330 335
Ile Ser Asp Ser Asn Ser Glu Ser Pro Pro Tyr Gly Tyr Thr Arg Ile
340 345 350
Asp Tyr Asp Leu Asn Arg Asn Ala Gly Gly Lys Tyr Val Phe Leu Cys
355 360 365
Tyr Lys Gln Lys Asn Ile Ser Val Gly Gly Asp Ala Asp Ala Ile Thr
370 375 380
Asp Val Leu Val Val Tyr Gly Asn Asp Arg Asn Pro Ser Val Pro Ser
385 390 395 400
Gly Tyr Thr Lys Ile Asp Lys Asp Leu Asn Ser Gly Ala Gly Gly Lys
405 410 415
Tyr Ile Tyr Phe Cys Tyr Ser Lys Asp Lys Arg Lys Gln Glu Glu Gly
420 425 430
Leu Pro Ile Arg Gly Leu Arg Val Val Gly Pro His Pro Thr Ser Val
435 440 445
Ala Pro Tyr Gly Phe Ser Lys Ile Asp Ile Asp Leu Asn Met Gly Ala
450 455 460
Gly Gly Asp Phe Ile Tyr Leu Cys Lys Ser Arg His Leu Glu
465 470 475
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 6
gcatctagga ccgactagct aactaac 27
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 7
ctttgcatca tgtcttgaac aatg 24
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 8
cgccatgagg agcaa 15
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 9
gctggccgtg aaggtgaa 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 10
tccacgctag cgctgaagta 20
<210> 11
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 11
ctcagcggaa gcta 14
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 12
tgactgtcaa aggccacgg 19
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 13
agatggacaa gtctaggttc cacc 24
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 14
ccgtttagcg cgtgtttaca acaagctg 28
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 15
catcgtgaac cactacatcg agac 24
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 16
gtcgatccac tcctgcgg 18
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 17
accgtgaact tccgcaccga gc 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 18
ttggactaga aatctcgtgc tga 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 19
gctacatagg gagccttgtc ct 22
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 20
gcgtttgtgt ggattg 16
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 21
gcatctagga ccgactagct aactaactag ggcgccatga ggagcaatca ttgttcaaga 60
catgatgcaa ag 72
<210> 22
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 22
gctggccgtg aaggtgaagc tcagcggaag ctacggctac ttcagcgcta gcgtgga 57
<210> 23
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 23
tgactgtcaa aggccacggc cgtttagcgc gtgtttacaa caagctgtaa gagcttactg 60
aaaaaattaa catctcttgc taagctgggg gtggaaccta gacttgtcca tct 113
<210> 24
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 24
catcgtgaac cactacatcg agacctccac cgtgaacttc cgcaccgagc cgcagacccc 60
gcaggagtgg atcgac 76
<210> 25
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 25
ttggactaga aatctcgtgc tgattaattg ttttacgcgt gcgtttgtgt ggattgtagg 60
acaaggctcc ctatgtagc 79
<210> 26
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 26
cgaggggtac 10
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 27
aggatcgagg ggtacctcac 20
<210> 28
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 28
ccatggtgca taatgaggat cgaggggtac ctcactgact agctaatcga 50
<210> 29
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 29
gcgccatgag 10
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 30
agggcgcgcc atgaggagca 20
<210> 31
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 31
actagctaac taactagggc gcgccatgag gagcaatcat tgttcaagac 50
<210> 32
<211> 24867
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 32
cgtactgcac tgccaccatt caagacaagc tatggtcgtc gccgtgaacg tgagccgcgc 60
atcgttgaag gctaggtcca cgaggaggta gacaagggca catgcgctcc caagagcttg 120
ttcgtgttcg tgacccgacg accgcgcgcg tttgtccgtg ggctcgtggg acgccagcag 180
cccacgcgaa acggttcccc tgccgcgcgc gcgcgcgccc ggtgcatggc tctcctcagc 240
ctccgaatgg agtcatcacc gtcgacgcct cgacggcgcg gaggtgacca aataaggtcc 300
ggctgctcgc agccgtggca cgaaacgagg acacacggac tggtaggagg ctaggggggg 360
cacggacaag accgctccgt tccgttgcct ctcccgcgct ctgcgaggga tgatgcatgg 420
gcagcgcgcg gacacacgga ctggcagcgg ccctgtaccc acgtcgcagt gccgggatcc 480
gcgcctacca cggcacgatc agcgtcatca tggcacaatc attcacgaac ctcccagtcc 540
cagcggattg cacgccgaaa aatcgtcctc tagaagaaag ctttttctcg tcgcacatcg 600
gcgcttctgc tcggcacggc atgtgaaact gtcagggcac aggggtaggt ttactgacaa 660
ggtttgattt cttttccggc tgctgagcac ggtccgcgac tgggagcaaa ttcaatgccc 720
ttgctttctc ccgtcccggc ccattcaaac cgggccgtcg ttttagtttc tttttatgtt 780
ttacttggtt ttagcggcga ggcgatgcaa cgaagaccac agcagcaaac tactattgtt 840
tcagggtcat ttctaataca ctctccgtcc taaaatatta ggtggcgctt ggcagagttt 900
ccacagcttc gctcagagcg agaatcactc ttactgagct aaatgataaa aatcggaact 960
gcttcatgtt gagagtggag tgaatctagt ctacactatg tattagaaag tgagagaaaa 1020
aaaacatgct tcccactaca ctactcccaa catgctcccc actctttaac ccctcatgaa 1080
tcatttcaca gcctatttgc caaacaattt tcgtcaaata tattcacttc tagtagagaa 1140
tcactcagaa tcaccaatca gctctcggaa ctagagaatt gatcaaagac aaactctatt 1200
accttcaatg atatgtggtt atgattcatg ttggcaagct gtgatcctgt tgctgctgtt 1260
cccctggtac tttttttttt gtgtgccggt tgagttttta tagtttatgt tgtgctgcat 1320
atgaatgagt tttggtagtt accgtggttg ccgttcacag cggcgttgcc tgctgttcat 1380
atgttggcaa tccgtgaatt tgcatgcttc tatatatgag tttggtgttc aattgtactt 1440
atatactacc aaaaaatacc atagtttcag tgggctgaag aaattaaaac ccatgcatgc 1500
tagtaatgtc atagctaggt gtataccatg gttttccaat accaaactta gctaccaaac 1560
acatactact gcatctgtat atataatgca ctggtgtgca gccgtcagcc gtgtgccttc 1620
tgaagcgtga aacctggtaa aaaaaaaaaa cgggggaggc aagaagcatc agggcaggca 1680
ggaggatcct agtacatatc ctacttactg gcttgcagca aggctagctg atggctgcgt 1740
gcgtgcttac atgatgatga tcatgcgtgt cgttcgtact cgtacgagga tcgaggaaag 1800
acaccataac tcaccttcaa cagacaccct tcgttaggag catgcacgga tagatggcgt 1860
ctagcatatc gataggacat gacaagtggt acgatccccg tcacatgtcc atggaggcat 1920
ctgatatgga cacggcgtgt atctatcgcg gctggaacag aaccagcgct cgcgcggcgg 1980
tcggcgggag ggacagacct tggctccgtg cgttcaggtt gtgcttgtgc cgcgcgccac 2040
gcacggtctc cgccgcctgc agctgaaatt ttagatttac atcctatccc tttatttttt 2100
ttatttgtca caattcagtt caaaaatgaa gaacggaggt agtgcatcct ttgtgagact 2160
aatgaaaatc acatctggat cctgaaatcg gcgtcgtaac ctacaaggcc acggactgga 2220
ttagatagtg gtccatggtg cataatgagg atcgaggggt acctcactga ctagctaatc 2280
gagctagtta ccctatgagg tgacatgaag cgctcacggt tactatgacg gttagcttca 2340
cgactgttgg tggcagtagc gtacgactta gctatagttc cggacttacc gataacttcg 2400
tatagcatac attatacgaa gttatggcgc cgctagcctg cagtgcagcg tgacccggtc 2460
gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat taccacatat 2520
tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat atttaaactt 2580
tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat cagtgtttta gagaatcata 2640
taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagta ttttgacaac aggactctac 2700
agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata 2760
taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt tagggttaat ggtttttata 2820
gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa 2880
aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa aatagaataa cctaaagtga 2940
ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt 3000
ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag 3060
cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc 3120
ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca 3180
gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct 3240
cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt cccttcctcg 3300
cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc cccaacctcg tgttgttcgg 3360
agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc gtcggcacct ccgcttcaag 3420
gtacgccgct cgtcctcccc cccccccctc tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc 3480
atgcatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg 3540
tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct 3600
gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc 3660
agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt 3720
cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt 3780
gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg 3840
tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc 3900
atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 3960
tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg 4020
gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc 4080
tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt 4140
ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga 4200
tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc 4260
tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc 4320
atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt 4380
ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt gttacttctg caggtcgact 4440
ttaacttagc ctagggaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 4500
ttcagatcca ccgggatccc cgatcatgca aaaactcatt aactcagtgc aaaactatgc 4560
ctggggcagc aaaacggcgt tgactgaact ttatggtatg gaaaatccgt ccagccagcc 4620
gatggccgag ctgtggatgg gcgcacatcc gaaaagcagt tcacgagtgc agaatgccgc 4680
cggagatatc gtttcactgc gtgatgtgat tgagagtgat aaatcgactc tgctcggaga 4740
ggccgttgcc aaacgctttg gcgaactgcc tttcctgttc aaagtattat gcgcagcaca 4800
gccactctcc attcaggttc atccaaacaa acacaattct gaaatcggtt ttgccaaaga 4860
aaatgccgca ggtatcccga tggatgccgc cgagcgtaac tataaagatc ctaaccacaa 4920
gccggagctg gtttttgcgc tgacgccttt ccttgcgatg aacgcgtttc gtgaattttc 4980
cgagattgtc tccctactcc agccggtcgc aggtgcacat ccggcgattg ctcacttttt 5040
acaacagcct gatgccgaac gtttaagcga actgttcgcc agcctgttga atatgcaggg 5100
tgaagaaaaa tcccgcgcgc tggcgatttt aaaatcggcc ctcgatagcc agcagggtga 5160
accgtggcaa acgattcgtt taatttctga attttacccg gaagacagcg gtctgttctc 5220
cccgctattg ctgaatgtgg tgaaattgaa ccctggcgaa gcgatgttcc tgttcgctga 5280
aacaccgcac gcttacctgc aaggcgtggc gctggaagtg atggcaaact ccgataacgt 5340
gctgcgtgcg ggtctgacgc ctaaatacat tgatattccg gaactggttg ccaatgtgaa 5400
attcgaagcc aaaccggcta accagttgtt gacccagccg gtgaaacaag gtgcagaact 5460
ggacttcccg attccagtgg atgattttgc cttctcgctg catgacctta gtgataaaga 5520
aaccaccatt agccagcaga gtgccgccat tttgttctgc gtcgaaggcg atgcaacgtt 5580
gtggaaaggt tctcagcagt tacagcttaa accgggtgaa tcagcgttta ttgccgccaa 5640
cgaatcaccg gtgactgtca aaggccacgg ccgtttagcg cgtgtttaca acaagctgta 5700
agagcttact gaaaaaatta acatctcttg ctaagctggg ggtggaacct agacttgtcc 5760
atcttctgga ttggccaact taattaatgt atgaaataaa aggatgcaca catagtgaca 5820
tgctaatcac tataatgtgg gcatcaaagt tgtgtgttat gtgtaattac tagttatctg 5880
aataaaagag aaagagatca tccatatttc ttatcctaaa tgaatgtcac gtgtctttat 5940
aattctttga tgaaccagat gcatttcatt aaccaaatcc atatacatat aaatattaat 6000
catatataat taatatcaat tgggttagca aaacaaatct agtctaggtg tgttttgcga 6060
atgcgacctt cttatgtgct tctagtctcc aaatgtggtt gatagttatt ttgctctaag 6120
atcaacagta atgaagtata aatcatcgtt gtggtgtgct actcggttaa ttgagcatta 6180
acacacacaa acatgacgag gatggtataa tctccaaaaa tgtgtacttt gttaggtggg 6240
accctatagc cttgattaat gtgctatgtt aggcatgcct ggaaacgtgt gacgcatatg 6300
ttttgtgaac ctgttgatat tatatgtgct tttatattac catattttat taaaatacta 6360
atatttatta ctagtaagat ataacattct atctagctta aaaactaacc ataaatattc 6420
cataataact agatttacca aactaatata ctaaatatac ataataaata caaaattaac 6480
aagacaataa tcaatattta tgagcttaat atatttagac attatggttg gtcgacgata 6540
atcatgctaa cttttcgtaa ttgcttgatt gaaatatgct tagaataatg cctctttgtt 6600
ctacatggca aatagggacc attatggtgt aacaccctgg gaaccacaaa caccccgaaa 6660
tgctactaaa ctacacaact aaccttcata tataaaattt cgacagcatc tcctttgaaa 6720
atttgcatag acgtggaagc aacagagtat aaacagatat catgataaga aaacatacta 6780
gacattaata atctgctaga aatgggaaga atcctaactt gacgactgcg taactgacta 6840
gagtcacact tagctgaccc tagtcactta caactgactt cgtgtcctag gcttaggcta 6900
ctgctagtcc gcggtgtatc cgtgatcgag ttggcgccag acggaatctg ttctccatcg 6960
ctgacatcct cgagtagatc acattcaagc ttgatatcga attcctgcag cccatccctc 7020
agccgccttt cactatcttt tttgcccgag tcattgtcat gtgaaccttg gcatgtataa 7080
tcggtgaatt gcgtcgattt tcctcttata ggtgggccaa tgaatccgtg tgatcgcgtc 7140
tgattggcta gagatatgtt tcttccttgt tggatgtatt ttcatacata atcatatgca 7200
tacaaatatt tcattacact ttatagaaat ggtcagtaat aaaccctatc actatgtctg 7260
gtgtttcatt ttatttgctt ttaaacgaaa attgacttcc tgattcaata tttaaggatc 7320
gtcaacggtg tgcagttact aaattctggt ttgtaggaac tatagtaaac tattcaagtc 7380
ttcacttatt gtgcactcac ctctcgccac atcaccacag atgttattca cgtcttaaat 7440
ttgaactaca catcatattg acacaatatt ttttttaaat aagcgattaa aacctagcct 7500
ctatgtcaac aatggtgtac ataaccagcg aagtttaggg agtaaaaaac atcgccttac 7560
acaaagttcg ctttaaaaaa taaagagtaa attttacttt ggaccaccct tcaaccaatg 7620
tttcacttta gaacgagtaa ttttattatt gtcactttgg accaccctca aatctttttt 7680
ccatctacat ccaatttatc atgtcaaaga aatggtctac atacagctaa ggagatttat 7740
cgacgaatag tagctagcat actcgaggtc attcatatgc ttgagaagag agtcgggata 7800
gtccaaaata aaacaaaggt aagattacct ggtcaaaagt gaaaacatca gttaaaaggt 7860
ggtataaagt aaaatatcgg taataaaagg tggcccaaag tgaaatttac tcttttctac 7920
tattataaaa attgaggatg tttttgtcgg tactttgata cgtcattttt gtatgaattg 7980
gtttttaagt ttattcgctt ttggaaatgc atatctgtat ttgagtcggg ttttaagttc 8040
gtttgctttt gtaaatacag agggatttgt ataagaaata tctttaaaaa aacccatatg 8100
ctaatttgac ataatttttg agaaaaatat atattcaggc gaattctcac aatgaacaat 8160
aataagatta aaatagcttt cccccgttgc agcgcatggg tattttttct agtaaaaata 8220
aaagataaac ttagactcaa aacatttaca aaaacaaccc ctaaagttcc taaagcccaa 8280
agtgctatcc acgatccata gcaagcccag cccaacccaa cccaacccaa cccaccccag 8340
tccagccaac tggacaatag tctccacacc cccccactat caccgtgagt tgtccgcacg 8400
caccgcacgt ctcgcagcca aaaaaaaaaa aagaaagaaa aaaaagaaaa agaaaaaaca 8460
gcaggtgggt ccgggtcgtg ggggccggaa acgcgaggag gatcgcgagc cagcgacgag 8520
gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatcg ccactatata catacccccc 8580
cctctcctcc catcccccca accctaccac caccaccacc accacctcca cctcctcccc 8640
cctcgctgcc ggacgacgag ctcctccccc ctccccctcc gccgccgccg cgccggtaac 8700
caccccgccc ctctcctctt tctttctccg tttttttttt ccgtcacggt ctcgatcttt 8760
ggccttggta gtttgggtgg gcgagaggcg gcttcgtgcg cgcccagatc ggtgcgcggg 8820
aggggcggga tctcgcggct ggggctctcg ccggcgtgga tcaggcccgg atctcgcggg 8880
gaatggggct ctcggatgta gatctgcgat ccgccgttgt tgggggagat gatggggggt 8940
ttaaaatttc cgccatgcta aacaagatca ggaagagggg aaaagggcac tatggtttat 9000
atttttatat atttctgctg cttcgtcagg cttagatgtg ctagatcttt ctttcttctt 9060
tttgtgggta gaatttgaat ccctcagcat tgttcatcgg tagtttttct tttcatgatt 9120
tgtgacaaat gcagcctcgt gcggagcttt tttgtaggta gaaggatcca cacgacacca 9180
tgtcccccga gcgccgcccc gtcgagatcc gcccggccac cgccgccgac atggccgccg 9240
tgtgcgacat cgtgaaccac tacatcgaga cctccaccgt gaacttccgc accgagccgc 9300
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tggccgaggt ggagggcgtg gtggccggca tcgcctacgc cggcccgtgg aaggcccgca 9420
acgcctacga ctggaccgtg gagtccaccg tgtacgtgtc ccaccgccac cagcgcctcg 9480
gcctcggctc caccctctac acccacctcc tcaagagcat ggaggcccag ggcttcaagt 9540
ccgtggtggc cgtgatcggc ctcccgaacg acccgtccgt gcgcctccac gaggccctcg 9600
gctacaccgc ccgcggcacc ctgcgcgccg ccggctacaa gcacggcggc tggcacgacg 9660
tcggcttctg gcagcgcgac ttcgagctgc cggccccgcc gcgcccggtg cgcccggtga 9720
cgcagatctg agtcgacctg caggcatgcc gctgaaatca ccagtctctc tctacaaatc 9780
tatctctctc tataataatg tgtgagtagt tcccagataa gggaattagg gttcttatag 9840
ggtttcgctc atgtgttgag catataagaa acccttagta tgtatttgta tttgtaaaat 9900
acttctatca ataaaatttc taattcctaa aaccaaaatc cagtggcgag ctaatgcggc 9960
ccgaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac ctggtggcgc cgctaggggc 10020
tgcaggaatt cctgcagccc gggggatcca ctagttctag agcggccgac ctcgacagat 10080
ctaagcttac tagtgccgtg ggtcgtttaa gctgccgctg tacctgtgtc gtctggtgcc 10140
ttctggtgta cctgggaggt tgtcgtctat caagtatctg tggttggtgt catgagtcag 10200
tgagtcccaa tactgttcgt gtcctgtgtg cattataccc aaaactgtta tgggcaaatc 10260
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aacatgttgc tattttattg ggttctgatt gctattttat tgggttctga ttgctagttt 10560
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gctaagtttt tttttttcca agggtaaatt ttctggattc tccagtgttt ctgtggccga 10680
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ttagccgaag tcgataactt tggcaacaac agaagaggat ggagaaaata cattattatc 24600
ctgatggtat ttgtaaacaa tgtttgtaaa accttggggc atgattataa ttctatataa 24660
agacagttca ttttcctata aataggtgag cagtaccctg cataaggcat ctttttgagg 24720
ggtgatcact tcgtttaact tagcttacag agaacctttg taccatcttg tgtgtggagc 24780
tgaaggtatg cttgtacacc tttatcaaga gagatagagt aaattgctaa ggcatataag 24840
atgagttgaa tatgaagtta cactttg 24867
Claims (55)
- 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 유전자형을 포함하는 옥수수 식물로서, 상기 유전자형은 서열번호 26 및 서열번호 29에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자형은 서열번호 27 및 서열번호 30에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자형은 서열번호 28 및 서열번호 31에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 작동 가능하게 연결된 제1 및 제2 발현 카세트를 포함하는 DNA 구축물로서, 상기 제1 발현 카세트는
1) sb-RCc3 인핸서
2) zm-PCOa 프로모터;
3) zm-HPLV9 인트론;
4) ipd079Ea; 및
5) sb-SCI-1B 터미네이터를 포함하는 것인, DNA 구축물. - 제4항의 DNA 구축물을 포함하는 식물.
- 제5항에 있어서, 옥수수 식물인 식물.
- 서열번호 21에 기재된 서열을 포함하는 식물.
- 옥수수 이벤트 DP-915635-4로서, 상기 옥수수 이벤트의 종자의 대표적인 샘플은 수탁번호 PTA-126746으로 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁된 것인, 옥수수 이벤트.
- 제8항의 옥수수 이벤트의 식물 부분.
- 옥수수 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 종자로서, 서열번호 26 및 서열번호 29로부터 선택된 DNA 분자를 포함하고, 옥수수 이벤트 DP-915635-4 종자의 대표적인 샘플은 수탁번호 PTA-126746으로 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁된 것인, 종자.
- 제10항의 종자로부터 성장한 옥수수 식물 또는 이의 부분.
- 제8항의 옥수수 식물로부터 생산된 형질전환 종자.
- 제12항의 종자로부터 성장한 형질전환 옥수수 식물 또는 이의 부분.
- 서열번호 21 및 26 내지 31로부터 선택된 뉴클레오티드 서열 및 이의 전체 길이 상보체를 포함하는 단리된 핵산 분자.
- 서열번호 22 내지 25로부터 선택된 핵산 서열 및 이의 전체 길이 상보체를 포함하는 앰플리콘.
- 옥수수 이벤트 DP-915635-4 식물, 조직 또는 종자로부터 유래된 생물학적 샘플로서, 서열번호 26 및 서열번호 29로부터 선택된 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열은 핵산 증폭 또는 핵산 혼성화 방법을 사용하여 상기 샘플에서 검출 가능하고, 상기 옥수수 이벤트 DP-915635-4 종자의 대표적인 샘플은 수탁번호 PTA-126746으로 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁된 것인, 생물학적 샘플.
- 제16항에 있어서, 형질전환 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 식물, 식물 조직 또는 종자를 포함하는 생물학적 샘플.
- 제17항에 있어서, 형질전환 옥수수 식물 이벤트 DP-915635-4로부터 추출된 DNA 샘플이고, 상기 DNA 샘플은 서열번호 21 내지 31로부터 선택된 뉴클레오티드 중 하나 이상 및 이의 상보체를 포함하는 것인, 생물학적 샘플.
- 제16항에 있어서, 옥수수 가루, 옥수수 분쇄물, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분 및 옥수수 부산물을 함유하도록 전체적으로 또는 부분적으로 제조된 곡물로부터 선택된 생물학적 샘플.
- 옥수수 이벤트 DP-915635-4 식물, 조직 또는 종자로부터 유래되고 서열번호 26 및 서열번호 29로부터 선택된 서열이거나 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 추출물로서, 상기 옥수수 이벤트 DP-915635-4 종자의 대표적인 샘플은 수탁번호 PTA-126746으로 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁된 것인, 추출물.
- 제20항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 핵산 증폭 또는 핵산 혼성화 방법을 이용하여 상기 추출물에서 검출 가능한 것인, 추출물.
- 제21항에 있어서, 형질전환 옥수수 식물 이벤트 DP-915635-4의 식물, 식물 조직 또는 종자를 포함하는 추출물.
- 제22항에 있어서, 옥수수 가루, 옥수수 분쇄물, 옥수수 시럽, 옥수수유, 옥수수 전분 및 옥수수 부산물을 함유하도록 전체적으로 또는 부분적으로 제조된 곡물로부터 선택된 조성물이고, 상기 조성물은 검출 가능한 양의 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 추출물.
- 잡종 옥수수 종자의 생산 방법으로서,
a) 서열번호 21 내지 31로부터 선택된 뉴클레오티드를 포함하는 제1 근친교배 옥수수 계통 및 상이한 유전자형을 갖는 제2 근친교배 계통을 유성 교배시키는 단계;
b) 상기 교배로부터 자손을 성장시키는 단계; 및
c) 이에 의해 생산된 잡종 종자를 수확하는 단계를 포함하는 방법. - 제24항에 있어서, 제1 근친교배 옥수수 계통은 자친인 것인, 방법.
- 제24항에 있어서, 제1 근친교배 옥수수 계통은 웅친인 것인, 방법.
- 딱정벌레목 해충에 저항성인 옥수수 식물을 생산하는 방법으로서,
a) 제1 모 옥수수 식물을 제2 모 옥수수 식물과 유성 교배시키고, 여기서 상기 제1 또는 제2 모 옥수수 식물은 이벤트 DP-915635-4를 포함하여, 복수의 1세대 자손 식물을 생산하는 단계;
b) 1세대 자손 식물을 자가수정시켜 복수의 2세대 자손 식물을 생산하는 단계; 및
c) 이벤트 DP-915635-4를 포함하고 딱정벌레목 해충에 저항성인 2세대 자손 식물로부터 선택하는 단계를 포함하는 방법. - 잡종 옥수수 종자의 생산 방법으로서,
a) 제1항의 DNA 구축물을 포함하는 제1 근친교배 옥수수 계통을 제1항의 DNA 구축물을 포함하지 않는 제2 근친교배 계통과 유성 교배시키는 단계; 및
b) 이에 의해 생산된 잡종 종자를 수확하는 단계를 포함하는 방법. - 제28항에 있어서, 옥수수 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 2세대 자손 식물을 옥수수 이벤트 DP-915635-4 DNA가 결여된 모 식물에 역교배시켜 딱정벌레목 해충에 저항성인 역교배 자손 식물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 옥수수 뿌리벌레에 저항성인 옥수수 식물을 생산하는 방법으로서,
a) 제1 모 옥수수 식물을 제2 모 옥수수 식물과 교배시키고, 여기서 상기 제1 또는 제2 모 옥수수 식물은 이벤트 DP-915635-4를 포함하여, 복수의 1세대 자손 식물을 생산하는 단계;
b) 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 1세대 자손 식물을 선택하는 단계;
c) 단계 (b)의 1세대 자손 식물을 옥수수 이벤트 DP-915635-4 DNA가 결여된 모 식물과 역교배시켜 복수의 역교배 자손 식물을 생산하는 단계; 및
d) 역교배 자손 식물로부터 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 식물을 선택하는 단계를 포함하고,
단계 (d)의 선택된 역교배 자손 식물은 서열번호 21, 26 또는 29를 포함하는 것인, 방법. - 제30항에 있어서, 제1 모 옥수수 계통의 식물은 자친 또는 웅친인 것인, 방법.
- 제30항의 방법에 의해 생산된 잡종 종자.
- 생물학적 샘플에서 이벤트 DP-915635-4를 포함하는 옥수수 식물의 접합성을 결정하는 방법으로서,
a) 상기 샘플을 DNA 분자의 제1 쌍 및 DNA 분자의 별개의 제2 쌍과 접촉시켜,
1) 옥수수 이벤트 DP-915635-4 DNA를 포함하는 핵산 증폭 반응에 사용될 경우 이벤트 DP-915635-4에 대해 특징적인 제1 앰플리콘을 생성하고,
2) DP-915635-4 DNA 이외의 옥수수 게놈 DNA를 포함하는 핵산 증폭 반응에 사용될 경우 DP-915635-4 DNA 이외의 옥수수 게놈 DNA에 대해 특징적인 제2 앰플리콘을 생성하는 단계;
b) 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
c) 그렇게 생성된 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하고, 두 앰플리콘의 존재의 검출은 상기 샘플이 옥수수 이벤트 DP-915635-4 DNA에 대해 이형접합임을 나타내고, 단지 제1 앰플리콘의 검출은 상기 샘플이 옥수수 이벤트 DP-915635-4 DNA에 대해 동형접합임을 나타내는 것인, 방법. - 제33항에 있어서, DNA 분자의 제1 쌍은 프라이머 쌍 서열번호 6 및 7을 포함하는 것인, 방법.
- 제33항에 있어서, DNA 분자의 제1 및 제2 쌍은 검출 가능한 라벨을 포함하는 것인, 방법.
- 제35항에 있어서, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨인, 방법.
- 제35항에 있어서, 검출 가능한 라벨은 프라이머 분자 중 하나 이상과 공유 결합된 것인, 방법.
- 옥수수 핵산을 포함하는 샘플에서 이벤트 DP-915635-4에 고유한 핵산 분자의 존재를 검출하는 방법으로서,
a) 이벤트 DP-915635-4로부터의 게놈 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용될 때 이벤트 DP-915635-4에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성하는 한 쌍의 프라이머와 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 핵산 증폭 반응을 수행하여 이벤트 DP-915635-4에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
c) 이벤트 DP-915635-4에 대해 특징적인 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하는 방법. - 제38항에 있어서, 이벤트 DP-915635-4에 대해 특징적인 핵산 분자는 핵산 증폭 연쇄 반응에 의해 생성된 앰플리콘인, 방법.
- 제38항에 있어서, 프로브는 검출 가능한 라벨을 포함하는 것인, 방법.
- 제40항에 있어서, 검출 가능한 라벨은 형광 라벨인, 방법.
- 제40항에 있어서, 검출 가능한 라벨은 프로브와 공유 결합된 것인, 방법.
- 중합효소 연쇄 반응 방법의 결과로서 이벤트 DP-915635-4에 대해 특징적인 앰플리콘을 생성하기 위해 샘플에서 이벤트 DP-915635-4 DNA 주형을 표적으로 하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 폴리뉴클레오티드 프라이머.
- 제43항에 있어서,
a) 제1 폴리뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 6에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보체를 포함하고;
b) 제2 폴리뉴클레오티드 프라이머는 서열번호 7에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 및 이의 상보체를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오티드 프라이머 쌍. - 제43항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머는 적어도 18개의 뉴클레오티드인 것인, 프라이머 쌍.
- 샘플에서 이벤트 DP-915635-4에 해당하는 DNA의 존재를 검출하는 방법으로서,
a) 엄격한 혼성화 조건 하에서 옥수수 이벤트 DP-915635-4로부터의 DNA와 혼성화하고 상기 엄격한 혼성화 조건 하에서 비-DP-915635-4 옥수수 식물 DNA와 혼성화하지 않는 폴리뉴클레오티드 프로브와 옥수수 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및
c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하고,
혼성화의 검출은 이벤트 DP-915635-4의 존재를 나타내는 것인, 방법. - 핵산 검출 방법에서 프라이머 또는 프로브로 기능하기에 충분한 길이의 인접 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 이벤트 DP-915635-4에 고유하고, 샘플에서 표적 핵산 서열의 증폭 또는 이에 대한 혼성화에 이은 앰플리콘 또는 표적 서열에 대한 혼성화의 검출 시, 샘플에서 이벤트 DP-915635-4에 고유한 핵산 서열의 존재에 대해 특징적인 핵산을 검출하기 위한 키트.
- 제47항에 있어서, 핵산 분자는 서열번호 6 내지 31로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 키트.
- 제47항에 있어서, 핵산 분자는 서열번호 6 내지 31로부터 선택된 프라이머 및 이의 상보체인 것인, 키트.
- 옥수수 이벤트 DP-915635-4의 유전자형을 포함하는 옥수수 식물로서, 상기 유전자형은 서열번호 26 및 서열번호 29와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 제50항에 있어서, 상기 유전자형은 서열번호 27 및 서열번호 30과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 제50항에 있어서, 상기 유전자형은 서열번호 28 및 서열번호 31과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 제50항에 있어서, 유전자형은 서열번호 26 또는 서열번호 27 중 하나에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드 변화를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 옥수수 식물.
- 양치식물로부터 살충 단백질을 발현하고, 옥수수 뿌리벌레에 대해 살충 활성을 나타내는 박테리아 단백질과 조합하여 옥수수 뿌리벌레에 대해 적어도 약 0.15의 평균 마디 손상 뿌리 등급을 나타내고, 선택적으로 옥수수 뿌리벌레의 내인성 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 발현하는 옥수수 식물로서, 살충 단백질, 박테리아 살충 단백질 및 dsRNA가 상이한 작용 방식을 나타내는 것인, 옥수수 식물.
- 서부 옥수수 뿌리벌레에 대해 3가지의 별개의 작용 방식을 나타내는 옥수수 식물로서, 적어도 2가지의 방식은 박테리아로부터 유래되지 않은 살충 단백질에 기인하는 것인 옥수수 식물.
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