KR20010082509A - 식물로부터 유래된 리보플라빈 생합성 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물로부터 유래된 리보플라빈 생합성 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터
노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 식물 리보플라빈 신타제 효소 복합체의 β 서브유니트(루마진 신타제)를 암호화하는 유전자 및 이중 작용성 효소 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 리보플라빈 생합성 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 이종성 숙주내에서 식물 리보플라빈 생합성 효소를 재조합적으로 생산하고 이들 재조합적으로 생산된 효소를 사용하여 제초제 활성에 대한 화학 물질을 스크리닝하는 방법 및 목적하지 않는 식물의 성장을 억제시키기 위한 동정된 제초제 화학 물질의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 리보플라빈 생합성 유전자를 사용하여 식물, 식물 조직, 식물 종자 및 식물 세포내 제초제 내성을 부여하기 위한 방법을 제공한다.

Description

식물로부터 유래된 리보플라빈 생합성 유전자 및 이의 용도{Riboflavin biosynthesis genes from plants and uses thereof}
본 발명은 일반적으로 식물에서 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소 활성에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 효소 및 리보플라빈 신타제 효소 복합체의 β 서브유니트(루마진 신타제)를 암호화하는 식물 유전자에 관한 것이다. 본 발명은 이종성 숙주에서 이들 리보플라빈 생합성 효소의 재조합 생산, 제초제 활성에 대한 화학 물질의 스크리닝 및 이로써 동정된 제초제 화학 물질을 사용한 목적하지 않는 식물 성장의 억제를 포함하는 다양한 용도를 갖는다.
I. 리보플라빈 생합성
리보플라빈(비타민 B2- - -6,7-디메틸-9-(1-D-리비틸)-이소알록사진)은 모든 식물 및 많은 미생물로부터 합성된다. 리보플라빈은 탄수화물의 효소적 산화에서 요구되는 FAD 및 FMN과 같은 조효소에 대한 전구체이기 때문에 기본 대사에 필수적이다. 리보플라빈의 생합성은 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Figure 1 of Mironov et al., Mol. Gen. Genet. 242:201-208(1994)]에 명시된 바와 같이 구아노신-5'-트리포스페이트(GTP)로부터 시작하여 여러개의 효소적 단계를 거쳐 진행된다.
GTP 사이클로하이드롤라제 II는 리보플라빈 생합성에 있어서 첫번째 효소이고 이것은 GTP로부터 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트의 합성을 촉매한다. DHBP 신타제는 리불로스-5'-포스페이트의 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트(DHBP)으로의 전환을 촉매한다. 바실러스(Bacillus)에서 이들 2개의 효소적 활성은 단일의 이중 작용성 효소에 의해 수행되지만 이. 콜리에서 이들 2개의 효소적 활성은 2개의 분리된 효소에 의해 수행된다.
리보플라빈 신타제 단백질은 대략 60β 서브유니트 및 3개의 α 서브유니트로 이루어진 약 1,000,000-Da 효소 복합체이다. β-서브유니트는 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘(DARP)과 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트(DHBP)의 6,7-디메틸-8-리비틸루마진(루마진)으로의 전환을 촉매하는 캡시드(capsid)를 형성함에 따라서 β-서브유니트는 또한 루마진 신타제로서 공지되어 있다. α-서브유니트는 β 서브유니트 캡시드 내부에 포함되고 2개의 루마진 단위체의 하나의 DARP 분자(이것은 첫번째 리보플라빈 신타제 반응으로 재순환된다)와 하나의 리보플라빈 분자로의 전환을 촉매한다.
II. 제초제 발견
작물 전답에 잡초와 같은 목적하지 않는 식물 성장을 억제하기 위한 제초제는 거의 전세계적으로 사용하게 되었다. 제초제 시장은 연간 150억불을 초과한다.이의 광범위한 사용에도 불구하고 잡초 억제는 아직도 농부에게는 비용이 많이드는 상당한 문제점이다.
제초제를 효과적으로 사용하기 위해서는 온전하게 처리되어야 한다. 예를 들어, 적용 시간 및 적용 방법 및 잡초 식물 발육 단계가 제초제를 사용하여 잡초를 우수하게 억제하기 위해서는 중요하다. 다양한 잡초 종이 제초제에 내성이기 때문에 효과적인 새로운 제초제를 제조한다는 것이 날로 중요해지고 있다. 현재 신규한 제초제는 재조합 DNA 기술을 수단으로하는 고-효율 스크리닝을 사용하여 발견될 수 있다. 식물 성장 및 발육에 필수적인 대사적 효소는 표준 분자 생물학적 기술을 통해 재조합적으로 생산될 수 있고 효소 활성에 대한 신규 억제제의 스크리닝에 있어서 제초제 표적물로서 사용된다. 상기 스크리닝을 통해 발견된 신규 억제제는 목적하지 않는 식물 성장을 억제하기 위해 제초제로서 사용될 수 있다.
III. 제초제 내성 식물
보다 큰 효능, 광범위한 잡초 스펙트럼 및 토양에서의 보다 신속한 분해를 나타내는 제초제는 또한 불행하게도 작물에 대해 보다 큰 식물 독성을 갖는다. 상기 문제에 적용되는 한가지 해결책은 제초제에 내성이거나 저항성인 작물을 개발하는 것이다. 제초제에 내성인 작물 잡종 또는 변종은 제초제를 사용함으로써 작물 피해에 대한 부수적인 위험없이 잡초를 사멸시킬 수 있다. 내성을 나타내도록 함으로써 제초제의 사용이 이전에는 제초제에 대한 작물의 민감성으로 인해 배제되거나 제한(사전에 유사시에 사용)되어 있었던 작물에 제초제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 앤더슨등의 미국 특허 제4,761,373호는 다양한 이미다졸리논 또는 설폰아미드 제초제에 내성인 식물에 관한 것이다. 변형된 아세토하이드록시산 신타제(AHAS) 효소에 의해 내성이 부여된다. 굿맨등(Goodman et al)의 미국 특허 제4,975,374호는 글루타민 신타제(GS)을 억제하는 것으로 공지된 제초제(예를 들어, 포스피노트리신 및 메티오닌 설폭스이민)에 의한 억제에 내성인 돌연변이 GS를 암호화하는 유전자를 포함하는 식물 세포 및 식물에 관한 것이다. 베드브룩등(Bedbrook et al)의 미국 특허 제5,013,659호는 설포닐우레아 제초제에 의한 억제에 대해 식물에 내성을 부여하는 돌연변이 아세토아세테이트 신타제를 발현하는 식물에 관한 것이다. 소머등(Somers et al)의 미국 특허 제5,162,602호는 사이클로헥산디온 및 아릴옥시페녹시프로판산 제초제에 의한 억제에 내성인 식물을 기술하고 있다. 변형된 아세틸 조효소 A 카복실라제(ACCase)에 의해 내성이 부여된다.
정의
명백하게 하기 위하여 명세서에 사용되는 특정 용어는 하기와 같이 제공되고 정의된다.
활성화 DNA 서열: 게놈, 바람직하게는 식물의 게놈내 유전자의 발현을 조절하는 DNA 서열. 활성화 DNA 서열은 게놈내에 내인성 표적 유전자와 상보적이다. 활성화 DNA 서열이 세포내로 도입되어 발현되는 경우 이것은 표적 유전자의 발현을 억제한다. 본 발명과 연계되어 유용한 활성화 DNA 서열은 식물의 정상적인 성장과발육에 필수적인 하나 이상의 유전자를 양성적으로 동정하기 위해 안전하게 형질전환된 식물내 유전자 기능을 차단시킬 수 있는 해독될 수 있거나 해독될 수 없는 센스 서열과 같은 우세한 억제제로서 작용하는 서열 또는 암호화 서열을 포함한다. 바람직한 활성화 DNA 서열은 안티센스 DNA 서열이다. 바람직하게 표적 유전자는 식물의 성장 또는 생존에 필수적인 생합성 효소, 수용체, 시그날 전달 단백질, 구조 유전자 산물 또는 수송 단백질과 같은 단백질을 암호화한다. 특히 바람직한 양태에서, 표적 유전자는 루마진 신타제 또는 이중 작용성 효소 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제를 암호화한다. 표적 유전자와 안티센스 서열의 상호작용은 실질적으로 표적 유전자의 발현을 억제하여 식물을 사멸시키거나 최소한 정상적인 식물 성장 또는 발육을 억제한다.
활성화 DNA 작제물: 합성 프로모터에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 완전한 하이브리드 전사 인자가 존재하지 않는 경우에, 세포, 바람직하게 식물 세포에 도입되는 경우 발현되지 않는, 즉 사일런트(silent)인 활성화 DNA 서열에 작동적으로 연결된 합성 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 작제물. 활성화 DNA 작제물이 세포, 조직 또는 식물에 도입되어 활성화 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 안정한 형질 전환주를 형성한다.
키메릭: "키메릭"은 벡터 또는 유전자와 같은 DNA 서열이 재조합 DNA 기술에 의해 함께 융합하여 천연적으로 존재하지 않고 특히 형질전환될 식물에 존재하지 않는 별개의 공급원으로부터 유래된 하나 이상의 DNA 서열로 이루어진다는 것을 나타내는데 사용된다.
DNA 셔플링(shuffling): DNA 셔플링은 DNA 분자내에 돌연변이를 도입하거나 바람직하게 무작위로 재배열시켜 2개 이상의 DNA 분자사이에 DNA 서열을 바람직하게 무작위로 서로 대체시키는 방법이다. DNA 셔플링으로부터 비롯된 DNA 분자는 하나 이상의 주형 DNA 분자로부터 유래된, 천연적으로 존재하지 않는 DNA 분자인 셔플링된 DNA 분자이다. 셔플링된 DNA는 주형 DNA에 의해 암호화된 효소에 대해 변형된 효소를 암호화하고 바람직하게 주형 DNA에 의해 암호화된 효소에 대해 변형된 생물학적 활성을 갖는다.
효소 활성: 이것은 본원에서 기질의 산물로의 전환을 촉매하는 효소의 능력을 의미한다. 효소의 기질은 효소의 고유 기질 뿐만 아니라 효소에 의해 산물 또는 산물의 동족체로 전환될 수 있는 천연 기질의 동족체를 포함한다. 효소의 활성은 예를 들어, 특정 시간후 반응내 산물의 양을 결정하거나 특정 시간후 반응 혼합물내에 잔류하는 기질의 양을 결정함으로써 측정된다. 효소의 활성은 또한 특정 시간후 반응 혼합물내에 잔류하는 미반응된 조인자(co-factor)의 양을 결정하거나 특정 시간후 반응 혼합물내 반응된 조인자를 결정함으로써 측정된다. 효소 활성은 또한 특정 시간후 반응 혼합물내 잔류하는 자유 에너지의 공여체 또는 에너지가 풍부한 분자(예: ATP, 포스포에놀피루베이트, 아세틸 포스페이트 또는 포스포크레아틴)의 양을 결정하거나 특정 시간후 반응 혼합물내 사용된 자유 에너지의 공여체 또는 에너지가 풍부한 분자(예: ADP, 피루베이트, 아세테이트 또는 크레아틴)의 양을 결정함으로써 측정된다.
발현은 식물내 내인성 유전자 또는 형질전환 유전자의 전사 및/또는 해독을언급한다. 안티센스 작제물의 경우에 예를 들어, 발현은 단지 안티센스 DNA의 전사만을 언급한다.
유전자는 암호화 서열 및 연합된 조절 서열을 언급하고 이때 암호화 서열은 mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 센스 RNA 또는 안티센스 RNA로 전사된다. 조절 서열의 예는 프로모터 서열 및 5' 및 3'-비해독 서열이다.
제초제: 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직의 성장을 억제하거나 사멸시키는데 사용되는 화학 물질.
이종성 DNA 서열: 천연적으로 존재하는 DNA 서열의 천연적으로 존재하지 않는 다중 카피물을 포함하여, 숙주세포에 도입되어 숙주세포와 천연적으로 연합되지 않은 DNA 서열.
동종성 DNA 서열: 숙주세포로 도입되어, 숙주세포와 천연적으로 연합된 DNA 서열.
억제제: 식물의 성장 또는 생존에 필수적인 생합성 효소, 수용체, 신호 전달 단백질, 구조 유전자 산물 또는 수송 단백질과 같은 단백질의 효소 활성을 불활성화시키는 화학 물질. 본원에서 억제제는 식물로부터 기원하는 루마진 신타제 또는 이중 작용성 효소 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제의 효소적 활성을 불활성화시키는 화학 물질이다. 용어 "제초제"는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직에 적용되는 경우의 억제제를 정의하는데 사용된다.
분리: 본원에서, 분리된 DNA 분자 또는 분리된 효소는 사람의 수작업에 의해 천연 환경으로부터 분리되어 존재하고 따라서 천연 산물이 아닌 DNA 분자 또는 효소이다. 분리된 DNA 분자 또는 효소는 정제된 형태로 존재하거나 예를 들어, 형질전환된 숙주세포와 같은 비-천연 환경에서 존재할 수 있다.
최소 프로모터: 상류(upstrean) 활성화의 부재하에 크게 감소된 프로모터 활성을 갖거나 불활성인 프로모터 성분, 특히 TATA 성분. 적합한 전사 인자의 존재하에 최소 프로모터는 전사시키는 기능을 한다.
변형된 효소 활성: 식물내에 천연적으로 존재하는 활성(예: 사람에 의해 상기 활성이 직접적으로 또는 간접적으로 조작되는 것 없이 천연적으로 존재하는 효소활성)과 상이한 효소 활성으로, 즉 천연적으로 존재하는 효소 활성을 억제하는 억제제에 대한 내성을 의미한다).
식물은 식물, 특히 종자 식물을 언급한다.
식물 세포: 원형질 및 세포벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리학적 단위. 식물 세포는 분리된 단세포 또는 배양된 세포의 형태이거나 예를 들어, 식물 조직 또는 식물 기관과 같은 고등 기관 단위의 일부일 수 있다.
재조합 DNA: 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 연결되는, 조합된 DNA 서열의 분자.
재조합 DNA 기술: 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술된 바와 같이 DNA 서열을 함께 연결시키는데 사용되는 방법.
상당한 증가: 측정 기술에서의 고유 오차 한계 보다 큰 효소 활성의 증가, 바람직하게 억제제의 존재하에 야생형 효소의 활성보다 약 2배 이상의 증가, 보다바람직하게 약 5배 이상의 증가 및 가장 바람직하게는 약 10배 이상의 증가.
상당한 감소: 효소 반응 산물의 양이 측정 기술에서의 고유 오차 한계 보다 높고, 바람직하게 억제제의 부재하에 야생형 효소의 활성이 약 2배 이상 감소, 보다 바람직하게는 약 5배 이상의 감소, 가장 바람직하게는 약 10배 이상의 감소를 의미한다.
실질적으로 유사한: 본원에서, 루마진 신타제를 암호화하는 서열 1의 일부, 즉 서열 2의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 1의 일부와 60% 이상의 서열 상동성을 갖는 DNA 분자; 또는 식물 기원의 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 효소를 암호화하는 서열 13의 일부, 특히 서열 14의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 13의 일부와 60% 이상의 서열 상동성을 갖는 DNA 분자. 실질적으로 유사한 루마진 신타제 뉴클레오타이드 서열은 특히 하기 조건하에서 서열 1 또는 이의 단편과 특이적으로 하이브리드화한다: 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA에서의 하이브리드화, 50℃에서 2 x SSC, 1% SDS를 사용한 세척. 실질적으로 유사한 식물 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 뉴클레오타이드 서열은 상기 조건하에서 서열 13 또는 이의 단편과 특이적으로 하이브리드화한다. 단백질에 대해서 본원에 사용된 바와 같은 "실질적으로 유사한"은 서열 2에 제공된 아미노산 서열 또는 서열 14에 제공된 아미노산 서열중 하나와 90% 이상 상동성인 단백질 서열을 의미한다.
기질: 기질은 효소가 천연적으로 수행하는 생화학 경로에서 천연적으로 인지하고 산물로 전환되는 분자이거나 천연적으로 일어나는 반응과 유사한 효소적 반응에서 또한 효소에 의해 인지되고 효소에 의해 산물로 전환되는 변형된 분자이다.
합성 서열은 천연 서열에 존재하지 않는 구조적 특징을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 예를 들어, 쌍자엽 식물 및/또는 단자엽 식물 유전자의 G+C 함량 및 이의 정상적인 코돈 분포와 매우 유사한 인공 서열을 합성된 서열로서 일컫는다.
내성: 억제제 또는 제초제에 노출되는 경우에도 정상적인 성장 또는 기능을 계속 유지하는 능력.
형질전환(transformation): 이종성 DNA를 세포, 조직 또는 식물에 도입하는 방법. 형질전환된 세포, 조직 또는 식물은 형질전환 과정의 최종 산물 뿐만 아니라 이의 형질전환된 후손을 포함하는 것으로 이해된다.
형질전환된(transgenic): 바람직하게 목적하는 DNA 서열과 작동적으로 연결된 적합한 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 것을 의미한다.
상기 관점에서, 본 발명의 목적은 신규하고 개선된 제초제를 동정하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 잡초와 같은 식물의 성장을 억제하기 위한 신규하고 개선된 제초제를 사용하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 또 다른 본 발명의 목적은 상기 신규하고 개선된 제초제에 내성인 개선된 작물 식물을 제공하는 것이다.
상기 목적에 추가로, 본 발명은 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소(이러한효소는 루마진 신타제 활성 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성중 하나를 갖는다)를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하는 것이다.
한 양태에 따라, 본 발명은 리보플라빈 신타제의 β 서브유니트(루마진 신타제)를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 분자는 루마진 신타제 활성을 갖는 효소(이러한 효소는 서열 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함한다)를 암호화는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 루마진 신타제 활성을 갖는 효소(이러한 효소는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 이때 DNA 분자는 하기 조건하에서 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자와 하이브리드화한다: 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, 0.5M NaPO4, pH 7.0, 1mM EDTA에서 하이브리드화; 50℃에서 2X SSC, 1% SDS로 세척. 본 발명은 추가로 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하고 이때 효소는 루마진 신타제 활성을 갖고 DNA 분자는 하기 조건하에서 서열 1에 제시된 암호화 서열과 하이브리드화한다: 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, 0.5M NaPO4, pH 7.0, 1mM EDTA에서 하이브리드화; 50℃에서 2X SSC, 1% SDS로 세척. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 서열 1에 제시된 암호화 서열과 실질적으로 유사하고 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 이때 DNA 분자는 서열 1에 제시된 암호화 서열의 연속적인 20개의 염기쌍 부분의 서열과 상동성인 20개 염기쌍의 뉴클레오타이드 부위를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 서열 1에 제시된 암호화 서열을 포함하고 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화한다. 루마진 신타제를 암호화하는 서열 1에 제공된 뉴클레오타이드 서열이 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로 부터 분리되지만 본 발명에 의해 제공되는 정보를 사용하여 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당해 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 임의의 식물로부터 수득될 수 있다.
또 다른 양태에 따라, 본 발명은 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제를 암호화하는 식물로 부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 분자는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 이때 효소는 서얼 14에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 이때 효소는 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 본발명의 또 다른 실시예에서 DNA 분자는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 DNA 분자는 하기 조건하에서 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자와 하이브리드화한다:50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, 0.5M NaPO4, pH 7.0, 1mM EDTA에서 하이브리드화; 50℃에서 2X SSC, 1% SDS로 세척. 본 발명은 추가로 식물에서 분리된, 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공하고 이때 효소는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/ DHBP 신타제 활성을 갖고 DNA 분자는 하기 조건하에서 서열 13에 제시된 암호화 서열과 하이브리드화한다: 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, 0.5M NaPO4, pH 7.0, 1mM EDTA에서 하이브리드화; 50℃에서 2X SSC, 1% SDS로 세척.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 서열 13에 제시된 암호화 서열과 실질적으로 유사하고 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 DNA 분자는 서열 13에 제시된 암호화 서열의 연속적인 20개의 염기쌍 부분의 서열과 상동성인 20개 염기쌍 뉴클레오타이드 부분을 포함한다. 여전히 또 다른 실시예에서, 본 발명의 DNA 분자는 서열 13에 제시된 암호화 서열을 포함하고 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화한다. 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제를 암호화하는 서열 13에 제공된 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 제공된 정보를 사용하여 아라비도프시스 탈리아나로부터 분리되지만 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 당해 기술분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 임의의 식물로부터 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 제공한다. 추가로, 본 발명은 상기 키메릭 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고 이때 벡터는 숙주 세포내로 안정적으로 형질전환될 수 있다. 추가로, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고 이때 숙주 세포는 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA 분자를 발현시킬 수 있다. 본 발명에 따른 숙주세포는 세균 세포, 효모 세포 또는 식물 세포일 수 있다. 특히 본 발명에 따른 숙주 세포는 세균 세포일 수 있다.
본 발명은 추가로
(a) 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 식물로부터 기원하는 DNA 분자를 셔플링시키고;
(b) 수득한 셔플링된 뉴클레오타이드 서열을 발현시키고;
(c) 셔플링되지 않은 DNA 분자에 의해 암호화된 효소의 활성과 비교하여 변형된 루마진 신타제 활성에 대해 선별함을 포함하는, 변형된 루마진 신타제 활성을 갖는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법을 제공한다.바람직하게, 본 발명의 방법에 따라 셔플링된 뉴클레오타이드 서열은 서열 1이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 셔플링된 DNA 분자에 관한 것이다. 바람직하게 셔플링된 DNA 분자는 루마진 신타제 활성의 억제제에 대해 증가된 내성을 갖는 효소를 암호화한다. 본 발명은 또한 셔플링된 DNA 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자; 상기 키메릭 유전자를 포함하는 재조합 벡터(이때 벡터는 숙주 세포로 안정적으로 형질전환); 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 바람직하게 세균 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포, 특히 식물 세포이다. 본 발명은 또한 상기 식물 세포를 포함하는 식물 또는 종자에 관한 것이다. 바람직하게 상기 식물은 루마진 신타제 활성의 억제제에 대해 내성이다.
본 발명은 추가로,
(a) 변형된 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 식물로부터 기원하는 DNA 분자를 셔플링시키고;
(b) 수득한 셔플링된 뉴클레오타이드 서열을 발현시키고;
(c) 셔플링되지 않은 DNA 분자에 의해 암호화된 효소의 활성과 비교하여 변형된 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성에 대해 선별함을 포함하는, 변형된 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 방법에 따라 셔플링된 뉴클레오타이드 서열은 서열 13이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 셔플링된 DNA 분자에 관한 것이다. 바람직하게 셔플링된 DNA 분자는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성의 억제제에 대해 증가된 내성을 갖는 효소를 암호화한다. 본 발명은 또한 셔플링된 DNA 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자; 상기 키메릭 유전자를 포함하는 재조합 벡터(이때 벡터는 숙주 세포로 안정적으로 형질전환); 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 바람직하게 세균 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포, 특히 식물 세포이다. 본 발명은 또한 상기 식물 세포를 포함하는 식물 또는 종자에 관한 것이다. 바람직하게 상기 식물은 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성의 억제제에 대해 내성이다.
또 다른 양태에 따라 본 발명은 또한 상기 기술된 리보플라빈 생합성 효소의 재조합적 생산 및 이의 사용 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 리보플라빈 생합성에 관여하는 분리된 식물 효소를 제공하고 이때 효소는 루마진 신타제 활성을 갖는다. 바람직하게 상기 효소는 서열 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게 상기 효소는 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 리보플라빈 생합성에 관여하는 분리된 식물 효소를 제공하고 이때 효소는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는다. 바람직하게 상기 효소는 서열 14에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 보다 바람직하게 상기 효소는 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 루마진 신타제 및 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제II/DHBP 신타제와 같은 정제된 식물 리보플라빈 생합성 효소를 사용하여 작물, 특히, 옥수수 및 밀, 귀리, 호밀, 수수, 쌀, 보리, 기장, 잔디 및 벼과 사료 작물과 같은 또 다른 곡류 작물 뿐만 아니라 면화, 사탕 수수, 사탕무, 종유 유채 및 땅콩과 같은 농경학적으로 중요한 작물이 성장하는 지역에서 목적하지 않는 식물 성장을 억제하는 제초제로서 사용될 수 있는 신규한 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
루마진 신타제에 대하여 루마진 신타제 활성을 억제하는 능력을 갖는 화학 물질에 대한 스크리닝은 바람직하게 (a) 효소가 루마진 합성을 촉매할 수 있는 조건하에서 제 1반응 혼합물에서 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘 및 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트와 배합하는 단계; (b) 제1 반응 혼합물에서와 같은 동일한 조건하에서 제2 반응 혼합물에서 화학 물질 및 효소와 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노피리미딘 및 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트를 배합하는 단계; (c) 제1 및 제2 반응 혼합물에서 생산된 루마진의 양을 측정하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 반응 혼합물에서 생산된 루마진의 양을 비교하는 단계(제2 반응 혼합물에서 제조된 루마진의 양이 제1 반응 혼합물에서 제조된 루마진의 양보다 훨씬 적은 경우 화학물질이 효소의 루마진 신타제 활성을 억제할 수 있는 것이다)를 포함한다. 제1 반응 혼합물이 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘 50μM 및 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트 0.5mM를 포함하는 본 발명에 따른 스크리닝 방법이 바람직하다. 반응 혼합물중에서 생성된 루마진의 양이 407nm 여기 파장에서 형광 측정계를 사용하여 측정되는, 본 발명에 따른 스크리닝 방법이 더욱 바람직하다.
이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제에 대하여 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 능력을 갖는 화학 물질에 대한 스크리닝은 바람직하게 (a) 효소가 각각 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 합성을 촉매할 수 있는 조건하에서 제 1반응 혼합물에서 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 GTP 또는 리불로스-5-포스페이트와 배합하는 단계; (b) 제1 반응 혼합물에서와 같은 동일한 조건하에서 제2 반응 혼합물에서 화학 물질 및 효소를 GTP 또는 리불로스-5-포스페이트와 배합하는 단계; (c) 제1 및 제2 반응 혼합물에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양을 측정하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 반응 혼합물에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양을 비교하는 단계(제2 반응 혼합물에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양이 제1 반응 혼합물에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양보다 훨씬 적은 경우 화학물질이 효소의 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제할 수 있다)를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 스크리닝 방법에 의해 동정된 제초제 화학 물질 및 상기 제초제 화학 물질을 식물에 적용시켜 화학물질이 식물내 루마진 신타제 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제의 활성을 억제시킴으로써 식물의 성장을 억제시키는 방법을 구현한다.
본 발명은 추가로 변형된 리보플라빈 생합성 효소 활성을 갖고 있어 천연에 존재하는 리보플라빈 생합성 효소 활성을 정상적으로 억제하는 수준에서 제초제에 의한 억제에 내성인 식물, 식물 조직, 식물 종자 및 식물 세포를 구현한다. 본 발명에 포함되는 제초제 내성 식물은 정상적으로 억제하는 제초제에 대한 잠재적인 표적이 될 수 있는 식물, 특히 농경학적으로 중요한 상기 언급된 작물을 포함한다. 상기 양태에 따라 식물, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포는 변형되지 않은 야생형 리보플라빈 생합성 효소를 정상적으로 억제하는 농도에서 제초제에 의한 억제에 내성인 변형된 리보플라빈 생합성 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 암호화 서열과 작동적으로 연결된, 식물내에서 작용하는 적합한 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자로 안정적으로 형질전환된다. 변형된 리보플라빈 생합성 효소 활성은 또한 다중 카피물의 야생형 리보플라빈 생합성 유전자를 식물에 제공하거나 보다 강한 야생형 프로모터의 조절하에 야생형 리보플라빈 생합성 유전자를 과발현시킴으로써 야생형 제초제-민감성 리보플라빈 생합성 효소의 발현을 증가시켜 식물에 부여될 수 있다. 이와같이 작제된 형질전환된 식물, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포는 통상적인 선별 방법에 의해 선택됨으로써 제초제 내성주가 분리되고 특징화되고 발육된다. 또한 무작위 돌연변이 또는 부위-특이적 돌연변이가 제초제 내성주를 생성시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직을 제공하고 이때 효소는 루마진 신타제 활성을 갖고 DNA 분자는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직에 정상적으로 천연에 존재하는 루마진 신타제 활성을 억제하는 양의 제초제에 대한 내성을 부여한다. 상기 양태의 한 실시예에 따라 효소는 서열 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 양태의 또 다른 실시예에 따라 DNA 분자는 실질적으로 서열 1에 제시된 암호화 서열과 실질적으로 유사하다. 관련된 측면에서 본 발명은 (a) 천연적으로 존재하는 루마진 신타제 활성을 억제하는 제초제에 내성인 식물 또는 식물 종자인 제초제 내성 작물을 심거나 제초제 내성 작물 종자를 파종시키는 단계; 및 (b) 천연적으로 존재하는 루마진 신타제 활성을 억제하는 양의 제초제를, 전답에 있는 작물 또는 작물 종자 및 잡초에 적용시키는 단계(이때, 제초제는 작물의 성장을 상당히 억제시키지 않으면서 잡초의 성장을 억제한다)를 포함하는, 파종된 작물 종자 또는 식물의 작물이 있는 전답에서 선택적으로 잡초의 성장을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직을 제공하고 이때 효소는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖고 DNA 분자는 천연적으로 존재하는 정상적인 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 양에서 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직에 제초제에 대한 내성을 부여한다. 상기 양태의 한 실시예에 따라 효소는 서열 14에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 양태의 또 다른 실시예에 따라 DNA 분자는 실질적으로 서열 13에 제시된 암호화 서열과 실질적으로 유사하다. 관련된 측면에서 본 발명은 (a) 천연적으로 존재하는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 제초제에 내성인 식물 또는 식물 종자인 제초제 내성 작물을 심거나 제초제 내성 작물 종자를 파종시키는 단계; 및 (b) 천연적으로 존재하는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 양으로 제초제를, 전답에 있는 작물 또는 작물 종자 및 잡초에 적용시키는 단계(이때, 제초제는 작물의 성장을 상당히 억제시키지 않으면서 잡초의 성장을 억제한다)를 포함하는, 파종된 작물 종자 또는 식물의 작물이 있는 전답에서 선택적으로 잡초의 성장을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적 및 장점은 하기에 기술된 본 발명의 연구 및 비제한적인 실시예로부터 당해 기술 분야의 기술자에게 명백해질 것이다.
I. 식물 리보플라빈 생합성 유전자
한 측면에서, 본 발명은 리보플라빈 신타제의 β 서브유니트(루마진 신타제)를 암호화하는, 식물원으로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다. 특히 본 발명은 루마진 신타제를 암호화하는 아라비도프시스 탈리아나로부터 분리된 DNA 분자 및 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는아라비도프시스 탈리아나로부터 분리된 DNA 분자 및 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 것과 실질적으로 유사한 DNA 분자를 제공한다. 아라비도프시스 탈리아나 기원의 루마진 신타제에 대한 DNA 암호화 서열은 서열 1에 제공되어 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 이중 작용성 효소인 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트(DHBP)를 암호화하는, 식물원으로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다. 특히 본 발명은 이중 작용성 효소를 암호화하는 아라비도프시스 탈리아나로부터 분리된 DNA 분자 및 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 것과 실질적으로 유사한 DNA 분자를 제공한다. 아라비도프시스 탈리아나 기원의 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제에 대한 DNA 암호화 서열은 서열 13에 제공되어 있다. 본 발명은 먼저 식물에서, GTP 사이클로하이드롤라제 II 및 DHBP 신타제가 단일 이중 작용성 효소를 구성한다는 것을 인지시킨다.
본 발명에 대한 출원인의 기재를 근거로 리보플라빈 생합성 효소를 암호화하는 DNA 서열은 처음으로 임의의 목적하는 식물 종의 게놈으로부터 분리될 수 있다. 식물로부터 리보플라빈 생합성 유전자를 분리하는 방법의 예는 실시예 1 및 11에 기술되어 있다. 이러한 방법을 사용하여 아라비도프시스 탈리아나로 부터 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스(Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State, Ohio State University, Columbus, OH)에 대한 연구는 EST가 이. 콜리 리보플라빈 신타제 β 서브유니트 및 비. 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라제와 상동성이라는 것을 밝힌다. 이들 EST에 특이적인 프라이머를 사용한 PCR에 의해 합성된 DNA 단편은 cDNA가 분리되는 아라비도프시스 람다 ZAP 라이브러리를 탐색하는데 사용된다. 하나의 cDAN에 의해 암호화된 결정된 단백질 서열은 이. 콜리 및 비. 서브틸리스 리보플라빈 신타제 β 서브유니트 모두에 대해 약 68%의 유사성을 나타낸다. 하나의 cDNA에 의해 암호화된 결정된 단백질 서열은 비. 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라제와 약 70%의 유사성을 보여준다.
또한, 리보플라빈 생합성 유전자 서열은 본 발명에 의해 교시된 아라비도프시스 탈리아나 암호화 서열(서열 1 및 13)과의 서열 유사성을 기초로 널리 공지된 기술에 따라 임의의 식물로부터 분리될 수 있다. 이들 기술에서, 공지된 식물 생합성 유전자의 암호화 서열의 전체 또는 일부가 선택된 식물로부터 일군의 클론된 게놈성 DNA 단편 또는 cDNA 단편(즉, 게놈성 또는 cDNA 라이브러리)에 존재하는 또 다른 리보플라빈 생합성 유전자 서열과 선택적으로 하이브리드화하는 프로브로서 사용된다. 상기 기술은 플레이팅된 DNA 라이브러리(플라크 또는 콜로니)의 하이브리드 스크리닝[참조문헌: Sambrook et al., "Molecular Cloning", eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press.(1989)] 및 공지된 리보플라빈 생합성 효소의 아미노산 서열중에서 보존된 도메인 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 증폭[문헌참조: Innis et al., "PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications", pub. by Academic Press(1990)]을 포함한다. 이들 방법은 특히 프로브 서열이 유래된 유기체와 밀접하게 연관된 유기체 기원의 리보플라빈 생합성 유전자 서열의 분리에 적합하다. 따라서 프로브로서 아라비도프시스 암호화 서열을 사용한 이들 방법의 적용은 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함하는 또 다른 식물종 기원의 리보플라빈 생합성 유전자 서열의 분리에 적합한 것으로 예상된다.
본 발명에 의해 교시된 분리된 리보플라빈 생합성 유전자 서열은 임의의 의도하는 목적에 적합한 표준 유전자 공학 기술에 따라 조작될 수 있다. 예를 들어, 전체 식물 리보플라빈 생합성 유전자 서열 또는 이의 일부는 암호화 서열 및 전령 RNA와 하이브리드화 할 수 있는 프로브로서 사용될 수 있다. 다양한 조건하에서 특이적 하이브리드화를 성취하기 위해 상기 프로브는 식물 리보플라빈 생합성 유전자 서열중에서 유일한 서열 및 길이에 있어서 10개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 프로브를 사용하여 PCR을 통해 선택된 유기체로부터 리보플라빈 생합성 유전자 서열을 증폭시키고 분석할 수 있다. 상기 기술은 목적하는 유기체로부터 추가의 리보플라빈 생합성 유전자 서열을 분리하거나 유기체내 리보플라빈 생합성 유전자 서열의 존재를 결정하기 위한 진단 검정으로서 유용할 수 있다. 상기 기술은 또한 제초제 내성, 열등한 상태와 같은 목적하는 특정 조건과 연관된 변형된 리보플라빈 생합성 유전자 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.
루마진 신타제 특이적 및 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제-특이적 하이브리드화 프로브가 또한 게놈 서열에 대한 프로브의 선택적 하이브리드화를 기초로하는 표준 기술을 사용하여 선택된 게놈내 이들 고유 유전자의 위치를 맵핑하는데 사용될 수 있다. 이들 기술은 프로브 서열내에서 확인되거나 함유된 DNA의다형성의 동정 및 교배된 2개의 다형성 모주(parental line)의 자가 수정으로부터 비롯된 맵핑 집단에서 공지된 맵 위치의 또 다른 마커와 상대적인 분리된 유전자를 추적하기 위한 상기 다형성의 용도를 포함하지만 이에 제한되지 않는다[문헌참조: Helentjaris et al., Plant Mol. Biol. 5:109(1985); Sommer et al. Biotechniques 12:82(1992); D'Ovidio et al., Plant Mol. Biol. 15:169(1990)].
임의의 식물 리보플라빈 생합성 유전자 서열은 리보플라빈 생합성 유전자를 맵핑하기 위한 프로브로서 유용한 것으로 사료되지만 바람직한 프로브는 선택된 식물 종과 보다 밀접하게 연관된 식물 종 기원의 유전자 서열이고 가장 바람직한 프로브는 선택된 식물 종 기원의 유전자 서열이다. 상기 방식으로 리보플라빈 생합성 유전자의 맵핑은 특히 품종 개량 목적을 위해 유용한 것으로 사료된다. 예를 들어, 제초제 내성을 부여하는 돌연변이 리보플라빈 생합성 유전자의 유전학적 맵 위치를 밝힘으로써 플랭킹 DNA 마커가 표준 유전학적 맵으로 부터 동정될 수 있다[문헌참조: Helentjaris, Trends Genet. 3:217(1987)]. 새로운 품종개량주에 제초제 내성을 도입하는 동안에 이들 마커는 매회의 백-크로싱(back-crossing)후 재현된 모체에 여전히 존재하는 연결된 플랭킹 염색체 DNA의 크기를 검색하는데 사용될 수 있다.
루마진 신타제 특이적 및 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제-특이적 하이브리드화 프로브는 또한 노던 블롯 분석과 같은 표준 기술을 사용하여 식물내 리보플라빈 생합성 유전자 mRNA의 수준을 정량하는데 사용될 수 있다. 상기 기술은 리보플라빈 생합성 유전자를 표적으로하는 제초제에 대한 증가된 내성과 같은특정 조건과 연관된 리보플라빈 생합성 유전자의 변환된 수준을 검출하기 위한 진단 검정으로서 유용하다.
II. 안티센스 억제에 의해 입증되는 식물내 리보플라빈 생합성 유전자의 본질
하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 정상적인 식물 성장 및 발육을 위한 리보플라빈 생합성 유전자의 본질은 본원에 참조로서 인용된 공동 소유 및 공계류중인 출원번호 제08/978,830호[1997년 11월 26일자로 출원된 것으로서 발명의 명칭은 "Methods and Compositions Useful for the Activation of Silent Transgenes"이다]에 기술된 안티센스 유효(validation) 시스템을 사용하여 식물내 루마진 신타제의 안티센스 억제에 의해 입증되었다. 상기 시스템에서, 하이브리드 전사 인자 유전자는 DNA-결합 도메인 및 활성화 도메인을 포함하는 것으로 이루어져 있다. 추가로, 활성화 DNA 작제물은 활성화 DNA 서열과 작동적으로 연결된 합성 프로모터를 포함하는 것으로 이루어져 있다. 하이브리드 전사 인자 유전자 및 합성 프로모터는 하이브리드 전사 인자의 DNA 결합 도메인이 특이적으로 활성화 DNA 서열의 발현을 활성화시키는 합성 프로모터에 특이적으로 결합할 수 있도록 선택되거나 고안된다. 제1 식물은 하이브리드 전사 인자 유전자로 형질전환되고 제2 식물은 활성화 DNA 작제물로 형질전환된다. 제1 식물과 제2 식물은 교배되어 하이브리드 전사 인자를 암호화하는 서열과 합성 프로모터 모두를 포함하는 후손 식물을 생산하고 이때 활성화 DNA 서열은 후손 식물에서 발현된다. 바람직한 양태에서, 활성화 DNA 서열은 루마진 신타제 유전자 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP신타제 유전자와 같은 내인성 유전자의 발현을 불활성화시킬 수 있는 안티센스 서열이다. 따라서 후손 식물은 정상적으로 내인성 유전자를 발현시킬 수 없다.
상기 안티센스 유효 시스템은 특히 지속적으로 유도되는 형질전환 유전자로서 회복될 수 없는 형질을 발현시키는데 유용하다. 예를 들어, 식물 생물학의 기초적인 연구에서 큰 관심이 되는 필수 유전자의 기능을 제거하도록 고안된, 잠재적으로 치명적인 효과를 갖는 외래 유전자 또는 안티센스 유전자 또는 우성-네가티브 돌연변이는 본래의 실험적인 문제를 제공한다. 감소된 형질전환 빈도수는 흔히 지속적으로 유도되는 특정 형질전환 유전자와 연관된 치사율의 증거로서 인용되지만 상기 유형의 네가티브 결과는 대안적인 식상한 설명으로 설명된다. 본 발명은 안정적으로 유지되고 증식하는 시험 형질전환 유전자가 이의 발현체로부터 분리되도록 하기 때문에 농업 분야에서 상당한 진전이다. 발현체로부터 형질전환 유전자 삽입물을 분리시키기 위한 능력은 특히 추론되는 유전자 기능의 본질에 대해 결론을 확증하는데 유용하다. 본 발명의 상당한 잇점은 정상적인 성장 또는 발육에 필수적인 식물 유전자가 상기 방식으로 동정될 수 있다는 것이다. 상기 유전자의 동정은 효과적인 제초제에 대해 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 유용한 표적을 제공한다. 하기에서, 안티센스 유효 시스템은 보다 상세하게 기술된다.
A. 하이브리드 전사 인자 유전자
본원에 기술된 안티센스 유효 시스템에 사용하기 위한 하이브리드 전사 인자 유전자는 (1) DNA 결합 도메인 및 (2) 프로모터에서 전사를 위해 구성되는 어셈블링의 성분과 상호작용하는 활성화 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 유전자 단편은 전형적으로 DNA 결합 도메인이 5' 말단 방향에 있고 활성화 도메인이 3' 말단 방향으로 있어 하이브리드 전사 인자로 발현되는 하이브리드 유전자를 형성할 수 있도록 연결된다. 당해 분야의 기술자는 통상적으로 활성화 도메인을 암호화하는 다양한 DNA 서열과 DNA 결합 도메인을 암호화하는 다양한 DNA 서열과 조합하여 다양한 배열의 하이브리드 전사 인자 유전자를 형성하도록 할 수 있다. DNA 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열의 예는 GAL-4, 박테리오파아지 434, lexA, lacl 및 파아지 람다 리프레서의 DNA 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 활성화 도메인을 암호화하는 DNA 서열의 예는 단순 포진 vP16, 옥수수 C1 및 P1을 암호화하는 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가로 적합한 활성화 도메인은 선택된 유기체 기원의 DNA 조각들을 적합한 DNA 결합 도메인으로 융합하고 직접적으로 이의 기능에 대해 선별함으로써 분리될 수 있다[문헌참조: Estruch et al.,(1994) Nucleic Acids Res. 22:3983-3989]. 전사 활성화 단백질의 도메인은 다양한 기원의 단백질간에서 대체될 수 있다[문헌참조: Brent and Ptashne(1985)Cell 43:729-736]. 바람직한 하이브리드 전사 인자 유전자는 옥수수 C1 활성화 도메인에 융합되는 GAL4 DNA 결합 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
B. 활성화 DNA 작제물
본원에 기술된 안티센스 유효 시스템에 사용하기 위한 활성화 DNA 작제물은 (2) 활성화 DNA 서열과 작동적으로 연결된 (1) 합성 프로모터를 포함한다. 합성 프로모터는 하이브리드 전사 인자의 DNA 결합 도메인에 의해 인지되는 하나 이상의DNA 결합 부위 및 최소 프로모터, 바람직하게 식물 세포에 의해 인지되는 프로모터로부터 기원하는 TATA 성분을 포함한다. 보다 특히 TATA 성분은 합성 프로모터가 도입되는 식물 세포 유형에 의해 인지되는 프로모터로부터 유래한다. 바람직하게, DNA 결합 부위는 최소 프로모터가 보다 효과적으로 활성화되도록 및 합성 프로모터와 연합된 활성화 DNA 서열이 보다 효과적으로 발현되도록 합성 프로모터내에서 수회 반복되어 있다. 당해 분야의 기술자는 통상적인 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용하여 목적하는 합성 프로모터를 제조할 수 있다. 본 발명에 유용한 합성 프로모터를 제조하는데 사용될 수 있는 DNA 결합 부위의 예는 GAL4 DNA 결합 단백질, lac 작동인자 및 lexA 결합 부위에 의해 인지되는 상류 활성화 서열(UASG)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 식물 세포에 의해 인지되는 프로모터 TATA 성분의 예는 CaMV 35S, 옥수수 Bz1 프로모터 및 UBQ3 프로모터로부터 유래된 성분을 포함한다. 특히 바람직한 합성 프로모터는 이의 5' 말단에서 GAL4 DNA 결합 도메인에 의해 인지되는 대략 10개의 연쇄적으로 직접 반복되는 상류 활성화 서열(UASG)로 융합되는 TATA 성분(전사 개시점에서 상대적인 뉴클레오타이드 -59 내지 +48)을 포함하는, 말단 절단된 CaMV 35S 서열을 포함한다.
활성화 DNA 서열은 식물 세포내로 안정하게 도입하여 발현될 필요가 있는 임의의 DNA 서열을 포함한다. 특히 바람직한 활성화 DNA 서열은 센스 또는 안티센스 서열이고 이의 발현은 내인성 대립 유전자의 발현을 감소시켜 정상적인 식물 성장 또는 발육을 억제한다. 활성화 DNA 서열은 합성 프로모터와 작동적으로 연결되어활성화 DNA 작제물을 형성한다. 합성 프로모터에 결합할 수 있고 이를 활성화시킬 수 있는 하이브리드 전사 인자가 또한 존재하지 않는 경우 활성화 DNA 작제물내 활성화 DNA 서열은 형질전환주에서 발현되지 않는, 즉 사일런트하다. 이어서 활성화 DNA 작제물은 세포, 조직 또는 식물에 도입되어 하기에 완전히 기술되는 바와 같이 활성화 DNA 서열을 발현시키는 안정한 형질전환주를 형성한다. 본원에서 바람직하게 활성화 DNA 서열은 바람직하게 안티센스 루마진 신타제 서열 또는 안티센스 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 서열을 포함한다.
C. 하이브리드 전사 인자 유전자 또는 활성화 DNA 작제물을 포함하는 형질전환된 식물
본원에 기술된 안티센스 유효 시스템은 하이브리드 전사 인자 유전자를 포함하는 제1 식물 및 활성화 DNA 작제물을 포함하는 제2 식물을 사용한다. 상기 기술된 하이브리드 전사 인자 유전자 및 활성화 DNA 작제물은 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되고 널리 공지된 방법(교배, 아그로박테리움-매개 형질전환, Ti 플라스미드 벡터, 미세추진체 발포(microprojectile bombardment) 리포좀 매개 취득 및 미세 주입등과 같은 직접적인 DNA 취득)에 의해 식물내로 도입된다. 형질전환체는 당해 기술자에게 공지된 표준 방법에 따라 형질전환 유전자의 존재 유무 및 이의 작용에 대해 스크리닝된다.
D. 하이브리드 전사 인자 유전자 및 활성화 DNA 작제물 모두를 포함하는 형질전환된 식물
하이브리드 전사 인자 유전자 및 활성화 DNA 작제물 모두를 포함하는 F1 식물은 교배-수분작용(cross-pollination)에 의해 생성되고 적당한 마커의 존재에 대해 선택된다. 단독의 활성화 DNA 작제물을 포함하는 식물과는 대조적으로 F1 식물은 CaMV 35S와 같은 강한 항상성 프로모터를 사용하여 수득한 것과 비교하여 고농도의 활성화 DNA 서열 발현 산물을 생성한다.
안티센스 유효 검정
따라서, 본원에 기술된 시스템내에서 유용한 검정은,
a) 합성 프로모터가 식물내에 존재하는 경우 합성 프로모터를 활성화시킬 수 있는 하이브리드 전사 인자를 암호화하는 하이브리드 전사 인자 유전자로 안정하게 형질전환되는 제1 형질전환된 식물을 제공하는 단계(이때 제1 형질전환된 식물은 하이브리드 전사 인자에 대해 동형 접합체이다);
b) 안티센스 루마진 신타제 서열 또는 안티센스 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 서열과 같은 활성화 DNA 서열과 작동적으로 연결된 단계 a)의 하이브리드 전사 인자에 의해 활성화될 수 있는 합성 프로모터를 포함하는 활성화 DNA 작제물로 안정하게 형질전환된 제2 형질전환된 식물을 제공하는 단계;
c) 제1 형질전환된 식물과 제2 형질전환된 식물을 교배시켜 하이브리드 전사 인자의 존재하에 활성화 DNA 서열을 발현하는 F1 식물을 수득하는 단계; 및
d) F1 식물상에서 활성화 DNA 서열의 발현 효과를 결정하는 단계를 포함한다.
III. 식물 리보플라빈 생합성 효소의 재조합 생산 및 이의 용도
숙주 유기체내 식물 리보플라빈 생합성 효소의 재조합 생산을 위해, 본 발명의 식물 리보플라빈 생합성 암호화 서열이 선택된 숙주에 대해 고안된 발현 카세트로 삽입될 수 있고 재조합으로 생산되는 숙주로 도입된다. 선택된 숙주에 대해 적합한 프로모터, 시그날 서열, 5' 및 3' 비해독 서열 및 인핸서와 같은 특이적 조절 서열의 선택은 당해 분야에서 통상적인 기술자 수준내에 있다. 적당한 판독 프레임으로 연결된 각각의 성분을 포함하는 수득한 분자는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있는 벡터로 삽입될 수 있다. 단백질의 재조합 생산을 위해 적합한 발현 벡터 및 방법은 이. 콜리, 효모 및 곤충 세포와 같은 숙주 유기체에 대해 공지되어 있다[참조문헌: Luckow and Summers, Bio/Technol. 6:47(1988)]. 특정 예는 pBluescript(Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG(International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis(Invitrogen, La Jolla, CA) 및 바큘로 바이러스 발현 벡터, 예를 들어, 오토그라피카 캘리포니카(Autographica californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV)의 게놈으로부터 기원하는 벡터와 같은 플라스미드를 포함한다. 바람직한 바큘로바이러스/곤충 시스템은 pVI11392/Sf21 세포(Invitrogen, La Jolla, CA)이다.
재조합적으로 생산되는 식물 리보플라빈 생합성 효소는 다양한 표준 기술을 사용하여 분리되고 정제될 수 있다. 사용될 수 있는 실질적인 기술은 사용되는 숙주 유기체(효소가 분비용으로 고안되는가에 상관없이) 및 기술자에게 친숙한 또 다른 인자에 따라 다양할 것이다[참조문헌: chapter 16 of Ausubel, F. et al.,"Current Protocols in Molecular Biology", pub. by John Wiley & Sons, Inc (1994)].
재조합적으로 생산되는 식물 리보플라빈 생합성 효소는 다양한 목적을 위해 적합하다. 예를 들어, 사용될 수 있는 실질적인 기술은 표적이 확인되지 않은 공지된 화학 물질을 스크리닝하여 이들이 리보플라빈 생합성 효소를 억제하는가를 결정하기위한 시험관내 검정에서 사용될 수 있다. 상기 시험관내 검정은 또한 보다 일반적인 스크리닝으로서 사용되어 상기 효소 활성을 억제하고 따라서 제초제 후보로서 지목되는 화학물질을 동정할 수 있다. 또한, 재조합적으로 생산된 리보플라빈 생합성 효소는 효소의 제초제 내성 형태 뿐만 아니라 신규한 억제성 제초제를 이상적으로 고안해내기 위해, 공지된 억제제와 이의 연관성을 추가로 특징화하는데 사용될 수 있다.
억제제 검정:
따라서, 식물 리보플라빈 생합성 유전자와 같은 필수적인 식물 유전자의 억제제를 동정하는데 유용한 검정은,
a) 효소의 기능을 억제하는 것으로 추정되는 억제제의 존재하에 식물 생합성 효소 및 이의 지질을 반응시키는 단계;
b) 추정되는 억제제의 부재하에 동일한 조건하에서의 효소 활성 비와 추정되는 억제제의 존재하에 효소 활성의 비를 비교하는 단계; 및
c) 추정되는 억제제가 리보플라빈 생합성 효소를 억제하는가를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 식물 루마진 신타제에 대한 억제 효과는 검정에서 루마진 합성의 감소 또는 완전한 억제에 의해 결정될 수 있다. 상기 결정은 후보 억제제의 존재 및 부재하에 실시예에서 기술된 바와 같은 형광성 또는 흡광도 검출을 사용하여 시험관내 검정에서 합성된 루마진의 양을 비교함으로써 수행될 수 있다. 유사한 검정은 이중 작용성 식물 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 효소의 억제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
추가로, 재조합적으로 생산된 식물 리보플라빈 생합성 효소는 바실러스 서브틸리스 기원의 리보플라빈 신타제에 대해 수행된 바와 같이 이들 분자의 복잡한 구조를 설명하는데 사용될 수 있다[문헌참조: Ladnstein, et al.,(1988) J. Mol. Biol. 203, 1045-1070]. 식물 리보플라빈 생합성 효소의 구조에 대한 정보는 예를 들어, 신규 억제성 제초제를 이상적으로 고안하는데 사용될 수 있다.
IV. 제초제 내성 식물
본 발명은 추가로 식물내에 천연적으로 존재하는 리보플라빈 생합성을 억제하는 제초제에 대해 내성인 식물, 식물 조직, 식물 종자 및 식물 세포에 관한 것이고 이때 내성은 변형된 리보플라빈 생합성 효소 활성에 의해 부여된다. 변형된 리보플라빈 생합성 효소 활성은 추가의 야생형 리보플라빈 생합성 유전자를 식물에 제공하여 야생형 제초제 민감성 리보플라빈 생합성 효소의 발현을 증가시키거나 식물내에서 변형된 제초제-내성 생합성 효소를 발현시키거나 이들 기술을 조합하여본 발명에 따른 식물에 부여될 수 있다. 대표적인 식물은 이들 제초제가 통상적으로 의도되는 목적을 위해 적용되는 임의의 식물을 포함한다.
면화, 땅콩, 종유 유채, 사탕수수, 옥수수, 쌀, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 수수, 기장, 잔디 및 벼과 사료 작물 및 사초와 같은 농경학적으로 중요한 작물이 바람직하다.
A. 야생형 리보플라빈 생합성 효소의 증가된 발현
증가된 발현을 통해 변형된 리보플라빈 생합성 효소 활성을 성취하는 경우 최소한 제초제에 의해 야기되는 성장 억제를 극복하기에 충분한 수준으로 식물 세포의 리보플라빈 생합성 효소를 수득한다. 일반적으로 발현된 효소의 수준은 본래에 발현되는 양의 2배 이상, 바람직하게 5배 이상, 보다 바람직하게 10배 이상이다. 증가된 발현은 다중 카피물의 야생형 리보플라빈 생합성 유전자; 유전자내에 암호화 서열의 다중 반복(예: 유전자 증폭) 또는 식물 세포내 내인성 유전자의 비-암호 조절 서열에서의 돌연변이에 의해 야기될 수 있다. 상기 변형된 유전자 활성을 갖는 식물은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 식물내에서 직접 선별하여 수득될 수 있다[문헌참조: 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 제5,162,602호 및 미국 특허 제5,162,602호 및 미국 특허 제4,761,373호]. 이들 식물은 또한 당해 기술분야에 공지된 유전 공학 기술에 의해 수득될 수 있다. 제초제-민감성 리보플라빈 생합성의 증가된 발현은 또한 리보플라빈 생합성 효소를 암호화하는 동종 또는 이종성 구조 유전자와 작동적으로 연결된, 식물 세포내 연합된 구조 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터를 포함하는 재조합 또는 키메릭 DNA 분자를 사용하여 식물 세포를 안정하게 형질전환시킴으로써 성취될 수 있다.
B. 변형된 제초제 내성 리보플라빈 생합성 효소의 발현
상기 양태에 따라, 식물, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포가 리보플라빈 생합성 효소의 제초제 내성 형태를 암호화하는 암호화 서열과 작동적으로 연결된, 식물내에서 적합하게 작용하는 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된다. 효소의 제초제 내성 형태는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖고 이것은 효소의 변형되지 않은 천연에 존재하는 형태를 억제하는 제초제에 대해 내성을 부여한다. 이와같이 생성된 형질전환된 식물, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포는 통상적인 선택 기술에 의해 선별되고 이로써 제초제 내성주가 분리되고 특징화되고 발육된다. 리보플라빈 생합성 효소의 제초제 내성 형태를 암호화하는 유전자를 수득하기 위한 방법은 하기에서 기술된다.
한가지 일반적인 전략은 미생물상에 직접 또는 간접적인 돌연변이 과정을 포함한다. 예를 들어, 이. 콜리 또는 에스. 세레비지애와 같은 유전학적으로 조작될 수 있는 미생물을 시험관내에서 UV 광 또는 에틸 또는 메틸 메탄 설포네이트와 같은 돌연변이제를 사용하여 무작위로 돌연변이시킬 수 있다. 돌연변이 과정은 예를 들어, 문헌[참조: Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1972); Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY(1980); Sherman et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1983); and 미국 특허 제4,975,374호]에 기술되어 있다. 돌연변이를 위해 선별되는 미생물은 정상적인, 억제제에 만감한 리보플라빈 생합성 유전자를 포함하고 상기 유전자에 의해 부여되는 활성에 의해 좌우된다. 돌연변이된 세포는 변형되지 않은 유전자를 억제하는 농도에서 억제제의 존재하에 성장한다. 억제제의 존재하에서 돌연변이되지 않은 미생물보다 더 잘 성장하는(즉, 억제제에 내성을 보임) 돌연변이된 미생물의 콜로니를 추가의 검정을 위해 분리한다. 이들 콜로니로부터 기원하는 리보플라빈 생합성 유전자는 클로닝 또는 PCR 증폭중 하나에 의해 분리되고 이의 서열은 해명된다. 변형된 유전자 산물을 암호화하는 서열은 이어서 미생물에 역으로 클로닝시켜 억제제 내성을 부여하는 능력을 확인한다.
식물 리보플라빈 생합성 유전자의 돌연변이 제초제-내성 대립 형질 유전자를 수득하는 방법은 식물내에서 직접 선별하는 것을 포함한다. 예를 들어, 아라비도프시스, 땅콩 또는 옥수수와 같은 식물의 성장 억제에 대한 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자의 효과는 선행 기술분야에 공지된 방법에 의해 살균된 종자를 증가하는 농도의 억제제를 함유하는 단순한 최소 염 배지의 플레이트상에 도말함으로써 결정된다. 상기 농도는 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 및 3000 부/밀리언(ppm)의 범위에 있다. 상당한 성장 억제가 증식적으로 검출될 수 있는 가장 낮은 양이 후속 실험을 위해 사용된다.
식물의 돌연변이는 내성 대립 형질 유전자가 선택된 집단내에 존재하는 빈도수를 증가시키는데 사용된다. 돌연변이된 종자 물질은 다양한 공급원으로부터 유래되는데 여기에는 화학적 또는 물리적 돌연변이 또는 종자 또는 화학적 또는 물리적 돌연변이 또는 꽃가루(문헌참조: Neuffer, In Maize for Biological Research Sheridan, ed. Univ. Press, Grand Forks, ND., pp. 61-64(1982)]를 포함하고 이어서 이것은 식물 및 수득된 수거된 M1돌연변이 종자를 발육시키는데 사용된다. 전형적으로 아라비도프시스에 대해, 화학물질(예: 에틸 메탄 설포네이트) 또는 물리적 제제(예: 감사선 또는 고속 중성자)로 돌연변이된 종자로부터 성장한 식물의 후손 종자인 M2종자(Lehle Seeds, Tucson, AZ)는 내성을 선별하기 위해 적당한 농도의 억제제를 포함하는 최소 염 배지상에 10,000 종자/플레이트(10cm 직경)이하의 밀도로 파종된다. 파종후 성장을 계속하고 7일 내지 21일간 녹색으로 남아있는 묘목을 흙에 이식하고 성숙하여 종자를 형성할때까지 성장시킨다. 이들 종자의 후손은 제초제 내성에 대해 시험된다. 내성이 우성인 경우 종자가 3:1의 내성:민감성으로 분열하는 식물은 M2세대에서 내성에 대해 이형 접합성인 것으로 추측된다. 모든 내성 종자를 생성하는 식물은 M2세대에서 내성에 대해 동형 접합성인 것으로 추측된다. 곤충 종자에 대한 상기 돌연변이 및 이의 M2 후손 종자의 스크리닝은 또한 또 다른 종, 예를 들어, 땅콩에서 수행될 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,084,082호]. 또한 제초제 내성에 대해 스크리닝되는 돌연변이 종자는 화학적 또는 물리적 수단에 의해 돌연변이된 꽃가루로 발육시킨 결과로서 수득된다.
제초제 내성에 대한 유전적 바탕이 변형된 리보플라빈 생합성 유전자라는 확증은 하기에서 예시되는 바와 같이 확인될 수 있다. 먼저, 억제제에 대해 내성을 나타내는 식물로부터 리보플라빈 생합성 유전자의 대립 형질 유전자를 서열 1 또는서열 13에서 보여지는 서열을 암호화하는 아라비도프시스 cDNA내의 보존된 영역 또는 보다 바람직하게는 내성 대립 형질 유전자를 생성시키는데 사용되는 식물 기원의 변형되지 않은 리보플라빈 생합성 유전자 서열을 기초로하는 프라이머와 함께 PCR을 사용하여 분리한다. 암호화 서열내 돌연변이의 존재를 결정하기 위해 대립 형질 유전자를 서열화한후 대립 형질 유전자는 추정되는 내성-부여 대립 형질 유전자가 형질 도입된 식물상에 억제제의 내성을 부여하는 이의 능력에 대해 시험된다. 이들 식물은 억제제에 민감한 아라비도프시스 식물 또는 임의의 또 다른 식물일 수 있다. 두번째로, 리보플라빈 생합성 유전자는 공지된 제한 단편 길이의 다형성(RFLPs)과 상대적으로 맵핑될 수 있다[문헌참조: Chang et al. Proc. Natl. Acad, Sci, USA 85:6856-6860(1988); Nam et al., Plant Cell 1:699-705(1989)]. 내성 형질이 독립적으로 동일한 마커를 사용하여 맵핑된다. 내성이 리보플라빈 생합성 유전자내의 돌연변이로 인한 경우 내성 형질은 리보플라빈 생합성 유전자의 위치와 구분될 수 없는 위치로 맵핑된다.
리보플라빈 생합성 유전자의 제초제-내성 대립 형질 유전자를 수득하는 또 다른 방법은 식물 세포 배양에서 선별하는 것이다. 식물 조직의 이식편, 예를 들어, 배, 잎 화반등 또는 목적하는 식물의 활발히 성장하는 캘러스 또는 현탁 배양물을 실험실 환경에서 사용하기에 적합한 억제성 제초제 또는 동족성 억제제의 증가하는 농도의 존재하에서 배지상에서 성장시킨다. 다양한 정도의 성장을 상이한 배양에서 기록한다. 특정 배양에서, 신속히 성장하는 변이체 콜로니가 정상적인 억제 농도의 억제제의 존재하에서도 계속적으로 성장하는 상태로 나타난다. 신속히 성장하는 변이체가 나타날 수 있는 빈도수는 조직 또는 세포를 억제제에 노출시키기 전에 화학적 또는 물리적 돌연변이제로 처리함으로써 증가될 수 있다. 리보플라빈 생합성 유전자의 추정되는 내성 부여 대립 형질 유전자를 상기에 기술된 바와 같이 분리하고 시험한다. 제초제 내성을 부여하는 것으로 확인된 대립 형질 유전자는 이어서 최적의 발현을 위해 유전자 조작될 수 있고 식물로 형질전환된다. 또한 식물은 이들 대립 형질 유전자를 포함하는 조직 또는 세포 배양물로부터 성장될 수 있다.
여전히 또 다른 방법은 세균 또는 효모에서 야생형 제초제 민감성 식물 리보플라빈 생합성 유전자의 돌연변이에 이어서 억제성 농도의 억제제를 함유하는 배지상에서 미생물을 배양시키고 억제제의 존재하에서도 성장하는 콜로니를 선별하는 것을 포함한다. 보다 특히, 루마진 신타제(서열 1) 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 효소(서열 13)를 암호화하는 아라비도프시스 cDNA와 같은 식물 cDNA는 선별된 유전자 활성이 없는 미생물로 클로닝된다. 형질전환된 미생물은 이어서 수개의 당해 기술분야에 공지된 화학적 또는 효소적 방법, 예를 들어, 중황산 나트륨[참조문헌: Shortle et al., Methods Enzymol. 100:457-468(1983)]; 메톡실아민[참조문헌: Kadonaga et al., Nucleic Acids Res. 13:1733-1745(1985)]; 올리고뉴클레오타이드-지시된 포화 돌연변이[문헌 참조: Hutchinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:710-714(1986)]; 또는 다양한 폴리머라제 불량도입(misincorporation) 전략[참조문헌: Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1588-1592(1982); Shiraishi et al., Gene 64:313-319(1988); andLeung et al., Technique 1:11-15(1989)]중 하나에 의한 생체내 돌연변이 또는 시험관내 돌연변이시킨다. 정상적인 억제성 농도의 억제제의 존재하에 성장하는 콜로니를 취하여 반복된 재스트리킹으로 순수하게 단일화한다. 이의 플라스미드를 정제하고 이들을 리보플라빈 생합성 유전자 활성이 없는 미생물에 형질 전환시켜 억제제에 대해 내성을 부여하는 능력을 시험한다. 상기 시험을 통과한 플라스미드 기원의 cDNA 삽입물의 DNA 서열을 결정한다.
제초제 내성 리보플라빈 생합성 유전자는 또한 시험관내 재조합을 포함하는 방법, 또한 소위 DNA 셔플링이라는 방법을 사용하여 수득된다. 돌연변이, 바람직하게 무작위 돌연변이는 DNA 셔플링에 의해 리보플라빈 생합성 유전자에 도입된다. 또한 DNA 셔플링은 리보플라빈 생합성 유전자내에 서열의 재조합 및 재배열을 유도하거나 2개 이상의 상이한 리보플라빈 생합성 단백질 암호화 서열간의 서열의 재조합 및 교환을 유도한다. 이들 방법으로 수백만의 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자를 제조할 수 있다. 돌연변이된 유전자 또는 셔플링된 유전자는 목적하는 성질, 예를 들어, 제초제에 대한 개선된 내성 및 상이한 부류의 억제제에 광범위 스펙트럼의 내성을 제공하는 돌연변이에 대해 스크링된다. 상기 스크리닝은 당해 기술분야의 통상적인 기술자의 기술 범위내에 있다.
바람직한 양태에서, 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자는 하나 이상의 주형 리보플라빈 생합성 유전자로부터 형성되고 이때 주형 리보플라빈 생합성 유전자는 목적하는 크기의 이본쇄 무작위 단편으로 절단되고 수득한 일군의 이본쇄 무작위 단편에 하나 이상의 일본쇄 또는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드를 첨가하는단계(이때 상기 올리고뉴클레오타이드는 이본쇄 무작위 단편에 대한 동종성 영역과 이종성 영역을 포함한다); 수득한 혼합물의 이본쇄 무작위 단편 및 올리고뉴클레오타이드를 변성시켜 일본쇄 단편이 되게하는 단계; 수득한 일군의 일본쇄 단편을, 상기 영역에서 일본쇄 단편이 어닐링하여 어닐링된 단편의 쌍을 형성하는 조건하에서 폴리머라제로 항온처리하는 단계(이때 동종성 영역은 한 구성원의 쌍이 또 다른 복제를 프라이밍하기에 충분한 동종성임에 따라 돌연변이된 이본쇄 폴리올리고뉴클레오타이드를 형성한다); 제1 단계 및 제2 단계를 추가로 2회 주기동안 반복하는 단계(이때, 추가 주기의 제2단계에서 수득한 혼합물은 이전의 주기의 제3단계에서 돌연변이된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 추가의 주기는 추가의 돌연변이된 이본쇄 폴리뉴클레오타이드를 형성하고 이때 돌연변이된 폴리뉴클레오타이드는 천연적으로 존재하는 리보플라빈 생합성 활성을 억제하는 제초제에 대한 내성이 증가된 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자이다)를 포함한다. 바람직한 양태에서, 일군의 이본쇄 무작위 단편내의 단일 종의 이본쇄 무작위 단편의 농도는 총 DNA 중량중의 1중량%이하이다. 추가의 바람직한 양태에서, 주형 이본쇄 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 약 100종의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 이본쇄 무작위 단편의 크기는 약 5bp 내지 5kb이다. 추가의 바람직한 양태에서, 방법의 제4 단계는 10회 이상의 주기동안 제2 단계 및 제3 단계를 반복함을 포함한다. 상기 바법은 문헌[참조: Stemmer et al. (1994) Nature 370:389-391, 미국 특허 제5,605,793호 및 Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291 및 WO 97/20078]에 기술되어 있고 이들 문헌은 본원에 참조로서 인용된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 문헌[참조: Zhao et al.(1988) Nature Biotechonogy 16:258-261]에 기술된 바와 같이 임의의 조합된 2개 이상의 상이한 리보플라빈 생합성 유전자는 엇갈린 연장 과정(staggered extension process)(StEP)에 의해 시험관내에서 돌연변이된다. 간략하게 2개 이상의 리보플라빈 생합성 유전자는 바람직하게 폴리머라제의 최적 중합 온도보다 낮은 온도에서 수행되는 연장 주기의 PCR 반응을 사용하는 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용된다. 예를 들어, 최적 온도가 약 72℃인 열안정성 폴리머라제를 사용하는 경우 연장 반응을 위한 온도는 바람직하게 72℃이하, 보다 바람직하게는 65℃이하, 바람직하게는 60℃이하, 보다 바람직하게는 연장 반응 온도는 55℃이다. 추가로, 지속적인 PCR 주기의 연장 반응의 지속 시간은 바람직하게 통상적으로 당해 기술분야에서 수행되는 것 보다 짧고 보다 바람직하게는 30초 미만이고, 바람직하게 15초 미만이고 보다 바람직하게 연장 반응의 지속시간은 5초이다. 단지 짧은 DNA 단편은 각각의 연장 반응에서 중합되어 변성 및 어닐링의 각 주기후에 개시 DNA 분자 사이에 연장 산물의 주형 스위치를 허용함으로써 다양한 연장 생성물을 생성한다. PCR 반응에서 최적의 주기 회수는 돌연변이될 리보플라빈 생합성 암호 영역의 길이에 의존하지만 바람직하게 40회 주기이상, 보다 바람직하게는 60회 주기 이상, 바람직하게 80회 주기 이상이 사용된다. 매번 조합되는 리보플라빈 생합성 유전자에 대한 최적의 연장 조건 및 최적수의 PCR 주기는 당해 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 결정된다. PCR 반응에 대한 또 다른 계수는 통상적으로 당해 기술분야에서 사용되는 것과 근본적으로 동일하다. 증폭 반응을 위한 프라이머는 바람직하게 리보플라빈 생합성 유전자의 암호화 서열의 외부에 위치한 DNA 서열, 예를 들어, 리보플라빈 생합성 유전자를 포함하는 벡터의 DNA 서열로 어닐링되도록 고안함으로써 PCR 반응에 사용되는 상이한 리보플라빈 생합성 유전자는 바람직하게 분리된 벡터내에 포함된다. 바람직하게 프라이머는 리보플라빈 생합성 암호화 서열로부터 500bp이하로 떨어져 위치한 서열, 바라직하게 리보플라빈 생합성 암호화 서열로부터 200bp이하로 떨어져 위치한 서열, 보다 바람직하게는 리보플라빈 생합성 암호화 서열로부터 120bp 떨어져 위치한 서열로 어닐링한다. 바람직하게, 리보플라빈 생합성 암호화 서열은 PCR 반응동안에 증폭된 DNA 서열에 포함된 제한 부위로 포위되어 있음으로써 중폭된 산물이 적합한 벡터로 클로닝되는 것을 용이하게 한다.
또 다른 바람직한 양태에서, 접착성 말단을 갖는 리보플라빈 생합성 유전자의 단편은 WO 98/05765에 기술된 바와 같이 제조된다. 접착성 말단은 리보플라빈 생합성 유전자의 일부와 상응하는 제1 올리고뉴클레오타이드를 유전자에 존재하지 않거나 제1 올리고뉴클레오타이드에 상응하는 유전자의 일부에 접해있지 않은 유전자 일부에 상응하는 제2 올리고뉴클레오타이드를 연결시킴으로써 형성되고 이때 제2 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 이본쇄 DNA는 주형으로서 제1 올리고뉴클레오타이드를 사용하고 프라이머로서 제2 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써 형성된다. 리보뉴클레오타이드는 절단되어 제거된다. 리보뉴클레오타이드의 5'에 위치한 뉴클레오타이드(들)는 또한 제거되어 접착성 말단을 갖는 이본쇄 단편이 된다. 상기 단편들은 무작위로 연결되어 다시 어셈블링되고 신규 조합의 유전자 서열이 수득된다.
임의의 리보플라빈 생합성 유전자 또는 임의로 조합된 리보플라빈 생합성 유전자는 본원에서 시험관내 재조합을 위해 사용되는데 예를 들어, 아라비도프시스 탈리아나와 같은 식물로부터 유래된 리보플라빈 생합성 유전자, 서열 1 또는 서열 13에 제시된 리보플라빈 생합성 유전자 또는 바실러스 또는 이. 콜리로부터 유래된 리보플라빈 생합성 유전자가 있다. 전체 리보플라빈 생합성 유전자 또는 이의 일부는 본원에서 사용된다. 상기 기술된 방법으로 수득된 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자의 라이브러리는 적당한 발현 벡터로 클론되고 수득한 벡터는 적합한 숙주, 예를 들어, 클라미도모나스(Chlamydomonas)와 같은 조류, 효모 또는 세균으로 형질전환된다. 바람직한 숙주는 바람직하게 리보플라빈 생합성 유전자 활성이 없는 숙주이다. 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자의 라이브러리를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 억세성 농도의 억제제를 함유하는 배지상에서 배양하고 억제제의 존재하에서 증식하는 콜로니를 선별한다. 정상적인 억제성 농도의 억제제의 존재하에 증식하는 콜로니를 취하고 반복되는 재스트리킹에 의해 순수하게 단일화한다. 이들의 플라스미드는 정제되고 이어서 싱기 시험을 통과한 플라스미드 기원의 cDNA 삽입물의 DNA 서열이 결정된다.
억제제에 내성인 변형된 리보플라빈 생합성 유전자를 동정하기 위한 검정은 하기의 변형된 방법을 사용하여 리보플라빈 생합성 효소의 억제제를 동정하기위한 검정(억제제 검정, 상기)으로서 상기 방식으로 수행될 수 있다:
첫번째로 돌연변이 리보플라빈 생합성 효소는 반응 혼합물중 하나에서 억제제 검정의 야생형 리보플라빈 생합성 효소로 대체된다. 두번째로 야생형 효소의억제제는 반응 혼합물 모두에 존재한다. 세번째로 돌연변이된 활성(억제제의 존재하의 활성 및 돌연변이된 효소) 및 돌연변이되지 않은 활성(억제제 존재하의 활성 및 야생형 효소)을 비교하여, 돌연변이되지 않은 활성과 비교하는 경우 돌연변이된 활성에서 효소 활성이 상당히 증가되었는가를 결정한다. 돌연변이된 활성은 적합한 기질 및 억제제의 존재하에 임의로 측정한 돌연변이된 효소의 활성이다. 돌연변이되지 않은 활성은 적합한 기질 및 억제제의 존재하에 임의로 측정된 야생형 효소의 활성이다. 상당한 증가는 측정 기술에서의 고유 오차 한계보다 크게 증가한 효소 활성, 바람직하게 억제제의 존재하에서 야생형 효소의 약 2배 이상의 활성 증가, 보다 바람직하게는 약 5배 이상의 증가, 가장 바람직하게는 약 10배 이상의 증가로서 정의된다.
제초제 내성 식물을 제조하는데 사용되는 것 뿐만 아니라 제초제 내성 리보플라빈 생합성 효소를 암호화하는 유전자는 또한 식물 세포 형질전환 방법에서 선택성 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 유전자로 형질전환되는 식물, 식물 조직, 식물 종자 또는 식물 세포는 또한 식물에 의해 발현될 수 있는 변형된 리보플라빈 생합성 효소를 암호화하는 유전자로 형질전환될 수 있다. 형질전환된 세포는 변형된 유전자를 발현하지 않는 식물 세포의 생존성을 억제하기에 충분한 양으로 효소의 억제제를 함유하는 배지로 이동되고 이때 단지 형질전환된 세포만이 생존할 것이다. 상기 방법은 변형된 리보플라빈 생합성 효소 암호화 유전자로 형질전환될 수 있는 임의의 식물 세포에 적용될 수 있고 목적하는 특정 형질전환 유전자와 함께 사용될 수 있다. 형질전환 유전자 및 변형된 유전자는 식물세포에서 작용을 하는 동일한 프로모터에 의해 또는 별도의 프로모터에 의해 발현될 수 있다.
V. 식물 형질전환 기술
리보플라빈 생합성 유전자의 야생형 또는 제초제 내성 형태는 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 식물 또는 세균 세포로 혼입될 수 있다. 일반적으로 이것은 당해 기술분야에 공지된 표준 클로닝 방법을 사용하여 리보플라빈 생합성 효소를 암호화화는 DNA 분자를, DNA 분자가 이종성(정상적으로 존재하지 않음)인 발현 시스템에 삽입시킴을 포함한다. 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포내 삽입된 단백질 암호화 서열의 전사 및 해독을 위해 필요한 성분을 포함한다. 당해 기술분야에 공지된 대다수의 벡터 시스템(예: 플라스미드, 박테리오파아지 바이러스 및 또 다른 변형된 바이러스)이 사용될 수 있다. 발현 시스템의 성분은 또한 변형되어 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 말단 절단된 서열, 뉴클레오타이드 치환 또는 또 다른 변형 방법이 사용될 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 발현 시스템은 적합한 조건하에서 실질적으로 임의의 식물 작물을 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 형질전환된 세포는 리보플라빈 생삽성 유전자의 선택된 형태가 형질전환된 식물에서 제초제 내성을 부여하도록 전체 식물로 재성장될 수 있다.
A. 식물 발현 카세트 작제물을 위한 요구 조건
형질전환 식물에서 발현되도록 의도된 유전자 서열은 먼저 식물내에서 발현성으로 적합한 프로모터 뒤쪽에 있는 발현 카세트로 어셈블링된다. 발현 카세트는 또한 형질전환 유전자의 발현을 위해 요구되거나 선택되는 임의의 추가의 서열을 포함한다. 상기 서열은 전사 종결 인자; 인트론, 필수 서열 및 유전자 산물이 특정 기관 및 세포 격실(compartment)로 표적화되기 위해 사용되는 서열과 같은 발현을 증가시키기 위한 외인성 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 발현 카세트는 하기에서 기술되는 식물 형질전환 벡터로 용이하게 전달될 수 있다. 전형적인 발현 카세트의 다양한 성분이 하기에서 기술된다.
1. 프로모터
발현 카세트에 사용되는 프로모터의 선택은 형질전환된 식물에서 형질전환 유전자의 공간적이고 일시적인 발현 패턴을 결정한다. 선택된 프로모터는 특정 세포 유형(예: 잎 상피 세포, 엽육 세포, 뿌리 피질 세포) 또는 특정 조직 또는 기관(예: 뿌리, 잎 또는 꽃)에서 형질전환 유전자를 발현할 것이고 목적하는 위치에서 유전자 산물이 축적하는 것을 반영하여 선택될 것이다. 또한 선택된 프로모터는 다양한 유도 조건하에서 유전자를 발현시킬 수 있다. 프로모터의 강도, 예를 들어, 전사를 촉진시키는 능력은 다양하다. 사용되는 숙주 세포 시스템에 따라, 당해 기술분야에 공지된 많은 적합한 프로모터중 임의의 하나가 사용될 수 있다. 예를 들어, 항상성 발현을 위해 CaMV 35S 프로모터, 쌀 액틴 프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터가 사용될 수 있다. 조절성 발현을 위해, 담배 또는 아라비도프시스 기원의 화학적 유도성 PR-1 프로모터가 사용될 수 있다[참조문헌: 미국 특허 제5,689,044호].
2. 전사 종결 인자
다양한 전사 종결 인자가 발현 카세트에 사용하기에 유용하다. 이들은 형질전환 유전자의 후반부 및 이의 정확한 폴리아데닐화 후반부에서 전사를 종결시키는데 관여한다. 적당한 전사 종결 인자는 식물에서 작용하는 것으로 공지된 종결 인자 및 CaMV 35S 전사 종결인자, tml 전사 종결인자, 노팔린 신타제 전사 종결인자 및 pea rbcS E9 전사 종결인자를 포함한다. 이들은 단자엽 및 쌍자엽 식물 모두에서 사용될 수 있다.
3. 발현을 증가시키거나 조절하기 위한 서열
많은 서열이 전사 단위체내에서 유전자 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌고 이들 서열은 본 발명의 유전자와 연계되어 사용되어 형질전환된 식물에서 이의 발현을 증가시킨다. 예를 들어, 옥수수 Adhl의 인트론과 같은 다양한 인트론 서열이 특히 단자엽 세포에서 발현을 증가시키는 것으로 나타났다. 추가로 바이러스로부터 유래된 많은 비해독 리더 서열이 또한 발현을 증가시키고 이들은 특히 쌍자엽 세포에서 효과적이다.
4. 암호화 서열 최적화
선택된 유전자의 암호화 서열은 목적하는 작물 종에서 최적 발현을 위해 암호화 서열을 변화시킴으로써 유전학적으로 조작될 수 있다. 특정 작물 종에서 최적 발현을 성취하기 위해 암호화 서열을 변형시키기 위한 방법은 널리 공지되어 있다[참조문헌: Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324(1991); and Koziel et al., Bio/technol. 11:194(1993)].
5. 세포내 유전자 산물의 표적화
유전자 산물을 표적시키기 위한 다양한 기작이 식물내에 존재하는 것으로 공지되어 있고 이들 기작의 작용을 조절하는 서열이 다소 상세하게 특징화되었다. 예를 들어, 유전자 산물의 엽록체로의 표적하는 다양한 단백질의 아미노 말단에 있는 시그날 서열에 의해 조절되고 이것은 엽록체로 들어가는 동안 절단되어 유전자 산물이 성숙한 단백질로 된다[참조문헌: Cormai et al. J. Biol. Chem. 263: 15104-15109(1988)]. 또 다른 유전자 산물은 미토콘드리아 및 퍼록시솜과 같은 기관으로 이동한다[문헌참조: Unger et al. Plant Molec. Biol. 13:411-418(1989)]. 이들 산물을 암호화화는 cDNA는 이종성 유전자 산물을 이들 기관으로 표적화시킬 수 있도록 조작될 수 있다. 추가로, 유전자 산물을 또 다른 세포 격실로 표적화시키는 서열이 특징화되었다. 아미노 말단 서열은 ER, 아포플라스트로 표적화시키고 알레우론 세포로부터 세포외 분비되도록 하는데 관여한다[문헌참조: Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783(1990)]. 추가로, 카복시 말단 서열과 연계된 아미노 말단 서열은 유전자 산물이 액포로 표적화되는데 관여한다[문헌참조: Shinshi et al. Plant Molec. Biol. 14: 357-368(1990)]. 상기 기술된 적합한 표적화 서열을 목적하는 형질전환 서열로 융합시킴으로써 유전자 산물을 특정 기관 또는 세포 격실로 이동시킬 수 있다.
B. 식물 형질전환 벡터의 작제
식물 형질전환에 유용한 많은 형질전환 벡터는 식물 형질전환 기술 분야에통상적인 기술자에게 공지되어 있고 본 발명에 적절한 유전자는 임의의 상기 벡터와 연계되어 사용될 수 있다. 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술 및 형질전환을 위한 표적 종에 따라 다양할 것이다. 특정 표적 종에 대해 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직할 수 있다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선택 마커는 가나마이신 및 관련 항생제에 내성을 부여하는 nptll 유전자[문헌참조: Messing & Vierra. Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304:184-187(1983)], 제초제인 포스피노트리신에 내성을 부여하는 bar 유전자[문헌참조: White et al., Nucl. Acids Res 18:1062(1990), Spencer et al. Theor. Appl. Genet 79:625-631(1990)], 항생제 하이그로마이신에 내성을 부여하는 hph 유전자[문헌참조: Blochinger & Dggelmann, Mol Cell Biol 4:2929-2931] 및 메타트렉세이트에 내성을 부여하는 dhfr 유전자[문헌참조: Bourouis et al., EMBO J. 2(7):1099-1104(1983)] 및 글리포세이트에 내성을 부여하는 EPSPS 유전자[문헌참조:미국 특허 제4,940,935호 및 제5,188,642호]를 포함한다.
1. 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환에 적합한 벡터
많은 벡터가 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하는 형질전환에 유용하다. 이들은 전형적으로 하나 이상의 T-DNA 경계 서열을 갖고 있고 pBIN19[조: Bevan, Nucl. Acids Res.(1984)] 및 pXYZ와 같은 벡터를 포함한다. 아그로박테리움 형질전환은 2개의 벡터 pCIB200 및 pCIB2001 뿐만 아니라 2개의 벡터 pCIB10 및 이의 하이그로마이신 선택 유도체[문헌참조: 미국 특허 제5,639,949호]를 포함한다.
2. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 벡터
아그로박테리움 튜메파시엔스를 사용하지 않는 형질전환은 선택된 형질전환 벡터내 T-DNA 서열을 필요로하지 않고 결과적으로 이들 서열이 없는 벡터 뿐만 아니라 T-DNA 서열을 포함하는 상기 기술된 바와 같은 벡터가 사용될 수 있다. 아그로박테리움에 의존하지 않는 형질전환 기술은 입자 발포(particle bombardment), 원형질 취득(예: PEG 및 전기 천공) 및 미세주입을 통한 형질전환을 포함한다. 벡터의 선택은 형질전환될 종에 대한 바람직한 선택에 좌우된다. 비-아그로박테리움 형질전환에 적합한 전형적인 벡터는 pCIB3064, pSOG19 및 pSOG35(문헌참조: 미국 특허 제5,639,949호)를 포함한다.
C. 형질전환 기술
목적하는 암호화 서열을 일단 발현 시스템에 클로닝하고 이것으로 식물 세포를 형질전환시킨다. 식물의 형질전환 및 재성장을 위한 방법은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Ti 플라스미드 벡터 뿐만 아니라 직접적인 DNA 취득, 리포좀, 전기천공, 미세주입 및 미세추진체는 외래 DNA를 전달하기 위해 사용되어 왔다. 추가로, 아그로박테리움 속 기원의 세균은 식물 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
쌍자엽 식물에 대한 형질전환 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고 아그로박테리움을 기초로한 기술 및 아그로박테리움을 요구하지 않는 기술을 포함한다. 비-아그로박테리움 기술은 직접적인 원형질 또는 세포에 의한 외인성 유전자 물질의 취득을 포함한다. 이것은 PEG 또는 전기천공으로 매개되는 취득, 입자 발포-매개 전달 또는 미세주입에 의해 성취될 수 있다. 각각의 경우에 형질전환된 세포는 당해 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 전체 식물로 재성장된다.
대부분의 단자엽 종의 형질전환은 현재 통상적인 것이 되었다. 바람직한 기술은 아그로박테리움 매개 형질전환 뿐만 아니라 PEG 또는 전기천공 기술을 사용한 원형질로의 유전자의 직접적인 전달, 입자 발포를 사용한 캘러스 조직으로의 유전자의 직접적인 전달을 포함한다.
VI. 육종
본 발명의 리보플라빈 생합성 유전자의 야생형 또는 변형된 형태는 다양한 종류의 식물 세포(겉씨 식물, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 포함)에 제초제 내성을 부여하는데 사용될 수 있다. 유전자는 광범위한 부류내에 속하는 임의의 식물 세포로 삽입될 수 있지만 특히 작물 식물 세포(예: 쌀, 밀, 보리, 호밀, 옥수수, 감자, 당근, 고구마, 사탕수수, 콩, 완두콩, 치코리, 상추, 양배추, 꽃양배추, 브로콜리, 순무, 무, 시금치, 아스파라거스, 양파, 마늘, 가지, 후추, 셀러리, 당근, 호박, 펌프킨, 주키니, 오이, 사과, 배, 마르멜로, 멜론, 서양자두, 체리, 복숭아, 승도복숭아, 살구, 딸기, 포도, 나무딸기, 검은딸기, 파인애플, 아보카도, 파파야, 망고, 바나나, 땅콩, 담배, 토마토, 수수 및 사탕수수)에 유용하다.
생산 및 품질을 위해 중요한 특징과 조합된, 고-수준 발현의 야생형 리보플라빈 생합성 유전자 및/또는 발현식물에 제초제 내성을 부여하는 리보플라빈 생합성 유전자의 제초제 내성 형태는 당해 기술분야에 공지된 육종 방법 및 기술을 통해 식물 세포주로 도입될 수 있다.
제초제 내성 리보플라빈 생합성 유전자 대립 형질이 작물 식물 또는 작물 식물이 재성장될 수 있는 식물 세포 배양물중에서 직접 선택하여 수득되는 경우, 대립 형질 유전자를 유전적으로 조작하고 이것으로 식물을 형질전환시킬 필요없이 제초제 내성 작물을 발육시키기 위해 전통적인 육종 기술을 사용하여 상업적 품종이 되게한다.
본 발명은 추가로 하기 상세한 실시예를 참조로 기술된다. 이들 실시예는 설명을 목적으로 제공되는 것이지 달리 특정되지 않는한 여기로 제한시키고자 하는 것은 아니다.
서열 목록의 서열에 대한 간단한 설명
서열 1은 아라비도프시스 탈리아나로 부터 유래된 리보플라빈 신타제의 β-서브유니트(루마진 신타제)를 암호화하는 cDNA 서열이다.
서열 2는 서열 1에 의해 암호화된 아라비도프시스 탈리아나 루마진 신타제의 예상되는 아미노산 서열이다.
서열 3은 올리고뉴클레오타이드 DG-63이다.
서열 4는 올리고뉴클레오타이드 DG-65이다.
서열 5는 올리고뉴클레오타이드 JG-L이다.
서열 6은 올리고뉴클레오타이드 RS-1이다.
서열 7은 올리고뉴클레오타이드 RS-2이다.
서열 8은 실시예 7에서 사용되는 합성 펩타이드이다.
서열 9는 실시예 7에서 사용되는 또 다른 합성 펩타이드이다.
서열 10은 올리고뉴클레오타이드 DG-252이다.
서열 11은 올리고뉴클레오타이드 DG-253이다.
서열 12는 올리고뉴클레어타이드 DG-254이다.
서열 13은 아라비도프시스 탈리아나로 부터 기원하는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 효소를 암호화하는 부분적인 cDNA 서열이다.
서열 14는 서열 13에 의해 암호화된 성숙한 아라비도프시스 탈리아나 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 효소의 예상되는 아미노산 서열이다.
서열 15는 올리고뉴클레오타이드 DG-67이다.
서열 16은 올리고뉴클레오타이드 DG-69이다.
서열 17은 올리고뉴클레오타이드 DG-392a이다.
서열 18은 올리고뉴클레오타이드 DG-393a이다.
서열 19는 올리고뉴클레오타이드 DG-390a이다.
서열 20은 올리고뉴클레오타이드 DG-391a이다.
실시예
본원에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있고 문헌[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning, eds., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989) and by T.J. Silhavy, M.L. Berman, and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) and by Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publication Assoc. and Wiley-Interscience(1987)]에 기술되어 있다.
실시예 1: 아라비도프시스로부터 기원된 루마진 신타제를 암호화하는 cDNA의 분리
아라비도프시스 탈리아나 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스의 연구(Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State, Ohio State University, Columbus, OH)는 EST(EST # P25540, gb acc. #Z34233)가 이. 콜리로 부터 기원하는 리보플라빈 신타제의 β 서브유니트와 상동성이라는 것을 밝힌다. 주형으로서 아라비도프시스 cDNA 라이브러리의 플라스미드 DNA(문헌참조: Minet et al., (1992) Plant J. 2:417-422) 및 EST 서열로서 고안된 합성 올리고뉴클레오타이드 DG-63(서열 3) 및 DG-65(서열 4)를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 204-bp DNA 단편을 생성한다. 204-bp 단편을 TA 클로닝 벡터 pCR II(Invitrogen Corp., San Diego, CA)에 연결한다. 형광성 염료로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용하는 연쇄 종결방법에 의한 서열 결정(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)는 204-bp 단편이 EST #P25540의 서열과 동일하다는 것을 확증한다.
람다 ZAP 아라비도프시스 cDNA 라이브러리의 약 150,000pfu를 10cm 평판 접시당 8,000 플라크의 밀도로 도말하고 37℃에서 7시간 성장시킨후 플라크를 여과한다. 프라임 타임 키트(International Biotechonlogies, Inc., Nwe Haven, CT)를 사용한 무작위 프라이밍 방법에 의해 32P-dCTP로 표지된 204-bp 단편으로 플라크 여과물을 탐침시킨다. 하이브리드화 조건은 65℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, NaPO40.5M, pH 7.0, EDTA 1mM, 소 알부민 1%이다. 밤새 하이브리드화시킨후에 여과물을 65℃에서 SDS 1%, 50mM NaPO4, 1mM EDTA로 세척한다. 6개의 양성 하이브리드화 플라크를 오토라디오그래프로 검출한다. 단일 플라크로 정제한후에 cDNA 삽입물을 분리하고 이의 서열을 형광성 염료로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용한 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 결정한다. GAP 프로그램(Deveraux, et al., (1084) Nucleic Acids Res. 12:387-95)을 사용하여 RSβ-1으로 명명된 가장 긴 클론의 데이터베이스 연구는 이. 콜리로부터 기원하는 리보플라빈 신타제 β 서브유니트와 서열이 유사하다는 것을 밝힌다. 단백질은 68%가 유사하고 44%가 동일하다. 추가로, 아라비도프시스 성숙한 단백질과 이. 콜리 리보플라빈 신타제 β 서브유니트의 비교는 엽록체 통과 단백질이 존재한다는 것을 제안한다.
pBluescript SK 벡터내 RSβ-1은 부다페스트 조약하에 1995년 2월 7일에 미국 일리노이주 61604 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐럴 리서치 컬쳐 콜렉션(NRRL)에 pDG-4a.t.로서 기탁되었고 NRRL 기탁번호 제B-21400호를 부여받았다.
RSβ-1을 암호화하는 아라비도프시스 cDNA 서열은 서열 1에 제시되어 있고암호화된 아미노산 서열은 서열 2에 제시되어 있다.
실시예 2: 아라비도프시스 루마진 신타제 암호화 서열과 서열 유사성을 기초로한 추가의 루마진 신타제 유전자의 분리
파아지 또는 플라스미드 라이브러리를 10cm 평판 접시당 약 8,000pfu의 밀도로 도말하고 플라크를 37℃에서 7시간동안 성장시킨후 여과한다. 프라임 타임 키트(International Biotechonlogies, Inc., Nwe Haven, CT)를 사용한 무작위 프라이밍 방법에 의해 32P-dCTP로 표지된 서열 1의 cDNA로 플라크 여과물을 탐침시킨다. 하이브리드화 조건은 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, NaPO40.5M, pH 7.0, EDTA 1mM이다. 밤새 하이브리드화시킨후에 여과물을 50℃에서 2 X SSC, SDS 1%로 세척한다. 양성적으로 하이브리드화 플라크를 오토라디오그래프로 검출한다. 단일 플라크로 정제한후에 cDNA 삽입물을 분리하고 이의 서열을 형광성 염료로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용한 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 결정한다. 상기 실험 프로토콜을 사용하여 당해 기술분야의 기술자는 임의의 따른 식물 종으로 부터 기원하는 아라비도프시스 암호화 서열(서열 1)과 실질적으로 유사한 루마진 신타제 유전자를 수득한다.
실시예 3: 안티센스 루마진 신타제에 융합된 GAL4 결합 부위/최소 35S CaMV 프로모터를 포함하는 벡터의 작제
pAT71:
10개의 GAL 4 결합 부위 및 최소 35S 프로모터(+59 내지 +1)를 EcoRI-PstI 단편으로서 pGALLuc2[문헌참조: Goff, et al.,(1991) Genes & Development 5:298 - 309]으로 부터 절단하고 pBluescript의 각각의 부위로 삽입하여 pAT52를 수득한다. pAT66을 pAT52의 HindIII-PstI 단편, pCIB1716의 PstI-EcoRI 단편(35S 비해독 리더, GUS 유전자, 35S 종결인자 포함) 및 HindIII-EcoRI 절단 pUC18 사이에 3자-방식 연결로 작제한다. pAT66의 35S 리더를 PstI-NcoI로 절단하고 +1에서 +48까지 연장되어 있는 PCR-생성된 35S 리더로 대체하여 pAT71을 수득한다.
pJG304:
플라스미드 pBS SK+(Stratagene, LaJolla, CA)를 SacI로 선형화하고 mung 콩 뉴클레아제로 처리하여 SacI 부위를 제거하고 T4 리가제를 사용하여 재연결시켜 pJG201을 수득한다. 10XGAL 4 보존 결합 부위/CaMV 35S 최소 프로모터/GUS 유전자/CaMV 종결인자 카세트를 KpnI로 pAT71로부터 제거하고 pJG201의 KpnI 부위로 클로닝하여 pJG304를 수득한다.
pJG304를 부분적으로 제한 엔도뉴클레아제 Asp718로 분해하여 완전한 길이의 선형 단편을 분리한다. 상기 단편을 과몰의 22 염기 올리고뉴클레오타이드 JG-L(서열 5)로 연결한다. 제한 분석을 사용하여 GAL4 DNA 결합 부위 5'에 삽입된 링커와 함께 클론을 동정하고 상기 플라스미드를 pJG304?Xhol로서 명명한다.
pDG1:
루마진 신타제 cDNA 클론의 단편을 올리고뉴클레오타이드 RS-1(서열 6) 및RS-2(서열 7)를 사용하여 cDNA 클론 RSβ-1으로부터 PCR 증폭시킨다. 상기 PCR 산물은 염기쌍 792번째에서 종결되는 루마진 신타제 cDNA(서열 1)의 5' 부위를 포함한다.
벡터 pJG304?XhoI를 SacI 및 NocI로 분해하여 GUS 유전자 암호화 서열을 절단한다. 루마진 신타제 PCR 단편을 SacI 및 NcoI로 분해하여 pJG304?Xhol에 연결하여 pDG1을 수득한다.
실시예 4: GAL4 결합 부위/CaMV 최소 35S 프로모터로부터 루마진 신타제 안티센스를 발현시키기 위한 식물 형질전환 벡터
pJG261:
벡터 pGPTV(Becker, et al., (1992) Plant Molecular Biology 20: 1195-1197)를 EcoRI 및 HindIII로 분해하여 노팔린 신타제 프로모터/GUS 카세트를 제거한다. 동시에, EcoRI 및 HindIII를 사용하여 pSE380(Invitrogen, San Diego, CA)로 부터 슈퍼링커를 절단하고 EcoR1/HindIII로 선형화된 pGPTV로 클로닝시켜 pJG261을 수득한다.
pDG2:
pDG1을 Xhol로 절단하여 GAL4 DNA 결합 부위/35S 최소 프로모터/안티센스 루마진 신타제/CaMV 종결인자 융합물을 함유하는 카세트를 절단해낸다. 전사가 bar 선택성 마커로부터 갈라져 나오도록 상기 카세트를 Xhol-분해된 pJG261에 연결하여 pDG2를 제조한다.
실시예 5: GAL4 결합 부위/최소 CaMV 35S 안티센스 루마진 신타제 형질전환된 식물의 생산
pDG2를 사용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 C58C1(pMP90)를 전기-형질전환(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)시키고 아라비도프시스 식물(Ecotype Columbia)를 침투로 형질전환시킨다[문헌참조: Bechtold, et al.,(1993)C.R.Acad.Sci.Paris, 316:1188-93]. 침투된 식물 기원의 종자를, 바스타 15mg/리터를 함유하는 발아 배지[Murashige-Skoog 염 4.3g/리터, Mes 0.5g/리터, 슈크로스 1%, 티아민 10㎍/리터, 피리독신 5㎍/리터, 니코틴산 5㎍/리터, 미오-이노시톨 1mg/리터, pH 5.8]상에서 선별한다.
실시예 6: GAL4/C1 트랜스활성화인자 형질전환된 식물의 생산
pGALC1[문헌참조: Goff, et al., (1991)] 기원의 GAL4-C1 EcoRI 단편을 pIC20H의 EcoRI 부위로 연결시킴으로써 pSGZL1을 작제한다. pSGZL1의 GAL4-C1 단편을 BamHI-BgIII로 절단하고 pCIB770(문헌참조: Rothstein, et al.,(1987) Gene 53:153-161)의 BamHI 부위로 삽입하여 pAT53을 수득한다.
아라비도프시스 뿌리 이식체를 문헌[참조: Valvekens, et al., (1985) PNAS USA 85:5536-5540]에 기술된 바와 같이 pAT53으로 형질전환시킨다. 단일 부위 삽입물을 갖고 양성 GAL4/C1 발현을 갖는 형질전환된 식물은 동형 접합체이다.
실시예 7
GAL4/C1 트랜스활성화인자 및 GAL4 결합 부위/최소 CaMV 35S 프로모터를 사용하는 루마진 신타제의 안티센스 억제
GAL4 결합 부위/최소 CaMV 35S 프로모터/안티센스 루마진 신타제 작제물을 포함하는 15개의 형질전환된 식물을 흙에 이식하고 그린하우스에서 성숙해질까지 성장시킨다. 1차 형질전환체상에 피어난 꽃을 동형 접합성 GAL4/C1 트랜스활성화인자 주 pAT53-103 기원의 꽃가루와 교배한다. F1 종자를 발아배지 및 바스타 15mg/리터를 포함하는 발아배지상에 도말한다. 플레이트상에 하나의 세포주는 50% 치사율의 표현형을 나타낸다. 남아있는 F1 세포주로부터의 묘목을 흙에 이식하고 그린하우스에서 성숙해질때까지 성장시킨다. 2개의 F1 세포주의 묘목중 반은 흙에서 죽는다.
정제된 단백질 유도체에 결합된 합성 펩타이드 CIGAVIRGDTT(서열 8) 및 KAGNKGAETALTALEM(서열 9)를 주입함으로써 루마진 신타제 항체를 염소에서 생성시킨다. F1 식물의 웨스턴 분석은 루마진 신타제 농도가 상당히 감소되었음을 밝힌다[문헌참조: Towbin et al., PNAS USA 76:4350-4354].
실시예 8
이. 콜리내 재조합 식물 루마진 신타제의 발현 및 정제
이. 콜리내 재조합 식물 루마진 신타제를 생산하기 위해, PCR을 사용하여 pET-32a[문헌참조: Novagen, Inc., Madison, WI]내에 티오레독신 유전자 5'말단으로 아라비도프시스 루마진 신타제 cDNA(서열 1)가 해독적으로 융합된 융합물을 생성시킨다. 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 DG-252(서열 10), DG-253(서열 11) 및 DG-254(서열 12)를 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하여 길이가 693bp 및 483bp인 DNA 단편을 증폭시킨다. PCR 산물을 NcoI 및 EcoRI로 분해한다. 분해 산물을 낮은 겔화 온도 아가로스 겔상에서 분리하고 단편을 절단해낸다. 이와 병행하여 플라스미드 pET32a를 NcoI 및 EcoRI로 분해한다. 분해 산물을 겔상에서 분리하고 pET32a를 겔로부터 절단해낸다. 벡터 단편을 2개의 PCR 합성된 단편에 연결하고 연결 산물을 컴피턴트 이. 콜리 XL 1 블루 세포(Stratagene, La Jolla, CA)에 형질전환시킨다.
앰피실린-내성 콜로니를 선택하고 배양하고 이의 플라스미드 DNA를 추출한다. 플라스미드의 구조는 형광성 염료로 표지된 디데옥시 종결 인자를 사용하는 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 서열화하여 확인한다. 예상되는 구조를 갖는 재조합 플라스미드는 pET32aRSβFL-1 및 pET32aRSβNo CTP-1으로 명명한다.
컴피턴트 이, 콜리 BL21(DE3)세포를 플라스미드 pET32aRSβFL-1 및 pET32aRSβ No CTP-1로 형질전환시키고 재조합 단백질을 발현시키고 제조업자(pET System Manual, Novagen Inc., Madison, WI)의 지침에 따라 정제한다. 상기 균주에 의해 생산되는 수득한 융합 단백질은 약 132개의 아미노산으로 구성된 이. 콜리 티오레독신 단백질, His-Tag 및 트롬빈 절단 부위 및 여기에 이어지는 아라비도프시스 루마진 신타제에 대해 추측된 성숙한 암호화 서열(플라스미드 pET32aRSβFL-1에 대해 예상되는 단백질 암호화 서열의 코돈 1 및 플라스미드 pET32aRSβNo CTP-1에 대해예상되는 단백질 암호화 서열의 코돈 71에서 시작한다)을 포함한다.
실시예 9: 루마진 신타제 활성 검정
HPLC 및 형광 측정계를 조합하여 루마진 신타제 활성을 검출한다. 루마진 및 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘(DARP)는 하기 조건하에서 형광성이다. 여기 파장 407nm; 방출 파장 487nm. 그러나, 루마진은 동몰의 DARP의 농도보다 약 6배 높은 형광성이다. 또한 405nm에서 루마진과 DARP간의 흡광도 차이는 6배 차이가 난다. 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트는 형광성이 아니다. 루마진 및 DARP를 33%의 90mM 포름산, 60%의 물 및 7%의 메탄올을 사용하여 C18 칼럼상에서 분리할 수 있다. 루마진은 4분에서 먼저 용출하고 이어서 2분후에 DARP가 용출한다.
피크 면적은 직접적으로 생산된 루마진의 몰량을 나타낼 수 있다. 최적화 연구는 반응 완충액이 100mM KPO4, pH 7, 5mM β-머캅토에탄올, 2mM DTT인것이 바람직하다는 것을 보여준다. 효소는 pH 6.5 내지 7.5의 범위에서 활성이지만 pH 7이 가장 바람직하다. 역학적 연구는 부타논 포스페이트에 대한 Km이 190μM이고 DARP에 대한 Km이 5.5μM이라는 것을 보여준다. 문헌[참조: Kis et al., Biochem. 34:2883-2892(1995)]은 세균 효소에 대해 각각 Km값이 130 및 5라고 보고하였다. 반응물을 10분동안 37℃에서 항온처리하고 이어서 5% TCA를 첨가하여 종료한다. 침전된 단백질을 원심분리하여 제거하고 10㎕의 상등액을 HPLC에 주입한다. 반응은 비-효소적으로 진행할 수 있기 때문에 모든 샘플에서 이러한 기본(background)활성을 공제하여야 한다.
실시예 10: 고 효율 스크리닝
루마진 신타제의 신규 억제제에 대한 고 효율 스크리닝은 바람직하게 루마진 및 DARP가 루마진에 대한 최적 조건에서 상이한 강도로 형광성을 나타낸다는 사실 또는 이들 2개의 화합물간의 흡광도가 6배 차이가 있다는 사실을 이용한다. 형광성 검출을 사용한 고 효율 스크리닝을 위한 프로토콜의 예는 다음과 같다: 루마진 신타제, 완충액, 시험 물질 및 DARP를 190㎕의 용적으로 96-웰 미세역가 플레이트의 웰에서 혼합하고 최초 형광값을 결정한다(예를 들어, 워터스 형광 측정계 미세 역가 판독기를 사용). 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트 10㎕ 분취액을 첨가하여 반응을 개시한다. 적당한 항온처리 시간후 형광성을 다시 측정한다. 최초 및 최종 판독간의 차이는 대조구 반응의 퍼센트로서 판정한다. 완전한 반응 혼합물중에 기질의 최초 농도는 바람직하게 DARP에 대해 50μM이고 부타논 포스페이트에 대해서는 0.5mM이다. 루마진 신타제 양 및 항온처리 시간은 약 25μM의 농도로 루마진이 생산되도록 조정한다. 이것은 대략 기본 바탕보다 3 내지 4배 큰 형광 시그날을 생성한다.
실시예 11: 아라비도프시스로부터 기원하는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제를 암호화하는 cDNA의 분리
아라비드프시스 탈리아나 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스의 연구(Arabidopsis Biological Resource Center at Ohio State, Ohio State University, Columbus, OH)는 EST(EST # SCH1T7P, gb acc. #T12970)가 바실러스 서브틸리스로 부터 기원하는 GTP 사이클로하이드롤라제와 상동성이라는 것을 밝힌다. 주형으로서 아라비도프시스 cDNA 라이브러리의 플라스미드 DNA(문헌참조: Minet et al., (1992) Plant J. 2:417-422) 및 EST 서열로서 고안된 합성 올리고뉴클레오타이드 DG-67(서열 15) 및 DG-69(서열 16)를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 322-bp DNA 단편을 생성한다. 322-bp 단편을 TA 클로닝 벡터 pCR II(Invitrogen Corp., San Diego, CA)에 연결한다. 형광성 염료로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용하는 연쇄 종결 방법에 의한 서열 결정(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)은 322-bp 단편이 EST #SCH1T7P의 서열과 동일하다는 것을 확증한다.
람다 ZAP 아라비도프시스 cDNA 라이브러리의 약 150,000pfu를 10cm 평판 접시당 8,000 플라크의 밀도로 도말하고 37℃에서 7시간 성장시킨후 플라크를 여과한다. 프라임 타임 키트(International Biotechonlogies, Inc., Nwe Haven, CT)를 사용한 무작위 프라이밍 방법에 의해 32P-dCTP로 표지된 322-bp 단편으로 플라크 여과물을 탐침시킨다. 하이브리드화 조건은 65℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, NaPO40.5M, pH 7.0, EDTA 1mM, 소 알부민 1%이다. 밤새 하이브리드화시킨후에 여과물을 65℃에서 SDS 1%, 50mM NaPO4, 1mM EDTA로 세척한다. 10개의 양성 하이브리드화 플라크를 오토라디오그래프로 검출한다. 단일 플라크로 정제한후에 cDNA 삽입물을 분리하고 이의 서열을 형광성 염료로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용한 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 결정한다. GAP 프로그램(Deveraux, et al., (1084) Nucleic Acids Res. 12:387-95)을 사용하여 GTP-1로 명명된 가장 긴 클론의 데이터베이스 연구는 바실러스 서브틸리스의 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제 서열과 유사하다는 것을 밝힌다. 단백질은 70%가 유사하고 54%가 동일하다. 추가로, 아라비도프시스 성숙한 단백질과 바실러스 서브틸리스 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제의 비교는 엽록체 통과 단백질이 존재한다는 것을 제안한다.
pBluescript SK 벡터내 GTP-1은 부다페스트 조약하에 1995년 2월 7일에 미국 일리노이주 61604 피오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815에 소재하는 애그리컬쳐럴 리서치 컬쳐 콜렉션(NRRL)에 pDG-3a.t.로서 기탁되었고 NRRL 기탁번호 제B-21399호를 부여받았다.
GTP-1을 암호화하는 아라비도프시스 cDNA 서열은 서열 13에 제시되어 있고 암호화된 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 14에 제시되어 있다.
실시예 12: 아라비도프시스 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제 암호화 서열과의 서열 상동성을 기초로 추가의 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제 유전자의 분리.
파아지 또는 플라스미드 라이브러리를 10cm 평판 접시당 약 8,000pfu의 밀도로 도말하고 플라크를 37℃에서 7시간동안 성장시킨후 여과한다. 프라임 타임 키트(International Biotechonlogies, Inc., Nwe Haven, CT)를 사용한 무작위 프라이밍 방법에 의해 32P-dCTP로 표지된 서열 13의 cDNA로 플라크 여과물을 탐침시킨다. 하이브리드화 조건은 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, NaPO40.5M, pH 7.0, EDTA 1mM이다. 밤새 하이브리드화시킨후에 여과물을 50℃에서 2 X SSC, SDS 1%로 세척한다. 양성적으로 하이브리드화 플라크를 오토라디오그래프로 검출한다. 단일 플라크로 정제한후에 cDNA 삽입물을 분리하고 이의 서열을 형광성 염료로 표지된 디데옥시 터미네이터를 사용한 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 결정한다. 상기 실험 프로토콜을 사용하여 당해 기술분야의 기술자는 임의의 따른 식물 종으로 부터 기원하는 아라비도프시스 암호화 서열(서열 13)과 실질적으로 유사한 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제 유전자를 수득한다.
실시예 13: 이. 콜리내 재조합 식물 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제의 발현 및 정제
이. 콜리내 재조합 고등 식물 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제를 생산하기 위해, 2단계 PCR 방법을 사용하여pET-32a[문헌참조: Novagen, Inc., Madison, WI]내에 티오레독신 유전자[문헌참조: LaVallie et al., Biotechnology 11:187-193(1992)] 5'말단으로 아라비도프시스 루마진 신타제 cDNA(서열 1)가 해독적으로 융합된 융합물을 생성시킨다. 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 DG-392a(서열 17) 및 DG-393a(서열 18)를 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하여 길이가 939bp인 DNA 단편을 증폭시킨다. PCR 산물을 NcoI 및 EcoRI로 분해한다. 분해 산물을 낮은 겔화 온도 아가로스 겔상에서 분리하고 단편을 절단해낸다. 이와 병행하여 플라스미드 pET32a를 NcoI 및 EcoRI로 분해한다. 분해 산물을 겔상에서 분리하고 pET32a를 겔로부터 절단해낸다. 벡터 단편을 2개의 PCR 합성된 단편에 연결하고 연결 산물을 컴피턴트 이. 콜리 XL 1 블루 세포(Stratagene, La Jolla, CA)에 형질전환시킨다.
앰피실린-내성 콜로니를 선택하고 배양하고 이의 플라스미드 DNA를 추출한다. 플라스미드의 구조는 형광성 염료로 표지된 디데옥시 종결 인자를 사용하는 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 서열화하여 확인한다. 예상되는 구조를 갖는 재조합 플라스미드는 pET32aGTP-1으로 명명한다.
합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 DG-390a(서열 19) 및 DG-391a(서열 20)를 폴리머라제 연쇄 반응에 사용하여 길이가 662bp인 DNA 단편을 증폭시킨다. PCR 산물을 NcoI로 분해한다. 분해 산물을 낮은 겔화 온도 아가로스 겔상에서 분리하고 단편을 절단해낸다. 이와 병행하여 플라스미드 pET32aGTP-1을 NcoI로 분해한다. 분해 산물을 겔상에서 분리하고 pET32aGTP-1 벡터를 겔로부터 절단해낸다. 벡터 단편을 2개의 PCR 합성된 단편에 연결하고 연결 산물을 컴피턴트 이. 콜리 XL1 블루 세포(Stratagene, La Jolla, CA)에 형질전환시킨다.
앰피실린-내성 콜로니를 선택하고 배양하고 이의 플라스미드 DNA를 추출한다. 플라스미드의 구조는 형광성 염료로 표지된 디데옥시 종결 인자를 사용하는 연쇄 종결 방법(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 서열화하여 확인한다. 예상되는 구조를 갖는 재조합 플라스미드는 pET32aGTP-2로 명명한다.
컴피턴트 이. 콜리 BL21(DE3)세포를 플라스미드 pET32aGTP-2로 형질전환시키고 재조합 단백질을 발현시키고 제조업자(pET System Manual, Novagen Inc., Madison, WI)의 지침에 따라 정제한다. 상기 균주에 의해 생산되는 수득한 융합 단백질은 약 132개의 아미노산으로 구성된 이. 콜리 티오레독신 단백질, His-Tag 및 트롬빈 절단 부위 및 여기에 이어지는 아라비도프시스 GTP 사이클로하이드롤라제 II/3,4-디하이드록시-2-부타논-4-포스페이트 신타제에 대해 추측된 성숙한 암호화 서열을 포함한다.
실시예 14: DNA 셔플링에 의한 리보플라빈 생합성 유전자의 시험관내 재조합
리보플라빈 생합성 단백질(예를 들어, 각각 서열 2 또는 서열 14)을 암호화하는 식물 리보플라빈 생합성 유전자(예를 들어, 서열 1 또는 서열 13)을 PCR로 증폭시킨다. 수득한 DNA 단편을 문헌[Stemmer et al(1994)PNAS 91:10747-10751]에 기술된 바와 같이 DNaseI 처리로 분해하고 PCR 프라이머를 반응 혼합물로부터 제거한다. 문헌[Stemmer et al(1994)PNAS 91:10747-10751]에 기술된 바와 같이 프라이머 없이 PCR 반응을 수행하고 이어서 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 수행한다.수득한 DNA 단편을 pTRC99a(Pharmacia, Cat no:27-5007-01)로 클로닝시키고 바이오래드 유전자 펄서 및 제조업자의 조건을 사용하여 전기천공에 의해 디옥시게나제 돌연변이 숙주를 형질전환시킨다. 형질전환된 숙주를 상기 기술된 방법에 따라 선택된, 억제성 농도의 억제제를 함유하는 배지상에서 성장시키고 억제제의 존재하에 성장하는 콜로니를 선별한다. 정상적인 억제성 농도의 억제제의 존재하에 성장하는 콜로니를 취하고 반복되는 재스트리킹으로 정제한다. 이의 플라스미드를 정제하고 상기 시험을 통과한 플라스미드로부터 cDNA 삽입물의 DNA 서열을 결정한다.
유사한 반응에서, 리보플라빈 생합성 단백질을 암호화하는 본 발명의 식물 리보플라빈 생합성 유전자를 포함하는 PCR-증폭된 DNA 단편 및 상이한 숙주로부터 기원하는 리보플라빈 생합성 유전자를 포함하는 PCR-증폭된 DNA 단편을 생체내에서 재배합하고 억제제에 개선된 내성을 갖는 수득된 변종을 상기한 바와 같이 회수한다.
실시예 15: 엇갈리는 연장 방법에 의한 리보플라빈 생합성 유전자의 시험관내 재조합.
리보플라빈 생합성 단백질(예를 들어, 각각 서열 2 또는 서열 14)을 암호화하는 식물 리보플라빈 생합성 유전자(예를 들어, 서열 1 또는 서열 13) 및 상이한 숙주로부터 기원하는 상응하는 리보플라빈 생합성 유전자를 각각 pBluescript 벡터의 폴리링커에 클로닝시킨다. PCR 반응을 "역 프라이머" 및 M13 20 프라이머"(Stratagene Catalog)를 사용하여 문헌[참조: Zhao et al. (1998) NatureBiotechnology 16:258-261]에 기술된 바와 같이 수행한다. 증폭된 PCR 단편을 적당한 제한 효소로 분해하고 pTRC99a로 클로닝시키고 돌연변이된 리보플라빈 생합성 유전자를 실시예 14에 기술된 바와 같이 스크리닝한다.
본원에 기술된 다양한 변형된 방법은 당해 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 상기 변형된 방법은 첨부된 청구항의 범위내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (66)

  1. 루마진 신타제 활성 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
  2. 제1항에 있어서, 효소가 루마진 신타제 활성을 갖는 DNA 분자.
  3. 제2항에 있어서, 효소가 서열 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 DNA 분자.
  4. 제2항에 있어서, 효소가 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DNA 분자.
  5. 50℃에서 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 7%, 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA를 사용한 하이브리드화 및 50℃에서 2 X SSC, SDS 1%를 사용한 세척과 같은 조건하에서 제4항에 따른 DNA 분자와 하이브리드화하는, 루마진 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
  6. 제2항에 있어서, 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA을 사용한 하이브리드화 및 50℃에서 2 X SSC, 1% SDS를 사용한 세척과 같은 조건하에서 서열 1에 제시된 암호화 서열과 하이브리드화하는 DNA 분자.
  7. 제2항에 있어서, DNA 분자가 서열 1에 제시된 암호화 서열의 연속적인 20개 염기쌍 부분과 동일한 서열인 20개의 염기쌍 뉴클레오타이드 부분을 포함하는 DNA 분자.
  8. 제2항에 있어서, 서열 1에 제시된 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자.
  9. 제1항에 있어서, 효소가 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 DNA 분자.
  10. 제9항에 있어서, 효소가 서열 14에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 DNA 분자.
  11. 제9항에 있어서, 효소가 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 DNA 분자.
  12. 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA를 사용한 하이브리드화 및 50℃에서 2 X SSC, 1% SDS를 사용한 세척과 같은 조건하에서 제11항에 따른 DNA 분자와 하이브리드화하는, 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
  13. 제9항에 있어서, 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4, pH 7.0, 1mM EDTA를 사용한 하이브리드화 및 50℃에서 2 X SSC, 1% SDS를 사용한 세척과 같은 조건하에서 서열 13에 제시된 암호화 서열과 하이브리드화하는 DNA 분자.
  14. 제9항에 있어서, DNA 분자가 서열 13에 제시된 암호화 서열의 연속적인 20개 염기쌍 부분과 동일한 서열인 20개의 염기쌍 뉴클레오타이드 부분을 포함하는 DNA 분자.
  15. 제9항에 있어서, 서열 13에 제시된 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자.
  16. 제1항에 따른 DNA 분자와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자.
  17. 숙주 세포로 안정하게 형질전환될 수 있는, 제16항에 따른 키메릭 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  18. 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA 분자를 발현할 수 있는, 제17항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포 및 식물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 세균 세포인 숙주 세포.
  21. (a) 제2항에 따른 DNA 분자를 셔플링시키고;
    (b) 수득한 셔플링된 뉴클레오타이드 서열을 발현시키고;
    (c) 제2항에 따른 DNA 분자에 의해 암호화된 효소의 활성과 비교하여 변형된 루마진 신타제 활성에 대해 선별하는 것을 포함하는, 변형된 루마진 신타제 활성을 갖는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 1인 방법.
  23. 제22항의 방법에 의해 수득할 수 있는 셔플링된 DNA 분자.
  24. 제23항에 있어서, 루마진 신타제 활성의 억제제에 대해 증가된 내성을 갖는 효소를 암호화하는 셔플링된 DNA 분자.
  25. 제23항에 따른 셔플링된 DNA 분자와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자.
  26. 숙주 세포로 안정하게 형질전환될 수 있는, 제25항에 따른 키메릭 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  27. 제26항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제27항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포 및 식물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  30. 제29항에 따른 식물 세포를 포함하는 식물 또는 종자.
  31. 제30항에 있어서, 식물이 루마진 신타제 활성의 억제제에 대해 내성인 식물.
  32. (a) 제9항에 따른 DNA 분자를 셔플링시키고;
    (b) 수득한 셔플링된 뉴클레오타이드 서열을 발현시키고;
    (c) 제9항에 따른 DNA 분자에 의해 암호화된 효소의 활성과 비교하여 변형된 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성에 대해 선별하는 것을 포함하는, 변형된 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열 13인 방법.
  34. 제33항의 방법에 의해 수득할 수 있는 셔플링된 DNA 분자.
  35. 제34항에 있어서, 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성의 억제제에 대해 증가된 내성을 갖는 효소를 암호화하는 셔플링된 DNA 분자.
  36. 제34항에 따른 셔플링된 DNA 분자와 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자.
  37. 숙주 세포로 안정하게 형질전환될 수 있는, 제36항에 따른 키메릭 유전자를포함하는 재조합 벡터.
  38. 제37항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  39. 제38항에 있어서, 세균 세포, 효모 세포 및 식물 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 숙주 세포.
  40. 제39항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  41. 제40항에 따른 식물 세포를 포함하는 식물 또는 종자.
  42. 제41항에 있어서, 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성의 억제제에 대해 내성인 식물.
  43. 루마진 신타제 활성 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는, 리보플라빈 생합성에 관여하는 분리된 식물 효소.
  44. 제43항에 있어서, 루마진 신타제 활성을 갖는 효소.
  45. 제44항에 있어서, 서열 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 효소.
  46. 제44항에 있어서, 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 효소.
  47. 제43항에 있어서 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖는 효소.
  48. 제47항에 있어서, 서열 14에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 효소.
  49. 제47항에 있어서, 서열 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 효소.
  50. (a) 효소가 루마진의 합성을 촉매할 수 있는 조건하에서, 제1 반응 혼합물중에 제44항에 따른 효소와 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘 및 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트를 배합시키는 단계;
    (b) 제1 반응 혼합물과 동일한 조건하에서 제2 반응 혼합물중에 화학 물질과 효소를 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘 및 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트와 배합시키는 단계;
    (c) 제1 및 제2 반응 혼합물중에서 생성되는 루마진의 양을 측정하는 단계; 및
    (d) 제1 및 제2 반응 혼합물중에서 생성된 루마진의 양을 비교하는 단계(여기서, 제2 반응 혼합물중에서 생성된 루마진의 양이 제1 반응 혼합물중에서 생성된 루마진의 양보다 훨씬 적은 경우 화학 물질이 효소의 루마진 신타제 활성을 억제할 수 있다)를 포함하는, 루마진 신타제 활성을 억제하는 능력에 대해 화학물질을 스크리닝하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 제1 반응 혼합물이 50μM의 2,4-디옥시-5-아미노-6-리비틸아미노-피리미딘 및 0.5mM의 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트를 포함하는 방법.
  52. 제50항에 있어서, 반응 혼합물중에 생성되는 루마진의 양이 407nm의 여기 파장에서 형광 측정계를 사용하여 결정되는 방법.
  53. 제50항의 스크리닝 방법에 의해 동정된 화학 물질.
  54. 제53항에 따른 화학물질을 식물에 적용시켜 화학물질이 식물내 루마진 신타제의 활성을 억제시킴으로써 식물의 성장을 억제하는 방법.
  55. (a) 효소가 각각 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 합성을 촉매할 수 있는 조건하에서, 제1 반응 혼합물중에 제47항에 따른 효소와 GTP 또는 리불로스-5-포스페이트를 배합시키는 단계;
    (b) 제1 반응 혼합물과 동일한 조건하에서 제2 반응 혼합물중에 화학 물질과 효소를 GTP 또는 리불로스-5-포스페이트와 배합시키는 단계;
    (c) 제1 및 제2 반응 혼합물중에서 생성되는 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양을 측정하는 단계; 및
    (d) 제1 및 제2 반응 혼합물중에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노-피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양을 비교하는 단계(여기서, 제2 반응 혼합물중에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양이 제1 반응 혼합물중에서 생성된 2,5-디아미노-4-옥시-6-리보실아미노피리미딘-5'-포스페이트 또는 3,4-디하이드록시-2-부타논 포스페이트의 양보다 훨씬 적은 경우 화학 물질이 효소의 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제할 수 있다)를 포함하는, 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 능력에 대해 화학물질을 스크리닝하는 방법.
  56. 제55항의 스크리닝 방법에 의해 동정된 화학 물질.
  57. 제56항의 화학물질을 식물에 적용하여 화학물질이 식물내 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제의 활성을 억제함으로써 식물의 성장을 억제시키는 방법.
  58. 효소가 루마진 신타제 활성 또는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖고 DNA 분자가 정상적으로는 리보플라빈 생합성을 억제하는 양의 제초제에 대한 내성을 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직에 부여하는, 리보플라빈 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는, 식물로부터 분리된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  59. 제58항에 있어서, 효소가 루마진 신타제 활성을 갖고 DNA 분자가 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직에 대해 천연적으로 존재하는 루마진 신타제 활성을 억제하는 양의 제초제에 대한 내성을 부여하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  60. 제59항에 있어서, 효소가 서열 2에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  61. 제59항에 있어서, 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA를 사용한 하이브리드화 및 50℃에서 2 X SSC, 1% SDS를 사용한 세척과 같은 조건하에서 DNA 분자가 서열 1에 제시한 암호화 서열과 하이브리드화하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  62. 제58항에 있어서, 효소가 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 갖고 DNA 분자가 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직에 대해 천연적으로 존재하는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 양의 제초제에 대한 내성을 부여하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  63. 제62항에 있어서, 효소가 서열 14에 제시된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  64. 제62항에 있어서, 50℃에서 7% 나트륨 도데실 설페이트(SDS), 0.5M NaPO4pH 7.0, 1mM EDTA를 사용한 하이브리드화 및 50℃에서 2 X SSC, 1% SDS를 사용한 세척과 같은 조건하에서 DNA 분자가 서열 13에 제시한 암호화 서열과 하이브리드화하는 식물, 식물 세포, 식물 종자 또는 식물 조직.
  65. (a) 제59항에 따른 식물 또는 식물 종자인 제초제 내성 작물 또는 작물 종자를 심거나 파종시키는 단계; 및
    (b) 천연적으로 존재하는 루마진 신타제 활성을 억제하는 양의 제초제를 전답의 작물 또는 작물 종자 및 잡초에 적용시켜 제초제가 작물의 성장을 상당히 억제시키지 않으면서 잡초의 성장을 억제시키는 단계를 포함하는, 파종된 작물 종자 또는 식물의 작물을 포함하는 전답내 잡초의 성장을 선택적으로 억제시키는 방법.
  66. (a) 제39항에 따른 식물 또는 식물 종자인 제초제 내성 작물 또는 작물 종자를 심거나 파종시키는 단계; 및
    (b) 천연적으로 존재하는 이중 작용성 GTP 사이클로하이드롤라제 II/DHBP 신타제 활성을 억제하는 양의 제초제를 전답의 작물 또는 작물 종자 및 잡초에 적용시켜 제초제가 작물의 성장을 상당히 억제시키지 않으면서 잡초의 성장을 억제시키는 단계를 포함하는, 파종된 작물 종자 또는 식물의 작물을 포함하는 전답내 잡초의 성장을 선택적으로 억제시키는 방법.
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