CN110964769B - 一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，属于基因工程技术领域，所述方法通过对核黄素生产菌株进行遗传修饰，去除胞内高水平GTP对pyr operon的激活机制，将pyr operon的表达稳定在低水平，以减少嘧啶核苷酸从头合成途径的代谢通量，增大PRPP进入嘌呤核苷酸合成途径的比例，从而提高核黄素的产量和收率，降低核黄素发酵成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法。
背景技术
核黄素（riboflavin）是核醇与6，7-二甲基异咯嗪的缩合物，即维生素B2。核黄素在细胞内以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的形式存在，作为氧化还原酶的辅酶，在代谢反应中起氢载体的作用。人和动物都缺乏核黄素合成途径，属于核黄素异养型。核黄素是人和动物的必需生长因子，在某些情况下会出现核黄素缺乏症。因此，核黄素作为饲料添加剂、食品添加剂和药品被普遍使用。目前，全世界核黄素年产销量超过万吨，其中70 %用于畜牧养殖业，30 %用于食品和医药行业。
工业上普遍采用重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵生产核黄素。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，是公认的GRAS（Generally Recognized as Safe）菌株，适用于发酵生产食品和药品。野生型枯草芽孢杆菌具有从无到有的核黄素生物合成途径（图1），但是，由于存在严谨的代谢调控机制，而不能过量合成核黄素，也不能在发酵液中积累核黄素。采用基因工程技术，对野生型枯草芽孢杆菌进行遗传改造，可以使重组枯草芽孢杆菌过量合成并积累核黄素，并应用于工业发酵生产核黄素。主要遗传改造位点及生理效应包括：（1）ribC基因点突变，导致其编码的黄素激酶/FAD合成酶的黄素激酶活性大幅度降低，最大程度地降低核黄素转化为FMN的反应速率，使核黄素能够积累；（2）对嘌呤核苷酸合成操纵子（puroperon）进行遗传修饰，去除嘌呤核苷酸对其表达的反馈抑制机制，并提高其表达水平，使细胞能够过量合成次黄嘌呤核苷酸（IMP）；（3）缺陷腺苷酸琥珀酸合成酶基因（purA），阻断IMP转化为AMP的分支代谢，为GTP的合成提供足够的IMP，为核黄素合成提供充足的前体物；（4）修饰核黄素操纵子（rib operon），解除FMN对其表达的反馈抑制作用，同时提高其表达水平，使细胞的核黄素合成途径的代谢通量尽可能提高。上述遗传改造所形成的重组枯草芽孢杆菌，能够过量合成并在胞外积累核黄素，而被用于核黄素的工业发酵生产。
目前，重组枯草芽孢杆菌工业发酵菌种存在的最主要问题是：核黄素的实际收率远低于理论收率，收率指消耗一克葡萄糖能够得到的核黄素克数。理论收率应该接近0.40g，而不同来源生产菌株的实际收率在0.025-0.06 g之间。低收率导致核黄素发酵生产成本较高，提高收率是核黄素发酵生产技术中亟待解决的瓶颈问题。
磷酸核糖焦磷酸（PRPP）来自于分解葡萄糖的磷酸戊糖途径（PP途径），是嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸从头合成的共同前体物。嘧啶核苷酸合成操纵子（pyr operon）编码嘧啶核苷酸从头合成途径的所有酶，其表达由PyrR蛋白介导，既被三磷酸鸟苷（GTP）激活，也被嘧啶核苷酸阻遏。在过量合成核黄素的重组枯草芽孢杆菌中，由于遗传改造的结果，其GTP的合成能力超强，其胞内的GTP始终处于高水平，这有利于核黄素的合成。但是，胞内高水平的GTP也会失活PyrR蛋白，使pyr operon得以组成型表达。虽然，GTP与嘧啶核苷酸竞争与PyrR蛋白的结合，而控制pyr operon的表达水平。但是，核黄素产量越高的菌株，其胞内GTP水平越高。这样就需要合成足够的嘧啶核苷酸以平衡GTP，结果造成pyr operon的过表达，以及嘧啶核苷酸合成途径的代谢通量持续增大，从而消耗更多的前体物PRPP。因此，在核黄素生产菌株中，存在嘧啶核苷酸合成途径与嘌呤核苷酸合成途径竞争PRPP的状态。其生理意义在于使胞内的嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸基本处于平衡状态，但是对核黄素合成带来的不利影响，即相当数量的PRPP被用于嘧啶核苷酸的合成，而降低了核黄素的收率和产量，特别是降低了核黄素的收率。
发明内容
针对现有技术中核黄素收率和产量较低的问题，本发明的目的在于提供一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，所述方法通过对核黄素生产菌株进行遗传修饰，去除胞内高水平GTP对pyr operon的激活机制，将pyr operon的表达稳定在低水平，以减少嘧啶核苷酸从头合成途径的代谢通量，增大PRPP进入嘌呤核苷酸合成途径的比例，从而提高核黄素的产量和收率，降低核黄素发酵成本。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，所述方法是对核黄素生产菌株枯草芽孢杆菌进行遗传修饰，所述遗传修饰择一选择以下途径：
其一、失活嘧啶核苷酸合成操纵子，缺陷所有的嘧啶核苷酸合成酶，完全阻断嘧啶核苷酸合成途径；同时在发酵培养基中添加尿嘧啶，使细胞通过补救途径合成嘧啶核苷酸；
其二、对嘧啶核苷酸合成操纵子表达元件进行修饰，具体包括对其启动子区和前导区碱基序列的替换和删除；
其三、对嘧啶核苷酸合成操纵子中的pyrAA和pyrAB基因的起始密码子和核糖体结合序列进行弱化修饰；
其四、对嘧啶核苷酸合成操纵子中编码乳清酸磷酸核糖转移酶的pyrE基因的起始密码子和核糖体结合序列进行弱化修饰。
作为对上述方案的进一步优化，所述其一，在嘧啶核苷酸合成操纵子中插入“CR”片段，替换其从启动子-35区上游开始，包括全部pyrR基因编码序列和pyrP基因部分编码序列的总共962 bp的序列。更进一步地，具体操作包括以下步骤：
a、以枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别扩增pyr operon的启动子-35区上游同源序列、“CR”片段和pyrP基因编码区下游同源序列三个片段，通过一步重叠PCR方法，将三个片段进行拼接，得到拼接片段；
b、采用感受态转化方法，将所述拼接片段转化枯草芽孢杆菌，筛选重组菌，得到pyroperon缺陷菌株；
c、在发酵培养基中补加尿嘧啶，采用所述pyroperon缺陷菌株进行核黄素发酵。
作为对上述方案的进一步优化，所述其二，对pyr operon的启动子-35区序列进行弱化修饰。更进一步地，采用以下步骤进行操作：
a、以枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别扩增pyr operon启动子-35区的上游同源序列、红霉素抗性基因片段和启动子-35区的下游同源序列三个片段，将三个片段进行拼接，得到拼接片段；
b、采用感受态转化方法，将所述拼接片段转化枯草芽孢杆菌，从而将红霉素抗性基因整合到pyr operon启动子的-35区，并替换原-35区序列；筛选转化子，得到重组菌；
c、利用无标记基因敲除方法，将所述重组菌染色体上整合的红霉素抗性基因敲除，同时将修饰后的-35区序列补齐，修饰结果为pyr operon启动子-35区序列由TTGACA替换为ATGCGT，得到修饰菌株；
d、采用所述修饰菌株进行核黄素发酵。
作为对上述方案的进一步优化，所述其四，采用以下步骤进行操作：
a、以枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别扩增pyr operon中pyrE基因起始密码子上游同源序列、增pyrE基因起始密码子下游同源序列以及红霉素抗性基因片段，用一步重叠PCR方法，将三个片段进行拼接，得到拼接片段；
b、采用感受态转化方法，将所述拼接片段转化枯草芽孢杆菌RX22，筛选重组菌，得到重组菌；
c、利用无标记基因敲除方法，将所述重组菌的红霉素抗性基因敲除，并同时完成对pyrE基因编码序列的起始密码子从ATG到TTG的替换，得到修饰菌株；
d、采用所述修饰菌株进行核黄素发酵。
有益效果：
在核黄素生产菌株中，通过对pyroperon的遗传修饰，消除GTP对其表达的激活效应，同时降低嘧啶核苷酸合成关键酶的胞内水平，在核黄素发酵过程中，始终维持其嘧啶核苷酸从头合成途径的代谢通量处于低水平，而降低PRPP的无效消耗。结果使核黄素的产量提高25 %，核黄素收率提高到0.12 g，显著降低了核黄素发酵成本。
附图说明
图1是核黄素生物合成途径；
图2是采用实施例1发酵生产核黄素与出发菌相比的产量和收率结果图；
图3是采用实施例2发酵生产核黄素与出发菌相比的产量和收率结果图。
具体实施方式
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
（1）通过失活pyr operon，缺陷所有的嘧啶核苷酸合成酶，完全阻断嘧啶核苷酸合成途径。在发酵培养基中添加尿嘧啶，使细胞通过补救途径合成嘧啶核苷酸。由于补救途径合成嘧啶核苷酸的不受高水平的GTP激活，而达到减少PRPP在嘧啶核苷酸合成中的消耗量，进而提高核黄素产量和收率的目的。
（2）通过对pyr operon表达元件的修饰，具体包括对其启动子区和前导区碱基序列的替换和删除，弱化其表达强度。由于pyr operon表达元件功能受损，即使在高GTP水平下，也只能维持低水平表达，而达到降低嘧啶核苷酸从头合成途径代谢通量，减少PRPP消耗的目的。
（3）对pyr operon中的pyrAA和pyrAB基因的起始密码子和核糖体结合序列进行弱化修饰，通过降低其转译效率，而降低其胞内水平，达到限制嘧啶核苷酸从头合成途径代谢通量，减少PRPP消耗的目的。pyrAA和pyrAB基因分别编码氨甲酰磷酸合酶的谷氨酰胺酶亚基和催化亚基，是催化嘧啶核苷酸从头合成的第一步反应的关键酶，对整条途径的代谢反应速率具有控制作用。
（4）在pyr operon中，pyrE基因编码乳清酸磷酸核糖转移酶，催化乳清酸和PRPP生成乳清苷5'-磷酸，这是直接消耗PRPP的反应。对pyrE基因的起始密码子和核糖体结合序列进行弱化修饰，降低其转译效率，减少胞内乳清酸磷酸核糖转移酶的数量，降低反应速率，减少PRPP的消耗。
pyr operon的启动子、前导区和pyrR、pyrP基因原序列如SEQ ID：01所示。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
培养基：（1）每升LB培养基含有以下组分：胰蛋白胨10 g，酵母抽提物5 g，NaCl 10g，将pH调至7.5；固体培养基添加琼脂15 g。（2）每升GPUS培养基含有以下组分：葡萄糖 100g，酵母粉 25 g，蛋白胨4 g，MgSO4∙7H2O 0.5 g，尿素 20 g，初始pH调至7.2。
培养方法：用固体LB培养基活化菌种并分离单菌落；用LB培养基，37 ℃振荡培养10 h制备种子；用GPUS培养基进行核黄素发酵，接种量3%，39 ℃振荡发酵。
枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及感受转化，均采用通用的分子生物学操作方法。所有用于转化的DNA均为线性DNA，用量在1-2 μg之间。
普通PCR及重叠PCR扩增反应，均采用标准方法。引物的合成与DNA片段的测序委托专业公司完成。
基因无标记修饰方法：本发明所使用的枯草芽孢杆菌染色体上均带有反选择盒，即由阿拉伯糖操纵子的启动子表达的新霉素抗性基因，其表达受araR编码的调节蛋白阻遏。采用同源重组方式，在出发菌待修饰基因位点插入一段由内部同源重组片段（D）、氯霉素抗性基因片段（C）和araR基因片段组成的DNA片段，通过氯霉素抗性筛选转化子。然后通过培养中间菌，利用细胞在分裂过程中所发生染色体内基因重组，弹出“CR”片段，完成基因的无标记修饰，用新霉素抗性筛选转化子。
发酵液中核黄素的定量分析方法：（1）取100 μL发酵液加入EP管，然后加入900 μL的0.05 mol/L的 NaOH溶液，将发酵液稀释10倍并充分溶解核黄素；（2）13000 r/min离心1min，沉淀细胞；（3）取400 μL上清液加入3.60 mL的HAc-NaAc缓冲液，将发酵液的上清液稀释10倍并将其pH值调整至中性，制备成待测样品；（4）用分光光度计测定样品的OD444值，按照下列公式：核黄素(g/L) = (OD444-0.0057)/32.1×稀释倍数，计算核黄素浓度；用400 μL0.05 mol/L的 NaOH溶液和3.60 mL的HAc-NaAc缓冲液的混合溶液，作为空白对照。所测定的OD444值应控制在0.2~1.0范围内，可通过变化样品稀释倍数调节。
发酵液中葡萄糖的定量分析方法：取发酵液100 μL，加入900 μL无菌水，稀释10倍，根据需要可进一步进行同样的10倍稀释。稀释液13000 r/min离心1min，取上清液作为待测样品。吸取25 μL的待测样品，使用SBA-40D生物传感分析仪测定葡萄糖含量，测量值乘以稀释倍数，为发酵液的葡萄糖浓度（g/L）。
基因转录水平分析方法：（1）采用北京天根生物有限公司的RNA提取试剂盒，提取细胞的总RNA；（2）用RNase-Free ddH2O稀释所提取的总RNA，使其OD260nm值在0.2~0.6之间，其OD260nm/OD280nm值应在1.8~2.0之间，RNA浓度控制在8-24 ng/μL。在PCR管中依次加入：提取的RNA稀释液1-2 μL，引物1μL（10 μM），5×Transcriptor RT Reaction Buffer 4 μL，Protector RNase Inhibitor 0.5 μL，Deoxynucleotide Mix 2 μL（10 μM），TranscriptorReverse Transcriptase 0.5 μL，RNase-Free ddH2O补齐至20 μL。按照下列PCR反应程序：55℃，30min，1cycle； 85℃，5min，1cycle；4℃，forever，反转录扩增目标基因的cDNA；（3）荧光定量PCR。在1.5mL RNase-FreePCR中，依次加入下列试剂：RNase-Free ddH2O 6 μL，扩增的cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Conc 10 μL，构成20 μL的反应体系。将反应体系加入96孔板并封膜，赶尽气泡。4℃、1000rpm离心1min。用荧光定量PCR仪，按照下列反应程序：95℃，5min，1cycle； 95℃，10s；53℃，10s；72℃，15s，55cycles； 95℃，5s，1cycle； 65℃，1min，1cycle；97℃，5s，1cycle； 40℃，30s，1cycle，进行qRT-PCR反应，测定C t 值。根据2-△△Ct法计算待测基因的相对表达量。（其中，△△C t值为［（C t（target,test）-C t（ref,test））-（C t（target,calibrator）-C t（ref,calibrator））］；target表示目标基因；ref表示内参基因；test表示待测样本；calibrator表示参照样本）。
实施例1-阻断pyr operon的表达
本实例以核黄素生产菌枯草芽孢杆菌RX20为出发菌，在其pyroperon中插入“CR”片段，同时替换其从启动子-35区上游开始，包括全部pyrR基因编码序列，以及pyrP基因部分编码序列，总共962 bp的序列。得到pyroperon缺陷菌株RX21。
a、以枯草芽孢杆菌RX19m的染色体为模板，用引物PU1和PU2cr，PCR扩增pyroperon的启动子-35区上游同源序列，用PD1cr和PD2 扩增pyrP基因编码区下游同源序列，用引物CR1和CR2扩增“CR”片段，并通过一步重叠PCR方法，将上述三个片段拼接。
b、采用感受态转化方法，将上述拼接片段转化枯草芽孢杆菌RX20，用含6 μg/mL氯霉素的LB平板筛选重组菌，得到pyr operon缺陷菌株RX21。其中，pyr operon缺陷型序列如SEQ ID：02所示。
c、以出发菌株RX20为对照菌株，进行RX21菌株的核黄素发酵，在GPUS发酵培养基中补加100 mg/L的尿嘧啶。结果如图2所示。
结果显示：pyroperon的表达阻断导致RX21菌株的核黄素产量提高25%，同时收率提高到0.12 g，增产效果和增加收率效果均非常显著。但是，RX21菌株的最大生物量为9.7×108个/mL，比出发菌的1.19×109个/mL显著降低。pyrR基因编码pyroperon表达调节蛋白，同时还有带有次要的磷酸核糖转移酶活性。pyrP基因编码尿嘧啶运输蛋白之一，负责尿嘧啶的吸收和分泌。这两个基因的功能都与补救途径合成嘧啶核苷酸有关，它们在RX21菌株中都随着pyroperon表达的被阻断而缺陷。补救途径受损是RX21菌株在补充100 mg/L尿嘧啶的GPUS培养基中发酵，生物量显著下降的原因。即使嘧啶核苷酸合成的补救途径受损，对生物量有一些不利影响，但不影响核黄素产量和收率的提高。
实施例2-弱化pyr operon的表达
本实例选则对pyr operon的启动子-35区序列进行弱化修饰，但本发明的技术方案并不限于以下方案，任何降低pyr operon表达水平，而导致嘧啶核苷酸从头合成途径的代谢通量显著降低，而不受GTP激活的技术方法，均在本发明的保护之内。
a、以枯草芽孢杆菌RX19E的染色体为模板，用引物PyrU1和PyrU2E，PCR扩增pyroperon启动子-35区的上游同源序列，用PyrD1E和PyrD2cr 扩增启动子-35区的下游同源序列，用引物E1和E2扩增红霉素抗性基因片段，用一步重叠PCR方法，将上述三个片段拼接。
b、采用感受态转化方法，将上述拼接片段转化枯草芽孢杆菌RX20，将红霉素抗性基因整合到pyr operon启动子的-35区，并替换原-35区序列。用含3 μg/mL红霉素的LB平板筛选转化子，得到重组菌RX22E。
c、利用无标记基因敲除方法，将RX22E染色体上整合的红霉素抗性基因敲除，同时将修饰后的-35区序列补齐。修饰结果为pyr operon启动子-35区序列由TTGACA替换为ATGCGT，得到菌株RX22。其中，pyr operon启动子弱化修饰后的序列如SEQ ID：03所示。
d、以RX20为对照菌，进行菌株RX22的核黄素发酵，用qRT-PCR方法测定pyr operon的相对转录水平，核黄素产量和收率，结果如下表1所示。转录分析显示，对pyr operon启动子-35区序列的替换，使其相对表达水平降低至原来的0.20倍。
表1 pyr operon的转录分析
注：每个时间点的数据是三个平行实验的平均值。
pyr operon表达的弱化，使RX22菌株的核黄素产量和收率同时提高，核黄素产量比对照菌RX20提高了23 %，核黄素收率提高到0.097 g，结果如图3所示。可见，弱化pyroperon的表达，而不利用补救途径，同样能够达到降低嘧啶核苷酸合成途径代谢通量，减少PRPP无效消耗，而提高核黄素产量和收率的效果。
实施例3-弱化pyrE基因的起始密码子
本实例将采用进一步弱化pyrE基因起始密码子的方法，降低乳清酸磷酸核糖转移酶转译效率，进一步降低反应速率的技术方案。但本发明的技术方案并不限于以下方案，而包括任何降低乳清酸磷酸核糖转移酶胞内水平和酶活性的方法。“ATG”替换为成为“TTG”，降低其翻译效率，减少胞内乳清酸酯磷酸核糖基转移酶的量，从而减少嘧啶核苷酸合成中PRPP的消耗量，为嘌呤核苷酸合成途径提供了更多的PRPP。或者降低关键酶的转译效率，
a、以枯草芽孢杆菌RX19E的染色体为模板，用引物PyrEU1和PyrEU2E，PCR扩增pyroperon中pyrE基因起始密码子上游同源序列，用PyrED1E和PyrED2cr 扩增pyrE基因起始密码子下游同源序列，用引物E1和E2扩增红霉素抗性基因片段，用一步重叠PCR方法，将上述三个片段拼接，得到拼接片段。
b、采用感受态转化方法，将上述拼接片段转化枯草芽孢杆菌RX22，用含3 μg/mL红霉素的LB平板筛选重组菌，得到重组菌RX23E。
c、利用无标记基因敲除方法，将RX23E的红霉素抗性基因敲除，并同时完成对pyrE基因编码序列的起始密码子从“ATG”到“TTG”的替换，得到菌株RX23。其中，经替换修饰后的pyrE基因编码序列如SEQ ID：04所示。
d、用GPUS培养基进行菌株RX23的核黄素发酵，结果显示，核黄素产量相对RX22无明显变化，核黄素收率提高到0.12 g。在弱化pyr operon表达水平的基础上，进一步弱化pyrE基因的起始密码子，对提高核黄素的收率有进一步的显著的作用。
以上实施例中所述引物的序列如下表2所示。
表2：引物序列表
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南巨龙生物工程股份有限公司
<120> 一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法
<130> 1
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2352
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 1
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gtgcttgacg cgaaatggtt tgcagtgcct gaatttatca ttccgttcaa agattatcac 1740
cgtcagttac gctcggcatc gcagccgcaa tggttcctgt cgcatttgtc acaatgtcag 1800
agcatatcgg ccaccaatgg tgctgagagc aaggttgtcg gacaagactt cataaaagca 1860
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atttcagcgc tgatcagttc agtgccgtca gcggtcatgg gaggcgtctc cttcctgctg 2100
ttcggaatca ttgcttcaag cggcctgaga atgctgattg acaacaaaat tgattatgaa 2160
aacaacagaa acctcattat tacatcagtt atccttgtca tcggtgtagg aggcgctttt 2220
atccaagtgt ctcagggcgg attccaagtg tcaggaatgg cgcttgccgc aattgtcggt 2280
gtcatcttaa acctgattct tccgcaggcg aaggaagagc aggcagacac atctgaacaa 2340
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<210> 2
<211> 1390
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 2
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tccacgaaca ggagaatatg tcgaatttga agcgccgctt cccgaggata tggcagaatt 120
aatcgaaaac ctcagaaaaa acggttcatt cagccttcag catttgtttg ccatgtttgg 180
ctcaaccatt ttggttccga agctcgtcgg aatgagtcct gctgtggcgt tggtgacaag 240
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gaacgcgagt gagttggtct acagcttaaa gcactttagt gtcgcaggag ttacgctggc 600
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ccctccgaca acgacttacg gagaaaacat tggcgtgctg gccatcacaa gagtattcag 1020
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 人工合成
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tgggtgcttt agttgaagaa tgtaatcgtt ggttcttcc 39
Claims (4)
1.一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，其特征在于：所述方法是对核黄素生产菌株枯草芽孢杆菌进行遗传修饰，所述遗传修饰择一选择以下途径：
其一、失活嘧啶核苷酸合成操纵子，缺陷所有的嘧啶核苷酸合成酶，完全阻断嘧啶核苷酸合成途径；同时在发酵培养基中添加尿嘧啶，使细胞通过补救途径合成嘧啶核苷酸；
所述其一，在出发枯草芽孢杆菌的嘧啶核苷酸合成操纵子中插入“CR”片段，替换其从启动子-35区上游开始，包括全部pyrR基因编码序列和pyrP基因部分编码序列的总共962bp的序列，得到pyroperon缺陷菌株；所述pyr operon缺陷型序列如SEQ ID：02所示；
所述“CR”片段是以带“CR”片段的枯草芽孢杆菌染色体为模板，以引物CR1和CR2扩增所得；所述CR1的序列如SEQ ID：07所示，所述CR2的序列如SEQ ID：08所示；其二、对嘧啶核苷酸合成操纵子表达元件进行修饰，具体包括对其启动子区和前导区碱基序列的替换和删除；
所述其二，对出发枯草芽孢杆菌的pyr operon的启动子-35区序列进行弱化修饰；所述pyr operon启动子弱化修饰后的序列如SEQ ID：03所示；
其三、在其二的基础上，对嘧啶核苷酸合成操纵子中编码乳清酸磷酸核糖转移酶的pyrE基因的起始密码子进行弱化修饰；经修饰后的pyrE基因编码序列如SEQ ID：04所示；
以上途径中，所用出发枯草芽孢杆菌染色体上均带有反选择盒，即由阿拉伯糖操纵子的启动子表达的新霉素抗性基因，其表达受araR编码的调节蛋白阻遏。
2.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，其特征在于：所述其一，具体操作包括以下步骤：
以带“CR”片段的枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别扩增pyr operon的启动子-35区上游同源序列、“CR”片段和pyrP基因编码区下游同源序列三个片段，通过一步重叠PCR方法，将三个片段进行拼接，得到拼接片段；
采用感受态转化方法，将所述拼接片段转化出发枯草芽孢杆菌，筛选重组菌，得到pyroperon缺陷菌株；
在发酵培养基中补加尿嘧啶，采用所述pyroperon缺陷菌株进行核黄素发酵。
3.根据权利要求1所述的一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，其特征在于：所述其二，采用以下步骤进行操作：
a、以带红霉素抗性基因的枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别扩增pyr operon启动子-35区的上游同源序列、红霉素抗性基因片段和启动子-35区的下游同源序列三个片段，将三个片段进行拼接，得到拼接片段；
b、采用感受态转化方法，将所述拼接片段转化出发枯草芽孢杆菌，从而将红霉素抗性基因整合到pyr operon启动子的-35区，并替换原-35区序列；筛选转化子，得到重组菌Ⅰ；
c、利用无标记基因敲除方法，将所述重组菌Ⅰ染色体上整合的红霉素抗性基因敲除，同时将修饰后的-35区序列补齐，修饰结果为pyr operon启动子-35区序列由TTGACA替换为ATGCGT，得到修饰菌株Ⅰ；
d、采用所述修饰菌株Ⅰ进行核黄素发酵。
4.根据权利要求3所述的一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法，其特征在于：所述其三，采用以下步骤进行操作：
a、以带红霉素抗性基因的枯草芽孢杆菌的染色体为模板，分别扩增pyr operon中pyrE基因起始密码子上游同源序列、pyrE基因起始密码子下游同源序列以及红霉素抗性基因片段，用一步重叠PCR方法，将三个片段进行拼接，得到拼接片段；
b、采用感受态转化方法，将所述拼接片段转化所述修饰菌株Ⅰ，筛选重组菌，得到重组菌Ⅱ；
c、利用无标记基因敲除方法，将所述重组菌Ⅱ的红霉素抗性基因敲除，并同时完成对pyrE基因编码序列的起始密码子从ATG到TTG的替换，得到修饰菌株Ⅱ；
d、采用所述修饰菌株Ⅱ进行核黄素发酵。
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