CN103224964A - 同时生产l-氨基酸及核黄素的微生物及使用其生产l-氨基酸及核黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时生产高浓度的L-氨基酸及核黄素的方法，及同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物，具体地，在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，从而提供一种修饰的、能够同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的变异型微生物；利用所述微生物同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的方法；及由所述变异型微生物培养液制备的包含L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的制剂或颗粒制剂、饲料及饲料添加剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种同时生产高浓度的L-氨基酸及核黄素的方法及同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物。
背景技术
玉米、高粱、大麦、小麦等谷类饲料作为饲料中利用最多的原料，一般情况下，其提供氨基酸需求量的30～60%。因此，为了满足剩余的需求量，并维持氨基酸之间的均衡，需要进一步供给氨基酸。此外，在所有的饲料中含有一定程度的维生素，不论哪一种维生素，如果不供给充分的量，就会产生缺乏症状。因此，维生素与氨基酸一样，需要进一步供给，才能够维持适当的含量。在饲料成分中，氨基酸是最贵的供应源，因此可以认为，有效地供应氨基酸是影响整体生产效率的因素之一。特别是，在所述氨基酸中，L-赖氨酸及L-苏氨酸对家畜的生长成为第一限制性必需氨基酸的情况很多。利用微生物的发酵法生产所述L-赖氨酸及L-苏氨酸，由所述发酵法生产的L-赖氨酸及L-苏氨酸在精制及浓缩后，添加到饲料中。用于发酵L-赖氨酸的微生物，其中以棒状杆菌属微生物（Corynebacterium sp.）或埃希氏杆菌（Escherichia.coli）为代表，有很多关于对所述微生物进行基因操作，从而生产L-赖氨酸的报道（韩国授权专利第10-0930203号、第10-0924065号、美国专利第7,871,801号）。
目前，正在使用遗传工程学的方法，对微生物进行改良，为提高L-赖氨酸或L-苏氨酸的产量而不断努力，但随着工业的发展，需要更多量的L-赖氨酸或L-苏氨酸，因此，正在继续努力开发能够更有效、经济地生产L-赖氨酸或L-苏氨酸的方法。
虽然维生素的需求量很小，但维生素是用于维持家畜正常代谢功 能、生长、繁殖功能，以及维持健康所必需提供的有机化合物。在所述维生素中，核黄素（B2）是一种水溶性维生素，在各种微生物和所有植物中能够生物合成核黄素，但在包括人类的脊椎动物的体内，具有无法生物合成的特性，因此需要从外部供给。如果猪缺乏所述核黄素的情况下，则会诱发性欲缺失和母猪的繁殖障碍（繁殖生物学（1981）25：659-665，动物科学杂志（1984）59：1567-1572(Biol.Reprod.（1981）25：659-665，J.Anim.Sci.（1984）59：1567-1572）），鸡的情况下，会引起神经方面的问题，特别是会引起坐骨及上臂神经的问题，还会对胚胎（embryo）的发育产生不良影响，导致胚胎死亡（韩国饲养标准，家禽，2002，农林部）。因此，所述核黄素一直以来被用作家畜生长的饲料添加剂，特别是浓缩状态的核黄素本身一直作为饲料使用。
目前全球核黄素的产量规模为每年6000吨，其中，75%左右作为饲料添加剂使用，其余部分用于食品及医药用品领域。作为生产核黄素的方法，一直在联合使用化学合成法和利用微生物的发酵法。化学合成法，其大体上是利用D-核糖等前体物质，经过多步骤工艺来生产高纯度核黄素的方法。所述化学合成法的起始物质价格昂贵，因此存在生产费用高的缺点，由此，开发了利用微生物的发酵法。利用微生物的发酵法，是从自然界分离出生产核黄素的微生物或使用遗传工程学方法或化学-物理方法诱导出变异的微生物，以使其过量生产核黄素，然后将上述微生物在适宜的条件下培养后，从发酵液中分离核黄素的方法。由于发酵法具备成本竞争力，且对环境友好，因此最近成为了主要研究对象，通过所述发酵法生产的核黄素经过精制及浓缩后，将其添加到饲料中。
作为代表，公开有利用作为酵母的无名假丝酵母（Candida famata）生产核黄素的方法（美国专利第5,231,007号），在核黄素的工业化生产中，作为子囊菌的阿氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii） 和棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii；国际专利公开第9526406号）是使用最多的菌株。作为细菌，报道有枯草杆菌（Bacillus subtilis），还有很多将所述细菌进行基因操作，生产核黄素的例子（欧洲专利第0821063号、美国专利第5,837,528号、美国专利第5,334,510号）。本发明人也曾利用上述细菌生产过核黄素（韩国授权专利第10-0542573号）。此外，还报道有通过操作，使关于核黄素生物合成的酶基因过量表达，从而生产出4.5g/L的核黄素的例子（工业微生物学及生物技术杂志（1999），22：8-8（J.Ind.Microbiol.Biotechnol.）1999），22：8-8））。
在动物饲料中，各成分的需求量按照以下标准供应。L-赖氨酸约为1～5g/kg、L-苏氨酸约为0.6～3.3g/kg、核黄素约为2～4mg/kg，其是L-赖氨酸的约0.1%（美国全国科学研究委员会.1998.美国国家科学院-国家研究委员会，华盛顿哥伦比亚特区（NRC.1998.National Academy of Sciences-National Research Council，Washington，D.C.））。但是，所述L-赖氨酸及核黄素分别用发酵法单独生产，在添加到饲料之前经过精制及浓缩过程，再分别运送到配合饲料工厂，因此会制定很高的饲料成本。如果，同时生产L-赖氨酸及核黄素的微生物中，核黄素的浓度达到L-赖氨酸浓度的约0.1%左右，则可以通过添加所述微生物的培养液来满足饲料添加剂的基准需求量，但至今尚无对这种设想的报告。
棒状杆菌属微生物的情况下，核黄素由磷酸戊糖途径（pentose-phosphate path way，PPP）产物之一的核酮糖5-磷酸（ribulose5-phosphate，Ru5P）和嘌呤途径（purime metabolism）产物之一的三磷酸鸟苷（Guanosine triphosphate，GTP），通过两种途径进行生物合成，由三磷酸鸟苷酸环化水解酶II（GTP cyclohydrolase II，RibA）基因、嘧啶脱氨基酶-还原酶（pyrimidine deaminase-reductase，RibG）基因、核黄素合酶α亚基（Riboflavin synthase subunit alpha， RibC）基因及核黄素合酶β亚基（riboflavin synthase subunit beta，RibH）基因组成的基因簇（以下称为“核黄素生物合成基因簇”）参与其中。所述核黄素生物合成基因簇与涉及磷酸戊糖途径的5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶（ribulose-5-phosphate-3-epimerase，Rpe，NCgl1536）一起形成操纵子（rib操纵子），所述Rpe及所述RibA都以Ru5P作为底物使用，处于竞争关系中（图1）。即，Rpe通过Ru5P生物合成5-磷酸木酮糖（D-Xylose-5-phosphate），对戊糖磷酸化过程中所生成的代谢产物重新导入糖酵解过程的中间反应起到介导作用，RibA生物合成作为核黄素生物合成中间阶段物质的3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸酯（KEGG，京都基因与基因组百科全书，[//www.genome.jp/kegg]）。
在棒状杆菌中，磷酸戊糖途径作为赖氨酸生物合成的主要还原力（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）的供给源，在现有文献中，有很多关于通过这样形成的NADPH的再生与L-赖氨酸生物合成之间的直接联系的报道（Wittmann和Heinzle，微生物学68：5843-5849，2002；Marx等人.，生物技术杂志104：185-197，2003；Ohnishi等人.，微生物学杂志242：265-274，2005（Wittmann and Heinzle，Microbiol68：5843-5849，2002；Marx et al.，J Biotechnol104：185-197，2003；Ohnishi et al.，Microbiol Lett242：265-274，2005））。
所述磷酸戊糖途径，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶（6-phosphogluconolactonase）、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD）、5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶（Rpe）、核糖-5-磷酸异构酶（ribose-5-phosphate isomerase，RpiA）、转酮醇酶（transketolase）及转醛醇酶（transaldolase）依次对反应进行催化，通过该过程生成的最终代谢产物被重新导入到糖酵解过程。
作为用于强化这样的磷酸戊糖途径的研究结果，公开有以下内 容。在欧洲专利EP01941065号（2001.06）和EP02781875号（2002.12）中，公开了所述酶中具有直接生产NADPH的酶的阴性反馈抑制耐性的突变，与此同时，公开了关于使转酮醇酶（transketolase）及转醛醇酶（transaldolase）过表达的、关于棒状杆菌赖氨酸生产菌株的发明（欧洲授权专利EP1109915、EP1179076、EP1179084）。此外，还公开有以下发明。使Rpe或RpiA分别过表达的棒状杆菌中，增加L-赖氨酸生产能力效果的发明（德国公开专利DE10037611、DE10037612）。
由此可知，棒状杆菌中，随着L-赖氨酸生产能力增加，对磷酸戊糖途径的依存度会变高，但作为本发明的核心要素的核黄素生物合成途径衍生自磷酸戊糖途径，因此为了核黄素生物合成，强化向糖途径的碳流的情况下，会导致通过磷酸戊糖途径需要进行糖酵解过程的碳源流出，最终会导致供给的单位碳源的L-赖氨酸生产收率下降。即，在磷酸戊糖途径上，需要充分碳流的L-赖氨酸生产菌株中，可以说核黄素生物合成途径与磷酸戊糖途径处于竞争关系，进而，向糖途径流入的碳流增加的情况下，会对L-赖氨酸生产能力带来不利影响。
自然界中可能存在同时生产L-赖氨酸及核黄素的微生物，但L-赖氨酸及核黄素的生产收率处于竞争关系，因此，尚没有在大量生产L-赖氨酸的工业用微生物中，试图使核黄素的产量也同时达到工业化水平的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题
在这样的背景下，发明人为了开发出同时生产L-赖氨酸及核黄素的微生物，经过深入研究，通过人工突变开发出了一种突变菌株。其是以具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌作为对象，为了增加磷酸戊糖途径上的碳流，通过人工突变赋予了高浓度葡糖酸适应性，从而使L-赖氨酸产量维持在与亲株相似水平，同时核黄素的产量与亲株相比 得到了增加。发明人确认了在L-赖氨酸生产棒状杆菌中，核黄素生物合成基因簇启动子被具有强表达诱导活性的异种启动子替换的情况下，也能够以高浓度同时生产L-赖氨酸及核黄素，此外，还确认了具有L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌中也显示出了相同的效果，从而完成了本发明。
技术方案
本发明的目的在于，提供一种同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的方法，其包括下述步骤：在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素。
本发明的另一目的在于，提供一种变异型谷氨酸棒状杆菌微生物，其是通过对具有高浓度L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌随机诱导突变，从而使所述L-赖氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，其保藏编号为KCCM11223P。
本发明的再一目的在于，提供一种变异型棒状杆菌属微生物，其为修饰的、能够同时生产L-氨基酸，及核黄素的微生物，其是在具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，以使得所述L-氨基酸维持高浓度产量，同时使核黄素的产量增加。
本发明的又一目的在于，提供一种含有L-氨基酸及核黄素的制剂或颗粒制剂，上述L-氨基酸及核黄素的制备包括：培养上述微生物，进行颗粒化的步骤。
本发明的又一目的在于，提供一种含有L-氨基酸及核黄素的制剂或含有上述颗粒制剂的饲料添加剂。上述L-氨基酸及核黄素的制备包括：培养上述微生物的步骤
有益效果
至今为止，工业上正在大量生产L-赖氨酸、L-苏氨酸等L-氨基酸及核黄素，将其用作动物所必需的饲料，根据本发明的同时生产L-氨基酸及核黄素的方法，可开发出一种能够同时高浓度地生产所述L-赖氨酸、L-苏氨酸等L-氨基酸及核黄素的微生物，从而可期待饲料在工业上的生产便利性及节约制造成本，可作为高效生产L-氨基酸及维生素饲料添加剂的菌株使用。
附图说明
图1是表示在糖酵解过程及核黄素生物合成途径中竞争地使用核酮糖5-磷酸的图。
图2是表示在rib操纵子的上端或内部插入强启动子，对rib操纵子编码的酶群或核黄素生物合成酶群进行活性强化的图。
图3是表示用于插入SEQ ID NO：5的启动子而制备的pDZ-Pmrb载体的图。
图4是表示用于插入SEQ ID NO：6的启动子而制备的pDZ-lysCP1-ribG载体的图。
具体实施方式
下面，对本发明的术语进行说明。
本发明的术语“rib操纵子”是指包括：作为核黄素生物合成基因簇的由编码嘧啶脱氨酶-还原酶（pyrimidine deaminase-reductase，RibG，NCgl1535）的ribG基因、编码核黄素合酶α亚基（Riboflavin synthase subunit alpha，RibC，NCgl1534）的ribC基因、编码GTP环化水解酶II（GTP cyclohydrolase II，RibA）的ribA基因，以及编码核黄素合酶β亚基（riboflavin synthase subunit beta，RibH，NCgl1532）的ribH基因组成的基因簇（以下称为“核黄素生物合成基因簇”）；以及编码涉及磷酸戊糖途径的5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶的rpe基因的操纵子（图2）。对于所述操纵子的各基因的信息，可以从公开的数据库（NCBI的GenBank等）中获得。
本发明的术语“L-氨基酸”，可以选自L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-色氨酸及L-蛋氨酸，优选为L-赖氨酸或L-苏氨酸。
为达到上述目的，本发明的一个具体方式提供一种同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，以及核黄素的方法，其包括下述步骤：在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，以及核黄素。
在本发明的具体实施例中，所述修饰的微生物，其L-赖氨酸或L-苏氨酸的产量维持在与亲株相同的水平，并且核黄素的产量增加了70～80倍左右，特别是确认了赖氨酸和核黄素的产量比例约为1：0.005，或L-苏氨酸和核黄素的比例约为1：0.03（表1至6）。由此，确认了利用本发明的微生物同时生产的L-氨基酸和核黄素适合添加到饲料中。
所述修饰的微生物，其作为修饰的、能够同时生产L-氨基酸及核黄素的微生物，其是在具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，以使得所述L-氨基酸的维持高浓度产量，同时使核黄素的产量增加。优选地，也可以是修饰的、能够同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸、及核黄素的变异型棒状杆菌属微生物，其是在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，同时使核黄素产量增加。
本发明的所述棒状杆菌属微生物可以包括具有L-氨基酸生产能力的所有棒状杆菌属菌株，例如，可以使用谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）（ATCC13032）、产氨棒杆菌 （Corynebacterium ammoniagenes）、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes）（FERM BP-1539）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）（ATCC14067）或乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）（ATCC13869）等，但并不限定于此。更优选地，可以使用谷氨酸棒状杆菌，作为所述谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum），例如可以使用KFCC10881（韩国授权专利第0159812号）、KFCC11074（韩国授权专利第0292299号）、KFCC11001（韩国授权专利第0253424号）及KCCM11222P，但并不限定于此。在本发明的具体实施例中，以KFCC10881作为亲株，制备了一种修饰的变异型微生物。所述微生物能够高浓度地维持L-赖氨酸或L-苏氨酸的产量，同时使核黄素的产量增加。特别地，修饰的变异型微生物以KCCM11222P作为亲株制得，以高浓度地维持所述L-算上的产量，同时使核黄素的产量增加。
具有所述L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其可以是增加了L-赖氨酸生产效率的微生物。用于改善L-赖氨酸生产效率的方法，例如可以使用扩增L-赖氨酸生物合成途径上的基因或对基因启动子进行修饰，从而提高酶活性的方法。作为涉及L-赖氨酸生物合成的酶，例如有天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸激酶、天门冬氨酸盐半醛脱氢酶、丙酮酸羧化酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氨基庚二酸脱羧酶等。作为涉及来自棒状细菌的启动子的现有专利，例如公开有二氢吡啶二羧酸还原酶的启动子得到改良的专利（国际专利WO09/096690），天冬氨酸激酶及天门冬氨酸盐半醛脱氢酶的启动子得到改良的专利（韩国授权专利第0930203号）。此外，在韩国授权专利第0924065号中还记载了以下方法。分别进一步导入1拷贝（copy）以上的所提到的与生物合成相关的基因，分别对所述基因的启动子导入外来的强启动子，从而改进L-赖氨酸的生产能力。
具有所述L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物，其可以是增加 了L-苏氨酸生产效率的微生物。为了改善L-苏氨酸生产能力，本领域技术人员可以使用不仅可以获得营养缺陷型突变株、抗类似物突变株或代谢调节突变株，还可以使用制备L-苏氨酸生物合成酶的活性增强的重组菌株的方法等本领域技术人员通常使用的方法。例如，对突变株或重组菌株进行修饰，使L-苏氨酸生物合成酶不受反馈限制，或增强重组菌株对L-苏氨酸生物合成酶基因的表达。在用这些方法进行L-苏氨酸生产细菌的改良中，可以单独或组合地赋予营养需求性、类似物抗性及代谢调节突变等性质。如果L-苏氨酸生物合成酶的活性增强，则一个以上的它们的酶的活性就会得到增强。作为编码L-苏氨酸生物合成酶的基因，例如有天冬氨酸激酶III基因（lysC）、天门冬氨酸盐半醛脱氢酶基因（asd）、包含在thr操纵子中的天冬氨酸激酶I基因（thrA）、高丝氨酸激酶基因（thrB）及苏氨酸合成酶基因（thrC），通过对编码上述酶的基因导入突变或通过基因扩增，增加细胞内酶活性来达到增强效果。这些可以利用基因重组技术得以实现。此外，通过使涉及苏氨酸分解的L-苏氨酸脱氢酶活性缺失，从而可以增加L-苏氨酸的生产。除了上述方法之外，还可以通过对L-苏氨酸生产具有不良影响的糖酵解途径进行阻碍，使涉及TCA周期或参与呼吸连锁过程的酶、调控基因表达的酶或副产物的生物合成系统中的酶减少或缺失，从而增加L-苏氨酸的生产。作为改善L-苏氨酸的生产效率的方法，例如，可以采用进行修饰以增强基因表达的方法，所述基因为编码生物合成途径上的酶的基因。作为参与L-苏氨酸的生物合成的酶，例如有高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶及苏氨酸合成酶，以及苏氨酸排放酶等。作为赋予L-苏氨酸生产能力或使其生产能力增强的其他方法，例如有导入变异，以解除高丝氨酸脱氢酶对苏氨酸的反馈调节的方法（美国专利第6,649,379号）等。在本发明的具体实施例中实现了对KFCC10881赋予作为L-苏氨酸类似物的AHV（2-amino-3-hydroxy-valerate）耐寒性的突变，使用了保藏编号 为KCCM11222P的变异型微生物KFCC10881-THR。
优选地，本发明的变异型棒状杆菌属微生物可以是在具有高浓度L-氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对rib操纵子表达的酶进行活性强化，从而被修饰为能够高浓度地维持所述L-氨基酸的产量，使核黄素产量增加，同时高浓度地生产L-氨基酸及核黄素的变异型棒状杆菌属微生物，或者可以是在rib操纵子中，对核黄素生物合成基因簇表达的酶进行活性强化的微生物。
上述强化活性的方法可以选自以下方法中的一种以上，但并不限定于此。所述方法例如有：增加对所述“操纵子或酶群”（以下称为酶群）进行编码的细胞内基因簇拷贝数，向编码所述酶群的染色体上基因簇调控序列导入变异；将编码所述酶群的染色体上基因簇调控序列替换为活性强的序列；将染色体上编码所述酶群的基因替换为突变的基因，以增加所述酶群的活性；及向编码所述酶群的染色体上基因簇中导入变异，以强化所述酶群的活性。可以通过本领域公知的多种方法实施。优选地，可以是将编码rib操纵子表达的酶群的染色体上基因调控序列替换为活性强的启动子；在编码位于核黄素生物合成基因簇最前方的RibG（嘧啶脱氨酶-还原酶，pyrimidine deaminase-reductase）的基因的染色体上游上，插入强启动子的方法；或增加对rib操纵子表达的酶群或核黄素生物合成基因簇表达的酶群进行编码的基因簇在细胞内的拷贝数。
所述细胞内拷贝数的增加包括：向细胞的染色体内可操作地连接编码所述酶的基因，从而稳定地表达上述酶的情况；或使含有编码所述酶的基因的载体能够可操作地转化到细胞内，从而稳定地表达上述酶的情况。所述载体是指可操作地连接到适合的调控序列上，并且含有基因碱基序列的DNA构建物，以能够在合适的宿主细胞内表达靶基因。对染色体DNA内部的rib操纵子表达的酶进行编码的基因拷贝数得到增加，本领域技术人员由上述的基因拷贝数得到增加的效 果，可以预测：rib操纵子表达是在染色体外部，通过载体使拷贝数得到增加，或可以预测：在染色体的内部和外部，对rib操纵子表达的酶进行编码的基因表达调控部位变化，或通过基因本身变异，使表达量增加时，也能够获得同样的效果。使用载体的情况下，通过使用导入了碱基序列的重组载体转化具有L-氨基酸生产能力的棒状杆菌属微生物，从而可以制备rib操纵子表达的酶的活性被强化的微生物。本发明对使用的载体没有特别地限定，可以使用常规的表达载体。优选pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118载体等。本发明的具体实施例中使用了pECCG117。
此外，在原核生物中，所述调控序列包括可以启动转录的启动子、用于调控所述转录的任意的操纵基因（operator）、编码适当的mRNA核糖体结合部位的RBS（核糖体结合位点，ribosome binding site）、及对转录和转译的终止进行调控的序列。
代替位于编码上述酶的基因上游的原始启动子，可以连接具有由固有的启动子产生的碱基取代变异的改良型启动子或异种启动子，作为所述异种启动子，例如有pcj7启动子、lysCP1启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA启动子、aceB启动子等，优选为来自棒状杆菌的启动子的pcj7启动子或lysCP1启动子，最优选为lysCP1启动子。
本发明的“lysCP1启动子”是通过取代基因启动子部位的碱基序列，从而进行改良的启动子，上述基因对天冬氨酸激酶及天门冬氨酸盐半醛脱氢酶进行编码。其是通过增大天冬氨酸激酶基因的表达量，可以将糖酵解活性提高到野生型的约5倍左右的强启动子（WO2009/096689）。所述lysCP1启动子可以由lysCP1启动子序列及包括lysC-asd基因的一部分的SEQ ID NO：17的第1至353的核苷酸序列（SEQ ID NO：6）构成。具体地，本发明的载体被制备成将含有所述SEQ ID NO：5的碱基取代变异的改良型启动子或所述SEQ ID NO： 6的表达诱导活性强的lysC基因的改良型启动子lysCP1导入到宿主细胞的染色体内。作为使靶基因过表达的方法，有将固有启动子序列的一部分碱基取代为其它碱基，从而提高表达量的启动子改良方法，以及用表达量多的其它基因的启动子取代的方法等（第WO2009/096689号）。
本发明的术语“转化”是指，将基因导入到作为宿主细胞的棒状杆菌属菌株内，使得能够在所述宿主细胞内表达的所有动作。此时，启动子和基因包括DNA及RNA作为多核苷酸。所述基因只要能够导入到宿主细胞内并进行表达，可以以任何形态导入。例如，所述基因，自身可以作为包括所述基因的表达所需要的所有要素（element）的多核苷酸结构体的表达盒（expression cassette）的形态导入到宿主细胞内。所述表达盒通常包括可操作地连接到所述基因上的启动子、转录结束信号、RBS及翻译结束信号。所述表达盒的形态可以是能够自我复制的表达载体。此外，所述基因可以通过其自身或多核苷酸结构体的形态导入到宿主细胞内，从而与宿主细胞表达所需要的序列可操作地连接。
本发明转化载体的方法，包括将核酸导入到细胞内的任何方法，根据宿主细胞的不同，可以采用本领域公知方法，选择合适的标准技术来实施。例如，可以使用电穿孔法（electroporation）、磷酸钙沉淀法、氯化钙沉淀法、显微注射法、聚乙二醇（PEG）法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法及醋酸锂-DMSO法等。
优选使用DNA的导入效率高，导入的DNA表达效率高的宿主作为宿主细胞，如上所述，可以使用棒状杆菌属微生物，优选谷氨酸棒状杆菌，具体可以使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。具有L-苏氨酸生产能力的微生物，只要是能够生产L-苏氨酸的微生物，对使用无限制。但优选使用KFCC10881-THR，其保藏编号为KCCM11222P。
具体地，可以将编码rib操纵子表达的酶群的染色体上的上游启 动子，替换为SEQ ID NO：5的启动子或将ribG基因的上游启动子替换为SEQ ID NO：6的启动子。在本发明的具体实施例中，将KFCC10881菌株替换为SEQ ID NO：5的启动子的结果，确认了在L-赖氨酸的平均浓度上虽无变化，但核黄素的平均浓度增加了约61倍（表2），将ribG基因的上游启动子替换为SEQ ID NO：6的启动子的结果，核黄素增加了73倍（表3），还确认了通过rib操纵子拷贝数的增加，核黄素增加了66倍（表4）。此外，将作为L-苏氨酸生产菌株的KFCC10881-THR，替换为SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6的启动子的结果，在L-苏氨酸的平均浓度上虽无变化，但核黄素的浓度分别增加了56倍和66倍（表6）。
此外，具体地，在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，通过在编码位于rib操纵子最前端的Rpe基因的上游插入强启动子，或在编码位于核黄素生物合成基因簇的最前端的RibG的基因的上游插入强启动子，从而对rib操纵子编码的酶群或核黄素生物合成酶群进行活性强化（图2），从而可以使其修饰为能够同时高浓度地生产核黄素与L-赖氨酸或L-苏氨酸。在本发明的具体实施例中，确认了位于保藏编号为KCCM11223P菌株的rib操纵子的最上游的rpe的第-10至第-16碱基序列存在变异。由此，对所述保藏菌株的rib操纵子的启动子预想区间（SEQ ID NO：5）进行克隆后，将其导入到L-赖氨酸生产能力亲株的染色体内的结果，确认了能够维持所述L-赖氨酸的产量的同时，核黄素的产量与KCCM11223P菌株以相似的水平增加（表2）。由此，通过强化所述rib操纵子，推测核黄素的生产率得到增加，在位于所述rib操纵子内核黄素生物合成基因簇的最上游的ribG的上游导入强启动子的结果，确认了与亲株相比核黄素的产量增加了大约73倍（表3）。此外，增加rib操纵子的拷贝数的情况下，也确认了与使用所述强启动子的情况类似的、核黄素产量增加的效果（表4）。同时，在L-苏氨酸生产能力亲株上， 将rpe上游的启动子用本发明的SEQ ID NO：5的启动子替换的结果，以及在ribG上游导入强启动子的情况下，确认了L-苏氨酸的产量也能够类似地维持，且核黄素的产量增加了大约60至70倍（表6）。由此，确认了本发明的变异型棒状杆菌属微生物，通过能够维持高浓度的L-氨基酸的产量，并增加核黄素的产量，可以同时高浓度地生产L-氨基酸和核黄素。
优选地，同时生产所述L-赖氨酸及核黄素的变异型棒状杆菌属微生物，其可以是通过对具有高浓度的L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌随机诱导突变，从而被修饰为使所述L-赖氨酸维持高浓度产量，使核黄素产量增加的保藏编号为KCCM11223P的谷氨酸棒状杆菌。此外，也可以是在具有所述L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，从而被修饰为使所述L-赖氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加的保藏编号为KCCM11220P、KCCM11221P或KCCM11223P的谷氨酸棒状杆菌。
本发明人为了增加L-赖氨酸生产菌株的磷酸戊糖途径上的碳流，在实施随机人工突变过程中，发现了带有深黄色菌体色泽的菌落，并确认了所述突变的菌落的所述L-赖氨酸的产量维持在相似的水平，同时核黄素的生产率增加了大约60倍（表1）。本发明人判断，所述突变株的这些特征，可以应用于需要以一定比例供给氨基酸和核黄素的饲料添加剂的生产中。由此，本发明人将所述突变菌株命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）CA01-2183，KFCC10881-YC，在2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），保藏编号为KCCM11223P。所述突变株也可以简单地统称为KFCC10881-YC。同时，本发明人将在亲株KFCC10881的rib操纵子启动子上导入了Pmrb启动子的突变菌株命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum） CA01-2162，KFCC10881：：Pmrb，在2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），保藏编号为KCCM11221P。所述突变菌株也可以简单地统称为KFCC10881：：Pmrb。此外，将在亲株KFCC10881的ribG基因的起始密码子上端，导入了lysCP1的菌株命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）CA01-2161，KFCC10881：：lysCP1_ribG。所述突变菌株也可以简单地统称为KFCC10881：：lysCP1_ribG，在2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），其保藏编号为KCCM11220P。
用本发明的方法同时生产的培养液内，L-氨基酸及核黄素的比例为1：0.0001～0.1，所述L-氨基酸为L-赖氨酸的情况下，更优选为1：0.001～0.05，最优选为1：0.003～0.01。此外，所述L-氨基酸为L-苏氨酸的情况下，L-苏氨酸及核黄素的比例更优选为1：0.001～0.1，最优选为1：0.005～0.05。
所述棒状杆菌属微生物的培养，可以在适当的培养基中，使用本领域技术人员公知的多种培养方法实施（Chmiel，Bipprozesstechnik1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik,Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991；Storhas，Bioreaktoren und periphere Einrichtungen，Vieweg Verlag，布伦瑞克/威斯巴登，1994）。所述培养方法的具体例包括：分批式、连续式及流加培养。在所述流加培养中，虽然包括注入分批及反复注入分批培养，但不限定于此。
此外，可以用于培养的培养基根据培养方式和菌株，可以适当选择本领域技术人员公知的培养基（"普通细菌学方法手册"美国细菌学协会，华盛顿，美国，1981（"Manual of Methods for General Bacteriology"by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,US,1981））。本发明中所使用的培养基包含多种碳源、氮源及微量元素成分。在用于培养棒状杆菌微生物的培养基中，可以使用蔗 糖、葡萄糖、果糖、脂肪、脂肪酸、醇、有机酸等作为碳源。可以作为碳源使用的具体例包括：糖蜜、葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素等的碳水化合物；大豆油、葵花籽油、蓖麻子油、椰子油等脂肪；棕榈酸、硬脂酸、亚油酸等脂肪酸；甘油及乙醇等醇；乙酸等有机酸，并且可以以多种方式使用适当量的碳源。可以使用蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浸渍液及大豆粉水解物等有机氮源及尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵及硝酸铵等无机氮源。这些氮源可以单独或组合使用。在所述培养基中还可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾及对应的钠盐作为磷酸供给源。此外，还可以包括硫酸镁或硫酸铁等的金属盐。此外，还可以包括氨基酸、维生素及合适的前体物等。可以将这些培养基或前体物以分批式或连续式加入到培养物中。
在培养过程中，将氢氧化铵、氢氧化钙、氨、磷酸及硫酸等化合物以合适的方式添加到培养液中，从而可以调节培养物pH。此外，在培养过程中，可以使用脂肪酸聚乙二醇酯等消泡剂来抑制气泡生成。此外，为了维持培养物的有氧状态，向培养物内注入氧气或含氧气体（例如，空气）。培养物的温度通常为20℃至45℃，优选25℃至40℃。培养时间可以持续到得到所希望的L-氨基酸的生成量为止，优选10至160小时。
此外，本发明的方法，还可以包括将含有L-氨基酸及核黄素的培养发酵液进行颗粒化的步骤。所述发酵液可以包含菌体沉淀物，或是去除了所述菌体沉淀物的发酵液。为了去除菌体沉淀物，还可以包括从含有所述L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的培养发酵液中去除菌体沉淀物的步骤。
所述发酵液中含有菌体沉淀物的情况下，不需要实施用于去除菌体沉淀物的过滤作业，不另外添加防潮剂，也可以生产出吸湿性低，流动性好，外观密度高，并可以调节氨基酸含量的颗粒制剂。所述颗 粒化方法可以应用韩国授权专利第0838200号上记载的方法或韩国授权专利第0338578号记载的方法等。具体地，可以通过下列步骤生产，但不限定于此，生产包括以下步骤：浓缩所述发酵液；在所述浓缩液中添加赋形剂，形成混合浓缩液；向造粒机投入200～500μm大小的微粒种子；及施加热风，从造粒机的下部向所述混合浓缩液喷射，包覆所述微粒种子，从而形成颗粒。
此外，不含有菌体沉淀物的情况下，具体地通过下列步骤生产，但不限定于此，生产包括以下步骤：将发酵液进行过滤，从而去除菌体沉淀物；浓缩所述过滤液；将所述浓缩液进行干燥，形成颗粒；及用赋形剂或防潮剂等包覆剂对所述颗粒进行包覆。
从发酵液中分离所述菌体沉淀物，可以通过以下方法分离而被去除：将L-氨基酸及核黄素进行离心分离、过滤、离子交换色谱分析法及结晶化等方法等。具体地，将发酵液进行低速离心分离，去除菌体沉淀物，还可以通过离子交换色谱分析法分离上清液，但不限定于此。
本发明的另一个实施方式提供一种变异型谷氨酸棒状杆菌微生物，其为修饰的微生物，其是通过对具有高浓度L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌随机诱导突变，从而使所述L-赖氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，上述微生物的保藏编号为KCCM11223P。
关于微生物如上所述。
本发明的另一实施方式可以提供一种修饰的、能够同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的微生物，其是在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，同时使核黄素的产量增加。
微生物、酶群的活性强化、变异型棒状杆菌属微生物如上所述。
本发明的另一实施方式提供一种颗粒制剂，其通过以下步骤制 得：
a）在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，以及核黄素；及
b）将含有所述步骤a）的L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的发酵液进行颗粒化。
优选地，所述L-氨基酸为L-赖氨酸或L-苏氨酸，修饰的微生物如上所述。
所述颗粒制剂的制备还可以包括从含有所述步骤a）中生产的L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的发酵培养液中，去除菌体沉淀物的步骤。即，如上所述，本发明的颗粒制剂可以包含或不包含菌体沉淀物。
优选地，如上所述，所述颗粒制剂的L-赖氨酸或L-苏氨酸：核黄素的比例可以是1：0.0001～0.01。
本发明的颗粒制剂表示用于克服现有粉末状态中存在的产生灰尘及产品损失等缺点的颗粒化形态的制剂。
本发明的另一实施方式提供一种含有L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的制剂，其通过以下步骤制得：a）在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素；及b）从含有所述步骤a）中生产的L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的发酵液中，去除菌体沉淀物。如上所述，优选地，上述制剂的L-赖氨酸或L-苏氨酸：核黄素的比例可以是1：0.0001～0.01。
本发明的另一实施方式提供一种包含上述颗粒制剂，或者包含上述含有L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素制剂的饲料或饲料添加剂。
在本发明的具体实施例中，用本发明方法生产的高浓度的L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素，特别是赖氨酸和核黄素的比例大约由1：0.005组成，L-苏氨酸和核黄素的比例大约由1：0.03组成（参照表1至6）。在动物饲料中，L-赖氨酸的需求量约为1～5g/kg，L-苏氨酸约为0.6～3.3g/kg，核黄素约为2～4mg/kg，其是L-赖氨酸的约0.1%（美国全国科学研究委员会，1998，美国国家科学院-国家研究委员会，华盛顿哥伦比亚特区（NRC.1998.National Academy of Sciences-National Research Council，Washington，D.C.））。目前为止，还没有关于因投入过量而产生毒性的报道。由此，确认了使用本发明方法同时生产的L-氨基酸和核黄素适合添加到饲料中。
优选地，所述L-氨基酸可以是L-赖氨酸或L-苏氨酸。
优选地，如上所述，所述饲料或饲料添加剂的L-赖氨酸或L-苏氨酸：核黄素的比例可以是1：0.0001～0.01。
本发明的饲料，可以将所述L-氨基酸及核黄素分别制备成饲料添加剂形态，混合到饲料中，也可以在制备饲料时直接添加。本发明饲料内的L-氨基酸及核黄素可以是液体状或干燥状态，优选干燥的粉末状态。可以采用通风干燥、自然干燥、喷雾干燥及冷冻干燥的干燥方法，但不限定于此。所述家畜用饲料，除了本发明的L-氨基酸及核黄素以外，还可以进一步添加可以提高饲料保存性的一般的添加剂。
在本发明的饲料添加剂中还可以进一步添加其它非病原性的微生物。作为可以添加的微生物，选自能够生产蛋白质分解酶、脂质分解酶及糖转换酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等枯草菌；在牛胃一样的厌氧条件下，具有生理活性及有机物分解能力的乳杆菌（Lactobacillus sp.）；表现出增加家畜的体重，增加产奶量，提高饲料的消化吸收率的米曲霉（Aspergillus oryzae）等丝状菌（奶制品与动物科学行业杂志43：910-926，1976（J Animal Sci43：910-926,1976）） 及酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等酵母（奶制品与动物科学行业杂志56：735-739，1983（J Anim Sci56：735-739，1983））。
本发明的含有L-氨基酸及核黄素的饲料，其可以是谷物类、根果类、食品加工副产物类、藻类、纤维质类、制药副产物类、油脂类、淀粉类、瓜类、谷物副产物类等植物性饲料，还可以是蛋白质类、无机物类、油脂类、矿物类、油脂类、单细胞蛋白质、浮游动物类、食物残渣等，但不限定于此。
本发明的含有L-氨基酸及核黄素的饲料添加剂有：用于防止品质降低而添加的粘合剂、乳化剂、防腐剂等，用于增大效用而添加到饲料中的氨基酸制剂、维生素制剂、酶制剂、益生菌剂、食用香料、非蛋白氮化合物、硅酸盐制剂、缓冲剂、着色剂、提取剂、低聚糖等，此外还可以进一步含有饲料混合剂等，但不限定于此。
下面，通过实施例将本发明更加具体地说明。但是，这些实施例只是为了举例说明本发明，本发明的范围并非限定在这些实施例中。
实施例1：利用人工诱变法的葡糖酸抗性株的筛选
在本实施例中，在谷氨酸棒状杆菌中，为了增加作为生产L-氨基酸时必要的NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）的主要供给途径的磷酸戊糖途径上的碳流，实施了对高浓度葡糖酸赋予适应性的实验。
将KFCC10881（韩国授权专利第0159812号）作为亲株，通过N-甲基-N-硝基-N-硝基胍（NTG）进行人工诱变后，在含有20g/L的浓度葡糖酸的下述复合平板培养基中进行培养，以比非处理对照区快的速度分离了形成菌落的菌株。NTG非处理对照区的情况下，培养了第60小时形成的菌落的平均直径为0.5mm，与此相比，在NTG处理区中仅培养了约40小时就形成了直径达到1mm大小的菌落。其中特异地发现与对照区不同的带有深黄色的菌落，推测是产生了新性状的突变，将该菌株命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）CA01-2183，KFCC10881-YC，欲查明显色的原因。所述突变菌株也可以简单地统称为KFCC10881-YC，将该菌株2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），保藏编号为KCCM11223P。
<复合平板培养基（pH7.0）>
20g葡糖酸、50g（NH4）2SO4、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、5g KH2PO4、10g K2HPO4、0.5g MgSO4.7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺素、2000μg钙-泛酸、2000μg烟酰胺、20g琼脂（以蒸馏水1L计）
实施例2：KFCC10881-YC的赖氨酸生产能力分析及显色原因查明
为了查明所述实施例1中制备的KFCC10881-YC菌株的特性，使用以下方法进行培养，比较了赖氨酸的生产能力，并分析了培养液成分。
在含有25mL种子培养基的250mL的三角瓶中接种各菌株，在30℃下，以200rpm振荡培养20小时。此后，在含有24mL的生产培养基的250mL三角瓶中，接种1mL的种子培养液，在30℃下以200rpm振荡培养72小时。所述种子培养基和生产培养基的组成分别如下。
<种子培养基（pH7.0）>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5g MgSO4.7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺、2000μg钙-泛酸、2000μg烟酰胺（以1L蒸馏水计）
<生产培养基（pH7.0）>
100g葡萄糖、40g（NH4）2SO4、2.5g大豆蛋白质、5g玉米浸渍固形物（Corn Steep Solids）、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4.7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺、2000μg钙-泛酸、3000μg烟酰胺、30g CaCO3（以1L蒸馏水计）
结束培养后，KFCC10881-YC的菌体色泽依然维持深黄色，确认了与培养上清液或对照区KFCC10881的培养液不同，呈深黄色。对此，本发明人判断这种显色原因物质包含在培养液中，为了进行查明，对影响微生物显色的类胡萝卜素类及核黄素的浓度进行了分析。其结果为，培养液中核黄素的浓度与对照区显示出了明显的差异，对于类胡萝卜素类并没有发现特别的差异。利用高效液相色谱法（HPLC）分析的L-赖氨酸及核黄素的浓度如表1所示。
表1 KFCC10881-YC的L-赖氨酸及核黄素生产浓度
其结果，如表1中的结果所示，可确认，与生产L-赖氨酸的菌株KFCC10881相比，KFCC10881-YC的情况下，L-赖氨酸的平均浓度虽然相同，但核黄素的浓度惊人地增加了57倍。菌落的颜色作为与亲株进行区分的明显特征，可知带有深黄色是因为核黄素的浓度增加所引起的。
实施例3：高浓度核黄素生产株的rib操纵子上游启动子的变异确认及所述变异型启动子（Pmrb）的染色体导入用载体制作
为了查明诱发所述实施例1中制备的KFCC10881-YC的色泽变化及核黄素生产能力增加的根本的基因水平上的碱基序列突变，确定与谷氨酸棒状杆菌属KFCC10881-YC的核黄素生物合成相关的染色体部位的碱基序列，根据美国国家健康研究院的基因序列银行（NIH GenBank）进行了确认。
其结果，确认了位于rib操纵子最上游的rpe基因的起始密码子的前第10与第16的碱基序列分别由G向A，由G向T进行了取代，将在rib操纵子启动子的预想区间上具有所述2个碱基取代变异的启动子命名为Pmrb（SEQ ID NO：5）。
为了确认碱基序列被取代的Pmrb启动子的表达诱导活性及随着酶活性增加的核黄素浓度的增加效果，制作了能够将其导入到染色体上的载体。
根据所报告的碱基序列，对5'末端上插入了EcoRⅠ限制酶部位的引物与在3'末端上插入了SalⅠ限制酶部位的引物（SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8）进行了合成，通过将KFCC10881-YC的染色体作为雏形的PCR，对包含rib操纵子启动子预想区间350bp的约650bp的Pm-rpe基因片段进行了扩增。PCR条件如下，在94℃下进行5分钟改性后，在94℃下改性30秒，在56℃下进行30秒退火处理，在72℃下重复进行30次40秒聚合后，在72℃下进行了7分钟聚合反应。使用的引物如下。
SEQ ID NO：7：5'-tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctc-3'
SEQ ID NO：8：5'-tttgtcgacattccgctaaaacacgt-3'
使用限制酶EcoRⅠ和SalⅠ处理PCR扩增的基因片段，分别得到DNA碎片后，将其连接到具有限制酶EcoRⅠ及SalⅠ末端的染色体导入用pDZ载体（韩国专利第2009-0094433号）上，然后转化到大肠菌DH5α上，然后涂抹到含有卡那霉素（25mg/L）的LB固体培养基上。对菌落进行筛选，所述菌落为：通过PCR，插入了目标基因的载体所转化的菌落。然后，使用公知的质粒提取法，得到质粒，将该质粒命名为pDZ-Pmrb（图3）。
实施例4：在高浓度赖氨酸生产株的染色体内rib操纵子上游导入Pmrb的菌株制备，以及赖氨酸及与核黄素生产能力的比较
将所述实施例3中制备的载体pDZ-Pmrb，通过同源染色体的重组，转化到作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881上。然后，通过菌落颜色变化，选择性地分离染色体上导入了rib操纵子启动子变异的菌株，按照实施例2的方法培养，对回收的L-赖氨酸及核黄素的浓度进行了分析（表2）。将导入了所述rib操纵子启动子 变异的菌株，命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）CA01-2162，KFCC10881：：Pmrb。所述突变菌株也可简单地统称为KFCC10881：：Pmrb，2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），其保藏编号为KCCM11221P。
表2根据导入启动子变异的L-赖氨酸及核黄素产量变化
如表2中的结果所示，其结果为，确认了与具有野生型rep基因固有启动子的对照区KFCC10881（实验组3）相比，插入了具有2个碱基取代变异的启动子Pmrb的KFCC10881：：Pmrb的情况下（实验组4），L-赖氨酸的平均浓度虽无变化，但核黄素的平均浓度惊人地增加了约61倍。
实施例5：用于向rib操纵子内ribG上游导入强启动子（LysCP1）的载体制备
为了只是过表达rpe基因以外的核黄素生物合成基因，将来自棒状杆菌的强启动子连接到位于rib生物合成基因簇的最前侧的ribG基因（SEQ IN NO：4）的起始密码子上端上，从而制备了用于诱导核黄素生物合成基因簇表达量增加的重组载体。
为了确保来自谷氨酸棒状杆菌ribG的基因片段，将谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的染色体DNA作为雏形，设计合成了一种引物（SEQ IN NO:9及SEQ IN NO:10），以使其在5'末端上具有EcoRⅠ限制酶部位，在3'末端上具有XbaⅠ限制酶部位。使用合成的引物，通过PCR得到了包含ribG基因的起始密码子上游300bp的DNA片段。此外，设计合成了一种引物（序列号SEQ IN NO:及SEQ IN NO:12），以使其在5'末端上具有XbaⅠ和NdeI限制酶部位，在3'末端上具有SalⅠ限制酶部位，通过PCR确保了包含ribG基因的起始密码子的300bp DNA片段。PCR条件如下，在94℃下进行5分钟改性后，在94℃下改性30秒，在56℃下进行30秒退伙处理，在72℃下重复进行30次30秒的聚合后，在72℃下进行了7分钟聚合反应。将所述2个PCR扩增产物分别用EcoRⅠ和XbaⅠ，XbaⅠ和SalⅠ处理后，将pDZ载体与使用限制酶SalⅠ和EcoRⅠ处理而获得的DNA碎片连接，从而制备了pDZ-ribG载体。用于PCR的引物序列如下。
SEQ ID NO：9：5'-tttgaattcgtgtgcgtgcaggtttctcc-3'
SEQ ID NO：10：5'-tttctagattactgcgcgagtgctc-3'
SEQ ID NO：11：5'-ttttctagataacatatggatgttgcgcacgcg-3'
SEQ ID NO：12：5'-tttgtcgacattggcgtaaaacacgt-3'
可以扩增来自谷氨酸棒状杆菌的lysCP1启动子（SEQ ID NO：6），还设计合成了一种引物（SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14），以使其在5'末端上具有插入了XbaⅠ限制酶部位，在3'末端上具有NdeⅠ限制酶部位，通过将谷氨酸棒状杆菌菌株的染色体DNA作为雏形的PCR，扩增了约400bp的启动子部位。PCR条件如下：在94℃下进行5分钟改性后，在94℃下改性30秒，在58℃下进行30秒退火处理，在72℃下重复进行30次30秒的聚合后，在72℃下进行了7分钟聚合反应。将所述PCR扩增产物用XbaⅠ和NdeⅠ处理后，将pDZ-ribG载体与使用限制酶XbaⅠ和NdeⅠ处理而获得的DNA碎片连接，从而制备了pDZ-lysCP1_ribG载体（图4）。用于PCR的引物序列如下。
SEQ ID NO：13：5'-ttttctagatagggagccatcttttgggg-3'
SEQ ID NO：14：5'-tttcatatgctttgtgcacctttcg-3'
实施例6：在ribG的上游导入了强启动子（LysCP1）的菌株的赖氨酸及核黄素生产能力比较
使用电脉冲法将所述实施例5中制备的载体pDZ-lysCP1_ribG转化到作为L-赖氨酸生产菌株的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881中，选择性地分离染色体上的ribG基因固有启动子被lysCP1取代的菌株，从而得到了同时生产L-赖氨酸及核黄素的KFCC10881：：lysCP1_ribG。将该菌株按照实施例2的方法进行培养，分析了培养液中的L-赖氨酸及核黄素的浓度（表3）。将所述KFCC10881：：lysCP1_ribG菌株命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）CA01-2161，KFCC10881：：lysCP1_ribG。上述突变的菌株也可简单地统称为KFCC10881：：lysCP1_ribG，在2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），保藏编号为KCCM11220P。
表3随着启动子的导入而变化的L-赖氨酸及核黄素的生产量变化
如表3中的结果所示，确认了与具有野生型启动子的对照区KFCC10881（实验组5）相比，使用lysCP1启动子过表达RibG的情况下（实验组6），在L-赖氨酸的平均浓度上虽然没有变化，但核黄素的平均浓度增加了约73倍。
由此，可以确定,利用异种启动子过表达核黄素生物合成操纵子的情况下，在完全不影响赖氨酸生产的同时，还可以大幅增加核黄素的产量，可知，启动子的表达诱导活性越强，会增加依靠核黄素生物合成基因簇过表达的核黄素的生产能力。
实施例7：rib操纵子的拷贝数增加的菌株的赖氨酸及核黄素生产能力比较
在KFCC10881菌株上导入含有rib操纵子的质粒，从而增加核 黄素生物合成基因的拷贝数，用于确认核黄素的生产能力。
根据报告的碱基序列，合成在5'末端上插入了XbaⅠ限制酶部位的引物和在3'末端上插入了相同限制酶部位的引物（SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16），通过以KFCC10881染色体为雏形的PCR，扩增了包括启动子部位的约4500bp的rib操纵子。PCR条件如下：在94℃下进行5分钟改性后，在94℃下改性30秒，在56℃下进行30秒退火处理，在72℃下重复进行30次4分钟的聚合，在72℃下进行了7分钟聚合反应。用于上述PCR的引物序列如下。
SEQ ID NO：15：5'-TTTGGTACCGATTGAAAAGTCCGTGCG TG-3'
SEQ ID NO：16：5'-TTTGGTACCCGCGATCTTTTTCAGAAA CT-3'
用限制酶XbaⅠ处理PCR扩增的基因片段，获得DNA碎片后，将其连接到具有限制酶XbaⅠ末端的pECCG117载体上，转化到大肠菌DH5α上后，涂抹到含有卡那霉素（25mg/L）的LB固体培养基上。对菌落进行筛选，所述菌落为：通过PCR，插入了靶基因的载体所转化的菌落。然后，使用公知的质粒提取法，得到质粒，将该质粒命名为pECCG117-rib。
利用电脉冲法将上述制备的载体pECCG117-rib导入到KFCC10881菌株后，按照实施例2的方法进行培养，分析了培养液中的L-赖氨酸及核黄素的浓度（表4）。
表4随质粒导入而变化的L-赖氨酸及核黄素的产量变化
如表4所示，其结果为确认了与不包含rib操纵子的对照区KFCC10881：：pECCG117（实验组7）相比，通过导入质粒增加rib操纵子的拷贝数的情况下（实验组8），L-赖氨酸的平均浓度虽无变化，但核黄素的浓度增加了66倍。
由此，通过利用质粒增加核黄素生物合成操纵子的拷贝数，过表达核黄素生物合成基因的情况下，在完全不影响赖氨酸生产的同时，还可以大幅增加核黄素的产量。
实施例8：利用人工诱变法的AHV抗性L-苏氨酸生产菌株的制备
在本实施例中，为了增加谷氨酸棒状杆菌的L-苏氨酸生产能力，实施了对作为L-苏氨酸类似物质的AHV（2-氨基-3-羟基-戊酸酯）赋予抗性的实验。将KFCC10881作为亲株，通过N-甲基-N-硝基-N-硝基胍（NTG）进行人工诱变后，在含有1～10g/LAHV的下述基本培养基中进行培养，在培养基内，根据AHV浓度变化是否形成菌落，与NTG非处理对照区进行了比较。NTG非处理对照区的情况下，以培养第72小时为基准，显示出了对1～3g/LAHV的抗性，在培养时间相同的情况下，NTG处理区中，浓度达到AHV6g/L时，才形成了菌落。为了确认这些L-苏氨酸的生产能力是否增加，按照下述方法进行了培养，并分析了培养液中L-苏氨酸的产量。
在含有25mL的种子培养基的250mL三角瓶中接种各菌株，在30℃下，以200rpm振荡培养了20小时。此后，在含有24mL的生产培养基的250mL三角瓶瓶中，接种1ml的种子培养液，在30℃下以200rpm振荡培养48小时。所述种子培养基和生产培养基的组成分别如下。
<基本培养基（pH7.2）>
5g葡萄糖、1g KH2PO4、5g(NH4)2SO4、0.4g MgSO4.7H2O、0.5gNaCl、200μg生物素、100μg盐酸硫胺、100μg钙-泛酸、0.03g烟酰 胺、0.01g L-苏氨酸、2g尿素、0.09mg Na2B4O710H2O、0.04mg（NH4） 6Mo7O27.4H2O、0.01mg ZnSO4.7H2O、0.01mg CuSO4.5H2O，0.01mg MnCl2.4H2O、1mg FeCl3.6H2O、0.01mg CaCl2（以1L蒸馏水计）。
<种子培养基（pH7.0）>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5g MgSO4.7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺、2000μg钙-泛酸、2000μg烟酰胺（以1L蒸馏水计）。
<生产培养基（pH7.0）>
100g葡萄糖、20g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白质、5g玉米浸渍固形物、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4.7H2O、100μg生物素、1000μg盐酸硫胺、2000μg钙-泛酸、3000μg烟酰胺、30g CaCO3（以1L蒸馏水计）
在结束培养后，利用HPLC分析了培养液中L-苏氨酸的浓度，将表现出最高L-苏氨酸生产能力的变异株命名为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）CA01-2182，KFCC10881-THR。上述突变菌株也可简单地统称为KFCC10881-THR，2011年11月11日保藏于韩国微生物保藏中心（韩国首尔西大门区弘济1洞儒林大厦），保藏编号为KCCM11222P。KFCC10881-THR的L-苏氨酸生产能力如下（表5）。
表5KFCC10881-THR的L-苏氨酸生产浓度
上述表5中，示出了作为实验组9的对照区KFCC10881的L-苏氨酸平均浓度，实验组10为KFCC10881-THR的L-苏氨酸的平均浓度。
如表5的结果所示，确认了KFCC10881-THR的情况下，与KFCC10881相比L-苏氨酸的生产能力增加了约5.6g/L左右。
实施例9：在染色体内rib操纵子上游或ribG上游导入强启动子的菌株制备，以及苏氨酸和核黄素生产能力的比较
利用电脉冲法，将上述实施例3制备的载体pDZ-Pmrb和实施例5中制备的pDZ-lysCP1_ribG分别转化到上述实施例8中制备的作为L-苏氨酸生产菌株的KFCC10881-THR中，选择性地分离染色体上的rpe基因固有启动子被Pmrb取代的菌株或ribG基因固有启动子被lysCP1取代的菌株，按照实施例7的方法培养，对回收的L-苏氨酸及核黄素的浓度进行了分析（表6）。
表6根据导入启动子变异的L-苏氨酸及核黄素的产量变化
如表6的结果所示，其结果为，确认了与具有野生型rpe及ribG基因固有启动子的对照区KFCC10881-THR（实验组11）相比，导入了具有2个碱基取代变异的启动子Pmrb的KFCC10881：：Pmrb（实验组12）和利用lysCP1启动子过表达RibG的KFCC10881-THR：：lysCP1_ribG的情况下（实验组13）L-苏氨酸的平均浓度虽无变化，但核黄素的平均浓度分别增加了约56倍和66倍。
由上述结果可知，过表达核黄素生物合成操纵子的情况下，在完全不影响L-苏氨酸生产的同时，还大幅增加了核黄素的产量，可以同时生产L-苏氨酸及核黄素。由此可知，在L-苏氨酸生产菌株中，随着 核黄素生物合成操纵子启动子的表达诱导活性越强，会增加依靠核黄素生物合成基因簇过表达的核黄素的生产能力。
Claims (21)
1.一种同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的方法，其包括下述步骤：在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，以及核黄素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌属微生物选自谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）及乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-赖氨酸或L-苏氨酸：核黄素的比例为1：0.0001~0.1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将含有所述L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的培养发酵液颗粒化的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括从含有所述L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的培养发酵液中去除菌体沉淀物的步骤。
7.一种变异型谷氨酸棒状杆菌微生物，其特征在于，其为修饰的微生物，其是通过对具有高浓度L-赖氨酸生产能力的谷氨酸棒状杆菌随机诱导突变，从而使所述L-赖氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，其保藏编号为KCCM11223P。
8.一种变异型棒状杆菌属微生物，其特征在于，其为修饰的、能够同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的微生物，其是在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，同时使核黄素的产量增加。
9.根据权利要求8所述的微生物，其特征在于，所述棒状杆菌属微生物选自谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）、热产氨棒状杆菌（Corynebacterium thermoaminogenes）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）及乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）。
10.根据权利要求8所述的微生物，其特征在于，其是对核黄素生物合成基因簇表达的酶群进行活性强化的微生物。
11.根据权利要求10所述的微生物，其特征在于，所述对酶群进行活性强化的方法选自以下方法中的一种以上：增加对所述酶群进行编码的细胞内基因拷贝数，向编码所述酶群的染色体上的基因调控序列导入变异；将编码所述酶群的染色体上的基因调控序列替换为活性强的序列；将染色体上的编码所述酶群的基因替换为突变的基因，以增加所述酶群的活性；及向编码所述酶群的染色体上的基因中导入变异，以强化所述酶群的活性。
12.根据权利要求11所述的微生物，其特征在于，所述对酶群进行活性强化的方法为将编码所述酶群的染色体上基因的调控序列替换为活性强的启动子。
13.根据权利要求12所述的微生物，其特征在于，所述启动子具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的序列。
14.根据权利要求8所述的微生物，其特征在于，其为修饰的、能够同时生产L-赖氨酸及核黄素的微生物，其是在具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，对含有核黄素生物合成基因簇的rib操纵子表达的酶群进行活性强化，以使得所述L-赖氨酸维持高浓度产量，同时使核黄素的产量增加，所述微生物的保藏编号为KCCM11220P、KCCM11221P或KCCM11223P。
15.根据权利要求8所述的微生物，其特征在于，具有所述L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物的保藏编号为KCCM11222P。
16.一种颗粒制剂，其特征在于，其通过以下步骤制得：
a）在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素；
b）将含有所述步骤a）的L-赖氨酸或L-苏氨酸，以及核黄素的发酵液进行颗粒化。
17.根据权利要求16所述的颗粒制剂，其特征在于，所述L-赖氨酸或L-苏氨酸：核黄素的比例为1：0.0001~0.01。
18.根据权利要求16或17所述的颗粒制剂，其特征在于，还包括从含有所述步骤a）中生产的L-赖氨酸或L-苏氨酸及核黄素的发酵培养液中，去除菌体沉淀物的步骤。
19.一种含有L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素的制剂，其特征在于，其通过以下步骤制得：
a）在具有L-赖氨酸或L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌属微生物中，培养修饰的上述微生物，以使得所述L-赖氨酸或L-苏氨酸维持高浓度产量，使核黄素的产量增加，从而用发酵法同时生产L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素；
b）从含有所述步骤a）中生产的L-赖氨酸或L-苏氨酸及核黄素的发酵液中，去除菌体沉淀物。
20.根据权利要求19所述的含有L-赖氨酸或L-苏氨酸及核黄素的制剂，其特征在于，所述L-赖氨酸或L-苏氨酸：核黄素的比例为1：0.0001~0.01。
21.一种饲料添加剂，其含有权利要求16或18的颗粒制剂，或者包含权利要求19的含有L-赖氨酸或L-苏氨酸，及核黄素制剂。
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