CN101580812A

CN101580812A - 生产l-谷氨酸的细菌和生产l-谷氨酸的方法

Info

Publication number: CN101580812A
Application number: CNA2008100818630A
Authority: CN
Inventors: 王德辉; 贾冬舒; 段昭炜
Original assignee: CHANGCHUN DACHENG INDUSTRIAL GROUP Co Ltd
Current assignee: CHANGCHUN DACHENG INDUSTRIAL GROUP Co Ltd
Priority date: 2008-05-13
Filing date: 2008-05-13
Publication date: 2009-11-18

Abstract

本发明公开了一种生产L－谷氨酸的方法，包括在培养基中培养属于棒杆菌属，并且具有生产L－谷氨酸能力的微生物，以及从该培养基收集产生的L－谷氨酸。所使用的微生物菌株中导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因，提高了氧传递效率，增加了氧传递量。所使用的微生物菌株优选的还是具有催化L－谷氨酸生物合成途径的分支反应，并且产生不是L－谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏(其中使用了低能离子注入诱变的方法)，或者还具有催化L－谷氨酸生成的酶的活性增强的菌株。

Description

生产L-谷氨酸的细菌和生产L-谷氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产L-谷氨酸的微生物和用该微生物发酵生产L-谷氨酸的方法。其中，该微生物是一种具有生产L-谷氨酸能力的棒杆菌属细菌。具体的说，该微生物是谷氨酸棒杆菌。

背景技术

L-谷氨酸是可作为食物、药物和诸如此类的重要氨基酸。

生产L-谷氨酸的常规方法是利用所谓的生产L-谷氨酸的棒状细菌及其突变体通过发酵方法产生，该细菌原则上属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)和微杆菌属(Microbacterium)的细菌及其突变体(参见Amino acid fermentation，Gakkai shuppan center，pp195-215，1986)。发酵生产L-谷氨酸的其他公知的方法包括利用芽孢杆菌、链霉菌、青霉菌和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,220,929)，利用假单孢菌、节杆菌、沙雷伯氏菌、念珠菌属和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,563,857)，利用芽孢杆菌、假单孢菌、沙雷伯氏菌和诸如此类的微生物的方法(日本专利公开号(KOKOKU)，32-9393(1957))等。

虽然通过前面所述培育这样的微生物或改善的生产方法已经相当大地提高L-谷氨酸的生产率，但是仍然需要开发更为有效、更廉价的L-谷氨酸的生产方法，以便满足将来对氨基酸的明显增长的需求。

为了达到上述目的，本发明的研究人员进行了不懈的努力和大量的重复研究。结果，本研究人员发现，在特定的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中，如果使谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、硫辛酸乙酰转移酶中的至少一种酶的活性增强，和/或使异柠檬酸裂解酶、苹果酸合成酶和硫辛酸琥珀酰转移酶中至少一种酶的活性减弱，所述细菌的L-谷氨酸产量可以提高，并且，依据这些发现完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是增强谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸生产能力，并提供一种更有效、成本更低的生产L-谷氨酸的方法。

本发明的目的之一是提供一种属于棒杆菌属(Corynebacterium)的微生物，优选地，该微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其具有生产L-谷氨酸的能力。

具体地，在该棒杆菌属微生物中导入了血红蛋白基因(Vitreoscillahemoglobin gene，简写为vgb)，使该微生物在合适的培养基中，提高氧传递体系，增加氧传递量，从而增强L-谷氨酸的生产能力。其中，所述的血红蛋白基因来自透明颤菌(Vitreoscilia spp.)。

本发明的棒杆菌属微生物进一步包括如下特征：

(1)属于棒杆菌属并且具有生产L-谷氨酸的微生物，其中所述微生物中催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增强；

(2)根据上述(1)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反应的酶选自谷氨酸脱氢酶(下面简写为gdh)、异柠檬酸脱氢酶(下面简写为aceK)、丙酮酸羧化酶(下面简写为pycA)和硫辛酸乙酰转移酶(下面简写为acoC)中的至少一种；

(3)根据上述(2)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反应的酶是gdh和aceK；

(4)根据上述(2)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反应的酶是gdh、aceK、pycA和acoC四种；

(5)根据上述任意一种的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏；

(6)根据上述(5)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶选自异柠檬酸裂解酶(下面简写为IL)、苹果酸合成酶(下面简写为MS)和硫辛酸琥珀酰转移酶(下面简写为LS)中的至少一种；

(7)根据上述(6)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶是IL；以及

(8)根据上述(6)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶是IL、MS和LS三者。

本发明的另一目的是提供一种生产L-谷氨酸的方法，该方法包括在谷氨酸生产常用的液体培养基中培育本发明如上所述的任意一种微生物，以便在该培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从培养基中收集L-谷氨酸。

本发明的微生物属于棒杆菌属，该细菌通过EM途径完成糖代谢，在这一途径产生的丙酮酸在需氧的条件下进入TCA循环，通过gdh或谷氨酸合成酶从TCA循环的中间产物α-酮戊二酸生物合成L-谷氨酸。

本发明的细菌属于棒杆菌属，利用细菌血红蛋白基因表达来提高棒杆菌属基因工程菌的氧传递体系，增加氧传递量。

由于基因工程菌中外源基因的表达，含有重组质粒的细胞会需要更多的氧，从而可能会改变细胞的能量代谢，而不利于细胞的生长(Khoravi，M，Ryanw，webter，D，A等等，质粒，1990，23：138-143)。在大规模高密度的发酵中，细胞大量生长造成溶解氧浓度急剧下降。因此，提高设备通氧条件，使细胞处于有氧呼吸状态，成为基因工程菌发酵中关键问题之一。现有的改进方法主要是提高搅拌速度，增加通气量，加入助溶剂，提高气液传质系数等等，但效果有限，并且会大大增加生产成本。

透明颤菌(Vitreoscilia spp.)是一种生长于贫氧环境中的专性好氧革兰氏阴性细菌，能诱导合成一种血红蛋白--透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin，VHb)。该蛋白是一种氧结合蛋白，这种蛋白的同源二聚体对氧的亲和力与真核生物相近，有很高的氧解离常数，具有很强的氧传输能力，尤其是它自身基因的启动子在贫氧条件下能大量有效地启动该基因表达，可提高发酵液中氧的传递速度，从而促进细胞生长和蛋白质的合成。VHb在大肠杆菌的表达能增加电子传递数目，跨膜pH值和ATP合成速率。

在本发明的细菌中，由于导入了含有透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)的pCDFDuet-2表达质粒，利用Vgb基因的表达，提高了棒杆菌属基因工程菌中氧的传递效率，增加了氧传递量，从而促进了L-谷氨酸的生产。

本发明的细菌是属于棒杆菌属，并且具有产生L-谷氨酸的能力的微生物。在本文使用的表述“具有产生L-谷氨酸的能力”指在培养过程中具有在培养基中积累L-谷氨酸的能力。产生L-谷氨酸的能力可以是具有类似于野生型特性的能力，或通过育种授予的或添加的能力。属于棒杆菌属并且具有产生L-谷氨酸的能力的微生物的例子包括例如催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增强了的这样的微生物，和催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏了的微生物。本发明所述的微生物可进一步包括催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增强，和催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并且产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。

作为催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的例子，可以提到的是丙酮酸激酶，gdh，谷氨酸合成酶，aceK，柠檬酸合成酶，磷酸甘油酸激酶，磷酸甘油酸变位酶，pycA，磷酸果糖异构酶，己糖激酶，acoC和诸如此类。在这些酶中，优选地，选自gdh、aceK、pycA或acoC的中至少一种；更优选地，选自其中的两种、三种或四种；作为本发明的微生物，在这些酶中，最优选地是，其中gdh和aceK的酶活性增加，或者所有四种酶gdh，aceK，pycA，acoC的活性都增加。

这四种酶的活性是否增加了，以及活性增加的程度，可以通过细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性测量，并且将它与野生型菌株或亲本菌株比较即可以确定。用于测定上述酶活性的方法是公知的，并且，本领域技术人员可以方便准确地证实其细胞内的酶活性是否增强。

本发明的细菌是属于棒杆菌属，并且催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增强，这种微生物可以作为变异体获得，其中在编码该酶的基因中已经产生突变，或通过利用上面提到的微生物作为起始亲本菌株的遗传重组菌株获得，下面对这些方法进行简单的描述。

重组质粒的构建：根据已知透明颤菌Vitreoscilla sp.C1基因组DNA序列，设计引物，扩增完整Vgb基因，将完整的Vgb基因片段，与质粒pCDFDuet-1平末端相连接，构建含有Vgb基因的质粒pCDFDuet-2。

为了增强gdh，aceK，pycA，acoC的活性，例如，编码gdh，aceK，pycA，acoC的基因可以克隆进入适当质粒，可以利用得到的质粒转化作为寄主的前面提到的起始亲本菌株，这可以增加编码各个gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的拷贝数，结果，增强了gdh，aceK，pycA，acoC的活性。

将选自gdh，aceK，pycA，acoC基因中的两种或三种或四种以任何联合，导入前面提到的起始亲本菌株，当导入三种或四种基因时，将这三种或四种基因克隆进入一种质粒，并且导入寄主，或者他们分别克隆进入一到两种质粒，所述质粒可以在同一寄主中存在，并且导入寄主中。

对所用质粒没有特别限制，只要它能够在所属棒杆菌属的微生物中自主复制。质粒的例子包括例如：pUC18、pUC19、pBR322和诸如此类。除了这些质粒，也可以使用噬菌体DNA载体。

通过例如，利用氯化钙增强受体细胞对DNA的通透性的方法，或者诸如此类的方法可以达到转化，这些方法都是公知的(或可以参考J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔，分子克隆实验指南(第三版))。

gdh，aceK，pycA和acoC的活性也可以通过存在于作为寄主的起始亲本菌株的染色体DNA上的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的多个拷贝增强。为了在属于棒杆菌属的微生物的染色体中导入多个拷贝的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因，可以利用多个拷贝数的染色体DNA上的序列如重复DNA，和存在于转座因子末端的倒转重复。可选择地，也可将多个拷贝的基因导入染色体DNA，方法是利用携带gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的转座子的转座。这些技术可以增加转化体细胞中的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的拷贝数，结果增强了gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的活性。

可以利用任何生物体作为用于增加拷贝数的gdh，aceK，pycA和acoC基因的来源，只要生物体具有gdh，aceK，pycA和acoC的活性。在这些生物体中，细菌，即原核生物，如那些属于肠杆菌，克雷伯氏菌，泛菌，欧文氏菌，沙雷伯氏菌，埃希氏菌，棒状杆菌，短杆菌或芽孢杆菌属的细菌是优选。作为特定的实例，可以提到大肠杆菌。从以上提到的这样的微生物的染色体DNA可以得到gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因。

通过分离补充缺乏gdh，aceK，pycA或acoC活性的变异体菌株的营养缺陷型的DNA片段，可以从前面提到的任何微生物的染色体DNA分别得到gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因。

可选择地，因为已经阐明了埃希氏菌或棒状杆菌属的细菌的这些基因的核苷酸序列(基因，27卷，1984；微生物学，140卷，1994；生物化学，22卷，1983；生物化学杂志，95卷，1984；分子遗传学，218卷，1989；分子微生物学，6卷，1992)，利用根据每个阐明的核苷酸序列合成的引物和染色体DNA作为模板，通过PCR可以获得这些基因。

除了通过上面提到的基因扩增，通过增加gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的表达也可以增强gdh，aceK，pycA和acoC的活性。例如，通过利用另一个强启动子替代gdh，aceK，pycA或acoC基因的启动子以增强表达。这样的强启动子的例子包括，例如lac启动子，tac启动子，trp启动子，trc启动子，λ噬菌体P_R启动子和P_L启动子和诸如此类。启动子已经被替代的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因可以克隆进入质粒和导入寄主微生物，或利用重复DNA，倒转重复，转座子或诸如此类导入寄主微生物的染色体DNA。

通过利用另一个较强的启动子替代染色体上的gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因的启动子或在每个基因的编码序列的上游插入强启动子，也可以增强gdh，aceK，pycA和acoC的活性。特定地说，通过在gdh基因，aceK基因，pycA基因和acoC基因(这些基因的启动子用强启动子替代)或含有它们的一部分的DNA和染色体上对应的基因之间的同源重组可以达到。

属于棒杆菌属的微生物的特定例子包括，例如，谷氨酸棒杆菌，其中gdh，aceK，pycA或acoC的活性增强。

催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的例子包括例如，α-酮戊二酸脱氢酶，IL，磷酸乙酰转移酶，乙酸激酶，乙酰羟酸合成酶，MS，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，L-谷氨酸脱羧酶，LS和诸如此类.在这些酶中间，MS，IL，LS是优选的。

为了在属于棒杆茵属的微生物中获得上面提到的酶活性的下降和缺乏，可以通过常规诱变技术和低能离子注入诱变技术，或遗传工程技术在编码该酶的基因中导入引起酶活性的下降或缺乏的突变。

诱变技术的实例包括例如，利用低能离子注入诱变的方法，离子束作为一种新的诱变源在诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物效应而发展极为迅速。与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还有动能传递，质量沉积及电荷的中和与交换效应，它将物理诱变和化学诱变特性集于一身，能够在低剂量注入，细胞损伤较轻的情况下，诱发强烈地影响生物细胞的生理、生化性能，改造遗传物质的基本单位——碱基的改变，诱发染色体结构的变异。所用的低能离子为20keV的N⁺离子，以15×10¹⁴N⁺/cm²为最佳处理剂量。

诱变技术的实例包括例如，利用X-射线或紫外光辐射的方法，或者利用诱变试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和诸如此类处理的方法。导入突变的基因的位置可以是编码酶蛋白的编码区或如启动子的表达调节区。

遗传工程技术的实例包括，例如遗传重组，遗传转导，细胞融合和诸如此类.例如，在靶基因中插入药物抗性基因以便产生功能失活的基因(缺陷基因)。然后，这一缺陷基因可以导入属于棒杆菌属的微生物的细胞，并且在染色体上的靶基因可以用缺陷基因通过同源重组替代(基因破坏)。

通过测量候选菌株的细茵细胞提取物或纯化部分的酶活性，并且将它与野生型菌株或亲本茼株的比较可以确定是否微生物降低了靶酶的活性或缺乏该活性，以及该酶活性的降低程度。用于测定上述酶活性的方法是公知的，并且，本领域技术人员可以方便准确地证实其活性减弱。

根据靶酶，可以在变异体的表现型的基础上选择靶变异体。例如：在含有葡萄耱的基本培养基或含有乙酸或L-谷氨酸作为唯一碳源的基本培养基上缺乏MS，IL和LS活性或降低该活性的变异体不能生长，或显示了明显的在需氧条件下生长速率降低。但是，甚至在同样条件下，通过在含有葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸可以展示出正常的生长。根据这些现象，可以选择缺乏MS，IL和/或LS活性或降低该活性的变异体。

通过培养属于谷氨酸棒杆茵属并具有在液体培养基中产生L-谷氨酸的能力的微生物，以及在该培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从该培养基中收集L-谷氨酸。

本发明的另一目的是提供了一种生产L-谷氨酸的方法，该方法包括在谷氨酸生产常用的液体培养基中培育本发明如上所述的任意一种微生物，以在在该培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从该培养基中收集L-谷氨酸。

采用棒杆菌属，通过培养和积累生产氨基酸，特别是L-谷氨酸的方法是常规技术。现有技术中应用棒杆菌属，通过培养和积累生产氨基酸，特别是L-谷氨酸的任何方法均可以用于本发明。

该生产中所使用的培养基可以是含有碳源、氮源、和无机盐，以及有机营养如氨基酸、维生素、和诸如此类的普通营养培养基，可以是合成培养基或天然培养基。任何碳源和氮源可以用于培养基，只要它们可以被培养的微生物利用。

碳源可以是糖，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物以及糖蜜和诸如此类；另外，有机酸如乙酸和柠檬酸也可以单独利用或联合其它碳源利用。

氮源可以是氨，铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵，以及硝酸盐和诸如此类；玉米淀粉的副产物水解玉米浆可以作为有机氮源。

作为微量有机营养，可以使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有它们的物质如蛋白胨、酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白质分解产物和诸如此类物质，并且当利用其生长需要氨基酸和诸如此类的营养缺陷型变异体时，必需补充需要的营养。

作为无机盐，可使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐和诸如此类。

至于培养条件，可以在需氧条件下进行培养，温度为30到42℃，pH为6到8。可以连续培养30小时到60小时，以便在液体培养基中积累相当量的L-谷氨酸。

在完成培养后，可以通过已知方法收集培养基中积累的L-谷氨酸。例如，可以通过包括在除去细胞后浓缩培养基以便结晶产物，离子交换层析和诸如此类的方法分离L-谷氨酸。

附图说明

图1是说明质粒pCDFDuet-2构建过程的示意图；

图2是说明质粒pCDFDgdh构建过程的示意图；

图3是说明质粒pCDGA构建过程的示意图；

图4是说明质粒pETP构建过程的示意图；和

图5是说明质粒pETPA构建过程的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步的说明，但不以任何方式限制本发明的保护范围。

实施例1：构建含有vgb、gdh和aceK基因的质粒

根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/已公开的透明颤菌Vitreoscilla sp.C1基因组DNA序列，设计引物VgbF1：TGCTGCTACACCATACTGA和VgbR1：AAGTCCGGCGAAAGTCCT，作PCR扩增完整Vgb基因，PCR条件如下：

按下列步骤，在DNA扩增仪扩增：

预变性94℃5-10分钟

(1)94℃30秒

(2)55℃30秒

(3)72℃1分钟

30次循环，置72℃10分钟

质粒pCDFDuet-1(购自Novagen公司，含有链霉素抗性基因)，用EcoRI酶消化后补平末端，将其与Vgb基因的PCR产物平末端相连接，构建得到含有Vgb基因的质粒pCDFDuet-2，如图1所示。

根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/已公开的枯草芽孢杆菌枯草亚种168株(Bacillus subtilis subsp.Subtilis str.168)的谷氨酸脱氢酶(gdh)的基因序列(SEQ ID N0：11和12)，设计引物gdhF1和gdhR1(SEQ IDNO：1和NO：2)。以gdhF1和gdhR1为引物，以枯草芽孢杆菌枯草亚种168株(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)(已知菌种，可在市场上买到)的DNA为模板，用PFU酶(购自TAKARA公司)进行PCR扩增，条件如下：

按下列步骤，在DNA扩增仪扩增：

预变性94℃5-10分钟

(1)94℃30秒

(2)55℃30秒

(3)72℃1分钟

30次循环，置72℃10分钟

PCR产物经电泳回收，质粒pCDFDuet-2用NotI酶消化后，补平末端，将其与gdh基因的PCR产物平末端连接，得到含有Vgb和gdh基因的质粒pCDFDgdh，如图2所示。

根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/已公开的大肠杆菌(Escherichiacoli)K12的异柠檬酸脱氢酶(aceK)基因序列(SEQ ID NO：13和14)，设计引物aceK F1和aceK R1(SEQ ID NO：3和NO：4)，以aceK F1和aceK R1为引物，以大肠杆菌(Escherichia coli)K12的DNA为模板，用PFU酶进行PCR扩增，条件如下：

按下列步骤，在DNA扩增仪扩增：

预变性94℃5-10分钟

(1)94℃30秒

(2)55℃30秒

(3)72℃1分钟

30次循环，置72℃10分钟

PCR产物经电泳回收，质粒pCDFDgdh用PACI酶消化后，补平末端，将其与aceK基因的PCR产物平末端连接，得到含有vgb、gdh和aceK基因的质粒pCDGA，如图3所示。

实施例2：用导入了vgb、gdh和aceK基因的菌株发酵生产L-谷氨酸

取通常用于生产谷氨酸的生产菌株谷氨酸棒杆菌G101菌株，其中未导入任何其它基因。

将实施例1中所获得的重组质粒pCDGA转化具有产生L-谷氨酸能力的谷氨酸棒杆菌G101菌株，得到转化株G102菌株。因为质粒pCDFDuet-1含有链霉素抗性基因，所以构建的质粒pCDGA也含有链霉素抗性基因，在育种时需添加链霉素，车间生产时无需添加，将G102菌株接种到添加链霉素的基本培养基(葡萄糖70g/L、MgSO₄.7H₂O 1.1g/L、(NH₄)₂SO₄16.5g/L、KH₂PO₄1.1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄.5H₂O 0.01g/L、水解玉米浆17ml/L、L-蛋氨酸0.6g/L、L-苏氨酸0.12g/L、L-异亮氨酸0.06g/L，链霉素6mg/L，pH 7.0)中，在37℃，115～120转/分的条件下振荡培养40小时，同时将未导入pCDGA的G101菌株在不添加链霉素的同样的培养基中作为对照培养。培养完成后，从培养基中收集L-谷氨酸，测量积累产生的L-谷氨酸。结果如表1所示。

表1：L-谷氨酸的产量

谷氨酸棒杆菌G102由于导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因(vgb)，提高了氧传递效率，增加了氧传递量，并且其中谷氨酸脱氢酶(gdh)和异柠檬酸脱氢酶(aceK)的增强而使L-谷氨酸的产率得到提高。

实施例3：构建含有pycA和acoC基因的质粒

根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/已公开的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的丙酮酸羧化酶(pycA)的基因序列(SEQ ID NO：15和16)，设计引物pycAF1和pycAR1(SEQ ID NO：5和NO：6)，以pycAF1和pycAR1为引物，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的DNA为模板，用PFU酶进行PCR扩增，条件如下：

按下列步骤，在DNA扩增仪扩增

预变性94℃5-10分钟

(1)94℃30秒

(2)55℃30秒

(3)72℃1分钟

30次循环，置72℃10分钟

扩增片段经电泳回收，质粒pETDuet-1(购自Novagen公司，含有氨苄抗性)用EcoRI酶消化后补平末端，将其与丙酮酸羧化酶(pycA)基因的PCR产物平末端相连接，得到含有丙酮酸羧化酶(pycA)基因的质粒pETP，如图4所示。

根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/已公开的枯草芽孢杆菌枯草亚种168株(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)的硫辛酸乙酰转移酶(acoC)基因序列(SEQ ID NO：17和18)，设计引物acoC F1和acoCR1(SEQ ID NO：7和NO：8)，以acoC F1和acoC R1为引物，以枯草芽孢杆菌枯草亚种168株(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)的DNA为模板，用PFU酶进行PCR扩增，条件如下：

按下列步骤，在DNA扩增仪扩增

预变性94℃5-10分钟

(1)94℃30秒

(2)55℃30秒

(3)72℃1分钟

30次循环，置72℃10分钟

PCR产物经电泳回收，质粒pETP用NotI酶消化后，补平末端，将其与硫辛酸乙酰转移酶(acoC)基因的PCR产物平末端连接，得到含有丙酮酸羧化酶(pycA)基因和硫辛酸乙酰转移酶(acoC)基因的质粒pETPA，如图5所示。

实施例4：用导入了vgb、gdh、aceK、pycA和acoC基因的菌株发酵生产L-谷氨酸

将上述实施例3中所获得的重组质粒pETPA，转化至谷氨酸棒杆菌G102菌株中，得到G103菌株，并接种到基本培养基(葡萄糖135g/L、MgSO₄.7H₂O 1.1g/L、(NH₄)₂SO₄16.5g/L、KH₂PO₄1.1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄.5H₂O 0.01g/L、水解玉米浆30ml/L、L-蛋氨酸0.6g/L、L-苏氨酸0.12g/L、L-异亮氨酸0.06g/L、氨苄青霉素6mg/L、链霉素6mg/L，pH 7.0)中，在37℃，115～120转/分的条件下振荡培养40小时，同时将G102菌株和G101菌株也在不添加氨苄青霉素的同样的培养基中作为对照培养。培养完成后，从培养基收集L-谷氨酸，测量积累产生的L-谷氨酸。结果如表2所示。

表2：L-谷氨酸的产量

谷氨酸棒杆菌G103由于导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因，提高了氧传递效率，增加了氧传递量，并且其中谷氨酸脱氢酶(gdh)、异柠檬酸脱氢酶(aceK)、丙酮酸羧化酶(pycA)和硫辛酸乙酰转移酶(acoC)的增强使L-谷氨酸的产率得到提高。

实施例5：用敲除硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因的菌株生产L-谷氨酸

以质粒PKF3(购自TAKARA公司，含有氯霉素抗性基因Cat基因)为模板，用LSP1、LSP2为引物进行PCR扩增，其中LSP1靠近5’端的区域(加下划线部分)与硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因一端序列同源，LSP2靠近5’端的区域(加下划线部分)与硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因另一端序列同源；LSP1靠近3’端的区域(未加下划线部分)与质粒PKF3上Cat基因一侧序列互补，LSP2靠近3’端的区域(未加下划线部分)与质粒PKF3上Cat基因另一侧序列互补：

LSP1：5’GATGCCCTGTACACGGCGAGGCTCCCCTTGCCACGCTCAGTGGAACTCCGTCG-3′(SEQ ID NO：9)

LSP2：5’GCA GCC ATC TGG CTGCCT TAGTCTGTCTTACGGTGTAAAACGTCCGAAGGCC-3′(SEQ ID NO：10)

经PCR反应，条件如下：

按下列步骤，在DNA扩增仪扩增

预变性94℃5-10分钟

(1)94℃30秒

(2)55℃30秒

(3)72℃1分钟

30次循环，置72℃10分钟

扩增出两翼与硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因上下游序列同源，中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。

挑取谷氨酸棒杆菌G103的单菌落接种于新鲜LB培养基(含有氨苄青霉素)中，30℃振荡培养过夜，转接于50mL培养基，继续培养至A₆₀₀＝0.2-0.3。加入L-阿拉伯糖，继续培养至A₆₀₀＝0.5-0.6，将菌液置冰浴中15-20min，于4℃，5000×g离心10min，用灭菌的10％甘油洗涤菌体3次，将菌体重悬于0、5mL甘油中，制成感受态细胞。移取上述PCR产物与感受态细胞混合，电击后加入1ml预冷的LB培养基，30℃培养1h。移取200ul涂布于含有氨苄青霉素(氨苄青霉素6mg/L)和链霉素(链霉素6mg/L)的LB平板上，30℃培养，筛选阳性转化子。上述外源DNA片段转入G103菌株中后，在Red重组酶的作用下，外源DNA片段与染色体上的同源区域重组，导致将硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因敲除，得到硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因缺陷株G104。

将所获得的重组菌株G104，接种到基本培养基(葡萄糖180g/L、MgSO₄.7H₂O 1.1g/L、(NH₄)₂SO₄16.5g/L、KH₂PO₄1.1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄.5H₂O 0.01g/L、水解玉米浆45ml/L、L-蛋氨酸0.6g/L、L-苏氨酸0.12g/L、L-异亮氨酸0.06g/L、氨苄青霉素6mg/L、链霉素6mg/L，pH7.0)中培养，同时，将未硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因未被敲除的菌株G103也在同样的培养基中作为对照培养。培养完成后，从培养基中收集L-谷氨酸，测量积累产生的L-谷氨酸。结果如表3所示。

表3：L-谷氨酸的产量

谷氨酸棒杆菌G104由于导入了来自透明颤菌的血红蛋白基因，提高了氧传递效率，增加了氧传递量，并且其中谷氨酸脱氢酶(gdh)、异柠檬酸脱氢酶(aceK)、丙酮酸羧化酶(pycA)和硫辛酸乙酰转移酶(acoC)的增强以及硫辛酸琥珀酰转移酶(LS)基因被敲除，而使L-谷氨酸的产率得到提高。

实施例6：异柠檬酸裂解酶(IL)，苹果酸合成酶(MS)的弱化处理。

异柠檬酸裂解酶(IL)，苹果酸合成酶(MS)的诱变处理

用化学诱变剂硫酸二乙酯(DES)和甲酰胺处理谷氨酸棒杆菌G104，获得突变菌G104-1菌株，该菌种的保藏号是：CGMCC No：2368，保存日期2008年1月28日，该突变菌G104-1菌株与原菌株G104相比，异柠檬酸裂解酶(IL)和苹果酸合成酶(MS)有一定的弱化。

对该突变株进行培养选育，并进一步对它进行紫外诱变和组成型选育，获得异柠檬酸裂解酶(IL)和苹果酸合成酶(MS)进一步弱化的菌株G104-2，该菌种的保藏号为：CGMCC No：2366，保存日期2008年1月28日)，该突变菌G104-2菌株与原菌株G104-1相比，异柠檬酸裂解酶(IL)和苹果酸合成酶(MS)有更进一步的弱化。

将所获得的菌株G104-2，在培养基(葡萄糖230g/L、MgSO₄.7H₂O 1.1g/L、(NH₄)₂SO₄16.5g/L、KH₂PO₄1.1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.01g/L、MnSO₄.5H₂O 0.01g/L、水解玉米浆57ml/L、L-蛋氨酸0.6g/L、L-苏氨酸0.12g/L、L-异亮氨酸0.06g/L，氨苄青霉素6mg/L，链霉素6mg/L)中，在pH7.0培养，同时，将G104-1菌株和未诱变处理的菌株G104也在同样的培养基中作为对照培养。培养完成后，从培养基中收集L-谷氨酸，测量积累产生的L-谷氨酸。结果表示在表4。

表4：L-谷氨酸的产量

谷氨酸棒杆菌G104-2的异柠檬酸裂解酶(IL)，苹果酸合成酶(MS)弱化后，使L-谷氨酸的产率在G104基础上得到提高。

以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>申请人长春大成实业集团有限公司

<120>生产L-谷氨酸的细菌和生产L-谷氨酸的方法

<160>18

<170>Patent In版本3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>1

tacataggcc taaattttcc tttt 24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>2

agtaaggtcc gtccggcgcc aatt 24

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>3

tacggcgcac cggaccttaa taac 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>4

gccatacccc tctacgaaaa aact 24

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

aacagagtcg ttagctatgt tttt 24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

gaggaacttt aactttttcg tatt 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

taccgccatt ttcatcacta cggt 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

cttgggcgtc gtaattaaaa tatc 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>9

gatgccctgt acacggcgag gctc 24

<210>10

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>10

gcagccatct ggctgcctta gtct 24

<210>11

<211>786

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌枯草亚种168株(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)

<400>11

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600

gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

<210>12

<211>261

<212>PRT

<400>12

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala Ser Gly Leu Gly Lys

5 10 15 20

Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys

25 30 35 40

Gln Asp Pro Asn Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln

45 50 55 60

Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile Lys Glu Phe Gly

65 70 75 80

Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro

85 90 95 100 105

Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu

110 115 120 125

Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser Ser Val His

130 135 140 145

Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met

150 155 160 165

Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly

170 175 180 185

Ala Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp Val Glu

190 195 200 205 210

Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu

215 220 225 230

Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln

235 240 245 250

Tyr Pro Ser Phe Gln Ala Gly Arg Gly

255 260

<210>13

<211>1737

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)K12

<400>13

atgccgcgtg gcctggaatt attgattgct caaaccattt tgcaaggctt cgatgctcag 60

tatggtcgat tcctcgaagt gacctccggt gcgcagcagc gtttcgaaca ggccgactgg 120

catgctgtcc agcaggcgat gaaaaaccgt atccatcttt acgatcatca cgttggtctg 180

gtcgtggagc aactgcgctg cattactaac ggccaaagta cggacgcggc atttttacta 240

cgtgttaaag agcattacac ccggctgttg ccggattacc cgcgcttcga gattgcggag 300

agctttttta actccgtgta ctgtcggtta tttgaccacc gctcgcttac tcccgagcgg 360

ctttttatct ttagctctca gccagagcgc cgctttcgta ccattccccg cccgctggcg 421

aaagactttc accccgatca cggctgggaa tctctactga tgcgcgttat cagcgaccta 481

ccgctgcgcc tgcgctggca gaataaaagc cgtgacatcc attacattat tcgccatctg 541

acggaaacgc tggggacaga caacctcgcg gaaagtcatt tacaggtggc gaacgaactg 601

ttttaccgca ataaagccgc ctggctggta ggcaaactga tcacaccttc cggcacattg 661

ccatttttgc tgccgatcca ccagacggac gacggcgagt tatttattga tacctgcctg 721

acgacgaccg ccgaagcgag cattgttttt ggctttgcgc gttcttattt tatggtttat 781

gcgccgctgc ccgcagcgct ggtcgagtgg ctacgggaaa ttctgccagg taaaaccacc 841

gctgaattgt atatggctat cggctgccag aagcacgcca aaaccgaaag ctaccgcgaa 901

tatctcgttt atctacaggg ctgtaatgag cagttcattg aagcgccggg tattcgtgga 961

atggtgatgt tggtgtttac gctgccgggc tttgatcggg tattcaaagt catcaaagac 1021

aggttcgcgc cgcagaaaga gatgtctgcc gctcacgttc gtgcctgcta tcaactggtg 1081

aaagagcacg atcgcgtggg ccgaatggcg gacacccagg agtttgaaaa ctttgtgctg 1141

gagaagcggc atatttcccc ggcattaatg gaattactgc ttcaggaagc agcggaaaaa 1201

atcaccgatc tcggcgaaca aattgtgatt cgccatcttt atattgagcg gcggatggtg 1261

ccgctcaata tctggctgga acaagtggaa ggtcagcagt tgcgcgacgc cattgaagaa 1321

tacggtaacg ctattcgcca gcttgccgct gctaacattt tccctggcga catgctgttt 1381

aaaaacttcg gtgtcacccg tcacgggcgt gtggtttttt atgattacga tgaaatttgc 1441

tacatgacgg aagtgaattt ccgcgacatc ccgccgccgc gctatccgga agacgaactt 1501

gccagcgaac cgtggtacag cgtctcgccg ggcgatgttt tcccggaaga gtttcgccac 1561

tggctatgcg ccgacccgcg tattggtccg ctgtttgaag agatgcacgc cgacctgttc 1621

cgcgctgatt actggcgcgc actacaaaac cgcatacgtg aagggcatgt ggaagatgtt 1681

tatgcgtatc ggcgcaggca aagatttagc gtacggtatg gggagatgct tttttga 1737

<210>14

<211>577

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)K12

<400>14

Met Pro Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Arg Gln Thr Ile Leu Gln Gly Phe Asp Arg Gln Tyr

5 10 15 20

Gly Arg Phe Leu Glu Val Thr Ser Gly Arg Gln Gln Arg Phe Glu Gln Arg Asp Trp His Arg

25 30 35 40

VaI Gln Gln Arg Met Lys Asn Arg Ile His Leu Tyr Asp His His Val Gly Leu Val Val Glu

45 50 55 60

Gln Leu Arg Cys Ile Thr Asn Gly Gln Ser Thr Asp Arg Arg Phe Leu Leu Arg Val Lys Glu

65 70 75 80

His Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Phe Glu Ile Arg Glu Ser Phe Phe Asn Ser

85 90 95 100 105

Val Tyr Cys Arg Leu Phe Asp His Arg Ser Leu Thr Pro Glu Arg Leu Phe Ile Phe Ser Ser

110 105 110 115

Gln Pro Glu Arg Arg Phe Arg Thr Ile Pro Arg Pro Leu Arg Lys Asp Phe His Pro Asp His

120 125 130 135

Gly Trp Glu Ser Leu Leu Met Arg Val Ile Ser Asp Leu Pro Leu Arg Leu Arg Trp Gln Asn

140 145 150 155

Lys Ser Arg Asp Ile His Tyr Ile Ile Arg His Leu Thr Glu Thr Leu Gly Thr Asp Asn Leu

160 165 170 175

Arg Glu Ser His Leu Gln Val Arg Asn Glu Leu Phe Tyr Arg Asn Lys Arg Arg Trp Leu Val

180 185 190 195 200

Gly Lys Leu Ile Thr Pro Ser Gly Thr Leu Pro Phe Leu Leu Pro Ile His Gln Thr Asp Asp

205 210 205 210

Gly Glu Leu Phe Ile Asp Thr Cys Leu Thr Thr Thr Arg Glu Arg Ser Ile Val Phe Gly Phe

215 220 225 230

Arg Arg Ser Tyr Phe Met Val Tyr Arg Pro Leu Pro Arg Arg Leu Val Glu Trp Leu Arg Glu

235 240 245 250

Ile Leu Pro Gly Lys Thr Thr Arg Glu Leu Tyr Met Arg Ile Gly Cys Gln Lys His Arg Lys

255 260 265 270

Thr Glu Ser Tyr Arg Glu Tyr Leu Val Tyr Leu Gln Gly Cys Asn Glu Gln Phe Ile Glu Arg

275 280 285 290 295

Pro Gly Ile Arg Gly Met Val Met Leu Val Phe Thr Leu Pro Gly Phe Asp Arg Val Phe Lys

300 305 310 315

Val Ile Lys Asp Arg Phe Arg Pro Gln Lys Glu Met Ser Arg Arg His Val Arg Arg Cys Tyr

320 325 330 335

Gln Leu Val Lys Glu His Asp Arg Val Gly Arg Met Arg Asp Thr Gln Glu Phe Glu Asn Phe

340 345 350 355

Val Leu Glu Lys Arg His Ile Ser Pro Arg Leu Met Glu Leu Leu Leu Gln Glu Arg Arg Glu

360 365 370 375

Lys Ile Thr Asp Leu Gly Glu Gln Ile Val Ile Arg His Leu Tyr Ile Glu Arg Arg Met Val

380 385 390 395 400

Pro Leu Asn Ile Trp Leu Glu Gln Val Glu Gly Gln Gln Leu Arg Asp Arg Ile Glu Glu Tyr

405 410 415 420

Gly Asn Arg Ile Arg Gln Leu Arg Arg Arg Asn Ile Phe Pro Gly Asp Met Leu Phe Lys Asn

425 430 435 440

Phe Gly Val Thr Arg His Gly Arg Val Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Glu Ile Cys Tyr Met Thr

445 450 455 460

Glu Val Asn Phe Arg Asp Ile Pro Pro Pro Arg Tyr Pro Glu Asp Glu Leu Arg Ser Glu Pro

465 470 475 480

Trp Tyr Ser Val Ser Pro Gly Asp Val Phe Pro Glu Glu Phe Arg His Trp Leu Cys Arg Asp

485 490 495 500 505

Pro Arg Ile Gly Pro Leu Phe Glu Glu Met His Arg Asp Leu Phe Arg Arg Asp Tyr Trp Arg

510 515 520 525

Arg Leu Gln Asn Arg Ile Arg Glu Gly His Val Glu Asp Val Tyr Arg Tyr Arg Arg Arg Gln

530 535 540 545

Arg Phe Ser Val Arg Tyr Gly Glu Met Phe

550 555

<210>15

<211>3447

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)K12

<400>15

ttgtctcagc aatcgataca aaaagtatta gtagcaaaca ggggagaaat tgcaatccga 61

atattccggg cgtgtaccga gttgaatatt cgtacagttg cggtctattc aaaagaagat 121

tccggttcct accatcggta caaagcggat gaagcatact tggtcggtga agggaaaaaa 181

ccgattgatg cttacctgga tattgaaggt atcattgata ttgcgaaaag aaacaaagtc 241

gatgcaattc atccgggata cggtttctta tctgaaaata ttcattttgc gagacgatgt 301

gaagaagaag gcatcgtatt catagggcca aaatccgagc atctcgatat gtttggtgac 361

aaggtaaaag cgcgtgagca ggcagaaaaa gcgggaatcc ccgtgattcc gggaagcgac 421

ggtcctgccg aaacgcttga agccgtcgaa caatttggac aagctaacgg ttatccgatc 481

atcattaaag cctcgcttgg cggcggcggc cgcggtatgc ggattgtcag atctgaaagt 541

gaagttaaag aagcatatga gcgtgctaaa tcagaggcga aagcagcctt tggcaatgat 601

gaagtttatg tagaaaaatt aattgagaat ccgaaacata ttgaggttca ggtcattgga 661

gacaagcagg gcaatgtcgt ccatcttttt gagagggatt gctccgttca aagacgccat 721

caaaaagtca ttgaagtggc gccgagtgtc tcgctgtcac ctgaattaag ggaccaaatt 781

tgtgaggctg cagttgcgct tgccaaaaat gtaaactata taaatgcggg gacggtcgaa 841

ttccttgttg caaacaacga gttctacttt attgaagtaa atcctcgcgt acaagttgaa 901

cacacgataa cagaaatgat tactggtgtc gatattgttc aaactcagat ccttgttgcc 961

caagggcaca gccttcacag caaaaaagta aatattcctg agcaaaagga catttttaca 1021

atcggctatg ccattcagtc acgggttacg actgaggatc cgcaaaatga tttcatgcct 1081

gatacaggaa aaatcatggc ttaccgctca ggcggcggtt ttggtgtccg tcttgatacc 1141

ggaaacagct tccagggcgc cgtgatcaca ccatactatg attcacttct cgttaagctt 1201

tcaacttggg ctttaacgtt tgaacaggca gctgccaaaa tggtgcgaaa ccttcaggag 1261

tttagaatca gaggcataaa aacgaacatt ccgttccttg agaacgttgc aaagcatgag 1321

aagttcctga cagggcaata tgatacatct ttcattgata caacgcctga attatttaat 1381

ttccctaaac aaaaagaccg cggaacgaaa atgctcactt acatcggcaa tgtgacagtg 1441

aacggcttcc ctggaatcgg gaaaaaagaa aaaccggcgt ttgacaaacc gttaggcgta 1501

aaggtagacg ttgatcagca gcctgccaga ggaacaaagc aaattctcga tgaaaaaggt 1561

gcagaagggc ttgcaaattg ggttaaggag cagaaatctg tccttttaac tgatacgaca 1621

ttcagggatg cccaccaatc gttattggca actagaatca gatcgcatga tttgaaaaaa 1681

atcgcaaatc cgacggctgc gttatggcct gaactattca gtatggaaat gtggggaggc 1741

gcgaccttcg atgtagccta ccgattcctg aaagaagatc cgtggaaacg tttggaagat 1801

cttcgcaaag aagtgccgaa taccttattc cagatgttgc ttcgctcatc aaatgcggtc 1861

ggctatacga attatccgga caatgtgatt aaagaatttg tgaagcaatc agctcaatcc 1921

ggtattgatg tgtttcgtat tttcgacagc ttaaactggg taaaagggat gacgttagcc 1981

attgatgctg ttagggatac cggcaaagtg gcagaagctg cgatttgtta tacgggagat 2041

atccttgaca agaaccggac gaagtacgac cttgcatatt atacatcgat ggcgaaggag 2101

cttgaggcgg ccggagccca tattctcggg attaaagata tggcagggct gttaaaaccg 2161

caggctgcat atgagctcgt ttctgcgttg aaagaaacga tcgacattcc ggttcacctt 2221

catacgcatg atacgagcgg aaacggtatt tatatgtatg cgaaagctgt tgaagccggc 2281

gttgatatca tagacgtggc ggtcagctca atggcgggat taacgtcaca gcctagcgcg 2341

agcggatttt atcatgcgat ggaaggcaac gaccgccgtc cggaaatgaa tgtccaagg 2401

gttgaattgc tgtcccaata ttgggagtcg gtgcgtaaat attatagtga atttgaaagc 2461

ggaatgaagt ctccgcatac tgaaatttat gaacacgaaa tgccaggggg ccaatacagc 2521

aacctgcagc agcaagccaa gggagtaggc cttggcgacc gctggaacga agtcaaggaa 2581

atgtacagac gcgtgaacga tatgttcggt gacatcgtca aggtaacgcc ttcctcaaaa 2641

gtagtcggag atatggcact ctacatggtg caaaacaatc tgactgaaaa agacgtttac 2701

gaaaaaggtg aatctttaga tttccctgat tctgtcgtgg agctttttaa aggaaatatc 2761

ggccagcctc atggcggatt cccagaaaaa ctgcaaaagc tgatcttaaa agggcaggag 2821

ccgattacag tcagaccggg cgaactgctt gagccggtgt catttgaagc gatcaaacag 2881

gaatttaaag agcagcataa cttggaaatt tcagatcagg atgctgtggc atatgccctt 2941

tatcctaaag tcttcactga ttatgtgaaa acgacagaaa gctatggaga catctcggta 3001

ttagatacac cgacattctt ctacggtatg acattaggtg aagagataga agttgaaatt 3061

gagcgcggca aaacgctgat cgttaagctg atttcaatcg gtgagcctca gcctgatgcc 3121

acccgcgtcg tttatttcga actcaacggg cagccgcgtg aagtagtcat taaagatgaa 3181

agcattaagt cttccgttca ggaaaggctg aaagcagacc ggacaaatcc aagccacatc 3241

gcagcttcca tgcctggaac agttattaag gtattggctg aagcaggcac aaaagtcaat 3301

aaaggtgatc atttgatgat taatgaagcg atgaaaatgg aaacaacggt tcaggcgcct 3361

ttctcaggaa caatcaagca ggttcatgtg aaaaatggtg agccgatcca aacgggagat 3421

ctgctccttg aaattgaaaa agcataa 3347

<210>16

<211>1148

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)K12

<400>16

Met Ser Gln Gln Ser Ile Gln Lys Val Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Ala Ile Arg Ile

5 10 15 20

Phe Arg Ala Cys Thr Glu Leu Asn Ile Arg Thr Val Ala Val Tyr Ser Lys Glu Asp Ser Gly

25 30 35 40

Ser Tyr His Arg Tyr Lys Ala Asp Glu Ala Tyr Leu Val Gly Glu Gly Lys Lys Pro Ile Asp

45 50 55 60

Ala Tyr Leu Asp Ile Glu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Arg Asn Lys Val Asp Ala Ile His

65 70 75 80

Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ile His Phe Ala Arg Arg Cys Glu Glu Glu Gly Ile

85 90 95 100 105

Val Phe Ile Gly Pro Lys Ser Glu His Leu Asp Met Phe Gly Asp Lys Val Lys Ala Arg Glu

110 115 120 125

Gln Ala Glu Lys Ala Gly Ile Pro Val Ile Pro Gly Ser Asp Gly Pro Ala Glu Thr Leu Glu

130 135 140 145

Ala Val Glu Gln Phe Gly Gln Ala Asn Gly Tyr Pro Ile Ile Ile Lys Ala Ser Leu Gly Gly

150 155 160 165

Gly Gly Arg Gly Met Arg Ile Val Arg Ser Glu Ser Glu Val Lys Glu Ala Tyr Glu Arg Ala

170 175 180 185

Lys Ser Glu Ala Lys Ala Ala Phe Gly Asn Asp Glu Val Tyr Val Glu Lys Leu Ile Glu Asn

190 195 200 205 210

Pro Lys His Ile Glu Val Gln Val Ile Gly Asp Lys Gln Gly Asn Val Val His Leu Phe Glu

215 220 225 230

Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His Gln Lys Val Ile Glu Val Ala Pro Ser Val Ser Leu

235 240 245 250

Ser Pro Glu Leu Arg Asp Gln Ile Cys Glu Ala Ala Val Ala Leu Ala Lys Asn Val Asn Tyr

255 260 265 270

Ile Asn Ala Gly Thr Val Glu Phe Leu Val Ala Asn Asn Glu Phe Tyr Phe Ile Glu Val Asn

275 280 285 290

Pro Arg Val Gln Val Glu His Thr Ile Thr Glu Met Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Gln Thr

295 300 305 310 315

Gln Ile Leu Val Ala Gln Gly His Ser Leu His Ser Lys Lys Val Asn Ile Pro Glu Gln Lys

320 325 330 335

Asp Ile Phe Thr Ile Gly Tyr Ala Ile Gln Ser Arg Val Thr Thr Glu Asp Pro Gln Asn Asp

340 345 350 355

Phe Met Pro Asp Thr Gly Lys Ile Met Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Phe Gly Val Arg Leu

360 365 370 375

Asp Thr Gly Asn Ser Phe Gln Gly Ala Val Ile Thr Pro Tyr Tyr Asp Ser Leu Leu Val Lys

380 385 390 395

Leu Ser Thr Trp Ala Leu Thr Phe Glu Gln Ala Ala Ala Lys Met Val Arg Asn Leu Gln Glu

400 405 410 415 420

Phe Arg Ile Arg Gly Ile Lys Thr Asn Ile Pro Phe Leu Glu Asn Val Ala Lys His Glu Lys

425 430 435 440

Phe Leu Thr Gly Gln Tyr Asp Thr Ser Phe Ile Asp Thr Thr Pro Glu Leu Phe Asn Phe Pro

445 450 455 460

Lys Gln Lys Asp Arg Gly Thr Lys Met Leu Thr Tyr Ile Gly Asn Val Thr Val Asn Gly Phe

465 470 475 480

Pro Gly Ile Gly Lys Lys Glu Lys Pro Ala Phe Asp Lys Pro Leu Gly Val Lys Val Asp Val

485 490 495 500

Asp Gln Gln Pro Ala Arg Gly Thr Lys Gln Ile Leu Asp Glu Lys Gly Ala Glu Gly Leu Ala

505 510 515 520 525

Asn Trp Val Lys Glu Gln Lys Ser Val Leu Leu Thr Asp Thr Thr Phe Arg Asp Ala His Gln

530 535 540 545

Ser Leu Leu Ala Thr Arg Ile Arg Ser His Asp Leu Lys Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ala Ala

550 555 560 565

Leu Trp Pro Glu Leu Phe Ser Met Glu Met Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp Val Ala Tyr Arg

570 575 580 585

Phe Leu Lys Glu Asp Pro Trp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Arg Lys Glu Val Pro Asn Thr Leu

590 595 600 605

Phe Gln Met Leu Leu Arg Ser Ser Asn Ala Val Gly Tyr Thr Asn Tyr Pro Asp Asn Val Ile

610 615 620 625 630

Lys Glu Phe Val Lys Gln Ser Ala Gln Ser Gly Ile Asp Val Phe Arg Ile Phe Asp Ser Leu

635 640 645 650

Asn Trp Val Lys Gly Met Thr Leu Ala Ile Asp Ala Val Arg Asp Thr Gly Lys Val Ala Glu

655 660 665 670

Ala Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Asp Ile Leu Asp Lys Asn Arg Thr Lys Tyr Asp Leu Ala Tyr

675 680 685 690

Tyr Thr Ser Met Ala Lys Glu Leu Glu Ala Ala Gly Ala His Ile Leu Gly Ile Lys Asp Met

695 700 705 710

Ala Gly Leu Leu Lys Pro Gln Ala Ala Tyr Glu Leu Val Ser Ala Leu Lys Glu Thr Ile Asp

715 720 725 730 735

Ile Pro Val His Leu His Thr His Asp Thr Ser Gly Asn Gly Ile Tyr Met Tyr Ala Lys Ala

740 745 750 755

Val Glu Ala Gly Val Asp Ile Ile Asp Val Ala Val Ser Ser Met Ala Gly Leu Thr Ser Gln

760 765 770 775

Pro Ser Ala Ser Gly Phe Tyr His Ala Met Glu Gly Asn Asp Arg Arg Pro Glu Met Asn Val

780 785 790 795

Gln Gly Val Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Trp Glu Ser Val Arg Lys Tyr Tyr Ser Glu Phe Glu

800 805 810 815

Ser Gly Met Lys Ser Pro His Thr Glu Ile Tyr Glu His Glu Met Pro Gly Gly Gln Tyr Ser

820 825 830 835 840

Asn Leu Gln Gln Gln Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly Asp Arg Trp Asn Glu Val Lys Glu Met

845 850 855 860

Tyr Arg Arg Val Asn Asp Met Phe Gly Asp Ile Val Lys Val Thr Pro Ser Ser Lys Val Val

865 870 875 880

Gly Asp Met Ala Leu Tyr Met Val Gln Asn Asn Leu Thr Glu Lys Asp Val Tyr Glu Lys Gly

885 890 895 900

Glu Ser Leu Asp Phe Pro Asp Ser Val Val Glu Leu Phe Lys Gly Asn Ile Gly Gln Pro His

905 910 915 920

Gly Gly Phe Pro Glu Lys Leu Gln Lys Leu Ile Leu Lys Gly Gln Glu Pro Ile Thr Val Arg

925 930 935 940 945

Pro Gly Glu Leu Leu Glu Pro Val Ser Phe Glu Ala Ile Lys Gln Glu Phe Lys Glu Gln His

950 955 960 965

Asn Leu Glu Ile Ser Asp Gln Asp Ala Val Ala Tyr Ala Leu Tyr Pro Lys Val Phe Thr Asp

970 975 980 985

Tyr Val Lys Thr Thr Glu Ser Tyr Gly Asp Ile Ser Val Leu Asp Thr Pro Thr Phe Phe Tyr

990 995 1000 1005

Gly Met Thr Leu Gly Glu Glu Ile Glu Val Glu Ile Glu Arg Gly Lys Thr Leu Ile Val Lys

1010 1015 1020 1025

Leu Ile Ser Ile Gly Glu Pro Gln Pro Asp Ala Thr Arg Val Val Tyr Phe Glu Leu Asn Gly

1030 1035 1040 1045 1050

Gln Pro Arg Glu Val Val Ile Lys Asp Glu Ser Ile Lys Ser Ser Val Gln Glu Arg Leu Lys

1055 1060 1065 1070

Ala Asp Arg Thr Asn Pro Ser His Ile Ala Ala Ser Met Pro Gly Thr Val Ile Lys Val Leu

1075 1080 1085 1090

Ala Glu Ala Gly Thr Lys Val Asn Lys Gly Asp His Leu Met Ile Asn Glu Ala Met Lys Met

1095 1100 1105 1110

Glu Thr Thr Val Gln Ala Pro Phe Ser Gly Thr Ile Lys Gln Val His Val Lys Asn Gly Glu

1115 1120 1125 1130

Pro Ile Gln Thr Gly Asp Leu Leu Leu Glu Ile Glu Lys Ala

1135 1140 1145

<210>17

<211>1197

<212>DNA

<400>17

1atggcggtaa aagtagtgat gccaaaattg ggaatggcca tgaaacaagg ggaagtatcg 61

atatggaata aaaaagtagg cgacccggtt gaaaagggag aaagcattgc cagcattcaa 121

tcggagaaaa ttgaaatgga gatcgaagcg cctgaaaaag gaacgctgat cgatatcaaa 181

gtgaaagagg gagaagaggt tccgcccggc acagctatct gctatatcgg ggacgccaat 241

gagtcggtgc aggaagaggc gggggcgcct gttgctgaag acaatatgcc gcaagccgtc 301

cagcccgtca aacaagaaaa caaacccgca gcctccaaaa aagatcgaat gaaaatatct 361

ccagtcgcca ggaaaatagc agaaaaagca ggattagacc taaaacaact gaaaggaact 421

ggaccaggcg gacgaatcgt gaaggatgac gtaacaaagg ctcttgctga acagaaaaaa 481

gatcaagcaa agcctgtttc ggagcagaaa gcgcaggaaa tcccggtgac aggcatgaga 541

aaggtcatcg ctgcccgaat gcaggaaagc ctggcaaaca gcgcgcagct gacgatcacg 601

atgaaagctg atatcaccaa gcttgccact cttcaaaaac agctttcacc aactgcggaa 661

gagagatacg gcacaaaact gacgatcact cattttgtct caagagccgc cgttctcgct 721

ctgcaagctc accctgtgct gaacagcttt tatcaaaatg agcgcatcat cacacatccc 781

catgtgcacc ttggtatggc tgtagccttg gaaaatggct tagtggtgcc tgtcatccgc 841

catgctgaaa agctatcgct gattgaactg gctcaatcca tctcagaaaa tgccaaaaaa 901

gcacgcgagg gacgtgcggg aagcgaagaa ctgcaaggat ctactttctc cattacaaac 961

cttggcgcgt ttggagttga gcatttcaca ccgatactaa atccgccgga aacaggcatt 1021

ctcggcatcg gagcaagcta tgacacaccg gtgtatcaag gggaggagat cgtcagaagc 1081

acgatcctgc cactcagcct gacatttgat cacagagcgt gtgacggcgc ccctgccgct 1141

gcattcctga aggcgatgaa aacatatttg gaagaacccg cagcattaat tttatag 1197

<210>18

<211>398

<212>PRT

<400>18

Met Ala Val Lys Val Val Met Pro Lys Leu Gly Met Ala Met Lys Gln Gly Glu Val Ser Ile

5 10 15 20

Trp Asn Lys Lys Val Gly Asp Pro Val Glu Lys Gly Glu Ser Ile Ala Ser Ile Gln Ser Glu

25 30 35 40

Lys Ile Glu Met Glu Ile Glu Ala Pro Glu Lys Gly Thr Leu Ile Asp Ile Lys Val Lys Glu

45 50 55 60

Gly Glu Glu Val Pro Pro Gly Thr Ala Ile Cys Tyr Ile Gly Asp Ala Asn Glu Ser Val Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ala Gly Ala Pro Val Ala Glu Asp Asn Met Pro Gln Ala Val Gln Pro Val Lys Gln

85 90 95 100 105

Glu Asn Lys Pro Ala Ala Ser Lys Lys Asp Arg Met Lys Ile Ser Pro Val Ala Arg Lys Ile

110 115 120 125

Ala Glu Lys Ala Gly Leu Asp Leu Lys Gln Leu Lys Gly Thr Gly Pro Gly Gly Arg Ile Val

130 135 140 145

Lys Asp Asp Val Thr Lys Ala Leu Ala Glu Gln Lys Lys Asp Gln Ala Lys Pro Val Ser Glu

150 155 160 165

Gln Lys Ala Gln Glu Ile Pro Val Thr Gly Met Arg Lys Val Ile Ala Ala Arg Met Gln Glu

170 175 180 185

Ser Leu Ala Asn Ser Ala Gln Leu Thr Ile Thr Met Lys Ala Asp Ile Thr Lys Leu Ala Thr

190 195 200 205 210

Leu Gln Lys Gln Leu Ser Pro Thr Ala Glu Glu Arg Tyr Gly Thr Lys Leu Thr Ile Thr His

215 220 225 230

Phe Val Ser Arg Ala Ala Val Leu Ala Leu Gln Ala His Pro Val Leu Asn Ser Phe Tyr Gln

235 240 245 250

Asn Glu Arg Ile Ile Thr His Pro His Val His Leu Gly Met Ala Val Ala Leu Glu Asn Gly

255 260 265 270

Leu Val Val Pro Val Ile Arg His Ala Glu Lys Leu Ser Leu Ile Glu Leu Ala Gln Ser Ile

275 280 285 290

Ser Glu Asn Ala Lys Lys Ala Arg Glu Gly Arg Ala Gly Ser Glu Glu Leu Gln Gly Ser Thr

295 300 305 310 315

Phe Ser Ile Thr Asn Leu Gly Ala Phe Gly Val Glu His Phe Thr Pro Ile Leu Asn Pro Pro

320 325 330 335

Glu Thr Gly Ile Leu Gly Ile Gly Ala Ser Tyr Asp Thr Pro Val Tyr Gln Gly Glu Glu Ile

340 345 350 355

Val Arg Ser Thr Ile Leu Pro Leu Ser Leu Thr Phe Asp His Arg Ala Cys Asp Gly Ala Pro

360 365 370 375

Ala Ala Ala Phe Leu Lys Ala Met Lys Thr Tyr Leu Glu Glu Pro Ala Ala Leu Ile Leu

380 385 390 395 398

<210>19

<211>441

<212>DNA

<213>透明颤菌Vitreoscilla sp.C1

<400>19

1atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 61

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 121

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 181

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 241

attgcagtca aacattgtca agcaggcgtg gcagcagcgc attatccgat tgtcggtcaa 301

gaattgttgg gtgcgattaa agaagtattg ggcgatgccg caaccgatga cattttggac 361

gcgtggggca aggcttatgg cgtgattgca gatgtgttta ttcaagtgga agcagatttg 421

tacgctcaag cggttgaata a

Claims

1、一种具有生产L-谷氨酸能力的棒杆菌属(Corynebacterium)细菌，其特征是在该棒杆菌属细菌中导入了血红蛋白基因。

2、根据权利要求1所述的棒杆菌属细菌，其是具有生产L-谷氨酸能力的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

3、根据权利要求1或2所述的棒杆菌属细菌，其中所述的血红蛋白基因来自透明颤菌属(Vitreoscilia spp.)。

4、根据权利要求3所述的棒杆菌属细菌，其中所述微生物中L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增强。

5、根据权利要求4所述的棒杆菌属细菌，其中所述的L-谷氨酸生物合成反应的酶选自谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶或硫辛酸乙酰转移酶中的至少一种；优选的，所述的L-谷氨酸生物合成反应酶是谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶；更优选的，其中所述的L-谷氨酸生物合成反应酶是谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶和硫辛酸乙酰转移酶。

6、根据权利要求1-5任意一项所述的棒杆菌属细菌，该微生物中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。

7、根据权利要求6所述的棒杆菌属细菌，其中采用低能离子注入诱变方法使不生成L-谷氨酸化合物反应的酶的活性降低或缺乏。

8、根据权利要求6所述的棒杆菌属细菌，其中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶选自异柠檬酸裂解酶、苹果酸合成酶或硫辛酸琥珀酰转移酶中的至少一种，优选的，其中催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶是异柠檬酸裂解酶；或是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶；或是异柠檬酸裂解酶、苹果酸合成酶和硫辛酸琥珀酰转移酶。

9、根据权利要求8所述的棒杆菌属细菌，其中异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶被弱化处理的棒杆菌属细菌是保藏号为CGMCC No：2368和CGMCCNo：2366的菌株。

10、生产L-谷氨酸的方法，该方法包括在谷氨酸生产常用的液体培养基中培养权利要求1-9任意一项所述的棒杆菌属细菌，以在该培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从培养基中收集L-谷氨酸。