JP5319489B2 - アミノ酸産生の代謝工学 - Google Patents
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Description
(発明分野)
本発明は、微生物遺伝学および組み換えDNA技術の分野に関する。より具体的には、本発明は、アミノ酸の発酵産生に関する。本発明により、アミノ酸産生に有用な微生物、アミノ酸産生を向上させる方法、およびアミノ酸産生プロセスが提供される。
発酵によるアミノ酸産生は、糖密、酢酸およびエタノールなどの廉価な炭素源からの安価な産生を可能とする。Corynebacteriaがアミノ酸の工業生産に有用である(S.Kinoshitaら、Proceedings of the International Symposium on Enzyme Chemistry 2:464−468(1957))という認識に従って、発酵プロセスによるアミノ酸の商業生産が、変異株の分離を用いてより実施可能になった。アミノ酸産生の微生物プロセスで用いられる微生物を4つのクラスに分類し得る:野生型株、栄養要求性変異株、調節変異株および栄養要求性調節変異株(K.Nakayamaら、NUTRITIONAL IMPROVEMENT OF FOOD AND FEED PROTEINS、M.Friedman編、(1978)、pp.649−661)。発酵により産生されたアミノ酸の立体特異性は、合成プロセスと比較して、微生物プロセスによるアミノ酸産生を優位なプロセスとし;微生物プロセスにより産生されるアミノ酸は、通常L−型である。
(1)アミノ酸Xを産生する微生物Cであって、ここで該微生物Cは、以下の工程:
(a)デキストロースから該アミノ酸を収率Yパーセントで産生する親微生物Aを選択する工程;
(b)以下:
(i)ランダム化学変異誘発;および
(ii)ilvBNオペロンのrDNA変異誘発;
からなる群から選択される方法により、該親微生物Aを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(c)工程(b)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの1つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程;ならびに
(d)工程(c)から、収率Zパーセントでデキストロースから該アミノ酸Xを産生する少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、ここで該収率Zパーセントは、該収率Yパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法により得られる、微生物C。
(2) 項目1に記載の微生物Cであって、ここでアミノ酸Xは、以下:
(a)グリシン;
(b)アラニン;
(c)メチオニン;
(d)フェニルアラニン;
(e)トリプトファン;
(f)プロリン;
(g)セリン;
(h)トレオニン;
(i)システイン;
(j)チロシン;
(k)アスパラギン;
(l)グルタミン;
(m)アスパラギン酸;
(n)グルタミン酸;
(o)リジン;
(p)アルギニン;および
(q)ヒスチジン、
からなる群から選択される、微生物C。
(3) 微生物Aが、以下:
(a)Corynebacterium;
(b)Brevibacterium;および
(c)E.coli、
からなる群から選択される、項目2に記載の微生物C。
(4) 微生物Bが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目3に記載の微生物C。
(5) 工程(ii)の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目3に記載の微生物C。
(6) 工程(ii)の変異誘発が、ilvBNオペロンの部位特異的変異誘発である、項目3に記載の微生物C。
(7) 微生物Corynebacteriumの株であって、該株は、以下の特徴:
(a)分枝鎖アミノ酸イソロイシン、ロイシンおよびバリンの1つ以上についての栄養要求性またはブラディトローフ性;
(b)培地で培養される場合、以下:
(i)グリシン;
(ii)アラニン;
(iii)メチオニン;
(iv)フェニルアラニン;
(v)トリプトファン;
(vi)プロリン;
(vii)セリン;
(viii)トレオニン;
(ix)システイン;
(x)チロシン;
(xi)アスパラギン;
(xii)グルタミン;
(xiii)アスパラギン酸;
(xiv)グルタミン酸;
(xv)リジン;
(xvi)アルギニン;および
(xvii)ヒスチジン、
からなる群からら選択されるアミノ酸を産生すること;ならびに
(c)少なくとも30%である、デキストロースからの工程(b)のアミノ酸のパーセント収率を生じること、
を有する、株。
(8) 前記ilvBNオペロンにおける変異によりさらに特徴付けられる、項目7に記載の微生物。
(9) 前記ilvBNオペロン変異が、欠失、挿入または点変異である、項目8に記載の微生物。
(10) 前記ilvBNオペロン変異が、配列番号3または配列番号5の配列により特徴付けられる、項目9に記載の微生物。
(11) NRRL寄託番号B−30149の同定特徴を有する微生物Corynebacteriumの株。
(12) NRRL寄託番号B−30150の同定特徴を有する微生物Corynebacteriumの株。
(13) アミノ酸Xの産生を増加する方法であって、該方法は、以下:
(a)デキストロースから該アミノ酸を収率Yパーセントで産生する親微生物Aを選択する工程;
(b)以下:
(i)ランダム化学変異誘発;および
(ii)ilvBNオペロンのrDNA変異誘発;
からなる群から選択される方法により、該親微生物Aを変異誘発させて、微生物Bを産生させる工程;
(c)工程(b)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの1つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程;ならびに
(d)工程(c)から、収率Zパーセントでデキストロースから該アミノ酸Xを産生する少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、ここで該収率Zパーセントは、該収率Yパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法。
(14) 前記アミノ酸Xが、以下:
(a)グリシン;
(b)アラニン;
(c)メチオニン;
(d)フェニルアラニン;
(e)トリプトファン;
(f)プロリン;
(g)セリン;
(h)トレオニン;
(i)システイン;
(j)チロシン;
(k)アスパラギン;
(l)グルタミン;
(m)アスパラギン酸;
(n)グルタミン酸;
(o)リジン;
(p)アルギニン;および
(q)ヒスチジン、
からなる群から選択される、項目13に記載の方法。
(15) 前記微生物Aが、以下:
(a)Corynebacterium;
(b)Brevibacterium;および
(c)E.coli、
からなる群から選択される、項目14に記載の方法。
(16) 前記微生物Bが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目15に記載の方法。
(17) 工程(b)の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目15に記載の方法。
(18) 工程(b)の変異誘発が、ilvBNオペロンの部位特異的変異である、項目15に記載の方法。
(19) アミノ酸Xを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、以下:
(a)微生物Cを培地で培養する工程であって、ここで該微生物Cは、以下:
(i)デキストロースから収率Yパーセントの該アミノ酸を産生する親微生物Aを選択する工程;
(ii)以下:
(1)ランダム化学変異誘発;および
(2)ilvBNオペロンのrDNA変異誘発、
からなる群から選択される方法により、該親微生物Aを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(iii)工程(ii)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの1つ以上について栄養要求性である、工程;ならびに
(iv)工程(iii)から栄養要求性である少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、該微生物Cは、該アミノ酸Xをデキストロースから収率Yパーセントで産生する、工程、
を包含する方法により得られる、工程;
(b)該微生物Cから産生される該アミノ酸Xを回収する工程、
を包含する、プロセス。
(20) 前記アミノ酸Xが、以下:
(a)グリシン;
(b)アラニン;
(c)メチオニン;
(d)フェニルアラニン;
(e)トリプトファン;
(f)プロリン;
(g)セリン;
(h)トレオニン;
(i)システイン;
(j)チロシン;
(k)アスパラギン;
(l)グルタミン;
(m)アスパラギン酸;
(n)グルタミン酸;
(o)リジン;
(p)アルギニン;および
(q)ヒスチジン、
からなる群から選択される、項目19に記載のプロセス。
(21) 前記微生物Aが、以下:
(a)Corynebacterium;
(b)Brevibacterium;および
(c)E.coli、
からなる群から選択される、項目20に記載のプロセス。
(22) 前記微生物Bが、バリンおよびイソロイシンについて栄養要求性またはブラディトローフである、項目21に記載のプロセス。
(23) 前記工程(ii)の変異誘発が、ランダム化学変異誘発である、項目21に記載のプロセス。
(24) 前記工程(ii)の変異誘発が、ilvBnオペロンの部位特異的変異誘発である、項目21に記載のプロセス。
(本発明の要旨)
本発明の目的は、親株よりも非常に効率よく、グルコースを、L−イソロイシン、L−ロイシンおよびL−バリン以外のアミノ酸へ変換し得る微生物を提供することである。変換効率は次の式により定量され得る。
すなわち、[(g 産生されたアミノ酸/g 消費されたデキストロース)×100]=パーセント収率およびデキストロースからの収率として表される。
前記の一般的記述および次の詳細な記述は例示的であり、かつ例示のみであり、特許請求の範囲のとおりの本発明のさらなる説明を提供することを意図されることが理解されるべきである。
(1.定義)
明細書および特許請求の範囲の明確で矛盾のない理解を提供するために、これらの語が使われるべき範囲を含めて、次の定義を提供する。
[(g 産生されたアミノ酸/g 消費されたデキストロース)×100]=%収率、である。
本発明は、概して、炭素流動を非分枝鎖アミノ酸合成に向けるために、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性である微生物の作製を提供する。より具体的に、ロイシン、イソロイシンまたはバリンなどの、一つ以上の分枝鎖アミノ酸(例えば、イソロイシンおよびバリン)を必要とする特異的な栄養要求性表現型を選択するか、またはイソロイシン、ロイシンおよびバリン合成への炭素流量を減少させるilvBNオペロンにおける変異を設計することにより、この系の炭素流動を、他の代謝経路(例えば、L−リシン合成)で利用できるようにし得る。
(a)デキストロースから該アミノ酸を収率Yパーセントで産生する親微生物Aを選択する工程;
(b)以下:
(i)ランダム化学変異誘発;および
(ii)ilvBNオペロンのrDNA変異誘発;
からなる群から選択される方法により、該親微生物Aを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(c)工程(b)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの1つ以上について栄養要求性またはブラディトローフである、工程;ならびに
(d)工程(c)から、収率Zパーセントでデキストロースから該アミノ酸Xを産生する少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、ここで該収率Zパーセントは、該収率Yパーセントよりも大きい、工程、
を包含する方法。
Press,Cold Spring Harbor,New York(1972);J.H.Miller,A Short Course in Bacterial Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1992);M.Singer およびP.Berg,Genes &Genomes,University Science Books,Mill Valley,California(1991);J.Sambrook,E.F.Fritsch およびT.Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);P.B.Kaufmanら、Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine,CRC Press,Boca Raton,Florida(1995);Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,B.R. Glick およびJ.E.Thompson編、CRC Press,Boca Raton,Florida(1993);およびP.F.Smith−Keary,Molecular Genetics of Escherichia coli,The Guilford Press,New York,NY(1989)において説明されている。
本発明のある具体的で好適な実施形態により、L−イソロイシン、L−ロイシンおよびL−バリン生合成に共通の酵素的ステップの改変が、デキストロースからのL−リシンのパーセント収率を向上させ得ることを提供する。
本発明のその別の具体的な好適な実施形態は、分枝鎖アミノ酸の生合成に重要なタンパク質をコードするクローン化DNA配列のin vitroおよびin
vivo 変異誘発をもたらすために、組み換えDNA技術を利用する。次いで、分枝鎖アミノ酸合成に対して栄養要求性で、親株よりも高収率でデキストロースから非分枝鎖アミノ酸を産生する変異株を作製することを目的として、親株を改変するために変異されたDNAを使用し得る。
さらに、クローン化DNAのin vitro変異誘発を具体的に示す参考文献は、当業者により既知である。例えば、部位指向性変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、リンカースキャニング変異誘発、in vitroにおけるランダム化学的変異誘発、カセット変異誘発、PCR変異誘発およびその他の方法が、Directed Mutagenesis:A Practical
Approach,M.J.McPherson編、Oxford University Press,New York,(1991)において詳しく説明されている。
本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生を増加させる方法を提供する。本発明は、アミノ酸Xの産生を増加させる方法を広く提供する。その方法が以下:
(a)デキストロースから上記アミノ酸をパーセント収率Yで産生する親微生物Aを選択する工程;
(b)以下:
(i)ランダム化学的変異誘発;およひ
(ii)ilvBNオペロンのrDNA変異誘発
からなる群から選択される方法により、上記親微生物Aを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(c)工程(b)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、1つ以上の分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンについて栄養要求性である、工程;ならびに
(d)工程(c)から、パーセント収率Zでデキストロースから上記アミノ酸Xを産生する少なくとも1つの微生物Cを選択することであって、ここで上記パーセント収率Zは、上記パーセント収率Yよりも大きい、工程、
を包含する。
本発明のさらなる目的において、アミノ酸の産生のためのプロセスを提供する。本発明は、一般的にアミノ酸Xの産生のためのプロセスを提供し、これは以下を含む:
アミノ酸Xを産生するためのプロセスであって、上記プロセスは、以下:
(a)微生物Cを培地で培養する工程であって、ここで上記微生物Cは、以下の方法:
(i)デキストロースからパーセント収率Yの上記アミノ酸を産生する親微生物Aを選択すること;
(ii)以下:
(1)ランダム化学的変異誘発;および
(2)ilvBNオペロンのrDNA変異誘発、
からなる群から選択される方法により、上記親微生物Aを変異誘発して、微生物Bを産生させること;
(iii)工程(ii)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、上記微生物Bは、分枝鎖アミノ酸ロイシン、イソロイシンおよびバリンの1つ以上について栄養要求性である、こと;ならびに
(iv)工程(iii)から少なくとも1つの微生物Cを選択することであって、上記微生物Cは、上記アミノ酸Xをデキストロースからパーセント収率Zで産生し、ここで上記パーセント収率Zは、パーセント収率Yより大きい、こと;
により得られる、工程;ならびに
(b)上記微生物Cから産生される上記アミノ酸Xを回収する工程、
を包含する。
本発明の特に好適な実施形態において、親株は放射線処理、または化学物質処理による変異誘発を含むがそれに限定されない、ランダム変異誘発に供される。より特に好適な実施形態は、親株のランダム化学変異誘発に引き出される。
本発明の別の特に好適な実施形態は、親株のrDNA変異誘発を提供する。より特に好適な実施形態は、in vitroまたはin vivoにおけるilvBNオペロンのrDNA変異誘発に引き出される。変異誘発されたilvBNオペロンまたはそのフラグメントの変異された形態は、当業者に周知である相同的組み換え技術を介して野生型のilvBNオペロン配列と置き換えられ得る(実施例6を参照のこと)。
しかし、選択された親株またはクローン化されたDNA配列は、変異誘発され、その結果として生ずる子孫は分枝鎖アミノ酸合成(すなわち、ロイシン、イソロイシンまたはバリン)の栄養要求性に関してスクリーニングされ、そして選択される。そのような変異体の選択は当業者に周知である。特に好適な実施形態は、バリンおよびイソロイシンの生合成に対する栄養要求性株に引き出される。
最終的には、本発明のプロセスの微生物の選択は、選り抜きのアミノ酸の産生に依存する。デキストロースからのパーセント収率を決めるために、式[(g アミノ酸/L / g 消費されたデキストロース/L)]×100の式を利用し、所望する微生物が、選り抜きのアミノ酸のデキストロースからのパーセント収率が親株よりも高い点に基づいて選択される。
適切な炭素源の例示的な例には、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン加水分解産物、セルロース加水分解産物および糖蜜のような炭水化物;酢酸、プロピオン酸、ギ酸、リンゴ酸、クエン酸およびフマル酸のような有機酸;およびグリセロールのようなアルコールが含まれるが、その限りではない。
適切な窒素源の例示的な例としては、アンモニアガスおよび液体アンモニアを含むアンモニア;塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムのような無機酸または有機酸のアンモニウム塩;ならびに、肉抽出物、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解産物、ダイズ固形加水分解産物および酵母抽出物を含む他の窒素含有物が挙げられるがその限りではない。
(化学的変異誘発およびバリン栄養要求性株の選択)
リシン産生Corynebacterium株BF100を、Miller,J.H.1972 (Miller,J.H.1972 Experiments in Molecular Genetcs.Cold Spring Harbor Laboratory)で記載されているように、アルキル化剤により、変異誘発を行った。最小培地(MM)上にコロニーのレプリカを取った。MM上で増殖しなかったが完全培地(CM)で増殖したコロニーを栄養要求性株として同定した。L−バリンおよびL−イソロイシンを補給した場合MM上で成長可能なそれらの栄養要求性株を、リシン収率解析を行うために選択した。
(rDNA技術を用いた分枝鎖栄養要求性株の産生)
(1.欠損ilvB遺伝子の調製)
Corynebacterium lactofermentum(ATCC21799)のilvBNオペロンをPCRで増幅し、pAL203を作製するためにpCR−Scriptにクローニングした。ilvB遺伝子には、2つのEcoNI制限酵素部位により挟まれた390bpの領域が含まれる。EcoNIは、プラスミドpCR−Scriptを切断しない。EcoNIを用いてプラスミドpAL203を切断し、pAL203deltaを回収するようにセルフライゲーションさせることにより、ilvB欠損対立遺伝子を設計した。
二重交差による対立遺伝子交換のためのベクターを、Maloyら、1996(MaloyS.R.,Stewart V.J.,およびTaylor R.K.1996 Genetic Analysis of Pathogenic Bacteria:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)により記述されているように構築した。ATCC37766は、E.coli.中で複製するが、Corynebacterium中では複製しないプラスミド、pK184の元となるものであった。sacB遺伝子をpJC3に挿入するために、SspI部位にサブクローニングした。pJC3は、Corynebacterium中で複製し得ない。どのカナマイシン耐性コロニーも、相同的組み換えによりクローニングされた遺伝子内の部位に相同的組み換えを行うことにより染色体へ導入されたベクターを有する。導入されたベクターにおけるsacB遺伝子の致死発現により、スクロース存在下での成長が阻害される。スクロース存在下での成長には、クローニングされた挿入断片の相同的領域に沿って生じる第二の交差が必要とされる。第一および第二の交差が、改変(欠損、部位突然変異)に隣接する場合、ilvBNの改変対立遺伝子は、宿主株の染色体上に存在する対立遺伝子と交換される。
(ランダム化学的変異誘発により作製されたバリン栄養要求性株からの、L−リシン収率の震盪フラスコ培養による分析)
SM1プレートからシングルコロニーを拾い、SM1ブロスに移すことによりB4B種菌を調製した。SM1は、水1L中に、50gスクロース、3gK2HPO4、3g尿素、0.5gMgSO4,7H20、20gポリペプトン、5gビーフ抽出物、0.9mgD−ビオチン、3mgチアミン、125mgナイアシンアミド、0.5gL−メチオニン、0.25gL−スレオニン、0.5gララニンを混合して調製し、pH7.3に調整した。プレートには20g/Lの寒天が含まれていた。SM1ブロス中で成長培養を16時間行った後、等容量の30%グリセロールを添加し、培養液を−80Cにて凍結した。
ン、5g ビーフ抽出物、3mg D−ビオチン、125mg ナイアシンアミド、0.5g L―メチオニン、0.25g L−スレオニン、および0.5g L−アラニンで構成され、pH7.3に調整した。培養物は、30Cにて、16時間成長させ、240rpmで2インチの変位で通気した。種培養のうち2mlを、21mlの発酵培地(FM4)の播種に使用した。FM4培地は、16mlの主要培地と5mlのデキストロースストックを混合して調製した。デキストロースストックは、180g D−グルコースに500mlの水を添加して調製した。主要培地には、1L中に、0.083gのMnSO4、
0.4mg D−ビオチン、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、ラフィネートおよび50gのCaCO3が含まれていた。FM4の最終容量が4%の乾燥固体になるようにコーンスティープを添加した。FM4の最終容量が5%硫酸アンモニウムになるようにラフィネートを添加した。30Cにて、48時間、250mlのバッフル付き震盪フラスコで、培養物を成長させ、240rpmで2インチの変位で通気を行った。
(rDNA法により作製されたバリン栄養要求性株からの、L−リシン収率の震盪フラスコ測定)
表4にて、震盪フラスコ中での、ilvBNオペロンの染色体コピーから390塩基対のDNA配列のを欠失させることにより改善したCorynebacterium株によるL−リシン産生におけるデータを示す(実施例2参照)。培養物を成長させ、実施例3に記載のように分析した。
(バリン栄養要求性によるリシン収率の微小発酵測定)
2Lのバッフル付き震盪フラスコ中で、500mL SM1で、18時間、種菌を成長させた。3.1LのFM4培地を、4L 微小発酵槽で使用した。温度およびpHを、32Cおよび7.2にそれぞれ維持した。20時間の時点で、フラスコの撹拌を700rpmから950rpmに増加させた。4.5LPMで空気を供給した。デキストロースを、3g/Lになるように維持した。発酵時間は、48時間であった。
(クローン化ILVBNのIn Vivo変異誘発により産生されたブラディトローフによるL−リシン産生)
(1.機能的AHAS酵素を産生する、欠損型ilvBNオペロンの調製)
pVAL1を得るために、pAL203のilVBNオペロンを、シャトルベクターpM2にサブクローニングした。pM2は、E.coliおよびCorynebacteriumの両方で複製し得る。pValIを、Stratagene Co.の変異誘発株XL1REDに形質転換した。XL1REDキット説明書に従って、変異誘発プラスミドを調製し、バリン栄養要求性であるCorynebacteriumに対して電気穿孔法を行った。バリン栄養要求性株は、イソロイシンおよびバリン補給、または機能的ilnBNオペロンを用いた遺伝学的補足なしではMMプレート上で成長不可能である。
ilvBNオペロンのRV1B5漏出対立遺伝子を、導入ベクターpJC3にサブクローニングし、実施例2で行われたような相同的組み換えにより、バリン栄養要求性株において漏出対立遺伝子を欠損対立遺伝子に交換するために使用した。BF100−1030は、RV1B5対立遺伝子を用いて構築されたバリンブラディトローフ株である。表6にて、BF100−1030が震盪フラスコ中で、親株よりも少量しかバリンを産生しないことを表すデータを示す。表7にて、BF100−1030ブラディトローフ株が表5の栄養要求性株に対して改善した成長を有することを示す。表7にて、また、ブラディトローフにより、微小発酵において親株よりも少量のバリンしか産生しないことを示す。
次の表で示すデータは、実施例セクションで考察している。用語「成長」は、660nmで測定された光学密度をいい;用語「力価」は、1リットルあたりのアミノ酸のグラム数をいい;用語「収率」は、以下の式:[(g リシン/L/(g デキストロース消費/L]×100によって定義されること;B4B=化学的変異誘発により構築されたバリン栄養要求性株;LC10=染色体ilvB遺伝子を、pAL203ΔのilnB欠損対立遺伝子と置換することにより構築されたバリン栄養要求性株;BF100−1030=染色体ilnB遺伝子を、RV1B5漏出対立遺伝子と置換することにより構築されたバリンブラディトローフであることに注意すること。
Claims (11)
- NRRL寄託番号B−30150として寄託された微生物Corynebacteriumの株であって、ここで該株は、以下の特徴:
(a)バリンについてブラディトローフである;
(b)親株に存在しないilvBNオペロンの変異;ならびに
(c)デキストロースを含む培地にて発酵法によって培養される場合に、同じ発酵法によって培養された該親株よりも高いL−リシン力価、および、低いL−バリン力価を産生する、微生物Corynebacteriumの株。 - 発酵によってL−リシンを作製する方法であって、該方法は、以下の工程:
以下の特徴(a)および(b)を有する微生物Corynebacteriumの変異株を得る工程:
(a)該Corynebacteriumの親株に存在しないilvBNオペロンの変異であって、該変異株をバリンについてブラディトローフにさせる、ilvBNオペロンの変異;
(b)デキストロースを含む培地にて発酵法によって培養される場合に、該変異株が、同じ発酵法によって培養された該親株よりも高いL−リシン力価、および、低いL−バリン力価を産生する;
ならびに
発酵培地中で該変異Corynebacteriumを培養してL−リシンを産生させる工程
を包含する、方法。 - L−リシンの産生を増加させる方法であって、ここで該方法は、以下の工程:
(a)内因性ilvBNオペロンを含む親微生物Aを選択する工程;
(b)以下:
(i)ランダム化学変異誘発;および
(ii)該ilvBNオペロンの組換えDNA変異誘発;
からなる群より選択される方法により、該親微生物Aにおける該内因性ilvBNオペロンを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(c)工程(b)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、バリンについてブラディトローフである、工程;ならびに
(d)工程(c)から、少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、ここで微小発酵法において成長させる場合、該微生物Cは、該親微生物Aよりも高いL−リシン力価、および、低いL−バリン力価を産生する、工程、
を包含し、ここで、該親微生物Aは、CorynebacteriumおよびBrevibacteriumからなる群より選択される、方法。 - 工程(b)の変異誘発がランダム化学変異誘発である、請求項3に記載の方法。
- 工程(b)の変異誘発が前記ilvBNオペロンの部位特異的変異誘発である、請求項3に記載の方法。
- L−リシンを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程:
(a)培地中で微生物Cを培養する工程であって、ここで、該微生物Cは、以下:
(i)内因性ilvBNオペロンを含む親微生物Aを選択する工程;
(ii)以下:
(1)ランダム化学変異誘発;および
(2)該ilvBNオペロンの組換えDNA変異誘発;
からなる群より選択される方法により、該親微生物Aにおける該内因性ilvBNオペロンを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(iii)工程(ii)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、バリンについてブラディトローフである、工程;ならびに
(iv)工程(iii)から、少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、ここで微小発酵法において成長させる場合、該微生物Cは、該親微生物Aよりも高いL−リシン力価、および、低いL−バリン力価を産生する、工程;
を包含する方法によって得ることができる、工程;ならびに
(b)該微生物Cから産生されるL−リシンを回収する工程;
を包含し、ここで、該親微生物Aは、CorynebacteriumおよびBrevibacteriumからなる群より選択される、プロセス。 - 工程(ii)の変異誘発がランダム化学変異誘発である、請求項6に記載のプロセス。
- 工程(ii)の変異誘発が前記ilvBNオペロンの部位特異的変異誘発である、請求項6に記載のプロセス。
- L−リシンを産生する微生物を作製する方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)内因性ilvBNオペロンを含む親微生物Aを選択する工程;
(b)該親微生物Aにおける該内因性ilvBNオペロンを変異誘発して、微生物Bを産生させる工程;
(c)工程(b)から少なくとも1つの変異誘発された微生物Bを選択する工程であって、該微生物Bは、バリンについてブラディトローフである、工程;ならびに
(d)工程(c)から、少なくとも1つの微生物Cを選択する工程であって、ここで微小発酵法において成長させる場合、該微生物Cは、該親微生物Aよりも高いL−リシン力価、および、低いL−バリン力価を産生する、工程、
を包含し、ここで、該親微生物Aは、CorynebacteriumおよびBrevibacteriumからなる群より選択される、方法。 - 微生物Aがランダム化学変異誘発によって変異誘発される、請求項9に記載の方法。
- 微生物Aが前記ilvBNオペロンのrDNA変異誘発によって変異誘発される、請求項9に記載の方法。
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