JPS58893A - 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法Info
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- JPS58893A JPS58893A JP56098699A JP9869981A JPS58893A JP S58893 A JPS58893 A JP S58893A JP 56098699 A JP56098699 A JP 56098699A JP 9869981 A JP9869981 A JP 9869981A JP S58893 A JPS58893 A JP S58893A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、発酵法ｔこよるし一インロイシンの製造法
、ｔこ関する。
、ｔこ関する。
発酵法ｔこよりＬ−インロイシンを製造しようとする場
合、野性株は殆んど菌体外ｔこＬ−イソ・ロイシンを生
産しないので、野性株ｔこ人工的１こ突然変異を生起せ
しめてｂ−インロイシン生産能ヲ付与する方法がとられ
ている。
合、野性株は殆んど菌体外ｔこＬ−イソ・ロイシンを生
産しないので、野性株ｔこ人工的１こ突然変異を生起せ
しめてｂ−インロイシン生産能ヲ付与する方法がとられ
ている。
従来知られているし一インロインン生産能を有する人工
変異株とｂては、セラチア属のインロイシンヒドロキサ
メート耐性菌（特公昭５２−３０５（１３）、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのロイシン要求性菌（特公昭
４７−３８’１９５ ）、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属のα−７ミノーβ−ヒトルキシー吉
草酸（以下ｒ ＡＨＶ 」と記す。）耐性菌、ブレビバ
クテリウム株のＡＨＶ耐性かつリジン要求性菌（特公昭
５ｌ−６２３７）、ブレビバクテリウム属のＡ ’ＨＶ
と０−メチルスレオニンに耐性を有する菌株（特公昭５
ｌ−２１０７７）、コリネバクテリウム属の８−（２−
アミノエチル）−ンステイン耐性菌（特開昭５２−６１
２９０）、ニジ臣すヒア属の２−アミノ−３−メチルチ
オ酪酸耐性菌、ブレビバクテリウム属のＡＨＶとトリク
ロロアラニンに耐性を有する菌株（特開昭５４−３５２
８７）等が知られている。
変異株とｂては、セラチア属のインロイシンヒドロキサ
メート耐性菌（特公昭５２−３０５（１３）、コリネバ
クテリウム・グルタミクムのロイシン要求性菌（特公昭
４７−３８’１９５ ）、ブレビバクテリウム属及びコ
リネバクテリウム属のα−７ミノーβ−ヒトルキシー吉
草酸（以下ｒ ＡＨＶ 」と記す。）耐性菌、ブレビバ
クテリウム株のＡＨＶ耐性かつリジン要求性菌（特公昭
５ｌ−６２３７）、ブレビバクテリウム属のＡ ’ＨＶ
と０−メチルスレオニンに耐性を有する菌株（特公昭５
ｌ−２１０７７）、コリネバクテリウム属の８−（２−
アミノエチル）−ンステイン耐性菌（特開昭５２−６１
２９０）、ニジ臣すヒア属の２−アミノ−３−メチルチ
オ酪酸耐性菌、ブレビバクテリウム属のＡＨＶとトリク
ロロアラニンに耐性を有する菌株（特開昭５４−３５２
８７）等が知られている。
更１こ最近、アミノ酸生産菌の育種方法として、エシェ
リヒア属微生物ニよるし一スレオニン生産（特開昭５５
−１３１３９７）、エシェリヒア属微生物ｅこよるし一
リジン生産（特開昭５６−１８５９６）、ア属微生物に
よるし一ヒスチジン生産（特開昭５６−５０９９）ｔこ
みられるよう１こ、プラスミドｅこアミノ酸生合成系遺
伝子を連結し、これを菌体内で発現させる−１いわゆる
遺伝子組換え技術により、アミノ酸の生産量を増大させ
る方法が報告された。
リヒア属微生物ニよるし一スレオニン生産（特開昭５５
−１３１３９７）、エシェリヒア属微生物ｅこよるし一
リジン生産（特開昭５６−１８５９６）、ア属微生物に
よるし一ヒスチジン生産（特開昭５６−５０９９）ｔこ
みられるよう１こ、プラスミドｅこアミノ酸生合成系遺
伝子を連結し、これを菌体内で発現させる−１いわゆる
遺伝子組換え技術により、アミノ酸の生産量を増大させ
る方法が報告された。
本発明者らは前述のようなもともと高いし一インロイン
ン生産能を有するブレビバクテリウム属及びコＩＪ ４
バクテリウム属の微生物の変異株を、Ｆ述の遺伝子組換
え技術な甫いてより生産性の高い菌株１こ改良すべく研
究したところ、ついに、コリネバクテリウム属又はブレ
ビバクテリウム属の微生物より得たイソロイシンアンタ
ゴニスト耐性ｔこ開学する染色体遺伝子領域が組み込ま
れているコリネバクテリウム属又はプレビバクナリウム
属微生物由来のプラスミドを含有するプレビバクテリム
属の微生物が従来の人工変異株より高い効率でＬ−イン
ロイシンを生産することを知った。
ン生産能を有するブレビバクテリウム属及びコＩＪ ４
バクテリウム属の微生物の変異株を、Ｆ述の遺伝子組換
え技術な甫いてより生産性の高い菌株１こ改良すべく研
究したところ、ついに、コリネバクテリウム属又はブレ
ビバクテリウム属の微生物より得たイソロイシンアンタ
ゴニスト耐性ｔこ開学する染色体遺伝子領域が組み込ま
れているコリネバクテリウム属又はプレビバクナリウム
属微生物由来のプラスミドを含有するプレビバクテリム
属の微生物が従来の人工変異株より高い効率でＬ−イン
ロイシンを生産することを知った。
即ちこの発明は、・コリネバクテリウム属又はブレビバ
クテリウム属の微生物より得たインロイシンアンタゴニ
スト耐性に関与する染色体遺伝子領域が組み込まれてい
るコリネバクテリウム属又はプレヒハクテリウム属微生
物由来のプラスミドを含有ｔ、Ｌ−インロインン生産能
を有するコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム
属の微生物を培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−イソ
ロイシンを採取することを特徴とする発酵法によるし一
インロインンの製造法である、。
クテリウム属の微生物より得たインロイシンアンタゴニ
スト耐性に関与する染色体遺伝子領域が組み込まれてい
るコリネバクテリウム属又はプレヒハクテリウム属微生
物由来のプラスミドを含有ｔ、Ｌ−インロインン生産能
を有するコリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム
属の微生物を培養し、培地中に生成蓄積されたＬ−イソ
ロイシンを採取することを特徴とする発酵法によるし一
インロインンの製造法である、。
インロイシンアンタゴニスト耐性ｔこ関する染色体遺伝
子領域の供与菌は、コリネバクテリウム属又はブレビバ
クテリウム属の微生物のインロイシンアンタゴニスト耐
性株を用いればどのようなものでもよいが、耐性の程度
がより高いものを用いれば、より望ましい結果が得られ
る。又多くの場合、Ｌ−トリプトファン生産能がより高
いものを遺伝子供与菌として用いれば、よりよい結果が
得られる。
子領域の供与菌は、コリネバクテリウム属又はブレビバ
クテリウム属の微生物のインロイシンアンタゴニスト耐
性株を用いればどのようなものでもよいが、耐性の程度
がより高いものを用いれば、より望ましい結果が得られ
る。又多くの場合、Ｌ−トリプトファン生産能がより高
いものを遺伝子供与菌として用いれば、よりよい結果が
得られる。
これらのほか、更ｔこＤＮＡ供与菌は、いわゆるコリネ
ホルムグルタミン酸生産菌にＡＨｖ耐性を付与すること
により容易に得られや。コリネホルムグルタミン酸生産
菌としては以下のものが知られている。
ホルムグルタミン酸生産菌にＡＨｖ耐性を付与すること
により容易に得られや。コリネホルムグルタミン酸生産
菌としては以下のものが知られている。
ブレビバクテリウム・デイバリカタム Ａ
ＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１３８２６ブレビバクテリウム
・イムマリオフイラム ＡＴＣＣ１４０６８ブ
レビ／ζクテリウム・ラクトファーメンタム Ａ
ＴＣＣ１３８６９ブレビバクテリウム・ロゼラム
ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム
ーサツカロリイテイカム ＡＴＣＣ１４０６６プ
レビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴ
ＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・アセトアンドフイ
ラム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・
アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６コリ
ネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣ
Ｃ１５９９１コリネバクテリウム・ リウム
ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム争メ
ラセコラ ＡＴＣＣ１７９６５コリネ
バクテリウム・グルタミン酸 ＡＴＣＣ
１３０３２インロイシンアンタゴニストは、ブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属の微生物の増殖を
抑制するが、その抑制は、Ｌ−インロイシンが培地中に
共存すれば、全体的又は部分的に解除されるようなもの
である。具体的には、ＡＨＶ。
ＴＣＣ１４０２０ブレビバクテリウム・フラバム
ＡＴＣＣ１３８２６ブレビバクテリウム
・イムマリオフイラム ＡＴＣＣ１４０６８ブ
レビ／ζクテリウム・ラクトファーメンタム Ａ
ＴＣＣ１３８６９ブレビバクテリウム・ロゼラム
ＡＴＣＣ１３８２５ブレビバクテリウム
ーサツカロリイテイカム ＡＴＣＣ１４０６６プ
レビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴ
ＣＣ１９２４０コリネバクテリウム・アセトアンドフイ
ラム ＡＴＣＣ１３８７０コリネバクテリウム・
アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６コリ
ネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣ
Ｃ１５９９１コリネバクテリウム・ リウム
ＡＴＣＣ１５９９０コリネバクテリウム争メ
ラセコラ ＡＴＣＣ１７９６５コリネ
バクテリウム・グルタミン酸 ＡＴＣＣ
１３０３２インロイシンアンタゴニストは、ブレビバク
テリウム属及びコリネバクテリウム属の微生物の増殖を
抑制するが、その抑制は、Ｌ−インロイシンが培地中に
共存すれば、全体的又は部分的に解除されるようなもの
である。具体的には、ＡＨＶ。
α−アミノ酪酸、イソロイシンヒドロキサメート、チア
イソロインン、２−チアゾールアラニン、β−ヒドロキ
ノロインン、０−メチルスレオニン等がある。
イソロインン、２−チアゾールアラニン、β−ヒドロキ
ノロインン、０−メチルスレオニン等がある。
ベクターＤＮＡとしては、上記ブレビバクテリウム属又
はコリネバクテリウム属のコリネホルムグルタミン酸生
産菌又はそれらの変異株より得られるプラスミド及びこ
れらプラスミドの誘導体が使用できる。
はコリネバクテリウム属のコリネホルムグルタミン酸生
産菌又はそれらの変異株より得られるプラスミド及びこ
れらプラスミドの誘導体が使用できる。
ＤＮＡ受容菌としては、上記ブレビバクテリウム属又は
コリネバクテリウム属のコリネホルムグルタミン酸生産
菌がそのまま使用できるが、これらコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌より得られたし一インロインン生産菌を用
いるのが望ましい。
コリネバクテリウム属のコリネホルムグルタミン酸生産
菌がそのまま使用できるが、これらコリネホルムグルタ
ミン酸生産菌より得られたし一インロインン生産菌を用
いるのが望ましい。
特に、Ｌ−インロイシン要求菌をＤＮＡ受容菌として用
いれば、Ｌ−イソロイシン１こ形質転換された株（Ｌ−
スレオニン生産菌）を選択する際１こ好都合である。Ｌ
−スレオニン生産菌をＤＮＡ受容菌として用いる場合に
は、よりＬ−インロイノンの生産能が高い菌株を用いる
のが望ましい。又Ｌ−インロイシン要求菌をＤＮＡ受容
菌として用いる場合にも、よりＬ−イソロイシンの生産
能が高い菌株より誘導したものを用いるのが望ましい。
いれば、Ｌ−イソロイシン１こ形質転換された株（Ｌ−
スレオニン生産菌）を選択する際１こ好都合である。Ｌ
−スレオニン生産菌をＤＮＡ受容菌として用いる場合に
は、よりＬ−インロイノンの生産能が高い菌株を用いる
のが望ましい。又Ｌ−インロイシン要求菌をＤＮＡ受容
菌として用いる場合にも、よりＬ−イソロイシンの生産
能が高い菌株より誘導したものを用いるのが望ましい。
ＤＮＡ供与菌より染色体ＤＮＡを抽出する方法は、通常
の方法が使用できる。抽出された染色体ＤＮＡはついで
制限酵素で切断される（ Ｂｉｏｃｈｅｍ。
の方法が使用できる。抽出された染色体ＤＮＡはついで
制限酵素で切断される（ Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ３８３ ：４６７（１
９７５） ） 、制限酵素は、切断を部分的に行なえば
多くのものが使用できる。
９７５） ） 、制限酵素は、切断を部分的に行なえば
多くのものが使用できる。
ベクターＤＮＡについても制限酵素によって切断され、
上記の切断された染色体ＤＮＡとりガーゼｔこよる連結
反応が行なわれる、連結反応は、ターミナルトラメスフ
ェラーゼｔこまり、切断された染色体ＤＮＡ及びベクタ
ーＤＮＡにそれぞれデオキシアデニル酸及びチミジル酸
、又はデオキシグアニル酸及びデオキシシチジル酸を付
加せしめ、ついでこれらが付加された染色体ＤＮＡとベ
クターＤＮＡを７二−リング（ａｎｎｅａｌ ｉｎｇ
）せしめてもよい。
上記の切断された染色体ＤＮＡとりガーゼｔこよる連結
反応が行なわれる、連結反応は、ターミナルトラメスフ
ェラーゼｔこまり、切断された染色体ＤＮＡ及びベクタ
ーＤＮＡにそれぞれデオキシアデニル酸及びチミジル酸
、又はデオキシグアニル酸及びデオキシシチジル酸を付
加せしめ、ついでこれらが付加された染色体ＤＮＡとベ
クターＤＮＡを７二−リング（ａｎｎｅａｌ ｉｎｇ
）せしめてもよい。
かくして得られた組換えＤＮＡを、組換えプラスミドを
宿主細胞内へ移入する方法としては、Ｅ、 ｃｏｌｔ
Ｋ−１２で報告されているように低温のもとで菌を塩
化カルシウムで処理して菌膜の透過性を増大せしめ、プ
ラスミドを移入する方法（Ｍａｎｄｅｌ、 Ｍ ａｎｄ
Ｈ４ｇａ＋ Ａ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． ＢｉｏＪ、。
宿主細胞内へ移入する方法としては、Ｅ、 ｃｏｌｔ
Ｋ−１２で報告されているように低温のもとで菌を塩
化カルシウムで処理して菌膜の透過性を増大せしめ、プ
ラスミドを移入する方法（Ｍａｎｄｅｌ、 Ｍ ａｎｄ
Ｈ４ｇａ＋ Ａ、、 Ｊ、 Ｍｏ１． ＢｉｏＪ、。
ｇａ、 １５９（１９７０））、枯草菌で報告されて
いるようｔこ増殖のある段階で、自然にプラスミドを取
り込みやすくなること（いわゆるコンピーテントな状態
）を利用して、プラスミドを移入する方法（Ｄｕｎｃａ
ｎ、 Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ
Ｙｏｕｎｇ。
いるようｔこ増殖のある段階で、自然にプラスミドを取
り込みやすくなること（いわゆるコンピーテントな状態
）を利用して、プラスミドを移入する方法（Ｄｕｎｃａ
ｎ、 Ｃ，Ｈ，、Ｗｉｌｓｏｎ、 Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ
Ｙｏｕｎｇ。
Ｆ、 Ｅ、、 Ｇｅｎｅ、上、１５３（１９７７）更に
は枯草菌、放線菌、酵母の報告にあるように細胞をプロ
トプラスト又はスフェロプラスト１こしてプラスミドを
移入する方法（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ
＋ Ｓ、 Ｎ、ｌＭｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ
、＋ 工６８． １１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ、Ｍ
、Ｊ、、Ｗａｒｄ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄＨｏｐｗｏｏｄ＋Ｄ
、Ａ、＋Ｎａｔｕｒ、ｅ＋ ２工４ 、 ３９８（１
９７８） ＋ Ｈｉｎｎｅｎ、 Ａ、。
は枯草菌、放線菌、酵母の報告にあるように細胞をプロ
トプラスト又はスフェロプラスト１こしてプラスミドを
移入する方法（Ｃｈａｎｇ、 Ｓ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ
＋ Ｓ、 Ｎ、ｌＭｏ１ｅｃ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ
、＋ 工６８． １１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ、Ｍ
、Ｊ、、Ｗａｒｄ、Ｊ、Ｍ、ａｎｄＨｏｐｗｏｏｄ＋Ｄ
、Ａ、＋Ｎａｔｕｒ、ｅ＋ ２工４ 、 ３９８（１
９７８） ＋ Ｈｉｎｎｅｎ、 Ａ、。
Ｈｉｃｋａ、 Ｊ、 Ｂ、 ａｎｄ Ｆｉｎｋ
、Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
、Ｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、＋ ＵＳＡ−二、 １９２９（１
９７８）等が知られている。
９７８）等が知られている。
Ａ）ＩＶ耐性に関与する遺伝情報が組み込まれているプ
ラスミドを細胞に移入せしめる方法としては、上記の塩
化カルシウム処理１こよる方法を用いたが、細胞をプロ
トプラスト化してプラスミドを移入する方法等も用いる
ことが可能である。
ラスミドを細胞に移入せしめる方法としては、上記の塩
化カルシウム処理１こよる方法を用いたが、細胞をプロ
トプラスト化してプラスミドを移入する方法等も用いる
ことが可能である。
形質転換株のうちより、Ｌ−イソロイシン生産能を有し
、インロイシンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領
域が組み込まれているプラスミドを含有する形質転換株
を選択するりこは、例えば、ＤＮＡ受容菌として、Ｌ−
インロイシン要求菌ヲ用い、Ｌ−インロイシンを含まず
ＤＮＡ受容菌の生育が抑制されるような量のイソロイシ
ンを含む培地中又は培地上に生育しうるような菌株を選
別すればよい。又ベクターＤＮＡ上のマーカーとして用
いることができる形質を併せもつ菌株を選別できるよう
な培地を用いれば、より選別が容易である。
、インロイシンアンタゴニスト耐性に関与する遺伝子領
域が組み込まれているプラスミドを含有する形質転換株
を選択するりこは、例えば、ＤＮＡ受容菌として、Ｌ−
インロイシン要求菌ヲ用い、Ｌ−インロイシンを含まず
ＤＮＡ受容菌の生育が抑制されるような量のイソロイシ
ンを含む培地中又は培地上に生育しうるような菌株を選
別すればよい。又ベクターＤＮＡ上のマーカーとして用
いることができる形質を併せもつ菌株を選別できるよう
な培地を用いれば、より選別が容易である。
このようにして一旦選別されたインロイシンアンタゴニ
スト耐性ｅこ関与する遺伝子領域が組ゐ込まれている組
換えプラスミドは、Ｌ）ＮＡ受容菌より抽出後他のＤＮ
Ａ受容菌、例えばし−インロイシン生産能を有するＤＮ
Ａ受容菌１こ導入することができる。
スト耐性ｅこ関与する遺伝子領域が組ゐ込まれている組
換えプラスミドは、Ｌ）ＮＡ受容菌より抽出後他のＤＮ
Ａ受容菌、例えばし−インロイシン生産能を有するＤＮ
Ａ受容菌１こ導入することができる。
かくして得られたＬ−インロイシン生産菌を培養する方
法は、従来のし一イソロイシン生産菌の培養方法と特ｅ
こ変らない。即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無
機イオン、更ｔこ必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常のものである。炭素源とし
ては、グルコース及びシュクロース、並びにこれらを含
有する澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物、酢酸等の有
機酸、エタノール等のアルコールが用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩、尿素等が使用できる。
法は、従来のし一イソロイシン生産菌の培養方法と特ｅ
こ変らない。即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無
機イオン、更ｔこ必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有
機微量栄養素を含有する通常のものである。炭素源とし
ては、グルコース及びシュクロース、並びにこれらを含
有する澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物、酢酸等の有
機酸、エタノール等のアルコールが用いられる。窒素源
としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウ
ム塩、尿素等が使用できる。
培養方法ｅこおいても、従来知られている通常のＬ−イ
ソロイシンの発酵法ｔこ使用されている方法がそのまま
適用できるっ培養は、実質的にＬ−イソロイシンの生成
蓄積が停止するまで行われる。
ソロイシンの発酵法ｔこ使用されている方法がそのまま
適用できるっ培養は、実質的にＬ−イソロイシンの生成
蓄積が停止するまで行われる。
かくして培養液中には著量のＬ−イソロイシンが生成蓄
積される。培養液よりＬ−インロイシンを採取するｅこ
は通常の方法が適用できる。本発明の微生物を用いるこ
と？こより、ＤＮＡ供与菌を用いる場合に比べ、高い収
率でＬ−イソロイシンを得ることができる。
積される。培養液よりＬ−インロイシンを採取するｅこ
は通常の方法が適用できる。本発明の微生物を用いるこ
と？こより、ＤＮＡ供与菌を用いる場合に比べ、高い収
率でＬ−イソロイシンを得ることができる。
実施例１
（１） 染色体ＤＮＡの調製
コリネバクテリウム番グルタミクムＡＪ１１５６０（Ｆ
ＥＲＭ−Ｐ５４８５ ） より誘導したインロイシン
生産能を有するＡＩ（Ｖ耐性株Ａｌｌを１ｅのＣＭＧ培
地（ペプトンｘｙ／ｄｌ、酵母エキス１ｔ／ｄ１１グル
コース０．５ｆ／ｄｉ及びＮａＣｌ Ｏ，５ｔ／ｄｉ
な含み、ｐｌ（７，２に調整したもの）を用い、３０
Ｃ”ｔ！約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を
集めた１、この菌体よりフェノール法ニよる通常のＤＮ
Ａ抽出法１こよって染色体ＤＮＡを抽出精製し、最終ｏ
、ｓｍｇのＤＮＡを得た。
ＥＲＭ−Ｐ５４８５ ） より誘導したインロイシン
生産能を有するＡＩ（Ｖ耐性株Ａｌｌを１ｅのＣＭＧ培
地（ペプトンｘｙ／ｄｌ、酵母エキス１ｔ／ｄ１１グル
コース０．５ｆ／ｄｉ及びＮａＣｌ Ｏ，５ｔ／ｄｉ
な含み、ｐｌ（７，２に調整したもの）を用い、３０
Ｃ”ｔ！約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を
集めた１、この菌体よりフェノール法ニよる通常のＤＮ
Ａ抽出法１こよって染色体ＤＮＡを抽出精製し、最終ｏ
、ｓｍｇのＤＮＡを得た。
尚、コリネバクテリウム−グルタミクムＡＪ１１５−６
０は、本発明の目的Ｖこかなう菌株としてスクリーニン
グした結果得られたものであり、重曹の同定をバーデー
ス・マニュアル・オブ・デタミネイテ仁かバタテリオロ
ジー第８版（１９７４）で行うと、コリネバクテリウム
属のセクンヨ７■に属するものと認定される。しかし、
セクション■では菌種名のみ記載されていて、菌学的性
状は記載されておらず、本検索書での重曹の同定は不可
能であった。
０は、本発明の目的Ｖこかなう菌株としてスクリーニン
グした結果得られたものであり、重曹の同定をバーデー
ス・マニュアル・オブ・デタミネイテ仁かバタテリオロ
ジー第８版（１９７４）で行うと、コリネバクテリウム
属のセクンヨ７■に属するものと認定される。しかし、
セクション■では菌種名のみ記載されていて、菌学的性
状は記載されておらず、本検索書での重曹の同定は不可
能であった。
そこで重曹の菌学的性状をセクションｍ１こ記載されて
いる菌種の原著の報告と比較して同定を行った。その結
果、ｒ Ｂｕｌｌ、 Ａｇｒ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ。
いる菌種の原著の報告と比較して同定を行った。その結
果、ｒ Ｂｕｌｌ、 Ａｇｒ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ。
Ｊａｐａｎ 、ヱユ、 １７６〜１８５（１９５８）Ｊ
及び［Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ａｐｐｌ、 Ｍｌｃｒｏｂｉｏ
ｌ、、 工ｊ、２７９〜３０１（１９６７’）ｊｒこ
記載されているコリネバクテリウム・グル１タミクムと
同定された。
及び［Ｊ、 Ｇｅｎ、 Ａｐｐｌ、 Ｍｌｃｒｏｂｉｏ
ｌ、、 工ｊ、２７９〜３０１（１９６７’）ｊｒこ
記載されているコリネバクテリウム・グル１タミクムと
同定された。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ベクターとしてプラスミドの１種ｐＡＭ ２８６（分子
量３ Ｘ １１１・ダルトノ）のＤＮＡを次のよう會こ
して調製した。まず、ｐＡＭ Ｚ ８６をプラスミドと
して保有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ１
１５６０を１ｇのＣＭＧ培地培地液種し、３０ｔＴで対
数後期まで培養したのち、リゾチーム−８ＤＳ処理Ｖコ
よって溶菌させ、３０，０ＯＯＸｒ。
量３ Ｘ １１１・ダルトノ）のＤＮＡを次のよう會こ
して調製した。まず、ｐＡＭ Ｚ ８６をプラスミドと
して保有するコリネバクテリウム・グルタミクムＡＪ１
１５６０を１ｇのＣＭＧ培地培地液種し、３０ｔＴで対
数後期まで培養したのち、リゾチーム−８ＤＳ処理Ｖコ
よって溶菌させ、３０，０ＯＯＸｒ。
３０分の超遠心１こより上清を得た。これよりプラスミ
ドＤＮＡを濃縮後、アガロースゲルを気泳動法によって
最終６０μｔのｐＡＭ２８６プラスミドＤＮＡを分画採
取した。
ドＤＮＡを濃縮後、アガロースゲルを気泳動法によって
最終６０μｔのｐＡＭ２８６プラスミドＤＮＡを分画採
取した。
〈３） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で
得た染色体ＤＮＡ １０μＶをとり、制限エンドヌクレ
アーゼＢｃｌ ｌを与え、３７ｒで１０分、３０分、又
は６０分反応させ、ＤＮＡ鎖を種々の程度ｔこ切断した
。（２）で得たベクターＤＮＡの場合は５μ９をとり、
６０分反応させ、完全Ｖこ切断せしめた。 ６５ ＩＴ
、５分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びレチ
オスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼ１こよって１０Ｃ１２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を
行った３、６５Ｃ１５分の熱処理後、反応液１こ２倍容
のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採
取した。
得た染色体ＤＮＡ １０μＶをとり、制限エンドヌクレ
アーゼＢｃｌ ｌを与え、３７ｒで１０分、３０分、又
は６０分反応させ、ＤＮＡ鎖を種々の程度ｔこ切断した
。（２）で得たベクターＤＮＡの場合は５μ９をとり、
６０分反応させ、完全Ｖこ切断せしめた。 ６５ ＩＴ
、５分の熱処理後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びレチ
オスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼ１こよって１０Ｃ１２４時間ＤＮＡ鎖の連結反応を
行った３、６５Ｃ１５分の熱処理後、反応液１こ２倍容
のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈澱採
取した。
（４） プラスミド１こよる形質転換ブリネバクテリ
ウム拳グルタミクムＡＪ１１５６０（ＦＥＲＭ−Ｐ５４
８５ ） よりＬ−インロイシン要求性変異株１６１
４４を誘導し、この菌株をＣＭＧ培地２０ｍ１ｔこ接種
し、０．６ Ａ６．。／ ａｔｅまで増殖した菌を遠心
して集菌した。菌体を氷冷下でＯ，Ｗ ＭｇＣ１゜にけ
ん濁し、菌体を集めた。次に菌体な、氷冷下。
ウム拳グルタミクムＡＪ１１５６０（ＦＥＲＭ−Ｐ５４
８５ ） よりＬ−インロイシン要求性変異株１６１
４４を誘導し、この菌株をＣＭＧ培地２０ｍ１ｔこ接種
し、０．６ Ａ６．。／ ａｔｅまで増殖した菌を遠心
して集菌した。菌体を氷冷下でＯ，Ｗ ＭｇＣ１゜にけ
ん濁し、菌体を集めた。次に菌体な、氷冷下。
０ 、 Ｉ Ｍ ＣａＣｌ２５ Ｎ’に懸濁して、ｏｃ
ｔこ２０分間時々振りながら保った。ついで菌体を集め
た後、少量の０．１ Ｍ ＣａＣ１，に懸濁した。
ｔこ２０分間時々振りながら保った。ついで菌体を集め
た後、少量の０．１ Ｍ ＣａＣ１，に懸濁した。
以上の操作ｔこまり、コンビ−チンドナ（Ｄ Ｎ Ａ取
り込み能を有する）細胞を得た。
り込み能を有する）細胞を得た。
この細胞懸濁液に（３１で得たＤＮＡの溶解液を加え、
ＤＮＡを細胞内ｔこ取り込ませた。この反応液を最少培
地プレート（グルコース２０ｆ、硫安１０Ｆ、尿素２．
５？、ＫＨ，Ｐｏ、 １．Ｏｒ 。
ＤＮＡを細胞内ｔこ取り込ませた。この反応液を最少培
地プレート（グルコース２０ｆ、硫安１０Ｆ、尿素２．
５？、ＫＨ，Ｐｏ、 １．Ｏｒ 。
ＭｇＳＯ４−７Ｈ，ＯＯ，４Ｆ、ビオチン５０μ？、チ
アミノ塩酸塩２００ｐ？、Ｆｅ５０４０７Ｈ２００，０
１ノ、ＭｎＳＯ４ユ４Ｈ２００，０１？及びＡ ＨＶ
１ 、ＯｖＩｇ／ｍｌを１ｅの脱イオン水１こ溶解し、
ｐＨ７，０に調整１−′だものを基本最少培地とし、こ
れに寒天２チを加えて殺菌した固形培地）？こ塗抹し、
３７Ｃで４日間培養した。生じたコロニーを釣菌、純化
後ｐＡＭ２８６１ｎＡＨＶ耐性で、かつＬ−イソロイる
形質転換株として保存した。
アミノ塩酸塩２００ｐ？、Ｆｅ５０４０７Ｈ２００，０
１ノ、ＭｎＳＯ４ユ４Ｈ２００，０１？及びＡ ＨＶ
１ 、ＯｖＩｇ／ｍｌを１ｅの脱イオン水１こ溶解し、
ｐＨ７，０に調整１−′だものを基本最少培地とし、こ
れに寒天２チを加えて殺菌した固形培地）？こ塗抹し、
３７Ｃで４日間培養した。生じたコロニーを釣菌、純化
後ｐＡＭ２８６１ｎＡＨＶ耐性で、かつＬ−イソロイる
形質転換株として保存した。
これらの形質転換株のうちより、よりＬ−インロイシン
の高いＡＪ１１６．８６（ＦＥＲＭ−Ｐ４Ｏ１０）を得
た。
の高いＡＪ１１６．８６（ＦＥＲＭ−Ｐ４Ｏ１０）を得
た。
菌と比較してし一インロイシンの生産性を調べた。
結果を第１表ｔこ示す。培養はグンレコース１０９／ｌ
ｉｅ、硫酸７７ モ、＝−ウＡ ３．Ｏｆ ／ｄｉ、Ｋ
Ｉ（、ＰＯ４０，１ｆ／ｄｉ、ＭｇＳＯ４−７Ｆｌ、Ｏ
Ｏ，０４ｆ／ｄｅ１ＦｅＳＯ４”７Ｈ，０１，Ｏｙｒｇ
７ｄｌ、ＭｎＳＯ４’４Ｈ２０１、Ｏ＊ｑ／ｌｔｅ、チ
アｊ７塩ｆｉ−０、１１１７／、 ／ １ ビオｆ−７
０，５■／ｌｌ、大豆蛋白加水分解物（「味液」）２、
Ｏｍｆｉ／ｄｌ及び炭酸力ルノウム５ｖ７ｄｌＣ別殺菌
添加）を含みｐＨ７，２＆こ調節した液体培地を用いた
。この培地を５００ｓｔ／容フラスコｅこ培地２ｏ＊１
ずつを入れ、これに第１表に示す微生物をそれぞれ１白
金耳植えつけ、３１Ｃで７２時間培養した。
ｉｅ、硫酸７７ モ、＝−ウＡ ３．Ｏｆ ／ｄｉ、Ｋ
Ｉ（、ＰＯ４０，１ｆ／ｄｉ、ＭｇＳＯ４−７Ｆｌ、Ｏ
Ｏ，０４ｆ／ｄｅ１ＦｅＳＯ４”７Ｈ，０１，Ｏｙｒｇ
７ｄｌ、ＭｎＳＯ４’４Ｈ２０１、Ｏ＊ｑ／ｌｔｅ、チ
アｊ７塩ｆｉ−０、１１１７／、 ／ １ ビオｆ−７
０，５■／ｌｌ、大豆蛋白加水分解物（「味液」）２、
Ｏｍｆｉ／ｄｌ及び炭酸力ルノウム５ｖ７ｄｌＣ別殺菌
添加）を含みｐＨ７，２＆こ調節した液体培地を用いた
。この培地を５００ｓｔ／容フラスコｅこ培地２ｏ＊１
ずつを入れ、これに第１表に示す微生物をそれぞれ１白
金耳植えつけ、３１Ｃで７２時間培養した。
培養後、遠心上清液中のし一インロイシンをマイクロバ
イオアッセイ法？こより定量した。
イオアッセイ法？こより定量した。
第 １ 表
／１６１１ ６０
扁１４４０
ＡＪ１１６８６ １２０実施
例２ （１） 染色体ＤＮＡの調製 実施例１のステップ（＋１に示した方法により、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ゛］ ３
８６９より誘導したイソロイノン生産能を有するＡＨＶ
耐性株ｌ６１８より、最終２．４■の染色体ＤＮＡを得
た。
例２ （１） 染色体ＤＮＡの調製 実施例１のステップ（＋１に示した方法により、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ゛］ ３
８６９より誘導したイソロイノン生産能を有するＡＨＶ
耐性株ｌ６１８より、最終２．４■の染色体ＤＮＡを得
た。
（２） ベクターＤＮＡの調製
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９より、実施例１のステップ（２）に示した方法
により、プラスミドの１種ｐＡＭ３３０ Ｄ’Ｎ Ａ
（ＪｙｌＱ’−ダルトン）をベクターＤＮＡとして最終
１５０μ２を得た。
３８６９より、実施例１のステップ（２）に示した方法
により、プラスミドの１種ｐＡＭ３３０ Ｄ’Ｎ Ａ
（ＪｙｌＱ’−ダルトン）をベクターＤＮＡとして最終
１５０μ２を得た。
＋３１ 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得た染色体ＤＮＡ １０μ２をとり、実施例１のステ
ップ（３目こ示した方法により、ＤＮＡ鎖を切断した。
で得た染色体ＤＮＡ １０μ２をとり、実施例１のステ
ップ（３目こ示した方法により、ＤＮＡ鎖を切断した。
一方、（２）で得たベクターＤＮＡも実施例１のステッ
プ（３１ｆこ示した方法により、切断し、切断されたベ
クターＤＮＡと上記染色体ＤＮＡフラクメントトを、実
施例１のステップ（３）ｔこ示ス方法１こより、リガー
ゼ１こよる連絡反応を行った。
プ（３１ｆこ示した方法により、切断し、切断されたベ
クターＤＮＡと上記染色体ＤＮＡフラクメントトを、実
施例１のステップ（３）ｔこ示ス方法１こより、リガー
ゼ１こよる連絡反応を行った。
（４） 形質転換
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１
３８６９より、Ｌ−インロイシンを要求する扁１４６を
変異誘導し、この菌株を受容菌として、実施例１のステ
ップ（４）ｅこ示す方法により、Ｌ−イソロイノン生産
能を有する形質転換株ＡＪ］１’６８７（ＦＥＲＭ−Ｐ
４Ｏ１０）を得た。
３８６９より、Ｌ−インロイシンを要求する扁１４６を
変異誘導し、この菌株を受容菌として、実施例１のステ
ップ（４）ｅこ示す方法により、Ｌ−イソロイノン生産
能を有する形質転換株ＡＪ］１’６８７（ＦＥＲＭ−Ｐ
４Ｏ１０）を得た。
（５）Ｌ−インロイシンの生産
（４）で得られた形質転換株ＡＪ１］６８７について、
実施例１のステップ（５）ｔこ示した方法により、Ｌ−
インロイシ／の発酵生産を行った。第２表ｔこ結果を示
す。
実施例１のステップ（５）ｔこ示した方法により、Ｌ−
インロイシ／の発酵生産を行った。第２表ｔこ結果を示
す。
第 ２ 表
／１６１８８２
扁１４６０
ＡＪ１１６８７ １４５
特許出願人 味の素株式会社
Claims (1)
- コリネバクテリウム属又はプレビバクテリウＡＩの微生
物より得たインロイシンアンタゴニスト耐性に関与する
染色体遺伝子領域が組ゐ込まれているコリネバクテリウ
ム属又はブレビバクテリウム属微生物由来のプラスミド
を含有し、Ｌ−インロイシン生産能を有するコリネバク
テリウム属又はブレビバクテリウム属の微生物を培養し
、培地中に生成蓄積されたＬ−インロイシンを採取する
ことを特徴とする発酵法ｔこよるＬ−インロイシンの製
造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56098699A JPS58893A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
| EP82105666A EP0071023A3 (en) | 1981-06-25 | 1982-06-25 | Method for producing l-isoleucine by fermentation |
| US06/392,145 US4442208A (en) | 1981-06-25 | 1982-06-25 | Method for producing L-isoleucine by fermentation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56098699A JPS58893A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58893A true JPS58893A (ja) | 1983-01-06 |
| JPH0353913B2 JPH0353913B2 (ja) | 1991-08-16 |
Family
ID=14226746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56098699A Granted JPS58893A (ja) | 1981-06-25 | 1981-06-25 | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4442208A (ja) |
| EP (1) | EP0071023A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58893A (ja) |
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| JPS6291193A (ja) * | 1985-06-05 | 1987-04-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
| JPS62186795A (ja) * | 1986-02-12 | 1987-08-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | アミノ酸の製造法 |
| JPS62232392A (ja) * | 1986-04-02 | 1987-10-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
| US5919670A (en) * | 1997-06-23 | 1999-07-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
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| JPS5867699A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
| JPS5877895A (ja) * | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドｐｈｍ１５１９ |
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| JPS59156294A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | ヒスチジンの製造法 |
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
| JPS6066989A (ja) * | 1983-09-24 | 1985-04-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−アルギニンの製造法 |
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| JPH0783714B2 (ja) * | 1983-08-29 | 1995-09-13 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ―アミノ酸の製造法 |
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| JPS6012995A (ja) * | 1983-06-15 | 1985-01-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ―スレオニン及び／又はｌ―イソロイシンの製造法 |
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| JPS62232392A (ja) * | 1986-04-02 | 1987-10-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−スレオニンおよびｌ−イソロイシンの製造法 |
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| US6143552A (en) * | 1997-06-23 | 2000-11-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing L-amino acids by fermentation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0071023A2 (en) | 1983-02-09 |
| JPH0353913B2 (ja) | 1991-08-16 |
| US4442208A (en) | 1984-04-10 |
| EP0071023A3 (en) | 1984-03-07 |
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