JPS6411280B2 - - Google Patents
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- JPS6411280B2 JPS6411280B2 JP56165511A JP16551181A JPS6411280B2 JP S6411280 B2 JPS6411280 B2 JP S6411280B2 JP 56165511 A JP56165511 A JP 56165511A JP 16551181 A JP16551181 A JP 16551181A JP S6411280 B2 JPS6411280 B2 JP S6411280B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、グルタミン酸生産性コリネホル
ム・バクテリアより分離されるプラスミドに関す
る。 グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリア
は大量のＬ−グルタミン酸を生産することが知ら
れていて、またその変異株はリジン等のアミノ
酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて、工業的に有用な微生物で
ある。一方、最近DNA組換え技術による工業微
生物の育種、改良がエシエリヒア・コリ等により
試みられているが、グルタミン酸生産性コリネホ
ルム・バクテリアについては、これらの微生物を
宿主とするに適したベクターが開発されておら
ず、DNA組換えによるグルタミン酸生産性コリ
ネホルム・バクテリアの育種、改良の妨げとなつ
ていた。 本発明者らはこのような背景において、コリネ
ホルム・バクテリアに適したベクターを開発すべ
く鋭意研究し、ついにグルタミン酸生産性コリネ
ホルム・バクテリアより、ベクターとして用いる
のに適した、あるいはベクターとして加工するに
適したプラスミドである分子量3.0±0.1メガダル
トンであつて、第１図に示す制限酵素切断地図を
有するプラスミドを見い出した。 本発明のプラスミドの具体例として、グルタミ
ン酸生産性コリネホルム・バクテリアであるブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より分離されたpAM330、コリネバ
クテリウム・グルタミカムAJ11560、FERM−
P5485より分離されたpAM286があり、これらの
プラスミドは以下の点で共通の性質を有してい
る。 分子量は3.0メガダルトン（アガロースゲル電
気泳動法、及び電子顕微鏡観察による）であり、
各種制限酵素に対する感受性は第１表に示すとお
りであり、制限酵素切断地図は第１図に示すとお
りである。第１図の制限酵素切断地図は全長を
100とし、Hind切断位置を０の位置に定めて表
わした。 プラスミドpAM330及びpAM286は、それぞれ
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869及びコリネバクテリウム・グルタミ
クムAJ11560、FERM−P5485より、実施例１及
び実施例２に記載された方法により、容易に分
離、精製できる。 【表】 グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリア
は、好気性、無胞子、非抗酸性、グラム陽性、不
定性の捍菌である、所謂コリネホルム・バクテリ
アの内のグルタミン酸を多量に生産するものであ
り、以下にその一部を具体的に例示する。 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ATCC13745 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・イマリオフイラム
ATCC14068 ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム
ATCC15887 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
ATCC15806 コリネバクテリウム・アルノカリテカム
ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032 コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス
ATCC15592 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC15354 アルスロバクター・シトレウス ATCC17775 アルスロバクター・パラフイネウス ATCC19064 アルスロバクターシンプレツクス ATCC15799 これらのグルタミン酸生産性コリネホルム・バ
クテリアは、本発明のプラスミドを安定して細胞
内に保つことができ、本発明のプラスミドの宿主
となることができる。 本発明のプラスミドは上記のような宿主微生物
内にて、よく増殖することができるので、このプ
ラスミドのいずれかの位置に外来遺伝子が挿入さ
れれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主である
グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリア細
胞内で発現せしめることができ、これら宿主微生
物の遺伝形質を変換せしめることができる。 本発明のプラスミドを宿主微生物細胞内に導入
するには、E.coli Ｋ−12で報告されているよう
に低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して菌
膜の透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する
方法（Mandel、Ｍ and Higa、A.、J.Mol.
Biol.、53、159（1970））、枯草菌で報告されてい
るように増殖のある段階で自然にプラスミドを取
り込みやすくなること（いわゆるコンピーテント
な状態）を利用して、プラスミドを移入する方法
（Duncan、C.H.、Wilson、G.A. and Young、
F.E.、Gene、１、1531977））、更には枯草菌、放
線菌、酵母の報告にあるように細胞をプロトプラ
スト又はスフエロプラストにしてプラスミドを移
入する方法（Chang、Ｓ and Cohen、S.N.、
Molec.Gen.Genet.、168、111（1979）；Bibb、M.
J.、Ward、J.M.and Hopwood、D.A.、Nature、
274、398（1978）；Hinnen、A.、Hicks、J.B.and
Fink、G.R.、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、75、
1929（1978））等が知られている。 本発明のプラスミに外来遺伝子を挿入するに
は、第１表に示すような制限酵素により切断され
る個所に挿入するのが便利であるが、その内、特
に同じ制限酵素による被切断個所が１カ所である
ような個所に挿入するのが望ましい。外来遺伝子
を挿入するには、プラスミド及び外来遺伝子源と
なるゲノムDNAをそれぞれ同じ制限酵素で、部
分時又は完全に分解し、これを適当な条件下に接
続せしめればよい。 外来遺伝子としてグルタミン酸生産性コリネホ
ルム・バクテリアのゲノムDNAが最も効率よく、
その遺伝子情報が発現される。 本発明のプラスミドは更に、そのドライブユニ
ツト以外の部分の全部又はその一部を取り除いて
も当然、上記のような宿主微生物内で増殖するこ
とができ、しかもより分子量は小さくなるので、
より好ましいベクターとして使用することができ
る。 本発明のプラスミドは、細胞内でのコピー数が
多く、従つて外来遺伝子を組み換えた時に、多量
の遺伝子増巾が期待できる。 実施例 １ pAM330DNAの単離 pAM330のDNAを次のようにして調製した。
まず、pAM330をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869を１のCMG培地（ペプトン１ｇ／
dl、酵母エキス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl
及びNaCl0.5ｇ／dlを含むPH7.2に調整したもの）
に接種し、30℃で対数後期まで培養したのち、リ
ゾチーム・SDS処理によつて溶菌させ、30000×
ｇ、30分の超遠心により上清を得た。これにポリ
エチレングリコールを添加してプラスミドDNA
を沈澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・
EDTA・NaClバツフアー（PH8.0）の少量に溶解
後アガロースゲル電気泳動法（電圧ゲル１cm当り
5V、15時間）によつて最終74μｇのpAM330プラ
スミドDNAを分画採取した。 pAM330の分子量の決定 pAM330の分子量の決定はアガロースゲル電気
泳動及び電子顕微鏡観察によつた。 アガロースゲル電気泳動はシヤープ（P.A.
Sharp）らの方法（Biochemistry 12、3055
（1973））により、0.7〜0.8％ゲルを用い、ゲル長
さcm当り、5Vで15時間、定電圧で泳動した。分
子量は分子量既知のプラスミドpBR322〔ボリバ
ー（Boliver.F）らgene２、95（1977）〕、pUB110
〔グリクザン（Gryczan T.J.）らJ.Bacteriol
134、318（1978）、ColE1〔バザラール（Bazaral
M.）らJ.Mol、Biol 36 185（1968）等との移動
度の比較によつて算出した。 電子顕微鏡観察はクラインシユミツトら
（Kleinschmidt Ａ、Zahn R.K.Z、Naturforsch、
14b、770（1959））のチトクロームＣ単分子膜展
開法によつた。 制限酵素による切断およびアガロースゲル電気泳
動 制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ、ベーリンガー・マンハイム社、ニユー・イン
グランド・バイオラブ社、ワーシントン・バイオ
ケミカル社の市販品を使用した。制限酵素による
消化は、少なくとも３倍過剰以上の酵素を使用し
て、各酵素毎に指定された条件で行なつた。プラ
スミドDNAを１種以上の制限酵素で切断する場
合には、第１の制限酵素切断断片を分離用アガロ
ースゲルよりタナカらの方法〔T.TANAKA
and B.Weisblum、J.Bacteriol.、121、354
（1975）〕により単離後、エタノール沈澱により濃
縮し第２の制限酵素で消化した。 切断断片をシヤープらの方法（P.A.Sherp et
al.、Biocbemistry、12、3055（1973）〕によりア
ガロース電気泳動にかけた。0.7〜１％のアガロ
ースゲルを用い、ゲル長さcm当たり５〜20Vで１
〜数時間、定電圧で泳動した。分子量はDNA分
子量標準試料（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ製ΦX174 RF−Hae断片及びλDNA−
Hind断片）との移動度の比較により算出した。 pAM330のコピー数測定 pAM330を含むブレビバクテリウム・ラクトフ
アーメンタムATCC13869を3H−チミジン100μCi
を含む最少培地グルコース20ｇ、硫安10ｇ、尿素
2.5ｇ、KH2PO41ｇ、MgSO4・7H2O0.4ｇ、ビオ
チン50μｇ、チアミンHCl200μｇ、FeSO4・
7H2O0.01ｇ及びMnSO4・4H2O0.01ｇを１の純
水に溶解し、PH7.0に調整したもの）５ml中で30
℃一夜振盪培養し、得られた菌体をリソザイム
SDSを用いて溶解後、CsCl−EtBr平衡密度勾配
遠心により、閉環状プラスミド区分を線状と閉環
状DNAに分離させ、放射能を計測した。閉環状
プラスミド画分の放射能は0.8〜1.0％と求めら
れ、pAM330の分子量を３×106、ブレビバクテ
リウム・ラクトフアーメンタムATCC13869染色
体DNA分子量を３×109とすると閉環状プラスミ
ドのコピー数は８〜10コと計算された（尚、この
コピー数測定法は閉環状プラスミドについてのみ
計測されるので、菌体内であるいは抽出操作中に
開環状となつたものは無視しており、実際のコピ
ー数はこの値以上となると考えられる。（長張健
二「分子育種と応用微生物」坂口健二、岡西昌則
編、講談社、P172（1979））。 pAM330を用いたDNA組換え体の作製 プレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より誘導した温度感受性変異株
No.5116（NRRLB−12405）（特開昭52−66687）
より常法により得た染色体DNA10μｇをとり、
制限エンドヌクレアーゼHindを与え、37℃で
10分、30分、又は60分反応させ、DNA鎖を種々
の程度に切断した。プラスミドpAM330DNAの
場合は5μｇをとり、60分反応させ、完全に切断
せしめた。65℃、５分の熱処理後、両反応液を混
合し、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4
フアージ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24
時間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採
取した。 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
No.5116よりＬ−グルタミン酸要求性変異株を誘
導し、No.3株（NRRLB−12406）を得た。この
株をCMG培地20mlに接種し、30℃で振盪培養を
行い、対数増殖期中期まで生育させた後集菌し、
塩化カルシウム法により、コンピテントな
（DNA取り込み能を有する）細胞を得た。 この細胞懸濁液に上記のDNAの溶解液を加え、
DNAを細胞内に取り込ませた。この反応液を適
宜希釈して最少培地プレート（グルコース20ｇ、
硫安10ｇ、尿素2.5ｇ、KH2PO41ｇ、MgSO4・
7H2O0.4ｇ、ビオチン50μｇ、チアミン塩酸塩
200μｇ、FeSO4・7H2O0.01ｇ、及びMnSO4・
4H2O0.01ｇを１の純水に溶解しPH7.0に調整し
たものを基本最少培地とし、これに寒天２％を加
えて殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃で４日間
培養した。 このようにして形質転換株AJ11561（FERM−
P5469）を得た。 AJ11561をDNA供与菌及びDNA受容菌と比較
してＬ−グルタミン酸の発酵生産を検定した。 結果を第１表に示した。培養はグルコース3.6
ｇ／dl、尿素0.5ｇ／dl、KH2PO40.1ｇ／dl、
MgSO4・7H2O0.1ｇ／dl、FeSO4・7H2O1mg／
dl、MnSO4・4H2O1mg／dl、チアミン塩酸塩0.1
mg／、ビオチン3μｇ／、大豆蛋白加水分解
液（「味液」）３ml／dl、及び炭酸カルシウム2.5
ｇ／dl（別殺菌添加）を含みPH7.0の液体培地を
用い、500ml容フラスコに培地20mlを入れ、これ
に第１表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつ
け、31℃で48時間培養した。培養後、遠心上清液
中のＬ−グルタミン酸を酵素法により定量した。 【表】 実施例 ２ pAM286DNAの単離 pAM286のDNAを次のようにして調整した。
まず、pAM286をプラスミドとして保有するコリ
ネバクテリウム・グルタミクムAJ11560を１の
CMG培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１
ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl及びNaCl0.5ｇ／dl
を含むPH7.2に調整したもの）に接種し、30℃で
対数後期まで培養したのち、リゾチーム・SDS処
理によつて溶菌させ、30000×ｇ、30分の超遠心
により上清を得た。これよりポリエチレングリコ
ールを用いてDNA画分を沈澱させ、沈澱区分を
１／１０容のTENバツフアー（20ｍＭトリス、20ｍ
MNaCl、１ｍMEDTA、PH8.0）に溶解後、CsCl
−EtBt平衡密度勾配遠心により閉環状プラスミ
ド画分を得、EtBrの抽出除去、透析による精製
を行ない、最終82μｇのpAM286DNAを得た。こ
れらの方法は松原の方法（山川民夫編、生化学実
験講座、２巻、p73、東京化学同人（1975）に
準じた。 制限酵素による切断及びアガロースゲル電気泳
動法は実施例１に示した方法に準じて行つた。 pAM286のコピー数測定 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560を
用い、実施例１に示した方法に準じて行なつたと
ころ、閉環状プラスミドのコピー数は８〜10コと
計算された（尚、このコピー数決定法は閉環状プ
ラスミドについてのみ計測されるので、菌体内で
あるいは抽出操作中に開環状となつたものは無視
しており、実際のコピー数はこの値以上となると
考えられる。（長張健二「分子育種と応用微生物」
坂口健二、岡西昌則編、講談社、p172（1979）））。 pAM286の分子量の決定 pAM286の分子量の決定は実施例１に示した方
法によりアガロースゲル電気泳動及び電子顕微鏡
観察によつた。 pAM286を用いたDNA組換え体の作製 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560よ
り誘導したＳ−（２−アミノエチル）−システイン
（AEC）耐性変異株No.22（NRRLB−12416）を
１のCMG培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキ
ス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl及びNaCl0.5
ｇ／dlを含み、PH7.2に調整したもの）を用い、
30℃で約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌
体を集めた。この菌体よりフエノール法による通
常のDNA抽出法によつて染色体のDNAを抽出静
製し、最終4.0mgのDNAを得た。 得られた染色体DNA10μｇをとり、制御エン
ドヌクレアーゼXbaを与え、37℃で10分、30
分、又は60分反応させ、DNA鎖を種々の程度に
切断した。又、pAM286DNAの場合は5μｇをと
り、60分反応させ、完全に切断せしめた。65℃、
５分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及び
ジチオスレイトール存在下、T4フアージ由来の
DNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA鎖の連
結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採
取した。 コリネバクテリウム・グルタミクムNo.22より
Ｌ−リジン要求性変異株を誘導し、No.97
（NRRLB−12417）を得た。この菌株をCMG培
地20mlに接種し、30℃で振盪培養を行ない、対数
増殖期中期まで生育させた後集菌し、塩化カルシ
ウム法により、コンピテントな（DNA取り込み
能を有する）細胞を得た。この細胞懸濁液に組み
換えDNAの溶解液を加え、DNAを細胞内に取り
込ませた。この反応液を最少培地プレート（グル
コース20ｇ、硫安10ｇ、尿素2.5ｇ、KH2PO41
ｇ、MgSO4・7H2O0.4ｇ、ビオチン50μｇ、チア
ミン塩酸塩200μｇ、FeSO4・7H2O0.01ｇ、及び
MnSO4・4H2O0.01ｇを１の純水に溶解しPH7.0
に調整したものを基本最少培地とし、これに寒天
２％を加えて殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃
で４日間培養した。生じたコロニーを釣菌、純化
後pAM286にＬ−リジン生合成に関与する遺伝子
が組み入れられているようなプラスミドを保有す
るコロニーを、目的とする形質転換株として保存
した。 以上のようにして、AJ11575（FERM−P5501）
を得た。 得られたリジン生産菌株を、DNA供与菌及び
DNA受容菌と比較してＬ−リジンの発酵生産を
検定した。 結果を第１表に示した。培養はグルコース10
ｇ／dl、尿素0.5ｇ／dl、（NH4）2SO44.5ｇ／dl、
KH2PO40.1ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.04ｇ／dl、
FeSO4・7H2O1mg／dl、MnSO4・4H2O0.01ｇ／
dl、チアミン塩酸塩0.1mg／、ビオチン0.5mg／
、アデニン10mg／dl、グルタミン酸ナトリウム
10mg／dl、及び炭酸カルシウム５ｇ／dl（別殺菌
添加）を含みPH8.0に調節した液体培地を用い、
500ml容フラスコに培地20mlを入れ、これに第２
表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ、31
℃で70時間培養した。培養後、遠心上清液中のＬ
−リジンをミクロバイオアツセイ法により定量し
た。 【表】
ム・バクテリアより分離されるプラスミドに関す
る。 グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリア
は大量のＬ−グルタミン酸を生産することが知ら
れていて、またその変異株はリジン等のアミノ
酸、イノシン酸等のプリンヌクレオチドを生産す
るものが知られていて、工業的に有用な微生物で
ある。一方、最近DNA組換え技術による工業微
生物の育種、改良がエシエリヒア・コリ等により
試みられているが、グルタミン酸生産性コリネホ
ルム・バクテリアについては、これらの微生物を
宿主とするに適したベクターが開発されておら
ず、DNA組換えによるグルタミン酸生産性コリ
ネホルム・バクテリアの育種、改良の妨げとなつ
ていた。 本発明者らはこのような背景において、コリネ
ホルム・バクテリアに適したベクターを開発すべ
く鋭意研究し、ついにグルタミン酸生産性コリネ
ホルム・バクテリアより、ベクターとして用いる
のに適した、あるいはベクターとして加工するに
適したプラスミドである分子量3.0±0.1メガダル
トンであつて、第１図に示す制限酵素切断地図を
有するプラスミドを見い出した。 本発明のプラスミドの具体例として、グルタミ
ン酸生産性コリネホルム・バクテリアであるブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より分離されたpAM330、コリネバ
クテリウム・グルタミカムAJ11560、FERM−
P5485より分離されたpAM286があり、これらの
プラスミドは以下の点で共通の性質を有してい
る。 分子量は3.0メガダルトン（アガロースゲル電
気泳動法、及び電子顕微鏡観察による）であり、
各種制限酵素に対する感受性は第１表に示すとお
りであり、制限酵素切断地図は第１図に示すとお
りである。第１図の制限酵素切断地図は全長を
100とし、Hind切断位置を０の位置に定めて表
わした。 プラスミドpAM330及びpAM286は、それぞれ
ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869及びコリネバクテリウム・グルタミ
クムAJ11560、FERM−P5485より、実施例１及
び実施例２に記載された方法により、容易に分
離、精製できる。 【表】 グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリア
は、好気性、無胞子、非抗酸性、グラム陽性、不
定性の捍菌である、所謂コリネホルム・バクテリ
アの内のグルタミン酸を多量に生産するものであ
り、以下にその一部を具体的に例示する。 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス
ATCC13745 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・イマリオフイラム
ATCC14068 ブレビバクテリウム・ケトグルタミクム
ATCC15887 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サツカロリテイカム
ATCC14066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイラム
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
ATCC15806 コリネバクテリウム・アルノカリテカム
ATCC21511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032 コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス
ATCC15592 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコラ ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC15354 アルスロバクター・シトレウス ATCC17775 アルスロバクター・パラフイネウス ATCC19064 アルスロバクターシンプレツクス ATCC15799 これらのグルタミン酸生産性コリネホルム・バ
クテリアは、本発明のプラスミドを安定して細胞
内に保つことができ、本発明のプラスミドの宿主
となることができる。 本発明のプラスミドは上記のような宿主微生物
内にて、よく増殖することができるので、このプ
ラスミドのいずれかの位置に外来遺伝子が挿入さ
れれば、その外来遺伝子の遺伝情報を宿主である
グルタミン酸生産性コリネホルム・バクテリア細
胞内で発現せしめることができ、これら宿主微生
物の遺伝形質を変換せしめることができる。 本発明のプラスミドを宿主微生物細胞内に導入
するには、E.coli Ｋ−12で報告されているよう
に低温のもとで菌を塩化カルシウムで処理して菌
膜の透過性を増大せしめ、プラスミドを移入する
方法（Mandel、Ｍ and Higa、A.、J.Mol.
Biol.、53、159（1970））、枯草菌で報告されてい
るように増殖のある段階で自然にプラスミドを取
り込みやすくなること（いわゆるコンピーテント
な状態）を利用して、プラスミドを移入する方法
（Duncan、C.H.、Wilson、G.A. and Young、
F.E.、Gene、１、1531977））、更には枯草菌、放
線菌、酵母の報告にあるように細胞をプロトプラ
スト又はスフエロプラストにしてプラスミドを移
入する方法（Chang、Ｓ and Cohen、S.N.、
Molec.Gen.Genet.、168、111（1979）；Bibb、M.
J.、Ward、J.M.and Hopwood、D.A.、Nature、
274、398（1978）；Hinnen、A.、Hicks、J.B.and
Fink、G.R.、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA、75、
1929（1978））等が知られている。 本発明のプラスミに外来遺伝子を挿入するに
は、第１表に示すような制限酵素により切断され
る個所に挿入するのが便利であるが、その内、特
に同じ制限酵素による被切断個所が１カ所である
ような個所に挿入するのが望ましい。外来遺伝子
を挿入するには、プラスミド及び外来遺伝子源と
なるゲノムDNAをそれぞれ同じ制限酵素で、部
分時又は完全に分解し、これを適当な条件下に接
続せしめればよい。 外来遺伝子としてグルタミン酸生産性コリネホ
ルム・バクテリアのゲノムDNAが最も効率よく、
その遺伝子情報が発現される。 本発明のプラスミドは更に、そのドライブユニ
ツト以外の部分の全部又はその一部を取り除いて
も当然、上記のような宿主微生物内で増殖するこ
とができ、しかもより分子量は小さくなるので、
より好ましいベクターとして使用することができ
る。 本発明のプラスミドは、細胞内でのコピー数が
多く、従つて外来遺伝子を組み換えた時に、多量
の遺伝子増巾が期待できる。 実施例 １ pAM330DNAの単離 pAM330のDNAを次のようにして調製した。
まず、pAM330をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869を１のCMG培地（ペプトン１ｇ／
dl、酵母エキス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl
及びNaCl0.5ｇ／dlを含むPH7.2に調整したもの）
に接種し、30℃で対数後期まで培養したのち、リ
ゾチーム・SDS処理によつて溶菌させ、30000×
ｇ、30分の超遠心により上清を得た。これにポリ
エチレングリコールを添加してプラスミドDNA
を沈澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトリス・
EDTA・NaClバツフアー（PH8.0）の少量に溶解
後アガロースゲル電気泳動法（電圧ゲル１cm当り
5V、15時間）によつて最終74μｇのpAM330プラ
スミドDNAを分画採取した。 pAM330の分子量の決定 pAM330の分子量の決定はアガロースゲル電気
泳動及び電子顕微鏡観察によつた。 アガロースゲル電気泳動はシヤープ（P.A.
Sharp）らの方法（Biochemistry 12、3055
（1973））により、0.7〜0.8％ゲルを用い、ゲル長
さcm当り、5Vで15時間、定電圧で泳動した。分
子量は分子量既知のプラスミドpBR322〔ボリバ
ー（Boliver.F）らgene２、95（1977）〕、pUB110
〔グリクザン（Gryczan T.J.）らJ.Bacteriol
134、318（1978）、ColE1〔バザラール（Bazaral
M.）らJ.Mol、Biol 36 185（1968）等との移動
度の比較によつて算出した。 電子顕微鏡観察はクラインシユミツトら
（Kleinschmidt Ａ、Zahn R.K.Z、Naturforsch、
14b、770（1959））のチトクロームＣ単分子膜展
開法によつた。 制限酵素による切断およびアガロースゲル電気泳
動 制限酵素はベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ、ベーリンガー・マンハイム社、ニユー・イン
グランド・バイオラブ社、ワーシントン・バイオ
ケミカル社の市販品を使用した。制限酵素による
消化は、少なくとも３倍過剰以上の酵素を使用し
て、各酵素毎に指定された条件で行なつた。プラ
スミドDNAを１種以上の制限酵素で切断する場
合には、第１の制限酵素切断断片を分離用アガロ
ースゲルよりタナカらの方法〔T.TANAKA
and B.Weisblum、J.Bacteriol.、121、354
（1975）〕により単離後、エタノール沈澱により濃
縮し第２の制限酵素で消化した。 切断断片をシヤープらの方法（P.A.Sherp et
al.、Biocbemistry、12、3055（1973）〕によりア
ガロース電気泳動にかけた。0.7〜１％のアガロ
ースゲルを用い、ゲル長さcm当たり５〜20Vで１
〜数時間、定電圧で泳動した。分子量はDNA分
子量標準試料（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ製ΦX174 RF−Hae断片及びλDNA−
Hind断片）との移動度の比較により算出した。 pAM330のコピー数測定 pAM330を含むブレビバクテリウム・ラクトフ
アーメンタムATCC13869を3H−チミジン100μCi
を含む最少培地グルコース20ｇ、硫安10ｇ、尿素
2.5ｇ、KH2PO41ｇ、MgSO4・7H2O0.4ｇ、ビオ
チン50μｇ、チアミンHCl200μｇ、FeSO4・
7H2O0.01ｇ及びMnSO4・4H2O0.01ｇを１の純
水に溶解し、PH7.0に調整したもの）５ml中で30
℃一夜振盪培養し、得られた菌体をリソザイム
SDSを用いて溶解後、CsCl−EtBr平衡密度勾配
遠心により、閉環状プラスミド区分を線状と閉環
状DNAに分離させ、放射能を計測した。閉環状
プラスミド画分の放射能は0.8〜1.0％と求めら
れ、pAM330の分子量を３×106、ブレビバクテ
リウム・ラクトフアーメンタムATCC13869染色
体DNA分子量を３×109とすると閉環状プラスミ
ドのコピー数は８〜10コと計算された（尚、この
コピー数測定法は閉環状プラスミドについてのみ
計測されるので、菌体内であるいは抽出操作中に
開環状となつたものは無視しており、実際のコピ
ー数はこの値以上となると考えられる。（長張健
二「分子育種と応用微生物」坂口健二、岡西昌則
編、講談社、P172（1979））。 pAM330を用いたDNA組換え体の作製 プレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869より誘導した温度感受性変異株
No.5116（NRRLB−12405）（特開昭52−66687）
より常法により得た染色体DNA10μｇをとり、
制限エンドヌクレアーゼHindを与え、37℃で
10分、30分、又は60分反応させ、DNA鎖を種々
の程度に切断した。プラスミドpAM330DNAの
場合は5μｇをとり、60分反応させ、完全に切断
せしめた。65℃、５分の熱処理後、両反応液を混
合し、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4
フアージ由来のDNAリガーゼによつて10℃、24
時間DNA鎖の連結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採
取した。 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
No.5116よりＬ−グルタミン酸要求性変異株を誘
導し、No.3株（NRRLB−12406）を得た。この
株をCMG培地20mlに接種し、30℃で振盪培養を
行い、対数増殖期中期まで生育させた後集菌し、
塩化カルシウム法により、コンピテントな
（DNA取り込み能を有する）細胞を得た。 この細胞懸濁液に上記のDNAの溶解液を加え、
DNAを細胞内に取り込ませた。この反応液を適
宜希釈して最少培地プレート（グルコース20ｇ、
硫安10ｇ、尿素2.5ｇ、KH2PO41ｇ、MgSO4・
7H2O0.4ｇ、ビオチン50μｇ、チアミン塩酸塩
200μｇ、FeSO4・7H2O0.01ｇ、及びMnSO4・
4H2O0.01ｇを１の純水に溶解しPH7.0に調整し
たものを基本最少培地とし、これに寒天２％を加
えて殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃で４日間
培養した。 このようにして形質転換株AJ11561（FERM−
P5469）を得た。 AJ11561をDNA供与菌及びDNA受容菌と比較
してＬ−グルタミン酸の発酵生産を検定した。 結果を第１表に示した。培養はグルコース3.6
ｇ／dl、尿素0.5ｇ／dl、KH2PO40.1ｇ／dl、
MgSO4・7H2O0.1ｇ／dl、FeSO4・7H2O1mg／
dl、MnSO4・4H2O1mg／dl、チアミン塩酸塩0.1
mg／、ビオチン3μｇ／、大豆蛋白加水分解
液（「味液」）３ml／dl、及び炭酸カルシウム2.5
ｇ／dl（別殺菌添加）を含みPH7.0の液体培地を
用い、500ml容フラスコに培地20mlを入れ、これ
に第１表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつ
け、31℃で48時間培養した。培養後、遠心上清液
中のＬ−グルタミン酸を酵素法により定量した。 【表】 実施例 ２ pAM286DNAの単離 pAM286のDNAを次のようにして調整した。
まず、pAM286をプラスミドとして保有するコリ
ネバクテリウム・グルタミクムAJ11560を１の
CMG培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１
ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl及びNaCl0.5ｇ／dl
を含むPH7.2に調整したもの）に接種し、30℃で
対数後期まで培養したのち、リゾチーム・SDS処
理によつて溶菌させ、30000×ｇ、30分の超遠心
により上清を得た。これよりポリエチレングリコ
ールを用いてDNA画分を沈澱させ、沈澱区分を
１／１０容のTENバツフアー（20ｍＭトリス、20ｍ
MNaCl、１ｍMEDTA、PH8.0）に溶解後、CsCl
−EtBt平衡密度勾配遠心により閉環状プラスミ
ド画分を得、EtBrの抽出除去、透析による精製
を行ない、最終82μｇのpAM286DNAを得た。こ
れらの方法は松原の方法（山川民夫編、生化学実
験講座、２巻、p73、東京化学同人（1975）に
準じた。 制限酵素による切断及びアガロースゲル電気泳
動法は実施例１に示した方法に準じて行つた。 pAM286のコピー数測定 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560を
用い、実施例１に示した方法に準じて行なつたと
ころ、閉環状プラスミドのコピー数は８〜10コと
計算された（尚、このコピー数決定法は閉環状プ
ラスミドについてのみ計測されるので、菌体内で
あるいは抽出操作中に開環状となつたものは無視
しており、実際のコピー数はこの値以上となると
考えられる。（長張健二「分子育種と応用微生物」
坂口健二、岡西昌則編、講談社、p172（1979）））。 pAM286の分子量の決定 pAM286の分子量の決定は実施例１に示した方
法によりアガロースゲル電気泳動及び電子顕微鏡
観察によつた。 pAM286を用いたDNA組換え体の作製 コリネバクテリウム・グルタミクムAJ11560よ
り誘導したＳ−（２−アミノエチル）−システイン
（AEC）耐性変異株No.22（NRRLB−12416）を
１のCMG培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキ
ス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl及びNaCl0.5
ｇ／dlを含み、PH7.2に調整したもの）を用い、
30℃で約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌
体を集めた。この菌体よりフエノール法による通
常のDNA抽出法によつて染色体のDNAを抽出静
製し、最終4.0mgのDNAを得た。 得られた染色体DNA10μｇをとり、制御エン
ドヌクレアーゼXbaを与え、37℃で10分、30
分、又は60分反応させ、DNA鎖を種々の程度に
切断した。又、pAM286DNAの場合は5μｇをと
り、60分反応させ、完全に切断せしめた。65℃、
５分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及び
ジチオスレイトール存在下、T4フアージ由来の
DNAリガーゼによつて10℃、24時間DNA鎖の連
結反応を行つた。 65℃、５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタ
ノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採
取した。 コリネバクテリウム・グルタミクムNo.22より
Ｌ−リジン要求性変異株を誘導し、No.97
（NRRLB−12417）を得た。この菌株をCMG培
地20mlに接種し、30℃で振盪培養を行ない、対数
増殖期中期まで生育させた後集菌し、塩化カルシ
ウム法により、コンピテントな（DNA取り込み
能を有する）細胞を得た。この細胞懸濁液に組み
換えDNAの溶解液を加え、DNAを細胞内に取り
込ませた。この反応液を最少培地プレート（グル
コース20ｇ、硫安10ｇ、尿素2.5ｇ、KH2PO41
ｇ、MgSO4・7H2O0.4ｇ、ビオチン50μｇ、チア
ミン塩酸塩200μｇ、FeSO4・7H2O0.01ｇ、及び
MnSO4・4H2O0.01ｇを１の純水に溶解しPH7.0
に調整したものを基本最少培地とし、これに寒天
２％を加えて殺菌した固形培地）に塗抹し、37℃
で４日間培養した。生じたコロニーを釣菌、純化
後pAM286にＬ−リジン生合成に関与する遺伝子
が組み入れられているようなプラスミドを保有す
るコロニーを、目的とする形質転換株として保存
した。 以上のようにして、AJ11575（FERM−P5501）
を得た。 得られたリジン生産菌株を、DNA供与菌及び
DNA受容菌と比較してＬ−リジンの発酵生産を
検定した。 結果を第１表に示した。培養はグルコース10
ｇ／dl、尿素0.5ｇ／dl、（NH4）2SO44.5ｇ／dl、
KH2PO40.1ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.04ｇ／dl、
FeSO4・7H2O1mg／dl、MnSO4・4H2O0.01ｇ／
dl、チアミン塩酸塩0.1mg／、ビオチン0.5mg／
、アデニン10mg／dl、グルタミン酸ナトリウム
10mg／dl、及び炭酸カルシウム５ｇ／dl（別殺菌
添加）を含みPH8.0に調節した液体培地を用い、
500ml容フラスコに培地20mlを入れ、これに第２
表に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ、31
℃で70時間培養した。培養後、遠心上清液中のＬ
−リジンをミクロバイオアツセイ法により定量し
た。 【表】
第１図は、pAM330の制限酵素切断地図を示
す。第２図は、pAM286の制限酵素切断地図を示
す。
す。第２図は、pAM286の制限酵素切断地図を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量3.0±0.1メガダルトンであつて、下式
(1)に示す制限酵素切断地図を有するプラスミド。 式(1)
Priority Applications (3)
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| DE8282109562T DE3279371D1 (en) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56165511A JPS5867699A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | プラスミド |
Publications (2)
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|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56165511A Granted JPS5867699A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | プラスミド |
Country Status (3)
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| EP (1) | EP0077548B1 (ja) |
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| FR2575492B1 (fr) * | 1984-12-27 | 1988-09-16 | Asahi Chemical Ind | Fragment d'adn contenant un gene codant pour la glutamate deshydrogenase, adn recombinant le contenant, et microorganisme contenant l'adn recombinant |
| JPH0755155B2 (ja) * | 1986-09-10 | 1995-06-14 | 協和醗酵工業株式会社 | アミノ酸の製造法 |
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