JPH0644869B2 - プラスミド及びそれを有する細菌 - Google Patents
プラスミド及びそれを有する細菌Info
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- JPH0644869B2 JPH0644869B2 JP59281341A JP28134184A JPH0644869B2 JP H0644869 B2 JPH0644869 B2 JP H0644869B2 JP 59281341 A JP59281341 A JP 59281341A JP 28134184 A JP28134184 A JP 28134184A JP H0644869 B2 JPH0644869 B2 JP H0644869B2
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- plasmid
- trimethoprim
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- recombinant dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本願発明は、コリネ型細菌由来であり、トリメトプリム
耐性を表現する遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片
と、コリネ型細菌細胞内で自律複製可能なプラスミドと
が連結されて得られる組換えＤＮＡ、及び該組換えＤＮ
Ａを保持するコリネ型細菌に関する。
耐性を表現する遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片
と、コリネ型細菌細胞内で自律複製可能なプラスミドと
が連結されて得られる組換えＤＮＡ、及び該組換えＤＮ
Ａを保持するコリネ型細菌に関する。
（従来の技術） コリネ型細菌は、ブレビバクテリウム・フラバム等のグ
ルタミン酸等のアミノ酸を大量に生産するものを含み、
工業的に極めて重要な微生物群である。
ルタミン酸等のアミノ酸を大量に生産するものを含み、
工業的に極めて重要な微生物群である。
このようなコリネ型細菌を宿主として利用して、組換え
DNA技術によりこれらのコリネ型細菌の発酵生産物の生
産性を高めるため、既にいくつかのプラスミドベクター
が開発されている（欧州特許出願公開0 093 611 ）。こ
れらのプラスミドベクターはいずれもコリネ型細菌細胞
内で増殖できるクリプティック(Cryptic)プラスミドに
ピラスミド選別のためのマーカー遺伝子を挿入しようと
するものであり、そのため、マーカー遺伝子としてエシ
ェリヒア属又はバチルス属等由来の遺伝子をコリネ型細
菌のプラスミドに挿入したものである。従って、コリネ
型細菌にとっては、異種DNAが組み込まれたものであり
従ってこのようなプラスミドベクターを使用することは
異種のDNAの組換え実験に属する。
DNA技術によりこれらのコリネ型細菌の発酵生産物の生
産性を高めるため、既にいくつかのプラスミドベクター
が開発されている（欧州特許出願公開0 093 611 ）。こ
れらのプラスミドベクターはいずれもコリネ型細菌細胞
内で増殖できるクリプティック(Cryptic)プラスミドに
ピラスミド選別のためのマーカー遺伝子を挿入しようと
するものであり、そのため、マーカー遺伝子としてエシ
ェリヒア属又はバチルス属等由来の遺伝子をコリネ型細
菌のプラスミドに挿入したものである。従って、コリネ
型細菌にとっては、異種DNAが組み込まれたものであり
従ってこのようなプラスミドベクターを使用することは
異種のDNAの組換え実験に属する。
（発明が解決しようとする問題点） 従ってこの発明の目的は、コリネ型細菌細胞内で増殖し
うるものであって、同種細菌由来のマーカー遺伝子を有
する同種のDNAのみから構成されるプラスミドベクター
を得ることにある。
うるものであって、同種細菌由来のマーカー遺伝子を有
する同種のDNAのみから構成されるプラスミドベクター
を得ることにある。
（問題点を解決するための手段） 本願発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行
った結果、本願発明を完成するに至った。すなわち本願
発明は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由
来であり、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を含
み、両端に Mbo I 切断部位を有し、 Cla I 及び Hind
III によりそれぞれ一箇所で切断される約１．２kbのＤ
ＮＡ断片、該ＤＮＡ断片と、コリネ型細菌細胞内で自律
複製可能なプラスミドとが連結されて得られる組換えＤ
ＮＡ、及び該組換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌であ
る。ここでトリメトプリム耐性を表現する遺伝子は、コ
リネ型細菌由来のものである。トリメトプリムはジヒド
ロ葉酸の構造類似体であり、ジヒドロ葉酸還元酵素に対
する阻害剤である。
った結果、本願発明を完成するに至った。すなわち本願
発明は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由
来であり、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を含
み、両端に Mbo I 切断部位を有し、 Cla I 及び Hind
III によりそれぞれ一箇所で切断される約１．２kbのＤ
ＮＡ断片、該ＤＮＡ断片と、コリネ型細菌細胞内で自律
複製可能なプラスミドとが連結されて得られる組換えＤ
ＮＡ、及び該組換えＤＮＡを保持するコリネ型細菌であ
る。ここでトリメトプリム耐性を表現する遺伝子は、コ
リネ型細菌由来のものである。トリメトプリムはジヒド
ロ葉酸の構造類似体であり、ジヒドロ葉酸還元酵素に対
する阻害剤である。
コリネ型細菌細胞内に導入されたときトリメトプリム耐
性を表現する遺伝子は、以下のようにして得られる。先
ずコリネ型細菌よりトリメトプリムに耐性を有する株を
選択する。コリネ型細菌の野生株は通常トリメトプリム
に感受性であり、従ってトリメトプリム耐性株を得るに
は変異株を誘導するのがよい。
性を表現する遺伝子は、以下のようにして得られる。先
ずコリネ型細菌よりトリメトプリムに耐性を有する株を
選択する。コリネ型細菌の野生株は通常トリメトプリム
に感受性であり、従ってトリメトプリム耐性株を得るに
は変異株を誘導するのがよい。
トリメトプリム耐性変異株は、コリネ型細菌である親株
に、Ｘ−線，γ−線，紫外線等を照射するか、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘
起剤に曝した後、トリメトプリム耐性を獲得した株を選
別すればよい。トリメトプリム耐性を獲得した株は、例
えば最小培地（グルコース２g/dl、硫酸１g/dl、尿素0.
25g/dl、KH2PO４0.1g/dl、MgSO4・7H2O 0.04g/dl、サイ
アミン塩酸塩２００μg/、ビオチン５０μg/、寒天
1.5g/dlを含み、pH7.0 に調整したもの）等の培地を用
い、これに１００μg/mlより好ましくは200μg/ml以上
のトリメトプリムを添加し、この培地上に生育してくる
株を分離することにより得られる。
に、Ｘ−線，γ−線，紫外線等を照射するか、Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異誘
起剤に曝した後、トリメトプリム耐性を獲得した株を選
別すればよい。トリメトプリム耐性を獲得した株は、例
えば最小培地（グルコース２g/dl、硫酸１g/dl、尿素0.
25g/dl、KH2PO４0.1g/dl、MgSO4・7H2O 0.04g/dl、サイ
アミン塩酸塩２００μg/、ビオチン５０μg/、寒天
1.5g/dlを含み、pH7.0 に調整したもの）等の培地を用
い、これに１００μg/mlより好ましくは200μg/ml以上
のトリメトプリムを添加し、この培地上に生育してくる
株を分離することにより得られる。
トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を分離する方法
は、コリネ型細菌のトリメトプリム耐性を表現する遺伝
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し（例
えばH.Saito and K.Miura，Biochem Biophys Acta 72 6
19(1963)の方法が使用できる）、これを適当な制限酵素
で切断する。染色体遺伝子を切断するには、切断反応時
間等を調節して、切断の程度を調節すれば、巾広い種類
の制限酵素が使用できる。制限酵素により切断された染
色体遺伝子は、ついで、コリネ型細菌で増殖し得るプラ
スミドベクターに接続し、得られた組換えDNAを用いて
コリネ型細菌を形質転換せしめ、トリメトプリム耐性を
保有するにいたった菌株を分離し、それよりトリメトプ
リム耐性を表現する遺伝子を分離できる。
は、コリネ型細菌のトリメトプリム耐性を表現する遺伝
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し（例
えばH.Saito and K.Miura，Biochem Biophys Acta 72 6
19(1963)の方法が使用できる）、これを適当な制限酵素
で切断する。染色体遺伝子を切断するには、切断反応時
間等を調節して、切断の程度を調節すれば、巾広い種類
の制限酵素が使用できる。制限酵素により切断された染
色体遺伝子は、ついで、コリネ型細菌で増殖し得るプラ
スミドベクターに接続し、得られた組換えDNAを用いて
コリネ型細菌を形質転換せしめ、トリメトプリム耐性を
保有するにいたった菌株を分離し、それよりトリメトプ
リム耐性を表現する遺伝子を分離できる。
この際用いられるコリネ型細菌は、トリメトプリムに感
受性のものであり、従って、トリメトプリム耐性を表現
する遺伝子を有する形質転換株は、上述の通りトリメト
プリム耐性株として得られる。
受性のものであり、従って、トリメトプリム耐性を表現
する遺伝子を有する形質転換株は、上述の通りトリメト
プリム耐性株として得られる。
コリネ型細菌は好気性，グラム陽性桿菌であり、非抗酸
性でバーヂース・マニュアル・オブ・デターミネティブ
バクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に記載さ
れている。その内、特に以下に例示するようなＬ−グル
タミン酸を大量に生産するものが知られていて、これら
はいずれも同一属に属するものと考えられる。ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068ブレビバクテリウム・ラクトファ -メンタム ATCC 13869ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240コリネバクテリウム・アセトアジドフィルム ATCC 13870コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990コリネバクテリウム・メラセコ -ラ ATCC 17965ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 コリネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有
するもののほかに、グルタミン酸生産性を失った変異株
及び他の変異株も含まれる。
性でバーヂース・マニュアル・オブ・デターミネティブ
バクテリオロジー第８版５９９頁（１９７４）に記載さ
れている。その内、特に以下に例示するようなＬ−グル
タミン酸を大量に生産するものが知られていて、これら
はいずれも同一属に属するものと考えられる。ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068ブレビバクテリウム・ラクトファ -メンタム ATCC 13869ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240コリネバクテリウム・アセトアジドフィルム ATCC 13870コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990コリネバクテリウム・メラセコ -ラ ATCC 17965ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 コリネ型細菌には上記のようなグルタミン酸生産性を有
するもののほかに、グルタミン酸生産性を失った変異株
及び他の変異株も含まれる。
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるようなプラスミドとす
るためには、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子はコ
リネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドの複製開始領
域DNAと接続される。複製開始領域DNAとしては、コリネ
型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドの野生型のものの
全部又はその複製開始領域を含むDNA断片が使用でき
る。更にこれら野性型プラスミド又はその複製開始領域
を含むDNA断片にコリネ型細菌由来のDNAが接続されたも
のも複製開始領域DNAとして使用できる。
るためには、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子はコ
リネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドの複製開始領
域DNAと接続される。複製開始領域DNAとしては、コリネ
型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドの野生型のものの
全部又はその複製開始領域を含むDNA断片が使用でき
る。更にこれら野性型プラスミド又はその複製開始領域
を含むDNA断片にコリネ型細菌由来のDNAが接続されたも
のも複製開始領域DNAとして使用できる。
コリネ型細菌細胞内で増殖しうる野性型プラスミドとし
ては、特開昭５８−６７６９９に記載されているpAM 33
0 、pAM 286 、特開昭５８−７７８９５に記載されてい
るpHM 1519 、特開昭５７−134500に記載されているpCG
1 、特開昭５８−３５１９７に記載されているpCG 2
、特開昭５７−１８３７９９に記載されているpCG 4
、pCG 11等が知られている。
ては、特開昭５８−６７６９９に記載されているpAM 33
0 、pAM 286 、特開昭５８−７７８９５に記載されてい
るpHM 1519 、特開昭５７−134500に記載されているpCG
1 、特開昭５８−３５１９７に記載されているpCG 2
、特開昭５７−１８３７９９に記載されているpCG 4
、pCG 11等が知られている。
複製開始領域DNAを有するプラスミドは、トリメトプリ
ム耐性を表現するDNAと接続するため、染色体遺伝子を
切断した際に用いられた制限酵素により切断される。染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたプラスミドDNA
はそのまま、あるいは必要があればそれぞれの両端に相
補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続せし
めて、ついでプラスミドDNAと染色体DNAフラグメントと
のライゲーション反応に付される。
ム耐性を表現するDNAと接続するため、染色体遺伝子を
切断した際に用いられた制限酵素により切断される。染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたプラスミドDNA
はそのまま、あるいは必要があればそれぞれの両端に相
補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続せし
めて、ついでプラスミドDNAと染色体DNAフラグメントと
のライゲーション反応に付される。
このようにして得られた、染色体DNAとプラスミドDNAと
の組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌へ導入する
には、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されて
いる様な(Mandel ，M.and Higa，Ａ．，Ｊ．Mol．Bio
l．，５３ 159(1970））受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法、またバチルス・ズ
ブチリスについて報告されている様に（Duncan，C.
H．，Wilson，G.A．and Young，F.E．，Gene，１，153
(1977)）細胞がDNAを取り込み得る様になる増殖段階
（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法により可
能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類
および酵母について知られている様に（Chang，Ｓ．and
Choen，S.N．，Molec．Gen．Genet.,168，111(1979)；
Bibb，M.J．，Ward，J.M．and Hopwood，O.A．，Natur
e，274，398(1978)；Hinnen，Ａ．，Hicks，J.B．and F
ink，G.R．，Proc.Natl.Acad．Sci．USA，75 1929(197
8)）、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込むプ
ロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミド
をDNA受容菌に導入することも可能である。
の組換えDNAをコリネ型細菌に属する受容菌へ導入する
には、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されて
いる様な(Mandel ，M.and Higa，Ａ．，Ｊ．Mol．Bio
l．，５３ 159(1970））受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法、またバチルス・ズ
ブチリスについて報告されている様に（Duncan，C.
H．，Wilson，G.A．and Young，F.E．，Gene，１，153
(1977)）細胞がDNAを取り込み得る様になる増殖段階
（いわゆるコンビテントセル）に導入する方法により可
能である。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類
および酵母について知られている様に（Chang，Ｓ．and
Choen，S.N．，Molec．Gen．Genet.,168，111(1979)；
Bibb，M.J．，Ward，J.M．and Hopwood，O.A．，Natur
e，274，398(1978)；Hinnen，Ａ．，Hicks，J.B．and F
ink，G.R．，Proc.Natl.Acad．Sci．USA，75 1929(197
8)）、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込むプ
ロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラスミド
をDNA受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込ま
せる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコールま
たはポリビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フイコール、プルロニッ
クＦ６８（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込
みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にDNAをとり込ま
せる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコールま
たはポリビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フイコール、プルロニッ
クＦ６８（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込
みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
形質転換の後、トリメトプリム耐性を獲得した菌株を所
望の形質転換株として分離する。このような形質転換株
は、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子が組み込まれ
ている組換えDNAを有している。組換えDNAを単離する方
法は、例えば形質転換株をリゾチーム・SDS処理により
溶菌させ、フェノール処理ののち、２容のエタノールを
加えてDNAを沈殿回収する。
望の形質転換株として分離する。このような形質転換株
は、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子が組み込まれ
ている組換えDNAを有している。組換えDNAを単離する方
法は、例えば形質転換株をリゾチーム・SDS処理により
溶菌させ、フェノール処理ののち、２容のエタノールを
加えてDNAを沈殿回収する。
（作用） このようにして得られたコリネ型細菌細胞内で増殖し同
細胞内に導入されたときトリメトプリム耐性を表現する
プラスミドは、異種のDNAを含んでいないので、コリネ
型細菌由来の遺伝子を挿入してコリネ型細菌により発現
させるのに特に適している。挿入，発現される遺伝子と
しては、アミノ酸生合成に関与する遺伝子等が考えられ
る。
細胞内に導入されたときトリメトプリム耐性を表現する
プラスミドは、異種のDNAを含んでいないので、コリネ
型細菌由来の遺伝子を挿入してコリネ型細菌により発現
させるのに特に適している。挿入，発現される遺伝子と
しては、アミノ酸生合成に関与する遺伝子等が考えられ
る。
実施例１ pAJ 228の作成 (1)ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 1203
6（ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９，ＥＥＲＭ ＢＰ−７３４よ
り変異誘導されたトリメトプリム耐性変異株AJ 12146
（ＦＥＲＭ Ｐ−７６７２，ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５）
を１のCMG培地（ペプトン１g/dl、酵母エキス１g/d
l、グルコース0.5g/dl、及びNaCl 0.5g/dlを含み、pH
７．２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振
盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体
をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、通常のフェノー
ル処理法により、染色体DNAを抽出精製し、最終的に
３．０mgのDNAを得た。
6（ＦＥＲＭ−Ｐ７５５９，ＥＥＲＭ ＢＰ−７３４よ
り変異誘導されたトリメトプリム耐性変異株AJ 12146
（ＦＥＲＭ Ｐ−７６７２，ＦＥＲＭ ＢＰ−７８５）
を１のCMG培地（ペプトン１g/dl、酵母エキス１g/d
l、グルコース0.5g/dl、及びNaCl 0.5g/dlを含み、pH
７．２に調整したもの）に植菌し、３０℃で約３時間振
盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体
をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、通常のフェノー
ル処理法により、染色体DNAを抽出精製し、最終的に
３．０mgのDNAを得た。
(2)ベクターとしてpAM 330を用いた。pAM 330は次の様
にして調製した。
にして調製した。
まずpAM 330をプラスミドとして保有するブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC 13869を１００ml
のCMG培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養
したのち、リゾチームSDS処理により溶菌させ、30,000
×g30分の超遠心により上清を得た。フェノール処理の
のち、２容のエタノールを加えてDNAを沈澱物として回
収した。これを少量のTEN緩衝液（２０mMトリス塩酸
塩、２０mM NaCl，１mM EDTA（pH８．０）に溶解後、ア
ガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAM 33
0プラスミドDNA約１５μｇを得た。
リウム・ラクトファーメンタムATCC 13869を１００ml
のCMG培地に接種し、３０℃で対数増殖期後期まで培養
したのち、リゾチームSDS処理により溶菌させ、30,000
×g30分の超遠心により上清を得た。フェノール処理の
のち、２容のエタノールを加えてDNAを沈澱物として回
収した。これを少量のTEN緩衝液（２０mMトリス塩酸
塩、２０mM NaCl，１mM EDTA（pH８．０）に溶解後、ア
ガロースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAM 33
0プラスミドDNA約１５μｇを得た。
(3) (1)で得た染色体DNA２０μｇと(2)で得たプラスミ
ドDNA１０μｇとを制限エンドヌクレアーゼMbo Ｉでそ
れぞれを３７℃、３０分間処理し、部分切断した。６５
℃，１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジ
チオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のDNAリガ
ーゼによって１０℃，２４時間DNA鎖の連結反応を行っ
た。６５℃，５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取した。
ドDNA１０μｇとを制限エンドヌクレアーゼMbo Ｉでそ
れぞれを３７℃、３０分間処理し、部分切断した。６５
℃，１０分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジ
チオスレイトール存在下、Ｔ４ファージ由来のDNAリガ
ーゼによって１０℃，２４時間DNA鎖の連結反応を行っ
た。６５℃，５分の熱処理後、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取した。
(4)トリメトプリム感受性のブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムAJ 12036を受容菌として用いた。
トファーメンタムAJ 12036を受容菌として用いた。
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５mlのCMG液体
培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニット／ml添加後、さらに１．５時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍシュー
クロース、２０mMマレイン酸、２０mM塩化マグネシウ
ム、３．５％ペナッセイブロス(Difco)からなるSMMP培
地（pH６．５）0.5mlで洗浄した。次いで１０mg/mlのリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し３０℃で２０時間プロ
トプラスト化を図った。6000×g、10分間遠心分離後、
プロトプラストをSMMPで洗浄し０．５mlのSMMPに再度懸
濁した。この様にして得られたプロトプラストと(3)で
調製したDNA１０μｇを５mM EDTA存在下で混合し、ポリ
エチレングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加
した後、DNAをプロトプラストに取り込ませる為に室温
に２分間放置した。このプロトプラストをSMMP培地１ml
で洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、形質発現の為、３
０℃で２時間培養した。この培養液をpH７．０のプロト
プラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再生培
地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン１２ｇ，KCl０．５ｇ，グルコース１０ｇ，MgC
l2・6H2O８．１ｇ，CaCl2・2H2O２．２ｇ，ペプトン４
ｇ，粉末酵母エキス４ｇ，カザミノ酸（Difco社）１
ｇ，K2HPO４0.2ｇ，コハク酸ナトリウム１３５ｇ，寒天
８ｇ及びトリメトプリム（Sigma社）２５μg/mlを含
む。
ーメーション法を用いた。まず、菌株を５mlのCMG液体
培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニット／ml添加後、さらに１．５時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍシュー
クロース、２０mMマレイン酸、２０mM塩化マグネシウ
ム、３．５％ペナッセイブロス(Difco)からなるSMMP培
地（pH６．５）0.5mlで洗浄した。次いで１０mg/mlのリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し３０℃で２０時間プロ
トプラスト化を図った。6000×g、10分間遠心分離後、
プロトプラストをSMMPで洗浄し０．５mlのSMMPに再度懸
濁した。この様にして得られたプロトプラストと(3)で
調製したDNA１０μｇを５mM EDTA存在下で混合し、ポリ
エチレングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加
した後、DNAをプロトプラストに取り込ませる為に室温
に２分間放置した。このプロトプラストをSMMP培地１ml
で洗浄後、SMMP培地１mlに再懸濁し、形質発現の為、３
０℃で２時間培養した。この培養液をpH７．０のプロト
プラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再生培
地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン１２ｇ，KCl０．５ｇ，グルコース１０ｇ，MgC
l2・6H2O８．１ｇ，CaCl2・2H2O２．２ｇ，ペプトン４
ｇ，粉末酵母エキス４ｇ，カザミノ酸（Difco社）１
ｇ，K2HPO４0.2ｇ，コハク酸ナトリウム１３５ｇ，寒天
８ｇ及びトリメトプリム（Sigma社）２５μg/mlを含
む。
３０℃で１週間培養後、約１００個のコロニーが出現し
てきたので、これをトリメトプリムを含む最少培地（２
％グルコース、１％硫酸アンモニウム、０．２５％尿
素、０．１％りん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マ
グネシウム７水塩、２ppm鉄イオン、２ppmマンガンイオ
ン、２００μg/サイアミン塩酸塩、５０μg/ビオチ
ン、pH７．０、寒天１．８％、トリメトプリム５０μg/
ml）にレプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た。
てきたので、これをトリメトプリムを含む最少培地（２
％グルコース、１％硫酸アンモニウム、０．２５％尿
素、０．１％りん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マ
グネシウム７水塩、２ppm鉄イオン、２ppmマンガンイオ
ン、２００μg/サイアミン塩酸塩、５０μg/ビオチ
ン、pH７．０、寒天１．８％、トリメトプリム５０μg/
ml）にレプリカし、トリメトプリム耐性１株を得た。
(5)これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、ベクターのpAM 330よりも明らかに
大きなプラスミドが検出された。この株をAJ 12147（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７６７３，ＦＥＲＭ ＢＰ−７８６）と名
付けた。
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、ベクターのpAM 330よりも明らかに
大きなプラスミドが検出された。この株をAJ 12147（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７６７３，ＦＥＲＭ ＢＰ−７８６）と名
付けた。
(6) AJ 12147が有するプラスミド（pAJ 228）上にトリ
メトプリム耐性遺伝子が存在することを確認するため、
このプラスミドDNAを用いブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムAJ 12036を再度、形質転換した。
メトプリム耐性遺伝子が存在することを確認するため、
このプラスミドDNAを用いブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムAJ 12036を再度、形質転換した。
生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ１０個を釣り上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドDNAを検出したところ、これらのいずれにもpAJ 2
28と同じ大きさのプラスミドが存在していた。上記組換
えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現する遺伝子
が存在することが明らかとなった。
ぞれ１０個を釣り上げアガロース電気泳動法によりプラ
スミドDNAを検出したところ、これらのいずれにもpAJ 2
28と同じ大きさのプラスミドが存在していた。上記組換
えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現する遺伝子
が存在することが明らかとなった。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12146
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 120
36を１，０００μg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンに０℃にて２０分間接触せしめて
変異処理し、最小培地（グルコース２g/dl、硫安１g/d
l、尿素0.25g/dl、KH2PO４0.1g/dl、MgSO4・7H2O 0.04g/
dl、サイアミン塩酸塩２００μg/、ビオチン５０μg/
、２ppm鉄イオン、２ppmマンガンイオン、寒天１．５
g/dlを含み、pH７．０に調整したもの）にトリメトプリ
ム１００μg/mlを加えた培地で生育しうる菌株として分
離したものである。
は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 120
36を１，０００μg/mlのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジンに０℃にて２０分間接触せしめて
変異処理し、最小培地（グルコース２g/dl、硫安１g/d
l、尿素0.25g/dl、KH2PO４0.1g/dl、MgSO4・7H2O 0.04g/
dl、サイアミン塩酸塩２００μg/、ビオチン５０μg/
、２ppm鉄イオン、２ppmマンガンイオン、寒天１．５
g/dlを含み、pH７．０に調整したもの）にトリメトプリ
ム１００μg/mlを加えた培地で生育しうる菌株として分
離したものである。
AJ 12036は、AJ 12147より宿主細胞を損うことなく宿主
細胞中の複合プラスミドを除去することにより容易に得
られる。即ち、プラスミドは宿主より自然に失なわれる
こともあるし、「除去」操作によって除くこともできる
（Bact.Rev．，36，p361-405（1972））。除去操作の一
例は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害する
濃度（２−５０μg/ml）のアクリジオレンジを含む培地
に、１ml当り約10４細胞程度になる様に少量の菌株を接
種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから２７−３７℃
で一夜培養する（Ｊ．Bacteriol．，88，261（196
4））。培養液を寒天培地に塗布し、２７−３７℃で一
夜培養する。
細胞中の複合プラスミドを除去することにより容易に得
られる。即ち、プラスミドは宿主より自然に失なわれる
こともあるし、「除去」操作によって除くこともできる
（Bact.Rev．，36，p361-405（1972））。除去操作の一
例は以下の通りである：宿主の生育を不完全に阻害する
濃度（２−５０μg/ml）のアクリジオレンジを含む培地
に、１ml当り約10４細胞程度になる様に少量の菌株を接
種し宿主菌の生育を不完全に阻害してから２７−３７℃
で一夜培養する（Ｊ．Bacteriol．，88，261（196
4））。培養液を寒天培地に塗布し、２７−３７℃で一
夜培養する。
培地上に出現したコロニーのうち、トリメトプリム（５
０μg/ml）に感受性を示す株プラスミドが除去されてい
る株で即ち、AJ 12036である。
０μg/ml）に感受性を示す株プラスミドが除去されてい
る株で即ち、AJ 12036である。
(7) pAJ 228 ＤＮＡの性質 (a) pAJ 228の分子量の決定はアガロースゲル電気泳動
によった。
によった。
アガロースゲル電気泳動はシャープ（P.A.Sharp）らの
方法（Biochemistry 12，3055(1973)）により、０．８
％ゲルを用い、ゲル長さcm当り、５Ｖで１５時間、定量
圧で泳動した。分子量はpAJ228を１ケ所切断する制限酵
素Cla I 0.5ユニットをpAJ228０．５μｇに３７℃、１
時間反応させ、切断し、直線状にした後、分子量既知の
分子量マーカー、λファージのHind IIIフラグメント
（BRL社）との移動度の比較によって算出し、７．６Kb
と計算された。
方法（Biochemistry 12，3055(1973)）により、０．８
％ゲルを用い、ゲル長さcm当り、５Ｖで１５時間、定量
圧で泳動した。分子量はpAJ228を１ケ所切断する制限酵
素Cla I 0.5ユニットをpAJ228０．５μｇに３７℃、１
時間反応させ、切断し、直線状にした後、分子量既知の
分子量マーカー、λファージのHind IIIフラグメント
（BRL社）との移動度の比較によって算出し、７．６Kb
と計算された。
また、同様の方法で市販されている各種制限酵素による
切断箇所を第１表に示した。
切断箇所を第１表に示した。
(b) pAJ 228 DNAの制限酵素切断地図の作成制限酵素はB
RLの市販品を使用し、制限酵素によるpAJ 228 DNAの切
断は、少なくとも３倍過剰以上の酵素を使用して、各酵
素毎に指定された条件で行なった。制限酵素切断地図作
成のためにプラスミドDNAを１種以上の制限酵素で切断
する場合には、第１の制限酵素切断断片を分離用アガロ
ースゲルよりタナカらの方法（Ｔ．Tanaka．，Ｂ．Weis
blum．Ｊ．Bacteriol．，121，354(1975)）により単離
後、エタノール沈澱により濃縮し第２の制限酵素で切断
した。切断断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、分子
量を算出し、制限酵素切断地図を作成した。（第１図） (c) pAJ 228のコピー数の測定 pAJ 228を保持するブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムAJ 12147をトリメトプリム５０μg/mlを含む５
mlのCMG液体培地に接種し、３０℃で一晩培養後、その
０．１mlをトリメトプリム５０μg/mlを含む５mlのCMG
液体培地に再度接種した。３０℃で対数増殖期の初期ま
で培養し1000μg/mlになるようにアンピシリンを添加
後、さらに２時間培養し、遠心分離により菌体を集め１
０mg/mlのリゾチームを含むトリム・EDTA・NaClバッファ
ー１．５mlに懸濁し３７℃で２時間インキュベート後、
SDS（最終濃度４％）を添加し６５℃、２０分間溶菌し
た。プロトプラストは完全に溶菌したことを確認した
後、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを加
え−２０℃でDNA沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・EDT
A.NaClバッファーに懸濁した。このDNA溶液をリボヌク
レアーゼで処理（リボヌクレアーゼＩ ５０μg/mlで３
７℃、６０分間反応）後、再度フェノール抽出し、つい
で２倍量のエタノールを加え、−２０℃でDNA沈澱さ
せ、沈澱物を少量のトリス・EDTA・NaClバッファーに懸
濁後０．８％のアガロースゲル電気泳動にかけ、泳動ネ
ガフィルムをデンシトメーターにかけ、染色体DNAとプ
ラスミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量を３．
０×109ダルトン、pAJ228を５．０×106ダルトンとして
計算によりコピー数を求めたところ、染色体あたり１６
コピー存在することが判明した。同様の方法で求めたpA
M 330のコピー数も１５コピーであった。
RLの市販品を使用し、制限酵素によるpAJ 228 DNAの切
断は、少なくとも３倍過剰以上の酵素を使用して、各酵
素毎に指定された条件で行なった。制限酵素切断地図作
成のためにプラスミドDNAを１種以上の制限酵素で切断
する場合には、第１の制限酵素切断断片を分離用アガロ
ースゲルよりタナカらの方法（Ｔ．Tanaka．，Ｂ．Weis
blum．Ｊ．Bacteriol．，121，354(1975)）により単離
後、エタノール沈澱により濃縮し第２の制限酵素で切断
した。切断断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、分子
量を算出し、制限酵素切断地図を作成した。（第１図） (c) pAJ 228のコピー数の測定 pAJ 228を保持するブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムAJ 12147をトリメトプリム５０μg/mlを含む５
mlのCMG液体培地に接種し、３０℃で一晩培養後、その
０．１mlをトリメトプリム５０μg/mlを含む５mlのCMG
液体培地に再度接種した。３０℃で対数増殖期の初期ま
で培養し1000μg/mlになるようにアンピシリンを添加
後、さらに２時間培養し、遠心分離により菌体を集め１
０mg/mlのリゾチームを含むトリム・EDTA・NaClバッファ
ー１．５mlに懸濁し３７℃で２時間インキュベート後、
SDS（最終濃度４％）を添加し６５℃、２０分間溶菌し
た。プロトプラストは完全に溶菌したことを確認した
後、フェノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを加
え−２０℃でDNA沈澱させ、沈澱物を少量のトリス・EDT
A.NaClバッファーに懸濁した。このDNA溶液をリボヌク
レアーゼで処理（リボヌクレアーゼＩ ５０μg/mlで３
７℃、６０分間反応）後、再度フェノール抽出し、つい
で２倍量のエタノールを加え、−２０℃でDNA沈澱さ
せ、沈澱物を少量のトリス・EDTA・NaClバッファーに懸
濁後０．８％のアガロースゲル電気泳動にかけ、泳動ネ
ガフィルムをデンシトメーターにかけ、染色体DNAとプ
ラスミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量を３．
０×109ダルトン、pAJ228を５．０×106ダルトンとして
計算によりコピー数を求めたところ、染色体あたり１６
コピー存在することが判明した。同様の方法で求めたpA
M 330のコピー数も１５コピーであった。
実施例２ 実施例１に示したプロトプラスト形質転換法を用いて、
コリネバクテリウム・グルタミカム（ATCC 13060）をpA
J 228を用いて形質転換した後、トリメトプリム耐性で
選択し、形質転換株を得た。また、アガロース電気泳動
により、形質転換株がpAJ 228を有していることを確認
した。
コリネバクテリウム・グルタミカム（ATCC 13060）をpA
J 228を用いて形質転換した後、トリメトプリム耐性で
選択し、形質転換株を得た。また、アガロース電気泳動
により、形質転換株がpAJ 228を有していることを確認
した。
実施例３ pAJ 228の小型化 実施例１で作成したpAJ 228のDNA５μｇを制限エンドヌ
クレアーゼHaeII（５ユニット）で３０℃，３０分間処
理し、部分切断した。その後実施例１と同様の方法でＴ
4ファージ由来のDNAリガーゼによるDNA鎖の連結反応を
行った。反応後、６５℃，１０分の熱処理し、２倍容の
エタノールの添加により沈澱採取されるDNAを実施例１
と同様の方法によりトリメトプリム感受性のブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036を受容菌とし
てプロトプラストトランスフォーメーションを行った
後、トリメトプリム１００μg/mlを含むプロトプラスト
再生培地で培養した結果、約１００個の再生コロニーが
出現してきたので、これらの株の中より１０株を選び、
実施例１で述べた方法により溶菌液を調製し、アガロー
スゲル電気泳動によりプラスミドDNAを検出したとこ
ろ、pAJ 228よりも明らかに小型のプラスミドが１株検
出された。このプラスミドをpAJ 225と名付けた。pAJ 2
25の分子量は実施例１に示したと同様のアガロース・ゲ
ル電気泳動を用いた解折により５．１Kbと算出された。
また第２図にはpAJ 225の制限酵素切断地図を示した。p
AJ 225はpAJ 228から制限酵素HaeIIにより切り出される
約２．５KbのDNA断片を取り除いた構造であり、小型化
することによって、pAJ 228に比べ、より大きなDNA断片
を組み込むことができる有用なプラスミドベクターであ
る。
クレアーゼHaeII（５ユニット）で３０℃，３０分間処
理し、部分切断した。その後実施例１と同様の方法でＴ
4ファージ由来のDNAリガーゼによるDNA鎖の連結反応を
行った。反応後、６５℃，１０分の熱処理し、２倍容の
エタノールの添加により沈澱採取されるDNAを実施例１
と同様の方法によりトリメトプリム感受性のブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036を受容菌とし
てプロトプラストトランスフォーメーションを行った
後、トリメトプリム１００μg/mlを含むプロトプラスト
再生培地で培養した結果、約１００個の再生コロニーが
出現してきたので、これらの株の中より１０株を選び、
実施例１で述べた方法により溶菌液を調製し、アガロー
スゲル電気泳動によりプラスミドDNAを検出したとこ
ろ、pAJ 228よりも明らかに小型のプラスミドが１株検
出された。このプラスミドをpAJ 225と名付けた。pAJ 2
25の分子量は実施例１に示したと同様のアガロース・ゲ
ル電気泳動を用いた解折により５．１Kbと算出された。
また第２図にはpAJ 225の制限酵素切断地図を示した。p
AJ 225はpAJ 228から制限酵素HaeIIにより切り出される
約２．５KbのDNA断片を取り除いた構造であり、小型化
することによって、pAJ 228に比べ、より大きなDNA断片
を組み込むことができる有用なプラスミドベクターであ
る。
実施例４ pAJ 228へのPstI切断部位の導入 pAJ 228は第１表に示したような制限酵素の切断部位を
有しているが遺伝子の挿入に有用な１箇所切断の部位と
してはClaI，HpaI，MstI，SmaI，XbaI，XhoI，XmaIが知
られているのみである。一方、これまで用いられてきた
コリネ型細菌細胞内で増殖可能なプラスミドベクターに
おいては制限酵素PstIによる切断部位が有用な遺伝子挿
入部位として利用されてきている（欧州特許出願公開0
093 611）。そこでpAJ 228中に新たにPst 切断部位を造
成することにした。
有しているが遺伝子の挿入に有用な１箇所切断の部位と
してはClaI，HpaI，MstI，SmaI，XbaI，XhoI，XmaIが知
られているのみである。一方、これまで用いられてきた
コリネ型細菌細胞内で増殖可能なプラスミドベクターに
おいては制限酵素PstIによる切断部位が有用な遺伝子挿
入部位として利用されてきている（欧州特許出願公開0
093 611）。そこでpAJ 228中に新たにPst 切断部位を造
成することにした。
pAJ 228のDNA 0.1μｇを制限エンドヌクレアーゼHpaIで
３７℃，２時間処理し、完全に切断した後６５℃，１０
分の熱処理を行なった。この反応液に宝酒造製のPstIリ
ンカーd(pG-C-T-G-C-A-G-C)を１００ｐmole添加し、ATP
及びジチオスレイトール存在下、Ｔ4ファージ由来のDNA
リガーゼによって１０℃，２４時間DNA鎖の連結反応を
行った。６５℃，５分の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取し
た。得られたDNAを実施例１と同様の方法でトリメトプ
リム感受性のブレビバクテリム・ラクトファーメンタム
AJ 12036にプロトプラストトランスフォーメーション法
により導入した後、トリメトプリム１００μg/mlを含む
プロトプラスト再生培地で培養した結果約１００個の再
生コロニーが出現してきたので、これらの株の中から１
０株を選び、実施例１に述べた方法により溶菌液を調製
し、アガロース・ゲル電気泳動によりプラスミドDNAを
検出したところ、いずれもpAJ 228とほぼ同様の大きさ
のプラスミドが検出された。これらのプラスミドを制限
酵素PstIあるいはHpaIで37℃，２時間処理し完全に切断
した後、アガロース・ゲル電気泳動によりプラスミドDN
Aを検出したところPstIにより切断され、HpaIにより切
断されないプラスミドが検出された。このプラスミドを
pAJ 226と名付けた。第３図にpAJ 226の制限酵素切断地
図を示す。pAJ 226はpAJ 228のHpaI切断部位にPstIリン
カーが挿入された結果、HpaI切断部位が消失し、PstI切
断部位が形成された。
３７℃，２時間処理し、完全に切断した後６５℃，１０
分の熱処理を行なった。この反応液に宝酒造製のPstIリ
ンカーd(pG-C-T-G-C-A-G-C)を１００ｐmole添加し、ATP
及びジチオスレイトール存在下、Ｔ4ファージ由来のDNA
リガーゼによって１０℃，２４時間DNA鎖の連結反応を
行った。６５℃，５分の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱採取し
た。得られたDNAを実施例１と同様の方法でトリメトプ
リム感受性のブレビバクテリム・ラクトファーメンタム
AJ 12036にプロトプラストトランスフォーメーション法
により導入した後、トリメトプリム１００μg/mlを含む
プロトプラスト再生培地で培養した結果約１００個の再
生コロニーが出現してきたので、これらの株の中から１
０株を選び、実施例１に述べた方法により溶菌液を調製
し、アガロース・ゲル電気泳動によりプラスミドDNAを
検出したところ、いずれもpAJ 228とほぼ同様の大きさ
のプラスミドが検出された。これらのプラスミドを制限
酵素PstIあるいはHpaIで37℃，２時間処理し完全に切断
した後、アガロース・ゲル電気泳動によりプラスミドDN
Aを検出したところPstIにより切断され、HpaIにより切
断されないプラスミドが検出された。このプラスミドを
pAJ 226と名付けた。第３図にpAJ 226の制限酵素切断地
図を示す。pAJ 226はpAJ 228のHpaI切断部位にPstIリン
カーが挿入された結果、HpaI切断部位が消失し、PstI切
断部位が形成された。
実施例５ pAJ 228からの発現ベクターの造成 プラスミドベクターに遺伝子DNAを組み込む場合、組み
込んだ遺伝子DNA上にその遺伝子の発現を司どるプロモ
ーターが存在する場合にはそのプロモーターの作用によ
って遺伝子発現が行われるが、組み込んだ遺伝子DNA上
にプロモーターが存在しない場合にはベクター中のプロ
モーターを利用して遺伝子を発現させることが必要とな
る。従って、ベクターの有するプロモーター領域の下流
に遺伝子DNA挿入用の制限酵素切断部位を配置したベク
ターは発現ベクターとして極めて有用である。実施例
１，３，および４に示したプラスミド・ベクターpAJ 22
8，pAJ 225，ならびにpAJ 226は、遺伝子DNA挿入用の制
限酵素切断部位が必ずしもプロモーター領域の下流に配
置されておらず、発現ベクターとしての有用性は低かっ
た。そこで本実施例ではpAJ 228中に存在するプロモー
ター領域の下流に制限酵素の切断部位を配置した発現ベ
クターを造成する方法について示す。
込んだ遺伝子DNA上にその遺伝子の発現を司どるプロモ
ーターが存在する場合にはそのプロモーターの作用によ
って遺伝子発現が行われるが、組み込んだ遺伝子DNA上
にプロモーターが存在しない場合にはベクター中のプロ
モーターを利用して遺伝子を発現させることが必要とな
る。従って、ベクターの有するプロモーター領域の下流
に遺伝子DNA挿入用の制限酵素切断部位を配置したベク
ターは発現ベクターとして極めて有用である。実施例
１，３，および４に示したプラスミド・ベクターpAJ 22
8，pAJ 225，ならびにpAJ 226は、遺伝子DNA挿入用の制
限酵素切断部位が必ずしもプロモーター領域の下流に配
置されておらず、発現ベクターとしての有用性は低かっ
た。そこで本実施例ではpAJ 228中に存在するプロモー
ター領域の下流に制限酵素の切断部位を配置した発現ベ
クターを造成する方法について示す。
pAJ 228中のプロモーター領域の検索には、プロモータ
ー領域を有さず、かつ、プロモーター領域の下流に組み
込んだ場合に検出可能な表現形質をコリネ型細菌細胞中
で発現するようなDNA断片をプローブとして用いる方法
が便利である。このようなDNA断片としてブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 11188（FERM-P 419
0）（特公昭５６−３０３８）由来のホモセリンキナー
ゼ(HK)をコードする２．９KbのDNA断片を用いた。このD
NA断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ
12079（ＦＥＲＭ Ｐ−７２３７，ＦＥＲＭ ＢＰ−５
７８）中に存在するHK遺伝子を挿入した組換えプラスミ
ドpAJ 211から制限酵素PstIによる部分切断で切り出す
ことが可能である。このDNA断片にプロモーター領域が
存在しないことは実施例４に示したpAJ 226のPst切断部
位に挿入した際に、挿入の方向のいかんにかかわらずＨ
Ｋ遺伝子の発現が認められないことから確認された。
ー領域を有さず、かつ、プロモーター領域の下流に組み
込んだ場合に検出可能な表現形質をコリネ型細菌細胞中
で発現するようなDNA断片をプローブとして用いる方法
が便利である。このようなDNA断片としてブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 11188（FERM-P 419
0）（特公昭５６−３０３８）由来のホモセリンキナー
ゼ(HK)をコードする２．９KbのDNA断片を用いた。このD
NA断片はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ
12079（ＦＥＲＭ Ｐ−７２３７，ＦＥＲＭ ＢＰ−５
７８）中に存在するHK遺伝子を挿入した組換えプラスミ
ドpAJ 211から制限酵素PstIによる部分切断で切り出す
ことが可能である。このDNA断片にプロモーター領域が
存在しないことは実施例４に示したpAJ 226のPst切断部
位に挿入した際に、挿入の方向のいかんにかかわらずＨ
Ｋ遺伝子の発現が認められないことから確認された。
次にこのＨＫ遺伝子を含むDNA断片を用いてpAJ 228より
発現ベクターを造成する方法について述べる。その方法
の概略を第４図に示した。
発現ベクターを造成する方法について述べる。その方法
の概略を第４図に示した。
pAJ 211より制限酵素PstIによる部分切断で切り出した
１．９MdのDNA断片の両端にBamHI ，SalI，PstIの切断
部位をもった第４図に示したような合成オリゴヌクレオ
チドリンカーをＴ4ファージ由来のDNAリガーゼを用いて
連結させた後、制限酵素BamHIで切断した。得られたDNA
混合物をアガロース・ゲル電気泳動にかけ、約２．９Kb
のDNA断片を分離抽出し、エタノール沈澱によりDNA断片
を回収した。こうして得られたDNA断片は２．９KbのＨ
Ｋ遺伝子を含むDNAの両端にPstI，SalI，BamHIの切断部
位が並んだ構造になっている（第４図）。
１．９MdのDNA断片の両端にBamHI ，SalI，PstIの切断
部位をもった第４図に示したような合成オリゴヌクレオ
チドリンカーをＴ4ファージ由来のDNAリガーゼを用いて
連結させた後、制限酵素BamHIで切断した。得られたDNA
混合物をアガロース・ゲル電気泳動にかけ、約２．９Kb
のDNA断片を分離抽出し、エタノール沈澱によりDNA断片
を回収した。こうして得られたDNA断片は２．９KbのＨ
Ｋ遺伝子を含むDNAの両端にPstI，SalI，BamHIの切断部
位が並んだ構造になっている（第４図）。
一方、pAJ 228は制限酵素MboIで部分切断した後６５
℃，１０分の熱処理をした。この反応液に前述の方法で
得たＨＫ遺伝子を含むDNA断片を加え、T4DNAリガーゼで
DNA鎖の連結反応を行った。反応後、６５℃，５分の熱
処理をし、２倍容のエタノールの添加により沈澱採取さ
れるDNAを、実施例１と同様の方法によりトリメトプリ
ム感受性で、かつ、ＨＫ遺伝子が欠損したブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 12078を受容菌として
プロトプラストトランスフォーメーションを行った後、
トリメトプリム１００μg/mlを含むプロトプラスト再生
培地で培養した結果約２００個の再生コロニーが出現し
てきた。
℃，１０分の熱処理をした。この反応液に前述の方法で
得たＨＫ遺伝子を含むDNA断片を加え、T4DNAリガーゼで
DNA鎖の連結反応を行った。反応後、６５℃，５分の熱
処理をし、２倍容のエタノールの添加により沈澱採取さ
れるDNAを、実施例１と同様の方法によりトリメトプリ
ム感受性で、かつ、ＨＫ遺伝子が欠損したブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ 12078を受容菌として
プロトプラストトランスフォーメーションを行った後、
トリメトプリム１００μg/mlを含むプロトプラスト再生
培地で培養した結果約２００個の再生コロニーが出現し
てきた。
これをトリメトプリムを２００μg/mlを含み受容菌の要
求物質であるスレオニンを含まない最少培地にレプリカ
し、トリメトプリム耐性で、かつスレオニン要求性が消
失した菌株４株を得た。これらの株より実施例１に示し
た方法により溶菌液を調製し、アガロース・ゲル電気泳
動によりプラスミドDNAを検出したところ14.9Kb，12.2K
b，9.6Kb，6.5Kbのプラスミドが検出された。このうち
最も分子量の小さい６．５KbのプラスミドをpAJ 224 HK
と名付けた。
求物質であるスレオニンを含まない最少培地にレプリカ
し、トリメトプリム耐性で、かつスレオニン要求性が消
失した菌株４株を得た。これらの株より実施例１に示し
た方法により溶菌液を調製し、アガロース・ゲル電気泳
動によりプラスミドDNAを検出したところ14.9Kb，12.2K
b，9.6Kb，6.5Kbのプラスミドが検出された。このうち
最も分子量の小さい６．５KbのプラスミドをpAJ 224 HK
と名付けた。
次にpAJ 224 HKを制限酵素PstIで完全に切断した後アガ
ロース電気泳動ゲルからベクターpAJ228が小型化したと
考えられる３．６Kb断片を回収し、実施例１と同様の方
法でT4DNAリガーゼによるDNA鎖の連結反応、ならびにト
リメトプリム感受性のブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムAJ 12036を受容菌としてプロトプラストトラ
ンスフォーメンションを行った。トリメトプリム１００
μg/mlを含むプロトプラスト再生培地で培養後、得られ
た再生コロニー約１００個の中より１０株を選び、実施
例１と同様の方法で溶菌液を調製し、アガロース・ゲル
電気泳動によりプラスミドDNAを検出したところ、pAJ 2
24 HKよりＨＫ遺伝子を含む２．９KbのDNAが除去された
と考えられる３．６KbのプラスミドDNAが検出された。
このプラスミドをpAJ 224と名付け、このpAJ224を保持
する菌株をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ 12196（ＦＥＲＭ Ｐ−８０１５，ＦＥＲＭ ＢＰ−
７８７）と名付けた。pAJ 224の制限酵素切断地図を第
５図に示す。
ロース電気泳動ゲルからベクターpAJ228が小型化したと
考えられる３．６Kb断片を回収し、実施例１と同様の方
法でT4DNAリガーゼによるDNA鎖の連結反応、ならびにト
リメトプリム感受性のブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムAJ 12036を受容菌としてプロトプラストトラ
ンスフォーメンションを行った。トリメトプリム１００
μg/mlを含むプロトプラスト再生培地で培養後、得られ
た再生コロニー約１００個の中より１０株を選び、実施
例１と同様の方法で溶菌液を調製し、アガロース・ゲル
電気泳動によりプラスミドDNAを検出したところ、pAJ 2
24 HKよりＨＫ遺伝子を含む２．９KbのDNAが除去された
と考えられる３．６KbのプラスミドDNAが検出された。
このプラスミドをpAJ 224と名付け、このpAJ224を保持
する菌株をブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
AJ 12196（ＦＥＲＭ Ｐ−８０１５，ＦＥＲＭ ＢＰ−
７８７）と名付けた。pAJ 224の制限酵素切断地図を第
５図に示す。
pAJ 224が発現ベクターとしての機能を有していること
は、上述のごとく、プロモーター領域を持たないＨＫ遺
伝子のDNA断片を制限酵素PstIの切断部位に挿入した場
合に、ＨＫ欠損株のスレオニン要求性が消失することか
ら確認できるわけであるが、さらにその発現活性の強度
を調べることを目的として、以下の実験を行なった。
は、上述のごとく、プロモーター領域を持たないＨＫ遺
伝子のDNA断片を制限酵素PstIの切断部位に挿入した場
合に、ＨＫ欠損株のスレオニン要求性が消失することか
ら確認できるわけであるが、さらにその発現活性の強度
を調べることを目的として、以下の実験を行なった。
発現活性の強度の指標としてはコリネ型細菌細胞中で発
現し、容易に測定可能なクロラムフェニコールに対する
耐性度を用いることとした。第６図に示したごとく、ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモーター領域を除
いた構造遺伝子領域をプラスミドpCM４（Gene，20，305
〜306(1982)参照）のDNAから制限酵素BamHIを用いて切
り出し、同じくBamHIで完全切断したpAJ 224のDNAと混
合し、T4DNAリガーゼによってDNA鎖の連結反応をした。
実施例１と同様の方法で熱変性，エタノール沈澱を行
い、得られたDNAをクロラムフェニコール感受性のブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036を受容
菌としてプロトプラストトランスフォーメーションを行
った後、クロラムフェニコール２μg/mlを含むプロトプ
ラスト再生培地で培養し、クロラムフェニコール耐性の
再生コロニーを得た。これらのクロラムフェニコール耐
性株の中で１０株を選び実施例１と同様の方法で溶菌液
を調製し、アガロース・ゲル電気泳動によってプラスミ
ドDNAを検出したところ、いずれもpAJ 224にpCM４由来
のクロラムフェニコール耐性の構造遺伝子領域を含むDN
A断片が挿入された４．４Kbのプラスミドであった。こ
のプラスミドをpAJ 224 Cmｒと名付けた（第６図）。
現し、容易に測定可能なクロラムフェニコールに対する
耐性度を用いることとした。第６図に示したごとく、ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子のプロモーター領域を除
いた構造遺伝子領域をプラスミドpCM４（Gene，20，305
〜306(1982)参照）のDNAから制限酵素BamHIを用いて切
り出し、同じくBamHIで完全切断したpAJ 224のDNAと混
合し、T4DNAリガーゼによってDNA鎖の連結反応をした。
実施例１と同様の方法で熱変性，エタノール沈澱を行
い、得られたDNAをクロラムフェニコール感受性のブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036を受容
菌としてプロトプラストトランスフォーメーションを行
った後、クロラムフェニコール２μg/mlを含むプロトプ
ラスト再生培地で培養し、クロラムフェニコール耐性の
再生コロニーを得た。これらのクロラムフェニコール耐
性株の中で１０株を選び実施例１と同様の方法で溶菌液
を調製し、アガロース・ゲル電気泳動によってプラスミ
ドDNAを検出したところ、いずれもpAJ 224にpCM４由来
のクロラムフェニコール耐性の構造遺伝子領域を含むDN
A断片が挿入された４．４Kbのプラスミドであった。こ
のプラスミドをpAJ 224 Cmｒと名付けた（第６図）。
次にpAJ 224 Cmｒを保持するブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムAJ 12036と他の菌株とのクロラムフェ
ニコールに対する耐性度を比較した結果を第２表に示
す。クロラムフェニコール耐性株の代表的な菌株として
クロラムフェニコール耐性遺伝子の全領域を有するプラ
スミドpAJ 1844（欧州特許出願公開0 093 611）を対照
として用いた。第２表より明らかなように、pAJ 224 Cm
rを保持する菌株はpAJ 1844を保持する菌株と同等のク
ロラムフェニコール耐性を示すことからpAJ224は発現ベ
クターとしての有用性が高いことが確認された。またpA
J 224 Cmr中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の構造
遺伝子領域の挿入方向について制限酵素XbaIおよびEcoR
Iによる切断パターンで解析した結果、得られたpAJ 224
Cmｒの中にはトリメトプリム耐性遺伝子側を上流
（５′側）として挿入されているもの（pAJ 224 Cmr-
A）と、逆の方向で挿入されているもの（pAJ 224 Cmr-
B）との２種類が存在していることが明らかとなった。
このことはpAJ 224においては、制限酵素BamHI,SalI,Ps
tIの切断部位をはさんで両側にプロモーター領域が存在
することを示しており、この切断部位に挿入した遺伝子
は挿入の方向のいかんにかかわらず発現可能なことを示
している。
トファーメンタムAJ 12036と他の菌株とのクロラムフェ
ニコールに対する耐性度を比較した結果を第２表に示
す。クロラムフェニコール耐性株の代表的な菌株として
クロラムフェニコール耐性遺伝子の全領域を有するプラ
スミドpAJ 1844（欧州特許出願公開0 093 611）を対照
として用いた。第２表より明らかなように、pAJ 224 Cm
rを保持する菌株はpAJ 1844を保持する菌株と同等のク
ロラムフェニコール耐性を示すことからpAJ224は発現ベ
クターとしての有用性が高いことが確認された。またpA
J 224 Cmr中のクロラムフェニコール耐性遺伝子の構造
遺伝子領域の挿入方向について制限酵素XbaIおよびEcoR
Iによる切断パターンで解析した結果、得られたpAJ 224
Cmｒの中にはトリメトプリム耐性遺伝子側を上流
（５′側）として挿入されているもの（pAJ 224 Cmr-
A）と、逆の方向で挿入されているもの（pAJ 224 Cmr-
B）との２種類が存在していることが明らかとなった。
このことはpAJ 224においては、制限酵素BamHI,SalI,Ps
tIの切断部位をはさんで両側にプロモーター領域が存在
することを示しており、この切断部位に挿入した遺伝子
は挿入の方向のいかんにかかわらず発現可能なことを示
している。
実施例６ pAJ 223の造成 実施例５のごとく造成されたpAJ 224 HKを制限酵素SalI
で完全切断した後、T4DNAリガーゼによってDNA鎖の連結
反応をした。実施例１と同様の方法で熱変性，エタノー
ル沈澱を行い、得られたDNAをトリメトプリム感受性の
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036に
プロトプラストトランスフォーメーションし、プロトプ
ラスト再生培地で培養した。出現した再生コロニーをト
リメトプリムを含む最少培地にレプリカし、トリメトプ
リム耐性株を選択した。これらの耐性株の中で２０株を
選び実施例１と同様の方法で溶菌液を調製し、アガロー
ス・ゲル電気泳動によってプラスミドDNAを検出したと
ころ、実施例５に示したpAJ 224とほぼ同様の３．６Kb
のプラスミドDNAが検出された。このプラスミドをpAJ 2
23と名付けた。第７図にはpAJ 223の制限酵素切断地図
を示した。pAJ 223はpAJ 224から制限酵素PstIの切断部
位を除去した構造を有している。
で完全切断した後、T4DNAリガーゼによってDNA鎖の連結
反応をした。実施例１と同様の方法で熱変性，エタノー
ル沈澱を行い、得られたDNAをトリメトプリム感受性の
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ 12036に
プロトプラストトランスフォーメーションし、プロトプ
ラスト再生培地で培養した。出現した再生コロニーをト
リメトプリムを含む最少培地にレプリカし、トリメトプ
リム耐性株を選択した。これらの耐性株の中で２０株を
選び実施例１と同様の方法で溶菌液を調製し、アガロー
ス・ゲル電気泳動によってプラスミドDNAを検出したと
ころ、実施例５に示したpAJ 224とほぼ同様の３．６Kb
のプラスミドDNAが検出された。このプラスミドをpAJ 2
23と名付けた。第７図にはpAJ 223の制限酵素切断地図
を示した。pAJ 223はpAJ 224から制限酵素PstIの切断部
位を除去した構造を有している。
第１図は、プラスミドpAJ 228の制限酵素切断地図であ
る。 第２図は、プラスミドpAJ 225の制限酵素切断地図であ
る。 第３図は、プラスミドpAJ 226の制限酵素切断地図であ
る。 第４図は、発現用プラスミドpAJ 224を造成する方法で
ある。 第５図は、プラスミドpAJ 224の制限酵素切断地図であ
る。 第６図は、プラスミドpAJ 224 Cmrを造成する方法であ
る。 第７図は、プラスミドpAJ 223の制限酵素切断地図であ
る。
る。 第２図は、プラスミドpAJ 225の制限酵素切断地図であ
る。 第３図は、プラスミドpAJ 226の制限酵素切断地図であ
る。 第４図は、発現用プラスミドpAJ 224を造成する方法で
ある。 第５図は、プラスミドpAJ 224の制限酵素切断地図であ
る。 第６図は、プラスミドpAJ 224 Cmrを造成する方法であ
る。 第７図は、プラスミドpAJ 223の制限酵素切断地図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (56)参考文献 特開 昭58−67699（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−77895（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−35197（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−148094（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，91（1982）Ｐ. 1205−1212 Ｇｅｎｅ，29（1984）Ｐ．135−143
Claims (8)
- 【請求項１】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来であり、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を
含み、両端に Mbo I 切断部位を有し、 Cla I 及び Hin
d III によりそれぞれ一箇所で切断される約１．２kbの
ＤＮＡ断片。 - 【請求項２】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来であり、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を
含み、両端に Mbo I 切断部位を有し、 Cla I 及び Hin
d III によりそれぞれ一箇所で切断される約１．２kbの
ＤＮＡ断片と、コリネ型細菌細胞内で自律複製可能なプ
ラスミドとが連結されて得られる組換えＤＮＡ。 - 【請求項３】組換えＤＮＡがプラスミド pAJ 228 であ
る、特許請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】組換えＤＮＡがプラスミド pAJ 225 であ
る、特許請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項５】組換えＤＮＡがプラスミド pAJ 226 であ
る、特許請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】組換えＤＮＡがプラスミド pAJ 224 であ
る、特許請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】組換えＤＮＡがプラスミド pAJ 223 であ
る、特許請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項８】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ム由来であり、トリメトプリム耐性を表現する遺伝子を
含み、両端に Mbo I 切断部位を有し、 Cla I 及び Hin
d III によりそれぞれ一箇所で切断される約１．２kbの
ＤＮＡ断片と、コリネ型細菌細胞内で自律複製可能なプ
ラスミドとが連結されて得られる組換えＤＮＡを保持す
るコリネ型細菌。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281341A JPH0644869B2 (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | プラスミド及びそれを有する細菌 |
| DE8585107645T DE3585341D1 (de) | 1984-06-22 | 1985-06-20 | Plasmid und die es enthaltenden bakterien. |
| EP19850107645 EP0169377B1 (en) | 1984-06-22 | 1985-06-20 | Plasmid and bacteria containing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281341A JPH0644869B2 (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | プラスミド及びそれを有する細菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152289A JPS61152289A (ja) | 1986-07-10 |
| JPH0644869B2 true JPH0644869B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=17637753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281341A Expired - Lifetime JPH0644869B2 (ja) | 1984-06-22 | 1984-12-27 | プラスミド及びそれを有する細菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0644869B2 (ja) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55148094A (en) * | 1979-05-07 | 1980-11-18 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Preparation of l-glutamine by fermentation |
| JPS5835197A (ja) * | 1981-08-26 | 1983-03-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | プラスミドｐｃｇ２ |
| JPS5867699A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
| JPS5877895A (ja) * | 1981-11-02 | 1983-05-11 | Ajinomoto Co Inc | プラスミドｐｈｍ１５１９ |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP59281341A patent/JPH0644869B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，２９（１９８４）Ｐ．１３５−１４３ |
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９１（１９８２）Ｐ．１２０５−１２１２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61152289A (ja) | 1986-07-10 |
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