JPH0571237B2 - - Google Patents
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- JPH0571237B2 JPH0571237B2 JP60282662A JP28266285A JPH0571237B2 JP H0571237 B2 JPH0571237 B2 JP H0571237B2 JP 60282662 A JP60282662 A JP 60282662A JP 28266285 A JP28266285 A JP 28266285A JP H0571237 B2 JPH0571237 B2 JP H0571237B2
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- phenylalanine
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、シキミ酸キナーゼが組込込まれて
いる組換えDNAを有するコリネ型細菌及びそれ
を用いるチロシン及び、又はフエニルアラニンの
製造法に関する。 従来の技術 シキミ酸キナーゼ（以下「SK」と記す。）は、
シキミ酸をシキミ酸３−リン酸に変換する反応を
触媒する酵素であり、シキミ酸３−リン酸は、コ
リスミ酸を経由してフエニルアラニン、チロシン
又はトリプトフアンに変換される。 一方、組換えDNA法によりこれら芳香族アミ
ノ酸生産菌を育種することは、いくつか知られて
いるが（例えば特開昭57−208994、特開昭57−
71397、特開昭58−89194、特開昭58−134994等）、
SKをコードする遺伝子（以下「SK遺伝子」と記
す）が組込まれたものではない。 発明が解決しようとする問題点 この発明は、チロシン及び、又はフエニルアラ
ニンの生産性がより高い微生物を得ること、及び
それによつてチロシン及び、又はフエニルアラニ
ンのより効率のよい製造法を見い出すことにあ
る。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現しSKをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換え
DNAを有するコリネ型細菌細胞を分離すること
に成功し、得られたコリネ型細菌がチロシン及
び、又はフエニルアラニンの高い生産性を有する
ことを見い出した。 即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸
生産菌に属するDNA供与菌より得られ、シキミ
酸キナーゼをコードするDNA断片が、コリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製で
きるベクタープラスミドに接続されて、コリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌に属しｍ−フルオロフ
エニルアラニンに耐性を示し、Ｌ−フエニルアラ
ニン要求性であり、Ｌ−チロシン生産性である
DNA受容菌に導入されて得られるＬ−チロシン
生産能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積
されたＬ−チロシンを採取することを特徴とする
Ｌ−チロシンの製造法であり、また本願発明は、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られ、シキミ酸キナーゼをコ
ードするDNA断片が、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープ
ラスミドに接続されて、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−チロシン要求性であり、Ｌ−
フエニルアラニン生産性であるDNA受容菌に導
入されて得られるＬ−フエニルアラニン生産能を
有する微生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ
−フエニルアラニンを採取することを特徴とする
Ｌ−フエニルアラニンの製造法である。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bacteria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargey′s Manual of Determinativa
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032，13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC 15354 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 SK遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌の
SK遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura
Biochem.Biophys.Acta72，619，（1963）の方法
が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断す
る。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプ
ラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のSK欠損変異株を形
質転換せしめ、SK生成活性を保有するにいたつ
た菌株を単離し、これよりSK遺伝子を分離でき
る。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pAJ 1844 特開昭58−192900参照 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酵素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.，Biol.53，
159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci，USA，751929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代りに、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、フイコール、ブルロ
ニツクF68（セルバ社）などの添加によつてDNA
のとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得
られる。 チロシン及び、又はフエニルアラニン生産菌と
して、SK欠損株を宿主として形質転換した株を
用いることができるが、以下に示すような宿主を
用いればよりチロシン及び、又はフエニルアラニ
ンの生産性が高い菌株が得られることがある。 チロシンの場合 コリネバクテリウム属のフエニルアラニンを要
求し３−アミノチロシン、ｐ−アミノフエニルア
ラニン、ｐ−フルオロフエニルアラニン、チロシ
ンヒドロキサメートに耐性を有する変異株H.
Hagino，K.Nakayama：Agric.Biol.Chem.，
37，2013（1973）、ブレビバクテリウム属のｍ−フ
ルオロフエニルアラニンに耐性を示す変異株
Sugimoto，Nakagawa，Tauchida，Shiio.，
Agric.Biol.Chem.，37，2327（1973）等がある。 最も好ましい宿主は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−フエニルアラニン要求性であ
り、Ｌ−チロシン生産性である微生物である。 フエニルアラニンの場合 ブレビバクテリウム属のｍ−フルオロフエニル
アラニン耐性を有する変異株（S.Sugimoto，M.
Nakagawa，T.Tsuchida，I.Shiio.，Agric.Biol.
Chem.，37，2327（1973））ブレビバクテリウム属
のチロシン、メチオニンを要求し５−メチルトリ
プトフアン、ｐ−フルオロフエニルアラニンに耐
性を有する変異株（特開昭49−116294）、ブレビ
バクテリウム属のチロシン、メチオニンを要求
し、５−メチルトリプトフアン、ｐ−フルオロフ
エニルアラニン高濃度耐性、デコイニン感受性を
有する変異株（特開昭59−34893）コリネバクテ
リウム属のチロシンを要求し、ｐ−フルオロフエ
ニルアラニン、ｐ−アミノフエニルアラニンに耐
性を有する変異株（H.Hagino，K.Nakayawa.，
Agric.Biol.Chem.，38，157（1974））等がある。 最も好ましい宿主は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−チロシン要求性であり、Ｌ−
フエニルアラニン生産性である微生物である。 SK遺伝子のほかに、以下の遺伝子が挿入され
ていればチロシン及び、又はフエニルアラニンの
生産性がより高くなることが多い。３−デヒドロ
キナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
チユロン酸−７−リン酸（DAHP）シンターゼ
遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝
子、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
シンターゼ、コリズミ酸シンターゼ遺伝子があげ
られる。 またフエニルアラニン又はチロシン生産菌を得
ようとするときは、プレフエン酸デヒドラターゼ
遺伝子、プレフエン酸トランスアミナーゼ、プレ
チロシンデヒドロゲナーゼ遺伝子、チロシンアミ
ノトランスフエラーゼ遺伝子等がSK遺伝子のほ
かに挿入されていることが望ましい。 このようにして得られたチロシン及び、又はフ
エニルアラニン生産能を有するコリネ型細菌を培
養してチロシン及び、又はフエニルアラニンを生
成蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌による
チロシン及び、又はフエニルアラニンの製造のた
めに使用されていた方法と特に大きく違う点はな
い。即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機
イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の
有機微量栄養素を含有する通常のものである。炭
素源としては、グルコース、シユクロース、ラク
トース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、
ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、
アンモ摸ニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にチロシン及び、又はフエニ
ルアラニンの生産蓄積が停止するまで行なわれ
る。 実施例 (1) SK遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11957（FERM−P6673）を１のCMG培地
（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、グル
コース0.5ｇ／dl、及びNaCI.5ｇ／dlを含み、PH
7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間
盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得
た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダルト
ン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ12037
を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数増殖期
後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理によ
り溶菌させ、30000×ｇ、30分の超遠心により上
清を得た。フエノール処理ののち、２容のエタノ
ールを加てDNAを沈澱回収した。これを少量の
TEN緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM
NaCl、1mM EDTA（PH8.0））に溶解後、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出して
pAJ1844プラスミドDNA約15μgを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μgと(2)で得たプラスミ
ドDNA5μgとを制限エンドヌクレアーゼPstで
それぞれを37℃に１時間保持し、切断した。65℃
に10分間加熱した後、両反応液を混合し、ATP
及びジチオスレイトール存在下、T4フアージ由
来のDNAリガーゼによつて10℃に24時間保持し
DNA鎖を連結せしめた。ついで反応液を、65℃
にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノール
を加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。 (4) SK遺伝子のクローニング SK遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムAJ12157（ブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ12036を親株とし、
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンにより変異処理することによりフエニルアラニ
ン、トリプトフアン、チロシンの３アミノ酸を生
育に要求する変異株として選択した。）を受容菌
として用た。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ、10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調製したDNA10μgを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませたるために
室温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現のため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をPH7.0のプPHロトプラスト再生
培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸
留水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、
MgCl2・6H2O8.1ｇ、CaCl2・2H2O2.2ｇ、ペプ
トン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Difco社）１ｇ、K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナト
リウム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコー
ル3μg／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約20000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
を最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモニ
ウム、0.3％尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、
0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、
2ppmマンガンイオンン、200μg／サイアミン
塩酸塩、50μg／ビオチン、クロラムフエニコ
ール10μg／ml、PH7.0、寒天1.8％）にレプリカ
し、クロラムフエニコール耐性でかつフエニルア
ラニン、トリプトフアン、チロシン要求性の消失
した３株を得た。 (5) 形質転換後のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、全ての株でベ
クターのpAJ1844よりも明らかに大きなプラスミ
ドが検出された。 ３株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制
限酵素Pstで切断すると全てのプラスミドに
2.9kbのDNA挿入断片が認められた。従つてSK
遺伝子は2.9kbのPst DNA断片上に存在する
と思われらる。ベクターpAJ1844のPst切断点
に2.9kbのDNA断片が挿入された組換プラスミド
をPSC5と名付けた。又PSC5を保持する株を
AJ12260（FERM Ｐ−8546）と名付けた。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出された2.9キロベースのDNA断片を含
む組換えプラスミド上にSK遺伝子が存在するこ
とを確認するためこのプラスミドDNA PSC5を
用い、ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタ
ムAJ12157を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ10個を釣り上げフエニルアラニン、ト
リプトフアン、チロシンの三重要求性をテストし
たところ、これらのいずれも要求性が消失してお
り、上記の組換えプラスミド上にSK遺伝子が存
在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のSK活性 被検株を第２表に示すチロシン及び、又はフエ
ニルアラニン生産用培地で40時間培養した菌体よ
り超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
32000×ｇ、20分間遠心分離して上清を得た。こ
の上清を粗酵素液として用いM.K.GAITONDE，
M.W.GORDON（1958，J.Biol.Chem230：1043〜
1050）等の方法を若干改変した方法、すなわち
50mM Veronal緩衝液（PH9.0）、1mMシキミ酸、
4mM ATP、5mM MgCl2、10mM NaFから成
る反応液１ml中で37℃、30分間反応させ、反応終
了後1Mトリス−−塩酸緩衝液（PH7.8）0.2mlを
加え、100℃で２分間処理し、酵素を失活させる。
冷却後3.0mlの反応液（シキミ酸を２〜10μg含む
ように適当に希釈した反応液）に0.5mlの１％過
ヨウ素酸を加え、３時間室温に放置し、0.5mlの
1N水酸化ナトリウムを加え、ただちに0.3mlの
0.1Mグリシンを添加し、380mμの吸光度を測定
することによりシキミ酸を定量した。反応液中に
添加したシキミ酸の量から反応終了後のシキミ酸
の量を差し引き、SK活性を求めた。第１表に測
定結果を示す。 【表】 (8) 各形質転換株のチロシン及び、又はフエニル
アラニン生産能 上記のPSC5を用い、ｍ−フルオロフエニルア
ラニン耐性株でチロシン及び、又はフエニルアラ
ニン生産性のブレビバクテリウム・ラクトフエル
メンタムMF−358とそのフエニルアラニン要求
性でかつチロシン生産性のFT−１及びチロシン
要求性でかつフエニルアラニン生産性のPX−１
を(4)で述べた方法により形質転換し、クロラムフ
エニコール耐性を指標として形質転換株を選択し
た。 かくして得られたAJ12261（FERM Ｐ−8547）、
AJ12262（FERA Ｐ−8548）、AJ12263（FERM
Ｐ−8549）を培養し、チロシン及び、又はフエニ
ルアラニン生産能を調べたところ第３表に示す結
果を得た。 培養は第２表に示す生産培地20mlを500ml容の
坂口フラスコに入れ、更に別途滅菌したCaCO3
を１ｇ加えたものに被検菌株を植えつけ、31.5℃
にて72〜92時間、振盪下に行なつた。培養液から
フエニルアラニン又はチロシンを採取する方法は
公知の方法に従つて行えば良く、培養液から菌体
を分離除去した後、濃縮晶析する方法あるいはイ
オン交換樹脂を用いる方法等により採取される。 【表】 【表】 尚、MF−358、FT−１、PX−１を得るため
には寄託されたAJ12261、AJ12262及びAJ12263
より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プ
ラスミドを除去することが可能である。即ち、プ
ラスミドは宿主より自然に失なわれることもある
し、「除去」操作によつて除くこともできる
（Bact.Rev.，36，p361−405（1972））。他の除去
操作の例は以下の通りである。AJ12261，
AJ12262及びAJ12263をCMG液体培地に接種し、
37℃で一晩培養（高温処理）後、培養液を適当に
希釈し、クロラムフエニコールを含有し又含有し
ないCMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間
培養する。かくしてクロラムフエニコール感受性
株として分離される株がMF−358、FT−１、
PX−１である。
いる組換えDNAを有するコリネ型細菌及びそれ
を用いるチロシン及び、又はフエニルアラニンの
製造法に関する。 従来の技術 シキミ酸キナーゼ（以下「SK」と記す。）は、
シキミ酸をシキミ酸３−リン酸に変換する反応を
触媒する酵素であり、シキミ酸３−リン酸は、コ
リスミ酸を経由してフエニルアラニン、チロシン
又はトリプトフアンに変換される。 一方、組換えDNA法によりこれら芳香族アミ
ノ酸生産菌を育種することは、いくつか知られて
いるが（例えば特開昭57−208994、特開昭57−
71397、特開昭58−89194、特開昭58−134994等）、
SKをコードする遺伝子（以下「SK遺伝子」と記
す）が組込まれたものではない。 発明が解決しようとする問題点 この発明は、チロシン及び、又はフエニルアラ
ニンの生産性がより高い微生物を得ること、及び
それによつてチロシン及び、又はフエニルアラニ
ンのより効率のよい製造法を見い出すことにあ
る。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現しSKをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換え
DNAを有するコリネ型細菌細胞を分離すること
に成功し、得られたコリネ型細菌がチロシン及
び、又はフエニルアラニンの高い生産性を有する
ことを見い出した。 即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸
生産菌に属するDNA供与菌より得られ、シキミ
酸キナーゼをコードするDNA断片が、コリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌の菌体内で自律複製で
きるベクタープラスミドに接続されて、コリネホ
ルム・グルタミン酸生産菌に属しｍ−フルオロフ
エニルアラニンに耐性を示し、Ｌ−フエニルアラ
ニン要求性であり、Ｌ−チロシン生産性である
DNA受容菌に導入されて得られるＬ−チロシン
生産能を有する微生物を培養し、培養液中に蓄積
されたＬ−チロシンを採取することを特徴とする
Ｌ−チロシンの製造法であり、また本願発明は、
コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られ、シキミ酸キナーゼをコ
ードするDNA断片が、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクタープ
ラスミドに接続されて、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−チロシン要求性であり、Ｌ−
フエニルアラニン生産性であるDNA受容菌に導
入されて得られるＬ−フエニルアラニン生産能を
有する微生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ
−フエニルアラニンを採取することを特徴とする
Ｌ−フエニルアラニンの製造法である。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bacteria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargey′s Manual of Determinativa
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム
ATCC 13032，13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ
ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC 15354 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 SK遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌の
SK遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura
Biochem.Biophys.Acta72，619，（1963）の方法
が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断す
る。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプ
ラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のSK欠損変異株を形
質転換せしめ、SK生成活性を保有するにいたつ
た菌株を単離し、これよりSK遺伝子を分離でき
る。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pAJ 1844 特開昭58−192900参照 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酵素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.，Biol.53，
159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様に
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274，398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci，USA，751929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代りに、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、フイコール、ブルロ
ニツクF68（セルバ社）などの添加によつてDNA
のとり込みを促進させる方法でも同等の結果が得
られる。 チロシン及び、又はフエニルアラニン生産菌と
して、SK欠損株を宿主として形質転換した株を
用いることができるが、以下に示すような宿主を
用いればよりチロシン及び、又はフエニルアラニ
ンの生産性が高い菌株が得られることがある。 チロシンの場合 コリネバクテリウム属のフエニルアラニンを要
求し３−アミノチロシン、ｐ−アミノフエニルア
ラニン、ｐ−フルオロフエニルアラニン、チロシ
ンヒドロキサメートに耐性を有する変異株H.
Hagino，K.Nakayama：Agric.Biol.Chem.，
37，2013（1973）、ブレビバクテリウム属のｍ−フ
ルオロフエニルアラニンに耐性を示す変異株
Sugimoto，Nakagawa，Tauchida，Shiio.，
Agric.Biol.Chem.，37，2327（1973）等がある。 最も好ましい宿主は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−フエニルアラニン要求性であ
り、Ｌ−チロシン生産性である微生物である。 フエニルアラニンの場合 ブレビバクテリウム属のｍ−フルオロフエニル
アラニン耐性を有する変異株（S.Sugimoto，M.
Nakagawa，T.Tsuchida，I.Shiio.，Agric.Biol.
Chem.，37，2327（1973））ブレビバクテリウム属
のチロシン、メチオニンを要求し５−メチルトリ
プトフアン、ｐ−フルオロフエニルアラニンに耐
性を有する変異株（特開昭49−116294）、ブレビ
バクテリウム属のチロシン、メチオニンを要求
し、５−メチルトリプトフアン、ｐ−フルオロフ
エニルアラニン高濃度耐性、デコイニン感受性を
有する変異株（特開昭59−34893）コリネバクテ
リウム属のチロシンを要求し、ｐ−フルオロフエ
ニルアラニン、ｐ−アミノフエニルアラニンに耐
性を有する変異株（H.Hagino，K.Nakayawa.，
Agric.Biol.Chem.，38，157（1974））等がある。 最も好ましい宿主は、コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−チロシン要求性であり、Ｌ−
フエニルアラニン生産性である微生物である。 SK遺伝子のほかに、以下の遺伝子が挿入され
ていればチロシン及び、又はフエニルアラニンの
生産性がより高くなることが多い。３−デヒドロ
キナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
チユロン酸−７−リン酸（DAHP）シンターゼ
遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝
子、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
シンターゼ、コリズミ酸シンターゼ遺伝子があげ
られる。 またフエニルアラニン又はチロシン生産菌を得
ようとするときは、プレフエン酸デヒドラターゼ
遺伝子、プレフエン酸トランスアミナーゼ、プレ
チロシンデヒドロゲナーゼ遺伝子、チロシンアミ
ノトランスフエラーゼ遺伝子等がSK遺伝子のほ
かに挿入されていることが望ましい。 このようにして得られたチロシン及び、又はフ
エニルアラニン生産能を有するコリネ型細菌を培
養してチロシン及び、又はフエニルアラニンを生
成蓄積せしめる方法は、従来コリネ型細菌による
チロシン及び、又はフエニルアラニンの製造のた
めに使用されていた方法と特に大きく違う点はな
い。即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機
イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の
有機微量栄養素を含有する通常のものである。炭
素源としては、グルコース、シユクロース、ラク
トース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、
ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、
アンモ摸ニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩その他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にチロシン及び、又はフエニ
ルアラニンの生産蓄積が停止するまで行なわれ
る。 実施例 (1) SK遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ11957（FERM−P6673）を１のCMG培地
（ペプトン１ｇ／dl、酵母エキス１ｇ／dl、グル
コース0.5ｇ／dl、及びNaCI.5ｇ／dlを含み、PH
7.2に調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間
盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得
た。 (2) ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダルト
ン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。 まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ12037
を100mlのCMG培地に接種し、30℃で対数増殖期
後期まで培養したのち、リゾチームSDS処理によ
り溶菌させ、30000×ｇ、30分の超遠心により上
清を得た。フエノール処理ののち、２容のエタノ
ールを加てDNAを沈澱回収した。これを少量の
TEN緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM
NaCl、1mM EDTA（PH8.0））に溶解後、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ分離後、切り出して
pAJ1844プラスミドDNA約15μgを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μgと(2)で得たプラスミ
ドDNA5μgとを制限エンドヌクレアーゼPstで
それぞれを37℃に１時間保持し、切断した。65℃
に10分間加熱した後、両反応液を混合し、ATP
及びジチオスレイトール存在下、T4フアージ由
来のDNAリガーゼによつて10℃に24時間保持し
DNA鎖を連結せしめた。ついで反応液を、65℃
にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノール
を加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。 (4) SK遺伝子のクローニング SK遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムAJ12157（ブレビバクテリウ
ム・ラクトフエルメンタムAJ12036を親株とし、
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンにより変異処理することによりフエニルアラニ
ン、トリプトフアン、チロシンの３アミノ酸を生
育に要求する変異株として選択した。）を受容菌
として用た。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ、10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調製したDNA10μgを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終濃度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませたるために
室温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現のため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をPH7.0のプPHロトプラスト再生
培地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸
留水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、
MgCl2・6H2O8.1ｇ、CaCl2・2H2O2.2ｇ、ペプ
トン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Difco社）１ｇ、K2HPO40.2ｇ、コハク酸ナト
リウム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコー
ル3μg／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約20000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
を最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモニ
ウム、0.3％尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、
0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、
2ppmマンガンイオンン、200μg／サイアミン
塩酸塩、50μg／ビオチン、クロラムフエニコ
ール10μg／ml、PH7.0、寒天1.8％）にレプリカ
し、クロラムフエニコール耐性でかつフエニルア
ラニン、トリプトフアン、チロシン要求性の消失
した３株を得た。 (5) 形質転換後のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、全ての株でベ
クターのpAJ1844よりも明らかに大きなプラスミ
ドが検出された。 ３株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制
限酵素Pstで切断すると全てのプラスミドに
2.9kbのDNA挿入断片が認められた。従つてSK
遺伝子は2.9kbのPst DNA断片上に存在する
と思われらる。ベクターpAJ1844のPst切断点
に2.9kbのDNA断片が挿入された組換プラスミド
をPSC5と名付けた。又PSC5を保持する株を
AJ12260（FERM Ｐ−8546）と名付けた。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出された2.9キロベースのDNA断片を含
む組換えプラスミド上にSK遺伝子が存在するこ
とを確認するためこのプラスミドDNA PSC5を
用い、ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタ
ムAJ12157を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ10個を釣り上げフエニルアラニン、ト
リプトフアン、チロシンの三重要求性をテストし
たところ、これらのいずれも要求性が消失してお
り、上記の組換えプラスミド上にSK遺伝子が存
在することが明らかとなつた。 (7) 形質転換株のSK活性 被検株を第２表に示すチロシン及び、又はフエ
ニルアラニン生産用培地で40時間培養した菌体よ
り超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
32000×ｇ、20分間遠心分離して上清を得た。こ
の上清を粗酵素液として用いM.K.GAITONDE，
M.W.GORDON（1958，J.Biol.Chem230：1043〜
1050）等の方法を若干改変した方法、すなわち
50mM Veronal緩衝液（PH9.0）、1mMシキミ酸、
4mM ATP、5mM MgCl2、10mM NaFから成
る反応液１ml中で37℃、30分間反応させ、反応終
了後1Mトリス−−塩酸緩衝液（PH7.8）0.2mlを
加え、100℃で２分間処理し、酵素を失活させる。
冷却後3.0mlの反応液（シキミ酸を２〜10μg含む
ように適当に希釈した反応液）に0.5mlの１％過
ヨウ素酸を加え、３時間室温に放置し、0.5mlの
1N水酸化ナトリウムを加え、ただちに0.3mlの
0.1Mグリシンを添加し、380mμの吸光度を測定
することによりシキミ酸を定量した。反応液中に
添加したシキミ酸の量から反応終了後のシキミ酸
の量を差し引き、SK活性を求めた。第１表に測
定結果を示す。 【表】 (8) 各形質転換株のチロシン及び、又はフエニル
アラニン生産能 上記のPSC5を用い、ｍ−フルオロフエニルア
ラニン耐性株でチロシン及び、又はフエニルアラ
ニン生産性のブレビバクテリウム・ラクトフエル
メンタムMF−358とそのフエニルアラニン要求
性でかつチロシン生産性のFT−１及びチロシン
要求性でかつフエニルアラニン生産性のPX−１
を(4)で述べた方法により形質転換し、クロラムフ
エニコール耐性を指標として形質転換株を選択し
た。 かくして得られたAJ12261（FERM Ｐ−8547）、
AJ12262（FERA Ｐ−8548）、AJ12263（FERM
Ｐ−8549）を培養し、チロシン及び、又はフエニ
ルアラニン生産能を調べたところ第３表に示す結
果を得た。 培養は第２表に示す生産培地20mlを500ml容の
坂口フラスコに入れ、更に別途滅菌したCaCO3
を１ｇ加えたものに被検菌株を植えつけ、31.5℃
にて72〜92時間、振盪下に行なつた。培養液から
フエニルアラニン又はチロシンを採取する方法は
公知の方法に従つて行えば良く、培養液から菌体
を分離除去した後、濃縮晶析する方法あるいはイ
オン交換樹脂を用いる方法等により採取される。 【表】 【表】 尚、MF−358、FT−１、PX−１を得るため
には寄託されたAJ12261、AJ12262及びAJ12263
より宿主細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プ
ラスミドを除去することが可能である。即ち、プ
ラスミドは宿主より自然に失なわれることもある
し、「除去」操作によつて除くこともできる
（Bact.Rev.，36，p361−405（1972））。他の除去
操作の例は以下の通りである。AJ12261，
AJ12262及びAJ12263をCMG液体培地に接種し、
37℃で一晩培養（高温処理）後、培養液を適当に
希釈し、クロラムフエニコールを含有し又含有し
ないCMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間
培養する。かくしてクロラムフエニコール感受性
株として分離される株がMF−358、FT−１、
PX−１である。
図１はプラスミドPSC5の制限酵素切断地図を
示す。
示す。
Claims (1)
- １ (A)コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属す
るDNA供与菌より得られ、シキミ酸キナーゼを
コードするDNA断片が、コリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の菌体内で自律複製できるベクター
プラスミドに接続されて、(B)(イ)コリネホルム・グ
ルタミン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルア
ラニンに耐性を示し、Ｌ−フエニルアラニン要求
性であり、Ｌ−チロシン生産性であるDNA受容
菌に導入されて得られるＬ−チロシン生産能を有
する微生物、あるいは(ロ)コリネホルム・グルタミ
ン酸生産菌に属しｍ−フルオロフエニルアラニン
に耐性を示し、Ｌ−チロシン要求性であり、Ｌ−
フエニルアラニン生産性であるDNA受容菌に導
入されて得られるＬ−フエニルアラニン生産能を
有する微生物を培養し、(C)培養液中に蓄積された
Ｌ−チロシンあるいはＬ−フエニルアラニンを採
取することを特徴とするＬ−チロシンあるいはＬ
−フエニルアラニンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28266285A JPS62143682A (ja) | 1985-12-16 | 1985-12-16 | 発酵法によるｌ―チロシン又はｌ―フェニルアラニンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28266285A JPS62143682A (ja) | 1985-12-16 | 1985-12-16 | 発酵法によるｌ―チロシン又はｌ―フェニルアラニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62143682A JPS62143682A (ja) | 1987-06-26 |
| JPH0571237B2 true JPH0571237B2 (ja) | 1993-10-06 |
Family
ID=17655423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28266285A Granted JPS62143682A (ja) | 1985-12-16 | 1985-12-16 | 発酵法によるｌ―チロシン又はｌ―フェニルアラニンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62143682A (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0732710B2 (ja) * | 1983-05-28 | 1995-04-12 | 協和醗酵工業株式会社 | フエニ−ルアラニンの製造法 |
| JPS6034197A (ja) * | 1983-08-04 | 1985-02-21 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | チロシンの製造法 |
| JPS6066984A (ja) * | 1983-09-22 | 1985-04-17 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 |
-
1985
- 1985-12-16 JP JP28266285A patent/JPS62143682A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62143682A (ja) | 1987-06-26 |
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