JPH0559710B2 - - Google Patents

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JPH0559710B2
JPH0559710B2 JP60037168A JP3716885A JPH0559710B2 JP H0559710 B2 JPH0559710 B2 JP H0559710B2 JP 60037168 A JP60037168 A JP 60037168A JP 3716885 A JP3716885 A JP 3716885A JP H0559710 B2 JPH0559710 B2 JP H0559710B2
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JP
Japan
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dna
plasmid
gene
strain
threonine
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JP60037168A
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JPS61195695A (ja
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Hiroshi Takagi
Yasushi Morinaga
Kyoshi Miwa
Takanosuke Sano
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
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Publication of JPH0559710B2 publication Critical patent/JPH0559710B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10Transferases (2.)
    • C12N9/12Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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Description

【発明の詳现な説明】 産業䞊の利甚分野 本発明はスレオニン又はむ゜ロむシンの補造法
に関し、詳しくは組換えプラスミドを有するコリ
ネホルム现菌を甚いる発酵法によるスレオニン又
はむ゜ロむシンの補造法に関する。 埓来の技術 埓来、発酵法により−スレオニンや−む゜
ロむシンを補造する堎合、埮生物ずしおは自然界
から分離した菌株たたは該菌株の人工倉異株が甚
いられおいる。−スレオニンを生産する人工倉
異株は数倚く知られおおり、その倚くはα−アミ
ノ−β−ヒドロキシ吉草酞以䞋、AHVず略蚘
する。に耐性があり、ブレビバクテリりム属た
たはコリネバクテリりム属に属しおいる。これら
の埮生物は収率10〜20で−スレオニンを生産
する。䟋えば、米囜特蚱第3582471号明现曞、同
第3580810号明现曞及び特公昭47−34956号公報に
はAHV耐性を瀺し、ブレビバクテリりム属、゚
シ゚リヒア属及びコリネバクテリりム属に属する
倉異株を甚いたスレオニンの補造法が開瀺されお
いる。たた、ブレビバクテリりム属及びコリネバ
クテリりム属に属する倉異株によるスレオニンの
生産に぀いお特開昭51−54984号公報、同53−
101591号公報、同54−32693号公報、同54−35285
号公報、同54−35286号公報、同54−35288号公
報、同54−37886号公報及び同54−92692号公報に
も開瀺されおいる。 䞀方、米囜特蚱第4278765号明现曞、特開昭55
−131397号公報及び同56−15696号公報には組換
えプラスミドDNAを甚いお圢質転換された゚シ
゚リヒア・コリを甚いおスレオニンを補造する方
法が瀺されおいる。 さらに、欧州特蚱出願公開第0066129号明现曞
にはAHVに察する耐性をコントロヌルする染色
䜓DNA断片が挿入されおいるプラスミドを有す
るコリネホルム现菌を䜿甚するスレオニンの生産
に぀いお蚘茉されおいる。曎に、欧州特蚱出願公
開第0131171号には、ホモセリンデヒドロゲナヌ
れをコヌドする遺䌝子が挿入されおいるプラスミ
ドを有するコリネホルム现菌を培逊しお、む゜ロ
むシン又はスレオニンを生産するこずが蚘茉され
おいる。 たた、む゜ロむシンに関する状況もスレオニン
の堎合ず酷䌌しおいる。む゜ロむシンを生産する
埮生物ずしおはむ゜ロむシンヒドロキサメヌトに
察しお耐性を有するセラチアの倉異株特公昭52
−30593号公報、その生育にロむシンを芁求する
コリネバクテリりム・グルタミカムの倉異株特
公昭47−38995号公報、AHVに耐性を有するブ
レビバクテリりム属及びコリネバクテリりム属の
倉異株特公昭40−2880号公報、AHVに耐性
を有し、か぀その生育にリゞンを必芁ずするブレ
ビバクテリりム属の倉異株特公昭51−6237号公
報、AHV及び−メチルスレオニンに耐性を
有するブレビバクテリりム属の倉異株特公昭51
−21077号公報、−−アミノ゚チル−シス
テむンに耐性を有するコリネバクテリりム属の倉
異株特公昭52−4629号公報、−アミノ−
−メチルチオ酪酞に耐性を有する゚シ゚リヒア属
の倉異株特開昭53−69881号公報、AHV及び
トリクロロアラニンに耐性を有するブレビバクテ
リりム属の倉異株特開昭54−35287号公報が
ある。 そのほか組換えプラスミドDNAを甚いお圢質
転換された゚シ゚リヒア・コリはアミノ酞の生産
胜が高いこずが開瀺されおいる䟋えば米囜特蚱
第4278765号明现曞参照。曎に欧州特蚱出願公開
第0071023号には、AHVに察する耐性をコント
ロヌルする染色䜓DNA断片が挿入されおいるプ
ラスミドを有するコリネホルム现菌を䜿甚するむ
゜ロむシンの生産に぀いお蚘茉されおいる。 発明が解決しようずする問題点 しかしながら䞊蚘のスレオニン又はむ゜ロむシ
ン生産胜を有する现菌のスレオニン又はむ゜ロむ
シン生産胜は、曎に改善する必芁がある。 問題点を解決するための手段 叙䞊のような状況䞋で本発明者らは、ホモセリ
ンキナヌれ以䞋「HK」ず蚘すをコヌドする
遺䌝子以䞋「HK」遺䌝子ず蚘すが組蟌たれ
おいる第のプラスミド及びホモセリンデヒドロ
ゲナヌれ以䞋「HD」ず蚘すをコヌドする遺
䌝子以䞋「HD遺䌝子」ず蚘すが組蟌たれお
いる第のプラスミドを育するコリネホルム现菌
が、スレオニン及びむ゜ロむシンの高い生産性を
有するこずを芋い出した。 コリネホルム现菌は、奜気性、グラム陜性桿菌
であり、非抗酞性でバヌヂヌス・マニナアル・オ
ブ・デタヌミネむテむブバクテリオロゞヌ第版
599頁1974に蚘茉されおいお、そのうち特に
以䞋に䟋瀺するような−グルタミン酞を倧量に
生産するものが知られおいる。 ブレビバクテリりム・デむバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリりム・サツカロリテむクム
ATCC14066 ブレビバクテリりム・むンマリオフむルム
ATCC14068 ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリりム・ロれりム
ATCC13825 ブレビバクテリりム・フラバム
ATCC13826 ブレビバクテリりム・チオゲニタリス
ATCC19240 コリネバクテリりム・アセトアシドフむルム
ATCC13870 コリネバクテリりム・アセトグルタミクム
ATCC15806 コリネバクテリりム・カルナ゚
ATCC15991 コリネバクテリりム・グルタミクム
ATCC1303213060 コリネバクテリりム・リリりム
ATCC15990 コリネバクテリりム・メラセコヌラ
ATCC17965 ミクロバクテリりム・アンモニアフむラム
ATCC15354 コリネホルム现菌には䞊蚘のようなグルタミン
酞生産性を有するもののほかに、グルタミン酞生
産性を倱぀たもの及びリゞン、アルギニン等のア
ミノ酞を生産する倉異株も含たれる。 本発明にお䜿甚されるプラスミドベクタヌは、
コリネホルム现菌现胞内においお増殖し埗るもの
であればどのようなものでも良い。具䜓的に䟋瀺
すれば、以䞋のものがある。 (1) pAM330 特開昭58−67699参照 (2) pHM1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ611 特開昭58−192900参照 (5) pAJ1844 特開昭58−192900参照 コリネホルム现菌现胞内で増殖可胜なプラスミ
ドのその他の䟋ずしおはpCG1特開昭57−
134500、pCG2特開昭58−35197、pCG4
pCG11特開昭57−183799がある。 本発明においおは、これらのプラスミドのうち
皮類のプラスミドが甚いられる。HKは、−
スレオニン及び−む゜ロむシン生成の䞭間䜓で
ある−ホモセリンよりホスホホモセリンを生成
する反応を觊媒する酵玠である。 HK遺䌝子を単離する方法は、コリネホルム现
菌のHK遺䌝子を有しおいる株より、たず染色䜓
遺䌝子を抜出し䟋えばH.Saito and K.Miura
Biochem.Biophys.Acta726191963の方法
が䜿甚できる、これを適圓な制限酵玠で切断す
る。぀いで、コリネホルム现菌で増殖し埗るプラ
スミドベクタヌに接続し、埗られた組換えDNA
を甚いおコリネホルム现菌のHK欠損倉異株を圢
質転換せしめ、HK生成掻性を保有するにいた぀
た菌株を単離し、これによりHK遺䌝子を分離で
きる。 HDは、アスパルテヌトセミアルデヒドよりホ
モセリンを生成する反応を觊媒する酵玠である。 HD遺䌝子を単離する方法も、HK遺䌝子を単
離する方法ず同じようにしお行うこずができる。
即ち、コリネホルム现菌のHD欠損倉異株を甚い
るこずにより、HD遺䌝子を埗るこずができる。 HK遺䌝子又はHD遺䌝子を埗るためのコリネ
ホルム现菌は、野性型のものであ぀おもよいが、
スレオニンによるフむヌドバツク阻害が解陀され
たようなHK又はHDを有する倉異株をDNA䟛䞎
株ずしお甚いた方がよりよい結果が埗られるこず
が倚い。このような倉異株は、AHVに耐性の倉
異株ずしお埗るこずができる。 HK遺䌝子又はHD遺䌝子を埗るために染色䜓
遺䌝子を切断する際に、切断反応時間等を調節し
お切断の皋床を調節すれば、巟広い皮類の制限酵
玠が䜿甚できる。 ベクタヌDNAは、染色䜓遺䌝子を切断した際
に甚いられた制限酵玠により切断され、たたは染
色䜓DNA切断フラグメント及び切断されたベク
タヌDNAのそれぞれの䞡端に盞補的な塩基配列
を有するオリゎヌクレオチドを接続せしめお、぀
いでプラスミドベクタヌず染色䜓DNAフラグメ
ントずのラむゲヌシペン反応に付される。 このようにしお埗られた、染色䜓DNAずベク
タヌプラスミドずの組換えDNAをコリネホルム
现菌に属する受容菌ぞ導入するには、゚シ゚リヒ
ア・コリ−12に぀いお報告されおいる様な
MandelM.and HigaA.J.Mol.Biol.
531591970受容菌现胞を塩化カルシりムで凊
理しおDNAの透過性を増す方法、たたはバチル
ス・ズブチリスに぀いお報告されおいる様に
DuncanC.H.WilsonG.A.and YoungF.
E.Gene1531977现胞がDNAを取り
蟌み埗る様になる増殖段階いわゆるコンビテン
トセルに導入する方法により可胜である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、攟線菌類および酵
母に぀いお知られおいる様にChangS.and
ChoenS.N.Molec.Gen.Genet.168111
1979BibbM.J.WardJ.M.and
HopwoodO.A.Nature2743981978
HinnenA.HicksJ.B.and FinkG.R.
Proc.Natl.Acad.Sci.USA75 19291978、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り蟌
むプロトプラストたたはスプロプラストにしお
プラスミドをDNA受容菌に導入するこずも可胜
である。 プロトプラスト法では䞊蚘のバチルス・ズブチ
リスにおいお䜿甚されおいる方法でも充分高い頻
床を埗るこずができるし、特開昭57−183799に蚘
茉されたコリネバクテリりム属たたはブレビバク
テリりム属のプロトプラストにポリ゚チレングリ
コヌルたたはポリビニルアルコヌルず二䟡金属む
オンずの存圚䞋にDNAをずり蟌たせる方法も圓
然利甚できる。ポリ゚チレングリコヌルたたはポ
リビニルアルコヌルのかわりに、カルボキシメチ
ルセルロヌス、デキストラン、フむコヌル、ブル
ロニツクF68セルバ瀟などの添加によ぀お
DNAのずり蟌みを促進させる方法でも同等の結
果が埗られる。 かくしお、HK遺䌝子又はHD遺䌝子が組蟌た
れたプラスミドが埗られる。この二぀の組換えプ
ラスミドを有するコリネホルム现菌は、二぀のプ
ラスミドが现胞内に共存しうるものであればむ゜
ロむシン又はスレオニンを生産する。共存しえな
いものであれば、共存しうるプラスミドベクタヌ
に容易にHK遺䌝子及びHD遺䌝子を移しかえる
こずができる。 コリネホルム现菌现胞内で二぀のプラスミドが
共存しうるためには、本発明者らの研究によれ
ば、プラスミドの耇補開始領域が異なるものであ
れば共存しうるが、耇補開始領域が同じものであ
぀おも、他の領域が倧きく異ならば共存しうるこ
ずがある。 二぀のプラスミドを保有するためのコリネホル
ム现菌宿䞻は、スレオニン又はむ゜ロむシン芁求
株であ぀おもよく、又野性株であ぀おもよい。し
かしAHV耐性を有する倉異株が通垞奜たしい結
果が埗られ、特により高いスレオニン又はむ゜ロ
むシン生産胜を有する菌株が最も奜たしい結果が
埗られる。 埗られたスレオニン又はむ゜ロむシン生産菌を
培逊する方法は、埓来のスレオニン又はむ゜ロむ
シン生産菌の培逊方法ず特に倉らない。即ち、培
地ずしおは、炭玠源、窒玠源、無機むオン、曎に
必芁に応じおアミノ酞、ビタミン等の有機埮量栄
逊玠を含有する通垞のものである。炭玠源ずしお
は、グルコヌス、シナクロヌス、ラクトヌス等及
びこれらの含有する柱粉加氎分解液、ポむ、糖
蜜等が甚いられる。窒玠源ずしおは、アンモニア
ガス、アンモニア氎、アンモニりム塩その他が䜿
甚できる。 培逊は奜気的条件䞋で培地のPH及び枩床を適宜
調節し぀぀、実質的にスレオニン又はむ゜ロむシ
ンの生産蓄積が停止するたで行なわれる。 かくしお培逊液䞭には著量のスレオニン又はむ
゜ロむシンが生成蓄積される。培逊液よりスレオ
ニン又はむ゜ロむシンを採取するには、通垞の方
法が適甚できる。 実斜䟋   ホモセリンキナヌれHK遺䌝子のクロヌ
ニング (1) HK遺䌝子を含む染色䜓DNAの調補 ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
ATCC13869のAHV耐性突然倉異株AJ11188
FERM−P4190FERM BP−577特公昭56−
3038をのCMG培地ペプトンdl、
酵母゚キスdl、グルコヌス0.5dl、及
びNaCl0.5dlを含み、PH7.2に調敎したもの
に怍菌し、30℃で玄時間振盪培逊を行ない、察
数増殖期の菌䜓を集めた。この菌䜓をリゟチヌ
ム・SDSで溶菌させたのち、通垞のプノヌル凊
理法により、染色䜓DNAを抜出粟補し、最終的
に3.5mgのDNAを埗た。 (2) ベクタヌDNAの調補 ベクタヌずしおpAJ1844分子量5.4メガダルト
ンを甚い、そのDNAを次の様にしお調補した。 たずpAJ1844をプラスミドずしお保有するブレ
ビバクテリりム・ラクトフアヌメンタムAJ12037
FERM−P7234を100mlのCMG培地に接皮し、
30℃で察数増殖期埌期たで培逊したのち、リゟチ
ヌムSDS凊理により溶菌させ、30000×30分の
超遠心により䞊枅を埗た。プノヌル凊理のの
ち、容の゚タノヌルを加えおDNAを沈柱回収
した。これを少量のTEN緩衝液20mMトリス
塩酞塩、20mM NaCl、1mM EDTAPH8.0に
溶解埌、アガロヌスゲル電気泳動にかけ分離埌、
切り出しおpAJ1844プラスミドDNA箄15Όを埗
た。 (3) 染色䜓DNA断片のベクタヌぞの挿入 (1)で埗た染色䜓DNA20Όず(2)で埗たプラス
ミドDNA10Όずを制限゚ンドヌクレアヌれPst
でそれぞれを37℃、時間凊理し、完党に切断
した。65℃10分の熱凊理埌、䞡反応液を混合し、
ATP及びゞチオスレむトヌル存圚䞋、T4フアヌ
ゞ由来のDNAリガヌれによ぀お10℃、24時間
DNA鎖の連結反応を行぀た。65℃分の熱凊理
埌、反応液に倍容の゚タノヌルを加えお連結反
応終了埌のDNAを沈柱採取した。 (4) HK遺䌝子のクロヌニング HK遺䌝子が欠損したブレビバクテリりム・ラ
クトフアヌメンタムAJ12078を受容菌ずしお甚い
た。 圢質転換の方法ずしおは、プロトプラストトラ
ンスフオヌメヌシペン法を甚いた。たず、菌株を
mlのCMG液䜓培地で察数増殖期の初期たで培
逊し、ペニシリンを0.6ナニツトml添加埌、
さらに1.5時間振盪培逊し、遠心分離により菌株
を集め、菌䜓を0.5Mシナヌクロヌス、20mMマ
レむン酞、20mM塩化マグネシりム、3.5ペナ
ツセむブロスDifcoからなるSMMP培地PH
6.50.5mlで掗浄した。次いで10mgmlのリゟチ
ヌムを含むSMMP培地に懞濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図぀た。6000×、10分間遠心
分離埌、プロトプラストをSMMPで掗浄し0.5ml
のSMMPに再床懞濁した。この様にしお埗られ
たプロトプラストず(3)で調補したDNA10Όを
5mM EDTA存圚䞋で混合し、ポリ゚チレングリ
コヌルを最終濃床が30になる様に添加した埌、
DNAをプロトプラストに取り蟌たせる為に宀枩
に分間攟眮した。このプロトプラストを
SMMP培地mlで掗浄埌、SMMP培地mlに再
懞濁し、圢質発珟の為、30℃で時間培逊した。
この培逊液をPH7.0のプロトプラスト再生培地䞊
に塗垃した。プロトプラスト再生培地は蒞留氎
あたりトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン12、ECl0.5、グルコヌス10、MgCl2・
6H2O8.1、CaCl2・2H2O2.2、ペプトン、
粉末酵母゚キス、カザミノ酞Difco瀟
、K2HPO40.2、コハク酞ナトリりム135、
寒倩及びクロラムプニコヌル3Όを含
む。 30℃で週間培逊埌、玄10000個のクロラムフ
゚ニコヌル耐性コロニヌが出珟しおきたのでこれ
をスレオニンを含たない培地Thr欠培地
グルコヌス、硫酞アンモニりム、0.25尿
玠、0.1りん酞二氎玠カリりム、0.04硫酞マ
グネシりム氎塩、2ppm鉄むオン、2ppmマンガ
ンむオン、200Όサむアミン塩酞塩、50ÎŒ
ビオチン、PH7.0、寒倩1.8にレプリカ
し、クロラムプニコヌル耐性であ぀おか぀スレ
オニン芁求性が消倱した菌株株を埗た。 (5) 圢質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調補し、アガロヌスゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを怜出したずころ、株でベクタ
ヌのpAJ1844よりも明らかに倧きなプラスミドが
怜出された。 これらのうちの代衚株をAJ12079FERM−
P7237FERM BP−578ず名づけた。 (6) 再トランスホヌメヌシペン AJ12079内の組換えプラスミドpAJ211䞊
にHK遺䌝子が存圚するこずを確認するためにこ
のプラスミドDNAを甚いブレビバクテリりム・
ラクトフアヌメンタムAJ12078を再床圢質転換し
た。 生じたクロラムプニコヌル耐性コロニヌのう
ち、それぞれ10個を釣り䞊げスレオニン芁求性を
テストしたずころ、これらのいずれも芁求性を消
倱しおおり、䞊蚘の組換えプラスミド䞊にHK遺
䌝子が存圚するこずが明らかずな぀た。  HK遺䌝子を有する2.9kb.PstDNA断片の
pAJ224ぞの移し倉え (1) トリメトプリム耐性を有するベクタヌプラ
スミドpAJ228の造成 ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
AJ12036より倉異誘導されたトリメトプリム耐性
倉異株AJ12146FERM−P7672FERM BP−
785をのCMG培地ペプトンdl、酵
母゚キスdl、グルコヌス0.5dl、及び
NaCl0.5dlを含み、PH7.2に調敎したものに
怍菌し、30℃で玄時間振盪培逊を行ない、察数
増殖期の菌䜓を集めた。この菌䜓をリゟチヌム・
SDSで溶菌させたのち、通垞のプノヌル凊理法
により、染色䜓DNAを抜出粟補し、最終的に3.0
mgのDNAを埗た。 (2) ベクタヌずしおpAM330を甚いた。
pAM330は次の様にしお調補した。 たずpAM330をプラスミドずしお保有するブレ
ビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
ATCC13869を100mlのCMG培地に接皮し、30℃
で察数増殖期埌期たで培逊したのち、リゟチヌム
SDS凊理により溶菌させ、30000×30分の超遠
心により䞊枅を埗た。プノヌル凊理ののち、
容の゚タノヌルを加えおDNAを沈柱物ずしお回
収した。これを少量のTEN緩衝液20mMトリ
ス塩酞塩、20mM NaCl、1mM EDTAPH8.0
に溶解埌、アガロヌスゲル電気泳動にかけ分離
埌、切り出しおpAM330プラスミドDNA箄15Ό
を埗た。 (3) (1)で埗た染色䜓DNA20Όず(2)で埗たプ
ラスミドDNA10Όずを制限゚ンドヌクレ
アヌれMbo でそれぞれを37℃、30分間凊
理し、郚分切断した。65℃、10分の熱凊理
埌、䞡反応液を混合し、ATP及びゞチオス
レむトヌル存圚䞋、T4フアヌゞ由来のDNA
リガヌれによ぀お10℃、24時間DNA鎖の連
結反応を行぀た。65℃、分の熱凊理埌、反
応液に倍容の゚タノヌルを加えお連結反応
終了埌のDNAを沈柱採取した。 (4) トリメトプリム感受性のブレビバクテリり
ム・ラクトフアヌメンタムAJ12036を受容菌
ずしお甚いた。 圢質転換の方法ずしおは、−(4)で述べた方法
を甚いた。トリメトプリムSigma瀟25Ό
を含む再生培地にお、30℃で週間培逊埌、玄
100個のコロニヌが出珟しおきたので、これをト
リメトプリムを含む最小培地グルコヌス、
硫酞アンモニりム、0.25尿玠、0.1りん
酞二氎玠カリりム、0.04硫酞マグネシりム氎
塩、2ppm鉄むオン、2ppmマンガンむオン、
200Όサむアミン塩酞塩、50Όビチオ
ン、PH7.0、寒倩1.8、トリメトプリム50Ό
mlにプリカし、トリメトプリム耐性株を埗
た。 (5) これらの株より−(2)で述べた方法によ
り、溶菌液を調補し、アガロヌスゲル電気泳
動法により、プラスミドDNAを怜出したず
ころ、ベクタヌのpAM330よりも明らかに倧
きなプラスミドが怜出された。この株を
AJ12147FERM−P7673FERM BP−
786ず名付けた。 (6) AJ12147が有するプラスミドpAJ228
䞊にトリメトプリム耐性遺䌝子が存圚するこ
ずを確認するため、このプラスミドDNAを
甚いブレビバクテリりム・ラクトフアヌメン
タムAJ12036を再床、圢質転換した。 生じたトリメトプリム耐性を有するコロニヌの
うちそれぞれ10個を釣り䞊げアガロヌス電気泳動
法によりプラスミドNAを怜出したずころ、これ
らのいずれにもpAJ228ず同じ倧きさのプラスミ
ドが存圚しおいた。䞊蚘組換えプラスミド䞊にト
リメトプリム耐性を衚珟する遺䌝子が存圚するこ
ずが明らかずな぀た。 (7) トリメトプリム耐性プラスミドpAJ228
ぞのHK遺䌝子pAJ211の2.9kb PstDNA
断片の移しかえ pAJ228はPstによる切断郚䜍を有さないため
HK遺䌝子を含むpAJ211由来の2.9kbのPst断
片をそのたた移しかえるこずは䞍可胜である。そ
こで第図に瀺した方法で移しかえを行぀た。即
ちpAJ211より制限酵玠Pstによる郚分切断で切
り出した2.9kbにDNA断片の䞡端にBamH
SalPstの切断郚䜍をも぀た第図に瀺した
ような合成オリゎヌクレオチドリンカヌをT4フ
アヌゞ由来のDNAリガヌれを甚いお連結させた
埌、制限酵玠BamHで切断した。埗られた
DNA混合物をアガロヌス・ゲル電気泳動にかけ、
箄2.9kbのDNA断片を分離抜出し、゚タノヌル沈
柱によりDNA断片を回収した。こうしお埗られ
たDNA断片は2.9kbのHK遺䌝子を含むDNAの
䞡端にPstSalBamHの切断郚䜍が䞊
んだ構造にな぀おいる第図。 䞀方、pAJ228は制限酵玠Mboで郚分切断し
た埌65℃10分の熱凊理をした。この反応液に前
述の方法で埗たHK遺䌝子を含むDNA断片を加
え、T4DNAリガヌれでDNA鎖の連結反応を行
぀た。反応埌、65℃、分の熱凊理をし、倍容
の゚タノヌルの添加により沈柱採取されるDNA
を、−(4)ず同様の方法によりトリメトプルム感
受性で、か぀、HK遺䌝子が欠損したブレビバク
テリりム・ラクトフアヌメンタムAJ12078を受容
菌ずしおプロトプラストトランスフオヌメヌシペ
ンを行぀た埌、トリメトプルム100Όmlを含
むプロトプラスト再生培地で培逊した結果玄200
個の再生コロニヌが出珟しおきた。 これをトリメトプルムを200Όmlを含み受
容菌の芁求物質であるスレオニンを含たない最少
培地にレプリカし、トリメトプルム耐性で、か぀
スレオニン芁求性が消倱した菌株株を埗た。こ
れらの株より−(2)に瀺した方法により溶菌液を
調補し、アガロヌス・ゲル電気泳動によりプラス
ミドDNAを怜出したずころ14.9kb12.2kb
9.6kb6.5kbのプラスミドが怜出された。このう
ち最も分子量の小さい6.5kbのプラスミドを
pAJ212ず名付けた。pAJ212を保持する株を1278
−HK株ず名付けた。 pAJ212は、HK遺䌝子を陀いお、pAJ224ずし
お、ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
AJ12196FERM−P8015FERM BP−787ず
しお寄蚗されおいる。 (9) 再トランスホヌメヌシペン AJ12078−HK内の組換えプラスミド
pAJ212䞊にHK遺䌝子が存圚するこずを確認
するためにこのプラスミドDNAを甚いブレビバ
クテリりム・ラクトフアヌメンタムAJ12078を再
床圢質転換した。 生じたトリメトプルム耐性コロニヌのうち、そ
れぞれ10個を釣り䞊げスレオニン芁求性をテスト
したずころ、これらのいずれも芁求性を消倱しお
おり、䞊蚘の組換えプラスミド䞊にHK遺䌝子が
存圚するこずが明らかずな぀た。  ホモセリンデヒドロゲナヌれHD遺䌝子
のクロヌニング (1) HD遺䌝子を含む染色䜓DNAの調補 ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
ATCC13869のα−アミノ−β−ハむドロキシ吉
草酞耐性突然倉異株AJ11188FERM−P4190
特公昭56−3038をのCMG培地ペプトン
dl、酵母゚キスdl、グルコヌス0.5
dl、及びNaCl0.5dlを含み、PH7.2に調敎
したものに怍菌し、30℃で玄時間振盪培逊を
行ない、察数増殖期の菌䜓を集めた。この菌䜓を
リゟチヌム・SDSで溶菌させたのち、通垞のプ
ノヌル凊理法により、染色䜓DNAを抜出粟補し、
最終的に3.6mgのDNAを埗た。 (2) ベクタヌDNAの調補 ベクタヌずしおpAJ1844特開昭58−192900参
照分子量5.4メガダルトンを甚い、その
DNAを次の様にしお調補した。 pAJ1844は、コリネバクテリりム・グルタミり
ムATCC13058を有しおいたプラスミドpHM1519
より誘導されたものである。 たずpAJ1844をプラスミドずしお保有するブレ
ビバクテリりム・ラクトフアヌメンタムAJ12037
FERM−P7234FERM−BP577を100mlの
CMG培地に接皮し、30℃で察数増殖期埌期たで
培逊したのち、リゟチヌムSDS凊理により溶菌さ
せ、30000×30分の超遠心により䞊枅を埗た。
プノヌル凊理ののち、容の゚タノヌルを加え
おDNAを沈柱回収し、pAJ1844プラスミドDNA
箄80Όを埗た。 (3) 染色䜓DNA断片のベクタヌぞの挿入 (1)で埗た染色䜓DNA40Όを、制限酵玠Pst
、0.124ナニツトで30℃、10分間郚分消化した。 (2)で埗プラスミドDNA10Όは制限゚ンドヌ
クレアヌれPstで37℃、時間凊理し、完党に
切断した。65℃10分の熱凊理埌、䞡反応液を混合
し、ATP及びゞチオスレむトヌル存圚䞋、T4フ
アヌゞ由来のDNAリガヌれによ぀お22℃、15時
間DNA鎖の連結反応を行぀た。65℃分の熱凊
理埌、反応液に倍容の゚タノヌルを加えお連結
反応終了埌のDNAを沈柱採取した。 (4) HD遺䌝子のクロヌニング HD遺䌝子が欠損したブレビバクテリりム・ラ
クトフアヌメンタムAJ12019NRRLB−15346
を受容菌ずしお甚いた。−(4)で述べた方法で圢
質転換をおこな぀た。 30℃で10日間培逊埌、クロラムプニコヌル耐
性であ぀おか぀ホモセリン芁求性が消倱した
AJ12020FERM−BP269を埗た。 (5) 圢質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調補し、アガロヌスゲル電気泳動法によりプラ
スミドDNAを怜出したずころ、7.64Mdのプラス
ミドを怜出し、pAJ210ず名づけた。 (6) 再トランスホヌメヌシペン AJ12020内の組換えプラスミドpAJ210䞊
にHD遺䌝子が存圚するこずを確認するためにこ
のプラスミドDNAを甚いブレビバクテリりム・
ラクトフアヌメンタムAJ12019を再床圢質転換し
た。 生じたクロラムプニコヌル耐性コロニヌのう
ち、それぞれ10個を釣り䞊げホモセリン芁求性を
テストたずころ、これらのいずれも芁求性を消倱
しおおり、䞊蚘の組換えプラスミド䞊にHD遺䌝
子が存圚するこずが明らかずな぀た。  pAJ210ずpAJ212の共存による−スレオニ
ンの生産 pAJ210を−(4)で甚いた圢質転換法により、
スレオニン生産菌、AHV耐性突然倉異株ブレビ
バクテリりム・ラクトフアヌメンタムAJ11188
FERM−P4190䞭に導入しお、圢質転換株を
クロムプニコヌル耐性で遞択し、菌株AJ12021
FERM−BP270株を埗た。 同様にpAJ212を圢質転換法によりAJ11188æ ª
に導入し、圢質転換株をトリメトプルム耐性で遞
択し、菌株11188−HK株を埗た。 さらにpAJ212をAJ12021株に導入し、クロラ
ムプニコヌル耐性か぀トリメトプルム耐性で遞
択し、二皮のプラスミドpAJ210ずpAJ212を含む
AJ12209FERM−P8106FERM BP−877株
を埗た。 A11188株、AJ12021株、11188−HK株及び
AJ12209株をスレオニン生産培地グルコヌス10
dlNH42SO43dlKH2PO40.1
dlMgSO4・7H2O0.04dlFeSO4・
7H2O10mgMnSO4・5H2O10mgチアミン・
HCl300Ό、ビオチン100Ό、倧豆蛋癜
酞加氎分解液「味液」45dl党窒玠ずし
お、む゜ロむシン25mgdlロむシン30dl
PH7.0CaCO35dl別に殺菌した30℃に
お72時間振盪培逊した。培逊埌、遠心䞊枅䞭の
−スレオニン、−リゞン及び−ホモセリンを
マむクロバむオアツセむ又は高速液䜓クロマトグ
ラフむヌで定量した。その結果を第衚に瀺し
た。 尚、pAJ210pAJ212は寄蚗されたAJ12209æ ª
から通垞の方法を甚いお分離しうる。 又、AJ12019はAJ12020より、AJ12078は
AJ12079又は12078−HKより、AJ11188は
AJ12021AJ12080又はAJ12209より宿䞻现胞を
損なうこずなく宿䞻现胞䞭の耇合プラスミドを陀
去するこずにより容易に埗られる。プラスミドは
宿䞻より自然に倱なわれるこずもあるし、「陀去」
操䜜によ぀お陀くこずもできるBact.Rev.
36p361−4051972。 陀去操䜜の䞀䟋は以䞋の通りである宿䞻の生
育を䞍完党に阻害する濃床−50dlのア
クリゞンオレンゞを含む培地に、ml圓り玄104
现胞皋床になる様に少量の菌株を接皮し宿䞻菌の
生育を䞍完党に阻害しおから27−37℃で䞀倜培逊
するJ.Bacteriol.882611964。培逊液を寒
倩培地に塗垃し、27−37℃で䞀倜培逊する。培地
䞊に出珟したコロニヌのうち、クロラムプニコ
ヌル10Όml又はトリメトプルム50ÎŒ
mlに感受性を瀺す株がプラスミドが陀去さ
れおいる株で即ち、AJ12019AJ12078及び
AJ11188である。 【衚】 実斜䟋  −(5)−(8)及び−(4)で埗た圢質転換株
AJ12079株AJ12078pAJ21112078−HKæ ª
AJ12078pAJ212及びAJ12020æ ª
AJ12019pAJ210は−む゜ロむシンを生産
した。第衚は、各菌株の培逊䞊枅䞭の−む゜
ロむシン、−スレオニン、−リゞン、及び
−ホモセリンをマむクロバむオアツセむ又は高速
液䜓クロマトグラフむヌで定量した結果である。 【衚】 なお、培逊は、で述べたスレオニン生産培地
からむ゜ロむシン及びロむシンを陀去した培地を
甚い、30℃、72時間振盪培逊した。 ブレビバクテリりム・ラクトフアヌメンタム
AJ12028FERM BP−272は、−む゜ロむシ
ン生産菌であり、−−アミノ゚チル−シス
テむン、AHV、β−ヒドロキシロむシン耐性
で、ロむシン栄逊芁求株ずしお育皮されたもので
ある。この菌株を−(8)及び−(5)で埗たプラス
ミドpAJ212及びpAJ210DNAで圢質転換し、
−(4)ず同様の方法でクロムプニコヌル及びトリ
メトプリム耐性圢質転換株12028DK株を埗た。 たたアガロヌスゲル電気泳動により圢質転換株
がpAJ210及びpAJ212を有しおいるこずを確認し
た。 で述べたスレオニン生産培地からむ゜ロむシ
ンを陀去した培地で30℃、72時間圢質転換株を培
逊し、生産された−む゜ロむシン、−スレオ
ニン、−リゞン、及び−ホモセリン量をマむ
クロバむオアツセむ又は高速液䜓クロマトグラフ
むヌで定量した。結果を第衚に瀺した。 【衚】
【図面の簡単な説明】
第図はHK遺䌝子を組み蟌んだpAJ212及び
発珟甚プラスミドpAJ224を造成する方法である。

Claims (1)

    【特蚱請求の範囲】
  1.  ブレビバクテリりム属现菌由来のホモセリン
    キナヌれをコヌドする遺䌝子が組蟌たれおいる第
    のプラスミド及びブレビバクテリりム属现菌由
    来のホモセリンデヒドロゲナヌれをコヌドする遺
    䌝子が組蟌たれおいる第のプラスミドを有する
    コリネホルム现菌を培逊するこずを特城ずするス
    レオニン又はむ゜ロむシンの補造法。
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