JPH0728749B2 - Ｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents
Ｌ−アルギニンの製造法Info
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- JPH0728749B2 JPH0728749B2 JP61224189A JP22418986A JPH0728749B2 JP H0728749 B2 JPH0728749 B2 JP H0728749B2 JP 61224189 A JP61224189 A JP 61224189A JP 22418986 A JP22418986 A JP 22418986A JP H0728749 B2 JPH0728749 B2 JP H0728749B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成に係わる酵
素、特にＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（以下AGK
と略す）、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダク
ターゼ（以下AGPRと略す）、Ｎ−アセチルオルニチン−
δ−アミノトランスフェラーゼ（以下AOATと略す）、オ
ルニチンカルバミルトランスフェラーゼ（以下OCTと略
す）、大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
（以下AGSと略す）欠損変異株のアルギニン要求性を非
要求性に回復させる活性を有する酵素、および大腸菌の
Ｎ−アセチルオルニチンデアセチラーゼ（以下AODと略
す）欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復さ
せる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以上
の酵素の合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物に保有させ、該微生物を培地に培養し、
培養物中に生成蓄積したＬ−アルギニンを採取すること
を特徴とするＬ−アルギニンの製造法に関する。従って
本発明はバイオインダストリーの産業分野に関し、特に
医薬品、食品において有用なＬ−アルギニンの製造分野
に関する。
ム属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成に係わる酵
素、特にＮ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（以下AGK
と略す）、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダク
ターゼ（以下AGPRと略す）、Ｎ−アセチルオルニチン−
δ−アミノトランスフェラーゼ（以下AOATと略す）、オ
ルニチンカルバミルトランスフェラーゼ（以下OCTと略
す）、大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ
（以下AGSと略す）欠損変異株のアルギニン要求性を非
要求性に回復させる活性を有する酵素、および大腸菌の
Ｎ−アセチルオルニチンデアセチラーゼ（以下AODと略
す）欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復さ
せる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以上
の酵素の合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドをコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
に属する微生物に保有させ、該微生物を培地に培養し、
培養物中に生成蓄積したＬ−アルギニンを採取すること
を特徴とするＬ−アルギニンの製造法に関する。従って
本発明はバイオインダストリーの産業分野に関し、特に
医薬品、食品において有用なＬ−アルギニンの製造分野
に関する。
従来の技術 コリネバクテリウム属やブレビバクテリウム属などのコ
リネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によるＬ−ア
ルギニンの製造法については、該菌種の野生株から誘導
された突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−ア
ルギニン生産性変異株としては、例えばアグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリィ（Agric.
Biol.Chem.），36,1675〜1684（1972）、特公昭54−372
35、特開昭57−150381などに記載されているように、ア
ミノ酸のアナログや核酸のアナログに対する耐性変異あ
るいはそれらに核酸塩基の要求性を付与した菌株が知ら
れている。
リネ型グルタミン酸生産菌を用いる発酵法によるＬ−ア
ルギニンの製造法については、該菌種の野生株から誘導
された突然変異株を用いる方法が知られている。Ｌ−ア
ルギニン生産性変異株としては、例えばアグリカルチュ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリィ（Agric.
Biol.Chem.），36,1675〜1684（1972）、特公昭54−372
35、特開昭57−150381などに記載されているように、ア
ミノ酸のアナログや核酸のアナログに対する耐性変異あ
るいはそれらに核酸塩基の要求性を付与した菌株が知ら
れている。
また、組換えDNA技術により育種された菌株を用いるＬ
−アルギニンの製造法も知られている。例えば大腸菌の
アルギン生合成に係わる酵素の遺伝子を担うDNA断片を
含む組換え体プラスミドDNAをコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌種に保有させ、該菌株を用
いてＬ−アルギニンを発酵生産する方法が知られている
（特開昭60−66989）。
−アルギニンの製造法も知られている。例えば大腸菌の
アルギン生合成に係わる酵素の遺伝子を担うDNA断片を
含む組換え体プラスミドDNAをコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属菌種に保有させ、該菌株を用
いてＬ−アルギニンを発酵生産する方法が知られている
（特開昭60−66989）。
発明が解決しようとする問題点 近年、Ｌ−アルギニンに対する需要が増大するにつれ、
Ｌ−アルギニンの製造法の改善がますます望まれてい
る。
Ｌ−アルギニンの製造法の改善がますます望まれてい
る。
問題点を解決するための手段 本発明者は、組換えDNA技術によりコリネバクテリウム
属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−アルギニンの
生産能力を向上させるために鋭意研究を重ねた。その結
果、先に大腸菌のＬ−アルギニン生合成に係わる酵素を
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミド（pEargl）
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に導入、保有させることにより、Ｌ−アルギニンの生
産性が向上することを見出し、特開昭60−66989に開示
したが、さらにコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種のＬ−アルギニン生合成に係わる酵素、
特にAGK、AGPR、AOAT、OCT、大腸菌のAGS欠損変異株の
アルギニン要求性を非要求性に回復させる活性を有する
酵素、および大腸菌のAOD欠損変異株のアルギニン要求
性を非要求性に回復させる活性を有する酵素から選ばれ
る少なくとも１つ以上の酵素の合成に関与する遺伝子を
含む組換え体プラスミドをコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌種に導入、保有させることによ
り、pEargl導入株よりもＬ−アルギニン生産性の向上し
た菌株が得られることを見出し、本発明を完成するに至
った。
属またはブレビバクテリウム属菌種のＬ−アルギニンの
生産能力を向上させるために鋭意研究を重ねた。その結
果、先に大腸菌のＬ−アルギニン生合成に係わる酵素を
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミド（pEargl）
をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌
種に導入、保有させることにより、Ｌ−アルギニンの生
産性が向上することを見出し、特開昭60−66989に開示
したが、さらにコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属菌種のＬ−アルギニン生合成に係わる酵素、
特にAGK、AGPR、AOAT、OCT、大腸菌のAGS欠損変異株の
アルギニン要求性を非要求性に回復させる活性を有する
酵素、および大腸菌のAOD欠損変異株のアルギニン要求
性を非要求性に回復させる活性を有する酵素から選ばれ
る少なくとも１つ以上の酵素の合成に関与する遺伝子を
含む組換え体プラスミドをコリネバクテリウム属または
ブレビバクテリウム属菌種に導入、保有させることによ
り、pEargl導入株よりもＬ−アルギニン生産性の向上し
た菌株が得られることを見出し、本発明を完成するに至
った。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、コリネバクテリウム属またはブレビバクテリ
ウム属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成酵素の合
成に関与する遺伝情報を含むDNA断片とベクターDNAとの
組換え体DNAを保有するコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培
養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積させ、該培養物から
Ｌ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギ
ニンの製造法を提供する。
ウム属に属する微生物のＬ−アルギニン生合成酵素の合
成に関与する遺伝情報を含むDNA断片とベクターDNAとの
組換え体DNAを保有するコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、培
養物中にＬ−アルギニンを生成蓄積させ、該培養物から
Ｌ−アルギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギ
ニンの製造法を提供する。
Ｌ−アルギニンの生合成酵素の合成に関与する遺伝情報
とは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチ
ル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチル
オルニチン−δ−アミノトランスフェラーゼまたはオル
ニチンカルバミルトランスフェラーゼの合成に関与する
もの、あるいは大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シン
テターゼ欠損変異株またはＮ−アセチルオルニチンデア
セチラーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に
回復させるものなどがあげられる。
とは、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ−アセチ
ル−γ−グルタミルリン酸レダクターゼ、Ｎ−アセチル
オルニチン−δ−アミノトランスフェラーゼまたはオル
ニチンカルバミルトランスフェラーゼの合成に関与する
もの、あるいは大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シン
テターゼ欠損変異株またはＮ−アセチルオルニチンデア
セチラーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に
回復させるものなどがあげられる。
宿主微生物として用いるコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
コリネ型グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全
て用いることができるが、好適には下記の菌株が用いら
れる。
レビバクテリウム属に属する微生物としては、いわゆる
コリネ型グルタミン酸生産菌として知られる微生物は全
て用いることができるが、好適には下記の菌株が用いら
れる。
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC31833 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC1387
0 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC1386
9 ブレビバクテリウム・チオゲンタリス ATCC19240 宿主としては、Ｌ−アルギニン生産能を有しない野生株
を用いることもできるが、Ｌ−アルギニン生産能を有す
る菌株を用いることもできる。アルギニン生産農を有す
る菌株としては、アミノ酸アナログ耐性変異株など公知
の菌株が使用できる。
0 コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 ブレビバクテリウム・ディバリカツム ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラブム ATCC14067 ブレビバクテリウム・イマリオフィラム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC1386
9 ブレビバクテリウム・チオゲンタリス ATCC19240 宿主としては、Ｌ−アルギニン生産能を有しない野生株
を用いることもできるが、Ｌ−アルギニン生産能を有す
る菌株を用いることもできる。アルギニン生産農を有す
る菌株としては、アミノ酸アナログ耐性変異株など公知
の菌株が使用できる。
本発明において、Ｌ−アルギニン生合成に係わる酵素の
遺伝子の供給源となる微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌でこれら酵素活性を有するものであればい
かなる微生物でもよく、例えばコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物の野生株ある
いはそれから誘導したＬ−アルギニン生産性変異株を用
いることができる。これらの菌株の染色体DNAは、本発
明者が特開昭58−126789に示したように、培養中にペニ
シリン処理した菌体をリゾチームおよび界面活性剤で処
理して溶菌した後、常法で除蛋白し、次いでエタノール
で沈澱させることにより単離できる。
遺伝子の供給源となる微生物としては、コリネ型グルタ
ミン酸生産菌でこれら酵素活性を有するものであればい
かなる微生物でもよく、例えばコリネバクテリウム属ま
たはブレビバクテリウム属に属する微生物の野生株ある
いはそれから誘導したＬ−アルギニン生産性変異株を用
いることができる。これらの菌株の染色体DNAは、本発
明者が特開昭58−126789に示したように、培養中にペニ
シリン処理した菌体をリゾチームおよび界面活性剤で処
理して溶菌した後、常法で除蛋白し、次いでエタノール
で沈澱させることにより単離できる。
染色体DNAから得られるアルギニン生合成に係わる酵素
の遺伝子を含むDNA断片を組み込むためのベクターとし
ては、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム
属菌種中で複製できるものであれば特に限定されない
が、例えば本発明者が開発したpCG1（特開昭57−13450
0）、pCG2（特開昭58−35197）、pCG4、pCG11（いずれ
も特開昭57−183799）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.）,196,175（1984）〕pCE54、pCB101
（いずれも特開昭58−105999）などのプラスミドを使用
することができる。プラスミドベクターは、本発明者が
特開昭57−134500あるいは特開昭57−186489に開示した
ように、菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌後ク
リアードライゼートを調製し、ポリエチレングリコール
でDNAを沈澱させ、しかる後に塩化セシウム−エチジウ
ムブロマイド密度勾配遠心にかけ、ccc−DNAとして単
離、精製することができる。
の遺伝子を含むDNA断片を組み込むためのベクターとし
ては、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム
属菌種中で複製できるものであれば特に限定されない
が、例えば本発明者が開発したpCG1（特開昭57−13450
0）、pCG2（特開昭58−35197）、pCG4、pCG11（いずれ
も特開昭57−183799）、pCE51、pCE52、pCE53〔いずれ
もモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.）,196,175（1984）〕pCE54、pCB101
（いずれも特開昭58−105999）などのプラスミドを使用
することができる。プラスミドベクターは、本発明者が
特開昭57−134500あるいは特開昭57−186489に開示した
ように、菌体をリゾチームおよび界面活性剤で溶菌後ク
リアードライゼートを調製し、ポリエチレングリコール
でDNAを沈澱させ、しかる後に塩化セシウム−エチジウ
ムブロマイド密度勾配遠心にかけ、ccc−DNAとして単
離、精製することができる。
アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むDNA断片
のベクタープラスミドとの組換え体は、染色体DNAとベ
クタープラスミドDNAを制限酵素で切断した後、DNAリガ
ーゼで処理するか、あるいはその切断末端をターミナル
トランスフェラーゼやDNAポリメラーゼなどで処理した
後、DNAリガーゼを作用させて結合するなどの常法〔メ
ソッヅ・イン・エンザイモロジイ（Methods in Enzymol
ogy）、68（1979）〕により、種々の組換え体混生物と
して生成させることができる。
のベクタープラスミドとの組換え体は、染色体DNAとベ
クタープラスミドDNAを制限酵素で切断した後、DNAリガ
ーゼで処理するか、あるいはその切断末端をターミナル
トランスフェラーゼやDNAポリメラーゼなどで処理した
後、DNAリガーゼを作用させて結合するなどの常法〔メ
ソッヅ・イン・エンザイモロジイ（Methods in Enzymol
ogy）、68（1979）〕により、種々の組換え体混生物と
して生成させることができる。
この組換え体混成物を用いて、アルギニン生合成に係わ
る酵素が欠損したコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属の変異株を形質転換し欠損形質が相補され
た形質転換株を選択する組換え体DNA技法によって、ア
ルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むDNA断片と
ベクターDNAとの組換え体プラスミドを取得することが
できる。コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属の形質転換法としては、本発明者が開発したプロト
プラストを用いる方法（特開昭57−186492および特開昭
57−186489、具体的には実施例に示す）により実施する
ことができる。
る酵素が欠損したコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属の変異株を形質転換し欠損形質が相補され
た形質転換株を選択する組換え体DNA技法によって、ア
ルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子を含むDNA断片と
ベクターDNAとの組換え体プラスミドを取得することが
できる。コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウ
ム属の形質転換法としては、本発明者が開発したプロト
プラストを用いる方法（特開昭57−186492および特開昭
57−186489、具体的には実施例に示す）により実施する
ことができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌株
で直接組換え体DNAを選択するかわりに、例えば大腸菌
のようにすでに遺伝子組換え技法が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、該遺伝子
の供与体DNAと大腸菌のベクターDNAの試験管内結合反応
物を用い、アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子の欠
損した大腸菌の変異株を形質転換し、欠損形質が相補さ
れた形質転換株を選択し、この形質転換株から該遺伝子
を含むクローン化DNA断片を得ることができる。該DNA断
片をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
細菌のベクターDNAと試験管内で組み換えて、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌を形質転
換すれば、該細菌にクローン化した該遺伝子を含む組換
え体DNAを保有させることができる。
で直接組換え体DNAを選択するかわりに、例えば大腸菌
のようにすでに遺伝子組換え技法が確立している宿主−
ベクター系を用いることもできる。すなわち、該遺伝子
の供与体DNAと大腸菌のベクターDNAの試験管内結合反応
物を用い、アルギニン生合成に係わる酵素の遺伝子の欠
損した大腸菌の変異株を形質転換し、欠損形質が相補さ
れた形質転換株を選択し、この形質転換株から該遺伝子
を含むクローン化DNA断片を得ることができる。該DNA断
片をコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属
細菌のベクターDNAと試験管内で組み換えて、コリネバ
クテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌を形質転
換すれば、該細菌にクローン化した該遺伝子を含む組換
え体DNAを保有させることができる。
以上のようにしてコリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属菌種の野生株の染色体DNAを供与源として
野生型のアルギニン生合成酵素の遺伝子を含む組換え体
が得られ、これをコリネバクテリウム属あるいはブレビ
バクテリウム属細菌に保有させ、アルギニン生産性を向
上させることができる。
クテリウム属菌種の野生株の染色体DNAを供与源として
野生型のアルギニン生合成酵素の遺伝子を含む組換え体
が得られ、これをコリネバクテリウム属あるいはブレビ
バクテリウム属細菌に保有させ、アルギニン生産性を向
上させることができる。
コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属菌種
などのコリネ型グルタミン酸生産菌および大腸菌におい
ては、Ｌ−アルギニン生合成経路の各生合成酵素の合成
がアルギニンによって抑制されること〔Yoshida,H.et a
l.,アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（Agric.Biol.Chem.），43,105（1979）〕、
また、コリネ型グルタミン酸生産菌では、Ｌ−アルギニ
ン生合成経路の第２酵素であるＮ−アセチルグルタミン
酸キナーゼ（AGK）にアルギニンによるフィードバック
阻害がかかること〔Udaka,S.,ジャーナル・オブ・バク
テリオロジイ（J.Bacteriol.），91,617（1966）〕が知
られている。このことより、コリネバクテリウム属およ
びブレビバクテリウム属菌種の野生株からクローン化さ
れた野生型のアルギニン生合成酵素の遺伝子も生成する
アルギニンによる調節を受けるものと考えらえる。従っ
てＬ−アルギニンの生産には、これらの調節が解除され
た変異型遺伝子を有する組換え体プラスミドを用いるほ
うが、増産効果が高まり好ましい。このような変異型遺
伝子を含む組換え体プラスミドは、アグリガルチュラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリィ（Agric.Bio
l.Chem.），43,1899（1979）に記載されているように、
Ｌ−アルギニンのアナログ、例えばＤ−アルギニンに体
する耐性を指標にして選択された、Ｌ−アルギニンによ
る阻害に非感受性となったAGKを有する変異株の染色体D
NAを供与源として、野生型の遺伝子を得たのと同様の方
法で取得できる。あるいは、野生型遺伝子を含む組換え
体プラスミドを例えばモレキュラー・アンド・ジェネラ
ル・ジェネティクス（Mol.Gen.Genet.），145,101（197
8）に記載されている方法でin vitroで変異を付与する
か、またはそれを保有する微生物をin vivoで変異処理
するかして変異型遺伝子を含む組換え体プラスミドを取
得することもできる。
などのコリネ型グルタミン酸生産菌および大腸菌におい
ては、Ｌ−アルギニン生合成経路の各生合成酵素の合成
がアルギニンによって抑制されること〔Yoshida,H.et a
l.,アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリィ（Agric.Biol.Chem.），43,105（1979）〕、
また、コリネ型グルタミン酸生産菌では、Ｌ−アルギニ
ン生合成経路の第２酵素であるＮ−アセチルグルタミン
酸キナーゼ（AGK）にアルギニンによるフィードバック
阻害がかかること〔Udaka,S.,ジャーナル・オブ・バク
テリオロジイ（J.Bacteriol.），91,617（1966）〕が知
られている。このことより、コリネバクテリウム属およ
びブレビバクテリウム属菌種の野生株からクローン化さ
れた野生型のアルギニン生合成酵素の遺伝子も生成する
アルギニンによる調節を受けるものと考えらえる。従っ
てＬ−アルギニンの生産には、これらの調節が解除され
た変異型遺伝子を有する組換え体プラスミドを用いるほ
うが、増産効果が高まり好ましい。このような変異型遺
伝子を含む組換え体プラスミドは、アグリガルチュラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリィ（Agric.Bio
l.Chem.），43,1899（1979）に記載されているように、
Ｌ−アルギニンのアナログ、例えばＤ−アルギニンに体
する耐性を指標にして選択された、Ｌ−アルギニンによ
る阻害に非感受性となったAGKを有する変異株の染色体D
NAを供与源として、野生型の遺伝子を得たのと同様の方
法で取得できる。あるいは、野生型遺伝子を含む組換え
体プラスミドを例えばモレキュラー・アンド・ジェネラ
ル・ジェネティクス（Mol.Gen.Genet.），145,101（197
8）に記載されている方法でin vitroで変異を付与する
か、またはそれを保有する微生物をin vivoで変異処理
するかして変異型遺伝子を含む組換え体プラスミドを取
得することもできる。
野生型あるいは変異型のアルギニン生合成遺伝子を含む
組換え体プラスミドは前記のようにプロストプラストを
用いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種に導入できる。これらの組換え
体プラスミド保有株によるＬ−アルギニンの生産は、従
来の発酵法によるＬ−アルギニン製造に用いられる培養
方法により行うことができる。
組換え体プラスミドは前記のようにプロストプラストを
用いる形質転換法によりコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属菌種に導入できる。これらの組換え
体プラスミド保有株によるＬ−アルギニンの生産は、従
来の発酵法によるＬ−アルギニン製造に用いられる培養
方法により行うことができる。
すなわち、該形質転換株を炭素源、窒素源、無機物、ア
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、pHなどを調節しつつ培養を行えば、培養
物中にＬ−アルギニンが生成蓄積するので、これを採取
する。
ミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中、好気的
条件下、温度、pHなどを調節しつつ培養を行えば、培養
物中にＬ−アルギニンが生成蓄積するので、これを採取
する。
炭素源としてはグルコース、グリセロール、フラクトー
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各
種有機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭
化水素、アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は
好適に用いられる。
ス、シュークロース、マルトース、マンノース、澱粉、
澱粉加水分解物、糖蜜などの種々の炭水化物、ポリアル
コール、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸などの各
種有機酸が使用できる。さらに菌の資化性によって、炭
化水素、アルコール類なども用いうる。とくに廃糖蜜は
好適に用いられる。
窒素源としてはアンモニアあるいは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはそ
の消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物、蛹加水分解
物などの窒息含有有機物など種々のものが使用可能であ
る。
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類あるいは
尿素および他の窒素含有物質ならびにペプトン、NZ−ア
ミン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールあるいはそ
の消化物、脱脂大豆粕あるいはその消化物、蛹加水分解
物などの窒息含有有機物など種々のものが使用可能であ
る。
さらに無機物としては、リン酸第一水素カリウム、リン
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用す
る。微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源な
どは、前記したような他の培地成分に従って培地に供給
されれば特に加えなくてもよい。
酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用す
る。微生物の生育に必要とするビタミン、アミノ酸源な
どは、前記したような他の培地成分に従って培地に供給
されれば特に加えなくてもよい。
培養は振盪培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条件
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養中の培地はpHは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アルギニンが
蓄積する。
下に行う。培養温度は一般に20〜40℃が好適である。培
養中の培地はpHは中性付近に維持することが望ましい。
培養期間は通常１〜５日間で培地中にＬ−アルギニンが
蓄積する。
培養終了後、菌体を除去して活性炭処理、イオン交換樹
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−アルギニンを
回収する。
脂処理などの公知の方法で培養液からＬ−アルギニンを
回収する。
このようにしてコリネ型グルタミン酸生産菌のアルギニ
ン生合成に係わる酵素の遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドを保有させたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属の菌株を用いることにより、非保有株または
pEargl導入株に比べ高い収率でＬ−アルギニンを生産す
ることができる。
ン生合成に係わる酵素の遺伝子を含む組換え体プラスミ
ドを保有させたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属の菌株を用いることにより、非保有株または
pEargl導入株に比べ高い収率でＬ−アルギニンを生産す
ることができる。
かかる微生物として具体的には、コリネバクテリウム・
グルタミクムK64（FERM BP−1114）、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムK65（FERM BP−1115）などがあげられ
る。これらの菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に昭和61年７月24日付で寄託されている。
グルタミクムK64（FERM BP−1114）、コリネバクテリウ
ム・グルタミクムK65（FERM BP−1115）などがあげられ
る。これらの菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に昭和61年７月24日付で寄託されている。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 （１） コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムAT
CC 13870の染色体DNAの調製 NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを純水１に
含み、pH7.2に調整した培地）で培養したコリネバクテ
リウム・アセトアシドフィラムATCC 13870の種培養10ml
を400mlの半合成培地SSM〔グルコース20g、（NH4）2SO4
10g、尿素 3g、酵母エキス 1g、KH2PO4 1g、MgCl2
・6H2O 0.4g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・４〜6H2O
0.2mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、CuSO4・5H2O 0.4mg、Na2
B4O7・10H2O 0.09mg、（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.04m
g、ビチオン30μｇ、サイアミン塩酸塩1mgを水１に含
み、pH7.2に調整した培地〕に接種して30℃で振盪培養
した。東京光電比色計で660nmにおける吸光度（OD）
（以下、特記しない限り吸光度は660nmで測定）を測定
し、OD0.2になった時点で0.5単位/mlの濃度になるよう
にペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、OD0.6
になるまで生育させた。
CC 13870の染色体DNAの調製 NB培地（粉末ブイヨン20g、酵母エキス5gを純水１に
含み、pH7.2に調整した培地）で培養したコリネバクテ
リウム・アセトアシドフィラムATCC 13870の種培養10ml
を400mlの半合成培地SSM〔グルコース20g、（NH4）2SO4
10g、尿素 3g、酵母エキス 1g、KH2PO4 1g、MgCl2
・6H2O 0.4g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・４〜6H2O
0.2mg、ZnSO4・7H2O 0.9mg、CuSO4・5H2O 0.4mg、Na2
B4O7・10H2O 0.09mg、（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.04m
g、ビチオン30μｇ、サイアミン塩酸塩1mgを水１に含
み、pH7.2に調整した培地〕に接種して30℃で振盪培養
した。東京光電比色計で660nmにおける吸光度（OD）
（以下、特記しない限り吸光度は660nmで測定）を測定
し、OD0.2になった時点で0.5単位/mlの濃度になるよう
にペニシリンＧを添加した。さらに培養を続け、OD0.6
になるまで生育させた。
培養液から菌体を集菌し、TES緩衝液〔0.03M トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略
す）、0.005Mエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以
下EDTAと略す）、0.05M NaCl、pH8.0〕で洗浄後、リゾ
チーム溶液（25％ショ糖、0.1M NaCl、0.05M トリ
ス、0.8mg/mlリゾチーム、pH8.0）10mlに懸濁し、37℃
で４時間反応させた。集菌した菌体から斎藤らの方法
〔バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Bioche
m.Biophys.Acta），72,619（1963）〕に従って高分子染
色体DNAを単離した。
（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下トリスと略
す）、0.005Mエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以
下EDTAと略す）、0.05M NaCl、pH8.0〕で洗浄後、リゾ
チーム溶液（25％ショ糖、0.1M NaCl、0.05M トリ
ス、0.8mg/mlリゾチーム、pH8.0）10mlに懸濁し、37℃
で４時間反応させた。集菌した菌体から斎藤らの方法
〔バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Bioche
m.Biophys.Acta），72,619（1963）〕に従って高分子染
色体DNAを単離した。
（２） 制限欠損変異とアルギニン生合成遺伝子欠損変
異を併せ持つ大腸菌変異株の取得 大腸菌の宿主−ベクター系を用いて外来性遺伝子である
コリネ型グルタミン酸生産菌のアルギニン生合成に係な
る酵素の遺伝子をより容易にクローン化するために、宿
主菌として宿主特異的制限欠損変異（hsdR）とアルギニ
ン生合成遺伝子欠損変異（arg-）とを併せ持つ大腸菌変
異株を以下のように取得した。
異を併せ持つ大腸菌変異株の取得 大腸菌の宿主−ベクター系を用いて外来性遺伝子である
コリネ型グルタミン酸生産菌のアルギニン生合成に係な
る酵素の遺伝子をより容易にクローン化するために、宿
主菌として宿主特異的制限欠損変異（hsdR）とアルギニ
ン生合成遺伝子欠損変異（arg-）とを併せ持つ大腸菌変
異株を以下のように取得した。
宿主特異的制限欠損変異（hsdR）を有する大腸菌K12株
亜株WA802（メチオニン要求性:FERM BP−718）にＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）4
00γ/mlを用いて通常の変異処理〔エックスペリメント
・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiment i
n Molecular Genetics）P.125コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（1972）〕を施した後、ペニシ
リンを用いる栄養要求株の濃縮法〔エックスペリメント
・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiment i
n Molecular Genetics）P.230コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（1972）〕に従ってアルギニン
要求株を濃縮後、選択した。得られたアルギニン要求株
の変異遺伝子の同定は各アルギニン生合成酵素の活性を
測定することで行った。各酵素活性の測定法は、AGSに
ついてはヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Eur.J.Biochem.），31,290（1972）、AGKとA
ODについてはジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバ
イオロジィ（J.Gen.Microbiol.）69,365（1971）に従っ
て行った。その結果AGS欠損変異株としてEA−１、AGK欠
損変異株としてEA−21、AOD欠損変異株としてEA−４を
それぞれ取得した。
亜株WA802（メチオニン要求性:FERM BP−718）にＮ−メ
チル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）4
00γ/mlを用いて通常の変異処理〔エックスペリメント
・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiment i
n Molecular Genetics）P.125コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（1972）〕を施した後、ペニシ
リンを用いる栄養要求株の濃縮法〔エックスペリメント
・イン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiment i
n Molecular Genetics）P.230コールド スプリング
ハーバー ラボラトリー（1972）〕に従ってアルギニン
要求株を濃縮後、選択した。得られたアルギニン要求株
の変異遺伝子の同定は各アルギニン生合成酵素の活性を
測定することで行った。各酵素活性の測定法は、AGSに
ついてはヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Eur.J.Biochem.），31,290（1972）、AGKとA
ODについてはジャーナル・オブ・ジェネラル・ミクロバ
イオロジィ（J.Gen.Microbiol.）69,365（1971）に従っ
て行った。その結果AGS欠損変異株としてEA−１、AGK欠
損変異株としてEA−21、AOD欠損変異株としてEA−４を
それぞれ取得した。
（３） アルギニン生合成遺伝子を含むDNA断片のクロ
ーニング クローン化は大腸菌の宿主−ベクター系にて実施した。
ベクターとして使用したpBR322（アンピシリン耐性、テ
トラサイクリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
pBR322プラスミドDNA1μｇおよび実施例（１）で調製し
たコリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC1387
0の染色体DNA3μｇを含む制限酵素SphI用反応液（6mM
トリス、125mM NaCl、6mM MgCl2、6mM β−メルカ
プトエタノール、0.01％ トリトン Ｘ−100、pH7.5）
200μに10単位のSphI（ベーリンガーマンハイム社
製）を添加し、37℃で60分間反応後65℃で30分間加温し
て反応を停止した。該反応消化物に10倍濃度のT4リガー
ゼ用緩衝液（660mM トリス、66mM MgCl2、100mM ジ
チオスレイトール、pH7.6）40μ、100mM ATP ４μ
、H2O 160μおよびT4リガーゼ（宝酒造社製）300
単位を加え、12℃で16時間反応させた。
ーニング クローン化は大腸菌の宿主−ベクター系にて実施した。
ベクターとして使用したpBR322（アンピシリン耐性、テ
トラサイクリン耐性）は宝酒造社製の市販品を用いた。
pBR322プラスミドDNA1μｇおよび実施例（１）で調製し
たコリネバクテリウム・アセトアシドフィラムATCC1387
0の染色体DNA3μｇを含む制限酵素SphI用反応液（6mM
トリス、125mM NaCl、6mM MgCl2、6mM β−メルカ
プトエタノール、0.01％ トリトン Ｘ−100、pH7.5）
200μに10単位のSphI（ベーリンガーマンハイム社
製）を添加し、37℃で60分間反応後65℃で30分間加温し
て反応を停止した。該反応消化物に10倍濃度のT4リガー
ゼ用緩衝液（660mM トリス、66mM MgCl2、100mM ジ
チオスレイトール、pH7.6）40μ、100mM ATP ４μ
、H2O 160μおよびT4リガーゼ（宝酒造社製）300
単位を加え、12℃で16時間反応させた。
このリガーゼ反応混合物を上記（２）で造成した大腸菌
K12株亜株EA−21（アルギニン、メチオニン要求性）の
形質転換に供した。EA−21株のコンピテント・セルはダ
ジェルトらの方法〔ジーン（Gene）６,23（1979）〕で
調製した。
K12株亜株EA−21（アルギニン、メチオニン要求性）の
形質転換に供した。EA−21株のコンピテント・セルはダ
ジェルトらの方法〔ジーン（Gene）６,23（1979）〕で
調製した。
すなわち、Ｌ培地（バクトトリンプトン10g、酵母エキ
ス5g、グルコース1gおよびNaCl5gを水１に含み、pH7.
2に調製した培地）50mlにEA−21株を植菌し、ODが0.5に
なるまで37℃で培養した。培養液を氷水中で10分間冷却
してから遠心した。冷却した0.1M CaCl2 20mlに菌体を
再懸濁し、０℃に20分間置いた。菌体を再遠心し、0.1M
CaCl2 0.5mlに懸濁し、０℃で18時間置いた。CaCl2処
理した菌液150μに前記リガーゼ反応混合物50μを
添加混合し、０℃に10分間置いてから37℃で５分間加温
した。次いでＬ培地2mlを添加し、37℃で２時間振盪培
養した。生理食塩水で２回遠心洗浄後、メチオニン30μ
g/mlおよびアンピシリン50μg/mlを添加したデービス最
少寒天平板培地〔グルコース2g、（NH4）2SO4 1g、K2H
PO4 7g、KH2PO4 2g、MgSO4・7H2O 0.1g、クエン酸３
ナトリウム塩 0.5g、サイアミン塩酸塩 4mgおよび寒
天16gを水１に含み、pH7.2に調整した培地〕に塗布
し、30℃で４日間培養した。出現した形質転換株の培養
菌体からアンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジィ（J.Bacteriol.）、140,400（1979）〕によりプ
ラスミドDNAを単離した。
ス5g、グルコース1gおよびNaCl5gを水１に含み、pH7.
2に調製した培地）50mlにEA−21株を植菌し、ODが0.5に
なるまで37℃で培養した。培養液を氷水中で10分間冷却
してから遠心した。冷却した0.1M CaCl2 20mlに菌体を
再懸濁し、０℃に20分間置いた。菌体を再遠心し、0.1M
CaCl2 0.5mlに懸濁し、０℃で18時間置いた。CaCl2処
理した菌液150μに前記リガーゼ反応混合物50μを
添加混合し、０℃に10分間置いてから37℃で５分間加温
した。次いでＬ培地2mlを添加し、37℃で２時間振盪培
養した。生理食塩水で２回遠心洗浄後、メチオニン30μ
g/mlおよびアンピシリン50μg/mlを添加したデービス最
少寒天平板培地〔グルコース2g、（NH4）2SO4 1g、K2H
PO4 7g、KH2PO4 2g、MgSO4・7H2O 0.1g、クエン酸３
ナトリウム塩 0.5g、サイアミン塩酸塩 4mgおよび寒
天16gを水１に含み、pH7.2に調整した培地〕に塗布
し、30℃で４日間培養した。出現した形質転換株の培養
菌体からアンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジィ（J.Bacteriol.）、140,400（1979）〕によりプ
ラスミドDNAを単離した。
形質転換株の一株から得られpCarg1と命名したプラスミ
ドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気泳動
による解析の結果、pBR322の唯一のSphI切断部位に７キ
ロベースのSphIDNA断片が挿入した構造を有しているこ
とがわかった。
ドは、各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気泳動
による解析の結果、pBR322の唯一のSphI切断部位に７キ
ロベースのSphIDNA断片が挿入した構造を有しているこ
とがわかった。
pCarg1を用い、EA−21株を前記と同様に形質転換しアン
ピシリン耐性で選択された形質転換株は、同時にアルギ
ニン非要求性を示し、それから単離されたプラスミドは
pCarg1と同一の構造を有していた。このことから、大腸
菌のAGK欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる活
性を有する酵素の合成に関与するコリネバクテリウム・
アセトアシドフィラム ATCC 13870の遺伝子がpCarg1上
にクローニングされていることが明らかになった。また
pCarg1を用い、前記（２）で取得した大腸菌K12株亜株
であるAGS欠損変異株EA−１およびAOD欠損変異株EA−４
（以上いずれもアルギニン、メチオニン要求性）を前記
と同様に形質転換し、アンピシリン耐性で選択された形
質転換株は同時にアルギニン非要求性を示した。すなわ
ちpCarg1上には大腸菌のAGS欠損変異株のアルギニン要
求性を回復させる活性を有する酵素および大腸菌のAOD
欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる活性を有す
る酵素の遺伝子もコードされていることが示された。
ピシリン耐性で選択された形質転換株は、同時にアルギ
ニン非要求性を示し、それから単離されたプラスミドは
pCarg1と同一の構造を有していた。このことから、大腸
菌のAGK欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる活
性を有する酵素の合成に関与するコリネバクテリウム・
アセトアシドフィラム ATCC 13870の遺伝子がpCarg1上
にクローニングされていることが明らかになった。また
pCarg1を用い、前記（２）で取得した大腸菌K12株亜株
であるAGS欠損変異株EA−１およびAOD欠損変異株EA−４
（以上いずれもアルギニン、メチオニン要求性）を前記
と同様に形質転換し、アンピシリン耐性で選択された形
質転換株は同時にアルギニン非要求性を示した。すなわ
ちpCarg1上には大腸菌のAGS欠損変異株のアルギニン要
求性を回復させる活性を有する酵素および大腸菌のAOD
欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる活性を有す
る酵素の遺伝子もコードされていることが示された。
またBaumbergらの方法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル
・ミクロバイオロジィ（J.Gen.Microbiol.）69,365（19
71）〕に従いAGK活性を、Vogelらの方法〔メソッヅ・イ
ン・エンザイモロジイ（Methods in Enzymology）17 pa
rtA255（1970）〕に従いAGPR活性を、Vogelらの方法
〔メソッヅ・イン・エンザイモロジイ（Methods in Enz
ymology）17 partA260（1970）〕に従いAOAT活性を、Pr
escottらの方法〔アナリティカル・バイオケミストリイ
（Anal.Biochem.）32,408（1969）〕に従いOCT活性をそ
れぞれpCarg1を保有するWA802株と保有しない該菌株に
ついて測定したところ、保有株では非保有株に比べ、い
ずれの酵素活性も３倍以上高まっていることが示され
た。すなわちpCarg1には、AGK、AGPR、AOATおよびOCTの
遺伝子がコードされていることが明らかになった。
・ミクロバイオロジィ（J.Gen.Microbiol.）69,365（19
71）〕に従いAGK活性を、Vogelらの方法〔メソッヅ・イ
ン・エンザイモロジイ（Methods in Enzymology）17 pa
rtA255（1970）〕に従いAGPR活性を、Vogelらの方法
〔メソッヅ・イン・エンザイモロジイ（Methods in Enz
ymology）17 partA260（1970）〕に従いAOAT活性を、Pr
escottらの方法〔アナリティカル・バイオケミストリイ
（Anal.Biochem.）32,408（1969）〕に従いOCT活性をそ
れぞれpCarg1を保有するWA802株と保有しない該菌株に
ついて測定したところ、保有株では非保有株に比べ、い
ずれの酵素活性も３倍以上高まっていることが示され
た。すなわちpCarg1には、AGK、AGPR、AOATおよびOCTの
遺伝子がコードされていることが明らかになった。
以上の結果よりpCarg1にはコリネバクテリウム・アセト
アシドフィラムATCC13870由来のAGK、AGPR、AOAT、OC
T、大腸菌のAGS欠損変異株のアルギニン要求性を回復さ
せる活性を有する酵素および大腸菌のAOD欠損変異株の
アルギニン要求性を回復させる活性を有する酵素の遺伝
子が存在することが示された。
アシドフィラムATCC13870由来のAGK、AGPR、AOAT、OC
T、大腸菌のAGS欠損変異株のアルギニン要求性を回復さ
せる活性を有する酵素および大腸菌のAOD欠損変異株の
アルギニン要求性を回復させる活性を有する酵素の遺伝
子が存在することが示された。
（４） プラスミドpCarg11の作製 上記pCarg1をコリネ型グルタミン酸生産菌のベクタープ
ラスミドpCG11と組み換え、大腸菌とコリネ型グルタミ
ン酸生産菌双方で複製可能なシャトルベクターpCarg11
を作製した。
ラスミドpCG11と組み換え、大腸菌とコリネ型グルタミ
ン酸生産菌双方で複製可能なシャトルベクターpCarg11
を作製した。
pCG11は本発明者が先に発明した、コリネバクテリウム
属およびブレビバクテリウム属のプラスミドベクターで
ストレプトマイシンおよびペクチノマイシン耐性の表現
型を与える。pCarg11の作製は以下の工程によって行っ
た。
属およびブレビバクテリウム属のプラスミドベクターで
ストレプトマイシンおよびペクチノマイシン耐性の表現
型を与える。pCarg11の作製は以下の工程によって行っ
た。
pCG11は、それを保有するコリネバクテリウム・グルタ
ミクムATCC31833株から先に本発明者が特開昭57−13450
0に記載した方法に従って単離した。pCG11DNA2μｇを含
む制限酵素BglII用反応液（10mMトリス、100mM NaCl、1
0mM MgCl2、pH7.5）100μに６単位のBglII（宝酒造
社製）を添加し、37℃で２時間反応後、65℃で30分間加
温して反応を停止した。一方pCarg1 DNA2μｇを含む制
限酵素BamHI用反応液（10mMトリス、100mM NaCl、10mM
MgCl2、pH7.5）100μに６単位のBamHI（宝酒造社
製）を添加し、37℃で２時間反応後、65℃で30分間加温
して反応を停止した。両消化物を混合し、10倍濃度のT4
リガーゼ用緩衝液40μ、100mM ATP4μ、H2O 150μ
およびT4リガーゼ（宝酒造社製）300単位を加え、12
℃で16時間反応させた。該リザーゼ反応混合物を用い、
大腸菌K12株亜株EA−21を上記（３）に示した方法によ
り形質転換し、メチオニン30μg/mlおよびスペクチノマ
イシン100μg/mlを含むデービス最少寒天平板培地上に
塗布した。この寒天平板上に出現したスペクチノマイシ
ン耐性かつアルギニン非要求性の形質転換株の１株より
アンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ
（J.Bacteriol.）140,400（1979）〕に従ってプラスミ
ドDNAを単離した。このプラスミドDNAの構造を制限酵素
切断とアガロースゲル電気泳動により解析したところ、
このプラスミドはpCG11の唯一のBgl II切断部位とpCarg
1の唯一のBamHI切断部位とが互いに結合した構造を有し
ていた（第１図参照）。このプラスミドをpCarg11と命
名した。
ミクムATCC31833株から先に本発明者が特開昭57−13450
0に記載した方法に従って単離した。pCG11DNA2μｇを含
む制限酵素BglII用反応液（10mMトリス、100mM NaCl、1
0mM MgCl2、pH7.5）100μに６単位のBglII（宝酒造
社製）を添加し、37℃で２時間反応後、65℃で30分間加
温して反応を停止した。一方pCarg1 DNA2μｇを含む制
限酵素BamHI用反応液（10mMトリス、100mM NaCl、10mM
MgCl2、pH7.5）100μに６単位のBamHI（宝酒造社
製）を添加し、37℃で２時間反応後、65℃で30分間加温
して反応を停止した。両消化物を混合し、10倍濃度のT4
リガーゼ用緩衝液40μ、100mM ATP4μ、H2O 150μ
およびT4リガーゼ（宝酒造社製）300単位を加え、12
℃で16時間反応させた。該リザーゼ反応混合物を用い、
大腸菌K12株亜株EA−21を上記（３）に示した方法によ
り形質転換し、メチオニン30μg/mlおよびスペクチノマ
イシン100μg/mlを含むデービス最少寒天平板培地上に
塗布した。この寒天平板上に出現したスペクチノマイシ
ン耐性かつアルギニン非要求性の形質転換株の１株より
アンらの方法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジィ
（J.Bacteriol.）140,400（1979）〕に従ってプラスミ
ドDNAを単離した。このプラスミドDNAの構造を制限酵素
切断とアガロースゲル電気泳動により解析したところ、
このプラスミドはpCG11の唯一のBgl II切断部位とpCarg
1の唯一のBamHI切断部位とが互いに結合した構造を有し
ていた（第１図参照）。このプラスミドをpCarg11と命
名した。
pCarg11を用いて前記の大腸菌K12株亜株EA−１、EA−2
1、EA−４を形質転換したところ、各スペクチノマイシ
ン耐性形質転換株は同時にアルギニン非要求性も有して
いることが示された。
1、EA−４を形質転換したところ、各スペクチノマイシ
ン耐性形質転換株は同時にアルギニン非要求性も有して
いることが示された。
またpCarg11保有株のAGK、AGPR、AOAT、OCT活性を上記
（３）と同様の方法により測定したところ、いずれの酵
素活性についても保有株は非保有株に比べ、活性が３倍
以上高まっていることが示された。以上よりPCarg11に
もAGK、AGPR、AOAT、OCT、大腸菌のAGS欠損変異株のア
ルギニン要求性を回復させる活性を有する酵素および大
腸菌のAOD欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる
活性を有する酵素の遺伝子が存在していることが示され
た。
（３）と同様の方法により測定したところ、いずれの酵
素活性についても保有株は非保有株に比べ、活性が３倍
以上高まっていることが示された。以上よりPCarg11に
もAGK、AGPR、AOAT、OCT、大腸菌のAGS欠損変異株のア
ルギニン要求性を回復させる活性を有する酵素および大
腸菌のAOD欠損変異株のアルギニン要求性を回復させる
活性を有する酵素の遺伝子が存在していることが示され
た。
このpCarg11を用いてコリネバクテリウム・グルタミク
ムATCC 31833を特開昭57−186492および特開昭57−1864
89に従って形質転換した。すなわち、該菌株をNB培地に
て培養し、しかる後にその種培養0.4mlを40mlのSSM培地
に接種し、30℃で振盪培養した。ODが0.15になった時点
で0.5単位/mlになるようにペニシリンＧを添加した。さ
らに培養を続け、ODが約0.6になったところで細胞を集
菌、RCGP培地〔グルコース 5g、カザミノ酸50、酵母エ
キス2.5g、K2HPO4 3.5g、KH2PO4 1.5g、MgCl2・6H2O
0.41g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・４〜6H2O 2mg、Zn
SO4・7H2O 0.9mg、（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビ
オチン30μｇ、サイアミン塩酸塩 2mg、コハク酸二ナ
トリウム135g、ポリビニルピロリドン（分子量10,000）
30gを水１に含む培地〕に1mg/mlのリゾチームを含む
液5ml（pH7.6）に約109細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ
型試験管に移して30℃で15時間緩やかに振盪反応してプ
ロトプラスト化した。このプロトプラスト菌液0.5mlを
小試験管にとり、2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC
緩衝液（10mM MgCl2、30mMgCl2、50mM トリス、400mM
ショ糖、pH7.5）1mlに懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液
0.1mlに再懸濁した。この菌液に２倍濃のTSMC緩衝液とp
Carg 11プラスミドDNA溶液との１対１混合液100μを
加えて混和し、次いでTSMC緩衝液中に20％ポリエチレン
グリコール（PEG）6,000（半井化学薬品社製）を含む液
1.0mlを添加して混合した。３分後、2,500×ｇで５分間
遠心分離にかけて上澄み液を除去し、沈降したプロトプ
ラストを1mlのRCGP培地（pH7.4）に懸濁してから30℃で
２時間緩やかに振盪した。ついでこのプロトプラスト懸
濁液の0.3mlをスペクチノマイシン40μg/mlを含むRCGP
寒天培地（RCGP培地に1.6％寒天を含む培地、pH7.4）に
塗抹し、30℃で８日間培養した。
ムATCC 31833を特開昭57−186492および特開昭57−1864
89に従って形質転換した。すなわち、該菌株をNB培地に
て培養し、しかる後にその種培養0.4mlを40mlのSSM培地
に接種し、30℃で振盪培養した。ODが0.15になった時点
で0.5単位/mlになるようにペニシリンＧを添加した。さ
らに培養を続け、ODが約0.6になったところで細胞を集
菌、RCGP培地〔グルコース 5g、カザミノ酸50、酵母エ
キス2.5g、K2HPO4 3.5g、KH2PO4 1.5g、MgCl2・6H2O
0.41g、FeSO4・7H2O 10mg、MnSO4・４〜6H2O 2mg、Zn
SO4・7H2O 0.9mg、（NH4）6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビ
オチン30μｇ、サイアミン塩酸塩 2mg、コハク酸二ナ
トリウム135g、ポリビニルピロリドン（分子量10,000）
30gを水１に含む培地〕に1mg/mlのリゾチームを含む
液5ml（pH7.6）に約109細胞/mlとなるように懸濁し、Ｌ
型試験管に移して30℃で15時間緩やかに振盪反応してプ
ロトプラスト化した。このプロトプラスト菌液0.5mlを
小試験管にとり、2,500×ｇで５分間遠心分離し、TSMC
緩衝液（10mM MgCl2、30mMgCl2、50mM トリス、400mM
ショ糖、pH7.5）1mlに懸濁して遠心洗浄後、TSMC緩衝液
0.1mlに再懸濁した。この菌液に２倍濃のTSMC緩衝液とp
Carg 11プラスミドDNA溶液との１対１混合液100μを
加えて混和し、次いでTSMC緩衝液中に20％ポリエチレン
グリコール（PEG）6,000（半井化学薬品社製）を含む液
1.0mlを添加して混合した。３分後、2,500×ｇで５分間
遠心分離にかけて上澄み液を除去し、沈降したプロトプ
ラストを1mlのRCGP培地（pH7.4）に懸濁してから30℃で
２時間緩やかに振盪した。ついでこのプロトプラスト懸
濁液の0.3mlをスペクチノマイシン40μg/mlを含むRCGP
寒天培地（RCGP培地に1.6％寒天を含む培地、pH7.4）に
塗抹し、30℃で８日間培養した。
出現したスペクチノマイシン耐性形質転換株を400mlSSM
培地で振盪培養し、ODが0.15になったところで0.5単位/
mlとなるようにペニシリンＧを添加し、さらにODが0.65
になるまで培養した。培養液から菌体を集菌し、TES緩
衝液で洗浄後、リゾチーム溶液10mlに懸濁し、37℃で４
時間反応させた。反応液に5M NaCl 2.4ml、0.5M EDT
A（pH8.0）0.6ml、および４％ラウリル硫酸ナトリウム
と0.7M NaClからなる溶液4.4mlを順次添加し、緩やか
に混和してから氷水中に15時間置いた。溶解物全量を遠
心管に移し、４℃で60分間69,400×ｇの遠心分離にかけ
上澄液を回収した。これに重量百分率10％相当のPEG6,0
00（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解
後、氷水中に置いた。10時間後、1,500×ｇで10分間遠
心分離してペレットを回収した。TES緩衝液5mlを加えて
ペレットを静かに再溶解してから1.5mg/mlエチジウムブ
ロマイド2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて
静かに溶解し、密度を1.580に合わせた。この溶液を10
5,000×ｇ、18℃で48時間超遠心分離にかけた。この密
度勾配遠心により共有結合で閉じられた環状のDNAは、
紫外線照射することによって遠心チューブ中下方の密度
の高いバンドとして見出された。このバンドを注射器で
遠心チューブの側面から抜きとることによってプラスミ
ドが分離された。ついで分離液を等容量のイソプロピル
アルコール液〔容量百分率90％イソプロピルアルコー
ル、10％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セ
シウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後にTES緩衝液に対して透析し
た。こうしてプラスミドDANを得た。
培地で振盪培養し、ODが0.15になったところで0.5単位/
mlとなるようにペニシリンＧを添加し、さらにODが0.65
になるまで培養した。培養液から菌体を集菌し、TES緩
衝液で洗浄後、リゾチーム溶液10mlに懸濁し、37℃で４
時間反応させた。反応液に5M NaCl 2.4ml、0.5M EDT
A（pH8.0）0.6ml、および４％ラウリル硫酸ナトリウム
と0.7M NaClからなる溶液4.4mlを順次添加し、緩やか
に混和してから氷水中に15時間置いた。溶解物全量を遠
心管に移し、４℃で60分間69,400×ｇの遠心分離にかけ
上澄液を回収した。これに重量百分率10％相当のPEG6,0
00（半井化学薬品社製）を加え、静かに混和して溶解
後、氷水中に置いた。10時間後、1,500×ｇで10分間遠
心分離してペレットを回収した。TES緩衝液5mlを加えて
ペレットを静かに再溶解してから1.5mg/mlエチジウムブ
ロマイド2.0mlを添加し、これに塩化セシウムを加えて
静かに溶解し、密度を1.580に合わせた。この溶液を10
5,000×ｇ、18℃で48時間超遠心分離にかけた。この密
度勾配遠心により共有結合で閉じられた環状のDNAは、
紫外線照射することによって遠心チューブ中下方の密度
の高いバンドとして見出された。このバンドを注射器で
遠心チューブの側面から抜きとることによってプラスミ
ドが分離された。ついで分離液を等容量のイソプロピル
アルコール液〔容量百分率90％イソプロピルアルコー
ル、10％TES緩衝液（この混液中に飽和溶解量の塩化セ
シウムを含む）〕で５回処理してエチジウムブロマイド
を抽出除去し、しかる後にTES緩衝液に対して透析し
た。こうしてプラスミドDANを得た。
これらのプラスミドを制限酵素消化とアガロースゲル電
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるpCarg11と同一の構造を有するものであること
がわかった。
気泳動で解析した結果、各種制限酵素切断様式で特徴付
けられるpCarg11と同一の構造を有するものであること
がわかった。
pCarg11中の遺伝子がコリネバクテリウム属菌種中でも
発現しうることをAGKおよびAOATの遺伝子について以下
のように確認した。
発現しうることをAGKおよびAOATの遺伝子について以下
のように確認した。
pCarg11を保有するコリネバクテリウム・グルタミクムA
TCC31833株および保有しない該株のAGKおよびAOATの発
現量をみるため、両株についてその粗酵素抽出液を調製
した。すなわち、両株の種培養10mlを300mlのSSM培地
（pCarg11保有株にはスペクチノマイシン100μg/mlを添
加）に接種して30℃で振盪培養し、ODが約３になるまで
生育させた。培養液から菌体を集菌し、緩衝液Ａ（10mM
トリス、1mMジチオスレイトール、pH7.2）で洗浄後、緩
衝液A10mlに再懸濁した。その懸濁液をソニケーター（T
OMY精工社製）により強度７で20分間超音波振動をか
け、懸濁液中の細胞を破砕した。破砕液を16,000rpm、4
0分（日立製作所製、RPR20−２ローター使用）の遠心処
理をし、上清を回収した。得られた上清について、緩衝
液A1に対して４℃、６時間の透析を２回行い、上清中
の低分子物質を除去した。
TCC31833株および保有しない該株のAGKおよびAOATの発
現量をみるため、両株についてその粗酵素抽出液を調製
した。すなわち、両株の種培養10mlを300mlのSSM培地
（pCarg11保有株にはスペクチノマイシン100μg/mlを添
加）に接種して30℃で振盪培養し、ODが約３になるまで
生育させた。培養液から菌体を集菌し、緩衝液Ａ（10mM
トリス、1mMジチオスレイトール、pH7.2）で洗浄後、緩
衝液A10mlに再懸濁した。その懸濁液をソニケーター（T
OMY精工社製）により強度７で20分間超音波振動をか
け、懸濁液中の細胞を破砕した。破砕液を16,000rpm、4
0分（日立製作所製、RPR20−２ローター使用）の遠心処
理をし、上清を回収した。得られた上清について、緩衝
液A1に対して４℃、６時間の透析を２回行い、上清中
の低分子物質を除去した。
このようにして得られた両株の粗酵素抽出液を用い、AG
KについてはBaumbergらの方法〔ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・ミクロバイオロジイ（J.Gen.Microbiol.）6
9、365（1971）〕AOATについてはVogelらの方法〔メソ
ッヅ・イン・エンザイモロジィ（Methods in Enzymoleg
y）17 partA、260（1970）〕に従い、各々の酵素活性を
測定した。その結果AGK、AOATいずれの酵素について
も、pCarg11を保有するATCC31833株より得られた抽出液
は、pCarg11を保有しない菌株より得られた抽出液に比
べAGKで30倍、AOATで10倍の比活性の上昇を示し、pCarg
11中の遺伝子がコリネ型グルタミン酸生産菌中で発現す
ることが確かめられた。
KについてはBaumbergらの方法〔ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・ミクロバイオロジイ（J.Gen.Microbiol.）6
9、365（1971）〕AOATについてはVogelらの方法〔メソ
ッヅ・イン・エンザイモロジィ（Methods in Enzymoleg
y）17 partA、260（1970）〕に従い、各々の酵素活性を
測定した。その結果AGK、AOATいずれの酵素について
も、pCarg11を保有するATCC31833株より得られた抽出液
は、pCarg11を保有しない菌株より得られた抽出液に比
べAGKで30倍、AOATで10倍の比活性の上昇を示し、pCarg
11中の遺伝子がコリネ型グルタミン酸生産菌中で発現す
ることが確かめられた。
以上のようにして得られたpCarg11を保有する形質転換
株はコリネバクテリウム・グルタミクムK64（FERM BP
−1114）として微工研に寄託されている。
株はコリネバクテリウム・グルタミクムK64（FERM BP
−1114）として微工研に寄託されている。
（５） 宿主菌のアルギニン生産性を増大させる変異型
プラスミドの作製 pCarg11DNAをヒドロキシルアミンで直接処理する方法
〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.）145,101（1978）〕で、Ｌ−アルギ
ニン生産性を一段と向上できる変異型プラスミドを以下
のように取得した。
プラスミドの作製 pCarg11DNAをヒドロキシルアミンで直接処理する方法
〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Mol.Gen.Genet.）145,101（1978）〕で、Ｌ−アルギ
ニン生産性を一段と向上できる変異型プラスミドを以下
のように取得した。
pCarg11はコリネバクテリウム・グルタミクムK64（FERM
BP−1114）株より前記（４）に示した方法に従い単離
した。そのpCarg11 ２μｇを含む変異処理液（50mM N
aH2PO4、400mM ヒドロキシルアミン塩酸塩、0.5mM ED
TA、pH6.0）300μを75℃で60分間反応し、その後にTE
S緩衝液に対して透析した。この反応液100μを用いて
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833を前記
（４）と同様に形質転換した。得られたスペクチノマイ
シン耐性株について、以下のようにそのアルギニン生産
試験を行った。NB培地で30℃、24時間培養した種培養0.
5mlを生産培地5ml〔廃糖蜜80g（グルコース換算）、（N
H4）2SO4 40g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、CaCO3 20g
を水１に含み、pH7.0に調整した培地〕の入った試験
管に接種し、30℃で72時間振盪培養した。培養後、培養
液をペーパークロマトグラフィーにかけニンヒドリン
発色後比色定量してＬ−アルギニン生成量を測定し、未
変異のpCarg11を保持したコリネバクテリウム・グルタ
ミクムATCC31833株に比べてＬ−アルギニン生成量が顕
著に増大して株を選択した。これらの株よりプラスミド
DNAを前記（４）と同様の方法で単離した。Ｌ−アルギ
ニン生産性の増大した株から得られたプラスミドDNAを
各種制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動にて
構造を解析した結果、これらプラスミドは未変異のpCar
g11と同一の制限酵素切断地図を有することが確認され
た。このうち最も高いＬ−アルギニン生産性を示した菌
株より得たプラスミドをpCarg110と命名した。pCarg110
を保有する菌株はコリネバクテリウム・グルタミクムK6
5（FERM BP−1115）として微工研に寄託されている。
BP−1114）株より前記（４）に示した方法に従い単離
した。そのpCarg11 ２μｇを含む変異処理液（50mM N
aH2PO4、400mM ヒドロキシルアミン塩酸塩、0.5mM ED
TA、pH6.0）300μを75℃で60分間反応し、その後にTE
S緩衝液に対して透析した。この反応液100μを用いて
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC31833を前記
（４）と同様に形質転換した。得られたスペクチノマイ
シン耐性株について、以下のようにそのアルギニン生産
試験を行った。NB培地で30℃、24時間培養した種培養0.
5mlを生産培地5ml〔廃糖蜜80g（グルコース換算）、（N
H4）2SO4 40g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 0.5g、CaCO3 20g
を水１に含み、pH7.0に調整した培地〕の入った試験
管に接種し、30℃で72時間振盪培養した。培養後、培養
液をペーパークロマトグラフィーにかけニンヒドリン
発色後比色定量してＬ−アルギニン生成量を測定し、未
変異のpCarg11を保持したコリネバクテリウム・グルタ
ミクムATCC31833株に比べてＬ−アルギニン生成量が顕
著に増大して株を選択した。これらの株よりプラスミド
DNAを前記（４）と同様の方法で単離した。Ｌ−アルギ
ニン生産性の増大した株から得られたプラスミドDNAを
各種制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動にて
構造を解析した結果、これらプラスミドは未変異のpCar
g11と同一の制限酵素切断地図を有することが確認され
た。このうち最も高いＬ−アルギニン生産性を示した菌
株より得たプラスミドをpCarg110と命名した。pCarg110
を保有する菌株はコリネバクテリウム・グルタミクムK6
5（FERM BP−1115）として微工研に寄託されている。
pCarg1およびpCarg11の作製過程を第１図に示す。又pCa
rg11またはpCarg110保有株および（４）に記載した方法
と同様にして導入したpEarg1保有株（特開昭60−6698
9）によるＬ−アルギニン生産試験の結果を第１表に示
す。
rg11またはpCarg110保有株および（４）に記載した方法
と同様にして導入したpEarg1保有株（特開昭60−6698
9）によるＬ−アルギニン生産試験の結果を第１表に示
す。
（６） pCarg11およびpCarg110導入株によるアルギニ
ン生産 コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC13868およびブ
レビバクテリウム・フラブムATCC14067をpCarg11および
pCarg110を用いて形質転換した。形質転換は第（４）項
と同様の方法で行った。スペクチノマイシン耐性形質転
換株から第（４）項と同様の方法でプラスミドを単離
し、各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気泳動に
よりその構造を解析したところ、形質転換株がpCarg11
あるいはpCarg110を保有することを確認した。
ン生産 コリネバクテリウム・ハーキュリスATCC13868およびブ
レビバクテリウム・フラブムATCC14067をpCarg11および
pCarg110を用いて形質転換した。形質転換は第（４）項
と同様の方法で行った。スペクチノマイシン耐性形質転
換株から第（４）項と同様の方法でプラスミドを単離
し、各種制限酵素での消化とアガロースゲル電気泳動に
よりその構造を解析したところ、形質転換株がpCarg11
あるいはpCarg110を保有することを確認した。
pCarg11、pCarg110またはpEarg1（特開昭60−66989）保
有株およびプラスミド非保有株のＬ−アルギニン生産試
験は前記（５）と同様の方法で行った。
有株およびプラスミド非保有株のＬ−アルギニン生産試
験は前記（５）と同様の方法で行った。
結果を第２表に示す。
発明の効果 本発明によれば、コリネバクテリウム属またはブレビバ
クテリウム属に属する微生物のアルギニン生合成に係わ
る酵素、特にAGK、AGPR、AOAT、OCT、大腸菌のAGSまた
はAOD欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復
させる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以
上の合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミドを
保有させることにより、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物におけるＬ−アルギ
ニンの生産性を向上させることができる。
クテリウム属に属する微生物のアルギニン生合成に係わ
る酵素、特にAGK、AGPR、AOAT、OCT、大腸菌のAGSまた
はAOD欠損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復
させる活性を有する酵素から選ばれる少なくとも１つ以
上の合成に関与する遺伝子を含む組換え体プラスミドを
保有させることにより、コリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属する微生物におけるＬ−アルギ
ニンの生産性を向上させることができる。
第１図はpCarg1およびpCarg11の制限酵素SphI、EcoRI、
BamHI、Bgl II、SalIによる切断点地図とその作製工程
を示す。図中ＥはEcoRI、SpはSphI、SaはSalI、ＢはBam
HI、BgはBgl IIによる切断点を表す。プラスミドの大き
さはキロベース（Kb）で表示されている。pCarg1および
pCarg11の太い実線部分に、コリネバクテリウム・アセ
トアシドフィラムATCC13870の染色体DNAに由来するアル
ギニン生合成酵素群の遺伝子が含まれている。
BamHI、Bgl II、SalIによる切断点地図とその作製工程
を示す。図中ＥはEcoRI、SpはSphI、SaはSalI、ＢはBam
HI、BgはBgl IIによる切断点を表す。プラスミドの大き
さはキロベース（Kb）で表示されている。pCarg1および
pCarg11の太い実線部分に、コリネバクテリウム・アセ
トアシドフィラムATCC13870の染色体DNAに由来するアル
ギニン生合成酵素群の遺伝子が含まれている。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (1)
- 【請求項１】コリネバクテリウム属またはブレビバクテ
リウム属に属する微生物由来のＮ−アセチルグルタミン
酸キナーゼ、Ｎ−アセチル−γ−グルタミルリン酸レダ
クターゼ、Ｎ−アセチルオルニチン−δ−アミノトラン
スフェラーゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラー
ゼ、大腸菌のＮ−アセチルグルタミン酸シンテターゼ欠
損変異株のアルギニン要求性を非要求性に回復させる活
性を有する酵素および大腸菌のＮ−アセチルオルニチン
デアセチラーゼ欠損変異株のアルギニン要求性を非要求
性に回復させる活性を有する酵素の合成に関与する遺伝
情報のすべてを含むDNA断片とベクターDNAとの組換え体
DNAを保有するコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属する微生物を培地に培養し、培養物中に
Ｌ−アルギニンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−アル
ギニンを採取することを特徴とするＬ−アルギニンの製
造法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61224189A JPH0728749B2 (ja) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Ｌ−アルギニンの製造法 |
| DE87113780T DE3785530T2 (de) | 1986-09-22 | 1987-09-21 | Verfahren zur Herstellung von L-Arginin. |
| KR1019870010471A KR900004425B1 (ko) | 1986-09-22 | 1987-09-21 | L-아르기닌의 제조방법 |
| EP87113780A EP0261627B1 (en) | 1986-09-22 | 1987-09-21 | Process for producing l-arginine |
| US07/099,798 US5017482A (en) | 1986-09-22 | 1987-09-22 | Process for producing L-arginine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61224189A JPH0728749B2 (ja) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Ｌ−アルギニンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6379597A JPS6379597A (ja) | 1988-04-09 |
| JPH0728749B2 true JPH0728749B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=16809916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61224189A Expired - Lifetime JPH0728749B2 (ja) | 1986-09-22 | 1986-09-22 | Ｌ−アルギニンの製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0261627B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0728749B2 (ja) |
| KR (1) | KR900004425B1 (ja) |
| DE (1) | DE3785530T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3047832U (ja) * | 1997-10-08 | 1998-04-28 | 有限会社エイ・エヌ・シー | ハンドフリー型通話装置 |
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|---|---|---|---|---|
| US5187268A (en) * | 1988-08-20 | 1993-02-16 | United States Of America | Gene encoding an anti-complement protein from vaccinia |
| US5284757A (en) * | 1989-01-12 | 1994-02-08 | Ajinomoto Company, Inc. | Process for producing l-arginine by fermentation with brevibacterium or corynebacterium |
| JP3078312B2 (ja) * | 1990-11-22 | 2000-08-21 | 協和醗酵工業株式会社 | 物質の製造法 |
| DE69126141T2 (de) * | 1991-08-26 | 1997-08-28 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur herstellung von 4-hydroxy-l-prolin |
| US5487986A (en) * | 1994-03-10 | 1996-01-30 | Genzyme Corporation | Method for increasing plasmid yield |
| US6184036B1 (en) * | 1998-07-17 | 2001-02-06 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Ornithine biosynthesis enzymes |
| JP2000197490A (ja) * | 1998-11-02 | 2000-07-18 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ―アルギニンの製造法 |
| US6255086B1 (en) | 1999-02-01 | 2001-07-03 | Ajinomoto Co., Inc. | Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing L-arginine |
| US20030124685A1 (en) | 1999-02-01 | 2003-07-03 | Yoko Kuwabara | Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing l-arginine |
| EP1057893B1 (en) * | 1999-06-03 | 2007-05-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-arginine |
| US7160705B2 (en) | 2000-04-28 | 2007-01-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine |
| RU2208640C2 (ru) * | 2000-07-06 | 2003-07-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА |
| ES2340405T3 (es) * | 2004-09-28 | 2010-06-02 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Metodo para producir l-arginina, l-ornitina o l-citrulina. |
| KR101481782B1 (ko) * | 2012-12-28 | 2015-01-13 | 대상 주식회사 | Gogat의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주 |
| KR101835935B1 (ko) * | 2014-10-13 | 2018-03-12 | 씨제이제일제당 (주) | L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조 방법 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55148093A (en) * | 1979-05-02 | 1980-11-18 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of l-arginine |
| JPS575693A (en) * | 1980-06-13 | 1982-01-12 | Ajinomoto Co Inc | Production of l-arginine through fermentation process |
| JPS5867699A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-22 | Ajinomoto Co Inc | プラスミド |
| EP0332233B1 (en) * | 1983-02-17 | 1993-10-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for preparing L-arginine |
| JPS6066989A (ja) * | 1983-09-24 | 1985-04-17 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｌ−アルギニンの製造法 |
-
1986
- 1986-09-22 JP JP61224189A patent/JPH0728749B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-09-21 EP EP87113780A patent/EP0261627B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-21 KR KR1019870010471A patent/KR900004425B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-09-21 DE DE87113780T patent/DE3785530T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-09-22 US US07/099,798 patent/US5017482A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3047832U (ja) * | 1997-10-08 | 1998-04-28 | 有限会社エイ・エヌ・シー | ハンドフリー型通話装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR880004091A (ko) | 1988-06-01 |
| EP0261627A3 (en) | 1989-10-04 |
| EP0261627A2 (en) | 1988-03-30 |
| EP0261627B1 (en) | 1993-04-21 |
| DE3785530T2 (de) | 1993-11-18 |
| JPS6379597A (ja) | 1988-04-09 |
| US5017482A (en) | 1991-05-21 |
| KR900004425B1 (ko) | 1990-06-25 |
| DE3785530D1 (de) | 1993-05-27 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |