KR900004425B1 - L-아르기닌의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

L-아르기닌의 제조방법
제 1 도는 pCarg1 및 pCargl1의 제한효소 Sph I . EcoR I . BamH I . BglII 및 SalI 절단지도 및 이들 플라스미드의 형성단계를 나타낸 것이다.
코리네박테리움, 브레비박테리움 속 등의 글루탐산-생산 코리네형 박테리아를 사용하는 L-아르기닌의　발효적 제조방법으로, 이들 속의 야생형 균주로부터 유도된 변이주를 사용하는 공지의 방법에 있다. 이들　L-아르기닌 생산 변이주의 예로는 아미노산 유사체 또는 핵산 유사체에 내성인 균주가 있으며, 이들은 임의로 핵산 염기-요구성을 가질 수 있다[Agric. Biol. Chem.,36,1675∼1684(l972). 일본국 특허공개 제37235/79호 및 일본국 특허공개 제150381/82호〕
더우기, DNA재조합 기술에 의해 형성된 균주가 L-아르기닌의 제조를 위해 사용될 수 있다는 것도 공지이다. 예를 들어, L-아르기닌은 에스케리키아 콜리로부터 유도된 아르기닌의 생합성에 관한 효소의 유전자를 함유한 DNA단편을 포함한 재조합 플라스미드 DNA를 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의　균주에 도입하고, 수득된 형질전환체를 배양함으로써 제조될 수 있다(일본국 특허공개 제66989/1985호).
최근 L-아르기닌의 필요가 증가함에 따라, 이 아미노산의 개량된 제조방법이 더욱 요구되고 있다.
DNA재조합 기술에 의해 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물의 L-아르기닌 생산성을 증가시키기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과, L-아르기닌의 생합성에 관련된 효소를 코오딩하는 에스케리키아 콜리의 유전자를 함유한 재조합 플라스미드(pEargl)을 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 균주에 도입시킴으로써 생산성이 증가될 수 있다는 것을 발견하였다(일본국 특허공개 제66989/85호). 그리고 더 연구하여, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물에서 L-아르기닌의 생합성에 관련된 효소의 군, 특히 N-아세틸 글루타메이트 키나아제(이후 AGK로 약칭한다), N-아세틸-γ-글루타밀一포스페이트 러덕타제(이후 AGPR로 약칭한다), N-아세틸 오르니틴-
Figure kpo00001
-아미노트랜스퍼라제(이후 AOAT로 약칭한다), 오르니틴 카르바밀트랜스퍼라제(이후 OCT로 약칭한다), 아르기닌 요구성을 갖는 에스케리키아 클러의 N-아세틸 클루타메이트 합성효소(이후 AGS로 약칭한다)-결핍 변이주를 비-아르기닌-요구성균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소, 및 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아콜러의 N-아세틸 오르니딘 데아세틸라제(이후 AOD로 약칭한다)-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을갖는 효소에서 선택된 적어도 하나의 효소의 합성에 관한 유전자를 함유한 재조합 폴라스미드를 코리네박테리움 또는 브레비박테러움 속의 미생물에 도입함으로써, pEargl-운반 균주에 비해 높은 L-아르기닌 생산성을 갖는 균주가 수득된다는 것을 발견하였다.
본 발명은 이러한 발견을 기초로 완성되었다.
본 발명은 AGK, AGPR, AOAT,OCT, 아르기닌 요구성을 갖는 에스케리키아 콜러의 AGS-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소, 및 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아 콜리의 아르기닌-요구성 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는　활성을 갖는 효소의 군에서 선택된 적어도 하나의 효소의 합성에 관한 유전정보를 갖는 코리네박테리웅 또는 브레비박테리움 속의 미생물로부터 유도된 DNA 단편 및 벡타 DNA로 구성된 재조합 DNA를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물을 배양 배지에서 배양하고, 배양브로스에 생성 및 축적된 L-아르기닌을 회수함을　특징으로 하는 L一아르기닌의 제조방법에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은 생물공업의 분야, 특히 약학및 식품공업 분야에서 유용한 물질인 L-아르기닌의 제조에 관한 것이다.
제 1 도는 pCarg1 및 pCargl1의 제한효소 SphI, EcoRI, BamHI, BglII 및 SalI 절단지도 및 이들 플라스미드의 형성단계를 나타낸 것이다. 여기서, E, Sp, Sa, B 및 Bg는 각각 EcoRI, SphI, SalI,BamHI 및 BglII의 절단부위를 나타낸다. 플라스미드의 크기는 킬로염기(kb)로 표시한다. 코리네박테러움 아세트애시도필룸 .ATCC 13870의 염색체 DNA로부터 유도된 아르기닌 생합성 효소를 코오딩하는 유전자는 pCarg1 및 pCarg11의 굵은 실선으로 표시된 부분에 포함된다.
본 발명은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며 하나이상의 L-아르기닌-생합성 효소에 관한 유전정보를 갖는 미생물로부터 유도된 DNA단편 및 벡타 DNA로 구성된 재조합 DNA를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물을 배양 배지에서 배양하여, 배양브로스에　 L-아르기닌을 축적하고, 그로부터 L-아르기닌을 회수함을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법을 제공한다.
L-아르기닌一생합성 효소의 합성에 관한 유전정보는 예를 들면 AGK, AGPR, AOAT,OCT, 아르기닌 요구성을 갖는 에스케리키아 콜리의 AGS-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소, 및 아르기닌 요구성을 갖는 에스케리키아 콜리의 AOD-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소중 적어도 하나의 합성에 관한 것이다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 숙주 미생물로는 글루탐산-생산 코리네형 박테리아로 공지된　어떤 균주도 사용될 수 있다. 바람직한 예는 다음과 같다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833
코리네박테리움 아세토 애시도필룸 ATCC l3870
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868
코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990
브레비박테리움 디바리카룸 ATCC 14020
브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067
브레비박테리움 이마리오필룸 ATCC 14068
브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869
브레비박테리움 리오게니탈리스 ATCC 19240
L-아르기닌 생산능을 갖지 않는 야생형 균주 이외에도, 아미노산 유사체에 내성을 갖는 균주 및 기타공지의 변이주와 같은 L-아르기닌을 생산할 수 있는 변이주가 숙주 미생물로 사용될 수 있다.
L-아르기닌의 생합성에 관한 효소를 코오딩하는 유전자의 공여 균주로는, 상응하는 효소활성을 갖는 어떤 글루탐산一생산 코리네형 박테리움도 사용될 수 있다. 예를 들면, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 야생형 균주, 및 그로부터 유도된 L-아르기닌 생산 변이주가 이용된다. 이들 균주의 염색체 DNA는　일본국 특허공개 제126789/1983호에 기재된 바와같이, 배양동안 페니실린으로 처리된 세포를 리소자임 및세균용혈용 표면활성제로 처리하고, 단백질을 공지방법에 의해 제거한 후, 에탄올 침전시킴으로써 분리될 수 있다. 염색체 DNA로부터 수득된 L-아르기닌의 생합성에 관한 효소를 코오딩하는 유전자를 함유한 DNA단편을 삽입하기 위한 벡타로는, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물에서 자동 복제할 수 있는 어떤 플라스미드도 사용될 수 있다. 이런 플라스미드의 예로는 PCGl(일본국 특허공개 제134500/82호),pCG2(일본국 특허공개 제35197/83호), pCG4 및 pCGl1(일본국 특허공개 제183799/82호), pCE51,pCE52및 pCE53[M01. Gen. Genet.,196,175(1984)] 및 pCE54 및 pCBl01(일본국 특허공개 제105999/83호)가 있다. 일본국 특허공개 제134500/82 및 186489/82호에 기재된 바와같이, 플라스미드 벡타는 세포를 리소자임및 세균용혈용 표면활성제로 처리하고, 그로부터 맑은 용혈물을 제조한 후, 폴리에틸렌클리클로 DNA를 침전시키고, 이렇게 수득된 DNA를 염화세슘/브롬화에티둠 밀도 경사 원심분리함으로써 ccc-DNA로 분리　및　정제될수있다.
아르기닌의 생합성에 관한 효소를 코오딩하는 유전자를 함유한 DNA단편 및 벡타플라스미드로 구성된 재조합 DNA는 염색체 DNA 및 벡타플라스미드 DNA를 제한효소로 절단하고, 필요하다면 절단된 말단을 말단트렌스퍼라제 및 DNA 폴리더라제로 처리한 후, 두 DNA를 DNA 리가아제의 작용에 의해 결찰시킴으로써 통상의 방법에 따라 각종 재조합 DNA와의 혼합물로 수득될 수 있다[Methods in Enzymology,68(1979) ] .
이렇게 수득된 결찰 DNA의 혼함물을 사용하여, 아르기닌의 생합성에 관한 효소가 결핍된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 변이주를 형질 전환시키고, 결핍이 보완된 형질 전환체를 선택한다. 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속 균주의 형질전환은 플로로플라스트를 사용하는 방법(일본국 특허공개 제186492/82호 및 186489/82호,특히 실시예)에 의해 수행될 수 있다. 아르기닌의 생합성에 관한 효소의 유전자를 함유한 DNA단편 및 벡타 DNA로 구성된 재조합 플라스미드는 DNA 재조합 기술에 의해 형질전환체로부터 수득될 수 있다.
또는, 상술한 바와같이 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 균주를 사용하여 재조합 DNA를 직접선택하는 계 대신에 에스케리키아 콜리의 계와 같이 DNA재조합 기술이 이미 밝혀진 숙주一벡타계를 사용할 수 있다. 즉, 에스케리키아 콜리의 벡타 DNA와 상기 유전자를 함유한 DNA단편을 결찰시킨 시험관내반응생성물을 사용하여 아르기닌의 생합성에 관한 효소의 유전자가 결핍된 에스케리키아 콜리의 변이주를 형질전환시킨다. 결핍이 보완된 형질전환체를 선택하고, 상기 유전차를 함유한 클로닝된 DAN단편을 형질전환체로부터 수득한다. 클로닝된 DNA단편을 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 벡타 DNA와 시험관내에서 재조합하고, 이렇게 수득된 재조합 DNA를 사용하여 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 균주를 형질 전환시킨다.
그러므로, 아르기닌-생합성 효소를 코오딩하는 야생형 유전자를 함유한 재조합 DNA는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 야생형 균주의 염색체 DNA를 사용함으로써 수득될 수 있다. 재조합 DNA를 형질 전환에 의해 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 적당한 균주에 도입함으로써 균주의 아르기닌 생산성을 증가시킬 수 있다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 미생물과 같은 글루탐산-생산 코리네형 박테리아에서, L-아르기닌 합성 경로에 포함된 효소의 합성이 아르기닌에 의해 억제된다는 것은 공지이다[Yoshida,H. et al.,Agric. Bio1. Chem.,43,105(1979)]. 또한 L-아르기닌 합성 경로에서 제2효소인 AGK가 아르기닌에 의한 억제를 피드백한다는 것도 공지이다[Udaka,S.,J. Bacterio1.,91,617(1966)]. 이러한 사실들은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속으로부터 클로닝된 야생형 유전자에 의해 코오딩되는 효소의 촉매반응 및합성이 아르기닌에 의해 영향받는다는 것을 나타낸다. 그러므로, 아르기닌 생산성을 더 향상시키기 위해 아르기닌에 의해 조절되지 않는 변이주 유전가를 함유한 재조합 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 아르기닌에 의해 조절되지 않는 변이주 유전자를 함유한 재조합 플라스미는, 문헌(Agric. Biol.Chem.,43,1899(1979))에 기재된 야생형 유전자의 경우와 같은 방법에 따라, L-아르기닌 유사체(예,D-아르기닌)에 대한 내성을 기준으로 선택된,L-아르기닌에 의한 억제에 민감하지 않은 AGK의 유전자를 함유한 변이균주의 염색체 DNA를 사용함으로써 수득될 수 있다. 또한, 이들 재조합 플라스미드는 문헌[M아. Gen. Genet.,145,101(1978)]에 따라 야생형 유전자를 함유한 재조합 플라스미드의 시험관내 변이유발, 또는 야생형 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 운반하는 균주의 생체내 변이유발에 의해 수득될수 있다.
이렇게 수득된 아르기닌의 생합성에 관한 야생형 또는 변이 유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 상술한 프로토플라스트를 사용한 형질전환 방법에 의해 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 균주에 도입할 수있다. 재조합 플라스미드를 운반하는 형질전환체에 의한 L-아르기닌의 생산은 발효에 의해 L-아르기닌을 제조하는 공지방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
형질 전환체를 온도, pH등을 조절하면서 호기성 조건하에 탄소원, 질소원, 무기화합물, 아미노산, 비타민 및 기타 영양물질을 함유한 통상의 배양배지에서 배양하고, 배양배지에 축적된 L-아르기닌을 회수한다.
탄소원으로는, 글루고오즈, 글리세롤, 프럭토오즈, 슈크로오즈, 말토오즈, 만노오즈, 녹말, 녹말 가수분해물 및 몰라세와 같은 각종 탄수화물 : 폴리알클 : 및 피루브산, 푸마르산, 락트산 및 아세트산과 같은 각종 유기산이 사용될 수 있다. 더우기, 사용된 균주의 동화능에 따라 탄화수소, 알콜등이 사용될 수 있다.특히 불랙스트랩 몰라세가 바람직하게 사용된다.
질소원으로는, 암모니아; 염화암모늄, 황산암모눔, 탄산암모늄 및 초산암모늄과 같은 각종 무기 및 유기암모늄염; 우레아 및 기타 질소-함유물질 : 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지대두 케이크 또는 그의 분해생성물 및 번데기 가수분해물이 사용될 수 있다.
무기 화합물로는, 인산수소 2 나트륨, 인산 2 수소칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있다. 이들이 상술한 영양물질의 성분으로 배지에 가해진다면 아미노산 및 비타민을 가할 필요는 없다.
배양은 호기적 조건하에, 예를 들면 진탕배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20∼40℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하다. L-아르기닌은 보통1∼5일동안 배양함으로써 배지에 축적된다.
배양후, 배양 브로스로부터 세포를 제거하고, 생성된 배양액을 공지방법(예,활성탄 또는 이온교환수지처리)으로 처리하여 L-아르기닌을 회수한다.
그러므로, 글루탐산-생산 코리네형 박테리아로부터 유도된 아르기닌의 생합성에 관한 효소를 코오딩하는　유전자를 함유한 재조합 플라스미드를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 균주를 사용함으로써, 이런 재조합 플라스미드를 운반하지 않는 균주를 사용하는 경우에 비해 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있다.
이런 균주의 예로는 1986년 7월 24일에 일본국 통상산업성 공업기술된 미생물 공업기술연구소(FRI)에 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰 K64(FERM BP-1114) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 K65(FERM BP-1115)가 있다. 이 균주들은 1988년 2월 11일자로 한국과학기술원에 각각 KCTC 8343P 및 KCTC 8344P의 수탁번호로 기탁되어 있다.
본 발명의 특정예는 하기의 대표적인 실시예에 의해 설명된다.
[실시예]
(1) 코리네박테리움 아세토애시도필름 ATCC 13870의 염색체 DNA의 제조
NB배지(20g/1육즙분말 및 5g/1 이스트 추출물을 함유한 배지 : pH 7.2)에서 배양된 코리네박테리움 아세토애시도필름 ATCC 13870의 종배양액 (10ml)을 400m1의 반합성 배지 SSM[20g/l 글루코오즈,10g기(NH4)2SO4,3g/l 우레아,lg/l 이스트추출물,lg/1 KH2PO4,0.4g/1 MgCl2·6H2O,10mg/1 FeSO4·7H2O,0.2mg/1 MeSO4·4-6H2O,0.9mg/l ZnSO4·7H2O,0.4mg/1 CuSO4·5H2O,0.09mg/1 Na2B4O7·10H2O,0.04mg/1 (NH4)6MO7O24·4H2O·30μg/1 비오틴 및 1mg/l 티아민 히드로클로라이드로 구성된 배지 : pH 7.2〕에 접종시키고, 30℃에서 진탕 배양한다.660nm에서의 광학밀도(OD; 이후 광학밀도는 특멸한 언급이없는한 660nm에서 측정한다)를 도꾜코덴칼로리메타로 측정하고,OD가 0.2에 이르렀을때, 페닐실린 G를.0.5단위/ml농도로 가한다.OD가 0.6이 될때까지 계속 배양한다.
성장된 세포를 배양브로스로부터 수거하여 TES완층용액[0.03M 트리스(히도록시메틸) 아미노메탄(이후트리스로 약칭한다),0.005M 디소듐 에틸렌디아민 테트라아세테이트(이후 EDTA로 약칭한다) 및 0.05MNaCl : pH 8.0〕으로 세척한다. 세척된 세포를 10m1의 리소자임 용액(25% 슈크로오즈,0.1M NaC1,0.05M 트리스 및 0.8mg/m1·리소자임 : pH 8.0)에 현탁시키고,37℃에서 4시간동안 반응시킨다. 수거된 세포로부터 사이또 등의 방법[Biochem. Biophys. Acta,72,619(1963)]에 따라 고분자 염색체 DNA를 분리한다.
(2) 에스케리키아 콜리의 제한-결핍 및 아르기닌-요구성 변이주의 제조.
에스케리키아 콜리 숙주-벡타계에 외부 유전자인 글루탐산-생산 코리네형 박테리아로부터 유도된 아르기닌의 생합성에 관한 효소의 유전자 클로닝을 용이하게 하기 위해, 에스케리키아 콜리의 제한-결핍 및 아르기닌-요구성 변이주를 상술한 바와같이 수득하여 숙주세포로 사용한다.
숙주-특이성 제한-결핍 변이성을 운반하는 에스케리키아 콜리 Kl2 WA802(메티오닌-요구성 : FERMBP-718) 를 공지 방법 [Experiment in MoIecular Genetics, P.125, Coldspring Harbor Laboratory(1972) ]에　따라400γ/mlN-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니단(NTG)을사용하여 변이를 일으키고, 페니실린을 사용하는 영양 요구 변이주 농축방법[Experiment in Molecular Gentics,P.230,Coldspring HarborLaboratory(1972)]에 따라 아르기닌-요구성 균주를 선택한다. 이들 아르기닌-요구성 균주의 변이 유전자는, AGS의 경우는 Eur. J. Biochem.,31,290(1972)에 설명된 방법, 및 AGK 및 AOD의 경우는 J.Gen. Microbio1.,69,365(1971)에 설명된 방법에 따라 아르기닌의 생합성에 관한 각 효소의 활성을 측정함으로써 확인된다. 그 결과, EA-1은 AGS-결핍 변이주로 수득되고, EA21은 AGK-결핍 변이주로 수득되며, EA-4는 AOD-결핍 변이주로 수득된다.
(3) 아르기닌 생합성에 관한 유전자를 함유한 DNA단편의 클로닝.
에스케리키아 콜리의 숙주-벡타계를 사용함으로써 클로닝을 수행한다. 다까라슈조사에서 시판하고 있는 pBR322(암피실린 및 테트라시클린에 내성)를 벡타로 사용한다.10단위의 제한효소 SphI(베링거만하임GmbH의 제품)을 pBR322플라스미드 DNA 및 상기(1)에서 제조된 코리네박테리움 아세토애시도 필름ATCC 13870의 염색체 DNA 3μg을 함유한 SphI용 반응용액(6mM 트리스,125mM NaC1,6mM MgCl2,6mM β-메르캅트 에탄올 및 0.01% 트리톤 X-100 : pH7.5)200μ1에 가하고, 혼합물을 37℃에서 60분간반응시킨후,65℃에서 30분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 생성된 반응혼합물에,10배 농도의 T4 리가아제 완충용액(660mM 트리스,66mM MgC12및 100mM 디티오트레이롤,pH7.6)40μ1,4μ1의 100mM ATP,160μ1의 물 및 300단위의 T4 리가아제(다까라 슈조사제품)을 가하고, 혼합물을 12℃에서 16시간동안 반응시킨다. 이 반응 혼합물을 상기(2)에서 제조된 에스케리키아콜리 EA-21(아르기닌-및 메티오닌-요구성)의 형질전환에 사용한다. EA-21 균주의 적합세포는 다가트 등의 방법[Gene.,6,23(1979)]에 따라 제조된다..
즉, EA-2l 균주를 50ml의 L배지(10g/1 박토-트립톤,5g/1 이스트 추출물,lg/1 글루코오즈 및 5g/1NaC1 : pH 7.2)에서 접종시키고,OD가 0.5가 될때까지 37℃에서 배양한다. 배양 브로스를 얼음에서 10분동안 냉각시키고, 원심분리에 의해 수거된 세포를 20m1의 냉각된 0.lM CaC12용액에 현탁시키고, 현탁액을 0℃에서 20분간 방치한다. 원심분리에 의해 세포를 다시 수거하고,0.5m1의 0.lM CaC12에 재현탁시킨후, 현탁액을 0℃에서 18시간동안 방치한다. 150μI의 이 CaC12-처리 세포현탁액에 상기에서 수득된 리가아제 반응혼합물 50μ1를 가하고, 생성된 혼합물을 0℃에서 10분동안 방치한 후,37℃에서 5분동안 가열한다. 2m1의 L배지를 가하고,　37℃에서 2시간동안 진탕배양을 수행한다. 생성된 배양액을 원심분리에 의해 생리식염수로 2번 세척하고, 세포를 30μg/m1메티오닌 및 50μg/ml암피실린을 함유한 데이비스 최소 한천평판배지[2g/1 글루코오즈,lg/1 (NH)2SO4,7g/1 K2HPO4,2g/l KH2PO4,0.1g/1 MgSO4·7H2O,0.5g/1 트리소둠시트레이트,4mg/I 티아민 히드로클로라이드 및 16g/1 한천 : pH 7.2〕에 펴고30℃에서　４시간동안배양한다．이렇게 성장된 형질전환체의 배양세포로부터 앤 등의 방법[J. Bacteriol.,140,400(1979)]에 의해 플라스미드를 분리한다.
각종 제한효소로 분해하고 아가로즈겔 전기영동에 의해 분석하면, 이 형질 전환체중 하나로 부터 수득된 플라스미드 pCarg1이 7kb의 SphI DNA단편이 pBR322의 단일 SphI 절단부위에 삽입된 구조를 갖는다는 것이 나타난다.
EA-21 균주를 상기와 같은 방법에 따라 pCarg1으로 형질전환시켜 암피실린 내성을 기준으로 선택된 변이주는 아르기닌 요구성을 갖지 않으며, 그로부터 분리된 플라스미드는 pCarg1과 같은 구조를 갖는다는 것이 확인된다. 이것은 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아 콜리의 AGK-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소의 합성에 관한 코리네박테리움·아세토애시도필룸 ATCC 13870의유전자가 pCarg1에 클로닝된다는 것을 나타낸다.
또한, 상기 (2)에서 제조된 에스케리키아 콜리 K12균주로부터 유도된 AGS-결핍 변이 균주 EA-1 및AOD-결핍 변이 균주 EA-4 (이둘은 이르기닌-및 메리오닌 요구성이다)을 상기과 같은 방법으로pCarg1으로 형질 전환시키고, 암피실린 내성을 기준으로 선택함으로써 수득된 변이주는 아르기닌 요구성을 갖지 않는다는 것이 확인된다. 이것은 pCargl이 아르기닌 요구성을 갖는 에스케러키아콜리의 AGS-결핍변이주 및 AOD-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소를 코오딩하는유전자를 함유한다는 것을 나타낸다.
pCarg1을 운반하는 WA802균주 및 pCatg1을 운반하지 않는 WA802 균주를 각각 비움 베르그등의 방법[J. Gen. Microbill.,69,365(197l)], 보겔등의 방법[Methods in Enzymology,17(part A),255(1970)], 보겔등의 방법 [Methods in Enzymology,17(part A), 260(1970)] 및 프레스코트등의 방법[Anal, Biochem.,32,408(1969)]에 따라 AGK활성, AGPR활성, AOAT활성 및 OCT활성 시험한다.pCarg1을 운반하는 WA802 균주는 각각의 효소활성보다 3배 더 높은 활성을 나타내며, 이것은 pCarg1이AGK, AGPR, AOAT 및 OCT를 코오딩하는 유전자를 함유한다는 것을 나타낸다.
상기에서 수득된 결과로 부터, pCarglol AGK, AGPR, AOAT,.OCT 및 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아 콜리의 AGS-결핍 변이주 및 AOD-결핍 변이주를 비-아르기닌-요구성 균주로 전환시키는활성을 갖는 효소를 코오딩하는 코리네박테리움 아세토애시도필룸 ATCC 13870으로 부터 유도된 유전자를운반한다는 것이 명백하다.
(4) 플라스미드 pCargl1의 제조
상기에서 수득된 pCarg1을 글루탐산-생산 코리네형박테리아에서 복제할 수 있는 벡타-플라스미드pCGl1과 재조합함으로써 에스케리키아 콜리 및 글루탐산-생산 코리네형박테리아 모두에서 복제할 수 있는셔틀 벡타 pCargl1을 제조한다.
pCGl1은 코리네박테리움 및 브레비박테리움의 미생물에서 복제할 수 있으며, 스트렙도마이신-스펙티노마이신 내성 유전자를 운반하는 플라스미드 벡타이다. pCargl1은 하기의 방법으로 형성된다.
일본국 특허공개 제134500/82호에 기재된 방법에 따라 pCG11을 운반하는 코리네박테리움 글루타미쿰ATCC 31833으로 부터 pCGl1을 분리한다.2μg의 pCGll DNA를 함유한 제한효소 BglII용 반응용액(10mM 트리스,100mM NaCl 및 10mM MgCl2: pH7.5) 100μl에 6단위의 BglII(다까라슈조사제품)를 가하고, 혼합물을 371℃에서 2시간동안 반응시킨 후,65℃에서 30분간 가열하여 반응을 중단한다. 한편,6단위의제한효소 BamHI(다까라슈조사 제품)을 2μg의 pCargl　DNA를 함유한 BamHI용 반응용액(10mM 트리스,100mM NaC1 및 l0mM MgCl2: pH7.5) 100μ1에 가한후, 혼합물을 37℃에서 2시간동안 반응시키고,65℃에서 30분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 상기의 두 분해반응 혼합물을 함께 혼합하고,10배 농도의　T4리가아제 완층용액 40μ1,4μ1의 100mM ATP,150μ1의 물 및 300단위의 T4리가아제(다가라슈조사 제품)를 가한다. 혼합물을 12℃에서 16시간동안 반응시킨다. 이 리가아제 반응 혼합물을 사용하여 상기 (3)과같은 방법으로 에스케리키아 클리 EA-21의 형질전환을 수행하고, 형성된 형질 전환체를 30μg/m1 메티오닌 및 1OOμg/m1 스펙티노마이신을 함유한 데이비스 최소 한천 평판배지에 펴바른다. 이 평판 배지에서 성장된 스펙티노 마이신내성 및 비-아르기닌 요구성 형질전환체로 부터 앤등의 방법[J. Bacterio1.,140,400(1979)]에 따라 플라스미드 DNA를 분리한다. 각종 제한효소로 분해 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해분석하면, 이 플라스미드는 pCGl1및 pCarg1이 전자의 만일 BglII 절단부위 및 후자의 단일 BamHI 절단부위에 결찰된 구조를 갖는다는 것을 알수 있다(제 1 도 참고)　이 플라스미드를 pCarg11이라고 한다.
모두 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 균주인 상기에서 수득된 EA-1, EA-21 및 EA-4 균주를pCargll로 형질 전환시킨다. 수득된 스펙티노 마이신에 대한 내성을 갖는 형질 전환체도 비-아르기닌 요구성을 갖는다는 것이 발견된다.
pCargll을 운반하는 균주 및 pCargl1을 운반하지 않는 균주를 상기 (3)과 같은 방법에 따라 AGK, AGPR, AOAT 및 OCT활성 시험한다. 이러한 사실물을 pCargl1이 AGK, AGPR, AOAT,OCT 및 아르기닌 요구성을 갖는 에스케리키아 콜리의 AGS-결핍 변이주 및 AOD 결핍 변이주를 비―아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소를 코오딩하는 유전자를 함유한다는 것을 나타낸다.
PCra911을 사용하여 일본국 특허공개 제186492/82 및 186489/82호에 기재된 방법에 따라 코리네박테리움글루타미쿰 ATCC 31833을 형질 전환시킨다. ATCC 31833균주의 세포를 NB 배지에서 배양하고, 수득된　종 배양액 0.4m1를 40m1의 SSM 배지에 접종시킨후,30℃에서 진탕 배양한다.OD가 0.15에 이르렀을때,페니실린 G를 0.5단위/m1의 최종농도로 가한다. 배양을 더 계속하고,OD가 약 0.6에 이르렀을때 성장된　세포를 수거한다. 수거된 세포를 1mg/m1리소자임을 함유한 5m1의 RCGP 배지 5g/1 글루코오즈, 5g/I카스아미노산, 2.5g/1이스트추출물, 3.5g/1 K2HPO4,1.5g/l KH2PO4,0.41g/1 MgCl2·6H2O,10mg／１FeSO4·7H2O, 2mg/l MnSO4·4-6H2O, 0.9mg/l ZnSO4·7H2O, 0.04mg/1 (NH4)6MO7O24·4H2O, 30μg/1 비오틴,2mg/l 티아민 히드로클로라이드,135g/1 디소듐 숙시네이트 및 30g/1폴리비닐피롤리돈(M.W : 10,000) : pH7.６〕에 약 109세포/m1가 되도록 현탁시키고, 현탁액을 L-튜브에 옮겨 30℃에서 1시간동안 서서히 진탕 배양하여 플로토플라스트를 만든다. 플로트플라스트 현탁액(0.5ml)를 작은 시험관에 넣고,2,500×g에서 5분동안 원심 분리하여 플로토플라스트를 분리한다. 플로토플라스트를 1m1의 TSMC 완충용액(10mM MgC12,30mM CaCｌ2,50mM 트리스 및 400mM 슈크로오즈 : pH7.5)에 현탁시키고, 원심분리에 의해 세척한후, 세척된 세포를 0.lml의 TSMC 완충용액에 재현탁시킨다. 2배 농도의 TSMC 완충용액과 pCargl1 플라스미드 DNA 용액의 1 : 1혼합물 100μI를 현탁액에 가하고,20%폴리에틸렌글리콜(PEG)6000 (나까라이 케미칼 제품)을 함유한 TSMC 완충용액 1.0m1를 더 가한다.3분후, 생성 혼합물을　2,500×g에서 5분동안 원심 분리하여 상층액을 제거한다. 침전된 플로트플라스트를 1m1의 RCGP배지(pH7.4)에 현탁시키고, 현탁액을 30℃에서 2시간 동안 서서히 진탕한다. 이 플로토 플라스트 현탁액(0.3ml)를 400μg/m1 스펙티노 마이신을 함유한 TCGP 한천배지(1.6% 한천을 함유한 RCGP 배지, pH7.4)에넓게 펴고,30℃에서 8일동안 배양한다.
이렇게 성장된 스펙티노 마이신-내성 형질전환체를 400m1의 SSM 배지에서 진탕 배양한다.OD가 0.15가 되었을때, 페니실린 G를 0.5단위/mｌ의 최종농도로 가하고,OD가 0.65가 될때까지 진탕 배양을 계속한다. 배양 브로스로 부터 수거된 세포를 TES 완충용액으로 세척하고,　10m1의 리소자임 용액에 현탁시킨후,　37℃에서 4시간동안 반응시킨다. 반응 혼합물에 2.4mI의 5M NaC1,0.6m1의 0.5M EDTA(pH8.0) 및 4%소듐 라우릴 설페이트 및 0.7M NaC1을 함유한 용액 4.4m1를 계속해서 가하고, 생성된 혼합물을 서서히교반한 후, 얼음에 15시간동안 방치한다. 세포 분해물을 전부 원심분리 튜브에 이동하고,　69,400g에서 4t℃ 60분간 원심 분리하여 상층액을 회수한다. 10중량%에 상응하는 량의 PEG 6000(나까라이 케미칼 제품)을 상층액에 가하고, 혼합물을 서서히 교반한후, 얼음에 방치한다. 10시간후,　1,500×g에서 10분동안 원심분리함으로써 펠릿을 회수하고, 5mｌ의 TES 완충용액에 서서히 재용해시킨다.　2.0ml의 1.5mg/m1 브롬화에티듐 용액을 가하고, 염화세슘을 더 가한후, 용액의 밀도가 1.580으로 조절되도록 서서히 용해시킨다. 수득된 용액을 105,000×g에서 18℃로 48시간동안 초원심 분리하고, UV 조사하에 원심분리 튜브의 하부에　고밀도레벨의 밴드로서 닫혀진 고리형 DNA가 검출된다. 이 밴드를 주사기에 의해 원심분리 튜브의 옆에서회수함으로써, 플라스미드를 분리한다. 수득된 분획을 같은 부피의 이소프로필알클 용액(포화량의 염화세슘을 더 함유한 이소프로필 알콜과 TES 완충용액의 9 : 1부피 혼합물)으로 5번 처리하여 추출에 의해 브롬화에티듐을 제거하고, 처리된 응액을 TES완충용액에 투석시켜 플라스미드 DNA를 수득한다.
각종 제한 효소로 분해 및 아가로즈 겔 전기영동 분석하면, 이 플라스미드는 제한 효소 절단패턴을 특징으로 하는 pCargl1과 같은 구조를 갖는다는 것이 나타난다.
코리네박테리움 속의 미생물에서 pCargl1에 포함된 유전자의 형질발현은 하기의 방법에 의해 AGK 및AOAT 유전자에 의해 확인된다.
pCargl1을 운반하는 코리네박테리움 글루라미쿰 ATCC 31833균주 및 pCargl1을 운반하지 않는 ATCC31833균주에서 AGK 및 AOAT 유전자의 형질 발현 정도를 비교하기 위해, 하기에 설명하는 바와같이 두　균주로부터 조효소 추출물을.제조한다. 즉, 종배양액(각 균주당 10ml)을 300m1의 SSM배지(100μg/ml 스펙티노마이신을 pCar911」운반균주용 배지에만 가한다)에 접종시키고,OD가 약 3이 될때까지 30℃에서 진탕 배양한다. 배양 브로스로 부터 수거된 세포를 완충용액 A(10mM 트리스 및 1mM 디티오트레이톨 : pH7.2)로 세척하고,10m1의 완충용액A에 현탁시킨다. 현탁액을 소니케이터(TOMY 세이꼬사 : 강도범위 : 7)에서 20분간, 초음파 처리하여 현탁액중의 세포를 파쇄하고, 파쇄된 세포 현탁액을 16,000rpm에서40분간 원심 분리한다(RPR20-2 로우터; 히다찌사). 상충액을 회수하고,　4℃에서 6시간 동안 11의 완충용액 A에 2번 투석하여 저분자물질을 제거한다.
이렇게 수득된 조효소 추출물을 바움버그등의 방법[J. Gen. Microbio1.,69,365(1971)]에 따라 AGK활성검사 및 보겔 등의 방법[Methods in Enzymology,17(Part A),260(1９70)]에 따라 AOAT 활성검사를 수행한다. pCargl1을 운반하는 ATCC 31833균주로부터 수득된 효소 추출물은 pCargl1을 운반하지 않는 ATCC 31833균주로부터 수득된 효소 추출물에　비해 AGK의 경우 30배 및 AOAT의 경우 10배 더 높은활성을 나타낸다· 이 사실은 pCargl1 중의 유전자가 글루탐산-생산 코리네형 박테리아에서 형질발현될수있다는 것을 나타낸다.
이렇게 수득된 pCargl1-운반 형질전환체는 코리네박테러움. 글루타미쿰 K64(FERM BP-1114)로 RTI에 기탁되어있다.　또한 이 형질 전환체는 1988년 2월 11일자로 한국과학기술원에 KCTC 8343P의 수탁번호로 기탁되어 있다.
(5) 숙주 미생물의 아르기닌 생산성을 증가 시킬 수 있는 변이 플라스미드의 제조.
하술하는 바와같이 pCargll DNA를 히도록실아민으로 직접 처리 [Mｏｌ. Gen. Genet.,145,101(1978)]함으로써, 숙주 미생물의 L-아르기닌 생산성을 증가 시킬 수 있는 변이 플라스미드를 제조한다.
상기(4)에 설명된 방법에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰 K64(FERM BP-1114, KCTC 8343P)로 부터 pCargl1을 분리한다. pCargl1(2μg)을 300μ1의 변이 유발용액(50mM NaH2PO4,400mM 히도록실아민히드로클로라이드 및 0.5mM EDTA : pH6.0)에 가하고, 혼합물을 75℃에서 60분간 반응 시킨 후, TES완충용액에 투석시킨다. 이렇게 수득된 투석물(100μ1)을 사용하여 상기(4)와 같은 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3l833을 형질전환 시키고, 수득된 스펙티노 마이신 내성균주에 대해 하기와 같이 아르기닌 생산성을 시험한다. NB 배지에서 30℃로 24시간동안 배양함으로써 수득된. 종배양액(0.5ml)를 시험관내의 생산배지[80g/1 불랙스트랩몰라세(글루코오즈로 전환),40g/l (NH4)2SO4,0.5g/I K2HPO4,0.5g／ＩKH2PO4및 20g/1 CaCO3: PH7.０〕5ml에 접종시키고,30℃에서 72시간동안 진탕배양한다. 배양후, 배양여과액을 종이 크로마토그래피하고, 생산된 L-아르기닌의 양을 닌히드린색 전개를 사용한 칼로리메트리에의해 측정한다. L-아르기닌 생산성을 현저하게 증가시키는 pCargl1을 운반하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833균주를 선택한다. 이들 균주로 부터 상기(4)와 같은 방법으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 각종 제한효소분해 및 아가로즈겔 전기영동에 의해 구조를 분석한다. 이를 플라스미드는 pCargl1과 같은 제한효소 절단지도를 갖는다는 것이 발견된다. 높은 L-아르기닌 생산성을 갖는 균주로 부터 분리된 플라스미드는 PCarg110이라고 한다. pCargll0을 운반하는 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 K65(FERMBP-1115)로 FRI에 기탁되어 있다. 또한 이 균주는 1９88년 2월 11일자로 한국과학 기술원에 KCTC8344P의 수탁번호로 기탁되어 있다.
제 1 도는 pCarg1 및 pCargl1의 형성 단계를 나타낸 것이다. 표1은 pCarggll 또는 pCargl10을 운반하는 균주, 및 상기(4)와 같은 방법으로 제조된 pEargl(일본국 특허공개 제66989/85호)을 운반하는 균주에대한 L-아르기닌 생산성 시험 결과를 나타낸다.
[표 1]
Figure kpo00002
(6) pCargl1 또는 pCargl10을 운반하는 균주에 의한 L-아르기닌의 생산
상기(4)와 같은 방법으로 pCargl1 및 pCargl10을 사용하여 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868 및브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067을 형질 전환시킨다. 수득된 스펙티노마이신-내성 형질 전환체로 부터(4)와 같운 방법으로 플라스미드를 분리하고, 각종 제한효소분해 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해 그의 구조를 분석한다. 이들 형질전환체는 pCargl1 또는 pCargl10를 운반한다는 것이 확인된다.
pCargl1, pCargl10 또는 pCargl (일본국 특허공개 제66989/85호)를 운반하는 균주 및 이들 플라스미드중 어느 하나도 운반하지 않는 균주를 사용하여 (5)와 같은 방법으로 L-아르기닌 생산 시험을 수행한다.
결과는 표2에 나타낸다.
[표 2]
Figure kpo00003

Claims (4)

  1. 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며 하나 이상의 L-아르기닌-생합성 효소의 합성에　관한 유전정보를 갖는 미생물로부터 유도된 DNA단편 및 벡타 DNA로 구성된 재조합 DNA를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테러움 속의 미생물을 배양배지에서 배양하여 배양브로스에 L-아르기닌을 축적하고, 그로부터 L-아르기닌을 회수함을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 유전정보가 N-아세틸 글루타메이트 키니아제, N-아세틸-γ-글루타밀포스페이트리 덕타제, N-아세틸오르니틴-δ-아미노트랜스퍼 라제, 오르니 틴 카르바밀 트렌스퍼 라제, 아르기 닌 요구성을 갖는 에스케러키아콜리의 N-아세틸글루타메이트 합성효소 결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소, 및 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아콜리의 N-아세틸오르니틴데아세틸라제-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소의 군에서 선택된 적어도 하나의 효소의 합성에 관한 정보인 L-아르기닌의 제조방법. .
  3. 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며, N-아세틸 글루타메이트 키나아제, N-아세틸-γ-글루타밀-포스페 이트 리 덕타제, N-아세 틸오르니틴-δ-아미노트렌스퍼라제, 오르니틴 카르바밀 트랜스퍼라제, 아르기닌-요구성을 갖는 에스케러키아콜리의 N-아세틸 글루타메이트 합성효소-결핍 변이주를비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소, 및 아르기닌 요구성을 갖는 에스케리키아콜리의N-아세틸오르니틴데아세틸라제-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성균주로 전환시키는 활성을 갖는 효소의 군에서 선택된 적어도 하나의 효소의 합성에 관한 유전정보를 갖는 미생물로 부터 유도된 DNA단편 및　벡타 DNA로 구성된 재조합 DNA.
  4. 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며, N-아세틸 글루타메이트 키나아제, N-아세틸-γ-글루타밀 포스페이트리덕타제, N-아세틸오르니틴-δ-아미노　트렌스퍼라제, 오르니틴카르바밀　트렌스퍼라제, 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아콜리의 N-아세틸 글루타메이트 합성효소-결핍 변이주를　비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는　효소, 및 아르기닌-요구성을 갖는 에스케리키아콜리의 N-아세틸오르니틴 데아세틸라제-결핍 변이주를 비-아르기닌 요구성 균주로 전환시키는 활성을 갖는효소의 군에서 선택된 하나이상의 효소의 합성에 관한 유전 정보를 갖는 미생물로 부터 유도된 DNA단편　및 벡타DNA로 구성된 제조합 DNA를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101481782B1 (ko) * 2012-12-28 2015-01-13 대상 주식회사 Gogat의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주
US10626426B2 (en) 2014-10-13 2020-04-21 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism of genus Corynebacterium having an ability to produce L-arginine and a method for producing L-arginine using the same

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5187268A (en) * 1988-08-20 1993-02-16 United States Of America Gene encoding an anti-complement protein from vaccinia
US5284757A (en) * 1989-01-12 1994-02-08 Ajinomoto Company, Inc. Process for producing l-arginine by fermentation with brevibacterium or corynebacterium
JP3078312B2 (ja) * 1990-11-22 2000-08-21 協和醗酵工業株式会社 物質の製造法
DE69126141T2 (de) * 1991-08-26 1997-08-28 Kyowa Hakko Kogyo Kk Verfahren zur herstellung von 4-hydroxy-l-prolin
US5487986A (en) * 1994-03-10 1996-01-30 Genzyme Corporation Method for increasing plasmid yield
JP3047832U (ja) * 1997-10-08 1998-04-28 有限会社エイ・エヌ・シー ハンドフリー型通話装置
US6242256B1 (en) * 1998-07-17 2001-06-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Ornithine biosynthesis enzymes
JP2000197490A (ja) * 1998-11-02 2000-07-18 Ajinomoto Co Inc Ｌ―アルギニンの製造法
US6255086B1 (en) 1999-02-01 2001-07-03 Ajinomoto Co., Inc. Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing L-arginine
US20030124685A1 (en) * 1999-02-01 2003-07-03 Yoko Kuwabara Carbamoyl-phosphate synthetase gene of coryneform bacteria and method for producing l-arginine
DE60034843T2 (de) * 1999-06-03 2008-01-17 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zur Herstellung von L-arginin
US7160705B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
RU2208640C2 (ru) * 2000-07-06 2003-07-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА, ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА
BRPI0516176B1 (pt) 2004-09-28 2020-12-29 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Polipeptídeo, dna, microorganismo, e, processo para produzir l-arginina, l-ornitina ou lcitrulina

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55148093A (en) * 1979-05-02 1980-11-18 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-arginine
JPS575693A (en) * 1980-06-13 1982-01-12 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation process
JPS5867699A (ja) * 1981-10-16 1983-04-22 Ajinomoto Co Inc プラスミド
JPS6066989A (ja) * 1983-09-24 1985-04-17 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Ｌ−アルギニンの製造法
EP0332234B1 (en) * 1983-02-17 1993-07-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for preparing l-tyrosine

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101481782B1 (ko) * 2012-12-28 2015-01-13 대상 주식회사 Gogat의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주
US10626426B2 (en) 2014-10-13 2020-04-21 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism of genus Corynebacterium having an ability to produce L-arginine and a method for producing L-arginine using the same

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Publication number Publication date
US5017482A (en) 1991-05-21
JPS6379597A (ja) 1988-04-09
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DE3785530D1 (de) 1993-05-27
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JPH0728749B2 (ja) 1995-04-05

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