BRPI0516176B1 - Polipeptídeo, dna, microorganismo, e, processo para produzir l-arginina, l-ornitina ou lcitrulina - Google Patents

Abstract

POLIPEPTÍDEO, DNA, MICROORGANISMO, E, PROCESSO PARA PRODUZIR L-ARGININA, L-ORNITINA OU L- CITRULINA Pretende-se fornecer um polipeptídeo tendo (i) uma seqüência de aminoácidos derivada da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 por substituição de um ou mais aminoácidos nas seqüências de aminoácidos das posições 20 e 38 a partir do término N, ou (ii) uma seqüência de aminoácidos derivada da seqüência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 por substituição de um ou mais aminoácidos nas seqüências de aminoácidos das posições 20 e 38 a partir do término N e deleção, substituição ou adição de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos das posições 1 a 19 ou das posições 39 a 294, e tendo uma atividade de N-acetilglutamato quinase.

Description

Campo técnico

[0001] A presente invenção se refere a um processo para produzir L- arginina, L-ornitina, ou L-citrulina.

Fundamento da Técnica

[0002] Em microorganismos, L-arginina é biossintetizada a partir de ácido L-glutâmico através de oito etapas de reação. L-ornitina e L-citrulina são intermediários na via biossintética de L-arginina. Biossíntese de L- arginina, L-ornitina e L-citrulina são reguladas similarmente àquelas de outros aminoácidos.

[0003] Em bactérias corineformes, por exemplo, transcrição de um operon composto de genes codificando enzimas responsáveis por biossíntese de L-arginina (daqui por diante abreviado como operon de arginina) é reprimida pelo repressor de arginina (daqui por diante referido com ArgR) (veja publicação de patente No. 1). É conhecido que em bactérias corineformes N-acetilglutamato quinase, que é a segunda enzima na via biossintética de ácido L-glutâmico para L-arginina (EC: 2. 7. 2. 8 daqui por diante algumas vezes abreviado como ArgR), é sujeita a inibição por retroalimentação por L-arginina (veja publicação de não patente No. 2).

[0004] L-Arginina, L-ornitina e L-citrulina são produzidas usando microorganismos assim como outros aminoácidos, e estudos foram conduzidos, como no caso de outros aminoácidos, para realçar a produtividade destes aminoácidos pelo uso de meios tal como mutação ou técnicas de DNA recombinante.

[0005] Por exemplo, existe um relato que Corynebacterium glutamicum K65 (FERM BP-1115) tendo produtividade de arginina realçada foi obtida transformando Corynebacterium glutamicum com um fragmento de DNA contendo um gene responsável por biossíntese de L-arginina e depois realizando mutagênese (veja publicação de patente No. 2).

[0006] Corynebacterium glutamicum caracterizada pelo fato de que a repressão de enzimas biossintéticas de arginina é cancelada (veja publicação de não patente No. 1) e Corynebacterium glutamicum caracterizada pelo fato de que a repressão de enzimas biossintéticas de arginina é cancelada, inibição por retroalimentação por L-arginina é dessensibilizada e permeabilidade de membrana de L-arginina é realçada (veja publicação de não patente No. 3) também foram obtidas por mutagênese.

[0007] Bactérias corineformes nas quais DNA codificando ArgR é destruído (veja publicação de patente No. 1). foram obtidas por técnicas de DNA recombinante.

[0008] Entretanto, não houve nenhum relato até agora sobre que mutação deveria ser introduzida em DNA codificando ArgB ou ArgR para obter uma linhagem na qual mutações são introduzidas em ambos os DNAs codificando respectivamente ArgB e ArgR e que tem produtividade de L- arginina realçada.

[0009] Publicação de patente No. 1:

[00010] Pedido de Patente Japonesa Não Examinado Publicado No. 51790/02

[00011] Publicação de patente No. 2:

[00012] Pedido de Patente Japonesa Não Examinado Publicado No. 79597/88

[00013] Publicação de não patente No. 1:

[00014] Agricultural & Biological Chemistry, vol. 43, p. 105-111 (1979)

[00015] Publicação de não patente No. 2:

[00016] Journal of Bacteriology, vol. 91, p. 617 (1966)

[00017] Publicação de não patente No. 3:

[00018] Agricultural & Biological Chemistry, vol. 36, p. 1675-1684 (1972)

Descrição da Invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

[00019] Um objeto da presente invenção é fornecer um processo eficiente para produzir L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina.

Meios para Solucionar os Problemas

[00020] A presente invenção se refere aos seguintes (1) a (18). (1) Um polipeptídeo que tem: (1) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos na região em posições 20 a 38 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1; ou (ii) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos na região em posições 20 a 38 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 e um ou mais resíduos de aminoácidos são deletados, substituídos ou adicionados na região em posições 1 a 19 ou 39 a 294; e que tem atividade de N-acetilglutamato quinase. (2) Um polipeptídeo que tem: (1) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos na região em posições 26 a 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1; ou (ii) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos na região em posições 26 a 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 e um ou mais resíduos de aminoácidos são deletados, substituídos ou adicionados na região em posições 1 a 25 ou 32 a 294; e que tem atividade de N-acetilglutamato quinase. (3) Um polipeptídeo que tem: (i) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido na posição 26 ou 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituído; (ii) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que os resíduos de aminoácidos nas posições 26 e 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 são substituídos; ou (iii) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos outros do que aqueles nas posições substituídas são deletados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos do (i) ou (ii) acima; e que tem atividade de N-acetilglutamato quinase. (4) Um polipeptídeo que tem: (i) uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo das sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9 e 11; (ii) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos outros do que resíduo 26 são deletados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo das sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOS: 3, 5 e 7; (iii) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos outros do que resíduo 31 são deletados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 9; ou (iv) uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos outros do que resíduos 26 e 31 são deletados, substituídos ou adicionados na sequência de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 11; e que tem atividade de N-acetilglutamato quinase. (5) Um DNA codificando o polipeptídeo de acordo com qualquer um dos (1) a (4) acima. (6) Um DNA tendo uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 e 12. (7) Um DNA que hibridiza com DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de DNA codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, que é selecionado a partir do grupo consistindo dos seguintes (i) a (iii): (1) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo na posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um resíduo de aminoácido outro do que L-alanina; (11) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo na posição 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um resíduo de aminoácido outro do que L-metionina; (111) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo na posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um resíduo de aminoácido outro do que L-alanina e o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo na posição 31 é um resíduo de aminoácido outro do que L-metionina, e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de N-acetilglutamato quinase. (112) O DNA de acordo com o (7) acima, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo na posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é L-valina, L-leucina ou L-isoleucina e o resíduo de aminoácido correspondente ao resíduo na posição 31 é L-valina. (113) Um DNA que hibridiza com DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de DNA codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, que é selecionado a partir do grupo consistindo dos seguintes (i) a (iii): (i) DNA tendo uma sequência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de que a região correspondente à região nas posições 76 a 78 a partir da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina ou adenina-timidina- citosina; (ii) DNA tendo uma sequência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de que a região correspondente à região nas posições 91 a 93 a partir da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é guanina-timidina-guanina; e (iii) DNA tendo uma sequência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de que a região correspondente à região nas posições 76 a 78 a partir da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina ou adenina-timidina- citosina, e a região correspondente à região nas posições 91 a 93 é guanina- timidina-guanina; e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de N- acetilglutamato quinase. (10) Um DNA recombinante que é obtido pela incorporação em um vetor do DNA de acordo com qualquer um dos (5) a (9) acima. (11) Um microorganismo que é obtido pela introdução do DNA recombinante de acordo com o (10) acima. (12) Um microorganismo tendo o DNA de acordo com qualquer um dos (5) a (9) acima. (13) O microorganismo de acordo com o (11) ou (12) acima, caracterizado pelo fato de que a atividade de repressão transcricional do repressor de arginina no operon de arginina é reduzida ou perdida. (14) O microorganismo de acordo com qualquer um dos (11) a (13) acima, caracterizado pelo fato de que atividade de ornitina carbamoil transferase é reduzida ou perdida. (15) O microorganismo de acordo com qualquer um dos (11) a (14) acima, caracterizado pelo fato de que atividade de argininosuccinato sintase é reduzida ou perdida. (16) O microorganismo de acordo com qualquer um dos (11) a (15) acima, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um microorganismo pertencendo ao gênero Corynebacterium. (17) O microorganismo de acordo com qualquer um dos (11) a (16) acima, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um microorganismo pertencendo a Corynebacterium glutamicum. (18) Um processo para produzir L-arginina, L-ornitina, ou L- citrulina que compreende cultivar o microorganismo de acordo com qualquer um dos (11) a (17) acima em um meio, permitindo que L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina se formem e acumulem na cultura, e recuperando L-arginina, L-ornitina ou L-citrulina da cultura.

Efeito da Invenção

[00021] A presente invenção fornece um processo eficiente para produzir L-arginina, L-ornitina ou L-citrulina.

Melhores Maneiras de Realizar a Invenção

[00022] Os polipeptídeos da presente invenção incluem um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos na região em posições 20 a 38 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 e que tem atividade de N-acetilglutamato quinase (daqui por diante referida como atividade de ArgB).

[00023] A sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é a sequência de aminoácidos de ArgB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e é codificada por DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2. O DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é registrado como NCgl1342 em DDBJ/GenBank/EMBL.

[00024] A região consistindo da sequência de aminoácidos nas posições 20 a 38 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é assumida como sendo uma região que forma a-hélice, julgando a partir da relação entre a sequência de aminoácidos de ArgB de Escherichia coli e sua estrutura tri-dimensional [Structure, 10, 329-342 (2002)] e a partir da homologia da dita sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de ArgB de Corynebacterium glutamicum.

[00025] A substituição de aminoácido pode ocorrer em qualquer sítio na região em posições 20 a 38 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, mas o sítio de substituição é preferivelmente na região em posições 26 a 31.

[00026] O número de resíduos de aminoácidos que são substituídos não é especificamente limitado na medida em que um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos substituída tenha atividade de ArgB, preferivelmente atividade de ArgB caracterizada pelo fato de que inibição por retroalimentação por L-arginina é reduzida ou removida. O número adequado é preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 5, ainda mais preferivelmente 1 ou 2.

[00027] Pode ser confirmado que o polipeptídeo tem atividade de ArgB caracterizada pelo fato de que inibição por retroalimentação por L-arginina é reduzida ou removida pela verificação de que sua atividade de ArgB na presença de L-arginina é maior do que aquela do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 na presença de L- arginina. A concentração de L-arginina é preferivelmente de 5 mmol/l ou mais, ainda mais preferivelmente de 10 mmol/l ou mais.

[00028] Atividade de ArgB de um polipeptídeo pode ser medida, por exemplo, por métodos tais como um método no qual ácido pirúvico formado pela reação de sistema de ácido fosfoenolpirúvico-piruvato quinase é colorimetricamente determinado como 2,4-dinitrofenilhidrazona usando ATP e N-acetil-L-ácido glutâmico como substratos [Meth. Enzymol., 17, 251-255 (1970)], e um método no qual acetilglutamato 5-fosfato que é formado pela reação de ATP e N-acetil-L-ácido glutâmico com hidroxilamina é determinado como ácido hidroxâmico [Meth. Enzymol., 17, 269-272 (1970)].

[00029] Os aminoácidos a serem substituídos não são especificamente limitados na medida em que um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos substituída tenha atividade de ArgB, preferivelmente atividade de ArgB caracterizada pelo fato de que inibição por retroalimentação por L- arginina é reduzida ou removida, e eles podem ser naturais ou não.

[00030] Exemplos de aminoácidos naturais são L-alanina, L- asparagina, L-ácido aspártico, L-glutamina, L-ácido glutâmico, glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-arginina, L-metionina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, L-valina e L-cisteína.

[00031] Os seguintes são exemplos dos aminoácidos capazes de substituição mútua. Os aminoácidos no mesmo grupo podem ser mutuamente substituídos.

[00032] Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanóico, metionina, O-metilserina, t-butilglicina, t- butilalanina, ciclohexilalanina

[00033] Grupo B: ácido aspártico, ácido glutâmico, ácido isoaspártico, ácido isoglutâmico, ácido 2-aminoadípico, ácido 2-aminosubérico

[00034] Grupo C: asparagina, glutamina

[00035] Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4- diaminobutanóico, ácido 2,3-diaminopropiônico

[00036] Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina

[00037] Grupo F: serina, treonina, homoserina

[00038] Grupo G: fenilalanina, tirosina

[00039] Os polipeptídeos da presente invenção também incluem um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que o resíduo de aminoácido em posição 26 ou 31, ou ambos resíduos de aminoácidos em posições 26 e 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 são substituídos e que tem atividade de ArgB.

[00040] No polipeptídeo da presente invenção, um ou mais resíduos de aminoácidos podem ser deletados, substituídos ou adicionados em sítios outros do que os sítios que foram substituídos na sequência de aminoácidos na medida em que o polipeptídeo tenha atividade de ArgB.

[00041] O número de resíduos de aminoácidos que são deletados, substituídos ou adicionados não é especificamente limitado, e o número adequado é 1 a dúzias, preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5.

[00042] Os aminoácidos a serem substituídos são os mesmos que os resíduos de aminoácidos acima capazes de serem substituídos na região em posições 20 a 38 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1.

[00043] “Deleção, substituição ou adição” se refere a deleção, substituição ou adição de um resíduo de aminoácido único ou plural na mesma sequência, e elas podem ocorrer simultaneamente.

[00044] A fim de que o polipeptídeo da presente invenção possa ter atividade de ArgB, é desejável que o polipeptídeo tenha pelo menos homologia de 60%, normalmente homologia de 80% ou mais, especificamente homologia de 95% ou mais com o polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1.

[00045] Na presente invenção, a homologia entre sequências de aminoácidos e sequências de nucleotídeos pode ser determinada pela utilização de algoritmo BLAST por Karlin e Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)] e FASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]. Com base no algoritmo BLAST, programas tal como BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]. Quando uma sequência de nucleotídeos é analisada por BLASTN com base em BLAST, os parâmetros, por exemplo, são como segue: escore = 100 e comprimento de palavra = 12. Quando uma sequência de aminoácidos é analisada por BLASTX com base em BLAST, os parâmetros, por exemplo, são como segue: escore = 50 e comprimento de palavra = 3. Quando programas BLAST e Gapped BLAST são usados, parâmetros padrão de cada programa são usados. As técnicas específicas para estas análises são conhecidas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).

[00046] Exemplos mais específicos das sequências de aminoácidos dos polipeptídeos da presente invenção são: a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3, na qual alanina em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituída por valina; a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 5, na qual alanina em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituída por leucina; a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 7, na qual alanina em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituída por isoleucina; a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 9, na qual metionina em posição 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituída por valina; e a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 11, na qual alanina em posição 26 e metionina em posição 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 são respectivamente substituídas por valina.

[00047] Exemplos dos DNAs da presente invenção incluem DNAs codificando os polipeptídeos da presente invenção, especificamente, DNAs tendo as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 e 12 que codificam os polipeptídeos tendo as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9 e 11, respectivamente.

[00048] Os DNAs da presente invenção incluem DNA que hibridiza com DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de DNA codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 sob condições estringentes, que é selecionado a partir do grupo consistindo dos seguintes (i) a (ix): (i) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um resíduo de aminoácido outro do que L-alanina; (ii) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um resíduo de aminoácido outro do que L-metionina; (iii) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é um resíduo de aminoácido outro do que L-alanina e o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 31 é um resíduo de aminoácido outro do que L-metionina; (iv) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é L-valina, L-leucina ou L-isoleucina; (v) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 31 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é L-valina; (vi) DNA codificando um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 26 a partir do término N da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é L-valina, L-leucina ou L-isoleucina, e o resíduo de aminoácido correspondendo ao resíduo em posição 31 é L-valina; (vii) DNA tendo uma sequência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de que a região correspondendo à região em posições 76 a 78 a partir da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina ou adenina- timidina-citosina; (viii) DNA tendo uma sequência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de que a região correspondente à região nas posições 91 a 93 a partir da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é guanina-timidina-guanina; e (ix) DNA tendo uma sequência de nucleotídeos caracterizada pelo fato de que a região correspondente à região nas posições 76 a 78 a partir da extremidade 5’ da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é guanina-timidina-timidina, citosina-timidina-guanina ou adenina-timidina- citosina, e a região correspondente à região nas posições 91 a 93 é guanina- timidina-guanina; e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de N- acetilglutamato quinase.

[00049] O DNA capaz de hibridização sob condições estringentes se refere a DNA que é obtido por hibridização de colônia, hibridização em placa, hibridização Southern blot, ou as semelhantes usando uma parte ou o DNA inteiro consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de DNA codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11, preferivelmente a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12, como uma sonda. Um exemplo específico de tal DNA é DNA que pode ser identificado pela realização de hibridização a 65° C na presença de 0,7 a 1,0 mol/l de cloreto de sódio usando um filtro com DNA derivado de colônia ou placa imobilizado nesta, e então lavando o filtro a 65° C com uma conc. de 0,1 a 2 vezes de solução SSC (conc. de 1 vez de solução SSC: 150 mmol/l de cloreto de sódio e 15 mmol/l de citrato de sódio).

[00050] Hibridização pode ser realizada de acordo com métodos descritos em Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) (daqui por diante abreviado como Molecular Cloning, 3rd ed.); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (daqui por diante abreviado como Current Protocols in Molecular Biology); DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) (daqui por diante abreviado como DNA Cloning), etc. O DNA hibridizável inclui DNA tendo pelo menos homologia de 75%, preferivelmente homologia de 80% ou mais, ainda mais preferivelmente homologia de 95% ou mais com a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 como calculado por uso de BLAST ou FASTA descritos acima.

[00051] Os microorganismos da presente invenção incluem quaisquer microorganismos tendo o DNA da presente invenção. São preferidos microorganismos caracterizados pelo fato de que a atividade de repressão transcricional do repressor de arginina (ArgR) no operon de arginina é reduzida ou perdida.

[00052] O tipo dos microorganismos da presente invenção não é especificamente limitado, e exemplos dos microorganismos incluem bactérias corineformes.

[00053] As bactérias corineformes incluem microorganismos pertencendo aos gêneros Corynebacterium, Brevibacterium e Microbacterium.

[00054] Exemplos de microorganismos pertencendo ao gênero Corynebacterium são Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium aceto glutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium melassecola e Corynebacterium thermoaminogenes, especificamente, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13060, Corynebacterium glutamicum ATCC 13826 (anteriormente Brevibacterium flavum), Corynebacterium glutamicum ATCC 14020 (anteriormente Brevibacterium divaricatum), Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 (anteriormente Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium callunae ATCC 15991, Corynebacterium herculis ATCC 13868, Corynebacterium lilium ATCC 15990, Corynebacterium melassecola ATCC 17965 e Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244.

[00055] Exemplos de microorganismos pertencendo ao gênero Brevibacterium são Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium roseum e Brevibacterium thiogenitalis, especificamente, Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068, Brevibacterium roseum ATCC 13825 e Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240.

[00056] Um exemplo de microorganismos pertencendo ao gênero Microbacterium é Microbacterium ammoniaphilum, especificamente, Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354.

[00057] A atividade de repressão transcricional de ArgR no operon de arginina no microorganismo da presente invenção deveria ser reduzida comparada com sua linhagem parental, preferivelmente para 50% ou menos, mais preferivelmente 10% ou menos, ainda mais preferivelmente 5% ou menos, o mais preferivelmente 0% ou perdida.

[00058] A linhagem parental pode ser qualquer microorganismo tendo a habilidade para formar L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina no qual ArgB é sujeito à inibição por retroalimentação por L-arginina e transcrição de operon de arginina é reprimida por ArgR, que pode ser ou uma linhagem tipo selvagem ou uma linhagem criada artificialmente a partir da linhagem tipo selvagem. O microorganismo hospedeiro para introduzir o DNA da presente invenção descrito abaixo também pode ser usado como a linhagem parental, contanto que ele tenha as propriedades acima.

[00059] Na presente invenção, o termo linhagem tipo selvagem se refere a um microorganismo que taxonomicamente pertence à mesma espécie do que o microorganismo da presente invenção e que tem o fenótipo que aparece na natureza mais frequentemente.

[00060] Quando o microorganismo da presente invenção é um microorganismo pertencendo a Corynebacterium glutamicum, um exemplo da linhagem tipo selvagem é Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

[00061] O microorganismo da presente invenção pode ser obtido tratando uma linhagem parental com um mutagene tal como N-metil-N’-nitro- N-nitrosoguanidina, cultivando a linhagem obtida usando um meio compreendendo hidroxamato de arginina (análogo de arginina), selecionando linhagens que crescem mais rápido do que a linhagem parental, e adicionalmente selecionando linhagens a partir de microorganismos tendo produtividade de L-arginina realçada comparada com aquela da linhagem parental quando cultivada usando um meio comum. O microorganismo da presente invenção pode ser mais convenientemente obtido pela introdução do DNA da presente invenção.

[00062] O método para obter o microorganismo da presente invenção pela introdução do DNA da presente invenção é descrito abaixo.

[00063] O DNA da presente invenção pode ser preparado a partir de DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou DNA que tem uma sequência de nucleotídeos tendo uma alta homologia com a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ArgB.

[00064] “Uma alta homologia com a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2” se refere à pelo menos homologia de 75%, preferivelmente homologia de 80% ou mais, ainda mais preferivelmente homologia de 95% ou mais.

[00065] O DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou DNA que tem uma sequência de nucleotídeos tendo uma alta homologia com a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ArgB pode ser preparado a partir de microorganismos tendo estes DNAs, e também pode ser obtido por síntese química usando um sintetizador de DNA (Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.).

[00066] Exemplos dos microorganismos tendo estes DNAs incluem aqueles pertencendo ao gênero Corynebacterium.

[00067] Exemplos dos microorganismos pertencendo ao gênero Corynebacterium são Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium efficiens e Corynebacterium crenatum, especificamente, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum K65 (FERM BP-1115), Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 e Corynebacterium efficiens JCM 44549. É preferido Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 tendo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2.

[00068] Um microorganismo tendo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou DNA que tem uma sequência de nucleotídeos tendo uma alta homologia com a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ArgB é cultivado por um método conhecido [por exemplo, Mol. Microbiol., 20, 833 (1996)].

[00069] Depois do cultivo, o DNA cromossômico do microorganismo é isolado e purificado, por exemplo, de acordo com o método de Saito, et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)].

[00070] PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] é realizado usando iniciadores preparados baseados na sequência de nucleotídeos de DNA codificando ArgB de Corynebacterium glutamicum, que é registrada como NCgl1342 em DDBJ/GenBank/EMBL (a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2), ou a sequência de nucleotídeos de uma região contendo a dita sequência de nucleotídeos (por exemplo, a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 30), e como um modelo, o DNA cromossômico isolado e purificado para preparar um fragmento de DNA contendo DNA codificando ArgB.

[00071] Exemplos dos iniciadores incluem DNAs consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 13 a 18 projetados baseados na sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 30.

[00072] Ademais, um DNA clonado contendo DNA codificando ArgB pode ser obtido a partir de uma biblioteca de DNA que é preparada usando o DNA cromossômico isolado e purificado de acordo com os métodos descritos em Molecular Cloning, 3rd ed., Current Protocols in Molecular Biology, etc. e então obtendo o clone desejado a partir da biblioteca de DNA por métodos tais como hibridização de colônia, hibridização em placa e hibridização Southern blot descritos em manuais de laboratório tal como Molecular Cloning, 3rd ed., Current Protocols in Molecular Biology e DNA Cloning.

[00073] Sondas usadas para hibridização incluem um DNA conhecido codificando o ArgB de Corynebacterium glutamicum ou uma parte do DNA, DNA que foi sintetizado baseado na sequência de nucleotídeos do dito DNA conhecido, e um fragmento de DNA obtido por PCR usando iniciadores de DNA sintetizados baseados na sequência de nucleotídeos de um DNA conhecido codificando ArgB.

[00074] Exemplos das sondas são DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 e um fragmento de DNA amplificado por PCR usando DNAs consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 13 a 18 como iniciadores e o DNA cromossômico de um microorganismo pertencendo a Corynebacterium glutamicum como um modelo.

[00075] O fragmento de DNA compreendendo DNA codificando ArgB obtido por hibridização de colônia, hibridização em placa, hibridização Southern ou as semelhantes, como tal ou depois de clivagem com enzimas de restrição apropriadas, é inserido em um vetor por um método convencional. Então, a sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA é determinada por um método de sequenciamento convencional tal como o método dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] usando Sequenciador de DNA ABI377 (Perkin-Elmer Corp.) ou os semelhantes.

[00076] Ademais, um fragmento de DNA tendo DNA codificando ArgB pode ser obtido realizando PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] usando iniciadores preparados baseados na sequência de nucleotídeos determinada e o DNA cromossômico como um modelo.

[00077] Também é possível preparar o fragmento de DNA desejado por síntese química usando um sintetizador de DNA (e.g., Modelo 8905, PerSeptive Biosystems, Inc.) baseado na sequência de nucleotídeos determinada do fragmento de DNA.

[00078] Um exemplo do DNA codificando ArgB que pode ser obtido pelo método acima descrito é DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2.

[00079] O DNA da presente invenção pode ser obtido introduzindo uma mutação sítio dirigida em DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou DNA que tem uma sequência de nucleotídeos tendo uma alta homologia com a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 e que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ArgB pelo método de mutagênese sítio dirigida descrito em Molecular Cloning, 3rd ed.; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), etc., por exemplo, o método usando PCR, de acordo com necessidade.

[00080] O DNA assim obtido da presente invenção é incorporado em um vetor tal como um vetor plasmídeo por um método comum para preparar o DNA recombinante da presente invenção.

[00081] Como para o vetor, não existe nenhuma limitação específica na medida em que ele seja um vetor capaz de ser introduzido em um microorganismo no qual o DNA da presente invenção é introduzido (daqui por diante referido como um microorganismo hospedeiro). Exemplos de vetores adequados são pHSG299 [Gene, 61, 63-74 (1987)], pBTrp2, pBTacl e pBTac2 (produtos de Boehringer Mannheim GmbH), pHelix1 (Roche Diagnostics Corp.), pKK233-2 (Amersham Pharmacia Biotech), pSE280 (Invitrogen Corp.), pGEMEX-1 (Promega Corp.), pQE-8 (Qiagen, Inc.), pET- 3 (Novagen, Inc.), pKYP10 (Pedido de Patente Japonesa Não Examinado Publicado No. 110600/83), pKYP200 [Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)], pLSA1 [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(+), pBluescript II KS(-) (Stratagene), pTrS30 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)], pTrS32 [preparado a partir de Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)], pPAC31 (folheto de WO98/12343), pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pUC118 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pPA1 (Pedido de Patente Japonesa Não Examinado Publicado No. 233798/88), pCG116, pCG1 (Pedido de Patente Japonesa Não Examinado Publicado No. 277082/94) e pCS299P (folheto de WO00/63388). É preferível usar vetores incapazes de replicação autônoma em um microorganismo hospedeiro porque o DNA recombinante da presente invenção pode ser integrado no cromossomo do microorganismo hospedeiro usando tais vetores.

[00082] Os microorganismos acima podem ser usados como os microorganismos hospedeiros.

[00083] Não existe nenhuma limitação específica como para os vetores incapazes de replicação autônoma em um microorganismo hospedeiro. É preferido um vetor tendo um gene envolvido em resistência a antibiótico, o que facilita seleção de um microorganismo no qual o DNA recombinante da presente invenção foi integrado no cromossomo por recombinação homóloga. É mais preferido um vetor tendo DNA codificando levansucrase (EC: 2.4.1.10) derivado a partir de Bacillus subtilis (sacB), o que facilita seleção de um microorganismo caracterizado pelo fato de que o DNA codificando ArgB habitualmente existente no cromossomo do microorganismo hospedeiro foi reposto pelo DNA da presente invenção. Um exemplo de tal vetor é plasmídeo pESB30 descrito em Exemplo 1.

[00084] O DNA recombinante da presente invenção é introduzido em um microorganismo hospedeiro.

[00085] Introdução de uma mutação que reduz ou oblitera atividade de ArgR do microorganismo da presente invenção pode ser realizada ou antes ou depois da introdução do DNA da presente invenção no microorganismo hospedeiro.

[00086] A redução ou perda de atividade de ArgR pode ser atingida tratando um microorganismo cuja atividade de ArgR está para ser reduzida ou perdida com um mutagene (e.g. N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina) e selecionando linhagens cuja produtividade de L-arginina é realçada comparada com aquela antes da mutagênese, ou alternativamente, introduzindo uma substituição, deleção ou adição de nucleotídeo em DNA codificando ArgR pelo método similar àquele para introduzir uma mutação sítio dirigida em DNA codificando ArgR.

[00087] A substituição, deleção ou adição de nucleotídeo pode ser introduzida em qualquer sítio contanto que atividade de ArgR possa ser reduzida ou perdida, mas é preferivelmente introduzida em um sítio na região de ligação de L-arginina do DNA codificando ArgR ou uma região contendo a região de ligação de forma que a atividade pode ser eficientemente reduzida ou perdida.

[00088] Um exemplo da região de ligação de L-arginina é a região em posições 45 a 240 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19, que é a sequência de nucleotídeos de DNA codificando ArgR de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Nos DNAs codificando ArgR de outros microorganismos, a região de ligação de L-arginina está na região correspondendo à região acima ou em sua vizinhança.

[00089] O número de nucleotídeos que são substituídos, deletados ou adicionados não é especificamente limitado na medida em que ele seja um número adequado para redução ou perda de atividade de ArgR.

[00090] Introdução do DNA da presente invenção em um microorganismo hospedeiro pode ser realizada por qualquer dos métodos capazes de introduzir o DNA recombinante da presente invenção em um microorganismo hospedeiro.

[00091] Por exemplo, métodos tal como eletroporação [Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)] e o método de protoplasto [J. Bacteriol., 159, 306 (1984)] podem ser usados.

[00092] Como ArgRB tipo selvagem está sujeito à inibição por retroalimentação por L-arginina, microorganismos nos quais a inibição por retroalimentação não é reduzida ou removida mostram uma taxa de crescimento mais lenta do que microorganismos nos quais a inibição por retroalimentação não é reduzida ou removida em um meio compreendendo hidroxamato de arginina (análogo de arginina). Microorganismos nos quais atividade de ArgR não é reduzida ou perdida têm um nível de expressão de ArgR inferior devido à repressão de transcrição de operon de arginina por acumulação de L-arginina e mostram uma taxa de crescimento ainda mais lenta em um meio compreendendo hidroxamato de arginina.

[00093] Portanto, é possível confirmar que o DNA da presente invenção foi introduzido em um microorganismo obtido pela introdução do DNA da presente invenção em um microorganismo hospedeiro pelo método acima verificando que a taxa de crescimento do microorganismo é realçada comparada com aquela do microorganismo hospedeiro quando a taxa de crescimento do microorganismo e aquela do microorganismo hospedeiro são comparadas em um meio compreendendo hidroxamato de arginina. A confirmação também pode ser feita preparando um plasmídeo ou um cromossomo a partir do microorganismo por um método convencional e então examinando a sequência de nucleotídeos.

[00094] Redução ou perda de atividade de ArgR do microorganismo pode ser confirmada comparando a expressão de operon de arginina no microorganismo e no microorganismo hospedeiro por hibridização Northern (Molecular Cloning, 3rd ed.) ou as semelhantes. As sondas usadas para hibridização Northern incluem DNA tendo uma parte ou a sequência de nucleotídeos inteira de genes constituindo o operon de arginina, por exemplo, o DNA descrito acima usado para selecionar o DNA codificando ArgB a partir de uma biblioteca de DNA.

[00095] A confirmação também pode ser feita usando um microorganismo portando um gene repórter incorporado ao operon de arginina como um microorganismo hospedeiro, e comparando a quantidade de expressão do gene repórter com aquela do microorganismo hospedeiro.

[00096] O microorganismo da presente invenção pode ser qualquer microorganismo tendo o DNA da presente invenção no qual atividade de ArgR é reduzida ou perdida. Quando o microorganismo da presente invenção é usado para produção de L-ornitina, é desejável que a atividade de ornitina carbamoiltransferase, que é uma enzima na via biossintética de L-arginina (EC: 2.1.3.3, daqui por diante referida como ArgF), no microorganismo seja perdida ou reduzida comparada com aquela da linhagem parental. Uma linhagem na qual atividade de ArgF é perdida ou reduzida comparada com aquela da linhagem parental pode ser obtida por mutagênese da mesma maneira que o método para introduzir uma mutação em ArgB e ArgR, ou introduzindo uma substituição, deleção ou adição de nucleotídeo em DNA codificando ArgF usando o mesmo método que o método para introduzir uma mutação sítio dirigida em ArgB e ArgR. O DNA codificando ArgF é conhecido e a informação de sequência de nucleotídeos descrita, por exemplo, em DDBJ/GenBank/EMBL podem ser usados. Um exemplo do DNA codificando ArgF é DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 31.

[00097] Quando o microorganismo da presente invenção é usado para produção de L-citrulina, é desejável que a atividade de argininosuccinato sintase, que é uma enzima na via biossintética de L-arginina (EC: 6.3.4.5, daqui por diante referida como ArgG), no microorganismo seja perdida ou reduzida comparada com aquela da linhagem parental. Uma linhagem na qual atividade de ArgG é perdida ou reduzida comparada com aquela da linhagem parental pode ser obtida por mutagênese da mesma maneira que o método para introduzir uma mutação em ArgB e ArgR, ou introduzindo uma substituição, deleção ou adição de nucleotídeo em DNA codificando ArgG usando o mesmo método que o método para introduzir uma mutação sítio dirigida em ArgB e ArgR. O DNA codificando ArgG é conhecido e a informação de sequência de nucleotídeos descrita, por exemplo, em DDBJ/GenBank/EMBL podem ser usados. Um exemplo do DNA codificando ArgG é DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 32.

[00098] L-Arginina, L-ornitina, ou L-citrulina podem ser produzidas cultivando o microorganismo da presente invenção em um meio, permitindo que L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina se formem e acumulem na cultura, e recuperando L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina.

[00099] Como o método para cultivar o microorganismo da presente invenção em um meio, quaisquer métodos comuns usados para cultivar um microorganismo podem ser usados.

[000100] Como o meio, quaisquer dos meios naturais e meios sintéticos podem ser usados na medida em que ele seja um meio adequado para cultivo eficiente do microorganismo da presente invenção que contém fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais inorgânicos, etc. que pode ser assimilado pelo microorganismo.

[000101] Como as fontes de carbono, quaisquer fontes de carbono que podem ser assimiladas pelo microorganismo da presente invenção podem ser usadas. Exemplos de fontes de carbono adequadas incluem carboidratos tal como glicose, frutose, sacarose, maltose, melaços contendo eles, amido e hidrolisado de amido; ácidos orgânicos tal como ácido acético, ácido lático e ácido succínico, e álcoois tal como etanol e propanol.

[000102] Exemplos das fontes de nitrogênio incluem amônia, sais de amônio de ácidos orgânicos ou inorgânicos tal como cloreto de amônio, sulfato de amônio, acetato de amônio e carbonato de amônio, outros compostos contendo nitrogênio, peptona, extrato de carne, extrato de levedura água de maceração de milho, hidrolisado de caseína, torta de soja, hidrolisado de torta de soja, e várias células microbianas fermentadas e produtos digeridos destas.

[000103] Exemplos dos sais inorgânicos incluem dihidrogêniofosfato de potássio, hidrogêniofosfato de dipotássio, fosfato de magnésio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato de ferro, sulfato de manganês, sulfato de cobre e carbonato de cálcio.

[000104] Ademias, micronutrientes tal como biotina, tiamina, nicotinamida e ácido nicotínico podem ser adicionados de acordo com necessidade. Estes micronutrientes podem ser fornecidos por extrato de carne, extrato de levedura, água de maceração de milho, ácido casamínico, etc.

[000105] Cultivo é realizado sob condições aeróbicas, por exemplo, agitando cultura ou cultura rotatória submersa sob aeração. A temperatura de cultivo é preferivelmente de 20 a 42° C, mais preferivelmente de 30 a 40° C. O pH do meio está na variação de 5 a 9, e é preferivelmente mantido cerca de neutro. O ajuste de pH é realizado usando um ácido inorgânico ou orgânico, uma solução de álcali, uréia, carbonato de cálcio, amônia, tampão de pH, etc.

[000106] Quando o DNA recombinante da presente invenção usado para preparação do microorganismo da presente invenção tem um promotor induzível, um indutor adequado para o promotor pode ser adicionado ao meio, se necessário. Por exemplo, quando um DNA recombinante tendo promotor lac é usado, isopropil-e-D-tiogalactopiranosídeo ou os semelhantes podem ser adicionados ao meio; e quando um DNA recombinante tendo promotor trp é usado, ácido indoleacrílico ou os semelhantes podem ser adicionados.

[000107] Cultivo é normalmente realizado por 1 a 6 dias e L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina é formada e acumulada na cultura.

[000108] Depois da compleição de cultivo, precipitados tal como células são removidas da cultura, e L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina acumulada na cultura pode ser recuperada combinando métodos conhecidos tal como tratamento com carbono ativo e tratamento com resina de troca iônica.

[000109] Algumas formas de realização da presente invenção são ilustradas nos exemplos seguintes. Estes exemplos não são para serem interpretados como limitando o escopo da presente invenção.

Exemplo 1

[000110] Construção de um Plasmídeo para Substituição de Aminoácidos em ArgB (1) Preparação de um Vetor para Recombinação Homóloga

[000111] Plasmídeo pHSG299 portando um gene conferindo resistência a canamicina [Gene, 61, 63 (1987)] foi tratado com PstI, e um fragmento de DNA de 2,6 pares de quilobases (daqui por diante abreviado como kb) contendo gene de levansucrase sacB derivado de Bacillus subtilis [Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)] foi ligado ao sítio de clivagem do plasmídeo pHSG299 para obter plasmídeo pESB30.

[000112] pESB30 foi tratado com BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) e sujeito à eletroforese em gel de agarose, seguida por extração e purificação usando GENECLEAN Kit (BIO 101). Ambas extremidades do fragmento de DNA obtido foram preenchidas usando um DNA blunting kit (DNA Blunting Kit, Takara Shuzo Co., Ltd.) de acordo com o protocolo anexado. O fragmento de DNA preenchido foi tratado com fenol/clorofórmio, concentrado por precipitação de etanol, e então sujeito à reação na presença de Taq polimerase (Roche Diagnosis) e dTTP a 70°C por 2 horas por adição de uma base de timina à extremidade 3’ para preparar plasmídeo pESB30-T. (2) Preparação de DNA Codificando ArgB no Qual Alanina na posição 26 é Substituída por Valina

[000113] DNA tendo a sequência de nucleotídeos em posições 19 a 38 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 30 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 13) e DNA tendo a sequência complementar à sequência de nucleotídeos em posições 1027 a 1047 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 30 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 14) foram sintetizados usando um sintetizador de DNA.

[000114] A sequência de nucleotídeos em posições 451 a 1332 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 30 é uma região codificando um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1, que é ArgB de Corynebacterium glutamicum. A sequência de nucleotídeos da região é mostrada em SEQ ID NO: 2.

[000115] DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos em posições 68 a 89 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4 (a sequência de SEQ ID NO: 4 é uma sequência em que citosina na posição 77 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 foi substituída por timidina e codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 3, caracterizada pelo fato de que alanina na posição 26 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 foi substituída por valina) (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 15) e DNA consistindo da sequência de nucleotídeos em posições 65 a 87 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 16) foram sintetizados usando um sintetizador de DNA.

[000116] O DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi preparado de acordo com o método de Saito, et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)], e dois tipos de PCR foram realizados usando o DNA cromossômico como um modelo, uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 13 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 15 e uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 14 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 16, respectivamente, como um conjunto de iniciadores, DNA polimerase Pfu turbo (Stratagene) e um tampão ligado. Dois produtos de PCR de 0,5 kb obtidos pelo PCR foram respectivamente sujeitos a eletroforese em gel de agarose, e extraídos e purificados usando GENECLEAN Kit (BIO 101).

[000117] PCR foi adicionalmente realizado usando ambos os produtos purificados como modelos, e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 13 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 14 como um conjunto de iniciadores. O produto de PCR obtido foi sujeito à eletroforese em gel de agarose, e extraído e purificado usando Kit GENECLEAN para obter um fragmento de DNA de 1,0 kb. A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA foi determinada usando um sequenciador e foi confirmado que o fragmento de DNA tinha a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4. (3) Preparação de DNA Codificando ArgB no Qual Metionina na posição 31 é Substituída por Valina

[000118] DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos em posições 83 a 102 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 10 (a sequência de SEQ ID NO: 10 é uma sequência em que adenina na posição 91 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 foi substituída por guanina e codifica uma sequência em que metionina na posição 31 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 foi substituída por valina) (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 17) e DNA consistindo da sequência de nucleotídeos em posições 79 a 99 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 10 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 18) foram sintetizados usando um sintetizador de DNA.

[000119] Foi realizado o mesmo procedimento que em (2) exceto que uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 13 e o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 17 e uma combinação do DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 14 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 18 foram respectivamente usados como um conjunto de iniciadores para obter um fragmento de DNA de 1,0 kb.

[000120] A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA obtido foi determinada usando um sequenciador e foi confirmado que o fragmento de DNA tinha a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 10. (4) Construção de um Plasmídeo para Substituição de um Aminoácido em ArgB

[000121] Cada um dos fragmentos de DNA tendo respectivamente as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 4 e 10 obtidos no (2) e (3) acima foi tratado na presença de Taq polimerase (Boehringer Mannheim GmbH) e dATP a 72°C por 10 minutos por adição de uma base de adenina à extremidade 3’ do fragmento de DNA.

[000122] Plasmídeo pESB30-T foi misturado com cada um dos fragmentos de DNA preparados pela adição de um resíduo de adenina aos fragmentos de DNA tendo as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NO: 4 e 10, respectivamente, e reação de ligase foi realizada usando Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Usando cada um dos produtos de reação obtidos, Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.) foi transformada de acordo com um método convencional. A linhagem foi cultivada em meio de ágar LB [contendo 10 g de Bacto-triptona (Difco), 5 g de extrato de levedura (Difco), 10 g de cloreto de sódio e 16 g de Bacto-ágar (Difco) em 1 litro de água, pH 7,0] contendo 20 μg/ml de canamicina para selecionar um transformante. O transformante foi cultivado durante a noite usando meio LB contendo 20 μg/ml de canamicina, e um plasmídeo foi preparado a partir da cultura obtida pelo método SDS de álcali (Molecular Cloning, 3rd ed.). As sequências de nucleotídeos dos plasmídeos obtidos foram determinadas usando um sequenciador e foi confirmado que os DNAs tendo as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 4 e 10, respectivamente, foram inseridos em pESB30-T nos respectivos plasmídeos.

[000123] O plasmídeo tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4 foi designado como pEargB26 e o plasmídeo tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 10 foi designado como pEargB31. (5) Construção de um Plasmídeo para Substituição de um Aminoácido em ArgB

[000124] Foi realizado o mesmo procedimento que em (2) exceto que uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 13 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 15 e uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 14 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 16 foram respectivamente usados como um conjunto de iniciadores e pEargB31 foi usado como um modelo para obter um fragmento de DNA de 1,0 kb. A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA obtido foi determinada usando um sequenciador e foi confirmado que o fragmento de DNA tinha a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 12.

[000125] Foi realizado o mesmo procedimento que em (4) exceto que o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 12 foi usado para obter plasmídeo pEargB2631 caracterizado pelo fato de que o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 12 foi incorporado em pESB30-T.

[000126] O DNA mostrado em SEQ ID NO: 12 é DNA codificando a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 11, que é DNA codificando a sequência de aminoácidos caracterizada pelo fato de que alanina na posição 26 e metionina na posição 31 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 são respectivamente substituídas por valina.

Exemplo 2

[000127] Introdução de Substituições de Aminoácidos em ArgB no Cromossomo (1) Introdução de Substituições de Aminoácidos em ArgB no Cromossomo de uma Linhagem Tipo Selvagem

[000128] Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi transformada por eletroporação de acordo com o método de Rest et al. [Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)] usando plasmídeos pEargB26, pEargB31 e pEargB2631 preparados em Exemplo 1, respectivamente, para selecionar linhagens resistentes a canamicina. Um cromossomo foi preparado a partir de uma das linhagens resistentes a canamicina e avaliado por hibridização Southern (Molecular Cloning, 3rd ed.), com a qual foi confirmado que pEargB26, pEargB31 e pEargB2631 foram respectivamente integrados no cromossomo das linhagens por recombinação homóloga tipo Campbell. Em tais linhagens, o DNA codificando ArgB que é originalmente presente no cromossomo e o DNA da presente invenção existem perto um do outro no cromossomo e a segunda recombinação homóloga é apta para ocorrer entre eles.

[000129] Como levansucrase codificada por sacB converte sacarose em um substrato suicida, um microorganismo tendo sacB não pode crescer em um meio contendo sacarose. Entretanto, quando a segunda recombinação homóloga ocorre entre o DNA codificando ArgB que é originalmente presente no cromossomo e o DNA da presente invenção, um destes DNAs é deletado junto com sacB e assim a linhagem resultante pode crescer no meio contendo sacarose. Quando o DNA codificando ArgB que é originalmente presente no cromossomo é deletado, um microorganismo caracterizado pelo fato de que o DNA codificando ArgB que é originalmente presente no cromossomo do microorganismo hospedeiro é substituído pelo DNA da presente invenção pode ser obtido.

[000130] Utilizando isto, o transformante acima foi disperso em meio de ágar Suc [compreendendo 100 g de sacarose, 7 g de extrato de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloreto de sódio, 5 g de extrato de levedura (Difco) e 15 g de Bacto-ágar (Difco) em 1 litro de água, pH 7,2] e cultivado a 30°C por um dia para selecionar uma colônia crescendo neste.

[000131] O DNA cromossômico foi preparado a partir da colônia assim obtida, e PCR foi realizado usando o DNA cromossômico como um modelo, o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 13 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 14 como um conjunto de iniciadores, DNA polimerase Pfu turbo (Stratagene) e o tampão ligado. A sequência de nucleotídeos do produto de PCR foi determinada usando um sequenciador.

[000132] Assim, uma linhagem caracterizada pelo fato de que o DNA codificando ArgB no cromossomo é substituído pelo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4 foi obtida a partir das linhagens nas quais pEargB26 foi introduzido, e a linhagem foi designada como linhagem B26.

[000133] Da mesma maneira, uma linhagem caracterizada pelo fato de que o DNA codificando ArgB no cromossomo é substituído pelo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 10 foi obtida a partir das linhagens nas quais pEargB31 foi introduzido, e a linhagem foi designada como linhagem B31.

[000134] Adicionalmente, uma linhagem caracterizada pelo fato de que o DNA codificando ArgB no cromossomo é substituído pelo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 12 foi obtida a partir das linhagens nas quais pEargB2631 foi introduzido, e a linhagem foi designada como linhagem B2631. (2) Construção de um Plasmídeo para Deleção de uma Sequência Interna de ArgR

[000135] O DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi preparado de acordo com o método de Saito, et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)].

[000136] Os seguintes DNAs foram sintetizados usando um sintetizador de DNA: DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos em posições 43 a 62 da sequência de nucleotídeos de DNA codificando ArgR de Corynebacterium glutamicum mostrada em SEQ ID NO: 19 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 20), DNA consistindo de uma sequência complementar à sequência de nucleotídeos em posições 1421 a 1440 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 21), DNA consistindo de uma sequência complementar à sequência de nucleotídeos preparada pela adição de uma sequência etiqueta na sequência de nucleotídeos em posições 539 a 559 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 22) e DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos preparada pela adição de uma sequência etiqueta na sequência de nucleotídeos em posições 941 a 961 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 23).

[000137] A sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 é uma sequência de nucleotídeos contendo a sequência de nucleotídeos de DNA codificando ArgR de Corynebacterium glutamicum. Dois tipos de PCR foram realizados usando o DNA cromossômico preparado como um modelo, uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 20 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 22 e uma combinação do DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 21 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 23, respectivamente, como um conjunto de iniciadores, DNA polimerase Pfu turbo (Stratagene) e o tampão ligado. Dois produtos de PCR de 0,5 kb obtidos pelo PCR foram respectivamente sujeitos a eletroforese em gel de agarose, e extraídos e purificados usando GENECLEAN Kit (BIO 101).

[000138] PCR foi adicionalmente realizado usando ambos os produtos purificados como modelos, o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 20 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 21 como um conjunto de iniciadores, DNA polimerase Pfu turbo (Stratagene) e o tampão ligado. O produto de PCR obtido foi sujeito à eletroforese em gel de agarose, e extraído e purificado usando GENECLEAN Kit (BIO 101) com o qual foi obtido um fragmento de DNA de 1,0 kb no qual a região em posições 560 a 940 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 codificando ArgR foi deletada foi obtida.

[000139] Este fragmento foi incorporado em plasmídeo pESB30-T de acordo com o método descrito em Exemplo 1 para obter plasmídeo pEdel- argR. (3) Construção de uma Linhagem Tendo uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgR

[000140] Foi realizado o mesmo procedimento que no (1) acima exceto que plasmídeo pEdel-argR foi usado. Este procedimento produziu uma linhagem na qual o DNA codificando ArgR no cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi substituído pelo DNA caracterizado pelo fato de que a região em posições 560 a 940 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 foi deletada. A linhagem obtida foi designada linhagem R. (4) Introdução de Substituições de Aminoácidos em ArgB no Cromossomo de uma Linhagem Tendo uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgR

[000141] Foi realizado o mesmo procedimento que no (1) acima exceto que linhagem R foi usada como um hospedeiro e pEargB26, pEargB31 e pEargB2631 foram usados como plasmídeos. Este procedimento produziu linhagens nas quais o DNA codificando ArgR no cromossomo foi substituído pelo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4, 10 ou 12 e o DNA codificando ArgR no cromossomo foi substituído pelo DNA caracterizado pelo fato de que a região em posições 560 a 940 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 19 foi deletada. As linhagens foram designadas como linhagem RB26, linhagem RB31 e linhagem RB2631, respectivamente.

Exemplo 3

[000142] Teste de Produção de L-Arginina, L-Ornitina e L-Citrulina Usando Linhagens Tendo Substituições de Aminoácidos em ArgB

[000143] As linhagens B26, B31, B2631, R, RB26, RB31 e RB2631 obtidas em Exemplo 2 foram cultivadas separadamente em meio de ágar BY (um meio compreendendo 7 g de extrato de carne, 10 g de peptona, 3 g de cloreto de sódio, 5 g de extrato de levedura e 15 g de Bacto-ágar em 1 litro de água, pH 7,2) a 30°C por 24 horas.

[000144] Células de cada uma das linhagens que cresceram no meio de ágar BY foram inoculadas em um tubo de teste contendo 6 ml de um meio de semente (um meio que foi preparado pela adição de 10 g de carbonato de cálcio em um meio contendo 25 g de sacarose, 20 g de licor de infusão de milho, 20 g de peptona, 10 g de extrato de levedura, 0,5 g de sulfato de magnésio heptahidratado, 2 g de dihidrogêniofosfato de potássio, 3 g de uréia, 8 g de sulfato de amônio, 1 g de cloreto de sódio, 20 mg de ácido nicotínico, 10 mg de sulfato de ferro heptahidratado, 10 mg de pantotenato de cálcio, 1 mg de sulfato de zinco heptahidratado, 1 mg de sulfato de cobre pentahidratado, 1 mg de cloridrato de tiamina e 100 μg de biotina em 1 litro de água e ajustado para pH 7,2 com uma solução aquosa de hidróxido de sódio), seguido por agitação de cultura a 32°C por 24 horas.

[000145] Cada uma das culturas de semente obtidas (2 ml) foi inoculada em um frasco com septos contendo 20 ml de um meio de cultura principal (um meio que foi preparado pela adição de 30 g de carbonato de cálcio em um meio contendo 60 g de glicose, 5 g de licor de infusão de milho, 30 g de sulfato de amônio, 8 g de cloreto de potássio, 2 g de uréia, 0,5 g de dihidrogêniofosfato de potássio, 0,5 g de hidrogêniofosfato de dipotássio, 1 g de sulfato de magnésio heptahidratado, 1 g de cloreto de sódio, 20 mg de sulfato de ferro heptahidratado, 20 mg de ácido nicotínico, 20 mg de β- alanina, 10 mg de sulfato de manganês pentahidratado, 10 mg de cloridrato de tiamina e 200 μg de biotina em 1 litro de água e ajustado para pH 7,7 com uma solução aquosa de hidróxido de sódio), seguido por agitação de cultura a 32°C por 48 horas.

[000146] O mesmo procedimento foi realizado usando Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 e a cultura obtida foi usada como um controle.

[000147] Depois de células terem sido removidas da cultura por centrifugação, as quantidades de L-arginina, L-ornitina e L-citrulina acumuladas no sobrenadante foram determinadas por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Os resultados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1

[000148] Como mostrado na Tabela 1, produção de L-arginina, L- ornitina e L-citrulina não foram confirmadas com as linhagens ATCC 13032 (controle), B26, B31, B2631 e R. Ao contrário, produção de L-arginina, L- ornitina e L-citrulina foram confirmadas com as linhagens RB26, RB31 e RB2631.

Exemplo 4

[000149] Construção de Linhagens Produzindo L-Ornitina Tendo uma Substituição de Aminoácido em ArgB (1) Construção de DNA para Construção de um Plasmídeo para Deleção de uma Sequência Interna de ArgF

[000150] DNA consistindo da sequência de nucleotídeos preparada pela adição de uma sequência etiqueta na sequência de nucleotídeos em posições 21 a 43 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 31 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 24) e DNA consistindo de uma sequência complementar à sequência de nucleotídeos preparada pela adição de uma sequência etiqueta na sequência de nucleotídeos em posições 1366 a 1385 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 31 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 25) foram sintetizados usando um sintetizador de DNA.

[000151] A sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 31 é uma sequência de nucleotídeos contendo a sequência de nucleotídeos de DNA codificando ArgF de Corynebacterium glutamicum. (2) Construção de um Plasmídeo para Deleção de uma Sequência Interna de ArgF: 1

[000152] O DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 foi preparado de acordo com o método de Saito, et al. [Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)].

[000153] PCR foi realizado usando o DNA cromossômico como um modelo, o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 24 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 25 como um conjunto de iniciadores, DNA polimerase Pfu turbo (Stratagene) e o tampão ligado. Um fragmento de DNA de 1,4 kb obtido pelo PCR foi tratado com BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), sujeito à eletroforese em gel de agarose, e extraído e purificado usando GENECLEAN Kit (BIO 101). O fragmento de DNA obtido foi misturado com pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) previamente clivado por BamHI, e reação de ligase foi realizada usando Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

[000154] Usando o produto de reação, Escherichia coli DH5α (Toyobo Co., Ltd.) foi transformada de acordo com o método descrito em Molecular Cloning, 3rd ed. A linhagem foi cultivada em meio de ágar LB contendo 50 μg/ml de ampicilina para selecionar um transformante. O transformante foi cultivado durante a noite usando meio LB contendo 50 μg/ml de ampicilina, e um plasmídeo preparado a partir da cultura obtida pelo método de SDS álcali (Molecular Cloning, 3rd ed.). O plasmídeo foi clivado por NcoI e sujeito à reação de ligase usando Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) por auto-circularização. Escherichia coli DH5α foi transformada usando o produto de reação e um plasmídeo foi preparado a partir do transformante obtido. A estrutura do plasmídeo foi avaliada usando enzimas de restrição, com as quais foi confirmado que o plasmídeo continha um fragmento de DNA caracterizado pelo fato de que 369 pares de bases foram deletadas no DNA codificando ArgF. (3) Construção de um Plasmídeo para Deleção de uma Sequência Interna de ArgF: 2

[000155] PCR foi realizado usando o plasmídeo obtido como um modelo, o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 24 e o DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 25 como um conjunto de iniciadores, DNA polimerase Pfu turbo (Stratagene) e o tampão ligado para obter um fragmento de DNA de 1,0 kb. O fragmento de DNA foi sujeito à reação na presença de Taq DNA polimerase (Boehringer Mannheim GmbH) e dATP a 72°C por 10 minutos para adicionar uma base de adenina na extremidade 3’. Reação de ligase foi realizada usando pESB30-T preparado no Exemplo 1, o fragmento de DNA tendo a adenina adicionada e Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.). O plasmídeo obtido foi designado como pEargF. (4) Construção de Linhagens Tendo uma Substituição de Aminoácido em ArgB e uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgF

[000156] Foi realizado o mesmo procedimento que em Exemplo 2 (1) exceto que as linhagens B26, B31, R, RB26, RB31 e ATCC 13032 foram usadas como hospedeiros e pEargF foi usado como um plasmídeo. Este procedimento produziu linhagens nas quais o DNA codificando ArgF no cromossomo foi substituído pelo DNA caracterizado pelo fato de que 369 pares de bases no DNA codificando ArgF foram deletadas, e as linhagens obtidas foram designadas como linhagens FB26, FB31, FR, FRB26, FRB31 e F, respectivamente.

Exemplo 5

[000157] Teste de Produção de L-Ornitina Usando Linhagens Tendo Substituições de Aminoácidos em ArgB e uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgF

[000158] As linhagens FB26, FB31, FR, FRB26, FRB31 e F preparadas em Exemplo 4 e a linhagem ATCC 13032 foram cultivadas separadamente em meio de ágar BY a 30°C por 24 horas. Cada uma das linhagens foi inoculada em um tubo de teste contendo 6 ml de um meio de semente (um meio que foi preparado pela adição de 10 g de carbonato de cálcio em um meio contendo 25 g de glicose, 0,5 g de dihidrogêniofosfato de potássio, 1,5 g de hidrogêniofosfato de dipotássio, 0,5 g de sulfato de magnésio, 20 g de peptona, 3 g de uréia, 50 μg de biotina e 0,3 g de L-arginina em 1 litro de água), seguido por agitação de cultura a 32°C por 24 horas. Cada uma das culturas de semente obtidas (2 ml) foi inoculada em um frasco com septos contendo 20 ml de um meio de cultura principal (um meio que foi preparado pela adição de 30 g de carbonato de cálcio em um meio contendo 100 g de glicose, 30 g de sulfato de amônio, 0,6 g de sulfato de magnésio, 0,5 g de dihidrogêniofosfato de potássio, 0,25 g de L-arginina, 16 mg de sulfato de ferro heptahidratado, 16 mg de sulfato de manganês pentahidratado, 4,9 mg de sulfato de zinco heptahidratado, 4,9 mg de cobre de manganês pentahidratado, 16 mg de cloreto de cálcio, 16 mg de β-alanina, 8 mg de cloridrato de tiamina, 180 μg de biotina e 16 g de licor de infusão de milho em 930 ml de água e ajustado para pH 7,2 com uma solução aquosa de hidróxido de sódio), seguido por agitação de cultura a 32°C por 48 horas.

[000159] Depois de células terem sido removidas da cultura por centrifugação, a quantidade de L-ornitina acumulada no sobrenadante foi determinada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Os resultados são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

[000160] Como está claro a partir da Tabela 2, a quantidade de produção de L-ornitina usando a linhagem FRB26 tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4 e deleções em ArgF e ArgR e a linhagem FRB31 tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 10 e deleções em ArgF e ArgR foi claramente maior do que aquela de L-ornitina usando as outras linhagens.

Exemplo 6

[000161] Construção de Linhagens Tendo uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgR Caracterizadas pelo Fato de que Alanina na posição 26 de ArgB é Substituída por Leucina ou Isoleucina (1) Construção de um Plasmídeo para Substituição de um Aminoácido em ArgB

[000162] DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos em posições 68 a 89 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 6 (a sequência de SEQ ID NO: 6 é uma sequência caracterizada pelo fato de que a região em posições 76 a 78 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é substituída por ctg e codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 5, em que alanina na posição 26 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituída por leucina) (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 26) e DNA consistindo da sequência de nucleotídeos em posições 65 a 87 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 6 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 27) foram sintetizados usando um sintetizador de DNA.

[000163] Da mesma maneira, DNA consistindo de uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos em posições 68 a 89 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 8 (a sequência de SEQ ID NO: 8 é uma sequência caracterizada pelo fato de que a região em posições 76 a 78 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 2 é substituída por atc e codifica a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 7, em que alanina na posição 26 da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 1 é substituída por isoleucina) (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 28) e DNA consistindo da sequência de nucleotídeos em posições 65 a 87 da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 8 (DNA consistindo da sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 29) foram sintetizados usando um sintetizador de DNA.

[000164] Foi realizado o mesmo procedimento que em Exemplo 1 (2) exceto que os DNAs consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 26 e 27 foram usados no lugar dos DNAs consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 15 e 16 para obter um fragmento de DNA de 1,0 kb tendo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 6. Separadamente, foi realizado o mesmo procedimento que em Exemplo 1 (2) exceto que os DNAs consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 28 e 29 foram usados no lugar dos DNAs consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 15 e 16 para obter um fragmento de DNA de 1,0 kb tendo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 8.

[000165] Foi realizado o mesmo procedimento que em Exemplo 1 (4) exceto que os fragmentos de DNA tendo respectivamente DNAs tendo as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 6 e 8 foram usados no lugar dos fragmentos de DNA tendo respectivamente DNAs tendo as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 4 e 10 para obter plasmídeos nos quais os DNAs tendo as sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 6 e 8 foram respectivamente incorporados em plasmídeo pESB30-T. Os plasmídeos obtidos foram designados como pEargB26L e pEargB26I, respectivamente. (2) Introdução de Substituição de um Aminoácido em ArgB em uma Linhagem Tendo uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgR

[000166] Foi realizado o mesmo procedimento que no Exemplo 2 (1) exceto que linhagem R foi usada como um hospedeiro e pEargB26L e pEargB26I foram usados como plasmídeos. Este procedimento produziu linhagens nas quais o DNA codificando ArgB no cromossomo da linhagem R foi substituído pelo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 6 e a linhagem na qual o DNA codificando ArgB no cromossomo da linhagem R foi substituído pelo DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 8. As linhagens foram designadas como linhagem RB26L e RB26I, respectivamente. (3) Teste de Produção de L-Arginina, L-Ornitina e L-Citrulina Usando Linhagens Tendo uma Substituição de um Aminoácido em ArgB e uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgR

[000167] A produtividade de L-arginina, L-ornitina e L-citrulina foram avaliadas da mesma maneira que no Exemplo 3 exceto que as linhagens RB26, RB26L e RB26I foram usadas.

[000168] Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3

[000169] Como está claro a partir da Tabela 3, ambas a linhagem RB26L tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 6 e a linhagem RB26I tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 8 produziram L-arginina, L-ornitina e L-citrulina tanto quanto a linhagem RB26 tendo o DNA tendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 4. As quantidades destes aminoácidos produzidos usando as linhagens RB26L e RB26I foram maiores do que aquelas usando a linhagem RB26.

Exemplo 7

[000170] Produção de L-Citrulina Usando Linhagens Tendo uma Substituição de um Aminoácido em ArgB e uma Deleção de uma Sequência Interna de ArgG

[000171] Iniciadores foram sintetizados baseados na sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 32 contendo a sequência de nucleotídeos de DNA codificando ArgG de Corynebacterium glutamicum. PCR é realizado usando os iniciadores obtidos e o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 como um modelo para construir um plasmídeo contendo um fragmento de DNA tendo uma deleção de cerca de 400 pares de bases no DNA codificando ArgG.

[000172] Um fragmento de DNA tendo uma deleção de cerca de 400 pares de bases no DNA codificando ArgG é preparado a partir do plasmídeo, e uma base de adenina é adicionada à extremidade 3’ do fragmento de DNA. Reação de ligase é realizada usando pESB30-T preparado em Exemplo 1, o fragmento de DNA tendo a adenina adicionada e Ligation Kit Ver. 1 (Takara Shuzo Co., Ltd.), e o plasmídeo obtido é designado como pEargG.

[000173] O processo acima pode ser realizado de acordo com o método descrito no Exemplo 4.

[000174] O mesmo procedimento que no Exemplo 2 (1) é realizado exceto que as linhagens B26, B31, R, RB26, RB31 e ATCC 13032 são usadas como hospedeiros e pEargG é usado como plasmídeo. Este procedimento produz linhagens nas quais o DNA codificando ArgG no cromossomo é substituído pelo DNA caracterizado pelo fato de que 400 pares de bases são deletadas no DNA codificando ArgG, e as linhagens obtidas são designadas como linhagens GB26, GB31, GR, GRB26, GRB31 e G, respectivamente.

[000175] As linhagens GB26, GB31, GR, GRB26, GRB31 e G e ATCC 13032 são cultivadas separadamente em meio de ágar BY a 30°C por 24 horas. Cada uma das linhagens é inoculada em um tubo de teste contendo 6 ml de um meio de semente (um meio que é preparado pela adição de 10 g de carbonato de cálcio em um meio contendo 25 g de glicose, 0,5 g de dihidrogêniofosfato de potássio, 1,5 g de hidrogêniofosfato de dipotássio, 0,5 g de sulfato de magnésio, 20 g de peptona, 3 g de uréia, 50 μg de biotina e 0,3 g de L-arginina em 1 litro de água), seguido por agitação de cultura a 32°C por 24 horas. Cada uma das culturas de semente obtidas (2 ml) é inoculada em um frasco com septos contendo 20 ml de um meio de cultura principal (um meio que é preparado pela adição de 30 g de carbonato de cálcio em um meio contendo 100 g de glicose, 30 g de sulfato de amônio, 0,6 g de sulfato de magnésio, 0,5 g de dihidrogêniofosfato de potássio, 0,25 g de L-arginina, 16 mg de sulfato de ferro heptahidratado, 16 mg de sulfato de manganês pentahidratado, 4,9 mg de sulfato de zinco heptahidratado, 4,9 mg de cobre de manganês pentahidratado, 16 mg de cloreto de cálcio, 16 mg de β-alanina, 8 mg de cloridrato de tiamina, 180 μg de biotina e 16 g de licor de infusão de milho em 930 ml de água e ajustado para pH 7,2 com uma solução aquosa de hidróxido de sódio), seguido por agitação de cultura a 32°C por 48 horas.

[000176] Depois de células terem sido removidas da cultura por centrifugação, a quantidade de L-citrulina acumulada no sobrenadante foi determinada por cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Aplicabilidade Industrial

[000177] Em conformidade com a presente invenção, N-acetilglutamato quinase modificada e DNA codificando a N-acetilglutamato quinase modificada são fornecidos, e L-arginina, L-ornitina, ou L-citrulina pode ser eficientemente produzida usando um microorganismo tendo o DNA. TEXTO LIVRE DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 13 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 14 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 15 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 16 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 17 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 18 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 20 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 21 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 22 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 23 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 24 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 25 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 26 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 27 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 28 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético SEQ ID NO: 29 - Descrição de Sequência Artificial: DNA Sintético

Claims (7)

1. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9 e 11, e possui atividade N-acetilglutamato quinase.

2. DNA, caracterizado pelo fato de ter uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo consistindo das sequências de nucleotídeos mostradas em SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10 e 12.

3. Microorganismo pertencente ao gênero Corynebacterium, caracterizado pelo fato de ter o DNA como definido na reivindicação 2; em que o microrganismo é Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

4. Microorganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a atividade de repressão transcricional do repressor de arginina no operon de arginina é reduzida ou perdida.

5. Microorganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que atividade de ornitina carbamoil transferase é reduzida ou perdida.

6. Microorganismo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que atividade de argininosuccinato sintase é reduzida ou perdida.

7. Processo para produzir L-arginina, L-ornitina ou L-citrulina, caracterizado pelo fato de compreender cultivar o microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 6 em um meio, permitindo que L-arginina, L-ornitina ou L-citrulina se formem e acumulem na cultura, e recuperando L-arginina, L-ornitina ou L-citrulina da cultura.