CN104031933A - 一株l-鸟氨酸合成菌的构建及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明敲除钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)SYPA5-5中编码鸟氨酸乙酰转移酶(Ornithinecarbamoyltransferase，OTC)的argF基因，对获得的重组菌株进行发酵产L-鸟氨酸的研究，属于生物技术领域。首先，构建argF基因内缺失片段(△argF)，连接至pK18mobsacB中获得重组质粒pK18mobsacB△argF，将其电转入SYPA5-5中，经两次同源重组，筛选获得重组菌株SYPA5-5△argF。其次，考察不同营养条件对重组菌株生长及L-鸟氨酸积累的影响，发现添加0.3g/LL-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需，利用糖质原料，发酵96h，L-鸟氨酸产量可达21.5g/L，糖酸转化效率为0.17g(L-ornithine)/g(glucose)。

Description

一株 L- 鸟氨酸合成菌的构建及其应用方法

技术领域

敲除钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5中编码鸟氨酸乙酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase，OTC)的argF基因，并对获得的重组菌株进行发酵产L-鸟氨酸的研究，属于生物技术领域。

背景技术

L-鸟氨酸(L-ornithine)为非蛋白质氨基酸，是尿素循环的重要中间代谢产物，因具有重要的生理功能而广泛应用于食品、医药及化工领域。微生物发酵法有节能环保、易提取分离等优点，具有重要的工业化应用价值。

实现微生物发酵法生产氨基酸的关键在于高产菌株的选育。代谢工程作为理性育种的技术手段被广泛应用于工业微生物的改造。目前，该技术已应用于L-鸟氨酸高产菌株的构建。Lee YJ等构建的大肠杆菌W3110 (△argF△argR△proB△speF，ParaB-arg214)在添加谷氨酸的条件下发酵，可积累13.2 mg/g (dry cell weight) L-鸟氨酸； Jiang LY等构建的谷氨酸棒杆菌ATCC13032 (△argF△argR△proB△speE)，经生长偶联的菌株驯养后，可积累17.2 g/L L-鸟氨酸。但上述L-鸟氨酸生产菌株仍存在产量不高或携带外源质粒等问题，限制了其工业化应用。

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5是本研究室经过多级诱变筛选获得的一株L-精氨酸高产菌株，利用葡萄糖为碳源，摇瓶发酵96 h可积累约30 g/L L-精氨酸。L-精氨酸的生物合成是以L-谷氨酸为前体，先通过5步酶促反应生成L-鸟氨酸；再经鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase，OTC)将L-鸟氨酸转化为L-瓜氨酸；最后，在精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase，ASS)和精胺琥珀酸裂解酶 (Argininosuccinase，ASL)催化下合成L-精氨酸。前期研究表明，SYPA5-5发酵生产L-精氨酸的过程中，中间代谢物L-鸟氨酸的积累量较低。本研究以SYPA5-5为出发菌株，敲除其编码鸟氨酸氨甲酰转移酶的基因argF，阻断L-鸟氨酸进一步合成L-精氨酸的途径，构建了能够积累L-鸟氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF，并研究了其发酵性能，为实现采用糖质原料直接发酵生产上述氨基酸奠定了基础。

发明内容

本发明提供合成L-鸟氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5△argF的构建及发酵生产L-鸟氨酸的方法。该菌株是利用SYPA5-5为出发菌株，以自杀质粒pK18mobsacB对其argF基因进行敲除后获得，在添加300 mM L-精氨酸条件下，利用糖质原料发酵96 h，积累21.5 g/L L-鸟氨酸，该菌株已经保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存号为CGMCCNo.8637，保存日期为2013年12月25日。本发明提供的方法属于基金项目：国家863资助项目（No. 2012AA022102）的研究内容。具体发明方案如下：

1. 重组菌株SYPA5-5△argF的构建

以SYPA5-5基因组DNA为模板，分别以F1/F2、F3/F4为引物，扩增argF上、下游片段，通过crossover PCR扩增获得argF基因内缺失片段(△argF)。将获得的△argF连入pK18mobsacB质粒得到重组质粒pK18mobsacB△argF。将重组质粒电转化入SYPA5-5感受态细胞中，经两次同源重组，对获取的转化子，提取基因组，进行PCR扩增并送至上海生工测序。

引物序列如下：

2. 不同浓度L-精氨酸对SYPA5-5△argF发酵积累L-精氨酸的影响

采用摇瓶分批发酵的方式对SYPA5-5△argF进行发酵。首先，在发酵培养基中添加0-0.5 g/L L-精氨酸，考查其添加对SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累的影响，并确定有利于菌体生长及L-鸟氨酸积累的浓度范围；其次，在该范围内选择不同L-精氨酸添加浓度，以获得最适添加浓度。具体发酵方案如下：

(1) 摇瓶种子培养：保存于斜面的SYPA5-5△argF，划线到肉汤平板上，置于30℃培养箱中培养24 h，挑取菌体，接种至摇瓶种子培养基中，置于30 ℃ 120 rpm往复式摇床上培养12-16 h，至OD_562nm约为15。肉汤培养基组分 (g/L)：葡萄糖 20；蛋白胨 10；牛肉膏 10；酵母粉5；NaCl 5；琼脂粉20；pH 7.0～7.2；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。种子培养基组分(g/L)：葡萄糖 30；玉米浆 20；(NH₄)₂SO₄ 20；KH₂PO₄ 1；MgSO₄·7H₂O 0.5；尿素 1.5；pH 7.0～7.2；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

(2) 摇瓶分批发酵：在发酵培养基中分别添加不同浓度L-精氨酸，将培养好的种子按5%的接种量接种于摇瓶发酵培养基中，置于30 ℃ 120 rpm往复式摇床上培养96 h，发酵至24 h补加50 g/L葡萄糖。摇瓶发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖(分消) 100；酵母粉 10；(NH₄)₂SO₄ 50；KH₂PO₄ 1.5；MgSO₄.7H₂O 0.5；FeSO₄·7H₂O 0.02；MnSO₄·H₂O 0.02；生物素 8 ×10^-5；L-组氨酸5×10^-4；CaCO₃ 30；pH 7.0～7.2；115 ℃高压蒸汽灭菌7 min。

(3) 发酵参数检测：

A. 生物量：用0.25 mol/L HCl对发酵液进行适当倍数稀释后，紫外分光光度计测定OD_562nm，OD值与菌体干重的关系为1 OD_562nm = 0.375 g(DCW)/L。

B. 游离氨基酸：将发酵液进行适当倍数稀释后，用异硫氰酸苯酯对发酵液中氨基酸进行衍生化，用HPLC分析各游离氨酸含量。

C. 葡萄糖含量：将发酵液进行适当倍数稀释后，用DNS法测定。

3. 菌株发酵过程比较

采用摇瓶发酵分批发酵模式，比较出发菌株SYPA5-5及重组菌株SYPA5-5△argF的发酵过程。按照2中所述方法进行发酵，在发酵过程中，每隔12 h取样，检测相关发酵参数。

附图说明

图1 重组菌株SYPA5-5△argF的构建。

(A) argF基因内缺失片段(△argF)的构建1: Marker; 2: argF上游片段; 3: argF下游片段; 4:△argF片段；

(B) 重组质粒pK18mobsacB△argF的构建1: Marker; 2: pMD 19-T-△argF单酶切; 3: pMD 19-T-△argF双酶切; 4: pK18mobsacB△argF的单酶切; 5: pK18mobsacB△argF的双酶切;

(C) 重组菌株SYPA5-5△argF的验证1: Marker; 2:以pK18mobsacB△argF为模板扩增△argF片段(对照); 2: 以重组菌株SYPA5-5△argF基因组DNA为模板扩增△argF片段;

图2不同浓度L-精氨酸对SYPA5-5△argF生长(白色)及产L-鸟氨酸(黑色)的影响。

图3 SYPA5-5 (A, a)与SYPA5-5△argF (B, b)摇瓶发酵过程参数及发酵结束后发酵液的液相图谱分析。■ L-精氨酸或L-鸟氨酸产量；▲ 菌体生物量；● 葡萄糖含量。

具体实施方式

实施实例1. 重组菌株SYPA5-5△argF的构建

(1) 重组敲除质粒pK18mobsacB-argF的构建

以SYPA5-5基因组DNA为模板，分别以F1/F2、F3/F4为引物 (表1)，扩增argF上游片段为517 bp，下游片段450 bp，通过crossover PCR扩增获得argF基因内缺失片段(△argF) 950 bp (图1A)。将获得的△argF连入pK18mobsacB质粒得到重组质粒pK18mobsacB△argF (图1B)。

表1 本研究所用的引物

(2) 重组菌株SYPA5-5△argF获取、筛选及验证

将重组质粒pK18mobsacB△argF电转化入SYPA5-5感受态细胞中，经两次同源重组，对获取的转化子，提取基因组，进行PCR扩增并送至上海生工测序，结果表明，成功构建了敲除argF的重组菌株SYPA5-5△argF (图1C)。

实施实例2. 重组菌株SYPA5-5△argF发酵产L-鸟氨酸的研究

(1) 不同浓度L-精氨酸对重组菌株SYPA5-5△argF发酵产L-鸟氨酸的影响

在发酵培养基中添加0-5 g/L的 L-精氨酸，摇瓶发酵96 h，结果如图2A所示：在添加0-0.5 g/L L-精氨酸时，菌体生物量及L-鸟氨酸的产量随L-精氨酸浓度的增加而增加；随着添加浓度继续增加，菌体生物量及L-鸟氨酸的产量略有下降。进一步研究了添加0-0.5 g/L的L-精氨酸的影响(图2B)，当L-精氨酸浓度为0.3 g/L时，重组菌株SYPA5-5△argF的生物量及L-鸟氨酸的产量达到最高值，分别为24.4 g/L和21.3 g/L，较不添加L-精氨酸时的生物量(12.5 g/L)和L-鸟氨酸产量(10.7 g/L)均提高约1倍。

(2) 重组菌株SYPA5-5△argF摇瓶发酵过程

分别考察出发菌株SYPA5-5及重组菌株SYPA5-5△argF的发酵过程，结果如图3所示。添加0.3 g/L L-精氨酸后，SYPA5-5△argF的生长速率与SYPA5-5基本保持一致，发酵结束后其生物量达23.3 g/L，与后者的25.5 g/L相当。

SYPA5-5可大量积累L-精氨酸，至发酵结束时产量达29.6 g/L (图3A)，同时，积累一定量的L-瓜氨酸(2.1 g/L)及L-鸟氨酸(1.8 g/L)，且L-赖氨酸及L-异亮氨酸作为副产物也有少量积累(图3a)。SYPA5-5△argF可大量积累L-鸟氨酸，至发酵结束时产量达21.5 g/L (图3B)，但发酵液中无L-瓜氨酸及L-精氨酸的积累，该结果表明，在L-精氨酸生产菌株SYPA5-5中敲除argF基因，可阻断L-鸟氨酸进一步转化为L-瓜氨酸的合成途径，进而实现L-鸟氨酸的大量积；该菌发酵液中L-赖氨酸的积累量较出发菌株略低，但L-谷氨酸和L-天冬氨酸的积累量较出发菌株略高(图3b)。

至发酵结束， SYPA5-5消耗约94%的葡萄糖，糖酸转化效率为0.22 g (L-arginine)/g (glucose)；SYPA5-5△argF消耗约84%的葡萄糖，较出发菌株葡萄糖消耗量略低，糖酸转化率为0.17 g (L-ornithine)/g (glucose)。上述结果表明，重组菌株可利用葡萄糖为碳源直接发酵合成大量L-鸟氨酸，但由于基因敲除后对菌体生长产生影响，而导致葡萄糖的利用效率存在差异。

Claims (4)

1.构建一株利用糖质原料发酵大量积累L-鸟氨酸的菌株的方法，其特征为：出发菌株分类命名为钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5∆argF，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保存号为CGMCC No.8637，保存日期为2013年12月25日。

2.权利要求1中所述的方法，其特征为：利用高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5为出发菌株，以pK18mobsacB质粒对其编码鸟氨酸乙酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase，OTC)的argF基因进行敲除，筛选获得的重组菌株可积累L-鸟氨酸。

3.利用糖质原料发酵大量积累L-鸟氨酸的方法，其特征为：

(1) 种子活化：将斜面保存的菌种划线于肉汤斜面中，30℃静置培养24 h；肉汤培养基组分 (g/L)：葡萄糖 20；蛋白胨 10；牛肉膏 10；酵母粉5；NaCl 5；琼脂粉20；pH 7.0～7.2；121 ℃ 高压蒸汽灭菌20 min；

(2) 摇瓶种子：将活化后的种子，挑取一环接种于摇瓶种子培养基中，30℃ 120 rpm往复式摇床培养 12-16 h，至OD_562nm约为15；种子培养基组分(g/L)：葡萄糖 30；玉米浆 20；(NH₄)₂SO₄ 20；KH₂PO₄ 1；MgSO₄·7H₂O 0.5；尿素 1.5；pH 7.0～7.2；121 ℃高压蒸汽灭菌20 min；

(3) 摇瓶发酵：将液体种子按5%的接种量接种至发酵培养基，30℃ 120 rpm往复式摇床培养 96 h，发酵至24 h补加50 g/L葡萄糖；摇瓶发酵培养基组分 (g/L)：葡萄糖(分消) 100；酵母粉 10； (NH₄)₂SO₄ 50；KH₂PO₄ 1.5；MgSO₄.7H₂O 0.5；FeSO₄·7H₂O 0.02；MnSO₄·H₂O 0.02；生物素 8 ×10^-5；L-组氨酸5×10^-4；CaCO₃ 30；pH 7.0～7.2；115 ℃高压蒸汽灭菌7 min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征为：添加适量L-精氨酸以有利于菌体的生长及L-鸟氨酸的积累。