CN105349567A - 一种信号肽及其在利用魔芋粉产l-鸟氨酸重组菌中的应用 - Google Patents

Abstract

一种信号肽及其在利用魔芋粉产L-鸟氨酸重组菌中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过分子克隆技术和基因工程技术将经筛选和密码子优化后的信号肽即SEQ？ID？N0.1与来源B.subtilis？CCTCC？M？209200的β-甘露聚糖酶融合构建表达载体，在高产L-鸟氨酸菌种中表达。首次报道，以该信号肽介导分泌β-甘露聚糖酶的重组钝齿棒状杆菌CGMCC？NO.0890/pargI-pMSPman能利用廉价魔芋粉发酵生产L-鸟氨酸，最优碳源添加条件下5L发酵罐上产量为23.5g/L。

Description

一种信号肽及其在利用魔芋粉产L-鸟氨酸重组菌中的应用

技术领域

利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。

背景技术

魔芋粉，主要含魔芋葡甘露聚糖，其来源是非粮食作物魔芋。据相关报道在我国云南、贵州、四川、湖北和湖南的西部、陕西南部等地均适宜魔芋种植，目前已有一定的规模，仅湖北省魔芋种植面积就达41万亩。目前魔芋粉主要用于部分食品，其水解低聚糖可作为功能性食品，应用还不是很广泛。大部分微生物无法直接利用，因此，改造微生物利用魔芋作为碳源发酵生产高附加值产品具有良好的应用前景。现国内外已有报道，改造酿酒酵母直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产L-赖氨酸的相关报道，未见有以魔芋粉底物的相关微生物改造。

发明人前期工作已获得通过相关基因工程和代谢工程技术改造的高产L-鸟氨酸的菌种：钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI，并申请发明专利：一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产L-鸟氨酸的方法。

发明人获得的高产L-鸟氨酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产L-鸟氨酸，不能直接利用魔芋粉作为主要碳源。

L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，可促进蛋白质的合成以及糖类和脂质的分解代谢并对肝脏的解毒功能具有重要的保障作用。通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产L-鸟氨酸菌种，使其能利用魔芋粉作为碳源发酵生产L-鸟氨酸。对简化L-鸟氨酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。

发明内容

本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的β-甘露聚糖酶基因与来源谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，替换对比不同信号肽引导分泌β-甘露聚糖酶基因在不同L-鸟氨酸高产菌的效果，得到经密码子优化的β-甘露聚糖基因信号肽——MannaseSignalPeptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种新发现信号肽。

所述MSP核苷酸序列是SEQIDN0.1所示的序列。

本发明在已有高产L-鸟氨酸菌种的基础上，通过基因工程技术不同信号肽引导分泌β-甘露聚糖基因在构建的不同L-鸟氨酸高产菌中表达。使其能以魔芋粉和葡萄糖作为混合碳源发酵生产L-鸟氨酸。

所述高产L-鸟氨酸菌种为本研究室前期构建的钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI。

本发明构建的重组钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI-pMSPman优化后5L发酵96hL-鸟氨酸的产量为23.5±0.7g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为1358±3.7U/mL。(碳源添加方式：初始10g/L魔芋粉和50g/L葡萄糖，后期分批补加90g/L魔芋粉)。

所述的技术方案：

1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。

2.重组菌的构建

从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下过夜连接。将连接产物用CaCl₂转化法转入E.coliBL21，获得含重组质粒的E.coliBL21。提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将含15％甘油的重组菌液保存-70℃冰箱。

3.重组菌的产酸培养

将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为可溶性淀粉和葡萄糖混合)，0.8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量(L-鸟氨酸及相关氨基酸等)。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。

4.重组菌的产酶培养

将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为葡萄糖)，0.8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发酵液测其酶活和蛋白含量。

具体实施方式

实施例1：信号肽引物与β-甘露聚糖酶串联的引物设计

根据NCBI上公布的相关基因序列和β-甘露聚糖酶基因序列设计信号肽和基因串联的大片段引物。

P1:pMSPmanHindIIIF

5’-CCCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCT

TCCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTCATACTGTGTCGCCTGTGAATC-3’

P2:pMSPmanHindIIIR

5’-CCCAAGCTTTTACTCAACGATTGGCGTTA-3’

实施例2：β-甘露聚糖酶基因信号肽替换及其克隆

[1]从B.subtilisCCTCCM209200提取染色体作为模板DNA。

[2]根据NCBI网站上公布的β-甘露聚糖酶基因序列设计信号肽和基因串联的PCR引物。以B.subtilisCCTCCM209200的基因组为模板利用大片段引物PCR，得到带有经密码优化的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示Mannasesignalpeptide(简称MSP)信号肽的β-甘露聚糖酶基因。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O38.5μL，ExTaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，30s，56℃退火，30s，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；4℃，10min，一个循环(其中退火温度和延伸时间根据不同引物和基因进行相对的调节)。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

实施例3：重组质粒pDXW10-MSPman的构建

[1]构建重组质粒pMD18-T-MSPman，导入E.coliJM109。将[2]中PCR回收的产物与克隆载体pMD18-T连接，连接体系为solutionI5μL，目的基因4.8μL，pMD18-T质粒0.2μL，16℃过夜连接。连接接产物转化E.coilJM109，涂布于含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取单菌落到含100ug/mL氨苄青霉素的10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-MSPman，经PCR和酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[2]将[1]中提取的pMD18-T-MSPman质粒与表达载体pDXW10分别进行HindIII与EcoRI的双酶切,利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，获得重组质粒pDXW10-MSPman。上述重组质粒都通过PCR和酶切验证。

实施例4：重组质粒pDXW10-MSPman电转化至钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI

挑取钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI分别接种于10mLLB液体培养基摇瓶中，30℃摇床培养过夜，取100μL过夜培养的菌液，接种于50mL的感受态培养基中，30℃摇床培养4h至OD562nm＝0.9左右，用无菌管离心去上清，再用10％的甘油悬浮菌体并离心，重复此步骤3次。最后分装于1.5mL的离心管，加入3uL重组质粒，于电压1800V，50mS条件下电转化。迅速向将电转化完成的菌体中加入800uL的新鲜LBG培养基(0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％葡萄糖)，并放置46℃的水浴锅中静置6min，之后在30℃摇床培养3h左右，离心涂布于含卡那霉素抗性的平板。在30℃的恒温培养箱培养64h，挑取菌落形态正常的单克隆并进行培养。将培养后的单克隆进行质粒提取，酶切验证和PCR验证，得到阳性的重组菌株，并保藏于-70℃冰箱。

实施例5：重组钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI-pMSPman分泌的β-甘露聚糖酶酶活测定

在试管中加入2.0mL5.0g/L刺槐豆胶底物溶液，65℃预热10min，加入2.0mL经过适当稀释的粗酶液，65℃精确反应15min。立即加入5.0mLDNS试剂，振荡摇匀，沸水浴中放置10min，置于冰水中冷却，然后加水补齐至10.0mL并摇匀。空白对照以2.0mL水代替适当稀释的粗酶液，540nm处测定吸光值。结合甘露糖标准曲线计算酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，以每1min产生1μmol还原糖的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活力单位(U)。

实施例6：重组钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI-pMSPman的发酵培养

将重组钝齿棒状杆菌SYPA5-5/pMSPman-pargI种子液接种至魔芋粉培养基，在30℃，600r/min培养条件下进行发酵培养，96hL-鸟氨酸的产量为23.5g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为1610±3.8U/mL。

魔芋粉培养基(g/L)：

初始培养基中含有初始魔芋粉10，葡萄糖50，酵母粉8，(NH₄)₂SO₄20，K₂HPO₄1.5，MgSO₄·7H₂O0.5，FeSO₄·7H₂O0.02，MnSO₄·H₂O0.02，CaCO₃30。PH7.0～7.2；发酵12h后开始分批补加魔芋粉总补加量为90g/L。

对照组：

(1)采用类似的方法，仅仅是将核苷酸序列如SEQIDNO:1的信号肽，替换成β-甘露聚糖酶基因自身原有的信号肽(核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，发酵显示：L-鸟氨酸的产量为21±0.8g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活为1025±5.8U/mL

(2)采用类似的方法，仅仅是将核苷酸序列如SEQIDNO:1的信号肽，替换成如：谷氨酸棒状杆菌来源的表层蛋白信号肽PS(核苷酸序列为ATGTTTAACAACCGTATCCGCACTGCAGCTCTCGCTGGTGCAATCGCAATCTCCACCGCAGCTTCTGGCGTAGCTATCCCAGCATTCGCTCAGGAGACCACT)或者是枯草芽孢杆菌来源的α-淀粉酶信号肽AE(核苷酸序列为ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCG)，发酵显示：L-鸟氨酸的产量分别为17±1.5g/L和15±1.3g/L，发酵液中β-甘露聚糖酶的酶活分别为865±6.7U/mL和752±3.9U/mL。

实施例7：重组钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI-pMSPman的发酵

基于实验室前期申请：一种利用重组钝齿棒杆菌一步发酵法生产L-鸟氨酸的方法专利中的双pH调控策略。前期添加葡萄糖和少量魔芋粉有利于细胞生长和底物诱导β-甘露聚糖酶的分泌表达，后期分批补加魔芋粉可用于水解作为细胞碳源生产L-鸟氨酸。

实施例8：重组钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI-pMSPman发酵L-鸟氨酸测定

发酵液中的L-鸟氨酸含量采用Chinard比色法初步测定，同时相关样品通过氨基酸分析仪精确测定。

虽然本发明已以较佳实施例(以MSP信号肽和钝齿棒状杆菌CGMCCNO.0890/pargI为例)公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (15)

1.一种提高微生物利用魔芋粉合成产物的方法，其特征在于，所述方法是将信号肽与β-甘露聚糖酶基因融合，然后将融合片段连接到表达载体上并转化到宿主微生物内得到重组微生物，利用重组微生物在以魔芋粉为主要碳源的培养基中发酵生产产物；

所述信号肽的核苷酸序列是(a)～(d)中任意一项：

(a)SEQIDNO:1所示的序列，

(b)包含SEQIDNO:1所示的碱基序列、并且具有信号肽活性的DNA，

(c)包含在SEQIDNO:1所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、

并且具有信号肽活性的DNA，

(d)与SEQIDNO:1所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有信号肽活性/来源于枯草芽

孢杆菌属细菌的DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶基因来源于枯草芽孢杆菌属，但不限于枯草芽孢杆菌属。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产物为L-鸟氨酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为钝齿棒状杆菌，但不限于钝齿棒状杆菌属。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pXMJ19，但不限于pXMJ19。

6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌CGMCCNO.0890/pargI-pMSPman，是在CGMCCNO.0890/pargI的基础上表达了β-甘露聚糖酶基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中初始含有10g/L魔芋粉和50g/L葡萄糖，在发酵后期通过分批补料方法补加90g/L魔芋粉。

8.一种重组钝齿棒状杆菌，其特征在于，所述重组钝齿棒状杆菌表达与SEQIDNO:1的信号肽融合的β-甘露聚糖酶基因；所述信号肽与β-甘露聚糖酶基因融合后，连接到表达载体上并转化到宿主菌内。

9.一种能够利用魔芋粉和葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，将带有权利要求1所述经密码子优化的信号肽与β-甘露聚糖酶基因融合得到的MSPman基因构建重组质粒并转化至微生物体内获得。

10.权利要求2所述的β-甘露聚糖酶基因来源于B.subtilisJNA3-10，但不限于枯草芽孢杆菌属。

11.一种重组质粒，其特征在于，将权利要求2所述的重组基因MSPman与表达载体pXMJ19连接构建获得，但表达载体不限于pXMJ19。

12.一种重组钝齿棒状杆菌SYPA5-5/pargI-pMSPman，其特征在于，将权利要求4所述的重组质粒转化至钝齿棒状杆菌SYPA5-5/pargI中获得。

13.权利要求5所述的基因工程菌的应用，其特征在于，原始菌为产L-鸟氨酸的钝齿棒状杆菌SYPA5-5/pargI，但不限于钝齿棒状杆菌属。

14.权利要求5所述的基因工程菌的应用，其特征在于，能够利用廉价碳源魔芋粉生产L-鸟氨酸，但不限于生产L-鸟氨酸。

15.权利要求5所述的基因工程菌的应用，其特征在于，生产L-鸟氨酸的碳源添加方式为：优选初始10g/L魔芋粉和50g/L葡萄糖，后期分批补料90g/L魔芋粉。