CN105296523A - 一种信号肽及其在利用淀粉产γ-氨基丁酸重组菌中的应用 - Google Patents

Abstract

一种信号肽及其在利用淀粉产γ-氨基丁酸重组菌中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过分子克隆技术和基因工程技术将去除N端信号肽的α-淀粉酶的融合前期筛选出一条高效分泌α-淀粉酶的信号肽SEQ？ID？N0.1，构建表达载体，在高产γ-氨基丁酸的菌种中表达。首次报道，以该信号肽介导分泌α-淀粉酶的重组菌天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPamy能利用廉价淀粉发酵生产γ-氨基丁酸，最优碳源添加条件下5L发酵罐上产量为46.9g/L。

Description

一种信号肽及其在利用淀粉产γ-氨基丁酸重组菌中的应用

技术领域

利用一种信号肽使重组菌高效分泌特定酶代谢廉价碳源进行氨基酸生产的方法和高效生产某种蛋白的方法，属于基因工程、蛋白质与酶工程和代谢工程领域。

背景技术

淀粉，作为微生物工业碳源的主要来源，一般需要经过液化和糖化两个阶段才能为微生物所利用。能直接利用淀粉作为碳源的微生物主要有链霉菌属、解淀粉芽孢杆菌及各种霉菌，而大部分用于生产的菌种无法直接利用淀粉作为碳源。现国内外已有报道，改造酿酒酵母直接以淀粉为碳源生产乙醇，导入α-淀粉酶基因使谷氨酸棒状杆菌利用可溶性生产L-赖氨酸的相关报道。

基于本研究室已授权的专利(公开号：CN103243128A)，发明人保藏的高产γ-氨基丁酸菌种天津短杆菌SW07-1/pGAD。该菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产γ-氨基丁酸，不能直接利用淀粉作为主要碳源

发明人获得的高产γ-氨基丁酸的菌种只能以葡萄糖为主要碳源发酵生产γ-氨基丁酸，不能直接利用淀粉作为主要碳源。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)是天然存在于某些生物体内的非蛋白质氨基酸，其为哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质，具有抗焦虑、降血压、镇定安神、增强记忆、调节激素分泌、促进生殖、利尿，镇痛等生理功能，在食品、饲料、医药等领域都具有广泛的应用。通过基因工程和代谢工程技术进一步改造高产γ-氨基丁酸菌种，使其能利用淀粉作为碳源发酵生产γ-氨基丁酸。对简化γ-氨基丁酸生产工艺、节约生产成本有一定的参考应用价值。

发明内容

本发明通过基因工程技术将去除自身信号肽的α-淀粉酶基因与来源谷氨酸棒状杆菌和枯草芽孢杆菌的Sec和Tat两个主要分泌途径的十二条信号肽分别融合，并比对α-淀粉酶在γ-氨基丁酸高产菌种中的分泌效果，得到β-甘露聚糖基因的信号肽——MannaseSignalPeptide(MSP)为分泌胞外酶效果较好的一种新发现信号肽。

所述MSP核苷酸序列是SEQIDN0.1所示的序列。

本发明在已有高产γ-氨基丁酸菌种的基础上，通过基因工程技术将β-甘露聚糖基因的信号肽融合到去掉自身信号肽的α-淀粉酶基因，构建表达载体导入到γ-氨基丁酸高产菌中，并成功表达。使其能以可溶性淀粉和葡萄糖作为混合碳源进行γ-氨基丁酸发酵。

所述高产γ-氨基丁酸菌种为本研究室前期构建的天津短杆菌SW07-1/pGAD。

本发明构建的重组天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPamy优化后5L发酵96hγ-氨基丁酸发酵的产量为46.9±1.4g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活为1903±6.6U/mL。(碳源为50g可溶性淀粉和70g葡萄糖)。

所述的技术方案：

1.根据NCBI上公布的相关基因序列设计信号肽和目的基因融合引物。

2.重组菌的构建

从相关菌种中抽提染色体DNA为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，琼脂糖核酸凝胶电泳检验回收产物的浓度。用相同的限制性内切酶对相关表达载体和纯化后的PCR产物进行双酶切，琼脂糖核酸凝胶电泳检测酶切产物并用凝胶回收试剂盒对其回收，并用超微量分光光度计检测其浓度。将酶切后的载体和PCR产物按一定比例混合，在T4DNA连接酶的作用下过夜连接。将连接产物用CaCl₂转化法转入E.coliBL21，获得含重组质粒的E.coliBL21。提取质粒，通过单双酶切及PCR验证后用电转化方法将重组质粒导入相关菌种中。最后，将含15％甘油的重组菌液保存-70℃冰箱。

3.重组菌的产酸培养

将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为可溶性淀粉和葡萄糖混合)，0.8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发酵液利用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量(γ-氨基丁酸及相关氨基酸等)。发酵培养基具备微生物生长所需的营养成分，并通过相关优化。

4.重组菌的产酶培养

将重组菌接种于新鲜的LB+0.5％Glucose液体培养基中进行活化，接种量为1％。次日以1％转接于发酵培养基中(底物为葡萄糖)，0.8mMIPTG诱导表达，生长后期收集发酵液测其酶活和蛋白含量。

具体实施方式

实施例1：信号肽引物与α-淀粉酶串联的引物设计

根据NCBI上公布的相关基因序列和α-amyase基因序列设计信号肽和基因串联的大片段引物。

P1:pMSPamyHindIIIF

5’-CCAAGCTTATGTTCAAGAAGCACACCATCTCCCTGCTGATCATCTTCCTGCTGGCTT

CCGCTGTTCTGGCTAAGCCAATCGAGGCTGCCCCGCCCGGGGCGAAGGAC-3’

P2:pMSPamyBamHIR

5’-CGCGGATCCTTAGTTGCGCCAGGTGTCGTTGA-3

实施例2：α-淀粉酶基因的信号肽替换及其克隆

[1]从StreptomyceskathiraeCCTCCM2012432提取染色体作为模板DNA。

[2]根据NCBI网站上公布的α-淀粉酶基因序列设计信号肽和基因串联的PCR引物。以StreptomyceskathiraeCCTCCM2012432的基因组为模板利用大片段引物PCR，得到带有经密码优化的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示Mannasesignalpeptide(简称MSP)信号肽的α-淀粉酶基因。PCR扩增体系(50μL)：模板1μL，上下游引物各0.5μL，dNTPMix4μL，10×ExTaqBuffer5μL，灭菌ddH2O38.5μL，ExTaqDNA聚合酶0.5μL。PCR反应条件：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，30s，56℃退火，30s，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；4℃，10min，一个循环(其中退火温度和延伸时间根据不同引物和基因进行相对的调节)。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

实施例3：重组质粒pXMJ19-MSPamy的构建

[1]构建重组质粒pMD18-T-MSPamy，导入E.coliJM109。将[2]中PCR回收的产物与克隆载体pMD18-T连接，连接体系为solutionⅠ5μL，目的基因4.8μL，pMD18-T质粒0.2μL，16℃过夜连接。连接接产物转化E.coilJM109，涂布于含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑取单菌落到含100ug/mL氨苄青霉素的10mL液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-MSPamy，经PCR和酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于-70℃冰箱保藏。

[2]将[1]中提取的pMD18-T-MSPamy质粒与表达载体pXMJ19分别进行HindIII与BamHI的双酶切,利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，获得重组质粒pXMJ19-MSPamy。上述重组质粒都通过PCR和酶切验证。

实施例4：重组质粒pXMJ19-MSPamy电转化至天津短杆菌SW07-1/pGAD

挑取天津短杆菌SW07-1/pGAD接种于10mLLB液体培养基摇瓶中，30℃摇床培养过夜，取100μL过夜培养的菌液，接种于50mL的感受态培养基中，30℃摇床培养4h至OD562nm＝0.9左右，用无菌管离心去上清，再用10％的甘油悬浮菌体并离心，重复此步骤3次。最后分装于1.5mL的离心管，加入3uL重组质粒，于电压1800V，50mS条件下电转化。迅速向将电转化完成的菌体中加入800uL的新鲜LBG培养基(0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，0.5％葡萄糖)，并放置46℃的水浴锅中静置6min，之后在30℃摇床培养3h左右，离心涂布于含氯霉素抗性的平板。在30℃的恒温培养箱培养64h，挑取菌落形态正常的单克隆并进行培养。将培养后的单克隆进行质粒提取，酶切验证和PCR验证，得到阳性的重组菌株，并保藏于-70℃冰箱。

实施例5：重组天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPamy分泌的α-淀粉酶酶活测定

发酵液于4℃、8000r/min冷冻离心20min，取上清液即为粗酶液，采用Bernfeld改良法。在比色管中加入1mL2％淀粉溶液及1mL0.1mol/L、pH6.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入一定稀释倍数的酶液1mL，于40℃反应30min，加入2mLDNS试剂，沸水浴3min，待冷却后用水定容至25mL，在540nm下测定吸光值.以蒸馏水代替酶液为空白调零管，以发酵液代替酶液直接加DNS为对照组，每个样品都设定对照组以消除发酵液中的还原糖影响.酶活定义：在上述条件下单位体积酶液水解淀粉产生等价于1μmol麦芽糖的还原糖所需的酶量为1U。

实施例6：重组天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPamy的发酵培养

将重组天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPamy种子液接种至淀粉培养基，在30℃，600r/min培养条件下进行发酵培养，48hγ-氨基丁酸的产量为46.9±1.4g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活为1903±6.6U/mL。

淀粉培养基(g/L)：

可溶性淀粉50，葡萄糖70，玉米浆3，(NH4)2SO420，K2HPO41.5，MgSO4·7H2O0.8，FeSO4·7H2O0.02，MnSO4·H2O0.02，尿素5.5g/L，维生素B1200ug/L。PH7.0～7.2。

对照组：

(1)采用类似的方法，仅仅是将核苷酸序列如SEQIDNO:1的信号肽，替换成β-甘露聚糖酶基因自身原有的信号肽(核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，发酵显示：γ-氨基丁酸的产量为43±2.7g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活为1565±3.9U/mL

采用类似的方法，仅仅是将核苷酸序列如SEQIDNO:1的信号肽，替换成如：谷氨酸棒状杆菌来源的表层蛋白信号肽PS(核苷酸序列为ATGTTTAACAACCGTATCCGCACTGCAGCTCTCGCTGGTGCAATCGCAATCTCCACCGCAGCTTCTGGCGTAGCTATCCCAGCATTCGCTCAGGAGACCACT)或者是枯草芽孢杆菌来源的α-淀粉酶信号肽AE(核苷酸序列为ATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTACTGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTCATTTGGTTCTGGCAGGACCG)，发酵显示：γ-氨基丁酸的产量分别为39±2.3g/L和35±1.2g/L，发酵液中α-淀粉酶的酶活分别为1354±2.7U/mL和1132±5.6U/mL。

实施例7：重组天津短杆菌SW07-1/pGAD-pMSPamy发酵γ-氨基丁酸的测定

发酵液中的γ-氨基丁酸，及L-谷氨酸残余均通过氨基酸测定仪定时检测。

虽然本发明已以较佳实施例(以MSP信号肽和天津短杆菌SW07-1/pGAD为例)公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种信号肽在提高微生物利用淀粉合成产物上的应用方法，其特征在于，所述方法是将一种高效分泌信号肽与α-淀粉酶基因融合，然后将融合片段连接到表达载体上并转化到宿主微生物内得到重组微生物，利用重组微生物在以淀粉为碳源的培养基中发酵生产产物；

所述信号肽的核苷酸序列是(a)～(d)中任意一项：

(a)SEQIDNO:1所示的DNA；

(b)包含SEQIDNO:1所示的碱基序列、并且具有信号肽活性的DNA；

(c)包含在SEQIDNO:1所示的碱基序列中缺失、取代或添加至少1个碱基所得的碱基序列、并且具有信号肽活性的DNA；

(d)与SEQIDNO:1所示的碱基序列在严紧条件下杂交、并且具有信号肽活性/来源于枯草芽孢杆菌属细菌的DNA。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-淀粉酶基因来源于StreptomyceskathiraeCCTCCM2012432，但不限于链霉菌属。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产物为γ-氨基丁酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物为天津短杆菌，但不限于天津短杆菌属。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pXMJ19，但不限于pXMJ19。

6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌SW07-1/pMSPman-pgad，是在SW07-1/pGAD的基础上表达了α-淀粉酶基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中以50g/L可溶性淀粉和70g/L葡萄糖做为混合碳源。

8.一种重组天津短杆菌，其特征在于，所述重组天津短杆菌表达与SEQIDNO:1的信号肽融合的α-淀粉酶基因；所述信号肽与α-淀粉酶基因融合后，连接到表达载体上并转化到宿主菌内。