CN107674855A - 一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产γ‑氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用，通过将植物乳杆菌中合成γ‑氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶基因gadB与谷氨酸棒杆菌中合成L‑谷氨酸的谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表达并导入谷氨酸棒杆菌中，通过利用基因串联表达后的谷氨酸棒杆菌进行发酵生产γ‑氨基丁酸的产γ‑氨基丁酸能够有效实现通过生物法来高效生产γ‑氨基丁酸的目的，不仅安全可靠还能够明显降低生产成本。

Description

一种产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法 和应用。
背景技术
γ-氨基丁酸(简称GABA)是天然的一种非蛋白质氨基酸[1]，中枢神经系统中一种重要的 抑制性神经递质[2]，广泛应用于食品、饲料、医药等领域，能有效抗焦虑、降血压、提高记 忆能力、调节激素分泌水平、促进生殖、镇痛等生理功能，其市场需求量逐年增多[3]。
目前，GABA的制备主要通过化学合成法、生物转化法和微生物直接发酵法[4-7]，化学合 成制备GABA的反应条件要求高，对环境造成比较大的污染，而且收率较低，产品的安全性 较差，获得的产品仅能在化工与医药领域应用，不能应用于食品与饲料行业。而通过植物生 长富集γ-氨基丁酸则周期长，含量很低。生物转化法通过利用超表达微生物中的谷氨酸脱羧 酶催化L-谷氨酸脱羧生产GABA，需在反应体系中添加外源的L-谷氨酸，虽然环境污染较少 但其生产成本也比较高。江南大学田灵芝等[8]人将植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因在大肠杆 菌进行GABA高效率生产，通过补加L-谷氨酸底物GABA转化浓度达204.5g/L，虽然产率 较高但由于大肠杆菌为非安全性微生物，仅能应用于化工领域，而浙江大学黄俊等人[9]经筛 选诱变得到一株安全乳酸菌，在3.7L发酵罐中GABA积累量达到76.36g/L，但产率较低， 无法进行大规模化生产。孙红梅等[10]利用产精氨酸钝齿棒杆菌为宿主菌进行谷氨酸脱羧酶基 因整合及精氨酸代谢流的改造实现了单菌发酵生产，但产量较低达8.28g/L。如何利用安全微 生物如谷氨酸棒杆菌直接发酵高产GABA是本研究的目标。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种工业化生产上应用广泛的一种氨基 酸生产菌，它是一种好氧的革兰氏阳性菌，在糖蜜玉米浆等廉价培养基中就能生长，大规模 应用于食品、医药、饲料等领域，无安全问题。现阶段工业化生产L-谷氨酸、L-赖氨酸、L- 缬氨酸等氨基酸生产菌大都为谷氨酸棒杆菌[11-12]。目前国内外在谷氨酸棒状杆菌代谢工程的 研究中并没有报道在该菌株中含有谷氨酸脱羧酶编码基因[13]。
本实验室前期筛选到的植物乳杆菌具有高产GABA能力，谷氨酸棒杆菌SF016是本研究 室通过筛选及多次诱变获得的一株高产L-谷氨酸的谷氨酸棒杆菌温敏突变株，可利用葡萄糖、 糖蜜等廉价原料发酵获得将近55g/l的L-谷氨酸。在谷氨酸棒杆菌中，谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，由gdh编码，简称GDH)是谷氨酸代谢合成途径的关键酶之一[14]，该酶可以 催化α-酮戊二酸还原生成L-谷氨酸，因此过表达该酶基因有望达到提高L-谷氨酸产量的目的。 本论文准备在谷氨酸棒杆菌SF016基础上，利用它自身合成的谷氨酸作为前体，通过转入谷 氨酸脱氢酶基因(Glutamate decarboxylase，由gadB编码，简称GAD)进一步提高其合成L- 谷氨酸能力同时表达外源的谷氨酸脱羧酶编码基因，将谷氨酸直接转变成γ-氨基丁酸，完成 γ-氨基丁酸在单个微生物细胞内的从头生物合成。相对于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨 酸钠为前体物质的生物转化法，这种生产方式的成本明显降低，且产品的安全性高，可用于 食品、饲料或医药等行业。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的在于提供一种利用基因串联表达技术将合成γ-氨基丁酸的谷氨酸脱羧酶基 因gadB与合成L-谷氨酸的谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表达并导入谷氨酸棒杆菌中进行 发酵生产γ-氨基丁酸的产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用。
为了实现上述的技术目的，本发明的技术方案为：
一种产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌SF016(corynebacterium glutamicum SF016)，已保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心中，其保藏编号 为CCTCC NO：M2017255，保藏日期为2017年5月12日。
进一步，所述的谷氨酸棒杆菌导入有来源自植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因。
一种构建产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的方法，其包括如下步骤：
(1)引物的设计
根据基因数据库GenBank中登记的谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸脱氢酶gdh基因序列设计 PCR所需的引物P1gdh和P2gdh；所述引物P1gdh的基因序列为CGGAATTCATGACAGTTGATGAGCAGGTCT，其中下划线为EcoRⅠ的酶切点；所述引物P2gdh的基因 序列为GCGTCGACTTAGATGACGCCCTGTGCCAGCA，其中下划线为sal Ⅰ的酶切点；
根据基因数据库GenBank中登记的植物乳杆菌菌株的谷氨酸脱羧酶gadB基因序列设计 PCR所需的引物P1gadB和P2gadB；所述引物P1gadB的基因序列为：CGGAATTCATGGCAATGTTATACGGTAAAC，其中下划线为EcoRⅠ的酶切点；所述引物 P2gadB的基因序列为GCGTCGACTCAGTGTGTGAATAGGTATTTC，其中下划线为sal Ⅰ的 酶切点；
根据基因数据库GenBank中登记的谷氨酸棒杆菌表达质粒pZ8-1的启动子ptac基因序列 设计引物P1tacgad；所述引物P1tacgad的基因序列为GCGTCGACTGACAATTAATCATCGGCTCGTA，其中下划线为sal Ⅰ的酶切点；
(2)基因片段扩增和表达载体的初步构建
以植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因表达载体pET28a-gadB为模版，通过FCR法，采用引 物P1gadB和引物P2gadB对谷氨酸脱羧酶gadB基因片段进行扩增；
以谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸脱氢酶gdh基因组DNA作为模版，通过FCR法，采用引物P1gdh和引物P2gdh对谷氨酸脱氢酶gdh基因片段进行扩增；
将上述通过PCR法扩增的gadB基因片段和gdh基因片段分别连接到穿梭质粒pZ8-1的 基因序列中，构建得到质粒pZ8-gadB和质粒pZ8-gdh，再以引物P1tacgdh和引物P2gdh为引 物，以质粒pZ8-gdh为模版，扩增携带tac启动子的谷氨酸脱氢酶gdh基因，然后将其连接到 克隆载体Pmd18-T simple T中进行构建表达载体T-tacgdh，在对其进行基因测序；
(3)串联表达载体pZ8-gadB-tacgdh的构建
将步骤(2)制得的质粒pZ8-gadB与表达载体T-tacgdh分别进行克隆，并将其制得的阳 性克隆质粒分别用限制性内切酶sal Ⅰ在37℃水浴条件下进行过夜单酶切，其中酶切体系为 20μL ddH2O、20μL质粒pZ8-gadB或表达载体T-tacgdh、5μL 10×H buffer缓冲液、5μL限 制性内切酶sal Ⅰ；
酶切处理完毕后，分别切胶回收酶切质粒pZ8-gadB和表达载体T-tacgdh的酶切基因片段 tacgdh进行磷酸化处理，再将其用于连接反应构建重组的串联表达载体pZ8-gad-tacgdh，其中 连接反应体系为4μL ddH2O、1μL经sal Ⅰ酶切后的酶切质粒pZ8-gad、10μL经sal Ⅰ酶切 后的酶切基因片段tacgdh、2μL 10×ligase buffer缓冲液、3μLDNA ligase，连接反应条件为 16℃过夜连接；
将构建好的串联表达载体pZ8-gad-tacgdh转入大肠杆菌感受态细胞内，并将其置于摇床 中，在37℃、120rmp的条件下进行摇动培育1h，对感受态细胞进行复苏处理，然后取100 μL复苏处理后的感受态细胞接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB平板上，然后将其置 于37℃的恒温培养箱中倒置培养16h，培养结束后，挑单菌落接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下，以250r/min的摇瓶速度进行培养过夜，然后将培养后的质粒提取利用限制性内切酶EcoRI酶切质粒并筛选出经克隆的正相连接的阳性表达 载体pZ8-gad-tacgdh，并将酶切验证正确的重组质粒pZ8-gad-tacgdh送检进行测序鉴定；
(4)gadB和gdh基因过表达菌株的构建
采用电转化法将酶切验证正确的重组质粒pZ8-gad-tacgdh导入谷氨酸棒杆菌的感受态细 胞中，并在含有20μg/mL的Km LBG平板上进行筛选阳性菌株，再提取质粒进行PCR和酶 切验证，最终筛选得到具有gadB和gdh基因的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg，即所述的产γ-氨基 丁酸的谷氨酸棒杆菌。
一种应用上述产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌进行生产γ-氨基丁酸的方法，其包括如下步 骤：
(1)将谷氨酸棒杆菌SF016-pgg接种至LBG培养基上进行培养；
(2)将经平板培养后的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg接种至种子培养基中进行培养；
(3)将种子培养基中接种有谷氨酸棒杆菌SF016-pgg的种子液接种到装有发酵培养基的发酵 罐中，其中种子液的转接量为15％，在发酵过程中，将溶氧量控制在20％～40％，其中发酵 时间为0～12h时，发酵罐的培养温度控制在32℃，之后再将发酵罐的培养温度控制在37℃ 进行继续培养，并将发酵反应体系的pH控制在5.0～7.0，发酵时间为40h。
进一步，所述的步骤(3)还包括：在发酵时间为0～25h时，流加质量百分浓度为25％ 的氨水和2M盐酸将发酵体系的pH控制在6.8～7.0，之后继续流加质量百分浓度为25％的氨 水和2M盐酸将发酵体系的pH控制在5.0～6.0。
进一步，所述的步骤(3)还包括：在发酵过程中通过流加质量百分浓度为65％的葡萄糖 将发酵体系的残糖浓度控制在0.5％～1.5％，其中发酵体系的初始葡萄糖浓度为3％。
进一步，所述的步骤(3)还包括：在发酵30h后，往发酵体系中加入0.1mol的PLP。
进一步，所述步骤(1)的LBG培养基的原料包括如下质量百分含量的组分：
进一步，所述步骤(2)的种子培养基的组分及其组分浓度如下：
进一步，所述步骤(3)的发酵培养基的组分及其组分浓度如下：
采用上述的技术方案，本发明的有益效果为：通过将植物乳杆菌中合成γ-氨基丁酸的谷 氨酸脱羧酶基因gadB与谷氨酸棒杆菌中合成L-谷氨酸的谷氨酸脱氢酶基因gdh进行串联表 达并导入谷氨酸棒杆菌中，通过利用基因串联表达后的谷氨酸棒杆菌进行发酵生产γ-氨基丁 酸的产γ-氨基丁酸能够有效实现通过生物法来高效生产γ-氨基丁酸的目的，不仅安全可靠 还能够明显降低生产成本。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对发明做进一步的阐述：
图1为本发明经基因重组的串联表达载体pZ8-gad-tacgdh的酶切谱图；
图2为本发明谷氨酸棒杆菌SF016-pgg的发酵过程曲线图；
图3为未经基因重组的谷氨酸棒杆菌SF016的发酵过程曲线图。
具体实施方式
一种构建产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的方法，其包括如下步骤：
(1)引物的设计
根据基因数据库GenBank中登记的谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸脱氢酶gdh基因序列设计 PCR所需的引物P1gdh和P2gdh；所述引物P1gdh的基因序列为CGGAATTCATGACAGTTGATGAGCAGGTCT，其中下划线为EcoRⅠ的酶切点；所述引物P2gdh的基因 序列为GCGTCGACTTAGATGACGCCCTGTGCCAGCA，其中下划线为sal Ⅰ的酶切点；
根据基因数据库GenBank中登记的植物乳杆菌菌株的谷氨酸脱羧酶gadB基因序列设计 PCR所需的引物P1gadB和P2gadB；所述引物P1gadB的基因序列为：CGGAATTCATGGCAATGTTATACGGTAAAC，其中下划线为EcoRⅠ的酶切点；所述引物 P2gadB的基因序列为GCGTCGACTCAGTGTGTGAATAGGTATTTC，其中下划线为sal Ⅰ的 酶切点；
根据基因数据库GenBank中登记的谷氨酸棒杆菌表达质粒pZ8-1的启动子ptac基因序列 设计引物P1tacgad；所述引物P1tacgad的基因序列为GCGTCGACTGACAATTAATCATCGGCTCGTA，其中下划线为sal Ⅰ的酶切点；
(2)基因片段扩增和表达载体的初步构建
以植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因表达载体pET28a-gadB为模版，通过FCR法，采用引 物P1gadB和引物P2gadB对谷氨酸脱羧酶gadB基因片段进行扩增；
以谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸脱氢酶gdh基因组DNA作为模版，通过FCR法，采用引物P1gdh和引物P2gdh对谷氨酸脱氢酶gdh基因片段进行扩增；
将上述通过PCR法扩增的gadB基因片段和gdh基因片段分别连接到穿梭质粒pZ8-1的 基因序列中，构建得到质粒pZ8-gadB和质粒pZ8-gdh，再以引物P1tacgdh和引物P2gdh为引 物，以质粒pZ8-gdh为模版，扩增携带tac启动子的谷氨酸脱氢酶gdh基因，然后将其连接到 克隆载体Pmd18-T simple T中进行构建表达载体T-tacgdh，在对其进行基因测序；
(3)串联表达载体pZ8-gadB-tacgdh的构建
将步骤(2)制得的质粒pZ8-gadB与表达载体T-tacgdh分别进行克隆，并将其制得的阳 性克隆质粒分别用限制性内切酶sal Ⅰ在37℃水浴条件下进行过夜单酶切，其中酶切体系为 20μL ddH2O、20μL质粒pZ8-gadB或表达载体T-tacgdh、5μL 10×H buffer缓冲液、5μL限 制性内切酶sal Ⅰ；
酶切处理完毕后，分别切胶回收酶切质粒pZ8-gadB和表达载体T-tacgdh的酶切基因片段 tacgdh进行磷酸化处理，再将其用于连接反应构建重组的串联表达载体pZ8-gadB-tacgdh，其 中连接反应体系为4μL ddH2O、1μL经sal Ⅰ酶切后的酶切质粒pZ8-gadB、10μL经sal Ⅰ 酶切后的酶切基因片段tacgdh、2μL 10×ligase buffer缓冲液、3μL DNAligase，连接反应条 件为16℃过夜连接，将过夜连接结束后的串联表达载体pZ8-gadB-tacgdh转化至Escherichia coli JM109中，然后经Km平板筛选得到转化子，挑去单克隆进行活化后抽提质粒进行酶切 验证并进行测定阳性克隆所插入目的的片段基因序列，其中EcorRⅠ单酶切图片如图1所示， 由图可知仅正向连接的gadB-tacgdh基因序列在EcorRⅠ酶作用下生产gadB的酶切片段，而 反向连接或无连接的质粒检测不到gadB基因的酶切片段，与预期结果一致；
将构建好的串联表达载体pZ8-gad-tacgdh转入大肠杆菌感受态细胞内，并将其置于摇床 中，在37℃、120rmp的条件下进行摇动培育1h，对感受态细胞进行复苏处理，然后取100 μL复苏处理后的感受态细胞接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB平板上，然后将其置 于37℃的恒温培养箱中倒置培养16h，培养结束后，挑单菌落接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下，以250r/min的摇瓶速度进行培养过夜，然后将培养后的质粒提取利用限制性内切酶EcoRI酶切质粒并筛选出经克隆的正相连接的阳性表达 载体pZ8-gad-tacgdh，并将酶切验证正确的重组质粒pZ8-gad-tacgdh送检进行测序鉴定，其中 LB液体培养基的原料组成及其质量百分含量为：
(4)gadB和gdh基因过表达菌株的构建
采用电转化法将酶切验证正确的重组质粒pZ8-gad-tacgdh导入谷氨酸棒杆菌的感受态细 胞中，并在含有20μg/mL的Km LBG平板上进行筛选阳性菌株，再提取质粒进行PCR和酶 切验证，最终筛选得到具有gadB和gdh基因的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg，即所述的产γ-氨基 丁酸的谷氨酸棒杆菌。
酶活对比测试
将重组基因工程菌株谷氨酸棒杆菌SF016-pgg以及原始菌株谷氨酸棒杆菌SF016分别在 摇瓶发酵培养基中培养72h，发酵液离心收集的菌体根据菌体浓度重悬于pH为8.0的Tris-HCl 缓冲液中，然后超声破碎细胞，再对破碎液进行离心，再取其上清液作为粗酶液，其中摇瓶 发酵培养基的组分及组分浓度为：
分别将谷氨酸棒杆菌SF016-pgg和谷氨酸棒杆菌SF016的粗酶液进行酶活性检测，结果 如下所示：
由上表可知，谷氨酸棒杆菌SF016-pgg粗酶液的GDH酶活明显高于其原始菌谷氨酸棒杆 菌SF016，而谷氨酸棒杆菌SF016并未检测到GAD的酶活性，谷氨酸棒杆菌SF016-pgg的GAD酶活高达0.65U/mg，标明了gadB基因和gdh基因均在重组的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg 中实现了表达。
一种应用上述产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌进行生产γ-氨基丁酸的方法，其包括如下步 骤：
(1)将谷氨酸棒杆菌SF016-pgg接种至LBG培养基上进行培养，其中LBG培养基的原料组分及其质量百分含量为：
(2)将经平板培养后的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg接种至种子培养基中进行培养，其中种 子培养基的组分及其组分浓度如为：
(3)将种子培养基中接种有谷氨酸棒杆菌SF016-pgg的种子液接种到装有发酵培养基的 发酵罐中，其中种子液的转接量为15％，在发酵过程中，将溶氧量控制在20％～40％，其中 发酵时间为0～12h时，发酵罐的培养温度控制在32℃，之后再将发酵罐的培养温度控制在 37℃进行继续培养，并将发酵反应体系的pH控制在5.0～7.0，发酵时间为40h，其中，在发 酵时间为0～25h时，流加质量百分浓度为25％的氨水和2M盐酸将发酵体系的pH控制在 6.8～7.0，之后继续流加质量百分浓度为25％的氨水和2M盐酸将发酵体系的pH控制在5.0～ 6.0，另外，在发酵过程中通过流加质量百分浓度为65％的葡萄糖将发酵体系的残糖浓度控制 在0.5％～1.5％，其中发酵体系的初始葡萄糖浓度为3％，在发酵30h后，往发酵体系中加入 0.1mol的PLP，其中发酵培养基的组分及其组分浓度如为：
对比测试
选取原始菌株谷氨酸棒杆菌SF016按照上述的生产方法和以同等的条件进行发酵，并记录 数据作为对照组，其中最终发酵产生的生物量OD562、发酵液中的γ-氨基丁酸(GABA)产量 以及L-谷氨酸的产量数据如下：
图2为重组菌谷氨酸棒杆菌SF016-pgg在发酵0～40h过程中所采集到的生物量OD562、发酵 液中的γ-氨基丁酸(GABA)产量以及L-谷氨酸的产量的数据曲线图，图3为原始菌谷氨酸棒 杆菌SF016在发酵0～40h过程中所采集到的生物量OD562、发酵液中的γ-氨基丁酸(GABA) 产量以及L-谷氨酸的产量的数据曲线图，结合图2和图3的发酵曲线可知，经基因串联表达的 重组菌谷氨酸棒杆菌SF016-pgg比原始菌株谷氨酸棒杆菌SF016晚6h进入平稳期，其最高的 OD562值也比原始菌株谷氨酸棒杆菌SF016少27.8％，其原因为额外引入了串联表达载体 pZ8-gad-tacgdh，增加了谷氨酸脱羧酶和谷氨酸脱氢酶的表达，从而导致了菌株需要消耗更多 的ATP用于菌体代谢，延迟其生长周期，且其发酵过程中pH的调整以及PLP的添加也对菌体 的生长产生了影响。
在图2和图3所示的基础上，可知谷氨酸棒杆菌SF016-pgg与原始菌谷氨酸棒杆菌SF016在 发酵过程中产生的GABA和L-谷氨酸的变化情况，在发酵40h后谷氨酸棒杆菌SF016所发酵的 L-谷氨酸的产量为53.82g/L，但是谷氨酸棒杆菌SF016-pgg在发酵前12h所产生的L-谷氨酸的产 量比谷氨酸棒杆菌SF016高，此为谷氨酸棒杆菌SF016-pgg中引入了谷氨酸脱氢酶基因，导致 其L-谷氨酸的积累较快，在12h后其L-谷氨酸含量逐渐下降，是由于导入的谷氨酸脱羧酶基因 的成功表达将L-Glu转化为GABA，从谷氨酸棒杆菌SF016-pgg的GABA曲线可以看出，在发酵 前12h主要是L-谷氨酸积累期，生产的GABA含量较低，在调整pH及添加辅酶PLP以后GABA 的含量开始逐渐上升，在经过发酵40h可积累约23.12g/L的GABA。
以上所述仅为本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导， 在不脱离本发明的原理和精神的情况下凡依本发明申请专利范围所做的均等变化、修改、替 换和变型，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 漳州卫生职业学院
<120> 一种产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法和应用
<130> FZJuChe20170527
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2037
<212> DNA
<213> 谷氨酸脱氢酶（Glutamte dehydrogenase）
<400> 1
gctagcctcg ggagctctag gagatcgtga aaaacgggtc aaatttctcc gatgtagcgc 60
ctataaaagt cgtaccaatt ccatttgagg gcgctcaatt gtggccaggt tatataacca 120
gtcagtcaac tggtctcatt cgctggtcgg atgaatttaa ttaaagaaga gacttcatgc 180
gagttaccgc gcgttttggc gatacaaatt gataacctaa agaaattttc aaacaaattt 240
taattctttg tggtcatatc tgtgcgacac tgccataatt tgaacgtgag cacttaccag 300
cctaaatgcc cgcagtgagt taagtctcaa agcaagaagt gctctttagg gcatccgtag 360
tttaaaacta ttaaccgtta ggtatgacaa gccggttgat gtgaacgcag tttttaaaag 420
tttcaggatc agatttttca caggcatttt gctccagcaa acgcctagga tgtacatgtg 480
ccctcaatgg gaaccaccaa catcactaaa tggcccaggt acacacttta aaatcgtgcg 540
cgcatgcagc cgagatggga acgaggaaat catgacagtt gatgagcagg tctctaacta 600
ttacgacatg cttctgaagc gcaatgctgg cgagcctgaa tttcaccagg cagtggcaga 660
ggttttggaa tctttgaagc tcgtcctgga aaaggaccct cattacgctg attacggtct 720
catccagcgc ctgtgcgagc ctgagcgtca gctcatcttc cgtgtgcctt gggttgatga 780
ccagggccag gtccacgtca accgtggttt ccgcgtgcag ttcaactctg cacttggacc 840
atacaagggc ggcctgcgct tccacccatc tgtaaacctg ggcattgtga agttcctggg 900
ctttgagcag atctttaaaa actccctaac cggcctgcca atcggtggtg gcaagggtgg 960
atccgacttc gaccctaagg gcaagtccga tctggaaatc atgcgtttct gccagtcctt 1020
catgaccgag ctacaccgcc acatcggtga gtaccgcgac gttcctgcag gtgacatcgg 1080
agttggtggc cgcgagatcg gttacctgtt tggccactac cgtcgcatgg ctaaccagca 1140
cgagtccggc gttttgaccg gtaagggcct gacctggggt ggatccctgg tccgcaccga 1200
ggcaactggc tacggctgcg tttacttcgt gagtgaaatg atcaaggcta agggcgagag 1260
catcagcggc cagaagatca tcgtttccgg ttccggcaac gtagcaacct acgcgattga 1320
aaaggctcag gaactcggcg caaccgttat tggtttctcc gattccagcg gttgggttca 1380
tacccctaac ggcgttgacg tggctaagct ccgcgaaatc aaggaagttc gtcgcgcacg 1440
cgtatccgtg tacgccgacg aagttgaagg cgcaacctac cacaccgacg gttccatctg 1500
ggatctcaag tgcgatatcg ctcttccttg tgcaactcag aacgagctca acggcgagaa 1560
cgctaagact cttgcagaca acggctgccg tttcgttgct gaaggcgcga acatgccttc 1620
cacccctgag gctgttgagg tcttccgtga gcgcgacatc cgcttcggac caggcaaggc 1680
cacccctgag gctgttgagg tcttccgtga gcgcgacatc cgcttcggac caggcaaggc 1740
agtcaacgtc ggtggcgttg caacctccgc tctggagatg cagcagaacg cttcgcgcga 1800
gacctgtgca gagaccgcag cagagtatgg acacgagaac gattacgttg tcggcgctaa 1860
cattgctggc ttcaagaagg tagctgacgc gatgctggca cagggcgtca tctaagaccc 1920
cggcgcttta cttaaacccc tgatccgcgt taaggatcag ggatttttga tttgttccag 1980
gtcaattatc cgatccacat gggttaagtg cacgctgtgc ggtcgcgcaa tgatgat 2037
<210> 2
<211> 1410
<212> DNA
<213> 谷氨酸脱氢酶（Glutamate decarboxylase）
<400> 2
atggcaatgt tatacggtaa acacaatcat gaagctgaag aatacttgga accagtcttt 60
ggtgcgcctt ctgaacaaca tgatcttcct aagtatcggt taccaaagca ttcattatcc 120
cctcgagaag ccgatcgctt agttcgtgat gaattattag atgaaggcaa ttcacgactg 180
aacctggcaa ctttttgtca gacctatatg gaacccgaag ccgttgaatt gatgaaggat 240
acgctggcta agaatgccat cgacaaatct gagtaccccc gcacggccga gattgaaaat 300
cggtgtgtga acattattgc caatctgtgg cacgcacctg atgacgaaca ctttacgggt 360
acctctacga ttggctcctc tgaagcttgt atgttaggcg gtttagcaat gaaattcgcc 420
tggcgtaaac gcgctcaagc ggcaggttta gatctgaatg cccatcgacc taacctcgtt 480
atttcggctg gctatcaagt ttgctgggaa aagttttgtg tctactggga cgttgacatg 540
cacgtggtcc caatggatga gcaacacatg gcccttgacg ttaaccacgt cttagactac 600
gtggacgaat acacaattgg tatcgtcggt atcatgggca tcacttatac cggtcaatat 660
gacgacctag ccgcactcga taaggtcgtt actcactaca atcatcagca tcccaaatta 720
ccagtctaca ttcacgtcga cgcagcgtca ggtggcttct ataccccatt tattgagccg 780
caactcatct gggacttccg gttggctaac gtcgtttcga tcaacgcctc cgggcacaag 840
tacggtttag tttatcccgg ggtcggctgg gtcgtttggc gtgatcgtca gtttttaccg 900
ccagaattag tcttcaaagt tagttattta ggtggggagt tgccgacaat ggcgatcaac 960
ttctcacata gtgcagccca gctcattgga caatactata atttcattcg ctttggtatg 1020
gacggttacc gcgagattca aacaaagact cacgatgttg cccgctacct ggcagccgct 1080
ctggataaag ttggtgagtt taagatgatc aataacggac accaactccc cctgatttgt 1140
taccaactag cctcgcgcga agatcgtgaa tggacccttt atgatttatc ggatcgccta 1200
ttaatgaacg gttggcaagt accaacgtat cctttacctg ctaatctgga acaacaagtc 1260
atccaacgaa tcgtcgttcg ggctgacttt ggcatgaata tggcccacga tttcatggat 1320
gacctgacca aggctgtcca tgacttaaac cacgcccaca ttgtctatca tcatgacgcg 1380
gcacctaaga aatacggatt cacacactga 1410

Claims (10)

1. 一种产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌，其分类命名为谷氨酸棒杆菌（corynebacterium glutamicum）SF016-pgg，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2017255，保藏日期为2017年5月12日。
2.根据权利要求1所述的产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述的谷氨酸棒杆菌导入有来源自植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因。
3.一种构建权利要求1或2所述的产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）引物的设计
根据基因数据库GenBank中登记的谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸脱氢酶gdh基因序列设计PCR所需的引物P1gdh和P2gdh；所述引物P1gdh的基因序列为CGGAATTCATGACAGTTGATGAGCAGGTCT，其中下划线为EcoRⅠ的酶切点；所述引物P2gdh的基因序列为GCGTCGACTTAGATGACGCCCTGTGCCAGCA，其中下划线为salⅠ的酶切点；
根据基因数据库GenBank中登记的植物乳杆菌菌株的谷氨酸脱羧酶gadB基因序列设计PCR所需的引物P1gadB和P2gadB；所述引物P1gadB的基因序列为：CGGAATTCATGGCAATGTTATACGGTAAAC，其中下划线为EcoRⅠ的酶切点；所述引物P2gadB的基因序列为GCGTCGACTCAGTGTGTGAATAGGTATTTC，其中下划线为salⅠ的酶切点；
根据基因数据库GenBank中登记的谷氨酸棒杆菌表达质粒pZ8-1的启动子ptac基因序列设计引物P1tacgad；所述引物P1tacgad的基因序列为GCGTCGACTGACAATTAATCATCGGCTCGTA，其中下划线为salⅠ的酶切点；
（2）基因片段扩增和表达载体的初步构建
以植物乳杆菌的谷氨酸脱羧酶基因表达载体pET28a-gadB为模版，通过FCR法，采用引物P1gadB和引物P2gadB对谷氨酸脱羧酶gadB基因片段进行扩增；
以谷氨酸棒杆菌菌株的谷氨酸脱氢酶gdh基因组DNA作为模版，通过FCR法，采用引物P1gdh和引物P2gdh对谷氨酸脱氢酶gdh基因片段进行扩增；
将上述通过PCR法扩增的gadB基因片段和gdh基因片段分别连接到穿梭质粒pZ8-1的基因序列中，构建得到质粒pZ8-gadB和质粒pZ8-gdh，再以引物P1tacgdh和引物P2gdh为引物，以质粒pZ8-gdh为模版，扩增携带tac启动子的谷氨酸脱氢酶gdh基因，然后将其连接到克隆载体Pmd18-T simple T中进行构建表达载体T-tacgdh，在对其进行基因测序；
（3）串联表达载体pZ8-gadB-tacgdh的构建
将步骤（2）制得的质粒pZ8-gadB与表达载体T-tacgdh分别进行克隆，并将其制得的阳性克隆质粒分别用限制性内切酶salⅠ在37℃水浴条件下进行过夜单酶切，其中酶切体系为20μL ddH2O、20μL 质粒pZ8-gadB或表达载体T-tacgdh、5μL 10×H buffer缓冲液、5μL 限制性内切酶salⅠ；
酶切处理完毕后，分别切胶回收酶切质粒pZ8-gadB和表达载体T-tacgdh的酶切基因片段tacgdh进行磷酸化处理，再将其用于连接反应构建重组的串联表达载体pZ8-gad-tacgdh，其中连接反应体系为4μL ddH2O、1μL 经salⅠ酶切后的酶切质粒pZ8-gad、10μL 经salⅠ酶切后的酶切基因片段tacgdh、2μL 10×ligase buffer缓冲液、3μL DNA ligase，连接反应条件为16℃过夜连接；
将构建好的串联表达载体pZ8-gad-tacgdh转入大肠杆菌感受态细胞内，并将其置于摇床中，在37℃、120rmp的条件下进行摇动培育1h，对感受态细胞进行复苏处理，然后取100μL复苏处理后的感受态细胞接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB平板上，然后将其置于37℃的恒温培养箱中倒置培养16h，培养结束后，挑单菌落接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下，以250r/min的摇瓶速度进行培养过夜，然后将培养后的质粒提取利用限制性内切酶EcoRI酶切质粒并筛选出经克隆的正相连接的阳性表达载体pZ8-gad-tacgdh，并将酶切验证正确的重组质粒pZ8-gad-tacgdh送检进行测序鉴定；
（4）gadB和gdh基因过表达菌株的构建
采用电转化法将酶切验证正确的重组质粒pZ8-gad-tacgdh导入谷氨酸棒杆菌的感受态细胞中，并在含有20μg/mL的Km LBG平板上进行筛选阳性菌株，再提取质粒进行PCR和酶切验证，最终筛选得到具有gadB和gdh基因的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg，即所述的产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌。
4.一种应用上述任一权利要求所述的产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌进行生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）将谷氨酸棒杆菌SF016-pgg接种至LBG培养基上进行培养；
（2）将经平板培养后的谷氨酸棒杆菌SF016-pgg接种至种子培养基中进行培养；
（3）将种子培养基中接种有谷氨酸棒杆菌SF016-pgg的种子液接种到装有发酵培养基的发酵罐中，其中种子液的转接量为15%，在发酵过程中，将溶氧量控制在20%～40%，其中发酵时间为0～12h时，发酵罐的培养温度控制在32℃，之后再将发酵罐的培养温度控制在37℃进行继续培养，并将发酵反应体系的pH控制在5.0～7.0，发酵时间为40h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）还包括：在发酵时间为0～25h时，流加质量百分浓度为25%的氨水和2M盐酸将发酵体系的pH控制在6.8～7.0，之后继续流加质量百分浓度为25%的氨水和2M盐酸将发酵体系的pH控制在5.0～6.0。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）还包括：在发酵过程中通过流加质量百分浓度为65%的葡萄糖将发酵体系的残糖浓度控制在0.5%～1.5%，其中发酵体系的初始葡萄糖浓度为3%。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）还包括：在发酵30h后，往发酵体系中加入0.1 mol的PLP。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）的LBG培养基的原料包括如下质量百分含量的组分：
蛋白胨 1%；
酵母膏 0.5%；
NaCl 1%；
葡萄糖 5%；
琼脂 2%；
余量为水。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）的种子培养基的组分及其组分浓度如下：
葡萄糖 2.2 g/dL；
酵母粉 1.0 g/dL；
黄豆提取物 2.0 g/dL；
FeSO4 10mg/dL；
MgSO4 ·7H2O 10 mg/dL；
尿素 0.04 g/dL；
丁二酸 1.0 g/dL；
VH生物素 0.04 mg/dL；
VB 10.02 mg/dL；
蛋氨酸 0.05 mg/dL；
消泡剂 0.0005mL/dL。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）的发酵培养基的组分及其组分浓度如下：
葡萄糖 5 g/dL；
KH2PO4 0.3 g/dL；
MgSO4·7H2O 0.1 g/dL；
苏氨酸 0.025g/dL；
赖氨酸 0.025 g/dL；
黄豆提取物 0.8 g/dL；
豆浓 0.1-0.08 g/dL；
FeSO4 2.6mg/ dL；
消泡剂 0.016g/ dL；
PABA对氨基苯甲酸 0.9mg/ dL；
VC-Na 0.9mg/ dL；
VH生物素 0.1 mg/ dL。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication
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