CN116410950B - 四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法，该四氢嘧啶生物合成基因簇至少包括如下3个基因，分别为：ectA基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；ectB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；ectC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述的四氢嘧啶生物合成基因簇微调了ectA、ectB、ectC的表达，并对ectA、ectB、ectC进行了定点突变，提高了菌种合成四氢嘧啶的能力。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，尤其是涉及一种四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法。
背景技术
四氢嘧啶，又名1，4，5，-四氢-2-甲基-4嘧啶羧酸，是一种环状氨基酸衍生物，其作为一种相容性溶质，广泛存在中度嗜盐菌中。四氢嘧啶不仅可帮助微生物抵御高渗透压冲击，维持其生长，还可以对高温、冷冻、射线等极端环境中细菌细胞的蛋白质、酶、核酸等起到保护作用。目前羟基四氢嘧啶已经广泛应用于在化妆品、医药、基因工程等领域。
目前，四氢嘧啶的生产方法主要通过嗜盐微生物特别是盐单胞菌在高盐环境下。这个过程通过采用被称为“细菌挤奶法”的方式进行生产，即先在高渗透压下培养细胞并在胞内积累四氢嘧啶，然后通过低渗冲击刺激四氢嘧啶从胞内释放到胞外，然后再重复进行高渗培养、低渗冲击，以获得较高浓度的四氢嘧啶。这个过程操作繁杂，且需要在高盐条件下进行培养，因此对设备要求高，导致其生产价格十分昂贵。
公开号为CN104593442A的中国发明专利（公开日为2015年5月6日）公开了一种利用重组大肠杆菌转化天冬氨酸为四氢嘧啶的方法，但该过程不连续，生产效率低。公开号为CN112342254B的中国发明专利（公开日为2021年4月23日）公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，但产量较低。因此开发一种高含量四氢嘧啶生产方法，降低其生产成本，提高生产效率，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种四氢嘧啶生物合成基因簇及发酵生产四氢嘧啶的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种四氢嘧啶生物合成基因簇，该四氢嘧啶生物合成基因簇至少包括如下3个基因，分别为：
ectA基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
ectB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ectC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述的基因簇来源于伸长盐单胞菌Halomonas elongata，ATCC No：33173。
本发明还提供一种四氢嘧啶生物合成基因簇形成的突变体，该突变体包括如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
所述的四氢嘧啶的生物合成基因簇突变体，其ectA基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第48位氨基酸由V替换成I，第66位氨基酸由A替换成C，第68位氨基酸由Q替换成H，第72位氨基酸由S替换成T，第77位氨基酸由T替换成E，第87位氨基酸由V替换成I，第99位氨基酸由Y替换成L，第120位氨基酸由V替换成L，第157位氨基酸由W替换成L，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
其ectB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第6位氨基酸由L替换成F，第86位氨基酸由Y替换成F，第120位氨基酸由R替换成K，第194位氨基酸由G替换成K，第293位氨基酸由Y替换成H，第305位氨基酸由A替换成V，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
其ectC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示原始序列的基础上具有如下突变：核酸序列对应的多肽氨基酸序列在第29位氨基酸由S替换成L，第35位氨基酸由G替换成M，第58位氨基酸由F替换成L，第91位氨基酸由Q替换成K，第112位氨基酸由G替换成P，其突变后的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种重组表达载体，该重组表达载体包含所述的生物合成基因簇或包含所述的突变体。所述的重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供一种重组四氢嘧啶生产工程菌，该工程菌包含所述的生物合成基因簇或包含所述的突变体。
一种四氢嘧啶表达菌株BL21（DE3）-pRSFDuet-ABC-2581-RBSs的构建方法，包括如下步骤：
分别对四氢嘧啶生物合成基因ectA、ectB、ectC进行定点突变，突变后的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，对突变后的四氢嘧啶生物合成基因ectA、ectB、ectC进行合成，分别在基因ectA、ectB、ectC序列前加上RBS序列微调各基因表达，在将表达框序列ectABC-RBSs插入到表达载体上，构建得到重组表达载体，所述的重组表达载体基因序列如SEQ ID No.7所示，并将所述的重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到所述重组四氢嘧啶生产工程菌。
本发明还提供应用所述的重组四氢嘧啶生产工程菌发酵生产四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：将所述的生产工程菌进行种子培养，将获得的种子液进行发酵生产四氢嘧啶。
进一步，所述的发酵步骤的具体操作为：将种子液接种到发酵培养基中，经诱导、发酵后得到四氢嘧啶发酵液。
进一步，所述的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖1-2%；酵母粉1-2%；蛋白胨 1-2%；硫酸铵 0.2-0.3%；磷酸二氢钠 0.1-0.3%；七水硫酸镁0.04-0.06%；柠檬酸三钠二水 0.004-0.006%；一水硫酸锰0.004-0.006%；七水硫酸亚铁0.004-0.006%；所述的发酵步骤的pH值为6.8-7.2，时间为44-48小时。
进一步，所述的发酵步骤的搅拌转速为400-1100rpm，通气量为1-2vvm，溶氧为25-30%；所述的发酵步骤还包括补料步骤；所述的补料步骤添加葡萄糖和酵母粉，保持发酵培养基中葡萄糖浓度小于等于5g/L。
进一步，所述的接种步骤的接种量为5-10%。
进一步，所述的诱导步骤采用的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；所述的诱导剂添加量为0.05-0.1 mM/L；诱导步骤前的培养温度为36-38℃，诱导步骤后的培养温度为30-33℃；诱导步骤前培养基的pH值为6.8-7.2，诱导步骤后培养基的pH值为6.4-6.6，诱导OD600值为35-45。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的四氢嘧啶生物合成基因簇微调了ectA、ectB、ectC的表达，并对ectA、ectB、ectC进行了定点突变，提高了菌种合成四氢嘧啶的能力。
本发明所述的发酵生产四氢嘧啶的方法通过对培养条件、补料步骤、诱导步骤的优化，极大的提高了四氢嘧啶产量，使四氢嘧啶浓度达到63g/L；并且，该方法无需在高盐环境下进行，对设备不产生腐蚀性；该方法为连续生产，生产效率高，工艺流程简单易于控制，糖转化率高，生产成本低，对工业化生产具有极高的价值。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
1、重组大肠杆菌 BL21（DE3）/ pRSFDuet-ABC-RBSs的构建
（1）重组质粒PRSFDuet-ABC-RBSs构建
以Halomonas elongata，ATCC No：33173基因组为模板，使用引物ectABC-F/ectABC-R，扩增含有不同载体同源臂序列的基因簇ectABC，获得ectABC片段 ，对ectABC进行定点突变，突变后的ectABC氨基酸序列如SEQ ID NO ：4、SEQ ID NO ：5、SEQ ID NO ：6所示；以pRSFDuet-1质粒为模板，使用引物对 pR-F1/pR-R1扩增获得相应的线性化的载体；使用Dpn I消化后，利用一步克隆酶将上述获得的 3 种目的基因簇片段ectABC 和线性化的载体进行连接，得到重组质粒pRSFDuet-ABC。
ectABC-F（SEQ ID NO ：8）：
GCGGTGGCGGCCGCTCTAGATTACAGCGGCTTCTGGTCGTC
ectABC-R（SEQ ID NO ：9）：
TCCTGCAGCCCGGGGGATCCGCTACAGCGAACCACGACAATGAACGCAACCACAGAG
pR-F1（SEQ ID NO ：10）：
CGGTACCCTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAATTTGAAC
pR-R1（SEQ ID NO ：11）：
GGCCGGCCGATATCCAATTGAGATCTGCCATATGTATATCTCC
使用引物对EctA-F/EctA-R以重组载体 pRSFDuet-ABC为模板进行全质粒环化PCR，得到的产物使用 Dpn I消化，纯化回收后转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，涂布卡那抗性平板，37 ℃恒温培养 20-24 h，挑选阳性转化子进行测序。测序正确的重组质粒即为单基因RBS4 序列替换的重组质粒，即为pRSFDuet-A-RBSs。
EctA-F（SEQ ID NO ：12）：
GTATAAGAAGGAGATATACATAATGAACGCAACCACAGAGCCCTTTACACCC
EctA-R（SEQ ID NO ：13）：
CTCTGTGGTTGCGTTCATTATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATAC
使用引物对 EctB-F/EctB-R 以重组载体pRSFDuet-A-RBSs为模板进行全质粒环化 PCR，得到的产物使用 DpnI 消 化 ，纯 化 回 收后 转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞， 涂布卡那抗性平板，37 ℃恒温培养 20-24 h，挑选平板上较大的单菌落进行测序。 测序正确的重组质粒即为双基因RBS序列替换的重组质粒，即为 pRSFDuet-AB-RBSs。
EctB-F（SEQ ID NO ：14）：
CAGATCTGAAAGGAGGAAAATATATGCAGACCCAGATTCTCGAACGCATGG
EctB-R（SEQ ID NO ：15）：
GGTCTGCATATATTTTCCTCCTTTCAGATCTGGTCGGTCTGGAACGGGC
使用引物对EctC-F/EctC-R扩增，以重组载体pRSFDuet-AB-RBSs 为模板进行全质粒环化PCR，得到的产物使用 Dpn I 酶进行消化， 产物纯化回收后转化 E.coli BL21（DE3）感 受 态 细胞，涂布卡那抗性平板，37 ℃恒温培养 20-24 h，挑选阳性转化子进行测序。测序正确的重组质粒即为三基因RBS序列替换后的重组质粒，即为pRSFDuet-ABC-RBSs，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
EctC-F（SEQ ID NO ：16）：
AAGGAGGAAAATATCGACATGATCGTTCGCAATCTCG
EctC-R（SEQ ID NO ：17）：
GTCGATATTTTCCTCCTTTCAGCTAAAGGCCTGCTTGGTG
（2）重组大肠杆菌构建
将表达载体pRSFDuet-ABC-RBSs利用热击法（42℃，90s）转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组大肠杆菌细胞BL21(DE3)/ pRSFDuet-ABC-RBSs。
2、高含量四氢嘧啶发酵生产方法
（1）平板种子活化
在超净工作台内将重组大肠杆菌BL21（DE3）/ pRSFDuet-ABC-RBSs接种至含卡纳（终浓度为50mg/L）和氯霉素（终浓度为50mg/L）的LB固体培养基中，37℃，恒温培养12h。
（2）一级种子培养
在超净工作台内，从活化好的平板种子中挑取一个生长良好的单菌落接种至装有50m种子培养基的150ml摇瓶中，30℃，150rpm，培养20h，得一级发酵种子液；所述种子培养基包括如下组分及其重量百分数：葡萄糖1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，pH值7.0。种子培养基灭菌程序为：121℃，20min。
（3）二级种子培养
在超净工作台内将所得的一级种子发酵液以3%接种量接入装有150ml种子培养基的500ml摇瓶中，37℃，220rpm，培养至OD600为1.8，得二级发酵种子液；种子培养基包括如下组分及其重量百分数：葡萄糖1%，酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化钠1%，pH值7.0。种子培养基灭菌程序为：121℃，20min。
（4）发酵培养
采用火焰种法将所得的二级种子发酵液以10%接种量接入装有1.5L发酵培养基的5L发酵罐中，培养温度37℃，自动流加25%氨水控制pH值为7.0，培养至OD600为20，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导，诱导剂浓度为0.2mmol/L，发酵期间进行补料，采用变速补料策略，将发酵液中残糖浓度控制在5g/L以下。发酵培养基包括如下组分及其重量百分数：葡萄糖1%；酵母粉1%；蛋白胨 1%；硫酸铵 0.3%；磷酸二氢钠 0.2%；七水硫酸镁 0.05%；柠檬酸三钠二水 0.005%；一水硫酸锰0.005%；七水硫酸亚铁0.005%，pH值7.0。发酵罐灭菌程序为121℃，20min。所述补料培养基包括如下组分及其重量百分数：葡萄糖50%。发酵耗时48h，得到发酵液。
对比例1
与实施例1的区别之处仅在于：
不对基因簇进行突变，直接使用原始基因簇ectABC进行后续处理，检测结果如表1所示。
表1 检测结果
对比例2
在采用不同诱导OD600的条件下（其他工艺条件同实施例1），检测结果如表2所示。
表2 检测结果
添加诱导剂对细胞生长会出现抑制，诱导时生物量较低则可能使菌体无法生长到较高的细胞浓度，从而四氢嘧啶含量较低；而诱导时生物量过高，则菌体处于衰老状态，活力下降，从而依克多因含量下降。由此可知，诱导OD600值在30-50之间能显著提高生物量和四氢嘧啶含量。
对比例3
在采用不同诱导剂浓度的条件下（其他工艺条件同实施例1），检测结果如表3所示。
表3 检测结果
诱导剂IPTG具有一定毒性，降低诱导剂浓度可能有助于维持菌体生长代谢活力，从而提高四氢嘧啶含量，但诱导剂浓度过低时，菌体表达四氢嘧啶合成途径相关酶量较低，从而产量较低。由此可知，诱导剂浓度在0.05-0.15mM/L的范围内能显著提高四氢嘧啶含量。
对比例4
诱导后自动流加氨水控制pH值为6.0-7.5（其他工艺条件同实施例1），检测结果如表4所示。
表4 检测结果
每一种酶都存在最适pH，故选择诱导后的pH至关重要，由此可知， pH值在6.4-6.6的范围内能显著提高四氢嘧啶含量。
对比例5
在采用不同诱导后温度的条件下（其他工艺条件同实施例1），检测结果如表5所示。
表5 检测结果
降低诱导温度可降低诱导后菌体生长速度，此有助于降低质粒的丢失率，从而提高四氢嘧啶含量，但温度过低菌体生长缓慢，最终生物量较低，导致四氢嘧啶含量下降。由此可知，诱导温度在30-33℃的范围内对生物量、四氢嘧啶含量有显著影响 。
综上所述，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示的四氢嘧啶生物合成基因簇pRSFDuet-ABC-RBSs的重组大肠杆菌发酵生产四氢嘧啶，通过对诱导OD600值、诱导剂浓度、诱导后pH值、诱导后温度、补料培养基的优化，并对发酵过程进行控制，可连续生产四氢嘧啶，显著提高了四氢嘧啶的产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种四氢嘧啶生物合成基因簇形成的突变体，其特征在于：该突变体由如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成。
2.一种重组表达载体，其特征在于：该重组表达载体包含权利要求1所述的突变体。
3.一种重组四氢嘧啶生产工程菌，其特征在于：该工程菌包含权利要求1所述的突变体；所述的工程菌为大肠杆菌。
4.应用权利要求3所述的重组四氢嘧啶生产工程菌发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：包括如下步骤：将所述的生产工程菌进行种子培养，将获得的种子液进行发酵生产四氢嘧啶。
5.根据权利要求4所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述的发酵步骤的具体操作为：将种子液接种到发酵培养基中，经诱导、发酵后得到四氢嘧啶发酵液。
6.根据权利要求5所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖1-2%；酵母粉1-2%；蛋白胨 1-2%；硫酸铵 0.2-0.3%；磷酸二氢钠 0.1-0.3%；七水硫酸镁0.04-0.06%；柠檬酸三钠二水 0.004-0.006%；一水硫酸锰0.004-0.006%；七水硫酸亚铁0.004-0.006%；所述的发酵步骤的pH值为6.8-7.2，时间为44-48小时。
7.根据权利要求5所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述的发酵步骤的搅拌转速为400-1100rpm，通气量为1-2vvm，溶氧为25-30%；所述的发酵步骤还包括补料步骤；所述的补料步骤添加葡萄糖和酵母粉，保持发酵培养基中葡萄糖浓度小于等于5g/L。
8.根据权利要求5所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述的接种步骤的接种量为5-10%。
9.根据权利要求5所述的发酵生产四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述的诱导步骤采用的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；所述的诱导剂添加量为0.05-0.1 mM/L；诱导步骤前的培养温度为36-38℃，诱导步骤后的培养温度为30-33℃；诱导步骤前培养基的pH值为6.8-7.2，诱导步骤后培养基的pH值为6.4-6.6，诱导OD600值为35-45。
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