CN116590207A - 一种利用葡萄糖生产乳酸单体的菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵工程和基因工程技术领域，具体涉及一种可利用葡萄糖高转化率合成乳酸单体的生产菌株及其获得方法。本发明通过基因克隆与基因重组技术在乳酸单体生产菌株中通过温敏型质粒游离表达PDH复合体中的关键酶的编码基因，然后再缺失宿主染色体上的上述关键酶的编码基因，获得细胞生长和增殖可以通过培养温度进行调控的乳酸单体生产新菌种，实现细胞生长过程与发酵生产体系的培养温度形成关联，通过培养温度改变实现对细胞生长过程的开关控制，进而在发酵产乳酸阶段使葡萄糖等原料最大限度的流向乳酸单体的合成，获得利用葡萄糖高转化率发酵生产乳酸单体的生产菌种，其产酸阶段的糖酸转化率达到99％以上。

Description

一种利用葡萄糖生产乳酸单体的菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及发酵工程和基因工程技术领域，具体涉及一种可利用葡萄糖高转化率合成乳酸单体的生产菌株及其获得方法，具体为细胞生长相关关键调控基因的克隆、表达、删除和以葡萄糖为原料的乳酸单体的发酵生产。
背景技术：
乳酸(又称为α-羟基丙酸，分子式为C2H5OCOOH)是一种天然存在的有机酸，广泛存在于人、动物、植物和微生物中。乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，乳酸及其衍生物被广泛应用于酿造、食品、农业、医药、化工、纺织、皮革、烟草、印染等行业中。乳酸是自然界最小的手性分子，其羧基α位碳原子为不对称碳原子，具有L(+)和D(-)两种光学构型。极高光学纯度极高化学纯度的L-乳酸或D-乳酸单体是重要的手性中间体和聚乳酸合成的原料。随着人们环保意识的提高，生物可降解聚乳酸材料的市场需求量剧增，也推动了对其单体L-乳酸和D-乳酸的需求，同时促进了对以高产量、高转化率和高生产强度生产极高光学纯度和极高化学纯度L-乳酸和D-乳酸合成方法的需求。
大肠杆菌生长速度快、营养需求简单，作为基因操作的工具菌，大肠杆菌遗传背景清楚、易于进行基因操作。通过定向遗传改良，可以使大肠杆菌在合成乳酸时的光学纯度和化学纯度皆能达到理想的程度。作为生产菌株，重组大肠杆菌通过合理搭建或改造L-乳酸或D-乳酸合成途径，并针对性阻断其他副产物合成途径后，其发酵产酸阶段的理论糖酸转化率可达到100％。
前期研究已有许多通过删除乳酸竞争途径来增加乳酸合成的报道(Zhou L.etal.,Current Microbiology,2011,62:981～989；Zhu Y.et al.,Applied EnvironmentalMicrobiology,2007,73:456～464；Zhou S.et al.,Applied EnvironmentalMicrobiology,2003,69:399～407；Zhu J.et al.,Applied Microbiology andBiotechnology,2004,64:367～375；Zhu J.et al.,Metabolic Engineering,2005,7:104～115)。进一步在重组大肠杆菌中增加乳酸合成关键途径-乳酸脱氢酶基因(ldhA)的拷贝数或将其启动子替换为强启动子有可能会增加乳酸合成的速率。此外，生产实践中常常会遇到菌体生长阶段产生乳酸消耗碳源，使得好氧阶段不能得到高菌体浓度和高活性细胞，进而影响发酵产酸阶段生产强度的问题。如，我们前期报道的菌株B0013-070(Zhou L.etal.,Current Microbiology,2011,62:981～989)在菌体生长阶段合成7g/L乳酸，与细胞合成竞争底物，由于在大规模发酵过程中供氧能力会显著下降，好氧阶段乳酸的积累会进一步增加，从而影响菌体量的积累，使得在乳酸积累阶段乳酸的体积生产强度降低。
此外，发酵产酸阶段菌体的继续生长同样会带来碳源的消耗使得发酵产酸阶段糖酸转化率通常不高于96％。为了实现乳酸单体的高转化率下的合成，已有研究通过基因工程直接删除菌体生长关键基因，然后通过添加乙酸等替代碳源的方式实现细胞生长过程的恢复(Zhu Y.et al.,Applied Environmental Microbiology,2007,73:456～464)，同时通过通入氮气等维持绝对厌氧条件获得发酵产酸阶段糖酸转化率接近99％的乳酸单体生产过程(Zhu Y.et al.,Applied Environmental Microbiology,2007,73:456～464)。而从工业化规模生产角度来讲，乙酸等物质的流加控制实现难度大，绝对厌氧体系则需要维持发酵体系的密闭性，从而增加了设备成本和维护成本。
丙酮酸脱氢酶(PDH)多酶复合体，是一种可催化丙酮酸不可逆的转化为乙酰-CoA的多酶复合物，主要包括丙酮酸脱氢酶(E1p)、二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(E2p)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)，aceE、aceF和lpdA基因分别编码这3种蛋白。PDH多酶复合体作为一组限速酶，连接EMP通路(糖酵解通路)和TCA循环，糖酵解通路降解细胞外糖并氧化其他有机化合物生成丙酮酸，TCA循环产生ATP和中间体来支持细胞的整体生长。丙酮酸在硫胺焦磷酸盐依赖的反应中被E1p(aceE基因编码)脱羧后，与E2p(aceF基因编码)的LD基结合的硫基乙酰化，然后LD的乙酰化脂基部分与位于C端的E2催化位点(CAT)相互作用，乙酰基转移到辅酶A上，剩余还原的LD基部分被E3(lpdA基因编码)氧化，重置脱氢酶，进行另一轮乙酰辅酶A的合成。PDH复合体的三种酶均属于细胞生长必需型关键酶，直接对其染色体上的编码基因进行敲除会导致细胞无法生长，或生长极其缓慢。
定点删除或敲除目标基因是研究特定基因及其编码蛋白以及相关代谢途径的重要手段之一。代谢工程改造和合成途径重构中，常需要对宿主菌生长代谢所必需的基因进行敲除或删除。由于该类型基因的敲除或删除会直接导致细胞不生长或生长极为微弱，而无法直接获得需要的转化子。
本发明建立了一种高效删除细胞生长必需型基因的方法。先借助具有同源重组辅助功能的温敏型质粒游离表达选定的细胞生长必需型基因，再通过选择选定基因上下游序列作为同源臂，删除染色体上原有的选定基因。获得的重组菌可通过调整培养温度，控制表达温敏型质粒中的选定细胞生长必需型基因。在原有乳酸单体高产菌种CGMCC 11059和CGMCC11060(ZL201580000781.7)的基础上，借助上述策略选育了新型乳酸单体高产菌种。较低培养温度下，该菌种在好氧菌体生长阶段可以正常生长，发酵产酸阶段通过升高培养温度，可以显著限制菌体生长情况，实现发酵原料最大限度的流向乳酸单体的合成，且这一过程可以在无需严格厌氧的大规模发酵生产体系下完成。发酵产酸阶段的糖酸转化率超过99％，接近理论转化率。
发明内容：
本发明目的是通过基因克隆与基因重组技术在乳酸单体生产菌株中实现细胞生长过程与发酵生产体系的培养温度形成关联，通过培养温度改变实现对细胞生长过程的开关控制，进而在发酵产乳酸阶段使葡萄糖等原料最大限度的流向乳酸单体的合成，获得利用葡萄糖高转化率发酵生产乳酸单体的生产菌种，以及高效合成乳酸单体的发酵生产技术。
本发明提供的技术方案之一，是一株生产乳酸的基因工程菌，所述工程菌以具有乳酸生产能力的菌株为宿主，通过温敏型质粒在宿主内游离表达PDH复合体中的关键酶的编码基因，然后再缺失宿主染色体上的上述关键酶的编码基因，获得细胞生长和增殖可以通过培养温度进行调控的乳酸单体生产新菌种，该菌种糖酸转化率提高到99％以上；
进一步地，所述PDH复合体中的关键酶，是催化丙酮酸为乙酰辅酶A过程中的酶，包括丙酮酸脱氢酶(E1p)、二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(E2p)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)，aceE、aceF和lpdA基因分别编码这3种蛋白；
优选地，所述PDH复合体中的关键酶是二氢硫辛酰胺转乙酰基酶E2p，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；E2p由aceF基因编码，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
进一步地，所述E2p的编码基因aceF通过克隆入温敏型质粒在宿主中进行游离表达，所述温敏型质粒具备编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质的功能；
更进一步地，所述温敏型质粒选自pKD3，pKD4，pKD46，pKD20或pKD13；
优选地，所述温敏型质粒为pKD46；
进一步地，温敏型质粒上还包含来源于大肠杆菌的启动子和终止子序列，用于控制PDH复合体中的关键酶的表达；所述启动子和终止子的来源包括但不限于乳酸脱氢酶(LdhA)，乙醇脱氢酶(AdhE)，甲酸裂解酶(PflB)，琥珀酸还原酶(FrdA)；
优选地，所述温敏型质粒上，含有来源于大肠杆菌的乳酸脱氢酶(LdhA)的启动子PldhA和终止子TldhA，PldhA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，TldhA的核苷酸序列如SEQID NO.12所示；
进一步地，所述缺失PDH复合体中的关键酶的编码基因的表达的方式包括但不限于基因敲除、基因失活等方式，所述基因失活包括通过删除、敲除或插入片段使其功能失活的方式；
优选地，所述缺失PDH复合体中的关键酶的编码基因的表达的方式为基因敲除；
更优选地，借助温敏型质粒辅助同源重组的功能对宿主染色体上PDH复合体中的关键酶的编码基因进行敲除；
进一步地，所述具有乳酸单体生产能力的宿主菌株包括但不限于大肠杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母、凝结芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌等；
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌CGMCC NO.11059或CGMCC NO.11060。
更优选地，所述生产乳酸单体的基因工程菌，是以大肠杆菌CGMCCNO.11059或CGMCC NO.11060为宿主，将二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的编码基因aceF、启动子PldhA和终止子TldhA克隆至温敏型质粒pKD46中，获得重组质粒pKD-PldhA-aceF，并将重组质粒pKD-PldhA-aceF转化至上述宿主中，之后敲除宿主菌中染色体上的aceF基因，获得重组大肠杆菌；
进一步地，以大肠杆菌CGMCC NO.11060为宿主，获得可代谢利用葡萄糖高转化率合成L-乳酸单体的大肠杆菌GSFL；
进一步地，以大肠杆菌CGMCC NO.11059为宿主获得可代谢利用葡萄糖高转化率合成D-乳酸单体的大肠杆菌GSFD；
大肠杆菌GSFL、GSFD均具有细胞生长过程可通过温度改变精确调控的特征。
本发明提供的技术方案之二，是技术方案一所述基因工程菌在生产乳酸中的应用；
进一步地，采用上述基因工程菌通过发酵罐发酵生产乳酸的方法如下：
在无机盐培养基中添加2～5wt.％的葡萄糖，以0.1％～10％的接种量接入生产菌株，在25～35℃、通风0.1～3vvm和200～1000r/min下控制溶解氧浓度不低于20％培养4～16h，过程中通过流加5～25wt.％氨水维持发酵液pH 6.0～7.5，当菌体OD600达到10～50后关闭通风并降低转速到0～200r/min，提高发酵温度到35～55℃进入乳酸合成阶段，期间补加葡萄糖，葡萄糖补加总量为200～270g/L发酵液(以起始发酵体积计算)；乳酸合成阶段通过流加5～30wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.0～7.5；当残糖浓度低于0.5g/L时，或耗糖速率低于1g/(L·h)时，或发酵液固形物含量过高难以搅拌时，结束发酵，发酵周期26～36h，乳酸浓度160g/L以上，产酸速率5.6g/(L·h)以上，发酵产酸阶段糖酸转化率99％以上；
更进一步地，通过分批补加浓度为3～70wt.％的葡萄糖溶液或以3～30g/(L·h)的流加速度流加10～70wt.％葡萄糖溶液来补加葡萄糖；
更进一步地，所述无机盐培养基组成为(w/v)：十二水磷酸氢二钠0.5％～2.5％，氯化钠0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.1％～1.0％，氯化铵0.01％～0.5％，其余为水；
优选地，在无机盐培养基中添加3～4wt.％的葡萄糖，以5％～8％的接种量接入生产菌株，在30～35℃、通风0.3～2vvm和200～1000r/min下培养6～8h，过程中通过流加15～25wt.％氨水维持发酵液pH 6.5～7.0，然后关闭通风并降低转速到100～200r/min，提高发酵温度到40～50℃，然后分批补加浓度为50～60wt.％的葡萄糖溶液或以8～20g/(L·h)的流加速度流加50～60wt.％葡萄糖溶液使得葡萄糖补加总量为230～240g/L发酵液(以起始发酵计算)，这一过程中通过流加20～25wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.5～7.0。
进一步地，采用上述基因工程菌通过摇瓶发酵生产乳酸的方法如下：
在摇瓶发酵培养基中，按初始OD600为0.05～0.2接入种子液，先好氧阶段25～37℃、100～250r/min培养8～16h，使菌体生长起来，再转入厌氧产乳酸阶段，厌氧产乳酸阶段，加入终浓度为10～80g/L的葡萄糖和终浓度2％～8％的CaCO3，37～50℃静置培养12～50h；发酵产酸阶段糖酸转化率99％以上。
进一步地，摇瓶发酵培养基如下：十二水磷酸氢二钠0.5％～2.5％，氯化钠0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.1％～1.0％，氯化铵0.01％～0.5％，葡萄糖0.1％～1.0％；pH 7.0。
有益效果：
本发明提供的重组菌具有明显的利用葡萄糖高转化率合成乳酸单体的能力。大规模发酵生产体系下(发酵罐培养)，乳酸单体发酵水平达到160g/L以上，光学纯度99.9％以上，化学纯度98％以上，发酵产酸阶段糖酸转化率99％以上(原始菌为96％)，葡萄糖到乳酸的整体转化率92％以上(原始菌为90％)，本发明中发酵产酸阶段糖酸转化率＝发酵产酸阶段乳酸积累量除以发酵产酸阶段的葡萄糖消耗量乘以100％；整体转化率＝发酵全程的乳酸积累量除以发酵全程的葡萄糖消耗量乘以100％。本发明提供的技术在乳酸单体发酵生产过程中，有助于提高原料到乳酸单体的转化率和降低副产物合成水平，有效降低了发酵生产成本和产品提取精制成本。同时，本发明技术实现了以发酵温度为调控手段，精确控制乳酸单体生产过程中的细胞生长和增殖情况，无需外源限制性添加营养物。简洁控制工艺有助于实现乳酸单体发酵生产体系的智能化控制和无人工厂的建立。本发明也可直接应用于蔗糖、淀粉以及糖蜜、菊芋、牛蒡、甘蔗汁、甜菜汁等其他原料的乳酸单体发酵生产。
附图说明：
图1质粒pKD-PldhA-aceF的物理图谱质粒。
图2质粒pKD-PldhA-aceF经BamHI线性化后的电泳图谱。
图3质粒pMD-aceF(Ed)-difGm经HindIII线性化后的电泳图谱。
图4染色体基因组上aceF基因删除过程示意图。
图5重组菌GSFL和GSFD经引物aceFE-p1和aceFd-p2菌落PCR验证凝胶电泳图谱。
图6重组菌GSFL、GDFL(左)和GSFD、GDFD(右)在LB平板上30℃培养24h对比图。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
本发明优选的出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)CGMCC No.11059和CGMCCNo.11060(已公开于ZL201580000781.7中)，分别为D-乳酸单体生产菌和L-乳酸单体生产菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC)，保藏日期均为2015年7月7日。
本发明优选的丙酮酸形成乙酰辅酶A的关键酶(PDH复合体)是编码二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(E2p)的aceF基因，其编码基因为通过PCR方式获得，其核苷酸序列具有SEQ IDNO.1的序列特征，其氨基酸序列具有SEQ ID NO.2的序列特征。
本发明所使用的质粒pKD46为现有技术，可通过商业途径进行购买，其构建方法也已通过文献(Datsenko and Wanner，PNAS.2000,97(12):6640-6645)公开。本发明所使用的PldhA启动子序列在前期研究中已完成功能验证(Zhou et al,J Ind MicrobiolBiotechnol,2012,39(8):1209-1217)，其核苷酸序列具有SEQ IDNO.11所示。
本发明通过基因克隆与基因重组技术，首先将来源于大肠杆菌的二氢硫辛酰胺转乙酰基酶编码基因aceF(SEQ ID NO.1)，以及D-乳酸脱氢酶的启动子PldhA(SEQ ID NO.11)和终止子TldhA(SEQ ID NO.12)克隆入温度敏感型表达载体pKD46中，获得的表达质粒pKD-PldhA-aceF，并转化入乳酸单体生产菌株中，然后通过同源重组将该菌株中染色体上原有aceF基因完整删除，获得细胞生长可通过培养温度调控的乳酸单体合成的重组菌；进一步建立并优化发酵条件与工艺，通过控制发酵温度，实现在菌体生长阶段获得高活性的细胞工厂，且在乳酸发酵阶段限制细胞增殖，最大限度引导引导碳源流向产物合成，提高乳酸单体工业化制造的转化率。
本发明采用的主要实验方法如下：
1、基因克隆、基因重组与表达质粒的构建常规分子克隆操作参考文献方法(Sambrook等。Molecular Cloning：A Laboratory Manual,1989)进行。二氢硫辛酰胺转乙酰基酶编码基因aceF作为本发明中的目标基因；基础表达载体为pKD46，大肠杆菌基因组DNA作为模板，扩增目的基因序列，所得产物经合适的酶酶切消化后，和带有合适启动子的载体连接并化转，选择合适的酶切位点酶切或通过PCR扩增得到带有特定启动子的序列，克隆入质粒pKD46中。
2、染色体DNA的提取
大肠杆菌染色体DNA提取方法按文献(诸葛健王正祥。工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994)进行。
3、质粒DNA的提取
质粒DNA的提取在用一定浓度的溶菌酶裂解细胞壁后使用Sigma公司的质粒小提试剂盒进行。
4、基因扩增
DNA扩增在0.2mL PCR薄壁管中进行。PCR扩增条件为：11(95℃5min)；301(94℃30s，58℃30s，68℃30～300s)；11(68℃10min)。依据不同扩增长度，PCR反应的延伸温度和时间有所不同。
5、大肠杆菌定点整合
参照文献(周丽等.微生物学通报,2010,37:923-928)介绍的方法进行。主要步骤如下：(1)以大肠杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因aceF序列并克隆入合适载体中，选择合适的酶切位点酶切或通过反向PCR扩增去除该基因序列中部的部分序列，同步克隆入difGm片段，获得突变盒片段(即：同源臂1-dif-Gm-dif-同源臂2)；。(2)采用PCR扩增技术制备上述定点整合表达盒序列，将该片段纯化后电转化含有辅助质粒pKD46的受体菌株。(3)在辅助质粒pKD46所产生的Red重组酶的作用下，上述DNA片段与染色体上的目的基因进行双交换，替换目的基因序列，重组转化子可利用突变盒上带有的庆大霉素抗性标记筛选出。该突变株再在自身产生的Xer重组酶的作用下进行两个dif位点的重组，环化去除抗生素抗性基因。正确转化子经菌落PCR验证、发酵验证功能等方法验证。
6、摇瓶发酵试验
从保藏于-70℃的甘油管接种菌株至相应抗性LB平板，25～37℃培养箱静置18～24h。挑取长势均匀的单菌落至50mL液体LB培养基中(诸葛健王正祥工业微生物实验技术手册，北京：中国轻工业出版社，1994)，25～37℃摇床，100～250r/min，12～24h，生长至菌体OD600为3.0以上。取大约50～150μL菌悬液接种于50mL的摇瓶发酵培养基(十二水磷酸氢二钠0.5％～2.5％，氯化钠0.02％～0.1％，磷酸二氢钾0.1％～1.0％，氯化铵0.01％～0.5％，葡萄糖0.1％～1.0％；pH 7.0)中，控制接种量使初始OD600均为0.05～0.2。先好氧阶段25～37℃、100～250r/min培养8～16h，使菌体生长起来，再转入厌氧产乳酸阶段。厌氧产乳酸阶段，加入终浓度为10～80g/L的葡萄糖和2～8％的CaCO3，在纱布外面加一层一次性手套，用报纸包裹后，用棉绳系紧，37～50℃静置培养12～50h。
7、发酵罐发酵试验
发酵菌种的平板培养、液体LB培养和摇瓶无机盐培养过程同摇瓶操作。150mL葡萄糖为碳源的无机盐培养液作为二级种子接种50L发酵罐，初始工作体积为25L。在无机盐培养基中添加2～5wt.％的葡萄糖，以0.1％～10％的接种量接入生产菌株，在25～35℃、通风0.1～3vvm和200～1000r/min下培养4～16h，过程中通过流加5～25wt.％氨水维持发酵液pH 6.0～7.5，当菌体OD600达到10～50后，关闭通风并降低转速到0～200r/min，提高发酵温度到35～55℃，然后分批补加终浓度为3～70wt.％的葡萄糖溶液或以3～30g/(L·h)的流加速度流加10～70wt.％葡萄糖溶液(葡萄糖补加总量为200～270g/L发酵液(以起始发酵体积计算))，这一过程中通过流加5～30wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 6.0～7.5。
8、发酵过程分析
(1)葡萄糖浓度测定发酵过程中取样测定葡萄糖浓度，需要先离心弃菌体取上清，并适当稀释至SBA-40X生物传感仪的可检测范围内进行测定，取三次平行数据的平均值。
(2)L-乳酸和D-乳酸及其他发酵产物测定方法
发酵液样品处理方法：按1mL发酵液加50μL浓硫酸的比例，去酸化处理发酵液，以释放被中和的有机酸，然后离心取上清，除去产生的CaSO4沉淀。将处理完的样品与100g/L的三氯乙酸等体积混匀，4℃放置2h，12000r/min离心6min，将上清适当倍数稀释，0.22μm微孔滤膜过滤，然后进行高效液相分析。
L-乳酸、D-乳酸、丙酮酸、甲酸、乙酸和丁二酸含量测定：样品用HPLC紫外检测器检测，检测流动相使用5mM的稀硫酸溶液，流动相流速设置为0.8mL/min，采用HPX-87H有机酸分析柱，波长210nm，柱温65℃，进样量为10μL。所有数据均为3次平行试验结果的平均值。
乳酸单体光学纯度测定：采用HPLC进行，检测流动相为5mM的CuSO4溶液，流动相流速1mL/min，采用光学纯度手型分析柱Astec CLC-L(D-乳酸先出峰，L-乳酸后出峰)，柱温25℃，紫外检测，波长254nm，进样量为10μL。
本发明及实施例涉及的引物对照表如下：
以下通过具体实施例对本发明作进一步地解释说明。
实施例1aceF基因表达质粒及重组大肠杆菌的构建
对来源于大肠杆菌的编码二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的aceF基因(GenBank登录号:944794，核酸序列SEQ ID No.1)，以大肠杆菌CGMCC No.11059的染色体基因组作为模板通过PCR扩增aceF基因(上下游引物分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，aceFp1和aceFp2)。将获得的大小约为1.9kb的PCR产物经BamHI和EcoRI消化后克隆入pLDHex质粒(该质粒构建过程公开于文献Niu etal.Highly efficient L-lactate production using engineeredEscherichia coli with dissimilar temperature optima for L-lactate formationand cell growth，Microbial Cell Factories 2014,13:78)的PldhA启动子的下游和TldhA终止子上游的BglII和EcoRI位点，获得重组质粒pT-PldhA-aceF。
以质粒pT-PldhA-aceF作为模板，经PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，ldhA2-p1/ldhARew-p2)获得包括D-乳酸脱氢酶编码基因启动子和终止子以及aceF基因大小约为2.5kb的表达盒PldhA-aceF片段。将获得的表达盒PldhA-aceF片段经BamHI消化后克隆入pKD46质粒的BamHI位点，获得重组表达质粒pKD-PldhA-aceF(物理图谱见图1)。该重组质粒BamHI线性化后，经琼脂糖凝胶电泳确认如图2所示，获得两条片段大小分别为6.3kb和2.5kb的条带。可知重组表达质粒pKD-PldhA-aceF构建成功。
采用电击转化的方法将上述构建的aceF基因表达质粒pKD-PldhA-aceF分别转化入D-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11059和L-乳酸单体高产菌株CGMCC No.11060中，获得了相应的重组菌GOFD和GOFL。
实施例2aceF基因突变盒构建及重组大肠杆菌染色体上aceF基因的删除
以大肠杆菌CGMCC No.11059的染色体基因组作为模板PCR扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，aceFE-p1和aceFd-p2)aceF基因及其上下游各约500bp的片段。将获得的大小约为2.9kb的PCR产物经HindIII消化后克隆入pMD18-T质粒(该质粒可在宝生物公司采购)的HindIII位点获得重组质粒pMD-aceF(Ed)。
以pMD-aceF(Ed)质粒作为模板，经PCR反向扩增(上下游引物分别为SEQ ID No.9和SEQ ID No.10，RaceFE-p1和RaceFd-p2)除去aceF基因片段，获得含有aceF基因上下游同源臂的质粒RpMD-aceF(Ed)，将反向PCR获得的片段RpMD-aceF(Ed)与difGm片段(该片段采购自江苏锐阳生物的大肠杆菌基因删除试剂盒)进行连接，获得包含aceF基因突变盒的重组质粒pMD-aceF(Ed)-difGm(图3，质粒pMD-aceF(Ed)-difGm经HindIII线性化后的电泳图谱)。以质粒pMD-aceF(Ed)-difGm为模板，经PCR扩增(引物aceFE-p1和aceFd-p2)，获得aceF基因突变盒aceF(Ed)::difGm(包括aceF基因上下游同源臂和difGm片段：同源臂1-dif-Gm-dif-同源臂2)。
将突变盒aceF(Ed)::difGm分别采用电击转化入实施例1构建的重组菌GOFL和GOFD中，在温敏型质粒的辅助下完成染色体基因组上的aceF基因的删除(在辅助质粒pKD46所产生的Red重组酶的作用下，aceF(Ed)::difGm与染色体上的aceF基因进行双交换)，分别获得染色体上aceF基因删除后的重组菌GSFL和GSFD(染色体基因组上aceF基因删除过程示意图见图4)，重组菌GSFL和GSFD的验证图如图5所示。进一步通过42℃条件下的传代培养获得aceF基因表达质粒pKD-PldhA-aceF丢失的重组菌GDFL和GDFD(重组菌GSFL、GDFL和GSFD、GDFD在LB平板上30℃培养24h对比图如图6所示)。
实施例3摇瓶培养体系下温度对细胞生长的调控
将上述获得的重组菌GOFL、GOFD、GSFL、GSFD、GDFL和GDFD分别在30℃和42℃温度下培养24h考察菌体生长情况，结果汇总于表1。
出发菌株CGMCC 11059和CGMCC 11060在30℃和42℃条件下均表现出显著生长，游离表达aceF基因后的菌株GOFD和GOFL同样在30℃和42℃条件下均表现出显著生长，这是因为30℃条件下游离质粒正常复制未丢失，染色体上和游离质粒的aceF基因均正常表达了E2p蛋白，而42℃条件下游离质粒虽然丢失，但染色体上的aceF基因正常表达了E2p蛋白。在游离表达aceF基因的基础上删除染色体基因组aceF基因的重组菌GSFD和GSFL在30℃和42℃条件下则表现出显著的生长差异。其中30℃条件生长显著，而在42℃条件下则表现出明显的细胞增殖抑制，这是因为30℃条件下游离质粒正常复制未丢失，虽然染色体上没有aceF基因，但是游离质粒上的aceF基因正常表达了E2p蛋白，而42℃条件下游离质粒丢失，且染色体上的aceF基因也缺失，最终由于E2p蛋白得不到表达而使得细胞生长受限。无aceF基因游离表达质粒且染色体基因组aceF基因删除后的重组菌GDFD和GDFL在30℃和42℃条件下均表现出明显的细胞增殖抑制，这是因为两种培养条件下由于染色体上无aceF基因，细胞内也无游离表达aceF基因的质粒，导致E2p蛋白得不到表达而使得细胞生长受限。
表1
实施例4摇瓶发酵体系下发酵产酸阶段糖酸转化率
将上述获得的重组菌GOFD、GSFD、GOFL和GSFL，以及CGMCC 11059、CGMCC 11060，从保藏于-70℃的甘油管接种菌株至相应抗性LB平板，30℃培养箱静置20h。挑取长势均匀的单菌落至50mL液体LB培养基中30℃摇床，200r/min，12h。取大约100μL菌悬液接种于50mL的摇瓶发酵培养基(十二水磷酸氢二钠1.5％，氯化钠0.05％，磷酸二氢钾0.3％，氯化铵0.3％，葡萄糖0.5％；pH 7.0)中，30℃、200r/min培养10h，转入厌氧产乳酸阶段。厌氧产乳酸阶段，加入终浓度为70g/L的葡萄糖和3％的CaCO3，在纱布外面加一层一次性手套，用报纸包裹后，用棉绳系紧，42℃静置培养36h。
发酵结束后，糖酸转化率汇总于下表2，aceF基因可温敏式丢失后的重组菌GSFD、GSFL的发酵产酸阶段糖酸转化率显著提升，由原始菌株的96％提高至99％以上。而游离表达aceF基因的GOFD、GOFL菌株，糖酸转化率较出发菌株略有降低。
表2
实施例5变温发酵工艺下高转化率合成乳酸单体
将重组菌GSFD和GSFL，以及CGMCC 11059、CGMCC 11060的甘油管冻藏物接种菌株至卡那抗性(50μg/mL)LB平板，30℃培养箱静置20h。挑取长势均匀的单菌落至50mL液体LB培养基中，30℃摇床，200r/min，12h。取5mL菌悬液接种至150mL以葡萄糖为碳源的无机盐培养基中(15.113g/LNa2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl，5g/L葡萄糖，调pH为7.0。)，30℃摇床，200r/min，10h，作为二级种子接种50L发酵罐，初始工作体积为25L。在无机盐培养基(15.113g/L Na2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，1g/L NH4Cl，0.5g/L NaCl，调pH为7.0。)中添加3wt.％的葡萄糖，33℃、通风2vvm和200～1000r/min下控制溶解氧浓度不低于20％，培养8h，过程中通过流加25wt.％氨水维持发酵液pH 7.0，当菌体OD600达到30后，关闭通风并降低转速到200r/min，提高发酵温度到42℃，将总量230g/L的葡萄糖(以起始发酵液体积计，葡萄糖的添加总量约为230g/L发酵液)分4批补加入发酵罐，流加25wt.％氢氧化钙悬浊液维持发酵液pH 7.0。当残糖浓度低于0.5g/L时，结束发酵；
此发酵条件下，发酵周期约29h，重组菌GSFD和GSFL的D-乳酸和L-乳酸的生产水平在162～168g/L之间，平均产酸速率达到5.66g/(L h)～5.82g/(L h)，发酵产酸阶段糖酸转化率为99.1％～99.5％，D-乳酸和L-乳酸的光学纯度均高于99.9％，化学纯度均高于98％(表3)。
表3
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (10)

1.一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述工程菌以具有乳酸生产能力的菌株为宿主，通过温敏型质粒在宿主内游离表达PDH复合体中的关键酶的编码基因，然后再缺失宿主染色体上的上述关键酶的编码基因获得的。
2.如权利要求1所述的一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述PDH复合体中的关键酶是二氢硫辛酰胺转乙酰基酶E2p，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；E2p由aceF基因编码，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述温敏型质粒选自pKD3，pKD4，pKD46，pKD20或pKD13。
4.如权利要求1所述的一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述具有乳酸单体生产能力的宿主菌株包括大肠杆菌、酿酒酵母、热带假丝酵母、凝结芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌。
5.如权利要求4所述的一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌CGMCC NO.11059或CGMCC NO.11060。
6.如权利要求1所述的一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述生产乳酸单体的基因工程菌，是以大肠杆菌CGMCC NO.11059或CGMCCNO.11060为宿主，将二氢硫辛酰胺转乙酰基酶的编码基因aceF、启动子PldhA和终止子TldhA克隆至温敏型质粒pKD46中，获得重组质粒pKD-PldhA-aceF，并将重组质粒pKD-PldhA-aceF转化至上述宿主中，之后敲除宿主菌中染色体上的aceF基因，获得重组大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的一株生产乳酸的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌CGMCCNO.11060为宿主，获得可代谢利用葡萄糖高转化率合成L-乳酸单体的大肠杆菌GSFL；以大肠杆菌CGMCC NO.11059为宿主获得可代谢利用葡萄糖高转化率合成D-乳酸单体的大肠杆菌GSFD。
8.权利要求1-7任意一项所述基因工程菌在生产乳酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，采用上述基因工程菌通过发酵罐发酵生产乳酸的方法如下：
在无机盐培养基中添加2～5wt.％的葡萄糖，以0.1％～10％的接种量接入生产菌株，在25～35℃、通风0.1～3vvm和200～1000r/min下控制溶解氧浓度不低于20％培养4～16h，过程中维持发酵液pH 6.0～7.5，当菌体OD600达到10～50后关闭通风并降低转速到0～200r/min，提高发酵温度到35～55℃进入乳酸合成阶段，期间补加葡萄糖，葡萄糖补加总量为200～270g/L发酵液；乳酸合成阶段维持发酵液pH 6.0～7.5；当残糖浓度低于0.5g/L时，或耗糖速率低于1g/(L·h)时，或发酵液固形物含量过高难以搅拌时，结束发酵，发酵周期26～36h。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，采用上述基因工程菌通过摇瓶发酵生产乳酸的方法如下：
在摇瓶发酵培养基中，按初始OD600为0.05～0.2接入种子液，先好氧阶段25～37℃、100～250r/min培养8～16h，使菌体生长起来，再转入厌氧产乳酸阶段，厌氧产乳酸阶段，加入终浓度为10～80g/L的葡萄糖和终浓度2％～8％的CaCO3，37～50℃静置培养12～50h。
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