CN102392056A - 一种基因工程菌株及利用该菌株生产二羟基丙酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因工程技术领域的菌株及利用该菌株生产二羟基丙酮(DHA)的方法，利用修饰的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)将甘油生物转化为二羟基丙酮，该修饰的氧化葡萄糖酸杆菌经修饰增加了sldAB基因的表达，并且敲除了mgdh基因和madh基因。该修饰的氧化葡萄糖酸杆菌还进一步经过了在葡萄糖为唯一碳源的培养基上的适应性进化。本发明的基因工程菌能够在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长良好，克服了野生型氧化葡萄糖酸杆菌只能利用价格相对较高的山梨醇、甘露醇作为有效碳源的不足，节约了生产成本。而且，在葡萄糖上培养的基因工程菌GAN比在山梨醇上培养的基因工程菌GAN具有更高的生产二羟基丙酮(DHA)的能力。

Description

一种基因工程菌株及利用该菌株生产二羟基丙酮的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基因工程技术领域的菌株及利用该菌株生产二羟基丙酮(DHA)的方法。

背景技术

二羟基丙酮(简称DHA)是一种重要的化工原料，医药、农药合成中间体和功能添加剂，用途十分广泛。二羟基丙酮是一种重要的化妆品的配方原料，尤其是作为防晒霜能阻止皮肤水分流失，起到保湿、防晒和防紫外线辐射的作用。二羟基丙酮是联系糖代谢和脂肪代谢重要的中间产物，能有效调节糖代谢与脂肪代谢的关系。体外供给二羟基丙酮，能有效地减缓脂肪合成速率，从而起到减肥作用。二羟基丙酮作为饲料添加剂喂养禽畜动物能使脂肪含量减少，蛋白质含量增加，从而使动物体的瘦肉率大大提高。另外，二羟基丙酮还可作为抗病毒试剂。DHA在国外已得到了工业应用，而目前我国生产DHA技术仍较落后，大多依赖进口。

目前，工业生产二羟基丙酮的方法主要是微生物转化甘油。该方法是利用微生物自身产生的山梨醇脱氢酶，使甘油分子结构上的仲位羟基进行脱氢反应生成DHA。利用的微生物主要是醋酸杆菌属的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)。氧化葡萄糖酸杆菌是一种重要的工业应用微生物，其膜上有许多多羟基化合物的脱氢酶，能够不完全氧化许多多羟基化合物，底物无需进入胞内即可被氧化直接排到培养基当中。由于反应快速、消耗能量低、分离产物简单，它的这些特性被广泛应用于工业生产过程，如生产维生素C、酮基葡萄糖酸、二羟基丙酮、醋酸等。最近，氧化葡萄糖酸杆菌还应用于合成一些新的化合物，如，L-核酮糖、D-塔格糖、米格列醇和手型的醇或酸等。2005年，氧化葡萄糖酸杆菌621H测序成功，这有利于进一步理解代谢网络和呼吸链机制，这必然会促进氧化葡萄糖酸杆菌在工业领域生产过程的改善以及新方法的应用。

利用氧化葡萄糖酸杆菌生产二羟基丙酮过程中，高浓度的底物甘油和产物二羟基丙酮会对细胞造成不可逆伤害，抑制细胞生长，这是工业生产DHA过程中遇到的一个难题。为消除底物抑制和产物抑制，可以优化培养发酵工艺，改进培养方式如固定化细胞法、静止细胞法，采用分批补料发酵或连续发酵法。另一方面可以筛选能够耐受高浓度底物和产物且具有高山梨醇脱氢酶活性的优良菌株，以提高甘油转化成DHA的效率。最近，氧化葡萄糖基因组测序成功，为基因工程菌的构建提供有利条件。结合代谢工程构建基因工程菌是一条从根本上解决二羟基丙酮生产过程中的抑制现象提高菌株生产能力的途径。

中国专利申请CN102146415A公开了一株能够利用葡萄糖为唯一碳源的氧化葡萄糖酸杆菌GDHE，其是氧化葡萄糖酸杆菌的mgdh基因敲除突变菌。与过去常用的山梨醇为碳源的培养基相比，该菌株在葡萄糖为碳源的培养基上获得的静息细胞能高产甘油脱氢酶。本发明人在氧化葡萄糖酸杆菌GDHE的基础上经过进一步的基因工程改造获得了一株能够在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长良好，同时可但GDHE菌株不耐受高浓度甘油，其转化甘油制备二羟基丙酮的效率有待进一步提高。本菌株能够利用来源广泛、供应充足、价格便宜的葡萄糖为碳源。

发明内容

本发明为了克服现有的二羟基丙酮为生物转化法中修饰的氧化葡萄糖酸杆菌GDHE对甘油底物不耐受的缺陷，并进一步提高其转化率，从而提供一种利用修饰的氧化葡萄糖酸杆菌生产二羟基丙酮的方法及其所用的氧化葡萄糖酸杆菌的修饰菌株和载体，该修饰菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长良好，同时可耐受高浓度甘油并且高效率转化甘油制备二羟基丙酮。

本发明的技术方案之一是：一种生产二羟基丙酮的方法，包括利用修饰的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)将甘油生物转化为二羟基丙酮，其中，所述的修饰的氧化葡萄糖酸杆菌经过修饰从而增加了sldAB基因的表达，并且敲除了mgdh基因和madh基因。

优选的，所述的sldAB基因编码下述(A)或(B)所示的蛋白质：

(A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质和SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白质；

(B)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脱氢酶亚基A活性的蛋白质，和SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脱氢酶亚基B活性的蛋白质。

优选的，所述的sldAB基因是下述(a)或(b)所示的DNA：

(a)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA；

(b)能够与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有山梨醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

优选的，所述的mgdh基因编码下述(A1)或(B1)所示的蛋白质：

(A1)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的蛋白质；

(B1)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质。

优选的，所述的mgdh基因是下述(a1)或(b1)所示的DNA：

(a1)SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的DNA；

(b1)能够与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

优选的，所述的mgdh基因编码下述(A2)或(B2)所示的蛋白质：

(A2)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的蛋白质；

(B2)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质。

优选的，所述的mgdh基因是下述(a2)或(b2)所示的DNA：

(a2)SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA；

(b2)能够与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

优选的，所述的sldAB基因的表达是通过增加sldAB基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达调控序列而得到增强的。

优选的，所述的敲除基因是通过基因打靶技术得到的。

优选的，所述的修饰的氧化葡萄糖酸杆菌还进一步经过了在葡萄糖为唯一碳源的培养基上得适应性进化。

优选的，所述的修饰的氧化葡萄糖酸杆菌是修饰的氧化葡萄糖酸杆菌621H。

本发明的技术方案之二是：一种高效转化生产二羟基丙酮的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因工程菌的制备方法，包括以下步骤：

1)通过基因打靶将一构建物定点引入氧化葡萄糖酸杆菌，所述的构建物含有两个作为同源重组臂的mgdh基因片段和至少一个选择性标记基因片段；

2)通过基因打靶将一构建物定点引入氧化葡萄糖酸杆菌，所述的构建物含有两个作为同源重组臂的madh基因片段和至少一个选择性标记基因片段；

3)增加氧化葡萄糖酸杆菌中的sldAB基因的表达；

4)将经过步骤1)至3)制备而得的氧化葡萄糖酸杆菌突变菌在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行适应性进化培养。

其中，优选的，所述的适应性进化培养是将菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行培养，每天达到指数生长中期时转接一次，直至比生长速率稳定。步骤3)增加氧化葡萄糖酸杆菌中的膜结合PQQ依赖型乙醇脱氢酶的表达的方法是常规方法，如增加氧化葡萄糖酸杆菌中的sldAB基因的拷贝数，或者修饰该基因的表达调控序列。倍增sldAB基因，较佳的如将含有sldAB基因表达盒的重组表达载体导入氧化葡萄糖酸杆菌突变菌。

本发明的技术方案之三是：一种高效转化生产二羟基丙酮的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，其是氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除突变菌，其中敲除的基因是膜结合mgdh基因和madh基因，并且还含有多拷贝数的sldAB基因或者修饰的表达调控序列的sldAB基因。其中，优选的，本基因工程菌由在葡萄糖为唯一碳源的培养基上适应性进化而得。优选的，所述的适应性进化是将菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行培养，每天达到指数生长中期时转接一次，直至比生长速率稳定。优选的，所述的适应性进化为25天。

本发明的技术方案之四是：一种用于基因敲除的重组载体，其含有两个作为同源重组臂的madh基因片段和至少一个选择性标记基因片段。其中，优选的，所述的标记基因是抗生素抗性基因。优选的，所述的各同源重组臂序列长度为1～20kb。优选的，所述的重组载体是质粒pSUP202。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明涉及一种基因工程技术领域的菌株及利用该菌株生产二羟基丙酮(DHA)的方法，具体地说，是关于一株能够利用来源广泛、供应充足、价格便宜的葡萄糖为碳源的基因工程菌并以其细胞为催化剂提高二羟基丙酮生产能力的方法。二羟基丙酮产量可达88.14g/L，甘油转化率为90％。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为本发明提供的基因工程菌GAN构建过程

图2为madh敲除菌株GDHEΔadh的PCR鉴定结果示意图，显示madh基因已经被敲除。其中泳道1：DNA marker III；泳道2：野生型621H菌株PCR产物(2.3kb)；泳道3：GDHE菌株PCR产物(2.3kb)；泳道4：GDHEΔadh菌株PCR产物(3.5kb)。

图3为构建的含自身启动子sldAB表达载体限制性内切酶消化鉴定结果示意图，显示含自身启动子sldAB基因已经被插入到pBBR1MCS4质粒中得到表达载体pBBR-sldAB。其中泳道1：DNA marker III；泳道2：含自身启动子sldAB基因PCR产物(3.0kb)；泳道3：表达载体pBBR-sldAB经EcoRI和XbaI消化后得到含自身启动子sldAB基因片段(3.0kb)及质粒片段(5.0kb)。

图4为GDHEΔadh pBBR-sldAB在葡萄糖为唯一碳源的培养基上的进化过程。

图5为菌株GDHE(◆)和GAN(■)分别在山梨醇培养基(实线)和葡萄糖培养基(虚线)上的催化40g/L甘油底物(a)或100g/L甘油底物(b)的过程。

具体实施方式

本发明提供一株用于生物转化高效生产二羟基丙酮的基因工程菌。初始菌GDHE是氧化葡萄糖酸杆菌的mgdh基因敲除突变菌。其缺失了膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶并且在葡萄糖培养基上进化了50天实验室适应性进化的氧化葡萄糖酸杆菌621H。

由于在高浓度甘油底物浓度下，氧化葡萄糖酸杆菌膜上的PQQ依赖型的乙醇脱氢酶会将甘油转化为甘油酸，而甘油酸会抑制细胞酶活性并且使下游分离过程复杂化。因此为了提高细胞对甘油的耐受性，消除膜结合乙醇脱氢酶催化导致的甘油酸积累，本发明在GDHE的基础上敲除负责编码膜结合PQQ依赖型乙醇脱氢酶的基因madh。同时本发明过量表达负责编码氧化甘油生成二羟基丙酮的膜结合山梨醇脱氢酶的基因sldAB。过量表达负责转化甘油为二羟基丙酮的关键酶PQQ依赖型的山梨醇脱氢酶可以提高细胞酶产量从而提高菌株二羟基丙酮生产能力。

过量表达蛋白破坏了胞内代谢平衡引起细胞生长衰退，因此本发明将所得的基因工程菌进行25天葡萄糖培养基上的实验室适应进化，通过代谢进化的方法，恢复了菌株在葡萄糖上的生长能力，最终得到本发明提供的基因工程菌GAN。该菌株能够利用葡萄糖为碳源，而且生长良好。葡萄糖培养基中获得的静息细胞比山梨醇培养基中获得的静息细胞具有更高的DHA生产能力。基因工程菌GAN比野生型菌株及GDHE具有更高的DHA生产速率。GAN适宜用于工业生产应用，具有较高菌体得率和较强二羟基丙酮生产能力。

用于本发明的微生物没有特别限制，只要是选自醋酸杆菌属。作为用于修饰菌的亲本株，特别理想的是氧化葡萄糖酸杆菌科。

本发明中通过常规的基因敲除的方法敲除了mgdh基因和madh基因。例如采用基因打靶技术。基因打靶中采用基因敲除载体，该载体含有两个作为同源重组臂的mgdh/madh基因片段和至少一个选择性标记基因片段。两同源臂和基因组同源序列发生同源重组，继而靶序列被敲除，同时载体上的选择性标记基因插入到了基因组的靶序列附近。在两重组臂中间是选择性标记基因片段。所述的标记基因可以是使用已知的任何标记基因，只要方便将正确和载体起作用的宿主细胞挑选出来即可。一般采用抗生素抗性基因。所述的载体可以是常规，如质粒pSUP202。

本发明中的sldAB基因、mgdh基因和madh基因意指属于氧化葡萄糖酸杆菌科的微生物的sldAB基因、mgdh基因和madh基因或其同源物。

sldAB基因、mgdh基因和madh基因的其同源物是指这样的基因：其来源于另一种微生物，但与氧化葡萄糖酸杆菌属的sldAB基因、mgdh基因和madh基因显示高度的结构相似性，且被引入宿主时，编码具有山梨醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶酶或者乙醇脱氢酶活性的蛋白质。sldAB基因、mgdh基因和madh基因的同源物的实例包括如在GenBank登记的基因。

sldAB基因、mgdh基因和madh基因的同源物可以从一些微生物中克隆获得，也可以从已知数据库中基于前述序列信息获得。

此外，用于本发明的sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因并不限于野生型基因，其可为编码SEQ ID NO：2、3、5、7中一个或多个位置上包含一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加而得到的氨基酸序列的蛋白质的突变体或人工修饰基因，只要所编码的蛋白质的具有山梨醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或者乙醇脱氢酶活性。

此外，作为sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因，可使用与序列SEQ ID NO：1、4、6的全核苷酸序列显示80％或更多同源性，优选94％或更多同源性并编码具有山梨醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或者乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。

此外，sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因的密码子可用方便sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因引入的宿主使用的密码子替代。

而且，sldAB基因、mgdh基因和/或madh基因还可为在严格条件下更够分别与SEQ IDNO：1、4或6的核苷酸序列互补的序列，或可从这些序列制备的探针杂交，并编码具有山梨醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或者乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。本发明中所指的“严格条件”是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。实例包括如彼此显示高度同源性的DNA，例如显示不少于80％同源性，优选不少于94％同源性的DNA彼此杂交，而低于上述水平的同源性的DNA不彼此杂交的条件，以及一般Southern杂交中的洗涤条件，即在60℃，1×SSC，0.1％SDS的条件下系第一次或多次。

本发明中，“基因表达的增加”意指所属基因的转录和/或基因翻译的增加。用于增强sldAB基因的表达的修饰可通过利用例如基因重组技术增加所述基因在细胞中的拷贝数来获得。如，通过将含有sldAB基因的DNA片段连接于在宿主细胞中起作用的载体(优选多拷贝载体)，制备重组载体并将其引入氧化葡萄糖酸杆菌，来增加基因的拷贝数。

在宿主细胞中起作用的载体包括可在氧化葡萄糖酸杆菌自主复制的载体。在氧化葡萄糖酸杆菌中较佳的可以选择pBBR1MCS系列载体。pBBR1MCS是一类用于革兰氏阴性菌的广宿主克隆载体，带有不同的抗性筛选标记。由不同的抗性分别有pBBR1MCS-1、pBBR1MCS-2、pBBR1MCS-3、pBBR1MCS-4。此外，还可以根据抗性等情况选择其它适用于革兰氏阴性菌的质粒。

为了将所述的制备的重组载体引入氧化葡萄糖酸杆菌，可使用迄今为止报道的任何已知的方法。例如采用大肠杆菌-真菌穿梭载体携带sldAB基因，制备大肠杆菌转化子，在帮助菌的帮助下和氧化葡萄糖酸杆菌进行三亲本接合，获得的接合子。也可以用电转化法，如将氧化葡萄糖酸杆菌受体菌种子以1％的接种量，在100ml山梨醇培养基(山梨醇80g/L，酵母粉20g/L，KH2PO41.5g/L，(NH4)2SO41.5g/L和MgSO4·7H2O 0.5g/L)里，30℃，220rpm，培养18h，然后离心，用无菌10％甘油洗涤，离心，反复3次，最后悬浮在1ml10％甘油里，使细胞浓度达到1010cells/ml为宜，50μl分装，-80℃保存。使用Gene-Pulser(Bio-Rad，MicroPulserTM，U.S.A.)电转化仪转化，50μl感受态细胞液与0.5μg左右的核酸混匀，冰浴30min，然后混合液移入预冷的电转杯中，经过1.8千伏，6.0毫秒的脉冲，细胞立即用0.9ml山梨醇培养液稀释，转入试管，150rpm，30℃培养4h。然后，细胞液涂布到有抗性的山梨醇固体培养基30℃培养，筛选出重组菌。

也可以通过将如上所述的sldAB基因的多拷贝整合入氧化葡萄糖酸杆菌基因组，如通过靶向基因组的同源重组，将所述基因以串联形式连接于基因组sldAB基因旁侧，或者将所述基因引入基因组中的非必须基因中，从而使所述基因以多拷贝数存在。

除了如上所述通过增加基因拷贝书之外，还可以通过用强启动子来替代基因组或质粒上sldAB基因的表达调控序列启动子。

本发明所述的氧化葡萄糖酸杆菌经过基因敲除和倍增后，在葡萄糖培养基上出现生长衰退现象，为此进行了实验室适应性进化培养。实验室适应性进化培养是常规的方法，如在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行培养，每天达到指数生长中期时转接一次，直至获得最大比生长速率稳定的菌株。进化培养时间本发明优选25天左右。

本发明进化培养后的菌株生长速率稳定，在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长良好。将该菌株扩大培养，分离出静息细胞，悬于缓冲液中，加入甘油进行催化反应生成DHA。这些都可通过已知的现有技术完成。

本发明的DHA高产菌株构建方法的一较佳实施方式包括以下步骤：

1.构建madh基因敲除的菌株GDHEΔadh。参见文献，以质粒pSUP202为载体，依次连接上adh1基因、卡那抗性基因、adh2基因得到质粒pSUP202-3-adhA::Km(Wei，L.J.，X.P.Yang，et al.Characterization of Enzymes in the Oxidation of 1，2-Propanediol tod-(-)-Lactic Acid by Gluconobacter oxydans DSM 2003.Molecular Biotechnology.2010，46(1)：26-33.)。以含单基因敲除载体pSUP202-3-adhA::Km的大肠杆菌为供体，氧化葡萄糖酸杆菌GDHE为受体，含质粒pRK2013的大肠杆菌为帮助菌进行三亲本接合，获得的接合子即为madh基因敲除菌GDHEΔadh。

2.构建含单基因表达载体pBBR-sldAB的大肠杆菌转化子。以氧化葡萄糖酸杆菌621H的基因组为模板扩增包含自身启动子的sldAB基因。将上述片段插入到有氨苄西林抗性的质粒pBBR1MCS4上，获得单基因表达载体pBBR-sldAB。将上述载体转入到大肠杆菌感受态细胞中，获得含单基因表达载体pBBR-sldAB的大肠杆菌转化子。

3.构建过表达sldAB基因的菌株GDHEΔadh pBBR-sldAB。以含表达载体pBBR-sldAB的大肠杆菌为供体，氧化葡萄糖酸杆菌GDHEΔadh为受体，含质粒pRK2013的大肠杆菌为帮助菌进行三亲本接合，获得的接合子即为sldAB过表达重组菌GDHEΔadhpBBR-sldAB。

4.由于GDHEΔadh pBBR-sldAB在葡萄糖培养基上出现生长衰退现象，将上述菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行培养，每天达到指数生长中期时转接一次，经25天实验室适应性进化后获得最大比生长速率稳定的菌株GAN。GAN在葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长良好。

5.采用获得的GAN静息细胞催化甘油生成DHA。将GAN接种到以葡萄糖为唯一碳源的培养基中培养至指数生长末期。上述培养液12,000rpm在4℃离心10分钟后收集菌体用pH＝6.0的磷酸缓冲液洗涤，重复上述步骤3次后，细胞重悬于磷酸缓冲液。在该重悬液中加入甘油进行催化反应生成DHA。

mgdh基因，膜结合PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶；madh基因，膜结合PQQ依赖型乙醇脱氢酶；sldAB基因，膜结合山梨醇脱氢酶。

SEQ ID NO：1：sldAB基因；SEQ ID NO：2：sldAB基因表达的蛋白，SldA；SEQ ID NO：3：sldAB基因表达的蛋白，SldB；SEQ ID NO：4：mgdh基因；SEQ ID NO：5：mgdh基因表达的蛋白，GDH；SEQ ID NO：6：madh基因；SEQ ID NO：7：madh基因表达的蛋白，ADH。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1敲除菌株GDHEΔadh的构建

利用同源交换的方法进行氧化葡萄糖酸杆菌GDHE基因组中膜结合乙醇脱氢酶(madh)基因的敲除。膜结合乙醇脱氢酶能够将乙醇氧化生成乙醛，乙醛经膜结合的乙醛脱氢酶进一步氧化为乙酸。具体如下：

1.1敲除载体pSUP202-3-adhA::Km的构建

参见文献，以质粒pSUP202为载体，依次连接上adh1基因、卡那抗性基因、adh2基因得到质粒pSUP202-3-adhA::Km(Wei，L.J.，X.P.Yang，et al.Characterization ofEnzymes in the Oxidation of 1，2-Propanediol to d-(-)-Lactic Acid by Gluconobacter oxydansDSM 2003.Molecular Biotechnology.2010，46(1)：26-33.)。

1.2将敲除载体导入氧化葡萄糖酸杆菌胞内完成基因敲除

①供体菌的建立：用重组质粒pSUP202-3-adhA::Km转化感受态E.coli JM109(购买自Novagen公司)，得到含有重组质粒pSUP202-3-adhA::Km的E.coli JM109。

帮助菌的建立：用质粒pRK2013(购于Clontech公司)转化感受态E.coli HB101(购买自Novagen公司)，得到含有帮助质粒pRK2013的E.coli HB101。

②菌体培养：分别将供体菌、帮助菌接种在加有卡那霉素抗性100mg/L的LB中培养约8小时。受体菌氧化葡萄糖酸杆菌GDHE(参见CN102146415A)接种在山梨醇培养基(山梨醇80g/L，酵母粉20g/L，KH₂PO₄1.5g/L，(NH₄)₂SO₄1.5g/L和MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，头孢菌素100mg/L)中培养约18小时。

③三亲接合：取上述供体菌、帮助菌及受体亲本菌液12000rpm离心，倒掉上清收集菌体，用生理盐水悬浮，重复上述步骤洗涤两次。按照1∶1∶1的比例将上述三株菌混合，离心收集菌体后，用山梨醇培养基洗一次，倒掉一部分上清，在剩下的少量培养基中用微量移液器将细胞混匀，转移到不加抗生素的固体山梨醇培养基上涂布，30℃倒置培养过夜。

重组质粒pSUP202-3-adhA::Km可以在帮助菌的帮助下进入氧化葡萄糖酸杆菌GDHE，由于其上带有膜结合乙醇脱氢酶的同源片段(adh1，adh2)，因此可以和氧化葡萄糖酸杆菌GDHE染色体上的madh DNA片段发生双交换，将含卡那霉素抗性基因的madh片段整合到氧化葡萄糖酸杆菌GDHE的染色体上，从而使膜结合乙醇脱氢酶基因失活。

④接合子的筛选：将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体山梨醇培养基上洗下，涂布到加入庆大霉素和卡那霉素各100mg/L的固体山梨醇培养基平板上，培养2～4天。氧化葡萄糖酸杆菌GDHE本身具有庆大霉素抗性，庆大霉素用于杀死三亲本结合过程中没有庆大霉素抗性的大肠杆菌。质粒pSUP202是自杀质粒，进入受体菌后不久就不能存在，只有含卡那霉素抗性基因的madh片段整合到染色体上的氧化葡萄糖酸杆菌GDHE才具卡那霉素抗性，因此通过庆大霉素和卡那霉素来筛选三亲接合子。

1.3敲除菌的筛选和验证

将筛选到的接合子接种于山梨醇培养基上，以其各自全基因组DNA为模板，利用以下引物分别做菌落PCR验证。引物1：5′-ACTTCTGGTCTACTGAC-3′；引物2：5′-TCTCAGATACCAGCCTG-3′。如图2所示，由于敲除菌的adh基因中插入卡那霉素抗性基因，所以敲除菌PCR产物较原始菌621H及突变株GDHE的PCR产物滞后。根据此原则，去除初筛中得到的假阳性菌落，挑取目的片段滞后的菌落即得到敲除菌GDHEΔadh。

实施例2过表达菌株GDHEΔadhpBBR-sldAB的构建

1.表达载体pBBR-sldAB的构建及其供体菌的建立

提取氧化葡萄糖酸杆菌621H(购买自德国DSMZ股份有限公司)的全基因组DNA，以其为模版，利用以下引物对PCR扩增带有自身启动子的sldAB基因片段。引物1：5′-CGCTCTAGAACAACACCTGGTTCTGGAT-3′，带下划线的碱基为XbaI酶切位点；引物2：5′-GCTTCCCACCCGAATTCTGGAAAAAACG-3′，带下划线的碱基为EcoRI酶切位点。

回收PCR产物，XbaI和EcoRI双酶切，连接到载体pBBR1MCS-4(参考文献KovachME，Elzer PH，Hill DS，Robertson GT，Farris MA，Roop RM，and Peterson KM.Four newderivatives of the broad-hostrange cloning vector pBBR1MCS carrying differentantibioticresistance cassettes.Gene.1995，166：175-176.向美国路易斯安那州立大学医学中心微生物学与免疫学系Kovach ME教授索取。)上，从而得到重组质粒pBBR-sldAB。用重组质粒pBBR-sldAB转化感受态E.coli JM109(购买自Novagen公司)，筛出具有氨苄西林抗性的E.coli JM109菌株作为初筛菌。以XbaI和EcoRI两种限制性内切酶消化初筛菌的质粒。如图3所示，由于阳性克隆的质粒上插入自身启动子的sldAB基因片段(3.0kb)，所以双酶切后得到两条条带，其一是带有自身启动子的sldAB基因片段(3.0kb)。根据此原则，去除初筛中得到的假阳性菌落。阳性菌落即为供体菌。

2.将表达载体导入氧化葡萄糖酸杆菌胞内完成基因过表达

①帮助菌的建立：用质粒pRK2013(购于Clontech公司)转化感受态E.coli HB101(购买自Novagen公司)，得到含有帮助质粒pRK2013的E.coli HB101。

②菌体培养：分别将供体菌、帮助菌接种在各加有氨苄西林抗性100mg/L和卡那霉素抗性100mg/L的LB中培养约8小时。受体菌氧化葡萄糖酸杆菌GDHEΔadh接种在山梨醇培养基(山梨醇80g/L，酵母粉20g/L，KH₂PO₄1.5g/L，(NH₄)₂SO₄1.5g/L andMgSO₄·7H₂O 0.5g/L，庆大霉素100mg/L，卡那霉素100mg/L)中培养约18小时。

③三亲接合：取上述供体菌、帮助菌及受体亲本菌液12000rpm离心，倒掉上清收集菌体，用生理盐水悬浮，重复上述步骤洗涤两次。按照1∶1∶1的比例将上述三株菌混合，离心收集菌体后，用山梨醇培养基洗一次，倒掉一部分上清，在剩下的少量培养基中用微量移液器将细胞混匀，转移到不加抗生素的固体山梨醇培养基上涂布，倒置30℃培养过夜。重组质粒pBBR-sldAB可以在帮助菌的帮助下进入氧化葡萄糖酸杆菌GDHEΔadh。

④接合子的筛选：将培养过夜的三亲接合菌体用无菌双蒸水从固体山梨醇培养基上洗下，涂布到加入庆大霉素、卡那霉素和氨苄西林各100mg/L的固体山梨醇培养基平板上，培养2～4天。氧化葡萄糖酸杆菌GDHEΔadh具有庆大霉素和卡那霉素抗性，庆大霉素及卡那霉素用于杀死三亲本结合过程中没有庆大霉素和卡那霉素抗性的大肠杆菌。含氨苄西林抗性的质粒pBBR-sldAB，进入受体菌后才能在含有庆大霉素、卡那霉素和氨苄西林的固体山梨醇培养基平板上生长。得到能够同时耐受庆大霉素、卡那霉素和氨苄西林的氧化葡萄糖酸杆菌GDHEΔadhpBBR-sldAB。

实施例3GDHEΔadhpBBR-sldAB在葡萄糖培养基上的适应性进化

在250ml的摇瓶中放置50ml培养基，培养基成分为：葡萄糖20g/L，酵母粉20g/L，KH₂PO₄1.5g/L，(NH₄)₂SO₄1.5g/L and MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，庆大霉素100mg/L，卡那霉素100mg/L，氨苄西林100mg/L。接种GDHEΔadhpBBR-sldAB，接种比例为1∶100(体积比)，大约24小时转接一次(培养过程中随菌体倍增时间的改变而改变初始接种量或者转接时间)，30℃摇床培养，每2小时测一次OD₆₀₀值，计算菌株每天在葡萄糖培养基上的最大比生长速率。如图4所示，菌株的最大比生长速率逐渐提高最后趋于稳定。将培养第25天的菌株命名为GAN。

实施例4在山梨醇培养基和葡萄糖培养基上的生长情况

分别将氧化葡萄糖酸杆菌突变体GDHE、GDHEΔadhpBBR-sldAB和GAN在山梨醇培养基中活化到OD₆₀₀＝1.0，以1％的接种量分别转接到50ml新鲜的山梨醇培养基或葡萄糖培养基中，30℃摇床培养，每2小时测一次OD₆₀₀值，计算在不同培养基上各株菌的最大比生长速率。待细菌生长到稳定期末期，确定菌体的最大细胞生长量(C_max)计算对应的干重，测定发酵液中的山梨醇或葡萄糖残余量。如表1所示，经过实验室适应性进化GAN恢复了在葡萄糖培养基上的生长能力，与GDHE相似。GAN在葡萄糖培养基上的最大细胞生长量(C_max)为0.974gCDW/L，接近于在山梨醇培养基上的最大细胞生长量，关于葡萄糖的细胞得率为0.165gCDW/g，而关于山梨醇的细胞得率仅为0.013gCDW/g，说明可以用20g/L葡萄糖代替80g/L山梨醇作为氧化葡萄糖酸杆菌突变株的碳源。

表1.菌株分别在山梨醇培养基和葡萄糖培养基上的生长情况

实施例5氧化葡萄糖酸杆菌静息细胞催化甘油情况

将氧化葡萄糖酸杆菌突变体GDHE、GAN在山梨醇培养基中活化到OD₆₀₀＝1.0，以1％的接种量分别转接到50ml新鲜的山梨醇培养基和葡萄糖培养基中，30℃摇床培养，待生长到指数生长末期，在4℃下12000rpm离心10分钟，收集菌体，用pH＝6.0的磷酸缓冲液洗涤3遍，最后用pH＝6.0的磷酸缓冲液重悬。每个100ml锥形瓶中的催化反应体系包括菌体1.0gDCW/L(OD₆₀₀＝3.0)，甘油40g/L和pH＝6.0的磷酸缓冲液共10ml。在30℃条件下，于220rpm转速的摇床中转化生产二羟基丙酮，每隔一定时间取样，样品在12000rpm离心10分钟取上清，检测发酵液中的二羟基丙酮浓度。转化24小时反应结束后测定甘油的最终残余量。

如图5(a)所示，葡萄糖培养基上获得的静息细胞比山梨醇培养基上获得的静息细胞具有更快的催化速率和更好的二羟基丙酮生产能力。由于高浓度底物和产物的抑制，12小时后GDHE将甘油氧化为二羟基丙酮的反应基本结束。葡萄糖培养基和山梨醇培养基上获得的GAN静息细胞甘油的转化率分别为99％和96％，而葡萄糖培养基和山梨醇培养基上获得的GDHE静息细胞甘油的转化率均为53％。

实施例6不同浓度甘油底物反应

按照实施例5相同的步骤进行反应，不同在于所用甘油底物浓度的不同。图5为菌株GDHE(◆)和GAN(■)分别在山梨醇培养基(实线)和葡萄糖培养基(虚线)上的催化40g/L甘油底物(a)或100g/L甘油底物(b)的过程。

如图5b所示，将甘油底物浓度提高为100g/L，相较于山梨醇培养基上获得的静息细胞，葡萄糖培养基上获得的静息细胞在催化甘油为二羟基丙酮的反应速率和二羟基丙酮生产能力方面的优势更加明显，二羟基丙酮产率提高33％～35％。45小时后葡萄糖培养基上获得的GAN静息细胞二羟基丙酮产量为88.14g/L，是山梨醇培养基上获得是GDHE静息细胞二羟基丙酮产量的2.5倍。葡萄糖培养基上获得的GAN静息细胞甘油的转化率为90％。与图5(a)相比，可能由于底物和产物的毒害作用，提高底物浓度到100g/L后，细胞的甘油转化率均降低，但明显葡萄糖培养基上获得的GAN具有更强的耐受高浓度甘油和二羟基丙酮的能力。

综上所述，基因工程菌GAN可以采用相对低廉的葡萄糖作为碳源进行培养，并且可以获得较高的生长速率和菌体得率，同时葡萄糖的消耗量仅为20g/L要远远低于工业上应用的山梨醇浓度80g/L，降低了生产成本，除此之外在葡萄糖培养基上得到的静息细胞具有更高的二羟基丙酮生产能力。敲除madh同时过量表达sldAB提高了氧化葡萄糖酸杆菌甘油和二羟基丙酮的耐受能力，同时二羟基丙酮生产能力也明显提高。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种生产二羟基丙酮的方法，包括利用修饰的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)将甘油生物转化为二羟基丙酮，其特征在于，所述的修饰的氧化葡萄糖酸杆菌经修饰增加了sldAB基因的表达，并且敲除了mgdh基因和madh基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sldAB基因编码下述(A)或(B)所示的蛋白质：

(A)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质和SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白质；

(B)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脱氢酶亚基A活性的蛋白质，和SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有山梨醇脱氢酶亚基B活性的蛋白质；

所述的mgdh基因编码下述(A1)或(B1)所示的蛋白质：

(A1)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的蛋白质；

(B1)SEQ ID NO：5所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质；

所述的madh基因编码下述(A2)或(B2)所示的蛋白质：

(A2)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的蛋白质；

(B2)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位而得到的氨基酸序列，并就具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sldAB基因是下述(a)或(b)所示的DNA：

(a)SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA；

(b)能够与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有山梨醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA；

所述的mgdh基因是下述(a1)或(b1)所示的DNA：

(a1)SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的DNA；

(b1)能够与SEQ ID NO：4所示核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA；

所述的mgdh基因是下述(a2)或(b2)所示的DNA：

(a2)SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的DNA；

(b2)能够与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列互补的序列或者与可从该核苷酸序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sldAB基因的表达是通过增加sldAB基因的拷贝数或通过修饰该基因的表达调控序列而得到增强的。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的敲除基因是通过基因打靶技术得到的。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰的氧化葡萄糖酸杆菌还进一步经过了在葡萄糖为唯一碳源的培养基上的适应性进化。

7.一种高效转化生产二羟基丙酮的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过基因打靶将一构建物定点引入氧化葡萄糖酸杆菌，所述的构建物含有两个作为同源重组臂的mgdh基因片段和至少一个选择性标记基因片段；

2)通过基因打靶将一构建物定点引入氧化葡萄糖酸杆菌，所述的构建物含有两个作为同源重组臂的madh基因片段和至少一个选择性标记基因片段；

3)增加氧化葡萄糖酸杆菌中的sldAB基因的表达；

4)将经过步骤1)至3)制备而得的氧化葡萄糖酸杆菌突变菌在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行适应性进化培养。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的适应性进化培养是将菌株在葡萄糖为唯一碳源的培养基上进行培养，每天达到指数生长中期时转接一次，直至比生长速率稳定。

9.一种高效转化生产二羟基丙酮的氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌，其特征在于，其是氧化葡萄糖酸杆菌的基因敲除突变菌，其中敲除的基因是膜结合mgdh基因和madh基因，并且还含有多拷贝数的sldAB基因或者修饰的表达调控序列的sldAB基因。

10.如权利要求9所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌由在葡萄糖为唯一碳源的培养基上适应性进化而得。

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