CN109097293B - 一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程毕赤酵母及其构建方法。本发明将α‑淀粉酶基因、糖化酶基因和乳酸脱氢酶基因通过毕赤酵母表达载体pTEFZαA整合至毕赤酵母基因组上构建而成。本发明构建的毕赤酵母发酵生产乙醇的能力低，可以减少碳源的流失，减少副产物的生成，增加乳酸的产率。其次，在发酵生产乳酸的过程中，无需另外添加商业化淀粉水解酶，简化了在发酵餐厨废弃物过程中的实际操作步骤，也降低了生产成本，更适用于工业化运用。

Description

一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母

技术领域

本发明涉及遗传工程及发酵工程领域，尤其涉及一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母及其构建方法。

背景技术

餐厨废弃物又称泔水、潲水，是居民在生活消费中形成的废弃物，其主要含有动物肉类，蔬菜，油脂，面包，米饭等。在化学成分上，主要含有蛋白质，脂肪，淀粉，纤维素等成分，其营养丰富，极易滋生金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等多种病原微生物，餐厨废弃物腐烂后会发出恶臭，对周围的空气造成污染。据统计，全球每年约有4亿吨餐厨废弃物产生，造成的浪费高达7,500亿美元，而且，随着经济的不断发展，餐厨废弃物的量在每年递增。餐厨废弃物的产生集中在城市的饭店、学校食堂等地方。但是，目前大部分的餐厨废弃物被用来喂猪、填埋，甚至制造“地沟油”，造成了严重的环境污染，仅少部分得以合理利用，比如焚烧、堆肥和沼气等等，但经济效益低下。因此，寻找一种能将餐厨废弃物进行充分资源化利用的办法，是餐厨废弃物处理面临的重要课题。

乳酸在食品，化妆品，药品以及工业上均有广泛的应用，使得乳酸的需求量在逐年上升，从2010年到2016年全球乳酸需求量从480,000吨上升到1,070,000 吨，平均每年上升14.2％。目前乳酸的生产大都是以粮食为原料，成本高，所以降低乳酸的生产成本是非常有必要的。利用餐厨废弃物生产高价值产品乳酸，不仅可以解决餐厨废弃物带来的环境污染问题，还可以变废为宝，具有巨大的社会效益。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇营养性酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源生长。生物量高，是最成功的外源蛋白表达宿主之一。其具有以下几个优点： (1)毕赤酵母属于克雷布特效应阴性菌(Crabtree-negative)，在富含葡萄糖的培养基中生长时，呼吸作用不受抑制，不产生乙醇，在严格好氧的条件下能够快速生长；(2)毕赤酵母属于单细胞生物，易满足于低营养条件，生长速度快，操作简便，高密度培养工艺成熟，已能应用于工业化大规模生产的发酵罐培养，细胞干重达到150g/L；(3)外源基因的表达通常通过基因组整合的方式整合在毕赤酵母基因组上，遗传稳定，连续培养50代外源基因遗传依然稳定；(4)外源蛋白表达量高，且自身分泌蛋白量少；(5)有完善的翻译后修饰系统，能保证外源蛋白表达的活性。

但是毕赤酵母缺乏有效降解淀粉生成葡萄糖，并将葡萄糖转化成乳酸的酶，在自然条件下，毕赤酵母不能直接利用餐厨废弃物中的淀粉用于生产乳酸。因此为了以餐厨废弃物作为原料发酵生产乳酸，必须通过基因工程，将降解淀粉和生产乳酸的基因导入毕赤酵母中，以弥补其降解餐厨废弃物和成产乳酸的缺陷。使重组毕赤酵母可以利用自身合成的淀粉酶将淀粉降解成可利用的碳源，并在乳酸脱氢酶的作用下，打通毕赤酵母乳酸合成途径，最终得到目标产物乳酸。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种基因重组毕赤酵母，将α-淀粉酶基因(α-amylase，Amy)、糖化酶基因(glucoamylase，Ga)和乳酸脱氢酶基因(lactate dehydrogenase，LDH)通过毕赤酵母表达载体(pTEFZαA)整合至毕赤酵母基因组上构建而成。

所述毕赤酵母表达载体pTEFZαA为以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，以毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子(TEF)SEQ ID NO.1替换毕赤酵母表达载体pGAPZαA的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子而得。包括如下步骤：

(1)通过PCR扩增，获得毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子(TEF)DNA片段；

(2)使用限制性内切酶BglII和Bsp119I分别对上述DNA片段和载体pGAPZαA 进行双酶切，然后将TEF片段连入载体，得到TEF启动子取代了GAP启动子的毕赤酵母表达载体pTEFZαA。

上述α-淀粉酶来源于米曲霉、糖化酶来源于黑曲霉、乳酸脱氢酶来源于凝结芽孢杆菌。所述α-淀粉酶和糖化酶为胞外分泌表达；所述乳酸脱氢酶为胞内表达。

上述基因重组毕赤酵母的构建方法，包括如下步骤：

S1：利用PCR技术分别扩增α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶基因，并在三个基因序列的5’端和3’端分别加上限制性内切酶Bsp119I和XbaI识别位点；使用限制性内切酶对毕赤酵母表达载体pTEFZαA和pGAPZαA，以及分别连接至载体上的SEQ ID NO.2所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.3所示的糖化酶基因和SEQ ID NO.4所示的乳酸脱氢酶基因进行双酶切，纯化回收所需片段；

S2：使用DNA连接酶将α-淀粉酶基因和糖化酶基因分别连入毕赤酵母表达载体pGAPZαA，将乳酸脱氢酶基因连入毕赤酵母表达载体pTEFZαA，形成三个重组单基因表达载体；

S3：使用限制性内切酶将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒和糖化酶基因表达盒从重组单基因表达载体上切下，然后以串联表达盒的形式逐个接入带有乳酸脱氢酶基因的单基因表达载体中，构建出α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶三基因共表达载体；

S4：使用限制性内切酶对上述构建的三基因共表达载体进行单酶切，使其线性化后将其转入毕赤酵母，并整合到其基因组上，获得能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母。

在上述的基因重组毕赤酵母的构建方法中，步骤S3中，所述三基因共表达载体的构建包括如下步骤：

S11：使用限制性内切酶对α-淀粉酶和糖化酶重组单基因表达载体进行双酶切，回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表达盒；

S12：使用限制性内切酶对乳酸脱氢酶重组单基因表达载体进行酶切，然后将糖化酶基因表达盒连入乳酸脱氢酶单基因表达载体，构建糖化酶和乳酸脱氢酶二基因表达载体；

S13：使用限制性内切酶对步骤S12所构建的二基因表达载体进行酶切，然后将α-淀粉酶基因表达盒连入二基因表达载体，构建出α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶三基因共表达载体。

在上述的基因重组毕赤酵母的构建方法中，步骤S1中所述的限制性内切酶为Bsp119I和XbaI；步骤S4中所述的限制性内切酶为ScaI。

在上述的基因重组毕赤酵母的构建方法中，步骤S11中所述的限制性内切酶为BglII和BamHI；步骤S12中所述限制性内切酶为BglII；步骤S13中所述限制性内切酶为BglII。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用毕赤酵母共表达α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶，使毕赤酵母能直接降解餐厨废弃物并生产乳酸，具有如下有益效果：首先，毕赤酵母发酵生产乙醇的能力低，可以减少碳源的流失，减少副产物的生成，增加乳酸的产率。其次，在发酵生产乳酸的过程中，无需另外添加商业化淀粉水解酶，简化了在发酵餐厨废弃物过程中的实际操作步骤，也降低了生产成本，更适用于工业化运用。

附图说明

图1为毕赤酵母表达载体pTEFZαA的构建；

图2为α-淀粉酶(图2a)、糖化酶(图2b)、乳酸脱氢酶(图2c)单表达载体的构建；

图3为α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建；

图4为基因重组毕赤酵母淀粉水解圈实验；

图5为基因重组毕赤酵母生长曲线和淀粉酶活曲线；

图6为基因重组毕赤酵母发酵淀粉产乳酸实验；

图7为基因重组毕赤酵母发酵餐厨废弃物产乳酸结果。

具体实施方式

为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步阐述。

实施例1：

本实施例所用的毕赤酵母x-33由分子生物研究中心保存，毕赤酵母商业化表达载体pGAPZαA购至Invitrogen公司。

一、毕赤酵母表达载体pTEFZαA的构建

1、参照NCBI公布的毕赤酵母转录延伸因子1-α基因(登录号为 CP014586.1)，运用primer 5.0设计引物并添加相应的酶切位点，克隆其编码区上游700bp的序列，引物序列如下：

pTEF-F：5'GCAGATCTCCAACTTCAGTGAAAAGTTCACCCG 3'(划线处为BglII酶切位点)

pTEF-R：5'GCTTCGAAGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGT 3'(划线处为Bsp119I酶切位点)

以毕赤酵母x-33基因组DNA为模板通过PCR扩增反应获得TEF启动子片段，将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体(Takara)上，测序验证。

PCR反应条件为：

以限制性内切酶BglII和Bsp119I对步骤1所得经测序验证的TEF片段和商业化载体pGAPZαA进行切割，回收TEF片段以及pGAPZαA骨架，然后以T4 DNA连接酶将TEF片段连入pGAPZαA骨架中，得到新的表达载体pTEFZαA。

二、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶单基因表达载体的构建

1、根据α-淀粉酶基因序列(GenBank登录号XM_001821384)，设计引物进行重叠PCR进行同义密码子替换(128Leu CTT-CTA，495Ile ATC-ATA)消除序列中的Bsp119I和BglII酶切识别位点。引物序列如下：

Amy-F：5'AGTTCGAAATGATGGTCGCGTGGTGGTC 3'(下划线处为Bsp119I 酶切位点)

(灰色碱基为突变位点)

(灰色碱基为突变位点)

(下划线处为XbaI酶切位点，灰色碱基为突变位点)

以α-淀粉酶基因为模板，首先用Amy-F和overlap-R；overlap-F和Amy-R 分别PCR扩增两段DNA序列，然后进行重叠PCR融合两端DNA序列得到完整的α-淀粉酶基因，将获得的完整α-淀粉酶基因连接到pMD19-T载体(Takara) 上，测序验证。

PCR反应条件为：

2、根据糖化酶基因序列(GenBank登录号：HQ848664)，利用primer 5.0 软件设计引物，并在其两端添加Bsp119I和XbaI酶切位点。引物序列如下：

Ga-F：5'AGTTCGAAATGTCGTTCCGATCTCTACTCG 3'(下划线处为Bsp119I内切位点)

Ga-R：5'AGTCTAGACTACCGCCAGGTGTCAGTCA 3'(下划线处为XbaI 内切位点)

以糖化酶基因为模板，PCR扩增获得糖化酶基因片段，将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体(Takara)上，测序验证。

PCR反应条件与步骤1中的相似。

3、参照NCBI公布的凝结芽孢杆菌乳酸脱氢酶(LDH1)基因(GenBank登录号：CP010525.1)，利用primer 5.0软件设计引物，并在其两端添加Bsp119I 和XbaI酶切位点。引物序列如下：

LDH-F：5'AGTTCGAAATGAAAAAGGTCAATCGTATTG 3'(下划线处为 Bsp119I酶切位点)

LDH-R：5'AGTCTAGATTACAATACAGGTGCCATCG 3'(下划线处为XbaI 酶切位点)

以凝结芽孢杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增获得乳酸脱氢酶基因片段，将PCR扩增产物连接到pMD19-T载体(Takara)上，测序验证。

PCR反应条件与步骤1中的相似。

4、使用限制性内切酶Bsp119I和XbaI分别对步骤1～3获得的α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶、表达载体pGAPZαA、表达载体pTEFZαA进行双酶切，回收纯化所需载体及基因片段。

5、使用T4DNA连接酶，将α-淀粉酶基因连入表达载体pGAPZαA，得到淀粉酶单基因表达载体pGAPZ-Amy(如图2a)。

6、使用T4DNA连接酶，将糖化酶基因连入表达载体pGAPZαA，得到糖化酶单基因表达载体pGAPZ-Ga(如图2b)。

7、使用T4DNA连接酶，将乳酸脱氢酶基因连入表达载体pTEFZαA，得到乳酸脱氢酶单基因表达载体pTEFZ-LDH(如图2c)。

至此，三个基因的单表达载体构建完毕。

三、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建及转化毕赤酵母。

1、使用限制性内切酶BglII对pTEFZ-LDH进行单酶切，然后对酶切产物进行去磷酸化处理，获得具有BglII突出末端的pTEFZ-LDH。

2、使用限制性内切酶BglII和BamHI对pGAPZ-Ga进行双酶切，然后回收带有载体启动子和终止子的糖化酶基因的完整表达盒。

3、利用BglII和BamHI是同尾酶，具有相同的突出末端的特点，使用T4DNA 连接酶将上述步骤1和2所得的载体和糖化酶基因表达盒连接，获得二基因表达载体pTEFZ-GL。

4、使用BglII对pTEFZ-GL进行单酶切，然后对酶切产物进行去磷酸化处理，获得具有BglII突出末端的pTEFZ-GL。

5、使用限制性内切酶BglII和BamHI对pGAPZ-Amy进行双酶切，然后回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶基因的完整表达盒。

6、利用BglII和BamHI是同尾酶，具有相同的突出末端的特点，使用T4DNA 连接酶将上述步骤4和5所得的载体和α-淀粉酶基因表达盒连接，获得三基因表达载体pTEFZ-AGL。

7、将上述步骤6得到的三基因共表达载体pTEFZ-AGL用限制性内切酶ScaI 线性化后，用电穿孔法转入毕赤酵母x-33中，在博来霉素的浓度为100μg/mL 的YPD琼脂平板上培养2～3天后，挑取能够正常生长的菌落，即为转有上述重组质粒的转化子。以菌落PCR鉴定阳性转化子，即为本发明所述的能降解餐厨废弃物的基因重组毕赤酵母。

四、基因重组毕赤酵母表达淀粉酶活性检测

1、淀粉水解圈实验：将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建及转化毕赤酵母”得到的具有博来霉素抗性的转化子菌落接种至含有1％可溶性淀粉的YPS固体培养基(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨， 10g/L可溶性淀粉)上，30℃培养箱中培养2天，用碘蒸气熏蒸，观察淀粉水解圈。结果如图4所示。

2、将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建及转化毕赤酵母”所得阳性基因重组毕赤酵母接种至5mL YPD培养基中，30℃、 200rpm条件下培养活化24h；

3、将活化的菌种，以1:100(v/v)的比例接种至100mL YPD培养基中， 30℃、200rpm条件下培养，每隔12h取样测菌体OD₆₀₀，离心取上清测淀粉酶酶活。

4、淀粉酶酶活测定：取三基因共表达重组毕赤酵母培养液上清200μL，加入300μLpH 5.5的HAc-NaAc缓冲液，再加入1％的可溶性淀粉溶液400μL，在60℃条件下反应30min，加入100μL 0.1mol/L的盐酸终止反应，按照葡萄糖标准曲线测定方法测定OD₅₄₀。淀粉酶总酶活定义为：在60℃，pH 5.5条件下，每分钟水解可溶性淀粉产生1μmol葡萄糖所需要的酶量。结果如图5所示，淀粉酶活在96h达到最高3.08U/mL。

五、基因重组毕赤酵母直接发酵可溶性淀粉生产乳酸

为了确定上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建及转化毕赤酵母”得到的具有博来霉素抗性的转化子可以降解淀粉并生产乳酸，将阳性转化子在不外加商业化淀粉酶的情况下，直接发酵40g/L的可溶性淀粉。具体操作如下：

1、菌种活化：将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建及转化毕赤酵母”得到的具有博来霉素抗性的转化子接种至5mL YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养活化24h；

2、种子液培养：将上述活化的菌株按照1％(v/v)的接种量转接至新鲜的 200mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养14-20h。4℃，4,000g离心5min 收集菌体。用无菌水洗一次，去除培养基中剩余的糖。

3、发酵液准备：精确称取2g可溶性淀粉，1g蛋白胨，加入50mL水，121℃灭菌20min。可溶性淀粉的终浓度为40g/L。

4、将第2步得到的菌体按照0.5％(w/v)的接种量接种至50mL上述发酵液中，补充无菌CaCO₃ 1g，30℃，200rpm厌氧发酵，每隔12h取样，12,000g 离心，取上清950μL，加入72％H₂SO₄ 50μL酸化，过滤，进行高效液相色谱分析剩余葡萄糖，以及生产乳酸的量。如图6所示，有乳酸的产生，说明三基因共表达毕赤酵母可以降解淀粉，并能够生产乳酸，乳酸产量在108h达到最高，为 25.18g/L，产率是0.63g/g淀粉。

六、基因重组毕赤酵母发酵餐厨废弃物生产乳酸

本实施例所用的餐厨废弃物由广东利世康低碳科技有限公司提供，其理化性质测定结果如下：pH 2.8，含水率89.18％，干物质含量10.82％，总糖含量34.97 g/L，粗油脂含量26.91％(w/w，干重)，总蛋白含量10.63％(w/w，干重)。

1、菌种活化：将上述“三、α-淀粉酶、糖化酶、乳酸脱氢酶三基因共表达载体的构建及转化毕赤酵母”得到的具有博来霉素抗性的转化子接种至5mL YPD培养基中，30℃、200rpm条件下培养活化24h；

2、种子液培养：将上述活化的菌株按照1％(v/v)的接种量转接至新鲜的 200mLYPD培养基中，30℃，200rpm培养14-20h。4℃，4,000g离心5min 收集菌体。用无菌水洗一次，去除培养基中剩余的糖，即为发酵种子液。

3、餐厨废弃物的准备：精确称取50g(精确到0.0001g)餐厨垃圾于100mL 血清瓶中，121℃灭菌20min。

4、发酵：按照5％(w/w)的接种量，将上述2步骤获得的种子液接种到餐厨废弃物中，添加1g无菌碳酸钙，30℃，200rpm厌氧发酵。每隔12h取样，离心取上清酸化进行高效液相色谱分析葡萄糖、乳酸、乙醇。结果见图7，基因重组毕赤酵母发酵餐厨废弃物产乳酸在72h达到最高值为16.80g/L，糖-乳酸转化率是理论产值的48％。通过以上结果可知本发明所构建的基因重组毕赤酵母能降解餐厨废弃物，并将其变废为宝地转化成乳酸。

上述实施例仅为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东利世康低碳科技有限公司

<120> 一种能降解利用餐厨废弃物的基因工程毕赤酵母及其构建方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 724

<212> DNA

<213> 毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子TEF(Pichia transcription elongationfactor 1-α promoter TEF)

<400> 1

gattgcagat ctccaacttc agtgaaaagt tcacccgtca tacaggctct agatcaagaa 60

gcaaacttaa tctcagcatc tggttacgta actctggcaa ccagtaacac gcttaaggtt 120

tggaacaaca ctaaactacc ttgcggtact accattgaca ctacacatcc ttaattccaa 180

tcctgtctgg cctccttcac cttttaacca tcttgcccat tccaactcgt gtcagattgc 240

gtatcaagtg aaaaaaaaaa aattttaaat ctttaaccca atcaggtaat aactgtcgcc 300

tcttttatct gccgcactgc atgaggtgtc cccttagtgg gaaagagtac tgagccaacc 360

ctggaggaca gcaagggaaa aatacctaca acttgcttca taatggtcgt aaaaacaatc 420

cttgtcggat ataagtgttg tagactgtcc cttatcctct gcgatgttct tcctctcaaa 480

gtttgcgatt tctctctatc agaattgcca tcaagagact caggactaat ttcgcagtcc 540

cacacgcact cgtacatgat tggctgaaat ttccctaaag aatttctttt tcacgaaaat 600

ttttttttta cacaagattt tcagcagata taaaatggag agcaggacct ccgctgtgac 660

tcttcttttt tttcttttat tctcactaca tacattttag ttattcgcca acttcgaagc 720

aatc 724

<210> 2

<211> 1512

<212> DNA

<213> α-淀粉酶基因(α- amylase gene)

<400> 2

ttcgaaatga tggtcgcgtg gtggtctcta tttctgtacg gccttcaggt cgcggcacct 60

gctttggctg caacgcctgc ggactggcga tcgcaatcca tttatttcct tctcacggat 120

cgatttgcaa ggacggatgg gtcgacgact gcgacttgta atactgcgga tcagaaatac 180

tgtggtggaa catggcaggg catcatcgac aagttggact atatccaggg aatgggcttc 240

acagccatct ggatcacccc cgttacagcc cagctgcccc agaccaccgc atatggagat 300

gcctaccatg gctactggca gcaggatata tactctctga acgaaaacta cggcactgca 360

gatgacttga aggcgctctc ttcggcccta catgagaggg ggatgtatct tatggtcgat 420

gtggttgcta accatatggg ctatgatgga gcgggtagct cagtcgatta cagtgtgttt 480

aaaccgttca gttcccaaga ctacttccac ccgttctgtt tcattcaaaa ctatgaagat 540

cagactcagg ttgaggattg ctggctagga gataacactg tctccttgcc tgatctcgat 600

accaccaagg atgtggtcaa gaatgaatgg tacgactggg tgggatcatt ggtatcgaac 660

tactccattg acggcctccg tatcgacaca gtaaaacacg tccagaagga cttctggccc 720

gggtacaaca aagccgcagg cgtgtactgt atcggcgagg tgctcgacgg tgatccggcc 780

tacacttgtc cctaccagaa cgtcatggac ggcgtactga actatcccat ttactatcca 840

ctcctcaacg ccttcaagtc aacctccggc agcatggacg acctctacaa catgatcaac 900

accgtcaaat ccgactgtcc agactcaaca ctcctgggca cattcgtcga gaaccacgac 960

aacccacggt tcgcttctta caccaacgac atagccctcg ccaagaacgt cgcagcattc 1020

atcatcctca acgacggaat ccccatcatc tacgccggcc aagaacagca ctacgccggc 1080

ggaaacgacc ccgcgaaccg cgaagcaacc tggctctcgg gctacccgac cgacagcgag 1140

ctgtacaagt taattgcctc cgcgaacgca atccggaact atgccattag caaagataca 1200

ggattcgtga cctacaagaa ctggcccatc tacaaagacg acacaacgat cgccatgcgc 1260

aagggcacag atgggtcgca gatcgtgact atcttgtcca acaagggtgc ttcgggtgat 1320

tcgtataccc tctccttgag tggtgcgggt tacacagccg gccagcaatt gacggaggtc 1380

attggctgca cgaccgtgac ggttggttcg gatggaaatg tgcctgttcc tatggcaggt 1440

gggctaccta gggtattgta tccgactgag aagttggcag gtagcaagat atgtagtagc 1500

tcgtgatcta ga 1512

<210> 3

<211> 1935

<212> DNA

<213> 糖化酶基因(Glycosylase gene)

<400> 3

ttcgaaatgt cgttccgatc tctactcgcc ctgagcggcc tcgtctgcac agggttggca 60

aatgtgattt ccaagcgcgc gaccttggat tcatggttga gcaacgaagc gaccgtggct 120

cgtactgcca tcctgaataa catcggggcg gacggtgctt gggtgtcggg cgcggactct 180

ggcattgtcg ttgctagtcc cagcacggat aacccggact acttctacac ctggactcgc 240

gactctggtc tcgtcctcaa gaccctcgtc gatctcttcc gaaatggaga taccagtctc 300

ctctccacca ttgagaacta catctccgcc caggcaattg tccagggtat cagtaacccc 360

tctggtgatc tgtccagcgg cgctggtctc ggtgaaccca agttcaatgt cgatgagact 420

gcctacactg gttcttgggg acggccgcag cgagatggtc cggctctgag agcaactgct 480

atgatcggct tcgggcagtg gctgcttgac aatggctaca ccagcaccgc aacggacatt 540

gtttggcccc tcgttaggaa cgacctgtcg tatgtggctc aatactggaa ccagacagga 600

tatgatctct gggaagaagt caatggctcg tctttcttta cgattgctgt gcaacaccgc 660

gcccttgtcg aaggtagtgc cttcgcgacg gccgtcggct cgtcctgctc ctggtgtgat 720

tctcaggcac ccgaaattct ctgctacctg cagtccttct ggaccggcag cttcattctg 780

gccaacttcg atagcagccg ttccggcaag gacgcaaaca ccctcctggg aagcatccac 840

acctttgatc ctgaggccgc atgcgacgac tccaccttcc agccctgctc cccgcgcgcg 900

ctcgccaacc acaaggaggt tgtagactct ttccgctcaa tctataccct caacgatggt 960

ctcagtgaca gcgaggctgt tgcggtgggt cggtaccctg aggacacgta ctacaacggc 1020

aacccgtggt tcctgtgcac cttggctgcc gcagagcagt tgtacgatgc tctataccag 1080

tgggacaagc aggggtcgtt ggaggtcaca gatgtgtcgc tggacttctt caaggcactg 1140

tacagcgatg ctgctactgg cacctactct tcgtccagtt cgacttatag tagcattgta 1200

gatgccgtga agactttcgc cgatggcttc gtctctattg tggaaactca cgccgcaagc 1260

aacggctcca tgtccgagca atacgacaag tctgatggcg agcagctttc cgctcgcgac 1320

ctgacctggt cttatgctgc tctgctgacc gccaacaacc gtcgtaactc cgtcgtgcct 1380

gcttcttggg gcgagacctc tgccagcagc gtgcccggca cctgtgcggc cacatctgcc 1440

attggtacct acagcagtgt gactgtcacc tcgtggccga gtatcgtggc tactggcggc 1500

accactacga cggctacccc cactggatcc ggcagcgtga cctcgaccag caagaccacc 1560

gcgactgcta gcaagaccag caccagtacg tcatcaacct cctgtaccac tcccaccgcc 1620

gtggctgtga ctttcgatct gacagctacc accacctacg gcgagaacat ctacctggtc 1680

ggatcgatct ctcagctggg tgactgggaa accagcgacg gcatagctct gagtgctgac 1740

aagtacactt ccagcgaccc gctctggtat gtcactgtga ctctgccggc tggtgagtcg 1800

tttgagtaca agtttatccg cattgagagc gatgactccg tggagtggga gagtgatccc 1860

aaccgagaat acaccgttcc tcaggcgtgt ggaacgtcga ccgcgacggt gactgacacc 1920

tggcggtagt ctaga 1935

<210> 4

<211> 951

<212> DNA

<213> 乳酸脱氢酶基因(Lactate dehydrogenase gene)

<400> 4

ttcgaaatga aaaaggtcaa tcgtattgca gtggttggaa cgggtgcagt tggtacaagt 60

tactgctacg ccatgattaa tcagggtgtt gcagaagagc ttgttttaat cgatattaac 120

gaagcaaaag cagaagggga agccatggac ctgaaccacg gcctgccatt tgcgcctacg 180

ccgacccgcg tttggaaagg cgattattcc gattgcggca ctgccgatct tgttgtcatt 240

acggcaggtt ccccgcaaaa accgggcgaa acaaggcttg atcttgttgc caaaaacgca 300

aaaattttta aaggcatgat taagagcatc atggacagcg gctttaacgg gatttttctt 360

gttgccagca acccggttga cattttgaca tatgtaactt ggaaagagtc cggcctgccg 420

aaagaacatg ttatcggttc gggcacagtg cttgactccg cgcgtctccg caactctttg 480

agcgcccact tcggaattga cccgcgcaat gtccatgccg caattatcgg cgaacacggc 540

gacacggaac ttccggtttg gagccataca acgatcggtt atgacaccat tgaaagctat 600

ctgcaaaagg gaaccattga ccaaaaaaca ttagatgata tttttgtcaa cacgagagat 660

gcggcttacc atatcattga acgaaaaggg gccacatttt acggcatcgg gatgtctctg 720

acccggatca caagagcgat cctgaacaat gaaaacagtg ttttgacagt ctctgccttt 780

ttggaaggcc agtacggaaa cagcgatgtg tacattggtg ttcctgccgt tattaaccgc 840

caaggcgtcc gtgaagtggt tgaaatcgag ctgaacgaca aagaacagga acaatttagc 900

cattctgtta aagtattaaa agaaacgatg gcacctgtat tgtaatctag a 951

Claims (6)

1.一种能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母，其特征是将α-淀粉酶基因、糖化酶基因和乳酸脱氢酶基因通过毕赤酵母表达载体pTEFZαA整合至毕赤酵母基因组上构建而成；所述α-淀粉酶基因的序列如SEQIDNO.2所示，所述糖化酶基因的序列如SEQ IDNO.3所示，所述乳酸脱氢酶基因的序列如SEQ ID NO.4所示；

所述毕赤酵母表达载体pTEFZαA为以毕赤酵母表达载体pGAPZαA为基础，以毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子SEQ ID NO.1替换毕赤酵母表达载体pGAPZαA的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子而得。

2.如权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母，其特征在于，包括如下步骤：

（1）通过PCR扩增，获得毕赤酵母的转录延伸因子1-α启动子TEFDNA片段；

（2）使用限制性内切酶BglII和Bsp119I分别对上述DNA片段和载体pGAPZαA进行双酶切，然后将TEF片段连入载体，得到TEF启动子取代了GAP启动子的毕赤酵母表达载体pTEFZαA。

3.权利要求1所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

S1：利用PCR技术分别扩增α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶基因，并在三个基因序列的5’端和3’端分别加上限制性内切酶Bsp119I和XbaI识别位点；使用限制性内切酶对毕赤酵母表达载体pTEFZαA和pGAPZαA，以及分别连接至载体上的SEQ ID NO.2所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.3所示的糖化酶基因和SEQ ID NO.4所示的乳酸脱氢酶基因进行双酶切，纯化回收所需片段；

S2：使用DNA连接酶将α-淀粉酶基因和糖化酶基因分别连入毕赤酵母表达载体pGAPZαA，将乳酸脱氢酶基因连入毕赤酵母表达载体pTEFZαA，形成三个重组单基因表达载体；

S3：使用限制性内切酶将含有载体启动子和终止子片段的完整的α-淀粉酶基因表达盒和糖化酶基因表达盒从重组单基因表达载体上切下，然后以串联表达盒的形式逐个接入带有乳酸脱氢酶基因的单基因表达载体中，构建出α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶三基因共表达载体；

S4：使用限制性内切酶对上述构建的三基因共表达载体进行单酶切，使其线性化后将其转入毕赤酵母，并整合到其基因组上，获得能降解利用餐厨废弃物的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母。

4.如权利要求3所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述三基因共表达载体的构建包括如下步骤：

S11：使用限制性内切酶对α-淀粉酶和糖化酶重组单基因表达载体进行双酶切，回收带有载体启动子和终止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表达盒；

S12：使用限制性内切酶对乳酸脱氢酶重组单基因表达载体进行酶切，然后将糖化酶基因表达盒连入乳酸脱氢酶单基因表达载体，构建糖化酶和乳酸脱氢酶二基因表达载体；

S13：使用限制性内切酶对步骤S12所构建的二基因表达载体进行酶切，然后将α-淀粉酶基因表达盒连入二基因表达载体，构建出α-淀粉酶、糖化酶和乳酸脱氢酶三基因共表达载体。

5.如权利要求3所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤S1中所述的限制性内切酶为Bsp119I和XbaI；步骤S4中所述的限制性内切酶为ScaI。

6.如权利要求4所述的能降解利用餐厨废弃物生成乳酸的基因重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，步骤S11中所述的限制性内切酶为BglII和BamHI；步骤S12中所述限制性内切酶为BglII；步骤S13中所述限制性内切酶为BglII。

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