CN110373340A - 一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，具体公开了一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。本发明对餐厨废弃物，具体为发酵残液进行处理，将其中的有机物进一步利用，与现有技术相比，尤其是将大量的蛋白质分解转变成氨基酸，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，同时生产出大量的氨基酸，氨基酸是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

Description

一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构 建方法

技术领域

本发明涉及遗传工程和发酵工程领域，更具体地，涉及一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法。

背景技术

餐厨垃圾俗称泔水，是居民在生活中形成的固体废弃物，食品浪费的数量正在随着人口的快速增加和经济的快速发展而迅速增长，残留的肉类，蔬菜，油脂，米饭是餐厨垃圾中的主要物质。在化学成分上，主要含有纤维素类，蛋白质类，糖类，脂肪类等有机物成分，具有含水量高，有机物比例高，含盐量高的特点。由于餐厨垃圾产量巨大，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌等多种有毒有害的病原微生物经常会在含有丰富的营养物质的餐厨垃圾中滋生。如果没有及时的加工处理，还会腐烂变质，产生NH₃和H₂S等大量带有臭味的气体和毒素等，不仅造成严重的空气问题，同时非法使用餐厨垃圾提取的废油已经对人的健康产生严重的危害。

根据统计，在餐饮行业中每年就有大约有4亿吨餐厨垃圾，造成的浪费总价值高达7500亿美元，而且还在呈现不断增长的趋势。所有急需要找到一种切实有效的方法对餐厨垃圾进行综合利用，不合理的利用餐厨垃圾不仅会造成严重的资源的浪费，还会造成严重的环境污染。焚烧处理和用作饲料是对餐厨垃圾的传统的处理方法；焚烧不仅对餐厨垃圾的利用效率低下，而且会排出大量的二氧化碳，使全球气候变暖加剧，大量的含氮、含硫、二噁英等化合物的产生，不仅污染空气，也会对人的身体产生极大的危害。餐厨垃圾处理后做成饲料饲喂牲畜，饲料中含有大量的有毒有害微生物和难于降解的毒素，饲养牲畜后，不仅会容易造成牲畜致病，还会使毒素在牲畜体内富集，最终影响到人的健康，而且其中含有不同来源的大量生物蛋白，未经处理饲喂牲畜存在的潜在的生物安全风险，所有需要发展一种有效的方法，对餐厨垃圾进行综合的利用，既可以避免垃圾围城，保护环境，减数有害气体，温室气体的排出，也可以达到提升废物产品的利用价值，对资源达到综合的利用。

微生物发酵正在被国内外业界重视，发酵技术正在成为一种对餐厨垃圾综合利用的有效方式，真正达到资源节约和环境有好地目的。发酵残液，一般是指在工业生产应用中，原材料经过微生物的发酵后所产生的废渣或废液的总称。而餐厨乙醇发酵残液，是指原始的餐厨垃圾经过了油脂去除，酵母菌酒精发酵以及酒精蒸馏提取等一系列工艺流程得到的微生物未利用的废弃物。经过前面工艺中的油脂去除和酒精发酵，餐厨垃圾中原有的油脂类和糖类化合物基本被利用完，而餐厨垃圾中的蛋白质类化合物只有很少的一部分被微生物生长所利用，大部分蛋白质以废弃物的形式残留在发酵残液中，而且随着工业上对餐厨垃圾发酵的进一步研究和发展，必然会使发酵产生的残液越来越多，如果不经过有效的处理，随意排放，残液中大量的蛋白质类有机物，不仅会造成有毒有害微生物的大量繁殖，而且会对环境造成严重的危害，所以必须采取有效的处理方式，对餐厨发酵残液进行处理，而处理的关键是将其中的有机物进一步利用，将大量的蛋白质分解转变成氨基酸就成为一条可行的办法，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，氨基酸还是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法，用于解决降解餐厨发酵液中蛋白质的问题。

本发明采取的技术方案是，提供一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

本发明的重点在于构建了一种能够降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株，将内切蛋白酶基因转入产朊假丝酵母并使其分泌表达，所选用的工具为产朊假丝酵母表达载体。

其中，内切蛋白酶，可以将蛋白质分子多肽链从中间打断成几段或几十段。广泛存在于生物体的消化，凝血和补体激活和补体激活生理功能等方面，其作用是通过识别相应的氨基酸残基链，活化的羟基与肽键的原子产生亲核反应。

产朊假丝酵母，在生产和生活中得到了广泛的应用，是美国食品和药品管理局认证的可视为安全的微生物菌株，产朊假丝酵母具有一系列优良的特性；培养条件简单，可以在一些简单的培养条件下就可以进行生长，而且具有五六碳糖双糖共转运系统，能够实现戊糖和己糖的共用，拓宽了应用范围；因自身不分泌胞外蛋白酶，产朊假丝酵母可以被应用于多种目标蛋白的表达，其本身作为一种生物安全性生物，只需要经过简单的分离纯化程序目标产物的分离，大大节约了生产成本。

进一步地，所述的产朊假丝酵母表达载体为产朊假丝酵母单基因表达载体。

进一步地，所述产朊假丝酵母表达载体为pcGAPGA。

一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，包括以下步骤：

S1：克隆黑曲霉中的内切蛋白酶基因；

S2：将上述内切蛋白酶基因接入产朊假丝酵母表达载体中，构建重组单基因表达载体；

S3：将上述构建得到的重组单基因表达载体用限制性核酸内切酶切割，使之线性化后转化产朊假丝酵母，构建基因重组产朊假丝酵母单基因表达菌株。

进一步地，所述步骤S2中包括如下步骤：

S21：将克隆得到的内切蛋白酶基因进行纯化得到pMD19T-pepA克隆载体；

S22：将克隆载体pMD19T-pepA和表达载体pcGAPGA进行双酶切；

S23：将回收到的内切蛋白酶目的基因片段与酶切后的pcGAPGA骨架进行连接形成新的质粒pcGAPGA-pepA。

进一步地，所述步骤S3中的限制性核酸内切酶为ScaI。

进一步地，步骤S3中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。

进一步地，所述步骤S22中，将克隆载体pMD19T-pepA与表达载体pGAPGA同时用BglII和Bsp119I两种内切酶进行双酶切。

进一步地，所述步骤S1中的内切蛋白酶基因为黑曲霉的内切蛋白酶基因pepA。

进一步地，所述产朊假丝酵母表达载体为含有CuGAP启动子的产朊假丝酵母表达载体pGAPGA。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：餐厨垃圾中含有大量的营养物质，其中原有的油脂类和糖类化合物基本被利用完，而餐厨垃圾中的蛋白质类化合物只有很少的一部分被微生物生长所利用，大部分蛋白质以废弃物的形式残留在发酵残液中。鉴于此，本发明提供了一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株，对餐厨发酵残液进行处理，将其中的有机物进一步利用，将大量的蛋白质分解转变成氨基酸，不仅可以解决残存的蛋白质污染问题，氨基酸还是制药、生物饲料、有机肥的原材料，具有一定的经济价值。

本发明的难点在于将内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体，一起转入产朊假丝酵母同时实现分泌表达。

附图说明

图1为本发明内切蛋白酶表达载体pcGAPGA-pepA的构建流程图。

图2为重组蛋白酶酶活的测定酪氨酸标准曲线。

图3为内切蛋白酶基因电泳。

图4为内切蛋白酶阳性克隆鉴定。

图5为内切蛋白酶菌液PCR电泳。

图6为内切蛋白酶重组酵母基因组PCR电泳。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。以下实施例中产朊假丝酵母rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

实施例1内切蛋白酶的克隆。

参照本实验室之前的研究所得到的内切蛋白酶基因序列(GenBank登录号XM_002482115.1)，利用primer 5.0软件对序列设计相应的引物，并在其两端添加Bsp119I和XbaI酶切位点，由Invitrogen公司合成，引物序见表一。

(1)内切蛋白酶基因高保真酶PCR扩增

采用PCR的方法扩增内切蛋白酶，反应体系如下：

PCR反应条件为：

PCR完成后，将5μL PCR产物按照如下方法进行凝胶电泳检测：称取0.25g琼脂糖，加入25mL 1×TAE缓冲液后，使用微波炉加热使其溶解，冷却至55℃左右时，加入2μL EB替代染料。混匀后将琼脂糖溶液倒入制胶板中，插入合适的梳子，室温下静置直至胶完全凝固。取出梳子，将琼脂糖凝胶转移至电泳槽中，倒入1×TAE电泳缓冲液至没过凝胶。依次将5μL DNA maker和混有上样缓冲液的PCR产物加入凝胶孔中。在120V恒定电压下电泳15min左右后，将凝胶转移至凝胶成像仪中，紫外灯下观察结果并保存。

之后进行纯化PCR产物：琼脂糖凝胶电泳结束后，将凝胶放置于紫外灯下，然后迅速切下含有目的DNA片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶；将切下的凝胶块转移至1.5mL的离心管中，称取凝胶的重量。按1mg凝胶块1μL体积计算，加入等体积的Buffer GDP。50℃水浴20min，期间上下颠倒离心管数次，让凝胶块溶解完全；短暂离心收集液体后，将DNA吸附柱套在2mL收集管中。把≤700μL溶胶液转移至柱子中。12,000×g离心2min；加入300μLBuffer GDP至柱子中，静置2min。12,000×g离心1min，倒弃滤液；加入600μL Buffer DW2至柱子中。12,000×g离心1min，倒弃滤液；把柱子放回收集管中。12,000×g离心3min；把柱子套在1.5mL离心管中，加入25μL的50℃预热的无菌水至柱子膜中央，放置3min。12,000×g离心2min，丢弃柱子，用微量分光光度计测其浓度后，把DNA片段保存于-20℃。

由于PrimeSTAR HS DNAPolymerase反应的产物是平末端，无法连接到T-vector上，因此需要加A反应，反应体系如下：

将72℃反应15min后的DNA片段，按照PCR产物纯化步骤进行纯化，后用微量分光光度计测定DNA浓度，-20℃保存。

内切蛋白酶pepA基因本大小为2166bp；如图3所示，扩增条带大小与预期一致，可用于后续实验。M：DNA Marker2000；1：pepA基因片段。

(2)内切蛋白酶基因的T-Vector连接

将(1)纯化后的内切酶DNA片段，利用DNA连接酶与pMD19-T载体连接，连接体系如下：

22℃进行连接反应1h，转化大肠杆菌后，于37℃条件下倒置恒温培养过夜，后对阳性菌株进行鉴定。

结果如图4所示，各重组子均扩增出单一条带，且大小相符，表明内切蛋白酶酶基因片段已成功克隆入T载体中。

M：DNA Marker 2000；1-5：pepA菌液PCR结果。

实施例2表达载体的构建

(1)大肠杆菌质粒提取

将通过实施例1得到，并经测序验证后的带有pMD19T-目的基因片段的大肠杆菌在37℃，200rpm条件下培养过夜，收集5mL过夜培养的菌液，参照天根生化科技有限公司的TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒提取质粒，具体步骤如下：

10,000rpm离心2min，倒弃上清液，收集菌体。加入300μL Buffer P1/RNaseA混合液，彻底重悬细胞。加入300μL Buffer P2，轻轻混匀8次使菌体充分裂解，静置1min。加入400μL Buffer P3，立即轻轻上下颠倒8次，充分混匀。10,000rpm离心5min。将上一步的上清液倒入收集管吸附柱中，10,000rpm离心1min。倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600μL Buffer PD，10,000rpm离心1min。倒弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入600μL Buffer PW(已经用无水乙醇稀释)，10,000rpm离心1min。倒弃滤液，将吸附柱放入收集管中，10,000rpm离心2min，室温放置8min晾干柱子。将吸附柱放置于干净的1.5mL离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80μL50℃预热的H2O，室温放置3min，10,000rpm离心3min，丢弃柱子，用微量分光光度计测量其浓度后，质粒保存于-20℃。

(2)内切蛋白酶表达载体pcGAPGA-pepA的构建流程

如图1所示。

(3)pMD19T-目的基因以及pcGAPGA双酶切

反应体系如下：

将反应体系配好之后，放置在37℃条件下反应1h，将全部反应产物进行凝胶电泳检测后，对目的DNA片段进行凝胶回收。

(4)DNA凝胶回收

DNA凝胶回收参照美基生物科技有限公司HiPure Gel Pure Micro Kit试剂盒说明书进行纯化。

(5)目的基因片段与pcGAPGA骨架连接

将(3)琼脂糖凝胶电泳纯化得到的目的基因片段与酶切后的pcGAPGA骨架进行连接形成新的质粒pcGAPGA-X(X-代表目的基因)，连接的反应体系如下：

在22℃条件下进行连接反应，1h后将连接后的产物，转化大肠杆菌。

(6)连接产物的大肠杆菌转化

热激转化大肠杆菌E.coli DH5α具体操作参照《分子克隆实验指南(第三版)》。

(7)阳性克隆菌株的鉴定

按照如下方法配置相应的PCR反应体系：

将上述PCR反应液配好后，按照25μL每管分装至PCR管中，用枪头蘸取少量重组菌体放入PCR管，离心1min，进行PCR反应，反应条件如下：

PCR反应完成以后，将5μL的PCR产物进行电泳分析。鉴定出目的基因与表达载体成功连接的阳性重组子。

将鉴定完成的克隆载体pMD19T-pepA与表达载体pGAPGA同时用BglII和Bsp119I两种内切酶进行双酶切，将回收到的pepA片段与pGAPGA骨架进行连接，热激发转化大肠杆菌，挑取平板上长出的重组子，菌落PCR鉴定得到单一且清晰的目的条带，说明内切蛋白酶基因已经成功插入表达载体pGAPGA中。

如图5所示，M：DNAMarker 2000；1-5：pepA菌液PCR结果。

实施例3表达载体pcGAPGA-X酶切线性化及电击转化产朊假丝酵母。

(1)产朊假丝酵母感受态细胞的制备

(2)电击转化

向每管产朊假丝酵母感受态细胞中分别加入20μL(约5μg)的重组质粒，轻轻混匀，冰浴15min后转移至预冷的电转杯中；电压为1.8kv，电击5ms后，立即加入1mL预冷的1M山梨醇溶液并混匀，常温静置15min；在无菌条件下将电转杯中的菌液全部转移至无菌的4mL离心管中，加入2mL YPD液体培养基并混匀，于30℃，175rpm复苏4h；4,000×g离心8min后，倒弃大部分上清液，剩余200μL重悬菌体；将菌体重悬液全部涂于含G418的YPD固体培养基上，30℃培养箱中倒置培养3-5天。

(3)产朊假丝酵母阳性重组子鉴定

用枪头的在平板上蘸取生长出重组子，放入具有G418抗性的YPD培养基中，在30℃，200rpm恒温条件下进行培养，二十四小时后，对各个重组子按1％接种量将酵母接种至5ml YPD液体培养基，在30℃，200rpm条件下培养24h后，使用美基盐析法酵母基因组提取试剂盒SolPure Yeast DNA Kit提取酵母基因组，然后用相应的引物进行PCR鉴定。提取酵母基因组方法如下：

吸取1mL酵母培养液至1.5mL离心管，12,000×g离心2min收集菌体；加入300μlBuffer SE，20μL Lyticase(5U/μl)和20μL(1M)DTT至酵母细胞中。用移液枪重悬酵母细胞后，37℃水浴1h；12,000×g离心2min收集酵母原生质体，小心弃去上清液；加入400μLBuffer WLB和2μL RNase Solution至原生质体中，高速涡旋30s后，65℃水浴45min；冰上放置3min后，加入100μL Buffer PPS至裂解液中，涡旋30s；12,000×g离心5min，收集上清液倒入新的1.5mL离心管中。

pGAPGA-pepA载体用限制性核酸内切酶ScaI线性化处理后，电转野生型产朊假丝酵母，置于30℃恒温条件下，在含有G418的平板中培养2-3天，挑取长出的重组子，转移到液体培养基中扩大培养，提取重组子的基因组。用对应的引物，对各重组子基因组进行PCR鉴定，结果能扩增出单一且清晰的目的条带，说明内切蛋白酶基因成功转化进产朊假丝酵母中。

如图6所示，M：DNA Marker 2000；1-5：pepA重组酵母提取基因组PCR结果。

实施例4重组蛋白酶酶活的测定

选取各阳性重组子，按照OD600＝0.1的初始接种量接种于YPD培养基中，培养60h，取3mL培养液，12000rpm离心5min后取上清液，用福林酚法对蛋白酶的酶活进行测定。

(1)酪氨酸标准曲线的绘制

表1酪氨酸准曲线配置

(2)按表1配置好相应的溶液，混合均匀后，在40℃恒温水浴锅中显色20min，取出，调节分光光度计到波长680nm，以不含氨基酸的0号管为空白，分别测定其他各管的吸光值。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。如图2所示。

样品酶活的测定：先将酪蛋白放在40℃恒温水浴锅中，预热5min；试管A(空白)加入酶液1mL，40℃温浴2min，加三氯乙酸2mL摇匀，40℃温浴10min，加酪蛋白溶液1mL，取出后静置10min，慢速滤纸过滤，收集滤液；试管B(需平行做三个试样)，加酶液1mL，40℃温浴2min，加酪蛋白溶液1mL，40℃温浴10min，加三氯乙酸2mL摇匀，取出后静置10min，慢速滤纸过滤，收集滤液；将两步收集到的滤液，分别加入5mL的碳酸钠溶液，福林酚1mL，40℃显色20min，于680nm波长下，以A管做对照，进行吸光度的测定。

计算：从标准曲线上读出酶样品稀释液水解后对应的酪氨酸含量，根据以下公式计算样品的酶活力：蛋白酶酶活(U/mL)＝A×K×4/10×n

式中A：平行样品的平均OD值；

K：吸光常数(OD＝1时，所对应的酪氨酸的量)

n：酶液的稀释倍数。

在上述实施例1～4过程中用到的引物如表2所示，其中字母F代表正向引物，R代表反向引物，序号代表不同的引物组合。

表2

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广东利世康低碳科技有限公司

<120> 一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

acatgtgtag tgacaataaa taacgataca gggcccttct gggtcttgta attggaatga 60

gtacaatgta aataccttaa cgaggaacaa ttggagggca agtctggtgc cagcagccgc 120

ggtaattcca gctccaatag cgtatattaa agttgttgca gttaaaaagc tcgtagttga 180

actttgggcc tggcaggccg gtccgctttt tggcgagtac tgaccctgcc gggcctttcc 240

ttctggctac cctcccctct ggagaggcga accaggactt ttactttgaa aaaattagag 300

tgttcaaagc aggcctttgc tcgaatatat tagcatggaa taatagaata ggacgtttgg 360

ttctattttg ttggtttcta ggaccatcgt aatgattaat agggacggtc gggggcatca 420

gtattcagtt gtcagaggac atgt 444

Claims (10)

1.一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株，其特征在于，所述产朊假丝酵母单基因表达菌株为将内切蛋白酶基因通过产朊假丝酵母表达载体整合至产朊假丝酵母基因组上构建而成。

2.根据权利要求1所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达载体，其特征在于，所述的产朊假丝酵母表达载体为产朊假丝酵母单基因表达载体。

3.根据权利要求1所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母表达载体为pcGAPGA。

4.根据权利要求1至3任一项所述的一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：克隆黑曲霉中的内切蛋白酶基因；

S2：将上述内切蛋白酶基因接入产朊假丝酵母表达载体中，构建重组单基因表达载体；

S3：将上述构建得到的重组单基因表达载体用限制性核酸内切酶切割，使之线性化后转化产朊假丝酵母，构建基因重组产朊假丝酵母单基因表达菌株。

5.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中包括如下步骤：

S21：将克隆得到的内切蛋白酶基因进行纯化得到pMD19T-pepA克隆载体；

S22：将克隆载体pMD19T-pepA和表达载体pcGAPGA进行双酶切；

S23：将回收到的内切蛋白酶目的基因片段与酶切后的pcGAPGA骨架进行连接形成新的质粒pcGAPGA-pepA。

6.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中的限制性核酸内切酶为ScaI。

7.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，步骤S3中所述的转化是使用电转化法、冷冻法或化学试剂法进行转化。

8.根据权利要求5所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S22中，将克隆载体pMD19T-pepA与表达载体pGAPGA同时用BglII和Bsp119I两种内切酶进行双酶切。

9.根据权利要求4所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中的内切蛋白酶基因为黑曲霉的内切蛋白酶基因pepA。

10.根据权利要求3所述的一种降解蛋白质的产朊假丝酵母但基因表达菌株的构建方法，其特征在于，所述产朊假丝酵母表达载体为含有CuGAP启动子的产朊假丝酵母表达载体pGAPGA。