CN113652363B

CN113652363B - 一种产耐热耐酸纤维素酶菌株hsu-12及其应用

Info

Publication number: CN113652363B
Application number: CN202110579388.5A
Authority: CN
Inventors: 许竟成; 董丽丽; 潘健; 柏晓辉; 佘新松; 李强; 李士壮; 李根山; 耿洪璐; 吕倩丽
Original assignee: Huangshan University
Current assignee: Huangshan University
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113652363A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种产耐热耐酸纤维素酶菌株HSU‑12及其应用，所述菌株为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏编号为：CCTCC NO:M2021600。所述菌株产的纤维素酶具有较好的酶活力，且对温度、pH值、金属离子及有机溶剂等均有不同程度的耐受性。

Description

一种产耐热耐酸纤维素酶菌株HSU-12及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种产耐热耐酸纤维素酶菌株HSU-12及其应用。

背景技术

能源是社会发展和人类文明进步的物质基础和动力，能源问题是社会经济发展中不容忽视的问题。尽管目前可被利用的能源有石油、天然气、煤炭和新能源，但化石能源仍是主要的消费能源。化石能源的大量使用导致很多环境问题，特别是CO₂排放量增加导致温室效应，进而影响全球的气候变化。同时，作为一种非可再生的能源，化石能源的大量使用也导致人类将面临能源危机。因此，开发高效、清洁、可再生的新能源迫在眉睫。生物质能源是指来源于任何动物、植物或微生物及其代谢产物的可再生或可循环的所有有机物能源。

生物质能是太阳能转化的一种形式，主要是通过植物的光合作用直接或间接将太阳能以化学能的形式固定在生物体内，也是一种可循环利用的再生能源。因此，生物质能源的开发与利用具有重要价值。目前已被开发利用的生物质能源主要有生物燃料乙醇、生物柴油和生物电能等，其中生物燃料乙醇和生物柴油应用已取得很大成绩。生物燃料乙醇的制备一般是以玉米、小麦、薯类和甜菜等粮食或非粮食作物为原料；随着人类人口的增长，这种以粮食来制备燃料乙醇的方法将被限制。若以秸秆等纤维素来制备生物燃料乙醇，不仅可避免因此造成的粮食危机，而且可解决发酵原料来源问题；故利用纤维素制备燃料乙醇具有广阔的市场前景。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种产耐热耐酸纤维素酶菌株HSU-12及其应用，所述菌株产的纤维素酶具有较好的酶活力，且对温度、pH值、金属离子及有机溶剂等均有不同程度的耐受性。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案为：

一株产耐热耐酸纤维素酶菌株，所述菌株为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏编号为：CCTCC NO:M2021600，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。

进一步的，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述菌株16S rDNA序列的扩增引物为：

27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

一种纤维素酶制备方法，将上述菌株培养发酵，并在发酵后的培养液中提取纤维素酶。

一种纤维素酶，所述纤维素酶采用上述方法制备而成。

一株产耐热耐酸纤维素酶菌剂，所述菌剂包含上述菌株。

上述菌株或纤维素酶在生物发酵或生产去污产品中的应用。

进一步的，应用温度为30～50℃，pH值为4～6。

一种去污剂，包括上述纤维素酶和Mg²⁺。

一种去污剂，包括上述纤维素酶，同时也包括甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜和Triton X-100中的一种或多种。

有益效果：

纤维素由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键聚合而成，且其分子间存在很多氢键和结晶度，导致其不溶于水、也不溶于有机溶剂等。纤维素酶是一类能将纤维素水解为寡糖和纤维二糖，并最终能将其分解成葡萄糖的酶系，在纺织工业和能源工业上有广泛的应用；已成为酶工程研究领域的热点和重点。为筛选产纤维素酶菌种资源，本文以羊瘤胃为材料，采用刚果红固体培养基筛选出一株产纤维素酶菌株HSU-12，其产生纤维素酶的最适温度和pH值分别是50℃和4.0，是一种耐热、耐酸的纤维素酶；在最适条件下，菌株HSU-12产纤维素酶发酵粗酶液的酶活力达7.99U·mL^-1。同时，该纤维素酶对温度、pH值、金属离子及有机溶剂等均有不同程度的耐受性，特别适合应用于工业生产。上述结果为菌株HSU-12的开发与利用提供了基础。

附图说明

图1为HSU-12菌株的菌落特征。

图2为菌株HSU-12的分子进化树。

图3为温度对纤维素酶酶活力的影响。

图4为pH值对纤维素酶酶活力的影响。

图5为金属离子对纤维素酶酶活力的影响。

图6为有机溶剂对纤维素酶酶活力的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

实施例1

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验样品

本实验所用的新鲜羊瘤胃购买于当地屠宰场，装于无菌纸袋后带回实验室备用。

1.1.2 实验仪器

SQ510C型高压灭菌锅(重庆雅马拓)、ZHJH-C2109B型超净工作台(上海智城)、MQD-B2R型恒温培养箱(上海旻泉)、AvantiJ-E型离心机(美国贝克库尔特公司)、UV-765型紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器)、DK-8D型三孔恒温电热水槽(上海匡贝实业)。

1.1.3 试剂

柠檬酸、柠檬酸三钠、NaCl、ZnCl₂、NaOH、HCl、CaCl₂、NiCl₂·6H₂O、HgCl₂、KCl、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、丙三醇等购自上海国药集团化学试剂有限公司。酵母粉、蛋白胨和刚果红购于上海生工生物工程有限公司。细菌基因组DNA抽提试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 培养基及DNS试剂配制

还原糖检测试剂DNS配制如下：用电子天平称量酒石酸钾钠182g，放入烧杯中加入450～650mL的蒸馏水，用玻璃棒不断地搅拌使其充分溶解，然后按照顺序依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g、NaOH 21g和苯酚5g充分搅拌直至无颗粒性物质，冷却至室温并定容至1000mL，经过滤除菌和杂质，保存于棕色瓶子中，避光保存一周方可使用。产纤维素酶菌株的富集和发酵培养基配制如下：精确称取CMC-Na 10g、酵母粉5.0g、氯化钠10g、蛋白胨10g放入烧杯中并加入400mL蒸馏水进行搅拌至完全溶解，将其转移到锥形瓶中定容至1000mL，121℃，0.1MPa，灭菌20min即可。刚果红固体选择培养基如下制备：精确称量CMC-Na 1.88g、蛋白胨10g、K2HPO4 0.5g、酵母粉5g、MgSO4.7H2O0.25g、琼脂14g、明胶2.00g放入烧杯中并加入400mL蒸馏水进行搅拌至完全溶解，转移到锥形瓶中定容至1000mL，121℃，0.1MPa，灭菌20min。同时将配制好的1mg/mL的刚果红染液0.1MPa，115℃，灭菌30min。最后冷却至一定温度，并在培养基中加入刚果红染液5mL，混匀(不要产生气泡)倒平板，待刚果红培养基凝固后放入4℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 初筛菌种的制备

用无菌手术剪从新鲜购买的羊瘤胃上随机剪取一块组织，放入无菌烧杯内，加入适量无菌水后用无菌玻璃棒充分搅拌。静置1h后，吸取1.0mL溶液于1.5mL无菌EP管中作为原始菌种样本。

1.2.2 产纤维素酶菌株的分离与纯化

从上述原始菌种样本中吸取0.5mL菌液接种至羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的富集培养基中，于37℃、180r·min^-1恒温富集培养。富集培养12h后，用无菌水以十倍稀释法分别稀释至10^-4、10^-5和10^-6，分别吸取100μL涂布于刚果红固体培养基上，并于37℃恒温培养箱中静置培养2～3d。观察刚果红固体培养基上菌落周围是否有透明水解圈，分别测量水解圈直径(H)和菌落直径(C)；采用平板划线法对H/C比值大的菌株进行纯化，直至纯化出稳定的单菌落。将纯化出的单菌落编号后，保存备用。

1.2.3 产纤维素酶菌株的鉴定

选取H/C比值大的菌株之一HSU-12菌株观察其菌落特征，并用试剂盒提取其基因组DNA；采用通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′及1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′扩增该菌株的16S rDNA序列，并送至上海生工生物工程有限公司测序。对测序的结果进行分析和拼接，并将拼接后的16S rDNA序列置于NCBI数据库16Sribosomal RNA sequences子库中进行比对分析。从比对结果中选取序列一致性较高的序列，利用软件Clustal X 2.1和MEGA 6.06构建该菌株的分子进化树，鉴定菌株HSU-12的种类。

1.2.4 葡萄糖标准曲线的绘制

准确配制0.1％标准葡萄糖溶液，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL该标准液于干净的玻璃试管中，用双蒸水补至3.0mL后混匀；再分别向上述试管中加入2.0mL DNS溶液，混匀后沸水浴中水浴10min；待溶液冷却至室温后于波长540nm处测定溶液的吸光值，重复3次并绘制葡萄糖标准曲线。本发明测得的葡萄糖浓度(X)和其吸光值(Y)的回归方程为：Y＝13.13 3X-0.174 5(R²＝0.9994)，线性度较好，可用于后续酶活测定实验。

1.2.5 纤维素酶粗酶液制备

取出保存于-80℃冰箱中的菌株HSU-12，划线于刚果红固体培养基上复苏。从复苏的菌株中挑取一个单克隆菌落接种于发酵培养基中活化12h，再按3％接种量将活化后菌液接种至新发酵培养基中，于28℃恒温摇床中180r·min^-1恒温发酵2d。发酵后的培养液于4℃离心机中200r·min^-1离心10min，获得的上清液即为纤维素酶粗酶液。

1.2.6 纤维素酶的最佳反应温度

取5支干净的试管，分别加入2mL pH4.0柠檬酸钠-Na₂HPO₄缓冲液配制的1％CMC-Na底物和1mL粗酶液后混合均匀，并分别置于30、40、50、50和70℃水浴锅中恒温反应20min；然后加入2mL DNS，混匀后于沸水浴中煮沸10min，流水冷却并定容至10mL，用分光光度计于波长540nm处测定溶液的吸光值，重复3次。同时，以酶活的酶液为对照组，测定相同条件下的溶液吸光值；计算该纤维素酶的酶活力。酶活力的定义为一定条件下，每毫升粗酶液每小时水解底物CMC-Na产生1μmol葡萄糖所需的酶量。

1.2.7 纤维素酶的最佳反应pH值

在步骤1.2.6确定的最佳反应温度下，以步骤1.2.6的方法测定该纤维素酶在pH值3、4、5、6、7和8条件下的酶活力。

1.2.8 金属离子对纤维素酶酶活力的影响

向反应液中加入终浓度为1mmol·L^-1的HgCl₂、MgCl₂、CaCl₂、ZnCl₂和KCl等金属离子处理，参照步骤1.2.6方法比较不同金属离子对该纤维素酶酶活力的影响。

1.2.9 有机溶剂对纤维素酶酶活力的影响

向反应液中分别加入终浓度为1％和15％(v/v)的甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜和Triton X-100，参照步骤1.2.6方法比较不同有机溶剂对该纤维素酶酶活力的影响。

2.结果与分析

2.1 HSU-12菌株的分子鉴定

采用羧甲基纤维素钠作为唯一碳源，利用刚果红选择培养基从羊瘤胃内筛选到一株产耐热纤维素酶的菌株HSU-12(图1)。从图1筛选的结果可知，菌株HSU-12在刚果红选择培养基上形成红色的菌落，并在菌落周围形成非常明显的水解圈；刚果红透明圈直径(H)为42.1mm，HSU-12菌落直径(C)为7.5mm，其透明圈直径H与菌落直径(C)的比值约是5.6。同时，观察发现菌株HSU-12在刚果红选择培养基上形成的菌落呈不规则的圆形，菌落整体上较为干燥。

抽提菌株HSU-12基因组后，采用细菌通用引物27F和1492R对菌株HSU-12的16SrDNA序列进行扩增并测序分析。通过对测序后的结果进行分析和拼接后，得到长度约为1390bp的菌株HSU-12 16S rDNA序列。将此序列置于NCBI数据库的Nucleotide BLAST工具中进行同源序列检索，从Nucleotide BLAST检索的结果可知来源于芽孢杆菌属的菌株与菌株HSU-12序列同源性较高。从该比对结果中选择序列覆盖度99％以上，序列一致性99.21％以上的10余株菌株的16S rDNA序列进行多序列比对，用软件MEGA6.06构建菌株HSU-12分子进化树(图2)，从图2构建的进化树结果知，菌株HSU-12与Bacillus cereus ATCC14579等蜡样芽孢杆菌处在同一个进化树分支上。综合菌落特征、16S rDNA序列进化分析结果，将菌株HSU-12鉴定为蜡样芽胞杆菌HSU-12(Bacillus cereus strain HSU-12)。

2.2 温度对纤维素酶酶活力的影响

采用羧甲基纤维素钠为底物，测定菌株HSU-12产生的纤维素酶在30、40、50、60和70℃温度下该纤维素酶酶活力(图3)。从实验结果知，温度在30～50℃时，该纤维素酶的酶活力随反应温度的升高而升高；在50℃时，该纤维素酶酶活力最大，为6.23U·mL^-1。而当反应温度继续升高至60～70℃，该纤维素酶酶活力迅速降低至4.81、3.58U·mL^-1。因此，50℃为该纤维素酶的最适反应温度。

2.3 pH值对纤维素酶酶活力的影响

在上述最适反应温度50℃时，测定菌株HSU-12产生的纤维素酶在不同pH值下的酶活力(图4)。从实验测定结果知，菌株HSU-12产纤维素酶在pH值4时酶活力最大，达7.99U·mL^-1；当pH值继续降低至3时，该酶酶活力迅速减小至3.13U·mL^-1；当pH值由4升高至5、6时，该酶酶活力略有降低，但酶活力仍维持在7.38U·mL^-1以上。而当pH值继续升高至7、8时，该酶酶活力迅速降低至4.08U·mL^-1左右。以上实验结果表明，该纤维素酶在pH值4～6时，酶活力相对稳定；且pH值4为其最适pH值。

2.4 金属离子对纤维素酶酶活力的影响

以最适pH 4.0、最适反应温度50℃时的纤维素酶活力为100％，测定金属离子Hg²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、K⁺等对该纤维素酶活力的影响(图5)。由实验结果知，Hg²⁺和Ni²⁺离子可显著降低该纤维素酶的酶活力，使其酶活力分别降至38.61％、81.07％；K⁺、Ca²⁺和Zn²⁺对该纤维素酶酶活力的影响不大，使其酶活力基本稳定在94.27％以上；而Mg²⁺离子对该纤维素酶酶活力有一定促进作用，使其酶活力提升至112.44％。

2.5 有机溶剂对纤维素酶酶活力的影响

以最适温度和pH值条件下纤维素酶活力为100％，测定添加1％和15％(v/v)不同有机溶剂对该纤维素酶活力的影响(图6)。由实验结果知，尽管添加甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜和Triton X-100会略微降低该纤维素酶的酶活力，但仍可使纤维素酶酶活力维持在85％以上；这说明该纤维素酶对有机溶剂有一定的耐受力。

纤维素是小麦、玉米等农作物秸秆的主要组成成分，但因其存在很多氢键和结晶度，导致其不溶于水等溶剂限制其应用。纤维素酶是一类可将纤维素最终水解为葡萄糖的酶系，具有广泛的用途；故筛选产纤维素酶菌株具有重要价值。可产生纤维素酶的微生物种类多样，如真菌的黑曲霉属和木霉属、放线菌的链霉菌属和诺卡氏菌属及细菌的芽孢杆菌属等。真菌虽产纤维素酶种类很多、活性较高，但其很多是致病菌且易产生大量孢子造成传染，故筛选高产纤维素酶的细菌具有重要意义。本发明采用纤维素做唯一碳源的刚果红培养基筛选到一株产纤维素酶菌株HSU-12经实验测定其水解透明圈直径H与菌落直径C的比值约是5.6；该比值略低于球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)与缺陷短波单胞，但与枯草芽孢杆菌及瘤胃细菌相近。由于H/C比值可反映纤维素酶活力的大小，故菌株HSU-12具有开发价值。

通过酶活力测定，发现菌株HSU-12产纤维素酶最适温度和pH值分别是50℃和4.0，且对温度和pH值都有一定的耐受范围。在最适温度和pH值条件下，测得该纤维素酶的酶活力为7.99U·mL^-1，酶活力较高，且更能耐受酸性环境。同时，本发明也发现菌株HSU-12产生的纤维素酶对金属离子Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、K⁺和Ni²⁺有一定的耐受能力；也能耐受有机溶剂且在浓度15％(V/V)的有机溶剂甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜(DMSO)及去污剂Triton X-100作用下仍可维持85％以上的活性。纤维素酶广泛应用于印染、酒精、饲料等领域，这些工业生产中要求纤维素酶对温度、pH、盐离子浓度及有机溶剂等有一定的耐受能力；菌株HSU-12产生的纤维素酶具有适合工业生产中应用的特性，值得后续进一步研究其相关基因，并构建基因工程菌，以为人类生产和生活服务。

本发明采用刚果红培养基筛选法从羊瘤胃中筛选出一株产耐热耐酸纤维素B.cereus菌株HSU-12，其产生纤维素酶的最适温度和pH值分别是50℃和4.0，是一种耐热、耐酸的纤维素酶；在最适条件下，菌株HSU-12产纤维素酶发酵粗酶液的酶活力达7.99U·mL^-1。同时，该纤维素酶对温度、pH值、金属离子及有机溶剂等均有不同程度的耐受性，特别适合应用于工业生产。上述结果为菌株HSU-12的开发与利用提供了基础。

菌株HSU-12的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示

>HSU-12

CGATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAAC。

序列表

<110> 黄山学院

<120> 一种产耐热耐酸纤维素酶菌株HSU-12及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgatggatta agagcttgct cttatgaagt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 60

aacctgccca taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt 120

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ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc 840

gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900

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gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1140

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caagaccgcg aggtggagct aatctcataa aaccgttctc agttcggatt gtaggctgca 1260

actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1320

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1380

gtggggtaac 1390

Claims

1.一株产耐热耐酸纤维素酶菌株，其特征在于，所述菌株为蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus），于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，菌株保藏编号为：CCTCC NO: M 2021600。

2.一种纤维素酶制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的菌株培养发酵，并在发酵后的培养液中提取纤维素酶。

3.一株产耐热耐酸纤维素酶菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的菌株。