CN106520586A - 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用 - Google Patents

一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106520586A
CN106520586A CN201610818306.7A CN201610818306A CN106520586A CN 106520586 A CN106520586 A CN 106520586A CN 201610818306 A CN201610818306 A CN 201610818306A CN 106520586 A CN106520586 A CN 106520586A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
hemicellulose
candida utili
expression vector
arabinose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610818306.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106520586B (zh
Inventor
刘泽寰
林蒋海
武可婧
熊春江
姜苏峻
肖文娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUANGDONG QIZHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
GUANGDONG QIZHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUANGDONG QIZHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd filed Critical GUANGDONG QIZHI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201610818306.7A priority Critical patent/CN106520586B/zh
Publication of CN106520586A publication Critical patent/CN106520586A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106520586B publication Critical patent/CN106520586B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01088—Beta-L-arabinosidase (3.2.1.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种能分解半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用。所述基因重组产朊假丝酵母能稳定表达来自里氏木霉的木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。利用该基因重组酵母，建立了一个能降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖和木糖醇的统合生物工艺。运用该工艺，以20g/l的蔗渣半纤维素为底物，经培养156h后，中间过程所产生的木糖被酵母本身耗尽，低聚木糖得率为20%，此时木糖醇和阿拉伯糖分别达到最高得率为3.5%和2.7%，半纤维素水解率达到40.4%。本统合生物工艺是一种环保便捷有效的联产工艺。

Description

一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体涉及一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用，所述应用具体为以基因重组产朊假丝酵母建立一种联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇的统合生物工艺。
背景技术
低聚木糖、木糖醇及阿拉伯糖均属于益生元，具有重要的生理功能。已有研究表明，低聚木糖、木糖醇及阿拉伯糖具有重要的生理作用，主要包括：(1)作为益生元，在人体内不能被消化吸收，可有效促进双歧杆菌等益生菌的增殖，从而抑制有害菌群的生长，进而改善肠道环境；(2)改善和抑制腹泻，缓解便秘；(3)可以抑制蔗糖的吸收，以抑制因摄入蔗糖而引起的血糖升高及肥胖等症状，有利于治疗糖尿病及控制体重；(4)它们供应的能量很少，可作为代糖，可供糖尿病，低血糖及肥胖病人食用；(5)不会引起龋齿；(6)低聚木糖具有免疫刺激作用，能够增强机体免疫力。
低聚木糖、木糖醇及阿拉伯糖可以通过水解半纤维生产。半纤维是木质纤维的主要成分之一，是自然界中除了纤维素之外的第二丰富的可再生自然资源；是以木聚糖为骨架，兼有阿拉伯糖、葡萄糖等多种成分构成的复杂多糖长链机构。从半纤维素中水解生产低聚木糖、木糖醇、阿拉伯糖等的方法包括化学提取、酸碱水解、生物酶解转化等方法。化学提取或酸碱水解方法操作繁琐，能耗高，且易造成环境污染。利用酶水解法操作相对简单，且因为没有大量化学物质的使用，易于纯化，而且有利于保护环境，得到的产物纯度较高。但是酶解半纤维素需要木聚糖酶(xylanase)等多种半纤维素酶(hemicellulase)的协同作用来完成。而目前商品化的纤维素酶、半纤维素酶的价格还比较昂贵，使得制备成本大幅上升，限制了酶水解法的工业应用。为解决以上这些困境，随着基因工程和代谢工程技术的进展，近几年来，统合生物工艺(consolidated bioprocessing,CBP)的概念获得了国内外生物质转化领域科学家的广泛关注。
Lynd等人(Kim S,Dale B E.Global potential bioethanol production fromwasted crops and crop residues[J].Biomass and bioenergy,2004,26(4):361-375.)提出了统合生物工艺方法(consolidated bioprocessing，CBP)的概念，即在不额外添加商业酶的情况下，由发酵微生物自身分泌表达的水解酶在同一个反应器中同时完成糖化和发酵的工艺过程。这种微生物通常是通过基因工程手段获得的重组菌。CBP工艺不需加入商业化酶，降低了生产成本，简化了操作步骤，有利于工业化生产。CBP工艺是实现半纤维素高效、绿色、环保利用的重要手段。
半纤维素经木聚糖酶等半纤维素酶降解后，可生成低聚木糖、木糖、阿拉伯糖等一系列产物，而目前还没有较为经济简便的方法能够很好地分离木糖和阿拉伯糖，得到较纯的木糖和阿拉伯糖产品；而且，由于木糖的经济价值较低，从半纤维素水解液中分离木糖，其投入产出比非常低。因此找到一个简便可行、低成本的低聚木糖、木糖和阿拉伯糖的分离纯化和制备方法在此类的研究中至关重要。
产朊假丝酵母能够将木糖转化为木糖醇，而且具有生长速度快，可以实现高密度培养等特点。因此，本发明选用产朊假丝酵母(ATCC22023)为宿主，在其体内表达木聚糖酶基因及阿拉伯糖苷酶基因。通过产朊假丝酵母能够同化木糖的性质，将半纤维素水解后产生的木糖利用，并转化为经济价值较高的木糖醇，既降低了低聚木糖和木糖分离的难度和成本，也解决了阿拉伯糖与木糖难分离的问题，同时也可以得到具有重要生理作用的木糖醇及阿拉伯糖。为低聚木糖的制备和分离提供了一个新的思路。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种能分解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母。
本发明的另一个目的是提供一种降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇的统合生物工艺。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种能分解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母，通过以下方法构建得到：将木聚糖酶基因和阿拉伯糖苷酶基因克隆到多基因表达载体pScIKPr上，然后将重组表达载体转化产朊假丝酵母即得重组产朊假丝酵母；所述多基因表达载体pScIKPr是通过将多基因表达载体pScIKP的rDNA片段去除而得到。
酵母多基因共表达载体pScIKP见专利号：ZL200810029630.6，一种酿酒酵 母多基因表达载体及其构建方法与应用。
所述表达载体pScIKPr通过以下方法构建所得：
(1)将酿酒酵母多基因表达载体pScIKP用Bsp119I和SacI进行双酶切；
(2)将上述(1)双酶切所得片段用S1核酸酶进行双链DNA末端平滑处理；
(3)将上述(2)所得片段经T4连接酶自连接得到pScIKPr。
所述双基因重组表达载体通过以下方法构建所得：
(1)将木聚糖酶基因的成熟肽片段与产朊假丝酵母的GAP基因启动子、酿酒酵母的α因子信号肽片段以及酿酒酵母的CYC基因终止子连接在一起构成木聚糖酶基因表达盒；
(2)将上述木聚糖酶基因表达盒以及pScIKP载体分别双酶切后连接到一起，构成木聚糖酶基因表达载体；
(3)将阿拉伯糖苷酶基因以及上述木聚糖酶基因表达载体分别双酶切后连接到一起，构成木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶双基因重组表达载体。
所述木聚糖酶基因来源于里氏木霉，经过去除其信号肽，突变第40位和97位碱基，并融合酿酒酵母α信号肽序列构成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述阿拉伯呋喃糖苷酶基因来源于里氏木霉，并突变其第131位碱基而成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
如上所述的基因重组产朊假丝酵母在降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇中的应用。
一种降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇的工艺，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将权利要求1所述的基因重组产朊假丝酵母甘油菌种(或斜面菌种、平板单克隆菌种)接种于含1％酵母提取物、2％蛋白胨及2％葡萄糖的YPD培养基中进行活化培养；
(2)将经过活化的菌种以1％接种量接种至新鲜YPD培养基中进行扩大培养，作为种子培养液；
(3)待上步所得种子培养液中，菌体生长达到对数生长期，以10％的接种量接种至含有2％半纤维素的YPD培养基中；于30℃、200rpm培养。
(4)按时间间隔取样，检测木糖醇、阿拉伯糖及低聚木糖的生成情况。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明构建能分泌表达木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的产朊假丝酵母基因工程菌株，并以该菌株为发酵菌，建立分级半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖和木糖醇的统合生物工艺。此工艺为一种新型的联产工艺，具有产品附加值高、产品种类丰富、容易实现等特点。与现有低聚木糖、阿拉伯糖和木糖醇的生产工艺相比，具有以下特点：首先，本发明的工艺所需的半纤维降解酶由发酵菌株，即产朊假丝酵母基因工程菌分泌表达生产，不需要额外添加商品化的木聚糖酶，大大节约了生产成本；其次，与化学降解法相比，由于没有使用酸碱等化学试剂，避免了化学环境污染的问题，而且减少后续化学试剂回收处理的步骤，既节约了化学试剂及后续处理工序的成本，又简化了操作步骤。
运用所构建的工艺，以20g/l的蔗渣半纤维素为底物，经培养156h后，中间过程所产生的木糖被酵母本身耗尽，低聚木糖得率为20％，此时木糖醇和阿拉伯糖分别达到最高得率为3.5％和2.7％。应用本发明所述的基因重组产朊假丝酵母菌株，蔗渣半纤维素水解率达到40.4％。此基因工程重组菌株的构建以及本工艺的设计不但解决了木糖和阿拉伯糖难以分离的问题，而且同时得到了具有生理功能的活性物质低聚木糖、阿拉伯糖和木糖醇。
本发明在构建重组产朊假丝酵母时需要克服的难点在于如何将木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶基因一起成功转入产朊假丝酵母中，并同时实现分泌表达。为了克服这一困难，本发明将木聚糖酶基因和阿拉伯呋喃糖苷酶基因一起克隆到发明人自有专利酿酒酵母多基因表达载体中，将双基因重组表达载体转化产朊假丝酵母就可以得到同时表达木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的重组产朊假丝酵母。
附图说明
图1为重组里氏木霉木聚糖酶基因和阿拉伯呋喃糖苷酶基因的产朊假丝酵母表达载体的构建。
图2为重组产朊假丝酵母降解蔗渣半纤维素的结果；a：木糖变化情况；b：木糖醇变化情况；c：木二糖变化情况含量；d：木三糖变化情况；e：阿拉伯糖变化情况；f：葡萄糖变化情况。
图3为半纤维素水解产物薄层层析结果，其中，M：混合标准品，X1-X4依次为木糖，木二糖，木三糖，木四糖；1-3：XA2 0h,48h,156h的水解产物；4-6：XYN4 0h,48h,156h的水解产物。
具体实施方式
下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂配料或材料均为通过商业途径得到。
实施例1pScIKPr载体的构建
S1.将pScIKP用Bsp119I和SacI进行双酶切，酶切条件如下：
将上述各成分混匀后，于37℃进行酶切反应2小时，用琼脂糖凝胶电泳回收约5.8kb片段。
S2.将上述5.8kb片段用S1核酸酶进行末端平滑处理，条件如下：
将上述个反应组分混匀后，于23℃反应10分钟，加入10mM EDTA终止反应；然后用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技公司)纯化备用；
S3.将上述步骤S2所得片段用T4DNA连接酶进行自环化，获得改造后的载体pScIKPr。
实施例2木聚糖酶基因(xyn2)表达盒的构建
S1.目的基因引物的设计：
S11.木聚糖酶成熟肽编码区的引物：根据NCBI中提供的里氏木霉的木聚糖酶基因xyn2的序列，运用oligo6生物软件设计用于特异性扩增xyn2的引物及 突变酶切位点的引物，并加上相应的酶切位点序列如下：
xyn2引物及突变XhoI和SacI位点的引物：
Mxyn2-F：
Mxyn2-R：5’-TCTAGATTAGTTGCTGACACTCTGTGAGGCAG-3’
以上为xyn2的扩增引物，两引物的5’端分别为XhoI和XbaI的酶切位点；上游引物同时突变了xyn2编码区的XhoI酶切位点(下加点)。
Mxyn2-SacImut-F：
Mxyn2-SacImut-R：
以上为突变xyn2编码区SacI位点的引物(下加点)。
S12:产朊假丝酵母GAP启动子(CuGAP)的扩增引物：根据NCBI数据库所得产朊假丝酵母GAP启动子序列，参考Kunigo等的文献(Kunigo,M.,et al.(2013)."Heterologousprotein secretion by Candida utilis."Applied Microbiology and Biotechnology97(16):7357-7368.)，设计CuGAP扩增引物，并添加相应的酶切位点，序列如下：
CuGAPF:5’-GTCGACAGATCTCTTACAGCGAGCACTCAAATC-3’
CuGAPR:5’-TTCGAATATGTTGTTTGTAAGTGTG-3’
S13:酿酒酵母α因子分泌信号肽的扩增引物：根据NCBI数据库所得酿酒酵母α因子基因序列，设计α因子分泌信号肽的扩增引物，并添加相应的酶切位点，序列如下：
a-F：5’-TTCGAAACGATGAGATTTCCTTC-3’
a-R：5’-CTCGAGAGATACCCCTTCTTCTTTAG-3’
S14:酿酒酵母CYC基因终止子的扩增引物：根据NCBI数据库所得酿酒酵母的CYC基因终止子序列，设计CYC基因终止子的扩增引物，并添加相应的酶切位点，序列如下：
CYCTTF:5’-TCTAGACACGTCCGACGGCGGCCCAC-3’
CYCTTR:5’-GCGGCCGCGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG-3’
S2:目的基因片段的扩增：
S21.xyn2编码区片段的PCR扩增：以两步PCR的方法扩增xyn2编码区片段。首先以里氏木霉的cDNA为模板，分别用引物Mxyn2-F和Mxyn2-SacImut-R为引物扩增xyn2第一部分；以Mxyn2-SacImut-F和Mxyn2-R为引物扩增xyn2第二部分。然后采用重叠PCR的方法将前述两部分片段连接起来，获得完整的xyn2编码区片段。具体方法如下：
第一步PCR反应体系如下：
反应条件：
反应结束后，PCR产物分别用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技公司)纯化；然后按照以下反应体系和反应条件进行重叠PCR反应，将两片段重叠连接成为一个完整片段：
第二步PCR反应体系如下：
首先将除上下游引物之外的所有组分混匀，按照第一步PCR的反应条件反应5个循环；然后再加入上下游引物，继续反应30个循环。PCR产物经电泳鉴定，纯化后置于-20℃备用。
S22.CuGAP启动子、α因子分泌信号肽和CYC终止子的扩增：
分别以产朊假丝酵母的基因组DNA和酿酒酵母的基因组DNA为模板，扩增CuGAP启动子、α因子分泌信号肽和CYC终止子的DNA片段。反应体系如下：
反应条件：
反应结束后，PCR产物分别用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技公司)纯化后置于-20℃备用。
S3.xyn2基因表达盒克隆进表达载体
S31.基因片段的T-A克隆及测序：将上述S2所纯化得到的xyn2成熟肽、CuGAP启动子、α因子分泌信号肽和CYC终止子的DNA片段克隆进pMD19-T 载体，并转化进大肠杆菌DH5α。运用菌落PCR方法鉴定阳性克隆，并挑选阳性克隆进行测序分析。获得测序正确的阳性克隆，分别命名为：pMD19-T-XYN2、pMD19-T-CuGAP、pMD19-T-aF和pMD19-T-CYCTT。
S32.xyn2基因克隆进表达载体：分别用限制性内切酶对S31所得阳性克隆进行双酶切(括号中为所用的限制性内切酶)：pMD19-T-XYN2(XhoI和XbaI)、pMD19-T-CuGAP(SalI和Bsp119I)、pMD19-T-aF(Bsp119I和XhoI)和pMD19-T-CYCTT(XbaI和NotI)。同时，用SalI和NotI对酵母多基因共表达载pScIKPr进行双酶切。分别回收各目的片段xyn2、CuGAP、α因子分泌信号肽、CYC终止子和载体骨架片段。然后用T4DNA连接酶将回收的到的基因片段和pScIKPr骨架进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌，利用菌落PCR方法鉴定阳性克隆，获得重组木聚糖酶产朊假丝酵母表达载体(pCuGAPGαA-XYN2)。
实施例3阿拉伯呋喃糖苷酶基因(abf1)表达载体的构建
S1.目的基因引物的设计及扩增：根据NCBI中提供的里氏木霉的阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf1的序列，运用oligo6生物软件设计用于特异性扩增abf1的引物及突变酶切位点的引物，并加上相应的酶切位点序列如下：
abf1引物及abf1突变SacI位点的引物：
TrABF1-F：5’-GGATCCTGCTCTCCAACGCTCGTATC-3’；
TrABF1-R：5’-ACTAGTTTAAGCAAAACCGCCACTAACCAC-3’；
以上为abf1的扩增引物，两引物的5’端分别为BamHI和SpeI的酶切位点。
以上为突变xyn2编码区SacI位点的引物(下加点)。
S2.abf1编码区片段的PCR扩增：以两步PCR的方法扩增abf1编码区片段。首先以里氏木霉的cDNA为模板，分别用引物TrABF1-F和Abf1-SacImut-R为引物扩增abf1的第一部分；以Abf1-SacImut-F和TrABF1-R为引物扩增xyn2第二部分。然后采用重叠PCR的方法将前述两部分片段连接起来，获得完整的abf1编码区片段。具体方法如下：
第一步PCR反应体系如下：
反应条件：
反应结束后，PCR产物分别用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技公司)纯化；然后按照以下反应体系和反应条件进行重叠PCR反应，将两片段重叠连接成为一个完整片段：
第二步PCR反应体系如下：
首先将除上下游引物之外的所有组分混匀，按照第一步PCR的反应条件反应5个循环；然后再加入上下游引物，继续反应30个循环。PCR产物经电泳鉴定，纯化后置于-20℃备用。
S3.abf1基因克隆进表达载体
S31.abf1基因的T-A克隆及测序：将上述S2所纯化得到的abf1片段克隆进pMD19-T载体，并转化进大肠杆菌DH5α。运用菌落PCR方法鉴定阳性克隆，并挑选阳性克隆进行测序分析。获得测序正确的阳性克隆(pMD19-T-ABF1)。
S2.abf1基因克隆进表达载体：用限制性内切酶BamHI和SpeI分别对pMD19-T-ABF1和重组木聚糖酶产朊假丝酵母表达载体(pCuGAPGαA-XYN2)进行双酶切；分别回收abf1和载体骨架片段。然后用T4DNA连接酶将回收的到的abf1基因片段和pCuGAPGαA-XYN2骨架进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌，利用菌落PCR方法鉴定阳性克隆，获得重组木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶双表达产朊假丝酵母表达载体(pCuGAPGαA-XYN2-ABF1)。
实施例4产朊假丝酵母电转化及重组基因工程菌株的筛选
S1.产朊假丝酵母电转化：用限制性内切酶SacI将实施例1和2所得的表达载体pCuGAPGαA-XYN2-ABF1进行线性化；然后电击转化产朊假丝酵母。转化产物涂布在同时含有G418抗生素的YPD平板培养基，30℃培养3天，待菌落长出后，进行菌落PCR鉴定，挑选阳性克隆。
S2.重组基因工程菌株的筛选：挑选6株菌落PCR鉴定为阳性的重组子，用YPD培养基活化后，以1％的接种量，接种至新的含有10ml YPD培养基的试管中，30℃，200rpm培养；在24h，48h，72h，各取一次样，每次取1.5ml菌液，离心收集上清，分别测木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶酶活。挑选出酶活最高的重组子(命名为XA2)，进行后续工艺构建。
实施例5一种降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇的工艺
S1.甘蔗渣中半纤维素的提取及其含量的测定：根据N Jayapal等人(Jayapal N,Samanta A K,Kolte A P,et al.Value addition to sugarcane bagasse:Xylanextraction and its process optimization for xylooligosaccharides production[J].Industrial Crops and Products,2013,42:14-24.)提出的碱提取法提取蔗渣中的半纤维素，并参考Xiadi Gao等人(Gao X D,Kumar R,Charles E.Wyman.Fast hemicellulosequantification via a simple one-step acid hydrolysis[J].Biotechnology andBioengineering,2014,9999:9.)的一步酸水解法测定所提取的半纤维素沉淀中干物质成分。
S2.低聚木糖、木糖醇及阿拉伯糖联产工艺的构建：取产朊假丝酵母野生菌，及本实验保藏的表达里氏木霉木聚糖酶单基因的重组产朊假丝酵母菌株XYN4及上述实施例3中得到的同时表达木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的重组产朊假丝酵母菌株XA2进行活化。将活化过夜的菌种，以1％的接种量分别接种至5ml YPD培养基中，30℃，200rpm条件下培养。当菌体生长至对数期时，以10％的接种量接种至含有2％(干重)半纤维素的YPD培养基中。在30℃，200rpm条件下进行培养(每个菌做两个平行)。在48h，72h，156h三个时间点分别取样1.5ml。将所取样品12000rpm，离心10min，取上清，用0.45μm的过滤器过滤后，用HPLC检测分析其成分。其中，检测阿拉伯糖和木糖醇用色谱柱BioRad HPX-87H，检测低聚木糖用色谱柱BioRad HPX-42A。结果如附图2所示。从图中可以看出，产朊假丝酵母野生菌株，没有降解半纤维素的能力，整个培养过程 中，没有低聚木糖，阿拉伯糖和木糖醇产生。而本发明所构建的重组菌XA2以及实验室之前构建的重组菌XYN4均能降解半纤维素产生低聚木糖和木糖醇。从图2-e可以看出，在整个培养过程中，重组菌XYN4没有产生阿拉伯糖，而重组菌XA2能降解半纤维素产生阿拉伯糖，这一结果证明了，阿拉伯糖苷酶能够降解木聚糖主链上的阿拉伯糖侧链，从而促进木聚糖酶对木聚糖的水解。
根据HPLC定量的结果显示，以20g/l的蔗渣半纤维素为底物，经培养156h后，中间过程所产生的木糖被酵母本身耗尽，低聚木糖得率为20％，此时木糖醇和阿拉伯糖分别达到最高得率为3.5％和2.7％。应用本发明所述的基因工程重组产朊假丝酵母菌株XA2，蔗渣半纤维素水解率达到40.4％。
S3.产物薄层层析(TLC)分析：为进一步分析上清液中低聚木糖的各种组分情况，参考Jingbo li等的方法，对产物进行薄层层析分析，将硅胶板在105℃活化30min后，取5μl样品上清液，点在事先在硅胶板上划好的点样点上，边点样，边用吹风机吹干，以避免样品扩散；在层析缸中加入适量展开剂，将硅胶板放入层析缸中，展开3h后，取出硅胶板，在通风橱内通风晾干，然后在硅胶板上均匀喷洒显色剂，通风晾干，然后于85℃，烘10min显色，观察条带并拍照。结果如附图3所示。
上述两个实验结果证明，本发明构建的低聚木糖，阿拉伯糖，木糖醇联产的统合生物工艺是有效的，能够同时产生上述三种产物，并消耗掉木糖，从而降低了木糖与阿拉伯糖分离的难度，同时也降低了生产成本。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东启智生物科技有限公司
<120> 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 663
<212> DNA
<213> 改造后的木聚糖酶基因
<400> 1
ctcgagaaaa gagaggctga agctatgccc acaggcctag agcctgagag cagtgtcaac 60
gtcacagagc gtggcatgta cgactttgtt cttggtgctc acaatgatca tcgccgtcgt 120
gcaagcatca actacgacca aaactaccaa actggcggac aagtcagcta ttcgccttcc 180
aacactggct tctcagtgaa ctggaacact caagatgact ttgttgtggg cgttggttgg 240
acgactggat cttctgctcc catcaacttt ggcggctctt ttagtgtcaa cagcggaact 300
ggcctgcttt ccgtctatgg ctggagcacc aacccactgg ttgagtacta catcatggag 360
gacaaccaca actacccagc acagggtacc gtcaagggaa ccgtcaccag cgacggagcc 420
acttacacca tctgggagaa tacccgtgtc aacgagcctt ccatccaggg cacagcgacc 480
ttcaaccagt acatttccgt gcggaactcg cccaggacca gcggaactgt tactgtgcag 540
aaccacttca atgcttgggc ctcgcttggc ctgcaccttg ggcagatgaa ctaccaggtt 600
gtcgctgtcg aaggctgggg tggtagtggt tctgcctcac agagtgtcag caactaatct 660
aga 663
<210> 2
<211> 1514
<212> DNA
<213> 改造后的阿拉伯呋喃糖苷酶基因
<400> 2
ttcgaatgct ctccaacgct cgtatcatcg cagcgggctg tattgctgca ggctctctcg 60
ttgctgctgg gccttgtgac atctactcct cgggcggaac gccttgcgtt gccgcccaca 120
gcaccactcg tgctctgttc agcgcttata ccggcccgtt ataccaggta aagcgcggct 180
ccgatggtgc cacaaccgcc atatcgcccc tctcaagtgg tgtggccaac gctgccgctc 240
aagatgcttt ctgtgcggga actacatgcc tcattaccat catatacgac cagtcgggtc 300
gcggcaacca tctcacccag gccccgccgg gcggcttcag cggcccggaa tccaacggct 360
atgacaacct ggctagtgca attggggcgc cggtaacact caacggccag aaggcgtatg 420
gagttttcgt gtctccagga acggggtatc ggaataacgc tgccagcggc acagccaaag 480
gagatgccgc ggagggcatg tatgcggttc tcgatggtac acactacaac ggcgcctgct 540
gctttgacta tggcaacgcc gagaccaaca gccgcgatac aggcaacggt catatggagg 600
ccatctattt tggcgacagc actgtctggg gtactggctc aggcaagggt ccgtggatca 660
tggctgatct cgagaacggc ttgttctcag gctccagtcc cggcaacaat gccggtgatc 720
cgtccatctc gtaccggttc gtcactgcag cgatcaaggg gcagccaaac caatgggcaa 780
tccgtggcgg caatgctgcg tctggctcgc tgtcaacttt ctacagcggc gctcgcccac 840
aagtctccgg atacaatccg atgagcaaag agggcgccat cattctcggc attggcggcg 900
acaacagcaa cggcgcccag ggcacattct atgagggcgt catgacctct ggatatcctt 960
ccgatgcaac agagaattca gtgcaagcca acatcgtagc tgccagatat gccgtcgcgc 1020
cgctgacaag tggtcctgcc ctcaccgtcg gttcgtcaat ctctctacga gccacaacag 1080
cttgctgcac gactcgctac atcgctcata gcgggtctac ggtcaacacc caagtcgtct 1140
catcatccag cgccacagcc ctcaagcaac aggccagctg gacggttcgt gccggcctgg 1200
caaataacgc ttgcttctcg tttgagtcca gggacacgtc gggcagctac attcgccact 1260
ccaacttcgg tcttgtgttg aatgccaatg atggcagtaa gctctttgct gaggatgcta 1320
ccttttgcac gcaggcgggc attaacggcc agggaagctc cattagatct tggagctacc 1380
caacgcgata ctttcgccac tacaataaca cgctctacat cgcgagtaac gggggcgttc 1440
acgtattcga tgccactgcc gctttcaacg acgacgtgag ctttgtggtt agtggcggtt 1500
ttgcttaatc taga 1514

Claims (9)

1.一种能分解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母，其特征在于，将木聚糖酶基因和阿拉伯糖苷酶基因克隆到多基因表达载体pScIKPr上，然后将重组表达载体转化产朊假丝酵母即得重组产朊假丝酵母；所述多基因表达载体pScIKPr是通过将多基因表达载体pScIKP的rDNA片段去除而得到。
2.根据权利要求1所述的重组产朊假丝酵母，其特征在于，所述多基因表达载体pScIKPr构建方法如下：
（1）将酿酒酵母多基因表达载体pScIKP用Bsp119I和SacI进行双酶切；
（2）将上述（1）双酶切所得片段用S1核酸酶进行双链DNA末端平滑处理；
（3）将上述（2）所得片段经T4连接酶自连接得到pScIKPr。
3.根据权利要求1所述的基因重组产朊假丝酵母，其特征在于，所述重组表达载体是通过以下方法构建得到的：
（1）将木聚糖酶基因的成熟肽片段与产朊假丝酵母的GAP基因启动子、酿酒酵母的α因子信号肽片段以及酿酒酵母的CYC基因终止子连接在一起构成木聚糖酶基因表达盒；
（2）将上述（1）木聚糖酶基因表达盒以及pScIKPr载体分别双酶切后连接到一起，构成木聚糖酶基因表达载体；
（3）将阿拉伯糖苷酶基因以及上述（2）木聚糖酶基因表达载体分别双酶切后连接到一起，构成木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶双基因重组表达载体。
4.根据权利要求2所述的重组表达载体，用于木聚糖酶基因表达盒以及pScIKP载体双酶切的限制性内切酶为SalI和NotI。
5.根据权利要求2所述的重组表达载体，用于阿拉伯糖苷酶基因以及木聚糖酶基因表达载体双酶切的限制性内切酶为BamHI和SpeI。
6.根据权利要求1所述的基因重组产朊假丝酵母，其特征在于，所述木聚糖酶基因来源于里氏木霉，经过去除其信号肽，突变第40位和97位碱基，并融合酿酒酵母α因子信号肽序列构成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求1所述的基因重组产朊假丝酵母，其特征在于，所述阿拉伯呋喃糖苷酶基因来源于里氏木霉，并突变其第131位碱基而成，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.权利要求1所述的基因重组产朊假丝酵母在降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇中的应用。
9.一种降解半纤维素联产低聚木糖、阿拉伯糖、木糖醇的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 菌种活化：将权利要求1所述的基因重组产朊假丝酵母甘油菌种（或斜面菌种、平板单克隆菌种）接种于含1%酵母提取物、2%蛋白胨及2%葡萄糖的YPD培养基中进行活化培养；
（2）将经过活化的菌种以1%接种量接种至新鲜YPD培养基中进行扩大培养，作为种子培养液；
（3）待上步所得种子培养液中，菌体生长达到对数生长期，以10%的接种量接种至含有2%半纤维素的YPD培养基中；于30℃、200 rpm培养；
（4）按时间间隔取样，检测木糖醇、阿拉伯糖及低聚木糖的生成情况。
CN201610818306.7A 2016-09-12 2016-09-12 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用 Active CN106520586B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610818306.7A CN106520586B (zh) 2016-09-12 2016-09-12 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610818306.7A CN106520586B (zh) 2016-09-12 2016-09-12 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106520586A true CN106520586A (zh) 2017-03-22
CN106520586B CN106520586B (zh) 2019-10-11

Family

ID=58343912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610818306.7A Active CN106520586B (zh) 2016-09-12 2016-09-12 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106520586B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018045591A1 (zh) * 2016-09-12 2018-03-15 广东启智生物科技有限公司 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
CN108587932A (zh) * 2017-11-30 2018-09-28 江苏省农垦麦芽有限公司 一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶
CN110218731A (zh) * 2019-06-06 2019-09-10 浙江工业大学 一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用
CN110305806A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 广东利世康低碳科技有限公司 一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法
CN110373340A (zh) * 2019-07-12 2019-10-25 广东利世康低碳科技有限公司 一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101319225A (zh) * 2008-07-22 2008-12-10 暨南大学 一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101319225A (zh) * 2008-07-22 2008-12-10 暨南大学 一种酿酒酵母多基因表达载体及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吕一鸣: "木聚糖酶与阿拉伯呋喃糖苷酶基因在毕赤酵母中共表达的研究", 《万方学位论文》 *
杨红兰等: "产朊假丝酵母整合表达载体的构建", 《微生物学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018045591A1 (zh) * 2016-09-12 2018-03-15 广东启智生物科技有限公司 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
CN108587932A (zh) * 2017-11-30 2018-09-28 江苏省农垦麦芽有限公司 一种提高麦汁过滤性能的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶
CN110218731A (zh) * 2019-06-06 2019-09-10 浙江工业大学 一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用
CN110218731B (zh) * 2019-06-06 2021-04-06 浙江工业大学 一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用
CN110305806A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 广东利世康低碳科技有限公司 一种降解蛋白质的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法
CN110373340A (zh) * 2019-07-12 2019-10-25 广东利世康低碳科技有限公司 一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法
WO2021008078A1 (zh) * 2019-07-12 2021-01-21 广东利世康低碳科技有限公司 一种降解餐厨废弃物的产朊假丝酵母单基因表达菌株及其构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106520586B (zh) 2019-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190161772A1 (en) Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
CN106520586B (zh) 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
Tri et al. Butanol production from cellulosic material by anaerobic co-culture of white-rot fungus Phlebia and bacterium Clostridium in consolidated bioprocessing
Chi et al. Bioaugmentation with Clostridium tyrobutyricum to improve butyric acid production through direct rice straw bioconversion
Boonsawang et al. Ethanol production from palm pressed fiber by prehydrolysis prior to simultaneous saccharification and fermentation (SSF)
GB2489967A (en) Method of producing an animal feed by hydrolysis and fermentation
CN105238704A (zh) 一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
Liu et al. Production of bioethanol from Napier grass via simultaneous saccharification and co-fermentation in a modified bioreactor
EP2825644A1 (en) Cbh1a variants
EP3802843B1 (en) Process for producing sugars from carbohydrate materials
CN111094556B (zh) 用于生产纤维素酶和木聚糖酶的突变株棘孢曲霉及其制备方法
CN107429265A (zh) 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
Zhao et al. Simultaneous manipulation of transcriptional regulator CxrC and translational elongation factor eEF1A enhances the production of plant-biomass-degrading enzymes of Penicillium oxalicum
CN103421851A (zh) 一种用甘薯废弃物制备糖和乙醇的方法
CN108753741A (zh) 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO15g及其应用
CN107406862A (zh) 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
Guo et al. Reducing β-glucosidase supplementation during cellulase recovery using engineered strain for successive lignocellulose bioconversion
Cripwell et al. Additional glucoamylase genes increase ethanol productivity on rice and potato waste streams by a recombinant amylolytic yeast
CN103805673A (zh) 一种利用转基因酵母混合发酵生产秸秆乙醇的方法
US11319559B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US20220186264A1 (en) Process for producing a fermentation broth
WO2018045591A1 (zh) 一种能降解利用半纤维素的基因重组产朊假丝酵母及其应用
AU2015261652A1 (en) Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
WO2024137248A1 (en) Compositions comprising arabinofuranosidases and a xylanase, and use thereof for increasing hemicellulosic fiber solubilization
WO2019219804A1 (en) Process for producing a polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 510760, Guangzhou District, Guangdong, Whampoa Province, three Po Road 19, 2 buildings, 1 floor, B District

Applicant after: Guangdong Li Shikang low-carbon technology Co. Ltd.

Address before: Nine, 333 Guangzhou, Jianshe Road, Guangdong, Luogang District, Guangzhou, 510555, China

Applicant before: GUANGDONG QIZHI BIOTECHNOLOGY CO., LTD.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant