CN107406862A - 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由木质纤维素材料生产醇和生产有机酸的整合方法。

Description

酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
发明领域
本发明涉及由木质纤维素材料生产醇和生产有机酸的整合方法。
发明背景
木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其提供了用于产生化石燃料的替代能源和化学源的有吸引力的平台。该材料有大量可供使用，并且可被转化为糖，糖可另外被转化为有价值的发酵产物，例如生物燃料和有机酸。
由木质纤维素材料生产发酵产物是本领域已知的，其通常包括以下步骤：预处理、水解、发酵和任选的回收发酵产物。
水解可包括液化、预糖化和/或糖化的步骤，在水解期间，存在于木质纤维素材料中的纤维素通过纤维素分解酶被部分(通常为30-95％，可取决于酶活性和水解条件)转化为还原糖。通常在45-70℃的升高的温度下和非无菌条件下，在持续6-168小时的过程中进行水解(见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。通常，糖然后被微生物(如酵母)转化为有价值的发酵产物，例如乙醇和琥珀酸。
琥珀酸是众所周知的具有高价值的四碳有机酸，因为它可被用作许多重要的工业化学品和消费品的前体。目前，由丁烷通过马来酸酐以石油化学方法生产琥珀酸。然而，最近备受关注的是利用微生物进行琥珀酸的微生物生产作为化学合成的替代。
近年来，主要是由于不确定的燃料供应和努力减少二氧化碳排放，由可再生生物质资源生产乙醇从全球环境的角度来看变得非常重要。生物乙醇被认为是良好的燃料替代物，这是因为源作物可以在全世界的大部分气候中可再生地生长。另外，使用生物乙醇通常是二氧化碳中性的。
近年来，出现了生物炼制(biorefinery)的概念。在生物炼制概念中，整合了用于生产多种产品(包括燃料、电能、化学品和牛饲料)的技术和生物质转化过程。采用这种方式利用了生物质原料的化学和结构组成的天然差异。谨慎管理和利用材料、产物和废物是期望的，使得生物炼制概念成为工业共生的明显实例。通过生产多种产物并整合废物处理，生物炼制可以最大限度地发挥源自生物质原料的价值，并将生物质加工转化为真正的机会。
优化在生物炼制中进行的工艺和生物炼制的整体设计是提高生物炼制的效率和降低其总成本的关键工具。
因此，期望包括旨在最大限度地提高生物炼制的产出并降低其总成本的新颖且创新的概念、设计和方法配置。
发明概述
本发明的一个目标是提供由木质纤维素材料生产醇和有机酸的改进的整合方法。优化和改进存在于许多特征，包括但不限于侧流的增值(valorisation)、流的分离、某些材料和流的(再)使用、酶促水解和发酵的条件、多种转化过程的整合。优选地，由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法包括以下步骤：
-酶促水解木质纤维素材料以获得酶促水解的木质纤维素材料，
-固/液分离所述酶促水解的木质纤维素材料以获得至少固体级分和至少液体级分，
-通过产醇的微生物发酵所述至少固体级分和/或所述至少液体级分以生产醇，
-通过产有机酸的微生物发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分以生产有机酸，
-任选地，通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产醇的微生物增殖，
-任选地，通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产有机酸的微生物增殖，
-任选地，使产酶的微生物的增殖，和
-任选地，通过产酶的微生物生产酶。
发明详述
贯穿本说明书和所附权利要求书，词语“包括”和“包含”及其变型均被解释为包括性的。即，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可包括未具体指出的其他元件或整体。在本文中不使用数量词修饰时指代一个或多于一个的(即，一个或至少一个的)语法对象。举例来说，“元件”可表示一个元件或多于一个的元件。本文所用的术语“微生物”是指一种或多种微生物。除非另有说明，术语“至少固体级分”和“至少液体级分”分别是指在固/液分离酶促水解的木质纤维素材料之后获得的至少固体级分和至少液体级分。如本文所述，在固/液分离之后，获得了至少固体级分和至少液体级分。“至少固体级分”和“至少液体级分”是指分离步骤的结果，也可分别用术语“固体级分”和“液体级分”代替。
本发明涉及共同生产醇和有机酸的整合方法。术语“整合方法”是本领域技术人员已知的，其是指这样的方法，其中组合了可单独进行的至少两个单独的工业方法的两个或更多个相关处理步骤，以使得至少一个处理步骤是这两个方法共用的。此外，在如本文所定义的“整合方法”中，在一个工业方法中产生和/或获得的流、级分和/或部分可用于另一个工业方法中，从而相对于每个单独方法之和有效改善了整体方法。整合方法优化了生物质的利用，并减少了否则将需要处理的副产物。换句话说，术语“整合方法”是指利用不同单元之间的相互作用的至少两个单元操作的组合，以有效地利用资源，提高能源效率，改善材料平衡，最大化利润和/或最小化成本。两个单元操作中的至少一个从另一单元操作接收材料和/或能量，并且可以依赖于这些。在整合方法中，从一开始就考虑不同单元操作之间的相互作用，而不是对它们进行单独优化。方法整合不限于新设备的设计，还包括改造设计，例如要安装在旧设备中的新单元，以及现有系统的操作。本发明还提供了醇和有机酸的生产方法，其中这些方法的单元被完全整合，因此所述方法由于其步骤内的互连和替代选择而具有低成本、简单操作和通用性。整合方法比单独的方法合在一起对能量且材料更有效，因此，通过木质纤维素生物质的完全利用和增值，产生了更高的生产率。
本发明涉及由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括：
-酶促水解木质纤维素材料以获得酶促水解的木质纤维素材料，
-固/液分离所述酶促水解的木质纤维素材料以获得至少固体级分和至少液体级分，
-通过产醇的微生物发酵所述至少固体级分和/或所述至少液体级分以生产醇，
-通过产有机酸的微生物发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分以生产有机酸，
-任选地，通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产醇的微生物增殖，
-任选地，通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产有机酸的微生物增殖，
-任选地，使产酶的微生物增殖，和
-任选地，通过产酶的微生物生产酶。
本发明还涉及由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括：
-预处理木质纤维素材料以获得预处理的木质纤维素材料，
-酶促水解预处理的木质纤维素材料以获得酶促水解的木质纤维素材料，
-固/液分离酶促水解的木质纤维素材料以获得至少固体级分和至少液体级分，
-通过产醇的微生物发酵所述至少固体级分和/或所述至少液体级分以生产醇，
-通过产有机酸的微生物发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分以生产有机酸。
-任选地，通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产醇的微生物增殖，
-任选地，通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产有机酸的微生物增殖，
-任选地，使产酶的微生物增殖，和
-任选地，通过产酶的微生物生产酶。
在一种实施方式中，至少液体级分被用作通过产有机酸的微生物生产有机酸的底物。换句话说，产有机酸的微生物发酵至少液体级分以产生有机酸。在一种实施方式中，产有机酸的微生物不发酵至少固体级分以产生有机酸。在一种实施方式中，由产醇的微生物产生的醇被用作通过产有机酸的微生物的发酵的底物。
在一种实施方式中，至少液体级分被用作通过产醇的微生物生产醇的底物。换句话说，产醇的微生物发酵至少液体级分以产生醇。在一种实施方式中，产醇的微生物不发酵至少固体级分以产生醇。在一种实施方式中，在固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的液体级分被用作通过产醇的微生物生产醇的底物。在一种实施方式中，在固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的液体级分和至少液体级分被用作通过产醇的微生物生产醇的底物。在一种实施方式中，酶促水解的木质纤维素材料被用作通过产醇的微生物生产醇的底物。换句话说，在酶促水解的木质纤维素材料经受固/液分离之前，将其用作通过产醇的微生物生产醇的底物。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括以下步骤：通过发酵至少液体级分和/或至少固体级分使产醇的微生物增殖。如果有必要的话，可以在增殖之前和/或期间添加一种或多种外部碳和营养源。增殖条件取决于所用微生物的类型，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括以下步骤：通过发酵至少液体级分和/或至少固体级分使产有机酸的微生物增殖。如果有必要的话，可以在增殖之前和/或期间添加一种或多种外部碳和营养源。增殖条件取决于所用微生物的类型，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括以下步骤：使产酶的微生物增殖。如果有必要的话，可以在增殖之前和/或期间添加一种或多种外部碳和营养源。增殖条件取决于所用微生物的类型，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一种实施方式中，本发明涉及如本文所述的由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括以下步骤：通过产酶的微生物生产酶。如果有必要的话，可以在生产之前和/或期间添加一种或多种外部碳和营养源。生产条件取决于所用微生物的类型，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一种实施方式中，本发明涉及由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括：
-酶促水解木质纤维素材料以获得酶促水解的木质纤维素材料，
-固/液分离所述酶促水解的木质纤维素材料以获得至少固体级分和至少液体级分，
-通过产醇的微生物发酵所述至少固体级分和/或所述至少液体级分以生产醇，
-通过产有机酸的微生物发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分以生产有机酸，
-通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产醇的微生物增殖，
-通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产有机酸的微生物增殖，
-使产酶的微生物增殖，和
-通过产酶的微生物生产酶。
在一种实施方式中，本发明涉及由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法，其中所述方法包括：
-预处理木质纤维素材料以获得预处理的木质纤维素材料，
-酶促水解预处理的木质纤维素材料以获得酶促水解的木质纤维素材料，
-固/液分离酶促水解的木质纤维素材料以获得至少固体级分和至少液体级分，
-通过产醇的微生物发酵所述至少固体级分和/或所述至少液体级分以生产醇，
-通过产有机酸的微生物发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分以生产有机酸。
-通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产醇的微生物增殖，
-通过发酵所述至少液体级分和/或所述至少固体级分使所述产有机酸的微生物增殖，
-使产酶的微生物增殖，和
-通过产酶的微生物生产酶。
在一种实施方式中，酶促水解和发酵可以是分开的步骤，但也可以组合。实例包括但不限于分步水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合水解和发酵(HHF)、分步水解和共发酵(SHCF)、混合水解和共发酵(HHCF)以及直接微生物转化(DMC)(有时也称为联合生物加工(CBP))。
在一种实施方式中，木质纤维素材料在酶促水解之前经受至少一次固/液分离。在一种实施方式中，预处理的木质纤维素材料在酶促水解之前经受至少一次固/液分离。因此，在使木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料经受酶促水解之前，可使其经受至少一次固/液分离。固/液分离的方法和条件取决于所用木质纤维素材料的类型，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。实例包括但不限于离心、旋流分离、过滤、倾析、筛分和沉降。在固/液分离期间，可以使用用于改善分离的手段和/或辅助物。
在一种实施方式中，使固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的液体级分经受酶促水解。使固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的固体级分经受进一步的固/液分离。这个循环可以重复几次。
在另一种实施方式中，使固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的固体级分经受酶促水解，而固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的液体级分在至少一个发酵过程中被用作底物。在一种实施方式中，固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的液体级分被用作产醇的微生物的增殖的底物和/或被用作通过产醇的微生物发酵以生产醇的底物。
在使木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料经受固/液分离步骤之前，可以加入额外的化合物，例如离心助剂。
在一种实施方式中，可以在使木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料经受固/液分离步骤之前加入酶促水解中使用的酶。从而所述酶部分存在于液体级分中。
在一种实施方式中，部分酶促水解的木质纤维素材料被用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。在一种实施方式中，用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的所述部分酶促水解木质纤维素材料是在固/液分离酶促水解的木质纤维素材料之后获得的至少液体级分。在一种实施方式中，部分酶促水解的木质纤维素材料以及部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料被用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。这意味着：在产酶的微生物增殖之前和/或期间和/或在通过产酶的微生物生产酶之前和/或期间，将部分酶促水解的木质纤维素材料和/或部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料加入产酶的微生物中。当然，还可以将产酶的微生物加入部分酶促水解的木质纤维素材料和/或部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料中。用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料尚未经受酶促水解。在一种实施方式中，用于产酶的微生物增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料尚未经受固/液分离。在另一种实施方式中，用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料已经受固/液分离。在后一种情况下，固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之后获得的固体级分被用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。
在一个优选的实施方式中，产酶的微生物所生产的酶被用于木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料的酶促水解中以获得酶促水解的木质纤维素材料。
在一种实施方式中，产酶的微生物的增殖和通过产酶的微生物生产酶是一个步骤，这意味着：在产酶的微生物的增殖期间，微生物已产生了酶。
在产酶的微生物增殖之前和/或期间和/或在通过产酶的微生物生产酶之前和/或期间加入产酶的微生物中的酶促水解的木质纤维素材料可以在加入之前被浓缩。在一种实施方式中，用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分酶促水解木质纤维素材料已经受固/液分离。在固/液分离酶促水解的木质纤维素材料之后获得的液体级分可用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。在一种实施方式中，可以使液体级分经受浓缩步骤，然后将其用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。
在产酶的微生物增殖之前和/或期间和/或在通过产酶的微生物生产酶之前和/或期间加入产酶的微生物中的木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料可以在加入之前进行洗涤。
在一种实施方式中，用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分酶促水解的木质纤维素材料与部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之间的比值介于1重量％：99重量％和99重量％：1重量％之间。当然，如果在产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶中使用一种或多种外部碳源，则该比值可不同。在一个替代性实施方式中，当酶促水解包括分开的液化步骤和糖化步骤(如下文更详细描述)时，液化步骤的产物可用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。这可以在添加或不添加酶促水解的木质纤维素材料的情况下进行。当然，部分酶促水解的木质纤维素材料、部分预处理的木质纤维素材料、液化步骤的产物以及外部碳和营养源的每种组合也可以用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。
用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分酶促水解的木质纤维素材料和部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料可以不同。用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分酶促水解的木质纤维素材料可以为总酶促水解的木质纤维素材料的至少1重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％、至少5重量％、至少6重量％、至少7重量％、至少8重量％、至少9重量％、至少10重量％、至少11重量％、至少12重量％、至少13重量％、至少14重量％、至少15重量％、至少20重量％。
用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的部分木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料可以为总木质纤维素材料和/或总预处理的木质纤维素材料的至少1重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％、至少5重量％、至少6重量％、至少7重量％、至少8重量％、至少9重量％、至少10重量％。
除了酶促水解的木质纤维素材料和木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之外，至少一种外部碳源和营养源也可用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶。外部碳源和营养源可以具有诱导物和/或营养物的功能。当然，可以添加几种不同的外部碳源和营养源。本领域技术人员已知适用于产酶的微生物的增殖和/或通过产酶的微生物生产酶的碳源和营养源。
酶促水解后，使酶促水解的木质纤维素材料经受固/液分离。固/液分离方法包括但不限于离心、旋流分离、过滤、倾析、筛分和沉淀。在固/液分离期间，可以使用用于改善分离的手段和/或辅助物。
固/液分离产生至少固体级分和至少液体级分。在一种实施方式中，至少固体级分包含3-97重量％的C5糖。在一种实施方式中，至少液体级分包含1-97重量％的C6糖。
在一种实施方式中，酶促水解至少包括液化步骤和糖化步骤，在液化步骤中木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料在至少第一容器中被水解；在糖化步骤中经液化的材料在所述至少第一容器和/或在至少第二容器中被水解。糖化可以在与液化相同的容器(即所述至少第一容器)中进行，它还可以在单独的容器(即至少第二容器)中进行。因此，在根据本发明的整合方法的酶促水解中，可以将液化和糖化合并。可替代地，液化和糖化可以是单独的步骤。液化和糖化可以在不同的温度下进行，但是也可以在单一温度下进行。在一种实施方式中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选地在60℃-75℃的温度下进行，并且糖化优选地在50℃-65℃的温度下进行。
酶促水解可以在一个或多个容器中进行，但也可以在一个或多个管或任何其它连续系统中进行。当酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时也是如此。液化步骤可以在一个或多个容器中进行，但也可以在一个或多个管或任何其它连续系统中进行和/或糖化步骤可以在一个或多个容器中进行，但也可以在一个或多个管或任何其它连续系统中进行。待用于本发明中的容器的实例包括但不限于补料分批搅拌容器、分批搅拌容器、具有超滤作用的连续流搅拌容器和连续活塞流柱反应器。搅拌可以通过一个或多个叶轮、泵和/或静态混合器进行。
在一种实施方式中，可以将木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料加入用于酶促水解的一个或多个容器中。在一种实施方式中，在加入木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之前，酶促水解中使用的酶已存在于一个或多个容器中。在另一种实施方式中，可以将酶促水解中使用的酶加入一个或多个容器中。在一种实施方式中，在加入酶促水解中使用的酶之前，木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料已存在于一个或多个容器中。在一种实施方式中，将木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料以及酶促水解中使用的酶二者同时加入一个或多个容器中。酶促水解中使用的酶可以是水性组合物。当酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时，本段也适用。
酶促水解中使用的酶可以在酶促水解之前和/或期间加入。如上所述，当木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料在酶促水解之前经受固/液分离时，可以在固/液分离之前加入酶促水解中使用的酶。或者，其也可以在固/液分离之后或固/液分离之前和之后加入。也可以在酶促水解期间加入酶。在酶促水解包括液化步骤和糖化步骤的情况下，可以在液化步骤期间和/或之后加入另外的酶。可以在糖化步骤之前和/或期间加入另外的酶。也可以在糖化步骤之后加入另外的酶。
在一种实施方式中，总酶促水解时间为10小时或更长、12小时或更长、14小时或更长、16小时或更长、18小时或更长、20小时或更长、30小时或更长、40小时或更长、50小时或更长、60小时或更长、70小时或更长、80小时或更长、90小时或更长、100小时或更长、110小时或更长、120小时或更长、130小时或更长、140小时或更长、150小时或更长、160小时或更长、170小时或更长、180小时或更长、190小时或更长、200小时或更长。
在一种实施方式中，总酶促水解时间为10-300小时、16-275小时、优选为20-250小时、更优选为30-200小时、最优选为40-150小时。
用于酶促水解的一个或多个容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10-4000cP之间、10-2000cP之间、优选10-1000cP之间。
在整合方法包括包含液化步骤和糖化步骤的酶促水解的情况下，液化步骤中木质纤维素材料的粘度保持在10-4000cP之间，10-2000cP之间，优选10-1000cP之间和/或糖化步骤中木质纤维素材料的粘度保持在10-1000cP之间、10-900cP之间、优选10-800cP之间。
可以利用Brookfield DV III流变仪在用于水解的温度下测定粘度。
在一种实施方式中，在酶促水解期间添加氧。在一种实施方式中，在至少部分酶促水解期间添加氧。可以在酶促水解期间连续或不连续地添加氧。在一种实施方式中，在酶促水解期间一次或多次添加氧。在一种实施方式中，可以在酶促水解之前、在将木质纤维素材料加入用于酶促水解的容器中期间、在将酶加入用于酶促水解的容器中期间、在部分酶促水解期间、在整个酶促水解期间或其任何组合添加氧。将氧添加到用于酶促水解的一个或多个容器中。
可用几种方式添加氧。例如，氧可作为氧气、富氧气体如富氧空气或空气而添加。也可以通过原位生成氧来添加氧。例如，可以通过电解生成氧，可以通过酶法(例如，通过添加过氧化物)产生氧，或可以通过化学方法(例如，通过氧生成系统例如KHSO5)产生氧。例如，通过过氧化氢酶由过氧化物产生氧。过氧化物可以以溶解的过氧化物的形式添加或通过酶促反应或化学反应生成。如果使用过氧化氢酶作为用于产生氧的酶，则可以使用存在于用于水解的酶组合物中的过氧化氢酶或者可以添加过氧化氢酶用于该目的。
如何添加氧的实例包括但不限于通过喷射、电解添加氧，化学添加氧，从顶部填充酶促水解中使用的一个或多个容器(将水解物投入罐中，从而将氧引入到水解物)和向所述一个或多个容器的顶部空间添加氧。将氧添加到容器的顶部空间时，可以供应水解反应所需的充足氧。通常，可以控制和/或改变添加到容器中的氧的量。通过仅在所述容器中的部分水解时间期间添加氧来限制供应的氧是可行的。另一种选择是通过例如使用空气和循环空气(离开反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气来添加低浓度的氧。可以通过在更长的水解时间段期间添加氧、通过添加更高浓度的氧或通过添加更多的空气来增加添加的氧的量。控制氧浓度的另一种方法是添加耗氧物和/或产氧物。可以将氧引入例如吹入木质纤维素材料的液体水解容器内容物中。也可以将其吹入容器的顶部空间。
在一种实施方式中，在将木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料添加到酶促水解中使用的一个或多个容器之前和/或期间和/或之后，将氧添加到所述一个或多个容器中。氧可以与进入水解容器的木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料一起引入。氧可被引入将进入容器的材料流中，或者与经过容器外环的部分容器内容物一起被引入。
在酶促水解中，无定形和结晶多糖或纤维素被水解为糖(如葡萄糖)。无定形多糖例如被内切葡聚糖酶转化为寡糖，然后所述寡糖可以被纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶转化为葡萄糖。结晶多糖的转化可以并行地或顺序地进行，并且甚至当大部分无定形多糖已被水解时继续。与过溶解性多糖单加氧酶组合添加氧在结晶多糖的水解期间是有益的，例如在将多糖降解为寡糖中。结晶葡聚糖结构可通过溶解性多糖单加氧酶打开。该类型的酶通过氧化糖苷键而打开该结构并使其可用于其他纤维素分解酶而进一步地将寡糖水解为葡萄糖。添加氧是非常有用的，特别是在其中结晶多糖被酶转化的相中。
在一种实施方式中，本发明的整合方法的酶促水解中所用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3。通常，容器小于3000m3或5000m3。如果本发明的整合方法的酶促水解中使用几个容器，则这些容器可以具有相同的容积，但也可以具有不同的容积。如果本发明的整合方法的酶促水解包括分开的液化步骤和糖化步骤，则用于液化步骤的容器和用于糖化步骤的容器可以具有相同的容积，但也可以具有不同的容积。
在一种实施方式中，通过产醇的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产醇的过程中使用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3、至少3000m3、至少3500m3、至少4000m3、至少4500m3。通常，容器小于5000m3。
在一种实施方式中，通过产有机酸的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产有机酸的过程中使用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3。通常，容器小于2000m3。
在一种实施方式中，通过发酵至少固体级分和/或至少液体级分使产醇的微生物增殖的过程中使用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3。通常，容器小于500m3。
在一种实施方式中，通过发酵至少固体级分和/或至少液体级分使产有机酸的微生物增殖的过程中使用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少150m3。通常，容器小于200m3。
在一种实施方式中，产酶的微生物增殖的过程中使用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3。通常，容器小于500m3。
在一种实施方式中，通过产酶的微生物生产酶的过程中使用的容器的容积为至少1m3。优选地，所述容器的容积为至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3。通常，容器小于100m3。
在一种实施方式中，产酶的微生物是真菌。在一种实施方式中，酶源自丝状真菌，或者酶包括丝状真菌酶。在一个优选的实施方式中，真菌是Rasamsonia，最优选Rasamsoniaemersonii。本发明的整合方法的酶促水解中使用的酶源自真菌，或者本发明的整合方法的酶促水解中使用的酶包括真菌酶。“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行且碳分解代谢是绝对好氧的。丝状真菌菌株包括但不限于，Acremonium,Agaricus,Aspergillus,Aureobasidium,Beauvaria,Cephalosporium,Ceriporiopsis,Chaetomium paecilomyces,Chrysosporium,Claviceps,Cochiobolus,Coprinus,Cryptococcus,Cyathus,Emericella,Endothia,Endothia mucor,Filibasidium,Fusarium,Geosmithia,Gilocladium,Humicola,Magnaporthe,Mucor,Myceliophthora,Myrothecium,Neocallimastix,Neurospora,Paecilomyces,Penicillium,Piromyces,Panerochaete,Pleurotus,Podospora,Pyricularia,Rasamsonia,Rhizomucor,Rhizopus,Scylatidium,Schizophyllum,Stagonospora,Talaromyces,Thermoascus,Thermomyces,Thielavia,Tolypocladium,Trametes pleurotus,Trichoderma和Trichophyton的菌株。
丝状真菌的若干菌株易于被公众从许多培养物保藏机构获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))和农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL))。这些菌株的实例包括Aspergillus nigerCBS513.88、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、P.chrysogenum CBS 455.95、Penicilliumcitrinum ATCC 38065、Penicillium chrysogenum P2、Talaromyces emersonii CBS393.64、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC48272、Trichoderma reesei ATCC26921或ATCC 56765或ATCC 26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Chrysosporiumlucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500-D、ATCC44006和其衍生株。
本发明的整合方法的酶促水解有利地结合从Rasamsonia属的微生物衍生的酶应用或本发明的整合方法的酶促水解中使用的酶包含Rasamsonia酶。
第一阶段的酶促水解优选在50-90℃进行。在该步骤中，优选热稳定的纤维素分解酶。本文所用的“热稳定”酶表示：酶的最适温度为50℃或更高，60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，85℃或更高。例如，它们可分离自嗜热微生物，或者可由本领域技术人员设计和人工合成。在一种实施方式中，多核苷酸可分离自或获自嗜热或耐热丝状真菌或者分离自非嗜热或非耐热但被发现热稳定的真菌。
“嗜热真菌”表示在50℃或更高的温度下生长的真菌。“耐热真菌”表示在45℃或更高(最大值接近50℃)的温度下生长的真菌。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是Humicola、Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia、Talaromyces、Thermomyces、Thermoascus或Thielavia细胞，优选地Rasamsonia细胞。优选的嗜热或耐热真菌是Humicola grisea var.thermoidea、Humicolalanuginosa、Myceliophthora thermophila、Papulaspora thermophilia、Rasamsoniabyssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia argillacea、Rasamsoniaeburnean、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、Rhizomucorpusillus、Rhizomucor miehei、Talaromyces bacillisporus、Talaromyces leycettanus、Talaromyces thermophilus、Thermomyces lenuginosus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus、Thermoascus aurantiacus和Thielavia terrestris。
嗜热真菌不限于特定分类学等级并出现在真菌进化树各处。实例是Mucorales中的Rhizomucor，Sordariales中的Myceliophthora和Eurotiales中的Talaromyces、Thermomyces和Thermoascus(参见Mouchacca 1997)。Talaromyces物种大部分是嗜温的，但例外是Emersonii和Thermophila部分(section)的物种。Emersonii部分包括Talaromycesemersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces bacillisporus和Talaromyces leycettanus，它们全部在40℃下生长良好。Talaromyces bacillisporus耐热，Talaromyces leycettanus耐热至嗜热，Talaromyces emersonii和Talaromycesbyssochlamydoides尤其嗜热(参见Stolk和Samson 1972)。Talaromyces部分Thermophila的唯一成员Talaromyces thermophilus在50℃下生长迅速(参见Stolk和Samson 1972)。这些嗜热的Talaromyces物种的目前分类主要基于表型和生理特征，例如它们在高于40℃时生长的能力、囊孢子颜色、子囊果覆盖物(ascornatal covering)的结构和特定无性型类型的形成。Stolk和Samson(1972)陈述：Emersonii部分的成员具有Paecilomyces(Talaromyces byssochlamydoides和Talaromyces leycettanus)或Penicilliumcylindrosporum系列(Talaromyces emersonii和Talaromyces bacillisporus)其中之一的无性型。稍后，基于多种特征例如从端孔而非在颈(collula，neck)上形成分生孢子(Penicillium和Paecilomyces的特征)，Pitt(1979)将属于Penicillium cylindrosporum系列的物种转移至Geosmithia属。在Geosmithia属内，仅Geosmithia argillacea是耐热的，Stolk等人(1969)和Evans(1971)提出了与Talaromyces部分Emersonii成员的联系。Talaromyces内的嗜热Talaromyces物种与Trichocomaceae的系统发生关系未知(参见J.Houbraken,Antonie van Leeuwenhoek 2012年2月；101(2):403-21)。
Rasamsonia是包括耐热的和嗜热的Talaromyces和Geosmithia物种的新属(J.Houbraken等人，如上所述)。基于表型、生理和分子数据，Houbraken等人提出将Talaromyces emersonii,Talaromyces byssochlamydoides,Talaromyces eburneus,Geosmithia argillacea和Geosmithia cylindrospora物种转移至Rasamsonia新属。优选的嗜热真菌是Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Thermomyceslenuginosus、Talaromyces thermophilus、Thermoascus crustaceus、Thermoascusthermophilus和Thermoascus aurantiacus，其中Rasamsonia emersonii是最优选的。Talaromyces emersonii、Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可交换使用。
应用于预处理的木质纤维素原料的Rasamsonia的纤维素分解酶显示出在50-70℃范围内的温度下的最大转化速率。酶在这些环境下保持活性达14天及更久，而没有完全停止活性。通过使用最佳温度条件，最大量的还原糖能在尽可能短的水解时间内从木质纤维素原料(完全水解)释放出。以这种方式，在不到5天可实现葡萄糖形式的纤维素的100％转化。发酵产物的理论最大产率(以g产物/克葡萄糖计的Yps最大)可来源于教本生物化学。对乙醇而言，根据酵母中正常的糖酵解发酵通路，1摩尔葡萄糖(180g)产生2摩尔乙醇(＝2×46＝92g乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511g乙醇/g葡萄糖。对丁醇(MW 74g/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411g(异)丁醇/g葡萄糖。对乳酸而言，同型乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90g/摩尔)。根据该化学计量，Yps最大＝1g乳酸/g葡萄糖。基于葡萄糖的琥珀酸的理论最大产率为1.12g琥珀酸/g葡萄糖。对其它发酵产物而言，可以进行类似的计算。应用Rasamsonia的纤维素分解酶实现的成本降低是总处理时间减少的结果。
由于本发明方法中所用酶的高稳定性，可以通过延长水解时间来延长酶的使用和减少酶剂量。例如，0.175mL酶/g木质纤维素材料干物质导致在72小时内从预处理的木质纤维素材料中释放还原糖的理论最大值的约90％。当使用0.075mL酶/g木质纤维素材料干物质时，在120小时内实现理论最大值的约90％转化。结果显示，由于酶活性的稳定性，减少的酶剂量可通过延长水解时间补偿，以获得相同量的还原糖。通过使用稳定的(例如Rasamsonia的)纤维素分解酶实现成本降低导致较少的酶剂量但仍导致相似的水解转化产率。
在将木质纤维素材料转化为乙醇的常见方法中，处理步骤优选地在腐败性条件(septic condition)下进行以减少操作成本。污染微生物的污染和生长可因而发生并导致不期望的副作用，例如乳酸、甲酸和乙酸生产，基于底物的乙醇的产率损失，毒素和细胞外多糖的产生。这些作用可显著影响生产成本。高处理温度和/或短处理时间限制水解和发酵期间的污染风险。热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)能在高于60℃的温度下水解木质纤维素原料。在这些温度下，污染微生物引起不期望副作用的风险是极小的甚至几乎为零。
在其中乙醇被生产的发酵步骤期间，温度典型地在30-38℃之间并且由于产量损失而优选地不被升高。通过应用短的发酵处理时间，污染的风险和作用和/或污染物的生长尽可能地被减小。使用稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可应用短的发酵时间，因而污染风险和/或污染物生长将被尽可能地降低。以这种方式应用Rasamsonia的热稳定纤维素分解酶实现的成本降低导致降低了由于污染导致的处理失败的风险。
热预处理后的第一个步骤是将预处理的材料冷却至酶具有最佳活性的温度。大规模时，这典型地通过添加(冷却)水完成，这除了降低温度外，还减少干物质含量。通过使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可实现成本降低，这是因为：i)需要更少的对预处理材料冷却，因为在水解期间允许更高温度，和ii)添加更少的水，这增加水解和发酵期间的干物质含量并因而增加乙醇工厂的乙醇生产能力(每体积每时间单位产生的量)。通过使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，成本降低也可通过使用比用在有非热稳定酶的方法中的水具有更高温度的冷却水实现。
水解结束时，酶活性表现为低的，因为一旦几乎所有纤维素被转化，极少还原糖被释放出。但是，存在的酶促活性的量仅减少少许，假设这主要是由于底物对酶的吸收。通过在水解后应用固液分离，例如离心、过滤、倾析、沉降等等，溶液中的酶活性的60％或更多(例如70％)可被回收并被再利用用于在下一水解期间水解新的预处理的木质纤维素材料。而且，固液分离后，溶液中的酶可从含有还原糖和来自酶促作用的其它水解物的溶液中分离出。可借助或不借助首先将酶吸附到任何类型的载体上，通过包括但不限于超滤和微过滤、离心、倾析、沉降技术进行该分离。例如，用0.175mL/g材料干物质的酶载量对预处理的材料水解20小时后，还原糖的理论最大量的50％被释出，相同水解72小时后，还原糖的理论最大量的90％被释出。通过离心和超滤，在渗余物中回收60-70％的酶活性，而滤液含有超过80％的释出的还原糖。通过再利用渗余物自身或被进一步纯化和/或浓缩后的渗余物，在下一水解步骤期间的酶剂量可被减少60-70％。通过这种方式通过使用稳定纤维素分解酶(例如Rasamsonia的那些)实现成本降低是更少酶剂量的结果。
本发明的整合方法可与水解后再循环酶、发酵后再循环产乙醇的微生物和/或发酵后再循环产有机酸的微生物和/或生产酶后再循环产酶的微生物组合。
酶(比如来自Rasamsonia的那些)的热稳定性导致在水解、发酵和真空蒸馏后糟水中的剩余的纤维素分解活性。酶的总活性在三个连续的方法步骤期间降低。真空蒸馏后获得的糟水可因而被再利用作为酶来源，用于将预处理材料转化为乙醇的新开始的水解-发酵-蒸馏处理循环。糟水可被以浓缩形式或(未)稀释形式和/或被纯化并有或没有额外的酶补充的形式被使用。
在一个最佳方法中，在新处理循环中再利用酶之前，补充到糟水中的酶量等于在先前处理循环的三个连续处理步骤期间损失的活性量。以这种方式，避免超剂量的酶，并因此获得酶的最有效使用。而且，通过在第一处理循环中提供高酶剂量并在随后处理循环中补充等于三个连续处理步骤期间损失的活性量的酶，可在每个处理循环中获得尽可能高的水解速率，导致少于48小时的短的水解时间和酶的最有效的酶使用的组合。
通过在水解期间应用混合，酶变得更经常地与底物接触，这导致催化活性被更有效使用。这将导致酶剂量更低并因而导致成本更低，除非混合对酶具有负面作用。稳定酶(比如来自Rasamsonia的热稳定酶)是稳健的并可抵抗(局部)高剪切和高温环境，这是浆体剧烈混合期间的情况。在混合系统中使用其因而是有益的并会导致剂量减少并因此导致成本降低。
在合适的微生物中表达和生产酶(例如至少2、3或4种不同纤维素酶)的一个优势可以为高的酶组合物产率，其可被用于本发明所述方法中。
在本发明的方法中，使用酶组合物。优选地，组合物是稳定的。本文所用的“稳定酶组合物”表示：酶组合物在30小时水解反应时间后保持活性，优选地，在30小时水解反应时间后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小时的水解反应时间后保持活性。
可通过用合适的微生物(例如Rasamsonia emersonii或Aspergillus niger)发酵合适的底物制备酶，其中酶通过微生物生产。可改变微生物以改进或制造酶。例如，可通过传统菌株改良程序或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可被原样使用以产生酶或可被改变以增加产量或产生改变的酶(其可包含异源酶，例如纤维素酶，即微生物原本不产生的酶)。优选地，真菌更优选地丝状真菌被用来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，使用诱导产酶的微生物表达酶的底物
酶被用来从包含多糖的木质纤维素材料中释放糖。主要的多糖为纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可在例如得自木材的木质纤维素材料中作为葡甘露聚糖存在。这些多糖向可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(actingin concert)的不同酶的作用下。糖产物表示木质纤维素材料的酶促水解物。糖产物包含可溶性糖(包含单体和多聚体二者)。优选地，其包含葡萄糖。其它糖的实例为纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖产物可被原样使用或者可被进一步加工，例如被回收、被浓缩和/或被纯化。
另外，果胶和其它果胶类物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
纤维素是由通过β-1,4键连接的葡萄糖残基构成的线性多糖。纤维素纤维的线性特性以及β-连接的葡萄糖(相对于α)的化学计量产生比淀粉的高度枝化α-连接结构更倾向于链间氢键结合的结构。因此，纤维素聚合物通常溶解度更小，并且与淀粉中存在的纤维相比形成更紧密结合的纤维。
以下更详细描述了可用于本发明中的酶：
裂解多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成产物例如纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。
半纤维素是复杂聚合物并且其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1,4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子枝化，并且可以通过与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸的键或者通过乙酸酯化(和阿魏酸对阿拉伯糖的酯化)被取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(例如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和杂葡聚糖)和另外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。
木聚糖酶与其它辅助酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶)一起催化半纤维素的水解。
果胶类物质包括果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们围绕一定程度上散布着L-鼠李糖的α(1,4)-连接的D-半乳糖醛酸单元的核心链构建。在任何细胞壁中都存在符合所述描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。结构单元的主要类型是：半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1,4)-连接的半乳聚糖和(1,5)-连接的阿拉伯聚糖侧链的鼠李糖单元交替。阿拉伯聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密关联)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹菜糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。
在本发明的整合方法中使用的酶优选地包含至少两种活性，但典型的酶将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。通常，在本发明的整合方法中使用的酶包含至少两种纤维素酶。所述至少两种纤维素酶可以包含相同或不同的活性。在本发明的整合方法中使用的酶还可以包含至少一种不同于纤维素酶的酶。优选地，所述至少一种不同的酶具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外活性。这种辅助活性的实例在本文中被提及，包括但不限于半纤维素酶。
因此，在本发明的整合方法中使用的酶可包含裂解性多糖单加氧酶活性、内切葡聚糖酶活性和/或纤维二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本发明中使用的酶可包含每种活性种类中的多于一种的酶活性。例如，在本发明中使用的酶可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。
在本发明的整合方法中使用的酶可来源于真菌，例如如Rasamsonia的丝状真菌例如Rasamsonia emersonii。在一种实施方式中，核心的一组(降解木质纤维素的)酶活性可来源于Rasamsonia emersonii。Rasamsonia emersonii能够提供本文中证明的对木质纤维素材料的水解而言高度有效的活性组。如果需要，活性组可被来自其它来源的额外的酶活性补充。这种额外的活性可来源于经典来源和/或由经遗传改造的生物生产。
在本发明的整合方法中使用的酶活性可以是热稳定的。本文中这表示：该活性的最适温度为60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，85℃或更高。在本发明的整合方法中使用的活性一般不具有相同的最适温度，但是优选地将是热稳定的。
另外，在本发明的整合方法中使用的酶活性可以能够在低pH下起作用。为了本发明目的，低pH表示5.5或更低，5或更低，4.9或更低，4.8或更低，4.7或更低，4.6或更低，4.5或更低，4.4或更低，4.3或更低，4.2或更低，4.1或更低，4.0或更低，3.9或更低，或3.8或更低，3.7或更低，3.6或更低，或3.5或更低的pH。
在本发明的整合方法中使用的活性可以通过任何上述最适温度和pH值的组合来限定。
在本发明的整合方法中使用的酶可包含来自不同于Rasamsonia的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们可以与一种或更多种Rasamsonia酶一起使用或者它们可以在不存在额外的Rasamsonia酶的情况下使用。
例如，用于本发明的整合方法中的酶可包含源于Aspergillus的β-葡糖苷酶(BG)，如Aspergillus oryzae如在WO 02/095014中公开的或具有在WO 2008/057637中公开的β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或Aspergillus fumigatus，如在WO 2005/047499中的SEQ IDNO:2或在WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5所公开的或Aspergillus fumigatusβ-葡糖苷酶变体，如在WO 2012/044915中公开的，如具有下列替换的：F100D,S283G,N456E,F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5进行编号)或Aspergillus aculeatus,Aspergillusniger或Aspergillus kawachi。在另一种实施方式中，β-葡糖苷酶源自Penicillium，如WO2007/019442中的SEQ ID NO:2所公开的Penicillium brasilianum或来自Trichoderma，如Trichoderma reesei,，如在US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US2006/0258554、US2004/0102619中描述的那些。在一种实施方式中，甚至可使用细菌β-葡糖苷酶。在另一种实施方式中，β-葡糖苷酶是从Thielavia terrestris(WO2011/035029)或Trichophaea saccata(WO 2007/019442)衍生的。
例如，用于本发明整合方法中的酶可包含内切葡聚糖酶(EG)，其源于Trichoderma,例如Trichoderma reesei；Humicola,例如Humicola insolens的菌株；Aspergillus,例如Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachii；Erwinia,例如Erwinia carotovara；Fusarium,例如Fusarium oxysporum；Thielavia,例如Thielaviaterrestris；Humicola,例如Humicola grisea var.thermoidea或Humicola insolens；Melanocarpus,例如Melanocarpus albomyces；Neurospora,例如Neurospora crassa；Myceliophthora,例如Myceliophthora thermophila；Cladorrhinum,例如Cladorrhinumfoecundissimum和/或Chrysosporium,例如Chrysosporium lucknowense的菌株。在一种实施方式中，甚至可使用细菌内切葡聚糖酶，其包括但不限于Acidothermus cellulolyticus内切葡聚糖酶(见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655,WO 00/70031,WO 05/093050)；Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(见WO 05/093050)；以及Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(见WO 05/093050)。
例如，用于本发明整合方法的酶可包含纤维二糖水解酶I，其源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2011/057140中SEQ ID NO:6或WO 2014/130812中SEQ IDNO:6公开的Cel7A CBH I或源于Trichoderma，如Trichoderma reesei。
例如，用于本发明整合方法中的酶可包含纤维二糖水解酶II，其源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2014/130812中SEQ ID NO:7或源于Trichoderma，如Trichoderma reesei或源于Thielavia，如Thielavia terrestris，如源于Thielavia terrestris的纤维二糖水解酶II CEL6A。
例如，用于本发明整合方法中的酶可包含GH61多肽(溶解性多糖单加氧酶)，其源于Thermoascus，如Thermoascus aurantiacus，如在WO2005/074656中作为SEQ ID No:2和在WO2014/130812中SEQ ID NO:1和WO 2010/065830所述的；或源于Thielavia，如Thielavia terrestris，如在WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:4，WO 2008/148131和WO 2011/035027中所述的；或源于Aspergillus，如Aspergillus fumigatus，如在WO 2010/138754作为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:3所述的；或源于Penicillium，如Penicillium emersonii，如作为WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中的SEQ ID NO:2所述的。另一些合适的GH61多肽包括但不限于Trichoderma reesei(见WO 2007/089290)、Myceliophthorathermophila(见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、Penicillium pinophilum(见WO 2011/005867)、Thermoascus sp.(见WO 2011/039319)和Thermoascus crustaceous(见WO2011/041504)。在一个方面，根据WO 2008/151043在存在有可溶的活化二价金属阳离子的情况下使用GH61多肽，例如硫酸锰。在一个方面中，在存在有二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物或从预处理的纤维素材料如预处理的玉米秸秆获得的液体的情况下使用GH61多肽。
仅举几例，可用于本发明整合方法中的其它纤维素分解酶在WO98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO 99/031255、WO2002/101078、WO 2003/027306、WO2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO2003/052057、WO2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO2006/074005、WO2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263和US 5,686,593中描述。
此外，在本发明整合方法中有用的木聚糖酶的示例包括但不限于源于Aspergillus aculeatus(见WO 94/21785)、Aspergillus fumigatus(见WO2006/078256)、Penicillium pinophilum(见WO 2011/041405)、Penicillium sp.(见WO 2010/126772)、Thielavia terrestris NRRL 8126(见WO2009/079210)和Trichophaea saccata GH10(见WO 2011/057083)的木聚糖酶。在本发明整合方法中有用的β-木糖苷酶的示例包括但不限于源于Neurospora crassa和Trichoderma reesei的β-木糖苷酶。在本发明方法中有用的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于源于Aspergillus aculeatus(见WO2010/108918)、Chaetomium globosum,Chaetomium gracile,Humicola insolens DSM 1800(见WO 2009/073709)、Hypocrea jecorina(见WO 2005/001036)、Myceliophtera thermophila(见WO2010/014880)、Neurospora crassa,Phaeosphaeria nodorum和Thielavia terrestrisNRRL 8126(见WO2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在本发明的整合方法中有用的阿魏酸酯酶(feruloyl esterases(ferulic acid esterases))的示例包括但不限于源于Humicolainsolens DSM 1800(见WO 2009/076122)、Neosartorya fischeri,Neurospora crassa,Penicillium aurantiogriseum(见WO 2009/127729)和Thielavia terrestris(见WO2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。在本发明整合方法中有用的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于源于Aspergillus niger,Humicola insolens DSM1800(见WO2006/114094和WO2009/073383)和M.giganteus(见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。在本发明方法中有用的α-葡萄糖醛酸苷酶的示例包括但不限于源于Aspergillusclavatus,Aspergillus fumigatus,Aspergillus niger,Aspergillus terreus,Humicolainsolens(见WO 2010/014706)、Penicillium aurantiogriseum(见WO 2009/068565)和Trichoderma reesei的α-葡萄糖醛酸苷酶。
在本发明整合方法中使用的酶可包含一种、两种、三种、四种或更多种纤维素酶，例如溶解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、一种或两种外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种、三种或四种或全部。在本发明整合方法中使用的酶可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。
在本发明整合方法中使用的酶可包含由本文所述的酶提供的一类纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由额外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在本文中使用时，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，部分地例如降解成纤维糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。根据本发明的纤维素酶可产生纤维素糊精与葡萄糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
溶解性多糖单加氧酶(LPMO)最近通过CAZy被分类在AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)中。如上面所提及的，溶解性多糖单加氧酶能够打开结晶葡聚糖结构。溶解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等,Journalof Biological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，GH61(糖苷水解酶家族61或有时被称为EGIV)蛋白是(溶解性)氧依赖性多糖单加氧酶(PMO’s/LPMO’s)。PMO和LPMO在本文可互换使用。文献中通常提及这些蛋白增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。基于一个家族成员中测量的极低的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性，GH61最初被归类为内切葡聚糖酶。本文所使用的术语“GH61”将被理解为这样的酶家族，其共有将被归类到得到确认的CAZyGH分类系统的家族61(http://www.cazy.org/GH61.html)中的常见保守序列部分和折叠。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC 3.2.1家族的成员。GH61最近被CAZy重新归类在家族AA9(辅助活性家族9)。GH61在本文中被用作纤维素酶的一部分。
CBM33(家族33碳水化合物结合模块)为溶解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等，Journal of Biological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，CAZy最近已被重新分类为AA10(辅助活性家族10)中的CBM33。
在本文中使用时，半纤维素酶是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。根据本发明的半纤维素酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
在本文中使用时，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。根据本发明的果胶酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
因此，在本发明的整合方法中使用的酶可包含任何纤维素酶，例如溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
在本文中使用时，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在本文中使用时，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。这种酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。
在本文中使用时，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
在本文中使用时，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当其还原基团参与待水解的键的葡萄糖残基自身在C-3处被取代时，这种酶促水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代性名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。
在本发明的整合方法中使用的酶可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
在本文中使用时，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC 3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylan endoxylanase)，其能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键。
在本文中使用时，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解，从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
在本文中使用时，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
在本文中使用时，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。
在本文中使用时，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。这种多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。
在本文中使用时，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸基-糖+H2O＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。这种酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素酶辅助酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。
在本文中使用时，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。
在本文中使用时，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
在本文中使用时，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
在本文中使用时，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
在本文中使用时，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
在本发明的整合方法中使用的酶可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。
在本文中使用时，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
在本文中使用时，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+n H2O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。这种酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
在本文中使用时，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
在本文中使用时，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰的乙酰基酯酶活性。
在本文中使用时，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。所述酶也可被称为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
在本文中使用时，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。这种酶也可被称为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
在本文中使用时，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
在本文中使用时，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被称为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
在本文中使用时，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。这种酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
在本文中使用时，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
在本文中使用时，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式，从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
在本文中使用时，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
在本文中使用时，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
在本文中使用时，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
在本发明的整合方法中使用的酶一般包含至少两种纤维素酶和任选地至少一种半纤维素酶和任选地至少一种果胶酶。在本发明的整合方法中使用的酶可包含溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这种酶也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。
另外，在本发明的整合方法中使用的酶中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸糖苷酶、扩展蛋白(expansin)、纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)(这些也被称作上文的辅助活性)。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶归类为EC 3.4，它们适合在本发明的整合方法中使用。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。
“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其它方式分解木质素聚合物的描述的其它酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
在本发明的整合方法中使用的酶可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo et al.,Eur.J.Biohem.269,4202-4211,2002)或膨胀因子样蛋白质。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀因子含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。为了本发明的目的，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含这种结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。
在本发明的整合方法中使用的酶可以包含纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesiondomain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。为了本发明的目的，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含这种结构域中的一种或两种。
在本发明的整合方法中使用的酶还可包含过氧化氢酶。术语“过氧化氢酶”表示过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)，其催化两个过氧化氢至氧和两个水的转化。过氧化氢酶活性可通过基于下列反应监控在240nm的过氧化氢的降解而确定：2H2O2→2H2O+O2。该反应是在25℃下pH为7.0的50mM磷酸盐中以10.3mM底物(H2O2)和每ml大约为100单位的酶而进行的。在16-24秒内用分光光度法监控吸光度，这应对应于0.45至0.4的吸光度减少。一个过氧化氢酶活性单位可被表达为在pH为7.0且25℃下每分钟降解的一微摩尔的H2O2。
在本发明的整合方法中使用的酶可由上文提到的每种酶种类的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的那些蛋白质)的任何组合构成。
在本发明的整合方法中使用的酶可以由来自以下来源的酶构成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。不同的酶可获自不同的来源。
酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如(预处理的)木质纤维素材料中。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用(预处理的)木质纤维素材料(例如玉米秆或麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以作为木质纤维素材料，并且被添加进木质纤维素材料中。
在本文所述的用途和方法中，上述酶可以同时(即在单一的酶组合物)或分别或顺次提供。
在一种实施方式中，所述酶为完整发酵液的形式。完整发酵液可通过非重组和/或重组丝状真菌的发酵而制备的。在一种实施方式中，丝状真菌是包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因的重组丝状真菌。在一种实施方式中，丝状真菌是包含可以与丝状真菌同源或异源的一个或多个基因的重组丝状真菌，其中一个或多个基因对可降解纤维素底物的酶进行编码。完整发酵液可包含任意多肽或其任何组合。
优选地，酶组合物为完整发酵液，其中细胞被杀死。完整发酵液可包含有机酸(用于杀死细胞)、被杀死的细胞和/或细胞碎片和培养基。
一般地，在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养丝状真菌。培养是使用在本领域中已知的程序在包括碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行。合适的培养基、温度范围和适于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的其他条件在本领域中是已知的。完整发酵液可通过使丝状真菌生长至稳定期并在碳限制条件下将丝状真菌保持足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段而制备的。一旦丝状真菌将酶如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶分泌至发酵培养基中，则可使用完整发酵液。本发明的完整发酵液可包含丝状真菌。在一些实施方式中，完整发酵液包含源自发酵结束时发酵材料的未分级物质。通常，完整发酵液包含已经利用过的培养基和在丝状真菌生长至饱和、在碳限制性条件下进行培养以允许蛋白质合成(特别地，表达纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)后存在的细胞碎片。在一些实施方式中，完整发酵液包含已经利用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，存在于完整发酵液中的丝状真菌可使用本领域中已知的方法进行裂解、透化或杀灭以产生细胞经杀灭的完整发酵液。在一种实施方式中，完整发酵液是细胞经杀灭的完整发酵液，其中含有丝状真菌的完整发酵液进行了裂解或杀灭。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌而杀死细胞，从而生成丝状真菌的细胞经杀灭的完整发酵液。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌而杀死细胞并将细胞经杀灭的发酵混合物的pH调整为合适的pH。在一种实施方式中，完整发酵液包含第一有机酸成分，其包括至少一个1-5碳有机酸和/或其盐，以及第二有机酸成分，其包括至少6个或更多碳的有机酸和/或其盐。在一种实施方式中，第一有机酸成分为醋酸、甲酸、丙酸、其盐或其任意组合，第二有机酸成分为苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或其任意组合。
如本文使用的术语“完整发酵液”指通过未进行或进行了最少回收和/或纯化的细胞发酵而产生的制备物。例如，完整发酵液是当微生物培养物生长至饱和时并在碳限制性条件下培养以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)以及分泌至细胞培养基中而产生的。通常，完整发酵液是未分级的且包括已经使用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为非存活的细胞。
如果需要的话，完整发酵液可以是分级的且可使用经分级物质中的一个或多个。例如，可从完整发酵液去除杀死的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些成分的组合物。
完整发酵液可进一步地包括防腐剂和/或抗微生物剂。这种防腐剂和/或试剂是本领域中是已知的。
通常，如本文所述的完整发酵液为液体，但也可含有不溶性成分，如杀死的细胞、细胞碎片、培养基成分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整发酵液。
在一种实施方式中，完整发酵液可补充有一个或多个未内源性表达的或通过丝状真菌在相对低水平进行表达的酶活性以提高纤维素底物降解例如为可发酵的糖，如葡萄糖或木糖。补充酶可作为完整发酵液的补充剂而进行添加且酶可以是单独的完整发酵液的成分或可进行纯化或最低程度地进行回收和/或纯化。
在一种实施方式中，完整发酵液包括过表达一种或多种酶以提高纤维素底物的降解的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液。替代地，完整发酵液可包括非重组丝状真菌和过表达一种或多种酶以提高纤维素底物的降解的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液的混合物。在一种实施方式中，完整发酵液包括过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌的发酵的完整发酵液。替代地，用于本方法和反应性组合物中的完整发酵液可包括非重组丝状真菌的发酵的完整发酵液和过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌的发酵的完整发酵液的混合物。
酶存在于酶促水解的液化步骤和糖化步骤中。这些酶可以相同或可不同。此外，如上所述，在根据本发明的整合方法的液化步骤和糖化步骤期间添加另外的酶。所添加的酶可以是在液化步骤和糖化步骤中已经存在的酶。或者，它们可以是不同的酶。此外，在液化步骤期间添加的另外的酶与在根据本发明的整合方法的糖化步骤期间添加的另外的酶可以不同或可以相同。
本文所用的木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适用于本发明方法中的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质(virgin biomass)和/或非原始生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗、甘蔗杆(canestraw)、甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energy cane)，玉米，玉米秆(cornstover)，玉米壳，玉米芯(corn cobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheat midlings)，燕麦壳，和硬木材和软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工产生的有机废弃物材料，所述农业加工包括农业和林业活动，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。在一个优选的实施方式中，木质纤维素材料是甘蔗渣或甘蔗杆。
纤维素是具有式(C6H10O5)n的有机化合物，一种由几百到一万以上β(1→4)连接的D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。葡聚糖分子是通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖。在本文，对于通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖而言，葡聚糖和纤维素可互换地使用。用于定量分析葡聚糖或多糖组成的方法在本领域是公知的且进行了描述的，并且例如概述于Carvalho de Souza等人，Carbohydrate Polymers 95(2013)657-663中。通常，葡聚糖的50％到70％是结晶纤维素，剩余部分是无定形纤维素。
在一种实施方式中，在酶促水解之前和/或期间对木质纤维素材料进行预处理。预处理方法是本领域中已知的，其包括但不限于热、机械、化学修饰、生物修饰及其任意组合。通常，进行预处理以提高木质纤维素材料中木质纤维素材料对酶促水解的可接近性和/或水解半纤维素和/或使半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理木质纤维素材料。预处理方法的示例包括但不限于，蒸汽处理(例如，在100-260℃、7-45巴的压力和中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下在120-200℃、2-15巴的压力和酸性pH下用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如，在存在有机溶剂和蒸汽的情况下在160-200℃、7-30巴的压力和酸性pH下用1-1.5％的H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如，在存在水/蒸汽的情况下在60-160℃、1-10巴的压力和碱性pH下用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(例如，在150-180℃、9-17巴的压力和碱性pH下用5-15％的NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如，在60-140℃、8-20巴的压力和碱性pH下用>15％的NH3处理5-30分钟)。
木质纤维素材料可进行洗涤。在一种实施方式中，可在预处理之前和/或之后洗涤木质纤维素材料。洗涤步骤可以在固/液分离木质纤维素材料和/或预处理的木质纤维素材料之前和/或之后进行。如果在固/液分离之后进行，则可以洗涤固/液分离后得到的固体级分。洗涤步骤可被用于去除可充当发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。可按技术人员已知的方式进行洗涤步骤。除洗涤之外，存在有其他解毒方法。预处理的木质纤维素材料也可通过包括但不限于固/液分离、真空蒸发、提取、吸附、中和、加灰过量、添加还原剂、添加解毒酶如漆酶或过氧化物酶、添加能够对水解物进行解毒的微生物的这些方法中的任一个(或任何组合)而进行解毒。
本发明整合方法中使用的酶可极其有效水解木质纤维素材料，例如玉米秆、麦秸、甘蔗杆和/或甘蔗渣，然后其可被进一步转化为产物，例如乙醇、生物气、丁醇、塑料、有机酸例如琥珀酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。此外，来自水解之后过程的中间产物(例如作为生物气生产中的中间体的乳酸)可被用作其它材料的结构单元。本发明利用乙醇和琥珀酸生产进行示例，但这仅作为例证而非限制，其它被提及的产物可被同样地良好生产。
在一种实施方式中，添加的酶的量(本文中也称为酶剂量或酶负载量)低。在一种实施方式中，酶的量是10mg蛋白/g干物质重量或更低，9mg蛋白/g干物质重量或更低，8mg蛋白/g干物质重量或更低，7mg蛋白/g干物质重量或更低，6mg蛋白/g干物质重量或更低，5mg蛋白/g干物质或更低，4mg蛋白/g干物质或更低，3mg蛋白/g干物质或更低，2mg蛋白/g干物质或更低或1mg蛋白/g干物质或更低(表示为mg蛋白/g干物质形式的蛋白)。在一种实施方式中，酶的量是5mg蛋白/g干物质重量或更低，4mg蛋白/g干物质重量或更低，3mg蛋白/g干物质重量或更低，2mg蛋白/g干物质重量或更低，1mg蛋白/g干物质重量或更低，0.5mg酶/g干物质重量或更低，0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低，0.3mg酶/g干物质重量或更低，0.25mg酶/g干物质重量或更低，0.20mg酶/g干物质重量或更低，0.18mg酶/g干物质重量或更低，0.15mg酶/g干物质重量或更低或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为mg酶/g干物质形式的总纤维素酶)。由于酶的活性和稳定性，低酶剂量是可行的。当酶促水解包括分开的液化步骤和糖化步骤时，可以在仅在一个步骤之前和/或期间或在两个步骤之前和/或期间加入酶。
酶促水解期间的pH可由技术人员选择。在一种实施方式中，水解期间的pH可以是3.0-6.4。本发明的稳定酶可具有高至2个pH单位，高至3个pH单位，高至5个pH单位的宽pH范围。最适pH可位于pH 2.0至8.0，2.5至7.5，3.0至7.0，3.5至6.5，4.0至5.0，4.0至4.5的界限内或约4.2。酶促水解的液化步骤和酶促水解的糖化步骤中使用的pH可以不同或可以相同。如果液化步骤和糖化步骤期间使用不同的酶，则所述酶的最佳pH可以不同或可以相同。
在一种实施方式中，进行水解步骤直到木质纤维素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被释放出。
显著地，本发明的方法可在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质进行。在一种实施方式中，在酶促水解结束时的干物质含量为5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或39wt％或更高。在一种实施方式中，在酶促水解结束时的干物质含量为5wt％至40wt％、6wt％至40wt％、7wt％至40wt％、8wt％至40wt％、9wt％至40wt％、10wt％至40wt％、11wt％至40wt％、12wt％至40wt％、13wt％至40wt％、14wt％至40wt％、15wt％至40wt％、16wt％至40wt％、17wt％至40wt％、18wt％至40wt％、19wt％至40wt％、20wt％至40wt％、21wt％至40wt％、22wt％至40wt％、23wt％至40wt％、24wt％至40wt％、25wt％至40wt％、26wt％至40wt％、27wt％至40wt％、28wt％至40wt％、29wt％至40wt％、30wt％至40wt％、31wt％至40wt％、32wt％至40wt％、33wt％至40wt％、34wt％至40wt％、35wt％至40wt％、36wt％至40wt％、37wt％至40wt％、38wt％至40wt％、39wt％至40wt％。
在一种实施方式中，在酶促水解的液化步骤结束时的干物质含量为5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或39wt％或更高。在一种实施方式中，在酶促水解的液化步骤结束时的干物质含量为5wt％至40wt％、6wt％至40wt％、7wt％至40wt％、8wt％至40wt％、9wt％至40wt％、10wt％至40wt％、11wt％至40wt％、12wt％至40wt％、13wt％至40wt％、14wt％至40wt％、15wt％至40wt％、16wt％至40wt％、17wt％至40wt％、18wt％至40wt％、19wt％至40wt％、20wt％至40wt％、21wt％至40wt％、22wt％至40wt％、23wt％至40wt％、24wt％至40wt％、25wt％至40wt％、26wt％至40wt％、27wt％至40wt％、28wt％至40wt％、29wt％至40wt％、30wt％至40wt％、31wt％至40wt％、32wt％至40wt％、33wt％至40wt％、34wt％至40wt％、35wt％至40wt％、36wt％至40wt％、37wt％至40wt％、38wt％至40wt％、39wt％至40wt％。
在一种实施方式中，在酶促水解的糖化步骤结束时的干物质含量为5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或39wt％或更高。在一种实施方式中，在酶促水解的糖化步骤结束时的干物质含量为5wt％至40wt％、6wt％至40wt％、7wt％至40wt％、8wt％至40wt％、9wt％至40wt％、10wt％至40wt％、11wt％至40wt％、12wt％至40wt％、13wt％至40wt％、14wt％至40wt％、15wt％至40wt％、16wt％至40wt％、17wt％至40wt％、18wt％至40wt％、19wt％至40wt％、20wt％至40wt％、21wt％至40wt％、22wt％至40wt％、23wt％至40wt％、24wt％至40wt％、25wt％至40wt％、26wt％至40wt％、27wt％至40wt％、28wt％至40wt％、29wt％至40wt％、30wt％至40wt％、31wt％至40wt％、32wt％至40wt％、33wt％至40wt％、34wt％至40wt％、35wt％至40wt％、36wt％至40wt％、37wt％至40wt％、38wt％至40wt％、39wt％至40wt％。
在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行根据本发明的整合方法中的发酵步骤。在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行通过产醇的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产醇。在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行通过产有机酸的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产有机酸。可以在进行酶促水解的相同容器中进行通过产醇的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产醇。或者，通过产醇的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产醇和通过产有机酸的微生物发酵至少固体级分和/或至少液体级分以生产有机酸可以在一个或多个单独的容器中进行，但也可以在一个或多个相同的容器中进行。
在一种实施方式中，产醇的微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。在一种实施方式中，产有机酸的微生物能够发酵至少C6糖。在一种实施方式中，产醇的微生物和产有机酸的微生物是不同的微生物。在另一种实施方式中，产醇的微生物和产有机酸的微生物是相同微生物，即产醇的微生物也能够生产有机酸例如琥珀酸。在一种实施方式中，产醇的微生物和/或产有机酸的微生物是酵母。
在另一个方面中，本发明因而包括这样的发酵方法，其中微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。为了从这种碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或其可通过经修饰的宿主细胞对其进行生产。在后者的情况下，经修饰宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌这种碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的另外优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的碳水化合物酶的量。这继而会防止对非葡萄糖的糖(例如木糖)代谢和运送所需体系的抑制。在一个优选的方法中，经修饰宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长(diauxic growth)。除了L-阿拉伯糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基将进一步包含经修饰宿主细胞生长所需的适宜成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成在本领域众所周知。
发酵时间可比在相同条件下的常规发酵中更短，其中部分酶促水解仍需在发酵期间进行。在一种实施方式中，就50g/l葡萄糖和来自木质纤维素材料的相应其它糖(例如50g/l木糖，35g/l的L-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖组合物而言，发酵时间是100小时或更短，90小时或更短，80小或更短，70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，可相应减少发酵时间。在一种实施方式中，乙醇生产步骤的发酵时间对于由C6糖制造乙醇而言为10-50小时，对于由C5糖制造乙醇而言为20-100小时。在一种实施方式中，琥珀酸生产步骤的发酵时间为20-70小时。
发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，所述发酵方法在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，从此再产生NAD+。因而，在一个优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方式中，发酵方法是厌氧的。厌氧方法是有利的，因为其比需氧方法更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧方法给出比需氧方法更高的产品产出。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。
在另一实施方式中，发酵方法在限氧条件下。更优选地，发酵方法是需氧的并在限氧条件下。限氧发酵方法是这样的方法，其中氧消耗被氧从气体至液体的转移所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5，更优选地至少6和甚至更优选地至少7mmol/L/h。
在一种实施方式中，醇发酵方法是厌氧的，而有机酸发酵方法是需氧的，但在限氧条件下进行。
发酵方法优选地在对经修饰细胞而言最佳的温度下运行。因而，对于大多数酵母或真菌细胞而言，发酵方法在低于42℃，优选地38℃或更低的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度下并在高于20℃、22℃或25℃的温度下进行。在一种实施方式中，醇发酵步骤和有机酸发酵步骤在25℃至35℃之间进行。
在本发明的一种实施方式中，利用发酵微生物进行发酵。在本发明的一种实施方式中，利用发酵C5的微生物进行C5糖的醇(例如乙醇)发酵。在本发明的一种实施方式中，利用发酵C5的微生物或商业的发酵C6的微生物进行C6糖的醇(例如乙醇)发酵。适用于乙醇生产的市售酵母包括但不限于BIOFERMTM AFT和XR(NABC—North American BioproductsCorporation,GA,USA)、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSM Specialties)、GERT STRANDTM(Gert StrandAB,瑞典)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行发酵。在一种实施方式中，在一个或多个发酵容器中进行发酵。在一种实施方式中，在一个或多个增殖容器中进行通过至少发酵液体级分和/或至少固体级分而使产醇的微生物和/或产有机酸的微生物增殖。增殖后，可以将产醇的微生物和/或产有机酸的微生物加入一个或多个发酵容器中。或者，将产醇的微生物和/或产有机酸的微生物的增殖与通过产醇的微生物和/或产有机酸的微生物发酵至少液体级分和/或至少固体级分以产生醇和/或有机酸分别组合。
在一种实施方式中，产醇的微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，其还能够发酵至少一种C6糖。在一种实施方式中，本发明涉及包括生产乙醇的整合方法，其中所述方法包括用能够发酵至少一种C5糖的微生物发酵含糖培养基的步骤。
在一种实施方式中，产有机酸的微生物是能够发酵至少一种C6糖的微生物。在一种实施方式中，本发明涉及用于生产琥珀酸的整合方法，其中所述方法包括用能够发酵至少一种C6糖的微生物发酵含糖培养基的步骤。
产醇的微生物可以是原核或真核生物。用于所述方法中的微生物可以是经遗传修饰的微生物。合适的产醇生物的实例为酵母，例如Saccharomyces例如Saccharomycescerevisiae,Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces uvarum,Hansenula,Issatchenkia,例如Issatchenkia orientalis,Pichia,例如Pichia stipites或Pichiapastoris,Kluyveromyces,例如Kluyveromyces fagilis,Candida,例如Candidapseudotropicalis或Candida acidothermophilum,Pachysolen,例如Pachysolentannophilus或细菌,例如Lactobacillus,例如Lactobacillus lactis,Geobacillus,Zymomonas,例如Zymomonas mobilis,Clostridium,例如Clostridium phytofermentans,Escherichia,例如E.coli,Klebsiella,例如Klebsiella oxytoca。在一种实施方式中，能发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一种实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选地是Saccharomyces cerevisiae种。根据本发明的方法中使用的酵母(例如Saccharomycescerevisiae)能够转化己(C6)糖和戊(C5)糖。根据本发明的方法中使用的酵母(例如Saccharomyces cerevisiae)能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除了厌氧发酵葡萄糖之外，酵母能够利用L-阿拉伯糖和木糖。在一种实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化为期望的发酵产物，例如转化为乙醇。可通过引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮乙醛酸(L-ribuloglyoxalate))和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来修饰宿主酵母从而产生能够从L-阿拉伯糖生产乙醇的生物体(例如Saccharomyces cerevisiae菌株)。可向宿主细胞中引入所述基因以使它能够利用阿拉伯糖。WO2003/095627中描述给出了这种方式。可以使用来自Lactobacillus plantarum的araA、araB和araD基因，其被公开于WO2008/041840中。可以使用来自Bacillus subtilis的araA基因和来自Escherichia coli的araB和araD基因，其被公开于EP1499708中。在另一种实施方式中，如WO2009011591中所公开，araA、araB和araD基因可来源于Clavibacter、Arthrobacter和/或Gramella属中的至少一种，特别地Clavibacter michiganensis、Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii中的至少一种。在一种实施方式中，酵母还可包含木糖异构酶基因的一个或多个拷贝和/或木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶的一个或多个拷贝。
酵母可包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的实例是引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，缺失醛糖还原酶(GRE3)基因，过表达PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许细胞中通过戊糖磷酸途径的流量(flux)增加。基因工程酵母的实例被描述于EP1468093和/或WO2006009434中。
合适的商业酵母的实例是RN1016，RN1016是来自荷兰DSM的发酵木糖和葡萄糖的Saccharomyces cerevisiae菌株。
在一种实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法在限氧条件下，更优选地所述方法是需氧的并在限氧条件下。限氧条件已在本文上文定义过。
乙醇体积生产率优选地为至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。方法中基于L-阿拉伯糖和任选的木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比，对于葡萄糖、L-阿拉伯糖和任选的木糖，理论最大产率为0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。
在一个方面中，与已知乙醇发酵方法相比，导致乙醇生产的发酵方法具有若干优势：厌氧方法是可行的；限氧条件是可行的；能够获得更高的乙醇产率和乙醇生产速率；使用的菌株可以能够使用L-阿拉伯糖和任选地木糖。
替代上述发酵方法，可使用至少两种不同的细胞，这表示该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有优选实施方式也是该共发酵方法的优选实施方式：发酵产物类别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、方法进行的温度、乙醇生产力、乙醇产率)。
产有机酸的微生物可以是原核生物或真核生物。所述方法中使用的微生物可以是遗传工程微生物。合适的产有机酸的生物的实例是酵母，例如Saccharomyces，例如Saccharomyces cerevisiae；真菌例如Aspergillus菌株，例如Aspergillus niger和Aspergillus fumigatus，Byssochlamys nivea，Lentinus degener，Paecilomycesvarioti和Penicillium viniferum；和细菌，例如Anaerobiospirillumsucciniciproducens，Actinobacillus succinogenes，Mannhei succiniciproducersMBEL 55E，Escherichia coli，Propionibacterium物种，Pectinatus sp.，Bacteroidessp.，例如Bacteroides amylophilus，Ruminococcus flavefaciens，Prevotellaruminicola，Succcinimonas amylolytica，Succinivibrio dextrinisolvens，Wolinellasuccinogenes和Cytophaga succinicans。在一种实施方式中，能够发酵至少一种C6糖的产有机酸的微生物是酵母。在一种实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选为Saccharomyces cerevisiae种。根据本发明的有机酸生产方法中使用的酵母(例如Saccharomyces cerevisiae)能够转化己(C6)糖。根据本发明的方法中使用的酵母(例如Saccharomyces cerevisiae)酵母能够厌氧发酵至少一种C6糖。
可进行发酵方法而完全无需在发酵期间调节pH。也就是说，所述方法是可以在不添加任何酸或碱的情况下进行的方法。然而，这排除了可添加酸的预处理步骤。要点是本发明方法中使用的酶能在低pH下起作用，因而不需要为了水解可发生而调整酸预处理原料的酸的pH。因此，本发明的方法可以是仅使用有机产物不需要无机化学输入的零废物方法。
可减少总反应时间(或水解步骤和发酵步骤合起来的反应时间)。在一种实施方式中，90％葡萄糖产率下的总反应时间为300小时或更少，200小时或更少，150小时或更少，140小时或更少，130小时或更少，120小时或更少，110小时或更少，100小时或更少，90小时或更少，80小时或更少，75小时或更少，或约72小时。相应地，在较低的葡萄糖产率下可达到较少总反应时间。
可通过本发明的整合方法产生的其它发酵产物可以是源自发酵的任何物质。其包括但不限于醇(如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮(如丙酮)；氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃(如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃(如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；和气体(如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特殊化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。在一个优选的实施方式中，有机酸是琥珀酸且/或醇是乙醇。
在一种实施方式中，回收醇、有机酸、酶、产酶的微生物、产醇的微生物和/或产有机酸的微生物。根据本发明的整合方法包括回收在整合方法期间产生的各种产物，包括发酵产物例如乙醇和琥珀酸。可以以本领域技术人员已知的方式从发酵液中分离发酵产物。回收技术的实例包括但不限于色谱法、电泳法、差别性溶解度、蒸馏或提取。对于每种发酵产物，技术人员能选择合适的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。
在一种实施方式中，本发明的整合方法还产生能量、热、电和/或蒸汽。
在一种实施方式中，固/液分离酶促水解的木质纤维素材料之后获得的固体级分、纯化/回收有机酸之后获得的废物，和/或蒸馏/回收乙醇之后获得的固体可被用于生产电。可以通过焚烧任何一种上述材料来生产电。电可用于根据本发明的整合方法的任一个步骤中。
针对若干木质纤维素材料发现了本发明的有益效果，因此认为各种木质纤维素材料的水解都存在这种有益效果。针对若干酶发现了本发明的有益效果，因此认为各种水解酶组合物都存在这种有益效果。
实施例
实施例1
由木质纤维素材料生产醇和有机酸的整合方法
通过离心将单批预处理的木质纤维素材料分离成固体级分和液体级分。洗涤固/液分离预处理的木质纤维素材料之后获得的固体级分以获得富含纤维素的浆体。
使部分浆体经受酶促水解。在这种情况下，通过以下方式在400升搅拌容器中水解64kg干物质浆体：将其加入254升含有来自Rasamsonia的纤维素分解酶的水性组合物中(在62℃温度下)。第一剂的浆体产生pH 4.2的10％w/w的干物质，其在3小时内通过酶被液化。从那时起，每小时加入5kg干物质浆体的份直至获得350kg糊状物，同时用10％的氨溶液将pH调节至4.2。在62℃下在搅拌条件下继续水解另外4天，得到了富含葡萄糖的水解物。
将水解物离心以获得固体级分和液体级分。用水洗涤固体级分。将洗涤水加入液体级分中，并通过蒸发浓缩合并的液体级分直至获得含有浓度为约450g/kg的葡萄糖的最终浓缩液体级分。
将一部分浓缩液体级分用于经遗传修饰的过量生产琥珀酸的Saccharomycescerevisae属酵母的增殖。用于酵母增殖的培养基基于Verduyn葡萄糖培养基，其含有硫酸铵、磷酸钾、磷酸镁、微量元素和维生素以及8g/kg的浓缩液体级分作为碳源(关于Verduyn培养基，请参见Yeast8,(1992),第201-517页)。在搅拌的容器中，在30℃下，在连续搅拌条件下增殖68小时。
加入如此获得的种子培养物以接种包含Verduyn培养基和限定浓度的其它组分(例如尿素、生物素和碳酸钙)的发酵罐。通过以下方式加入浓缩液体级分作为碳源：在发酵持续期间以16mL/kg·h的速率进料。48小时后，停止发酵，将培养液离心。使上清液经受反复蒸发、结晶、研磨和干燥，得到了粗制琥珀酸晶体。
将另一部分浓缩液体级分用于产酶的微生物的增殖和通过产酶的微生物生产酶。用真菌Rasamsonia emersonii接种含有矿物质培养基以及20g/kg浓缩物和40g/kg固体干物质浆体的发酵罐。在发酵方法的第一阶段(也称为生长阶段或增殖阶段)期间，真菌生物量增加而不产生蛋白质。在发酵方法的第二阶段(也称为酶生产阶段)期间，生产酶。发酵在37℃、pH 6、无菌、需氧条件下进行120小时，同时加入浓缩液体级分作为进料。发酵结束时获得的最终蛋白质浓度为65g/kg上清液。所得上清液显示出纤维素分解活性。
将固/液分离预处理的木质纤维素材料之后获得的液体级分的一部分与一部分浓缩液体级分混合以获得可发酵的混合物。利用发酵戊糖的Saccharomyces cerevisae菌株RN1016发酵这种混合物，在pH 5.5下发酵48小时后产生了5.1％w/w的乙醇。
在单独的实验中，在pH 4.2的34小时发酵中，利用Saccharomyces cerevisae菌株RN1016发酵富含葡萄糖的水解物。基于糖的乙醇产率为90％。
实施例2
由木质纤维素材料生产醇的整合方法
通过离心将单批预处理的木质纤维素材料分离成固体级分和液体级分。将液体级分储存在4℃直至用于生产乙醇(见下文)。洗涤固/液分离预处理的木质纤维素材料之后获得的固体级分以获得富含纤维素的浆体。
使部分浆体经受酶促水解。在这种情况下，通过以下方式在400升搅拌容器中水解64kg干物质浆体：将其加入254升含有来自Rasamsonia的纤维素分解酶的水性组合物中(在62℃温度下)。第一剂的浆体产生pH 4.2的10％w/w的干物质，其在3小时内通过酶被液化。从那时起，每小时加入5kg干物质浆体的份直至获得350kg糊状物，同时用10％的氨溶液将pH调节至4.2。在62℃下在搅拌条件下继续水解另外4天，得到了富含葡萄糖的水解物。
将富含葡萄糖的水解物离心以获得固体级分和液体级分。用水洗涤固体级分。将洗涤水加入液体级分中，并通过蒸发浓缩合并的液体级分直至获得含有浓度为约450g/kg的葡萄糖的最终浓缩液体级分。
将预处理木质纤维素材料之后获得的液体级分分成四等份。将第一份保持原样(未稀释的份)并原样发酵。将第二份用水稀释至其原始浓度的70％w/w并发酵。将第三份用13％w/w浓缩液体级分和17％w/w水稀释至70％w/w并发酵。将第四份用20％w/w浓缩液体级分和10％w/w水稀释至70％w/w并发酵。
利用发酵戊糖的Saccharomyces cerevisae菌株RN1016在pH 5.5下发酵这些份48小时以生产乙醇，并使用HPLC测量乙醇浓度。测量的乙醇浓度被表示为发酵结束时发酵材料的％w/w。结果示于表1。
表1显示：稀释预处理木质纤维素材料之后获得的液体级分导致更高的乙醇产率。表1还显示：相较于当仅用水稀释预处理木质纤维素材料之后获得的液体级分时，当用固/液分离水解物之后获得的浓缩液体级分稀释预处理木质纤维素材料之后获得的液体级分时，获得了甚至更高的乙醇生产产率。
实施例3
由木质纤维素材料生产醇的整合方法
该实施例基本上如实施例2所述进行，前提条件是：稀释不是用浓缩液体级分进行的，而是用固/液分离水解物之后获得的固体级分进行的。固体级分含有残余的可溶性糖(固体级分中总固体的约17％w/w)，其被包埋在固体级分中存在的剩余不溶性糖级分和木质素中。
用固体级分将液体级分稀释至70％w/w。用固体级分稀释导致更高的乙醇浓度(约4％w/w乙醇)。
实施例4
通过产酶微生物生产酶的整合方法
通过离心将单批预处理的木质纤维素材料分离成固体级分和液体级分。洗涤固/液分离预处理的木质纤维素材料之后获得的固体级分以获得富含纤维素的固体。
将一部分固体用作底物(称为底物A)以诱导酶产生。使另一部分固体经受如实施例1所述的酶促水解。将酶促水解之后获得的水解物离心以获得固体级分和液体级分。将固体级分(称为底物B)用水洗涤并用于诱导酶产生。
将洗涤水加入液体级分中，并通过蒸发浓缩所得的液体级分直至获得含有浓度为约450g/kg的葡萄糖的最终浓缩液体级分。
在真菌Rasamsonia中的两个酶生产方法中，使用浓缩液体级分作为碳源。在一个方法中，使用底物A作为酶生产诱导物，而在另一方法中，使用底物B作为酶生产诱导物。生产方法由生长阶段和酶生产阶段组成。在酶生产阶段结束时，使用标准蛋白质测定试验测定发酵液的液体级分中存在的酶的量，其显示为可比较的水平(50+/-5g/L)，这证明：固/液分离预处理的木质纤维素材料本身之后获得的固体级分和固/液分离酶促水解物之后获得的固体级分二者均可被用作酶生产中的诱导物。
表1：发酵经稀释的份和未稀释的份48小时之后的乙醇生产。

Claims (17)

1.一种由木质纤维素材料生产醇和生产有机酸的整合方法，其中所述方法包括：
-酶促水解所述木质纤维素材料以获得酶促水解的木质纤维素材料，
-固/液分离所述酶促水解的木质纤维素材料以获得至少固体级分和至少液体级分，
-通过产醇的微生物发酵所述固体级分和/或所述液体级分以生产醇，
-通过产有机酸的微生物发酵所述液体级分和/或所述固体级分以生产有机酸，
-通过发酵所述液体级分和/或所述固体级分使所述产醇的微生物增殖，
-通过发酵所述液体级分和/或所述固体级分使所述产有机酸的微生物增殖，
-使产酶的微生物的增殖，和
-通过所述产酶的微生物生产酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将部分所述酶促水解的木质纤维素材料和部分所述木质纤维素材料用于所述产酶的微生物的增殖和/或通过所述产酶的微生物生产酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中将所述产酶的微生物所生产的酶用于所述酶促水解。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述至少固体级分包含3-97重量％的C5糖。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述至少液体级分包含1-97重量％的C6糖。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述酶促水解至少包括：
-液化步骤，其中在至少第一容器中水解所述木质纤维素材料，和
-糖化步骤，其中在所述至少第一容器中和/或在至少第二容器中水解液化的木质纤维素材料。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中回收所述醇、有机酸、酶、产酶的微生物、产醇的微生物和/或产有机酸的微生物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述木质纤维素材料在所述酶促水解之前经受至少一次固/液分离。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在所述酶促水解期间添加氧。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述产酶的微生物是真菌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述真菌是Rasamsonia。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述酶为完整发酵液的形式。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述产醇的微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述产有机酸的微生物能够发酵至少C6糖。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述产醇的微生物和/或产有机酸的微生物是酵母。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述酶促水解结束时的干物质含量为5wt％或更高。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述有机酸是琥珀酸和/或所述醇是乙醇。
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