CN101821398A - 用于从经预处理的木质纤维素原料生产发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于从一种获自含半纤维素的原料的糖水解产物得到一种发酵产物的方法，该方法通过(i)从所述糖水解产物中除去悬浮的纤维固体物，以得到一种澄清的糖溶液；(ii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液中的木糖进行发酵，以产生一种含所述发酵产物的发酵液；(iii)从所述发酵液分离所述酵母，以产生一种酵母浆液；(iv)以一种氧化剂处理由此得到的酵母浆液以杀死微生物污染物，从而产生一种经氧化剂处理的酵母浆液；(v)将至少一部分所述经氧化剂处理的酵母浆液加回步骤(ii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；以及(vi)回收所述发酵产物。

Description

用于从经预处理的木质纤维素原料生产发酵产物的方法
相关专利申请
本申请要求以2007年8月27日提交的流水号为60/968,132的题为“Method for the production of a Fermentation Product from aPretreated Lignocellulosic Feedstock”的临时申请为优先权基础，该临时申请的全部内容均通过引用的方式纳入本文。
技术领域
本发明涉及一种生产发酵产物的方法。更具体地，本发明涉及一种从糖水解产物生产发酵产物的方法，其中所述糖水解产物获自含半纤维素的木质纤维素原料。
背景技术
燃料乙醇目前是用诸如玉米淀粉、甘蔗以及甜菜等的原料生产的。然而，由于大部分适合生产这些作物的农田已用作人和动物食物的来源，由这些原料生产乙醇的可行性受到限制。使用这些原料的另一个缺点是化石燃料被用在所述转化过程中。因此，这些过程对于减少温室气体的作用非常有限。
由含木质纤维素的原料(如农业废料和林业废料)生产乙醇近年来已受到诸多关注，其中的原因是这些原料很廉价且可大量获得。另外，农业废料和林业废料一般被燃烧或填埋，因此使用这些木质纤维素原料生产乙醇提供了另一处置木质纤维素废料的更好方式。而且，这些原料的另一个优点是，在纤维素转化过程后剩下的被称为木质素的副产品可用作燃料，替代化石燃料为该过程提供动力。多项研究已得出这样结论，即当考虑整个生产和消费的循环时，使用由纤维素生产的乙醇产生的温室气体近乎为零。
木质纤维素材料还被考虑用于生产除乙醇之外的其他发酵产物。这样的产物的实例有乳酸、山梨糖醇、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、丙二醇、丁二醇、木糖醇、丙酮和丁醇。
木质纤维素材料还被考虑用于生产除乙醇之外的其他发酵产物。这样的产物的实例有乳酸、山梨糖醇、乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、丙二醇、丁二醇、木糖醇、丙酮和丁醇。
将木质纤维素原料转化成乙醇或其他发酵产物的第一个化学过程步骤涉及使纤维性的木质纤维素材料断裂以从所述原料中释放出糖单体如葡萄糖和木糖，用以在随后的发酵步骤中转化成乙醇。所述降解纤维性材料的两个主要过程为酸水解或碱水解和酶法水解，所述酸水解或碱水解涉及使用单步骤的化学处理对所述原料的水解，所述酶法水解涉及酸或碱预处理及随后用纤维素酶进行水解。
在酸水解或碱水解过程中，在足以使木质纤维素原料的纤维素和半纤维素成分水解成为其单体组分的条件下，使所述木质纤维素原料与强酸或强碱相接触。
在所述酶法水解过程中，首先在与酸水解或碱水解过程类似但更温和的条件下对所述木质纤维素原料进行预处理。所述预处理的目的是增加纤维素表面积并将所述纤维性原料转化成泥质结构(muddytexture)，并且有少量的纤维素转化为葡萄糖。如果用酸进行预处理，那么所述原料的半纤维素成分被水解成木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖，而碱预处理不会水解糖多聚体，而是通过与存在于半纤维素上酸性基团反应来扩大底物的表面。在预处理之后，在随后使用纤维素酶的步骤中将纤维素水解成葡萄糖。
纤维素酶是一个上位术语，表示包括外切纤维二糖水解酶(exocellobiohydrolase，CBH)、内切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和β-木糖苷酶的多酶混合物。酶CBH和EG催化纤维素(β-1，4-D-葡聚糖键)的水解。CBHI和CBH II这两种CBH酶可作用于纤维素微纤维中葡萄糖聚合物的末端，并释放出纤维二糖，而酶EG作用于纤维素上的随机位置。总之，纤维素酶将纤维素水解成纤维二糖，接下来纤维二糖被β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。木聚糖酶例如木聚糖酶1(Xyn1)、木聚糖酶2(Xyn2)和β-木糖苷酶通常存在于纤维素酶混合物中，并且可水解存在于原料中的任何木聚糖。在显著量的木聚糖存在于经预处理的原料中的情况下，这些酶的存在是有利的。
该过程的下一步骤涉及使糖流体发酵，以产生乙醇或其他发酵产物。如果存在的主要底物是葡萄糖，那么发酵一般以一种酿酒酵母属种(Saccharomyces spp.)的酵母进行，该酿酒酵母属种的酵母将存在的葡萄糖和其他己糖转化成乙醇。另外，获自酸预处理的戊糖——木糖——可被发酵成乙醇，但野生型酿酒酵母株在天然情况下不含将木糖转化成乙醇所需的基因，因此必须将其导入这种酵母中以使该转化进行。能够将木糖转化成乙醇的重组酵母记载于例如美国专利5,789,210、美国专利6,475,768和欧洲专利EP 1 727 890 B1。
糖发酵成乙醇中特别是木糖发酵成乙醇中的一个问题是，该过程的效率受限于该反应的较慢的动力学。为了提高木糖转化成乙醇的容积比，已知可以提高发酵罐中的酵母浓度。这可以通过以下方式进行：通过例如离心从收获的发酵液中连续地分离酵母，然后将这些酵母再次循环回发酵罐中。分离酵母后所得液体中的乙醇是通过蒸馏或其他已知技术回收。通过以此种方式将酵母返回反应器，发酵罐中酵母的浓度连续地增大，这进而在相当程度上增加发酵的容积生产率。
然而，将酵母重复再循环的一个问题是微生物例如细菌也随酵母而循环。这会导致微生物污染物的水平增加，并且会导致不需要的发酵产物例如乳酸的产生。产生乳酸的微生物污染物的存在不但会导致产物纯度的降低，而且会降低所需发酵产物的产率。
用于净化含酵母溶液的一种已知方法涉及以酸溶液——通常为磷酸或硫酸——洗涤酵母，以将pH降低至约2.5以下。该处理的目标是破坏不能承受低pH条件的污染性微生物，而基本不降低酵母的生存力或发酵能力。然而，在这样的严格酸性条件下洗涤酵母会使它们受到很大应激，这会降低生存力及发酵能力并因此降低所产生的乙醇的产率。再者，酸洗涤对于破坏酸耐受细菌例如产生乳酸的细菌是无效的。
Chang等人(Appl.Environ.Microbiol.63：1-6，1997)公开了在从麦精生产乙醇的发酵过程中使用亚硫酸盐和过氧化氢控制细菌污染。对从发酵罐取出并通过过滤收集的酵母细胞进行亚硫酸盐处理。然而，正常出现在工业酵母发酵中的细菌污染物(两种乳杆菌(Lactobacillus)株)仅在存在氧的情况下对亚硫酸盐敏感。将氧通入浓缩的酵母浆液对后续的厌氧发酵过程是不利的。因此需要将这些酵母细胞再次调节成厌氧状态，以增加乙醇发酵过程的效率。所显示的其他结果证明，过氧化氢可有效降低所测试的乳杆菌种中的一种的生存力。
美国公开文本2003/0190742和2002/0117445(Whiteman)公开了通过以下方式在进行不同发酵批次生长的间隙对发酵罐进行灭菌：以水或二氧化氯处理，随后暴露于UV光或加入pH 2的酸性溶液。然而，它们没有公开对含酵母溶液进行处理以控制微生物污染物的增殖。
英国专利366,525(Wadsworth和Wickenden)公开了为了随后进行运输，对获自甘蔗的粗糖熔化物和糖浆进行灭菌。这种灭菌涉及将糖经氯气的稀溶液或液氯本身处理，它们会破坏残留的转化酶、酵母和细菌，并使所存在的杂质更容易被处理以随后被除去。然而，进行这种处理会同时破坏酵母和细菌，因此不是一种控制酵母培养物中细菌污染的有效方法。
美国专利7,078,201(Burmaster)公开了一种在玉米醪(corn mash)发酵成乙醇过程中监视及控制氧化-还原势的方法。通过升高氧化-还原势可减少甘油形成，这进而会提高乙醇产率。可用于该目的的氧化剂包括臭氧、二卤化物(氯、溴和碘)、二氧化氯、高锰酸钾和喷射的空气或氧气。然而，该公开物的目标是通过降低甘油产生使乙醇产率最大化，没有解决对不需要微生物的增殖进行控制的这一需求。
美国公开文本2006/0251762(Jansen等人)公开称，在从小麦生产乙醇的过程中使用次氯酸钠或二氧化氯来控制微生物增殖是已知的。然而，使用这些氧化性化学药品是不利的，因为这样会影响“至关重要的小麦麸质的功能性粘弹性”，并因此降低其品质。而且，Jansen等人教导了从小麦——一种含淀粉的原料——生产乙醇。在淀粉转化过程中，不进行酵母循环，这是因为获自这些过程的发酵溶液含有固体，并且葡萄糖转化成乙醇通常不受限于较慢的动力学。
Johnson和Kunz(The New Brewer，1998，Coming Clean-A NewMethod of Washing Yeast Using Chlorine Dioxide Vol.15#5-P56)公开了在酿造啤酒过程中将二氧化氯添加至酵母浆液中。然而，没有公开从含有半纤维素的木质纤维素原料产生发酵产物，也没有提及在将木糖转化成乙醇或其他发酵产物时遇到的具体问题。
PCT公开文本WO 2007/149450公开了一种用于在酵母发酵中阻止细菌污染物生长的方法，其通过将稳定的二氧化氯加入酵母发酵系统中进行。虽然可在将二氧化氯加入发酵系统之前加入所述接种物或可发酵的糖，但是该发明的目标是在发酵反应过程中阻止细菌生长。该发明没有提供一种用于减少可能在酵母发酵反应过程中积累的细菌污染物的方案；也没有提供一种用于浓缩发酵系统中的酵母细胞以提高用于发酵源自半纤维素的水解产物的过程中的效率的方案。
PCT公开文本WO 2007/097874还公开了一种用于减少酵母发酵系统中的细菌污染的方法。在该方法中，将二氧化氯加入发酵系统中、加入可发酵的碳水化合物中或者加入用于制备发酵接种物的增殖或调节系统中。该发明没有提供一种方案，用于减少可能在酵母发酵反应过程中积累的细菌污染物；也没有提供一种方案，用于浓缩发酵系统中的酵母细胞以提高用于发酵源自半纤维素的水解产物的过程的效率。
现今，在现有技术中很难进行一种有效的过程，用于发酵通过水解含半纤维素的原料得到的糖，以便高产率地生产发酵产物。开发一种有效的方法的关键仍是需要将这些原料转化成发酵产物例如乙醇。
发明内容
本发明提供了一种用于从糖水解产物得到一种发酵产物的方法，所述糖水解产物获自含半纤维素的原料。更具体地，本发明涉及一种用于从含半纤维素的原料生产一种发酵产物的方法。
本发明的一个目标是提供一种用于从糖水解产物生产一种发酵产物的改良方法，所述糖水解产物获自经预处理的木质纤维素原料。
本发明提供了一种用于从糖水解产物得到一种发酵产物的方法，其中所述糖水解产物获自含半纤维素的原料，所述方法包括：
(i)从所述糖水解产物中除去悬浮的纤维固体物，以得到一种澄清的糖溶液；
(ii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液中的木糖进行发酵，以产生含一种发酵产物的发酵液；
(iii)从所述发酵液中分离所述酵母，以产生一种酵母浆液及一种发酵产物；
(iv)以一种氧化剂处理所述酵母浆液，以减少所述酵母浆液中的微生物污染物，从而产生经氧化剂处理的酵母浆液；
(v)将至少一部分所述经氧化剂处理的酵母浆液加回发酵步骤——步骤(ii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；并且
(vi)回收所述发酵产物。
本发明提供了如上文定义的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述氧化剂选自臭氧、氯气、二氧化氯和高锰酸钾。再者，在所述处理步骤(步骤iv)中，所述氧化剂处理将所述酵母浆液中的细菌污染物浓度降低至比所述酵母浓度至少低100倍，或者将微生物污染物的浓度降至约103cfu/ml以下。发酵步骤(步骤ii)可以在一系列发酵反应器中进行，并且在加回步骤(步骤v)中，将所述经氧化剂处理的酵母浆液加回至所述一系列发酵反应器中的一个或多个发酵反应器中。
本发明还涉及上文定义的方法，其中在所述除去步骤(步骤i)中，所述澄清糖溶液含有一种选自如下的糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖和果糖。所述澄清糖溶液还可含有一种选自以下的有机酸：乙酸、葡糖醛酸或半乳糖醛酸。
本发明提供了上文定义的方法，其中在所述发酵步骤(步骤ii)中，所述酵母为一种能够将木糖和葡萄糖转化成乙醇的酿酒酵母属种。所述酵母还可以是一种能够将木糖转化成木糖醇的假丝酵母属种(Candida spp.)。
本发明涉及上文定义的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约10g/L至约300g/L。
本发明涉及上文定义的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，加入所述酵母浆液中的氧化剂的浓度为约0.5至约1500ppm。
本发明提供上文定义的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，对所述酵母浆液的处理可在约4℃至约37℃的温度、约3至约6的pH下进行，并且其中将所述酵母浆液最少处理约1分钟。
本发明涉及如上文定义的方法，其中所述糖水解产物通过以下途径获得：以一种pH调整剂预处理所述木质纤维素原料以产生一种经预处理的原料。所述pH调整剂可以是一种酸。再者，所述除去悬浮纤维固体的步骤可包括以一种水性溶液洗涤所述经预处理的木质纤维素原料。所述澄清糖溶液还可含有通过以下步骤产生的葡萄糖：通过酶法水解对所述经预处理的原料进行水解，例如用一种含有纤维素酶的酶混合物。所述酶混合物还可含有β-葡萄糖苷酶。
本发明还提供了一种用于从一种含半纤维素的原料得到乙醇的方法，包括：
(i)以酸对所述原料进行预处理，以产生一种含木糖的糖水解产物；
(ii)从所述糖水解产物中除去悬浮的固体物，以得到一种澄清的糖溶液；
(iii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液进行发酵，以产生一种含乙醇的发酵液；
(iv)从所述发酵液中分离酵母，以产生一种酵母浆液；
(v)以二氧化氯处理所述酵母浆液以杀死微生物污染物，从而产生经二氧化氯处理的酵母浆液；
(vi)将至少一部分所述经二氧化氯处理的酵母浆液加回发酵步骤(步骤iii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；并且
(vii)回收所述乙醇。
本发明还提供了一种用于从一种含半纤维素的原料得到木糖醇的方法，包括：
(i)以酸对所述原料进行预处理，以产生一种含木糖的糖水解产物；
(ii)从所述糖水解产物中除去悬浮的固体物，以得到一种澄清的糖溶液；
(iii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液进行发酵，以产生一种含木糖醇的发酵液；
(iv)从所述发酵液中分离酵母，以产生一种酵母浆液；
(v)以二氧化氯处理所述酵母浆液以杀死微生物污染物，从而产生经二氧化氯处理的酵母浆液；
(vi)将至少一部分所述经氧化剂处理的酵母浆液加回发酵步骤(步骤iii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；以及
(vii)回收所述木糖醇。
本发明克服了现有技术中将木质纤维素原料有效转化成发酵产物过程中的多个困难，涉及将酵母分离并循环至发酵中。将酵母循环回发酵器可增加发酵过程中酵母浓度，而无需将糖转移至细胞生长中以及与其他所需的发酵产物分开。发酵中酵母浓度增加可提高发酵的容积生产率，这会缩短实现目标转化所需的发酵时间。然而，通过这种酵母循环，任何能够在前一循环中生长的污染性微生物也会被循环至后一发酵中。污染性微生物与酵母竞争利用糖，生成不利的副产物，降低产率和纯度。已经有利地发现，通过在所述方法的该阶段以一种氧化性化学药品处理所述酵母浆液，产生不想要的副产物的污染性微生物的水平可被显著降低，而基本上不降低所述酵母的生存力或发酵能力。因此，通过进行本发明的方法，所需发酵产物的产率和所述产物的纯度可得到显著提高。
附图说明
本发明的这些特征和其他特征通过下文的描述将更加显而易见，在下文中参考了附图，其中：
图1示出的过程流程图显示了发酵过程中的酵母循环，根据本发明的一个实施方案，在分离酵母后加入二氧化氯。
图2示出分离自经污染的酿酒酵母预发酵的细菌污染物的生长情况，所述酵母发酵在(a)0、10、100、250和1000ppm二氧化氯；(b)0、10和50ppm过氧化氢；以及(c)0和1250ppm高锰酸钾存在的情况下于含木糖的木质纤维素水解物上进行。
图3示出了0、10、50、250、500和1000ppm二氧化氯对来自(a)20g/L酵母浆液、(b)200g/L酵母浆液和(c)300g/L酵母浆液中的细菌和酵母生长的作用，这些酵母浆液从一种重组酿酒酵母的细菌污染发酵液制备，所述重组酿酒酵母生长于含木糖的木质纤维素水解物上。
图4示出了重组酿酒酵母培养物的(a)木糖消耗(实心符号)和乙醇产生(空心符号)，以及(b)不想要的发酵副产物乳酸的产生，所述酵母培养物以经0、10、50、250、500和1000ppm二氧化氯处理的酵母浆液接种并培养于含木糖的木质纤维素水解产物上。
图5示出了经细菌污染的热带假丝酵母(Candida tropicalis)培养物的木糖消耗和木糖醇发酵产物的产生，所述热带假丝酵母培养物以经0ppm或100ppm二氧化氯处理的酵母浆液接种。
具体实施方式
本发明涉及一种用于从木质纤维素原料生产发酵产物的方法。更具体地，本发明涉及一种用于从含半纤维素的原料生产发酵产物的方法。
以下对实施方案的说明仅是示例性的，而并不是限制有效实施本发明的必要技术特征的组合。
用于本发明方法的原料是一种含半纤维素的材料。优选地，所述原料是一种木质纤维素材料，包括任何类型的植物生物质，例如但并不限于非木质植物生物质，种植作物例如但不限于草，例如但不限于C4草，例如柳枝稷、大米草、黑麦草、芒属、草芦或它们的组合；糖加工残渣例如但不限于，甘蔗渣、甜菜废粕或它们的组合；农业废料例如但不限于，大豆秸、玉米秸、稻秆、稻壳、大麦秆、玉米穗轴、小麦秆、菜籽秆、燕麦秆、燕麦壳、玉米纤维或它们的组合；或者林业生物质，例如但不限于，回收的木浆纤维、锯屑、硬木例如白杨木、软木或它们的组合。再者，所述木质纤维素原料可以包括木质纤维素废料或林业废料，例如但并不限于新闻用纸、纸板等。木质纤维素原料可包括一种纤维，或者木质纤维素原料可包括源自不同木质纤维素原料的纤维混合物。另外，所述木质纤维素原料可以包括未加工的木质纤维素原料、半干的木质纤维素原料或全干的木质纤维素原料。
木质纤维素原料包含的纤维素的量超过约20％，更优选超过约30％，更优选超过约40％(w/w)。例如，所述木质纤维素材料可以包含约20％至约50％(w/w)的纤维素或介于其间的任何量。所述木质纤维素原料还可包含其量超过约10％、更优选其量超过约15％(w/w)的木质素。所述木质纤维素原料还可以包含少量蔗糖、果糖和淀粉。
可以使用经过预处理的原料物实施本发明。预处理法的目的在于给予充分的机械作用和化学作用组合，以破坏纤维结构并增加原料表面积以使其容易被诸如纤维素酶等水解酶接触。机械作用一般包括，使用压力、研磨、碾磨、搅拌、粉碎、压缩/膨胀，化学作用包括使用热(通常为蒸汽)、酸或碱及溶剂。
所述预处理优选地为一种涉及添加“pH调整剂”的化学处理。本文使用的术语“pH调整剂”的意义涵盖任何这样的酸或碱，即该酸或碱适宜用于破坏所述木质纤维素原料的纤维结构及增加所述木质纤维素原料在随后的酶法水解中被水解的可达性。pH调整剂的非限制性实例有硫酸、硝酸、盐酸、石灰和氢氧化镁。
以酸预处理可将存在于所述木质纤维素原料中的半纤维素或其一部分水解成单糖，例如但不限于木糖、阿拉伯糖、甘露糖和/或半乳糖；以及有机酸，例如乙酸、半乳糖醛酸和葡糖醛酸。优选地，进行酸预处理，使得所述半纤维素几乎被完全水解且少量纤维素被转化成葡萄糖。纤维素在随后使用纤维素酶的步骤中被水解成葡萄糖。在预处理过程中，一般将浓度为约0.02％(w/v)至约2％(w/v)或介于其间的任何量(计算为纯酸占干原料加水性溶液的总重量的重量百分率)的稀酸用于所述预处理。优选地，所述酸预处理在约180℃至约250℃的温度或介于它们之间的任意温度下进行约60秒至约600秒的时间或者介于它们之间的任意时间，pH为约0.8至约2.0或介于它们之间的任意pH。
一种对原料进行酸预处理的方法是蒸汽爆破(steam explosion)，使用美国专利4,461,648(该专利通过引用的方式纳入本文)所述的工艺条件进行。另一种预处理所述原料浆液的方法涉及连续的预处理，是指通过一个反应器连续地泵入所述木质纤维素原料。连续的酸预处理是本领域技术人员熟知的，参见例如美国专利5,536,325；WO2006/128304；及美国专利4,237,226(它们通过引用的方式纳入本文)。本领域中已知的并且可以根据需要使用的其他技术，包括但不限于美国专利4,556,430(Converse等人；该专利通过引用的方式纳入本文)中公开的那些方法。
或者，所述预处理涉及加入碱。与酸预处理相比，以碱预处理可能不能完全水解所述原料的半纤维素成分。相反，所述碱与存在于所述半纤维素上的酸性基团作用。加入碱还可改变所述纤维素的晶体结构，使得它更易于水解。可用于所述预处理的碱的实例有氨(ammonia)、氢氧化铵、氢氧化钾和氢氧化钠。用于所述预处理中的碱优选地是可溶于水的。不可溶于水的碱的实例有石灰和氢氧化镁。如果进行碱预处理，那么在随后的纤维素酶水解步骤中优选地包括一种或多种木聚糖酶。合适的木聚糖酶的实例不但有β-木糖苷酶，还可有木聚糖酶1和2(Xyn1和Xyn2)。
合适的碱预处理的实例有氨冷冻爆破或氨纤维爆破(“AFEX”法)。根据该方法，所述木质纤维素原料与氨或氢氧化铵在压力容器中接触足够长的时间，以使氨或氢氧化铵能够改变所述纤维素纤维的晶体结构。然后迅速减小压力，这使得氨闪蒸(flash)或沸腾并爆破所述纤维素纤维结构(参见美国专利5,171,592、5,037,663、4,600,590、6,106,888、4,356,196、5,939,544、6,176,176、5,037,663和5,171,592，这些专利中的每一篇均通过引用的方式纳入本文)。然后，所述闪蒸的氨可依照已知的方法回收。
在酸或碱预处理后，可处理所述木质纤维素原料以得到含所述经预处理原料的固体流体和含可溶性成分的水性流体。这可通过以下方式实现：以一种水性溶液洗涤所述经预处理的原料，以产生一种洗液流体及一种包含所述经预处理原料的固体流体。或者，使用已知方法将所述经预处理原料进行固体-液体分离，所述方法例如离心、微孔过滤、板框式过滤(plate and frame filtration)、错流过滤、加压过滤、真空过滤等。如果使用的是酸预处理，所述水相不但含有在所述预处理过程中加入的酸和在所述预处理过程中释放的任何有机酸，还含有由半纤维素水解产生的糖。随后可对该流体进行加工，以除去无机酸和有机酸，然后任选地返回至含所述经预处理原料的固体流体。还可对获自所述经酸预处理原料的水性流体进行发酵，以将所述糖发酵。例如，可将存在于该流体中的木糖发酵成乙醇、木糖醇、乳酸、丁醇或它们的混合物。
通常将所述经预处理的木质纤维素材料用一种水性溶液调成浆液，所述水性溶液例如工艺用水、未经加工的水(fresh water)、蒸汽冷凝液或处理回收流体。浆液中经预处理木质纤维素原料的浓度取决于所述原料的颗粒大小、水滞留情况(water retention)、泵流量和其他性质。所述纤维固体(也被称为悬浮固体或者不溶固体)的浓度一般是约3％至30％(w/w)或介于其间的任何浓度值，或者约10％至约20％(w/w)或介于其间的任何浓度值。所述水性浆液优选地具有能使其被泵送的固体浓度。本领域中熟知，悬浮固体或不溶解固体的浓度可通过以下方式测定：用玻璃微纤维滤纸过滤浆液样品、将滤饼用水洗涤并在105℃下使其干燥过夜。所述纤维固体优选含有按重量计至少约20％至约70％的纤维素，或介于其间的任何量。例如，所述纤维固体可以含有20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的纤维素。
通常将所述经预处理原料的pH调整到所用纤维素酶的最优pH范围内。一般而言，将所述经预处理原料的pH调整到约3.0至约7.0的范围内，或介于其间的任何pH。例如，所述pH可为约4.0至约6.0或介于其间的任何pH，约4.5至约5.5或介于其间的任何pH，或者约3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0或介于其间的任何pH。如果所述经预处理原料为碱性(即，如果进行了碱预处理)，可将强酸例如硫酸用于pH调整。如果所述经预处理原料为酸性，可使用选自氨、氢氧化铵、石灰、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁和氢氧化钠的碱调整pH。例如，所述碱选自氨、氢氧化铵和氢氧化钠。
将所述经预处理原料浆液的温度调整到对于所述纤维素酶的活性而言最优的范围内。一般而言，大多数纤维素酶的适宜温度为约45℃至约55℃或介于其间的任何温度，例如45、46、48、49、50、51、52、53、54、55℃或介于其间的任何温度。
在调整所述预处理后的水性浆液的温度和pH之前、过程中或之后将纤维素酶和β-葡萄糖苷酶加入至所述经预处理原料中。优选地在调整所述经预处理的木质纤维素原料浆液的温度和pH之后，将纤维素酶和β-葡萄糖苷酶加入至所述浆液中。
术语“纤维素酶”意指水解纤维素的酶混合物。所述混合物可以包含葡萄二糖水解酶(GBH)、纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶。虽然GBH酶可以构成所述酶混合物的成分，但是它们在纤维素的酶法水解中的使用不如CBH酶和EG酶普遍。在一个非限制性实例中，所述纤维素酶混合物包含CBH酶、EG酶和β-葡萄糖苷酶。所述GBH酶主要从纤维素多聚体链末端水解纤维素多聚体链来释放葡萄糖，而所述CBH酶主要从纤维素多聚体链末端水解纤维素多聚体链来释放纤维二糖，所述EG酶主要在纤维素多聚体链中间水解纤维素多聚体。如果所述经预处理原料含木聚糖，那么特别优选在存在一种或多种木聚糖酶的情况下进行所述酶法水解。可用于此目的的木聚糖酶的实例包括木聚糖酶1、2(Xyn1和Xyn2)和β-木糖苷酶，它们通常存在于纤维素酶混合物中。
本发明的方法可使用任意类型的纤维素酶来实施而不必考虑其来源。可用于实施本发明的纤维素酶的非限制性实例包括来自真菌曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)和木霉属(Trichoderma)的纤维素酶，以及来自细菌芽孢杆菌属(Bacillus)和喜热裂孢菌属(Thermobifida)的纤维素酶。
选择纤维素酶的剂量以将经预处理原料的纤维素转化成葡萄糖。例如，适宜的纤维素酶剂量可为约1.0至约40.0滤纸单位(Filter PaperUnit)(FPU或IU)/g纤维素或介于其间的任何量，例如0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、22.0、24.0、26.0、28.0、30.0、32.0、34.0、36.0、38.0、40.0FPU(或IU)/g纤维素或介于其间的任何量。
将纤维二糖转化成葡萄糖是通过β-葡萄糖苷酶完成的。所述术语“β-葡萄糖苷酶”是指任何将葡萄糖二聚体、纤维二糖水解成葡萄糖的酶。所述β-葡萄糖苷酶的活性由酶学委员会(Enzyme Commission)按照其活性定义为EC 3.2.1.21。所述β-葡萄糖苷酶可以有多种来源；然而，在所有情况下，这些β-葡萄糖苷酶都能将纤维二糖水解成葡萄糖。所述β-葡萄糖苷酶可以是家族1或家族3糖苷水解酶，而其他家族成员也可以用于实施本发明。在本发明中使用的优选β-葡萄糖苷酶是来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的Bgl1蛋白。还包括这样β-葡萄糖苷酶，即该酶被修饰以包括纤维素结合结构域，从而使得该酶可结合纤维素。
在实践中，所述水解可以在包含一系列水解反应器的水解体系中进行。所述体系中的水解反应器的数量取决于反应器的价格、水性浆液的体积以及其他因素。对于商业级的乙醇厂，水解反应器的数量一般是4至12个或介于其间的任意数目。为了保持所需的水解温度，可以对水解反应器加装蒸汽、热水或其他热源的夹套。所述纤维素酶水解优选地是一个连续的过程，连续地补入经预处理的木质纤维素原料并取出水解产物浆液。然而，应理解的是，分批过程也涵盖在本发明的范围之内。
以纤维素酶进行的酶法水解可产生含葡萄糖、未转化的纤维素和木质素的溶液。可存在于所述水解产物浆液中的其他成分除包括二氧化硅、不溶性盐和其他化合物外，还包括糖：木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖，有机酸：乙酸、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
虽然已经描述了通过预处理、随后对经预处理原料进行纤维素酶水解来生产糖水解产物，但应理解的是，水性糖流体可由酸处理或碱处理产生，以影响所述原料的半纤维素和纤维素成分完全水解成它们各自的单体组分。所述水解可在两个阶段中完成(参见美国专利5,536,325，该专利通过引用的方式纳入本文)，或者在一个阶段中完成。
然后通过一种或多种发酵微生物对含木糖的水性糖流体进行发酵，以产生含所述发酵产物的发酵液。所述含木糖的水性糖流体可出现在所述原料加工过程中的多个阶段。如前文所述，可将含有在对所述木质纤维材料进行预处理时形成的木糖和其他戊糖的水性糖流体送去进行发酵。或者，将含经预处理原料和木糖的流体进行纤维素酶水解。这可得到一种糖水解产物，其不但含有由纤维素酶水解产生的葡萄糖，而且还含有预处理时形成的木糖和任何其他戊糖。在另一个实施方案中，将含木糖的水性流体从所述经预处理原料中分离，然后加入含由所述纤维素酶水解获得的葡萄糖的流体中，从而产生一种含葡萄糖和木糖以及其他己糖和戊糖的流体。在本发明的又一个实施方案中，所述水性糖流体获自完全酸或碱水解，其中所述原料的纤维素和半纤维素成分被水解成其单体组分。
在一个优选的实施方案中，进行发酵的水性糖流体基本上无未溶解的固体物，例如木质素和其他未水解的成分，使得随后从所述发酵液中分离酵母的步骤形成主要是酵母的分离物。分离可以通过已知的技术进行，包括离心、微孔过滤、板框式压滤、错流过滤、加压过滤、真空过滤等。
多种已知酵母的任一种均可用于将木糖转化成乙醇或其他发酵产物。这些酵母还可以将存在于所述澄清糖溶液中的其他糖(包括但不限于葡萄糖)转换成发酵产物。例如，所述发酵可以用被设计成可将己糖和戊糖发酵成乙醇的重组酿酒酵母进行。可将木糖和阿拉伯糖两种戊糖中的一种或两者都发酵成乙醇的重组酵母记载于美国专利5,789,210、美国专利6,475,768、欧洲专利EP 1 727 890、欧洲专利EP1 863 901和WO 2006/096130(它们通过引用的方式纳入本文)中。
如果木糖醇为发酵产物，那么所述微生物可以是天然能够将木糖转化成木糖醇的假丝酵母属酵母。
优选地，所述发酵于所述发酵微生物的最佳温度和最佳pH或附近进行。使用酿酒酵母属种将木糖发酵成乙醇的一般温度区间为25℃至37℃或介于其间的任意温度，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37℃或介于其间的任意温度，但如果所述酵母天然是热稳定的或被遗传改变为热稳定的，该温度可以更高。例如，所述温度可为约25℃至约55℃或介于其间的任意值。应用酿酒酵母属种的常规发酵的pH为约3至约6或介于其间的任意pH，例如pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或介于其间的任意pH。发酵微生物的剂量将取决于其他的因素，例如所述发酵微生物的活性、希望的发酵时间、反应器的体积和其他的参数。应了解的是，这些参数可由本领域技术人员根据需要加以调整，以实现最佳的发酵条件。
还可向所述糖流体补充发酵微生物生长需要的其他营养物。例如，可将酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐、微量元素和维生素加入至水解产物浆液中，以支持所述微生物的生长并优化所述微生物的生产率。
发酵可以分批模式、连续模式或分批补料模式进行，进行或不进行搅拌均可。优选地，通过混合轻轻地搅拌所述发酵反应器。在一般的商业级发酵中，所述发酵使用一系列反应器进行，例如1-6个反应器或介于其间的任意数目。
在实施本发明的过程中，进行发酵以使得发酵微生物被从所述发酵分离并被送回至所述发酵反应中。这可涉及从所述发酵反应器中连续地取出发酵液以及通过已知分离技术从该溶液中分离酵母，以产生酵母浆液。适宜的分离技术的实例包括但不限于，离心、微孔过滤、板框式压滤、错流过滤、加压过滤、沉淀、真空过滤等。
在实施本发明的过程中，酵母浆液中的细胞浓度(按照例如实施例2a中所测量的那样，单位为每升干重克数)为约10g/L至约300g/L。例如，所述酵母浆液中的细胞浓度可为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、180、200、220、240、260、280或300g/L。更优选地，所述酵母浆液中的细胞浓度为约20g/L至约200g/L。
然后，将所述酵母浆液以氧化剂处理，以破坏微生物污染物。所述氧化剂可选自臭氧、氯气、二氧化氯、过氧化氢和高锰酸钾。例如，所述氧化剂为二氧化氯。该氧化剂通过对胞内酶的芳香氨基酸和含硫氨基酸进行氧化而破坏微生物细胞。二氧化氯尤其适合作为氧化剂，这是因为细菌比酵母更易于受其影响，其原因是大多数的细菌酶只是位于细胞膜内侧，而大多数的酵母酶却位于细胞内结构中更深处。
优选将浓度为约0.5ppm至约1500ppm或介于其间任意浓度的所述氧化剂加入至所述酵母浆液中。例如，可以0.5、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500ppm的浓度或者它们之间的任意浓度加入所述氧化剂。例如，所述氧化剂可为二氧化氯，并且加入浓度为约100至约500ppm或介于其间的任意浓度。所述二氧化氯可使用已知方法生成，例如通过在使氯气与水反应后加入亚氯酸钠，或者通过使次氯酸钠与酸反应并加入亚氯酸钠。
所述氧化剂处理优选在约4℃至约40℃或介于其间的任意温度下进行，例如4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40℃或介于其间的任意温度。pH区间可为约3至约6或介于其间的任意pH，例如pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或介于其间的任意pH。处理持续时间可以是至少1分钟，优选至少15分钟，例如所述处理可以是1分钟至约30分钟或介于其间的任意时间，例如1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30分钟或介于其间的任意时间。
所述氧化剂处理优选地将所述微生物污染物的浓度降低至这样的水平，即所述微生物污染物在该水平下不再降低以酵母浆液进行的木糖发酵的生产率或产品产率。优选地，所述氧化剂处理可将微生物污染物的浓度(以每mL培养物的菌落形成单位或cfu/mL表示)降低至比酵母浓度(以每mL培养物的菌落形成单位或cfu/mL表示)低约100倍。更优选地，所述氧化剂处理将微生物污染物的浓度降低至约103cfu/mL或更低。例如，所述氧化剂处理将微生物污染物的浓度降低至约107至约103cfu/mL。
在以所述氧化剂处理所述酵母浆液后，将所述酵母再次引入至所述发酵反应中。优选地，约10％至约99％或介于其间任意量的所述酵母细胞被处理并被循环。更优选地，80％至95％的所述酵母细胞被处理并被循环。最优选地，至少90％的所述酵母细胞被处理并被循环。本发明的实施不受酵母细胞取出-处理-再导入的循环次数的限制。酵母循环可重复至少1次或5至15次。例如，酵母循环可重复5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。
所述发酵可应用一系列发酵反应器。在这种情况下，将酵母从所述一系列发酵反应器中的一个反应器中取出，以所述氧化剂处理，然后再次导入至所述发酵反应器的一个反应器中。可将所述氧化剂处理的酵母返回所述一系列反应器中同一反应器或不同反应器中。通过以该方式再循环所述酵母，它们的浓度会增加，这会提高所述反应器的容积比，并且还可通过使酵母细胞增殖所需的碳及其他营养物向转移最小化而使所需产物的产率最大化。
下面参照图1，对带有酵母循环的发酵系统进行描述。图1属于一个如何实施本发明的实例，但并不意味着是以任何方式进行限制。将从半纤维素水解产物获得的水性糖流体6加料至第一发酵反应器8中。该糖流之前已被处理以除去不溶的木质素和其他悬浮固体物。糖流体6与来自调节罐(conditioning tank)14的酵母通过管线16混合。所述调节罐进而填有含空气的流体和来自流体6的一部分糖。将含乙醇的发酵溶液经管线18从反应器8中取出，并加至分离单元22中，分离单元22通常是离心机，它将酵母从所述发酵溶液分离。将含乙醇的分离淡酒(beer)蒸馏，以得到富集乙醇的溶液。管线26中一部分酵母浆液流出。在流出后，将剩余酵母以二氧化氯的水性溶液洗涤，然后经管线26加至保持罐30中，在该保持罐中将它们保持于合适的条件下。然后，将以二氧化氯处理的酵母沿管线34供给，管线34有支路管线38，管线38进而将一部分酵母导回至发酵罐8，以将木糖转化成乙醇。将剩余的酵母经管线34送至调节罐14中进行细胞生长。然后，将来自调节罐14的酵母送至第二发酵罐42，并将该循环再重复一次。然后，可以第三发酵罐46重复该循环。虽然图1中描述了3个发酵罐，但本领域技术人员应了解的是，根据需要可改变发酵罐的数目。此外，还考虑可省略保持罐30，在这种情况下，酵母随后在例如发酵罐8中被保持足够的时间以破坏微生物污染物。
如果乙醇是发酵产物，那么通过蒸馏回收乙醇。进行蒸馏的分离发酵液或淡酒为稀的乙醇溶液，基本不包含包括未转化纤维素在内的固体物，但它除了含有分离16后可能剩余的少量酵母之外，还可含有在发酵过程中加入以支持微生物生长的成分。优选地对所述淡酒除气以除去二氧化碳，然后将其泵过一个或多个蒸馏柱以从所述淡酒中的其他成分中分离出乙醇。所述蒸馏单元中的柱优选被以连续方式操作，但应理解的是分批过程也被本发明所囊括。此外，对所述柱的操作可在高于大气压下、低于大气压下或在大气压下进行。可在一个或多个点对蒸馏过程进行加热，这通过直接注入蒸汽或者间接经热交换实现。所述蒸馏单元可包含一个或多个分立的淡酒柱和精馏柱。在这种情况下，将稀的淡酒送至所述淡酒柱，其在淡酒柱中被部分地浓缩。蒸汽从所述淡酒柱进入精馏柱，用于进行进一步纯化。或者，使用含整体浓缩或精馏段的蒸馏柱。可通过分子筛树脂、通过吸附或本领域技术人员熟悉的其他方法将剩余的水从所述蒸汽中除去。然后，将所述蒸汽压缩并改变性质。
在以下的实施例中将对本发明进一步阐明。然而，应理解这些实施例只是为了阐明本发明，而不是以任何方式用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1描述了用于下述实施例的酵母株。实施例2描述了一种方法，用于确定抗氧剂限制发酵木糖的酵母培养物发酵中细菌污染物生长的效力。实施例3描述了一种使用经二氧化氯处理的循环酿酒酵母从木糖产生乙醇的方法。实施例4描述了一种使用经二氧化氯处理的循环假丝酵母从木糖产生木糖醇的方法。
实施例1：酵母株
用于本研究的酿酒酵母株为其基因组中整合有多拷贝的以下基因的重组株：编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的树干毕赤酵母(Pichiastipitis)基因以及编码木酮糖激酶的酿酒酵母基因，如美国专利5,789,210中所述。所述热带假丝酵母株为ATCC 1369。
实施例2：以含木糖的木质纤维素水解产物进行的酿酒酵母重组体和热带假丝酵母重组体的14L分批补料发酵。
2a.酿酒酵母
将来自冷冻甘油原种的酿酒酵母细胞用于接种4L的Sc接种培养基(pH 6)。在30℃下，将所述接种物以160rpm振荡培养24小时。通过离心(以4000rpm心5分钟)收集细胞，并将整个细胞沉淀再次悬浮于约50mL的上清液中，这用于接种20L的Sc增殖培养基(pH5.0)。以56slpm的中度充气及以机械搅拌的500rpm搅动将分批补料发酵进行4天。将pH保持于5.0，最初2天将温度保持于30℃，后2天为28℃。将60g/L的葡萄糖溶液以83.3mL/小时的速度加料至所述容器中。每天对所述培养物取样3次，对样品进行细胞生长、木糖和葡萄糖的分析。在发酵结束后，收获全部发酵液并通过离心(在多个4L Nalgene瓶中以4000rpm离心5分钟)收集细胞。将细胞沉淀以22.5g细胞团块/L的浓度再次悬浮。这用于接种10L的Sc发酵培养基。以1slpm的充气、250rpm的机械搅拌将成批发酵进行2-3天。将pH保持在6.0，温度保持在28-30℃。每天对所述培养物取样3次，对样品进行细胞生长、木糖、葡萄糖和乙醇的分析。
组分   Sc接种培养基(g/L或mL/L)   Sc增殖培养基(g/L或mL/L)   Sc发酵培养基(g/L或mL/L)
  葡萄糖   60   375   0
  木质纤维素水解产物溶液d   0   500   900
  10x矿物培养基溶液d   100   100   100
微量元素溶液d   1   1   1
  维生素溶液d   1   1   1
  1M MES缓冲物   100   0   0
  酵母提取物   10   0   0
  蛋白胨   20   0   0
  消泡剂溶液   5   5-10   5-10
a10×矿物培养基含50g/L硫酸铵、30g/L磷酸二氢钾和5g/L硫酸镁。
b微量元素溶液含0.403M EDTA、15.6mM硫酸锌、5mM氯化锰、1.3mM氯化钴、1.2mM硫酸铜、1.6mM钼酸二钠、30.6mM氯化钙、10.8mM硫酸亚铁、16.2mM硼酸和0.6mM碘化钾。
c维生素溶液含50mg/L生物素、1.0g/L泛酸钙、1g/L烟酸、1.0g/L肌醇、1.0g/L硫胺盐酸盐和1.0g/L吡哆醛盐酸盐。
d木质纤维素水解产物溶液是依照WO 2006/128304的方法通过对小麦秆进行稀酸预处理来制备的，含110g/L木糖、15g/L葡萄糖、11g/L阿拉伯糖和5g/L半乳糖，以及其他溶解的固体和不溶固体。
细胞团块的干细胞重测量按如下进行：将5mL样品过滤通过预先称重的Fisher Brand G6，5.5cm玻璃纤维滤器。使用Procter SilexModel #35038以40％的功率，将所述滤器及其内含物经设定在450瓦特的微波进行16分钟的干燥。然后，将含干燥细胞团块的所述干滤器再次进行称重，并减去滤纸重。
每个样品的木糖和葡萄糖浓度按如下进行测量：将2mL发酵液在14,000rpm下离心3分钟以除去细胞，将上清液过滤通过0.2μm的注射器滤器。在5mM硫酸溶液中制备10×上清液稀释物。使用装配有1100系列自动采样器和抽泵系统以及Chemstation控制软件的Agilent1100系列HPLC柱，经HPLC分析稀释物。将保持于50℃的VarianMetaCarb 87H柱用于分离。洗脱剂为5mM硫酸水溶液，流速为0.600mL/分钟。葡萄糖、乙醇、木糖和木糖醇使用Agilent 1100系列折光率检测器进行定量。乙酸和乳酸使用Agilent 1200系列可变波长检测器测量。
2b.热带假丝酵母
将来自冷冻甘油原种的热带假丝酵母细胞用于接种2L的Ct接种培养基。在30℃下，将所述接种物以160rpm振荡培养24小时。通过离心收集细胞，并将整个细胞沉淀用于接种2L的Ct木糖培养基。在30℃下，将该培养物以160rpm振荡培养24小时，并将所述发酵液用于接种10L的Ct发酵培养基。以4slpm的轻度充气及以机械搅拌的150rpm搅动进行分批补料发酵。每天对所述培养物取样3次，如实施例2a中所述对样品进行细胞生长、木糖和木糖醇的分析。
组分   Ct接种培养基(g/L或mL/L)   Ct木糖培养基(g/L或mL/L)   Ct发酵培养基(g/L或mL/L)
葡萄糖   60   0   0
木质纤维素水解产物溶液d   0   800   800
10x矿物培养基溶液d 100   100   100
微量元素溶液d   1   1   1
维生素溶液d   1   1   1
1M MES缓冲物，pH 5.0   100   100
消泡剂溶液   5   5   5-10
a10×矿物培养基含50g/L硫酸铵、30g/L磷酸二氢钾和5g/L硫酸镁。
b微量元素溶液含0.403M EDTA、15.6mM硫酸锌、5mM氯化锰、1.3mM氯化钴、1.2mM硫酸铜、1.6mM钼酸二钠、30.6mM氯化钙、10.8mM硫酸亚铁、16.2mM硼酸和0.6mM碘化钾。
c维生素溶液含50mg/L生物素、1.0g/L泛酸钙、1g/L烟酸、1.0g/L肌醇、1.0g/L硫胺盐酸盐和1.0g/L吡哆醛盐酸盐。
d木质纤维素水解产物溶液是依照WO 2006/128304的方法对小麦秆进行稀酸预处理来制备的，含110g/L木糖、15g/L葡萄糖、11g/L阿拉伯糖和5g/L半乳糖，以及其他溶解的固体和不溶固体。
实施例3：对污染的发酵液样品中细菌污染的控制
经细菌污染的发酵液样品获自实施例2a中描述的预发酵。
为了分离并选择性地增殖所述污染物，使用真空过滤将污染的发酵液样品(5mL)过滤通过孔径1.6μm的GF/A 40mm滤纸至300mL的真空瓶中，以取出悬浮的固体和酵母。将所述滤纸以每次大约1.5mL的YEP-葡萄糖培养基(10.0g/L酵母提取物、20.0g/L蛋白胨和50.0g/L葡萄糖)冲洗，随后以剩下的培养基冲洗。然后将滤液转移至一个空的300mL烧瓶中，随后在30℃下以160RPM振荡培养大约16小时。这形成了用于实验的细菌接种物。
在装有3mL的YEP-葡萄糖培养基和48μL细菌接种物的杯(cuvette)中制备样品。向每个杯中加入剂量大约0、10、50、100、250、1000或1250ppm的二氧化氯、过氧化氢或高锰酸钾，如图2a和2b中标出的。制备无细菌的空白杯。将这些杯连续搅拌并在Cary300系列分光光度计(Varian)中保持于30℃下。然后，将这些样品在所述Cary分光光度计上持续数小时分析660nm下的光密度(OD660)。
这些结果显示于图2中。该图显示，100ppm或更高的二氧化氯(图2a)、50ppm或更高的过氧化氢剂量和1250ppm的高锰酸钾剂量(图2c)会抑制细菌生长(与0ppm对照相比于OD660下增加的降低速度)。
在另一个独立实验中，收获了来自实施例2a的经细菌污染的发酵液中所有内含物。通过离心(4分钟，4000rpm)收集酵母，并再次悬浮于原始的污染上清液中至20g/L、200g/L或300g/L。用显微镜确证污染。将所形成的3种浆液在冰水浴中冷却，以0、10、50、250、500、750或1000ppm的ClO2处理，连续稀释并铺板于YM琼脂(3.0g/L酵母提取物、3.0g/L麦精、5g/L蛋白胨、10g/L葡萄糖、20g/L琼脂)+氯霉素(34μg/mL)平板上用于酵母计数，及铺板于TSA(15g/L胰酶消化酪蛋白胨、5g/L酶消化大豆粉、5g/L NaCl，15g/L琼脂)+放线菌酮(0.05μg/mL)平板上用于细菌计数。对于酵母和细菌，将平板分别在30℃和37℃下孵育过夜。第二天对平板进行计数，用显微镜确认细菌菌落。
图3中的结果显示，250ppm或更高的二氧化氯剂量可有效地抑制20g/L酵母细胞悬液中的细菌生长，对酵母的生存力无影响或仅有很小影响。有效去除200g/L和300g/L酵母悬液中的细菌污染需要500ppm或更高的二氧化氯剂量；该剂量对酵母的生存力无影响或仅有很小影响。
实施例4：以经二氧化氯处理的循环酿酒酵母从木糖生产乙醇
收获来自经污染的发酵液的酿酒酵母细胞并使用实验室离心收集，以产生在悬浮于木质纤维素水解产物中细胞浓度为200g/L的酵母浆液。将所述酵母浆液以50ppm、300ppm和500ppm的二氧化氯处理。如实施例2a中所述，将所述酵母浆液用于对含分批模式的含10L Sc发酵培养基的发酵罐进行再次接种，目标起始酵母浓度为22.5g/L酵母。每天对所述培养物取样3次，如实施例2a中所述对样品进行木糖、乳酸和乙醇的分析。
图4中的结果表明，与以经50ppm二氧化氯(图4a)处理的酵母浆液接种的培养物相比，以经300ppm(图4b)或500ppm(图4c)二氧化氯处理的200g/L酵母浆液接种的培养物产生了显著更多的所需乙醇产物和更少的不需要的乳酸副产物。另外，以更高二氧化氯剂量处理的细胞显示了显著更快的木糖消耗速度。
实施例5：以经二氧化氯处理的循环热带假丝酵母从木糖生产木糖醇
从实施例2b中描述的全部预发酵发酵液中收获细胞，将所述细胞通过离心收集并再次悬浮于800mL上清液中，分成两份400mL的酵母浆液。在室温下将所述酵母浆液以0或100ppm的二氧化氯处理并接种至10L的Ct发酵培养基中，以处理的和未处理的酵母浆液重复实施例2b的分批发酵。在0小时、21小时、30小时、36小时、48小时、60小时、72小时、78小时、84小时、96小时、102小时、108小时和120小时取样，如实施例2a中所述对样品进行木糖和木糖醇的分析。
图5中的结果表明，与以未处理的浆液接种的热带假丝酵母培养物相比，以经处理的浆液接种的热带假丝酵母培养物产生了更多的木糖醇发酵产物。
以上结合一个或多个实施方案描述了本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，只要不背离权利要求书中限定的本发明的范围，可进行多种修改和变化。

Claims (61)

1.一种用于从一种糖水解产物得到一种发酵产物的方法，所述糖水解产物获自一种含半纤维素的原料，所述方法包括：
(i)从所述糖水解产物中除去悬浮的纤维固体物，以得到一种澄清的糖溶液；
(ii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液中的木糖进行发酵，以产生一种含发酵产物的发酵液；
(iii)从所述发酵液分离所述酵母，以产生一种酵母浆液及一种发酵产物；
(iv)以一种氧化剂处理所述酵母浆液，以减少所述酵母浆液中的微生物污染物，从而产生经氧化剂处理的酵母浆液；
(v)将至少一部分所述经氧化剂处理的酵母浆液加回所述发酵步骤——步骤(ii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；并且
(vi)回收所述发酵产物。
2.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述氧化剂选自臭氧、氯气、二氧化氯、过氧化氢和高锰酸钾。
3.根据权利要求2的方法，其中所述氧化剂为二氧化氯。
4.根据权利要求1的方法，其中所述发酵步骤(步骤ii)在一系列发酵反应器中进行，并且其中在所述加回步骤(步骤v)中，将所述经氧化剂处理的酵母浆液加回至所述一系列发酵反应器中的一个或多个发酵反应器中。
5.根据权利要求1的方法，其中在所述除去步骤(步骤i)中，所述澄清糖溶液含有一种选自如下的糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖和果糖。
6.根据权利要求1的方法，其中在所述除去步骤(步骤i)中，所述澄清糖溶液含有一种选自以下的有机酸：乙酸、葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
7.根据权利要求1的方法，其中在所述发酵步骤(步骤ii)中，所述酵母为一种能够将木糖和葡萄糖转化成乙醇的酿酒酵母属种(Saccharomyces spp.)。
8.根据权利要求1的方法，其中在所述发酵步骤(步骤ii)中，所述酵母为一种能够将木糖转化成木糖醇的假丝酵母属种(Candidaspp.)。
9.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，向所述酵母浆液中加入浓度约0.5至约1500ppm的氧化剂。
10.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，向所述酵母浆液中加入浓度约100至约500ppm的氧化剂。
11.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液中的细菌污染物浓度降低至比所述酵母浓度至少低100倍。
12.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液中的细菌污染物浓度降低至约103cfu/ml以下。
13.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约10g/L至约300g/L。
14.根据权利要求13的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约20g/L至约200g/L。
15.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液的温度为约4℃至约37℃。
16.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，所述酵母浆液的pH为约3至约6。
17.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，使所述酵母浆液与所述氧化剂接触最少约1分钟。
18.根据权利要求1的方法，其中在所述处理步骤(步骤iv)中，使所述酵母浆液与所述氧化剂接触最少约15分钟。
19.根据权利要求1的方法，其中所述糖水解产物通过以下途径获得：以一种pH调整剂预处理所述木质纤维素原料以产生一种经预处理的原料。
20.根据权利要求19的方法，其中所述pH调整剂为一种酸。
21.根据权利要求19的方法，其中在除去所述悬浮纤维固体的步骤(步骤i)中，以一种水性溶液洗涤所述经预处理的木质纤维素原料。
22.根据权利要求19的方法，其中所述澄清糖溶液含有通过以下步骤产生的葡萄糖：通过酶法水解对所述经预处理的原料进行水解。
23.根据权利要求22的方法，其中所述酶法水解以一种含纤维素酶的酶混合物进行。
24.根据权利要求23的方法，其中所述酶混合物还含有β-葡萄糖苷酶。
25.根据权利要求1的方法，其中所述糖水解产物通过以下方式产生：以酸或碱将所述木质纤维素原料中的纤维素和半纤维素水解成它们各自的糖单体。
26.根据权利要求5的方法，其中所述酵母将存在于所述澄清糖溶液中的糖转化成一种发酵产物。
27.一种用于从一种含半纤维素的原料得到乙醇的方法，包括：
(i)以酸对所述原料进行预处理，以产生一种含木糖的糖水解产物；
(ii)从所述糖水解产物中除去悬浮的固体物，以得到一种澄清的糖溶液；
(iii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液进行发酵，以产生一种含乙醇的发酵液；
(iv)从所述发酵液分离所述酵母，以产生一种酵母浆液；
(v)以二氧化氯处理所述酵母浆液以杀死微生物污染物，从而产生经氧化剂处理的酵母浆液；
(vi)将至少一部分所述经二氧化氯处理的酵母浆液加回发酵步骤(步骤iii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；并且
(vii)回收所述乙醇。
28.根据权利要求27的方法，其中在所述发酵步骤(步骤iii)中，所述发酵反应在一系列发酵反应器中进行，并且其中在所述加回步骤(步骤vi)中，将所述经氧化剂处理的酵母浆液加回至所述一系列发酵反应器中的一个或多个发酵反应器中。
29.根据权利要求27的方法，其中在所述除去步骤(步骤ii)中，所述糖水解产物含有一种选自如下的糖：半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。
30.根据权利要求27的方法，其中在所述发酵步骤(步骤iii)中，所述酵母能够将木糖转化成乙醇。
31.根据权利要求30的方法，其中在所述发酵步骤(步骤iii)中，所述酵母为一种能够将木糖和葡萄糖转化成乙醇的酿酒酵母属种。
32.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，向所述酵母浆液加入浓度约0.5至约1500ppm的二氧化氯。
33.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，向所述酵母浆液加入浓度约100至约500ppm的二氧化氯。
34.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细菌污染物浓度降低至比所述酵母浓度至少低100倍。
35.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细菌污染物浓度降低至约103cfu/ml以下。
36.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约10g/L至约300g/L。
37.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约20g/L至约200g/L。
38.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液的温度为约4℃至约37℃。
39.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液的pH为约3至约6。
40.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，使所述酵母浆液与所述氧化剂接触最少约1分钟。
41.根据权利要求27的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，使所述酵母浆液与所述氧化剂接触最少约15分钟。
42.根据权利要求27的方法，其中在除去所述悬浮纤维固体的步骤(步骤ii)中，以一种水性溶液洗涤所述经预处理的木质纤维素原料。
43.根据权利要求27的方法，其中所述澄清糖溶液含有由以下步骤产生的葡萄糖：通过酶法水解对所述经预处理的原料进行水解。
44.根据权利要求43的方法，其中所述酶法水解以一种含纤维素酶的酶混合物进行。
45.一种用于从一种含半纤维素的原料获得木糖醇的方法，包括以下步骤：
(i)以酸对所述原料进行预处理，以产生一种含木糖的糖水解产物；
(ii)从所述糖水解产物中除去悬浮的固体物，以得到一种澄清的糖溶液；
(iii)通过使用酵母的发酵反应对所述澄清糖溶液进行发酵，以产生一种含木糖醇的发酵液；
(iv)从所述发酵液中分离所述酵母，以产生一种酵母浆液；
(v)以二氧化氯处理所述酵母浆液以杀死微生物污染物，从而产生经氧化剂处理的酵母；
(vi)将至少一部分所述经氧化剂处理的酵母浆液加回发酵步骤(步骤iii)中，以增加所述发酵反应中的酵母浓度；并且
(vii)回收所述木糖醇。
46.根据权利要求45的方法，其中在所述除去步骤(步骤ii)中，所述糖水解产物还含有一种选自如下的糖：半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。
47.根据权利要求45的方法，其中在所述发酵步骤(步骤iii)中，所述酵母能够将木糖转化成木糖醇。
48.根据权利要求47的方法，其中在所述发酵步骤(步骤iii)中，所述酵母为一种能够将木糖转化成木糖醇的假丝酵母属种。
49.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，向所述酵母浆液加入浓度约0.5至约1500ppm的二氧化氯。
50.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，向所述酵母浆液加入浓度约100至约500ppm的二氧化氯。
51.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细菌污染物浓度降低至比所述酵母浓度至少低100倍。
52.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细菌污染物浓度低于约103cfu/ml。
53.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约10g/L至约300g/L。
54.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液中的细胞浓度为约20g/L至约200g/L。
55.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液的温度为约4℃至约37℃。
56.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，所述酵母浆液的pH为约3至约6。
57.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，使所述酵母浆液与所述氧化剂接触最少约1分钟。
58.根据权利要求45的方法，其中在所述处理步骤(步骤v)中，使所述酵母浆液与所述氧化剂接触最少约15分钟。
59.根据权利要求45的方法，其中在除去所述悬浮纤维固体的步骤(步骤ii)中，以一种水性溶液洗涤所述经预处理的木质纤维素原料。
60.根据权利要求45的方法，其中所述澄清糖溶液含有由以下步骤产生的葡萄糖：通过酶法水解对所述经预处理的原料进行水解。
61.根据权利要求47的方法，其中所述酶法水解以一种含纤维素酶的酶混合物进行。
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