BR102016013836A2 - Methods of optimization of the wash for the inactivation of micro-organisms deteriorating the brewer fermentation process - Google Patents

Abstract

métodos de otimização da lavagem para inativação de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro a presente invenção refere-se a métodos para inativação de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro em função do impacto do ph e temperatura, ou da concentração de dióxido de cloro e temperatura durante a lavagem. a presente invenção permite manter a viabilidade do fermento cervejeiro, através da geração de métodos preditivos que direcionam as melhores combinações das variáveis para a obtenção de inativações bacterianas eficientes e manutenção do fermento.

Description

MÉTODOS DE OTIMIZAÇÃO DA LAVAGEM PARA INATIVAÇÃO DE MICROORGANISMOS DETERIORADORES DO PROCESSO FERMENTATIVO

CERVEJEIRO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção trata-se de métodos de otimização da lavagem para inativaçâo de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro.

[002] A presente invenção se insere no campo da Engenharia, mais precisamente na área da engenharia de alimentos, e descreve dois métodos para determinar condições ótimas na lavagem do fermento cervejeiro.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Dentre as diversas etapas de produção, a fermentação é considerada a principal operação unitária da indústria cervejeira. Ao final da fermentação, obtém-se, além do mosto fermentado, um excesso de levedura, que pode ser reutilizado em novas bateladas de fermentação ou pode ser vendido para a indústria de ingrediente de alimentos, ou ainda, ser descartado. O completo descarte do fermento após somente um processo de fermentação pode levar à grandes impactos ambientais e perdas econômicas. Apesar de a cerveja ser reconhecida como uma bebida de singular estabilidade microbiológica, contaminações no processo fermentativo podem levar à redução do rendimento e produtividade da fermentação e alterações indesejáveis que afetam negativamente a qualidade do produto final. Desta forma, a contaminação do fermento cervejeiro por micro-organismos deterioradores é uma das principais preocupações das indústrias cervejeiras. Visando-se reduzir impactos ambientais e reduzir custos, é comum prática nas indústrias cervejeiras, a re-utilização do fermento em novos lotes de fermentação. Para que isto ocorra, torna-se necessário garantir que o fermento não represente uma fonte de contaminação da nova batelada de mosto a ser fermentado. As alternativas empregadas pelos cervejeiros para eliminar contaminações microbianas do fermento e permitir sua reutilização são: a lavagem ácida e a lavagem com dióxido de cloro. Apesar de ambas serem uma prática comum dentro das indústrias cervejeiras, a sua otimização e eficácia sobre micro-organismos deteriorantes contaminantes do processo fermentativo e o impacto sobre a levedura utilizada para fabricação da cerveja ainda não são conhecidos.

[004] Atualmente existem poucos trabalhos com aplicação de métodos preditivos dentro da indústria cervejeira. Esses métodos têm seu foco no controle das características da fermentação e no controle da formação de substâncias aromáticas. Entretanto, não há trabalhos que fizeram uso de métodos preditivos com enfoque na redução de contaminantes do processo cervejeiro.

[005] Assim, o presente trabalho tem por objetivo: otimizar o processo de lavagem ácida, e da lavagem com dióxido de cloro, visando-se obter fermento descontaminado e viável para não haver comprometimento do processo de fermentação.

[006] Algumas propostas com o intuito de eliminar tal necessidade foram propostas no estado da técnica, por exemplo: [007] O documento W02007097874 se refere a um método para reduzir a concentração de microrganismos indesejáveis e promover a propagação das leveduras, aumentando sua eficácia. 0 método emprega as seguintes etapas: introdução de uma quantidade de carboidrato fermentável, introdução de leveduras, produção de CL02 na forma de gás, dissolução deste gás para formar uma solução e introdução desta solução no fluido aquoso da fermentação. A invenção proposta difere do documento W02007097874 principalmente pelo fato do tratamento apresentar resultados mais eficientes na redução do contaminante em relação ao tempo de contato do sanitizante com o fermento. A solução para a redução dos contaminantes bacterianos apresentada no documento W02007097874, demora aproximadamente 72 horas para se atingir uma redução de 2 log UFC. Enquanto a combinação de temperatura, concentração do sanitizante ou pH da solução gera a redução de contaminante em um tempo, pelo menos, 36 vezes menor. Além da geração de um método preditivo que prevê a resposta de inativação do contaminante e da manutenção da viabilidade do fermento.

[008] O documento W02011116042 se refere a um método de produção de etanol por fermentação na presença de um oxidante estabilizado que controla o crescimento bacteriano sem reduzir a população da levedura. Um dos possíveis oxidantes citados é o dióxido de cloro. A invenção proposta difere do documento W02011116042 principalmente pelo fato do momento de aplicação dos sanitizantes, sendo ácido fosfórico e dióxido de cloro, ocorrerem em uma etapa diferente da fermentação, pois enquanto no método do documento W02011116042 a aplicação dos sanitizantes ocorre no processo fermentativo na presente invenção a aplicação ocorre na lavagem do fermento. Além de que, na presente invenção, são apresentados métodos que predizem a eficiência de redução dos contaminantes e a manutenção da viabilidade do fermento. A presente invenção busca eliminar os contaminantes presentes no fermento de reutilização, sem adições de substâncias que não compõem a receita da cerveja durante o processo de fermentação. Além da invenção em questão apresentar métodos que preveem a redução dos contaminantes e o impacto na viabilidade do fermento.

[009] Chen, L. , et al," Cleaning in place with onsite-generated electrolysed oxidizing water for water-saving disinfection in breweries" tratam de um estudo comparativo do uso de água ácida eletrolisada e ácido peracético como sanitizante para a desinfecção em cervejarias. Nesse trabalho os autores realizaram a comparações, de ambos os sanitizantes, e avaliaram seu efeito anti-microbiano para a limpeza de equipamentos e tanques na indústria cervejeira. No entanto, documento não apresenta uma aplicação direcionada a descontaminação do fermento cervejeiro e também não apresenta um método preditivo da aplicação. A invenção proposta difere do trabalho de Chen, L., et al principalmente pelo fato da aplicação das soluções sanitizantes apresentarem um foco em uma etapa da produção de cerveja. Além conferir uma predição da eficácia do tratamento em reduzir os contaminantes e manter a viabilidade do fermento.

[010] O documento EP231632 se refere ao uso do ácido perfórmico como agente sanitizante na indústria em especial na área de alimentos. Trata-se de uma solução de aplicação de um sanitizante em superfícies da indústria de alimentos A invenção proposta difere do documento EP231632, principalmente, pelo fato de que os sanitizantes são aplicados direto no fermento e não na superfície de equipamentos utilizados na indústria. A invenção proposta apresenta uma aplicação direcionada dos sanitizantes, assim como a apresentação de métodos que preveem os resultados de inativação do contaminante e manutenção da viabilidade do fermento.

[011] Krogerus, K., et al, "An Improved Model for Prediction of Wort Fermentation Progress and Total Diacetyl Profile" descrevem um método para predição do progresso da fermentação do mosto e do perfil do diacetil. Os efeitos da temperatura de fermentação, pH inicial do mosto e a quantidade de FAN foram estudados para desenvolver um método preditivo do progresso da fermentação. A invenção proposta difere do trabalho de Krogerus, K., et al principalmente pelo fato dos métodos apresentados terem sido desenvolvidos para prever a eficiência da redução de contaminantes do processo e manutenção da viabilidade da levedura durante a lavagem do fermento. Enquanto o documento de Krogerus, K., et al apresentado promove a aplicação de um método preditivo para objetivos voltados ao progresso da fermentação e não para a eliminação de contaminantes, não sendo considerada a manutenção da viabilidade do fermento. Desta forma a presente invenção propõe método preditivo para a produção eficiente de cerveja, porém relacionada a manutenção do uso do fermento em novas bateladas fermentativas e eliminação de bactérias contaminantes.

[012] Hepworth, N., et al, "The use of laboratory-scale f ermentations as a tool for modelling beer fermentations" se referem a um método desenvolvido para prever coeficientes de rendimento para o etanol, substrato, ésteres, produção das taxas de C02 como uma função da temperatura. A invenção proposta difere do trabalho de Hepworth, N., et al principalmente pelo fato dos métodos apresentados terem sido desenvolvidos para prever a eficiência da redução de contaminantes do processo e manutenção da viabilidade da levedura durante a lavagem do fermento. Enquanto o documento de Hepworth, N., et al não oferece soluções para problemas de contaminação da etapa de reaproveitamento do fermento.

[013] Krause, D., et al, "Ultrasonic sensor for predicting sugar concentration using multivariate calibration" se refere a um método de regressão multivariada para predição da concentração de maltose em uma solução aquosa. Foram analisados tempo e frequência de sinais ultrassônicos. 0 método permite a previsão da concentração em diferentes temperaturas utilizando método de regressão multivariada para pontos de temperatura individuais. A invenção proposta difere do trabalho de Krause, D., et al, principalmente pelo fato dos métodos apresentados terem sido desenvolvidos para prever a eficiência da redução de contaminantes do processo e manutenção da viabilidade da levedura durante a lavagem do fermento. Enquanto o documento de Krause, D., et al, apresenta soluções para monitoramento de uma substância do meio, e não oferece uma solução preditiva para a descontaminação do fermento. Desta forma a invenção proposta possibilita uma ação totalmente diferente do que é apresentado pelo documento de Krause, D., et al, pois permite a redução dos contaminantes do processo cervejeiro sem prejudicar a viabilidade do fermento.

[014] A partir do exposto, a presente invenção surge como uma alternativa aos métodos de sanitização na indústria cervejeira, pois promove a redução e o controle dos microrganismos deterioradores do processo fermentativo, além de manter a viabilidade do fermento cervejeiro. Outra alternativa proposta pela invenção é a da geração de métodos preditivos que direcionam as melhores combinações das variáveis para a obtenção de inativações bacterianas eficientes e manutenção do fermento. Salienta-se também a redução do impacto ambiental pela redução da geração de resíduos industriais (descarte de fermento). Além da redução de alterações sensoriais ou de perdas de processo, por exemplo redução de rendimento, devido à contaminação do fermento reciclado e utilizado em processos fermentativos posteriores.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[015] A presente invenção trata-se de métodos de otimização da lavagem para inativação de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro.

[016] Os métodos da presente invenção permitem a inativação de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro em função do impacto do pH e temperatura, ou da concentração de dióxido de cloro e temperatura durante a lavagem. A presente invenção permite manter a viabilidade do fermento cervejeiro, através da geração de métodos preditivos que direcionam as melhores combinações das variáveis para a obtenção de inativações bacterianas eficientes e manutenção do fermento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[017] As Figura IA e 1B representam graficamente a superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para redução decimal (yLA Log UFC/mL) em função do pH e temperatura (°C), apresentando as respostas dos experimentos para a inativação bacteriana através da lavagem ácida com ácido fosfórico.

[018] As Figuras 2A e 2B representam graficamente a superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para manutenção da viabilidade da levedura (Vf/VOLA) em função do pH e temperatura (°C), apresentando as respostas dos experimentos para a manutenção da viabilidade através da lavagem ácida com ácido fosfórico.

[019] As Figuras 3A e 3B representas graficamente a superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para redução decimal (γΟΙ Log UFC/mL) em função de mg/L e temperatura (°C), apresentando as respostas dos experimentos para a inativação bacteriana através da lavagem com dióxido de cloro.

[020] As Figuras 4A e 4B representam graficamente a superfície de resposta (a) e curvas de contorno (b) para manutenção da viabilidade da levedura (Vf/VOCl) em função da mg/L e temperatura (°C), apresentando as respostas dos experimentos para a inativação bacteriana através da lavagem com dióxido de cloro.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[021] A presente invenção trata-se de métodos de otimização da lavagem para inativação de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro.

[022] Os métodos da presente invenção são capazes de determinar condições ótimas na lavagem do fermento cervejeiro em função dos seguintes parâmetros: pH, concentração de dióxido de cloro ou de ácido, temperatura. Método de Lavagem Ácida [023] A presente invenção trata-se de um método de otimização da lavagem para inativação de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro, empregando ácido fosfórico e compreendendo as seguintes etapas: Etapa 1 - Calcular o impacto do pH e temperatura, na eficiência da redução de micro-organismos deterioradores (número de reduções decimais, log UFC/mL) por meio da equação 1: (Equação 1) Sendo: - Yla - número de reduções decimais do micro-organismo alvo (log UFC/mL) na lavagem ácida. - pH - pH da solução de cerveja e levedura ao adicionar ácido fosfórico. - T - temperatura da solução de cerveja e levedura. Etapa 2 - Calcular o impacto, do mesmo pH e temperatura utilizado na etapa 1, na porcentagem da razão entre a viabilidade final e inicial da levedura, por meio da equação 2: (Equação 2) Sendo: - ÍV_f/V_0 3 _LA - razão entre a viabilidade ao final do processo e a viabilidade no inicio da lavagem ácida com ácido fosfórico. - pH - pH da solução de cerveja e levedura ao adicionar ácido fosfórico. - T - temperatura da solução de cerveja e levedura. Método de Lavagem com dióxido de cloro [024] A presente invenção trata-se de um método de otimização da lavagem para inativaçâo de micro-organismos deterioradores do processo fermentativo cervejeiro, empregando dióxido de cloro (C102) e compreendendo as seguintes etapas: Etapa 1 - Calcular o impacto da concentração de dióxido de cloro e temperatura, dentro da faixa avaliada, na eficiência da redução do contaminante (número de reduções decimais, log UFC/mL) por meio da equação 3: (Equação 3) Sendo: - y_Cl- número de reduções decimais do micro-organismo alvo (log UFC/mL) na lavagem com dióxido de cloro. - mg/L- concentração em miligramas por litro de dióxido de cloro na solução de cerveja e levedura. - T - Temperatura da solução de cerveja e levedura.

Etapa 2 - Calcular o impacto, da mesma concentração de dióxido de cloro (mg/L) e temperatura utilizado na etapa 1, na porcentagem da razão entre a viabilidade final e inicial da levedura, por meio da equação 4: (Equação 4) Sendo: ÍV_f/V_0] _Cl~ razão entre a viabilidade ao final do processo e a viabilidade no inicio da lavagem com dióxido de cloro. - mg/L- concentração em miligramas por litro de dióxido de cloro na solução de cerveja e levedura. - T - Temperatura da solução de cerveja e levedura.

Exemplo de Concretização Micro-organismos e condições de cultivo [025] A cepa de bactéria lática utilizada nessa invenção foi L. brevis DSM 6235. A cepa de levedura S. cerevisiae Saflager W-35/70 (Fermentis©) , amplamente utilizada no processo de fabricação de cerveja. As culturas foram mantidas congeladas a -20°C em criotubos contendo meio MRS (de Man, Rogosa and Sharp - Merck 1.10661, Darmstadt, Alemanha) para L. brevis e YPD (1% p/v extrato de levedura, 2% p/v peptona bacteriológica e 2% p/v D-glicose) para a levedura.

[026] Para as cepas de L. brevis DSM 6235, uma subcultura foi preparada ao inocular 10 mL de caldo MRS, seguindo-se incubação a 30°C por 24h. Essas subculturas foram inoculadas em frascos de 250 mL contendo 90 mL de caldo MRS, seguindo-se incubação a 30°C sob agitação constante (150 rpm por 24h, Orbital shaker incubator G24, New Brunswick Scientific Co., Inc, Edison, NJ, USA). As células foram recuperadas por centrifugação (14000g, 10 min, 4°C) (Thermo Scientific centrifuge Heraeus Multifuge X3, Waltham, MA, USA) e lavadas 2 vezes com solução estéril de tampão fosfato salina PBS (pH 5,6). Após a lavagem, o pellet de células foi suspendido em PBS (pH 5,6) a uma concentração de aproximadamente 1010 UFC/mL. Para S. cerevisiae Saflager W-35/70, uma subcultura foi preparada ao inocular 10 mL de mosto cervejeiro (12° Plato), seguindo-se incubação a 25°C por 24 horas. Essa subcultura foi inoculada em frasco contendo 290 mL de mosto (12°Plato), seguindo-se outro período de incubação sob agitação (150 rpm) a 25°C por 24 horas. 0 inoculo de levedura foi após a centrifugação (4800 x g, 5 min, 4°C), sendo a taxa de inoculação de 0,35g de peso úmido de levedura para cada 100 mL de mosto a 12° Plato (-1,2x107 UFC/mL).

Condições da fermentação [027] Fermentações estáticas (1000 mL de mosto a 12° Plato) foram realizadas em frascos de 2000 mL incubados a 15 °C por 168 horas. O mosto lupulado (9 IBU), com 20% de maltose de milho, 12° Plato (OG 1.048) e a pH 5,6, foi produzido e doado por uma cervejaria localizada na região de Campinas, SP, Brasil. Todos os experimentos foram realizados com uma mesma batelada de mosto. Depois de fervido, no final do processo de mosturação, o mosto foi resfriado a 4°C e reservado em frascos de 2000 mL a -20°C. Antes do experimento o mosto foi fundido e pasteurizado a 60°C por 20 minutos. Em seguida os frascos contendo mosto foram inoculados com S. cerevisiae Saflager W-35/70, com a taxa descrita no item anterior, seguindo-se incubação a 15°C por 168 horas. Amostras de mosto não inoculado constituíram o controle negativo.

Regimes de lavagem [028] Após 7 dias de fermentação e estabilização do consumo de açúcares fermentescíveis, mensurados através da avaliação da redução do °Brix (PAL-1, ATAGO, Tokyo, Japão), as células de levedura foram recuperadas por centrifugação (4,000 x g por 10 min). A seguir as células foram re- suspendidas no próprio sobrenadante da fermentação (cerveja não maturada) na proporção de lg de células (massa úmida) para 5 mL de sobrenadante. Então, a suspensão de leveduras foi alocada em um biorreator encamisado, seguindo-se resfriamento a 4°C com o uso de um banho ultratermostatizado com circulação (MA-184, MARCONI, Piracicaba, SP, Brasil). 0 conteúdo do biorreator foi continuamente homogeneizado através de agitador magnético.

[029] Para os regimes de lavagem ácida realizados, ácido fosfórico 85%, de grau alimentício, foi adicionado à suspensão até a condição apresentada na tabela 1. 0 tratamento foi aplicado por 120 min, sendo que o tempo foi contado a partir do momento em que a temperatura e pH (AK103, AKSO, São Leopoldo, RS, Brasil) desejados foram atingidos. Para o regime de lavagem com o agente sanificante, dióxido de cloro líquido (Sealed Air Corporation, Brasil) foi adicionado a suspensão até as condições apresentadas na tabela 3. O tratamento foi aplicado por 30 min, contados a partir do momento em que a temperatura e concentração do sanitizante foram atingidos.

Enumeração de micro-organismos [030] No tempo inicial (N0) e no final do tratamento (Nf), amostras de lmL foram coletadas, seguindo-se diluições decimais em PBS pH 5.6, e plaqueamento em MRS ágar para contagem de bactérias láticas (30°C/72h). Após período de incubação, as colônias foram enumeradas e os resultados expressos como unidades formadoras de colônias (UFC) por mL, para cada ponto de amostragem. A viabilidade da levedura foi aferida, tanto nos pontos iniciais (N0), quanto finais (Nf) de todos os experimentos, através do método de coloração por azul de metileno e contagem de células por câmara de Neubauer Delineamento experimental, análises estatísticas e validação dos métodos desenvolvidos [031] Dois delineamentos compostos centrais rotacionais (DCCR) foram adotados visando-se a otimização das lavagens e obtenção de métodos de segunda ordem capazes de predizerem a eficiência da inativação das bactérias láticas (contaminantes do fermento) (número de reduções decimais, γ, em log UFC/mL), ao mesmo tempo que resultavam em manutenção da viabilidade da levedura cervejeira (ratio entre viabilidade final e a inicial da levedura cervejeira - Vf/VO). Os DCCR's foram compostos de um delineamento fatorial 22, 4 pontos axiais e 3 pontos centrais; totalizando 11 experimentos independentes cada (2k + 2*k + 3n0) . Os níveis desses delineamentos estão apresentados nas tabelas 1 e 3. As tabelas 1 e 3 apresentam as matrizes com os valores reais e codificados para cada variável analisada. Para a análise estatística dos dados e a geração de gráficos de superfície de resposta, o software STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA) e Protimiza Experimental design (Protimiza Inc, Campinas, SP, Brasil) foram utilizados. A qualidade de ajuste da equação do método preditivo foi expressa pelo coeficiente de determinação (R2) e sua significância estatística foi determinada pelo F test (Analise de variância - ANOVA).

RESULTADOS

Otimização da lavagem ácida [032] Os resultados dos processos de lavagem ácida do fermento cervejeiro em função do pH e temperatura são mostrados na tabela 1.

[033] A tabela 1 abaixo representa o DCCR com os valores reais e codificados para as respostas de redução decimal (yLA) em Log UFC/mL e ratio viabilidade final e inicial (Vf/VOLA) da lavagem ácida.

Tabela 1: [034] Pode-se observar que a variação de pH e temperatura de lavagem ácida impactou no número de reduções decimais (yLA) e ratio da viabilidade final e inicial (Vf/VOLA). De um modo geral, quanto menor o pH da solução de lavagem, maior o valor de yLA. De acordo com os resultados mostrados na tabela 1, a condição que resultou em valores maiores de yLA e Vf/VOLA foi a conduzida com pH 1.3 e temperatura de 2.1°C. Neste experimento, o yLA obtido foi de 6,9 Log UFC/mL e a Vf/VOLA foi de 98,9 % (tabela 1). Por outro lado, as condições que resultaram em menores yLA após 120 min de tratamento (0,2, 0,9, 1,6 e 2,7 log UFC/mL), foram os experimentos 6, 2, 4 e 7, respectivamente. Já os experimentos 3 e 5 resultaram nos piores valores de viabilidade do fermento cervejeiro: 22,3 e 29,5 %, respectivamente. Ao se analisar os resultados obtidos nos experimentos conduzidos com pH 1.3 e temperatura de 2.1°C e 7.1°C, pode-se observar que a temperatura parece ter um papel relevante na perda da viabilidade do fermento cervejeiro em baixos valores de pH. Por outro lado, quando o pH da lavagem ácida foi igual a 2.7, observou-se que a variação da temperatura não impactou na perda de viabilidade do fermento (tabela 1).

[035] Os valores de yLA e Vf/VOLA do fermento cervejeiro, obtidos quando os experimentos foram conduzidos nas condições descritas nos pontos centrais (9-11), apresentaram pequena variação, indicando, portanto, boa reprodutibilidade dos dados.

[036] A tabela 2 apresenta os resultados do teste de significância para os coeficientes de regressão do método polinomial da lavagem ácida para redução decimal e ratio da viabilidade.

[037] Sendo os valores de maior significância os que apresentam p-valores menores que 0,1. Os resultados indicam que os coeficientes mais significativos, para yLA, foram os quadráticos para pH e temperatura, sendo ambos responsáveis pela redução do valor de yLA. Nenhum efeito significativo para yLA foi observado pela interação de pH e temperatura (p > 0,1). Isso sugere que a interação entre essas variáveis não afeta o yLA. Para a ratio viabilidade todos os coeficientes se mostraram significativos (p < 0,1), porem o coeficiente linear de pH apresentou um grande impacto no aumento do ratio viabilidade, já os coeficientes pH quadrático e temperatura linear apresentaram influências significativamente semelhantes na redução do ratio (p < 0,1) . Para viabilidade a interação entre as variáveis pH e temperatura se mostrou significativa (p < 0,1), portanto a interação dessas variáveis influência a resposta do parâmetro em questão. Apesar de alguns coeficientes não se mostrarem significativos através dos testes estatísticos empregados, todos foram mantidos nos métodos polinomiais obtidos. As equações 1 e 2 demonstram métodos descrevendo os efeitos do pH e temperatura nos valores de yLA e ratio viabilidade para a lavagem ácida da levedura cervejeira: (Equação 2) [038] As figuras 1 e 2 apresentam as superfícies de resposta referentes aos métodos polinomiais de segunda ordem para yLA e ratio da viabilidade (Vf/VOLA), respectivamente. Para que a lavagem ácida seja considerada eficiente, a levedura deve apresentar uma manutenção da sua viabilidade e a eficiência da redução do contaminante deve ser máxima. Portanto, para se definir as melhores condições, as figuras 1 e 2 devem ser analisadas simultaneamente. Com isso, as análises das figuras revelam que as melhores condições para a inativação se encontram nas faixas de pH 1,3 a 2 e de temperatura entre 1 a 5 °C. Porém, combinações de baixos pH e temperaturas mais elevadas reduzem consideravelmente a porcentagem de células viáveis de leveduras.

[039] Para a variável dependente yLA os resultados apresentaram excelente correlação e o coeficiente de determinação foi de 0,97 e o Fcalc foi de 32,8 (Ftabelado = 3,4). Para a variável Vf/VOLA o coeficiente de determinação foi de 0,87 e o Fcalc foi de 7,2 (Ftabelado = 3,4), sendo esses valores satisfatórios, tendo em vista que o processo envolve variáveis biológicas. Para ambas variáveis dependentes o Fcalc foi maior que o Ftabelado, o que tornou possível a geração de superfícies de resposta e a obtenção de métodos. Esses métodos são considerados preditivos e estatisticamente significativos a um intervalo de confiança de 90%.

Otimização da Lavagem com dióxido de cloro [040] O delineamento composto central rotacional (DCCR) para lavagem com dióxido de cloro líquido (C102(L)) com as variáveis independentes mg/L e temperatura (°C); e as variáveis dependentes γΟΙ (Log UFC/mL) e Vf/VOCl, estão apresentadas na tabela 3.

[041] A tabela 3 abaixo representa o DCCR com os valores reais e codificados para as respostas de redução decimal (yCl) em Log UFC/mL e ratio viabilidade final e inicial (Vf/VOCl) da lavagem com dióxido de cloro.

Tabela 3: [042] O melhor resultado obtido, para a combinação entre eficiência de inativaçâo do contaminante e manutenção da viabilidade da levedura, foi de 5,3 Log UFC/mL (NO ~108 UFC/mL) e 98,4%; no experimento 7 (tabela 3). Por outro lado, os piores resultados para inativaçâo do contaminante foram: 0,2 e 1,7 UFC/mL, em 30 min de tratamento, para os experimentos 1 e 5, respectivamente. Para Vf/VOCl, os piores experimentos foram os 4, 6 e 8, sendo a ratio 52,5, 87,5 e 86,6%, respectivamente. Os pontos centrais (9-11) apresentaram pequena variação, indicando boa reprodutibilidade dos dados experimentais.

[043] A tabela 4 abaixo apresenta os resultados do teste de significância para os coeficientes de regressão do método da lavagem com dióxido de cloro para redução decimal e ratio da viabilidade.

[044] Sendo os valores de maior significância os que apresentam p-valores menores que 0,1. Quando observado os valores obtidos para yCl, os resultados indicam que somente o coeficiente de temperatura linear não foi significativo (p > 0,1), sendo o p-valor, aproximadamente 10 vezes maior do que o limiar estabelecido. O coeficiente de regressão para a interação entre mg/L e temperatura, apesar de ter um pequeno efeito, foi significativo (p <0,1) para a redução do valor de yCI. Sugerindo que a interação dessas variáveis afeta de forma negativa o valor de yCI. Para a Vf/VOCl todos os coeficientes se mostraram significativos (p < 0,1), sendo os coeficientes lineares de temperatura e mg/L, os que apresentaram o maior impacto no aumento da variável. Sendo os métodos obtidos através dos valores reais, todos os coeficientes foram mantidos. As equações 3 e 4 demonstram os métodos descrevendo os efeitos de mg/L e temperatura nos : valores de yCl e Vf/VOCl para a lavagem com dióxido de cloro: [045] Sendo os valores de maior significância os que apresentam p-valores menores que 0,1. Quando observado os valores obtidos para γΟΙ, os resultados indicam que somente o coeficiente de temperatura linear não foi significativo (p > 0,1), sendo o p-valor, aproximadamente 10 vezes maior do que o limiar estabelecido. O coeficiente de regressão para a interação entre mg/L e temperatura, apesar de ter um pequeno efeito, foi significativo (p <0,1) para a redução do valor de γΟΙ. Sugerindo que a interação dessas variáveis afeta de forma negativa o valor de γΟΙ. Para a Vf/VOCl todos os coeficientes se mostraram significativos (p < 0,1), sendo os coeficientes lineares de temperatura e mg/L, os que apresentaram o maior impacto no aumento da variável. Sendo os métodos obtidos através dos valores reais, todos os coeficientes foram mantidos. As equações 3 e 4 demonstram os métodos descrevendo os efeitos de mg/L e temperatura nos valores de γΟΙ e Vf/VOCl para a lavagem com dióxido de cloro: (Equação 4) [046] A figura 3 e 4 apresentam as superfícies de resposta referentes aos métodos polinomiais de segunda ordem para yCI e ratio da viabilidade (Vf/VoCl), respectivamente. Para se considerar o processo de lavagem com dióxido de cloro otimizado, deve-se encontrar condições em que a levedura apresente uma manutenção da sua viabilidade (>90%) e a redução do contaminante seja a mais alta possível. Para se identificar as condições idéias, as figuras devem ser analisadas simultaneamente. Portanto, ao se analisar as figuras, observa-se que as condições mais eficientes para a lavagem se encontram nas faixas de 22 a 50 mg/L e entre 5 a 22°C. De forma oposta, combinações de temperaturas mais próximas do ponto máximo em avaliação, aliado a altas concentrações do sanitizante reduzem de forma expressiva a viabilidade do fermento cervejeiro.

[047] Para a variável dependente yCl os resultados apresentaram excelente correlação e o coeficiente de determinação foi de 0,9 e o Fcalc foi de 10,1 (Ftabelado = 3,45). Para a variável Vf/VOCl o coeficiente de determinação foi de 0,8 e o Fcalc foi de 4,1 (Ftabelado = 3,4), sendo esses valores satisfatórios, tendo em vista que o processo envolve variáveis biológicas. Para ambas variáveis dependentes o Fcalc foi maior que o Ftabelado, o que tornou possível a geração de superfícies de resposta e a obtenção de métodos. Esses métodos são considerados preditivos e estatisticamente significativos a um intervalo de confiança de 90%.

VALIDAÇÃO DOS MÉTODOS PREDITIVOS

[048] Os métodos preditivos foram verificados através da realização de 4 experimentos com combinações aleatórias de pH/temperatura e mg/L/temperatura dentro da faixa avaliada nos DCCR's (tabelas 5 e 6).

[049] A tabela 5 abaixo representa os Testes de validação dos métodos preditivos para a Lavagem ácida.

Tabela 5: a - valores preditos pelo método / b - valores experimentais [050] A tabela 6 abaixo representa os Testes de validação dos métodos preditivos para a Lavagem com dióxido de cloro.

Tabela 6; a - valores preditos pelo método / b - valores experimentais [051] Todos os experimentos permitiram observar que os métodos são válidos. Os fatores Bias para as lavagens indicou predições seguras (yLA: 0,93 / Vf/V0LA:0,99 - γΟΙ: 1,0 / Vf/VOCl: 0,99), e os fatores de exatidão (yLA: 1,12 / % Vf/VOLA: 1,01 - γΟΙ: 1,08 / % Vf/VOCl: 1,03) mostraram um desvio de no máximo 12% para uma das variáveis resposta avaliadas.

[052] Ao se observar a tabela 5, relacionada à lavagem ácida, podemos inferir que os experimentos 1, 3 e 4 indicam que a predição do método é considerada "fail-safe" e o experimento 2 sugere um pequeno desvio de predição. Na tabela 6, referente a lavagem com dióxido de cloro, os experimentos 2 e 3 demonstram que o método para redução decimal é considerado "fail-safe". Porém os experimentos 1 e 4 apresentaram pequenos desvios de predição. Em relação a predição da viabilidade, para os 4 experimentos houve uma pequena tendência do método a um caráter "fail-dangerous".

Otimização da Lavagem ácida [053] A otimização do processo da lavagem ácida se deu através da averiguação do impacto de diferentes combinações das variáveis independentes pH e temperatura (°C) nas variáveis dependentes redução decimal do contaminante (yLA) e ratio da viabilidade da levedura cervejeira (Vf/VOLA). Para tanto, a abordagem do delineamento central composto rotacional (DCCR) foi utilizada. Com isso, pode-se observar que combinações de valores de pH baixos e altas temperaturas são eficientes para a redução do contaminante. Por exemplo, os valores de YLA alcançados, como 6,9, 6,6 e 7,0 Log UFC/mL, nos experimentos 1, 3 e 5, respectivamente (tabela 1) . Sendo o pKa do ácido fosfórico 2,1, uma solução que apresente um pH próximo desse valor será constituída por um equilíbrio entre formas dissociadas e não dissociadas. Por outro lado, quando o pH da solução se encontra abaixo de 2,1, ocorre um desiquilíbrio que aumenta a concentração das formas não dissociadas. Com isso, ocorre um maior fluxo da forma não dissociada para o interior da célula bacteriana. A eficiência da inativação bacteriana, nas condições de pH extremamente baixos pode, também, estar relacionado a presença dos iso-alfa-ácidos. Os iso-alfa-ácidos são ácidos fracos componentes do lúpulo, sendo reconhecidos como os principais agentes antimicrobianos naturalmente presentes na cerveja. Portanto, a redução do pH no tratamento pode ter favorecido um maior fluxo desses ácidos fracos para o interior do citoplasma bacteriano, aumentando a eficiência da inativação.

[054] Apesar da relação de maior eficiência de yLA a menores valores de pH, quando observamos o impacto na variável dependente Vf/VOLA, a temperatura se torna um fator de extrema relevância. Esse impacto pode ser observado, principalmente, nas diferenças da viabilidade final obtida entre os experimentos 1 e 3 (tabela 1). No experimento 1, a combinação de um baixo valor de pH (1,3) e uma baixa temperatura (2,1°C) proporcionou uma condição de tratamento eficiente, onde a eficiência de redução do contaminante foi uma das mais altas da presente invenção (6,9 Log UFC/mL), e a porcentagem da relação entre a viabilidade final e inicial se manteve alta (98,7). Por outro lado, no experimento 3, uma variação de 3,6 vezes a temperatura gerou uma viabilidade 4,4 vezes menor, mas como uma redução decimal semelhante.

[055] A faixa de concentração do sanitizante avaliada foi de 1 a 200 mg/L através da técnica de concentração mínima inibitória (CMI). Dentre as bactérias avaliadas, Bacillus subtilis apresentou a menor CMI, sendo inibida a 10 mg/L de C102 e Lactobacillus plantanarum a maior, com um CMI de 125 mg/L. A levedura cervejeira foi afetada em concentrações superiores a 50 mg/L, porém a sensibilidade a diferentes concentrações se mostrou dependente da cepa de levedura avaliada.

Otimização da Lavagem com dióxido de cloro [056] Na presente invenção, a otimização do processo da lavagem com dióxido de cloro se deu através da averiguação do impacto de diferentes combinações das variáveis independentes mg/L e temperatura (°C), nas variáveis dependentes redução decimal do contaminante iyCl) e viabilidade da levedura cervejeira (Vf/VOCl). Para isso a abordagem do delineamento central composto rotacional (DCCR) foi utilizada. Com isso, pode-se observar que dentre as faixas avaliadas, altas concentrações aliadas a altas temperaturas são mais eficientes em reduzir a população do contaminante. Por exemplo, os valores de yCI atingidos, como 6,4, 6,3 e 6,2 Log UFC/mL, nos experimentos 8, 6 e 4, respectivamente (tabela 3). Os experimentos 1 e 3 demonstram claramente que a temperatura do tratamento tem um impacto direto na eficiência do sanitizante em relação a redução do contaminante (tabela 3) . No experimento 1, a baixa temperatura, reduziu a eficiência do sanitizante para quase zero. Por outro lado, no experimento 3, com a mesma concentração de sanitizante a uma temperatura 2,7 vezes maior, a redução foi de 5,1 Log UFC/mL.

[057] Assim como observado na otimização da lavagem ácida, o impacto do tratamento na variável dependente Vf/VOCl está diretamente ligada a temperatura. Concentrações altas do sanitizante em paralelo com temperaturas mais altas se mostraram negativas na manutenção da viabilidade da levedura. Esse resultado pode ser observando, principalmente, nas diferenças da viabilidade final obtida entre os experimentos 2 e 4 (tabela 3). No experimento 2, a combinação de uma alta concentração (78 mg/L) e uma baixa temperatura (8°C) proporcionou uma condição de tratamento eficiente. Nesse caso a redução do contaminante foi de 5,3 Log UFC/mL e a porcentagem da relação entre a viabilidade final e inicial foi de 95,5. Por outro lado, no experimento 4, uma variação de +14°C gerou uma viabilidade 1,8 vezes menor.

[058] Através dos dados da presente invenção é possível afirmar que a utilização do DCCR como ferramenta para se avaliar faixas de tratamentos químicos para a redução de micro-organismos contaminantes do processo, assim como entender o impacto do mesmo na viabilidade de leveduras, se provou uma ferramenta eficaz. A presente invenção tem como foco em buscar a otimização de processos de sanitização das leveduras de inoculação da indústria cervejeira. Proporcionou o entendimento de como o pH e a concentração do sanitizante aliado à variação da temperatura impactam na eficiência de redução do contaminante e na manutenção da viabilidade da levedura cervejeira. Além de que, esses métodos possibilitaram a produção de métodos preditivos validados, que podem ser utilizados para se definir protocolos de lavagem dentro do ambiente industrial.

REIVINDICAÇÕES

Claims (2)

1. MÉTODO DE OTIMIZAÇÃO DA LAVAGEM PARA INATIVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS DETERIORADORES DO PROCESSO FERMENTATIVO CERVEJEIRO caracterizado por determinar o impacto do pH e temperatura para lavagem ácida e compreender as seguintes etapas: a) calcular o número de reduções decimais do micro- organismo alvo, log UFC/mL por meio da equação: b) calcular a porcentagem da razão entre a viabilidade final e inicial da levedura, por meio da equação:

2. MÉTODO DE OTIMIZAÇÃO DA LAVAGEM PARA INATIVAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS DETERIORADORES DO PROCESSO FERMENTATIVO CERVEJEIRO caracterizado por determinar o impacto da concentração do dióxido de cloro e temperatura para lavagem com dióxido de cloro, e compreender as seguintes etapas: a) calcular o número de reduções decimais do micro- organismo alvo, log UFC/mL por meio da equação: b) calcular a porcentagem da razão entre a viabilidade final e inicial da levedura, por meio da equação: