CN107002107A - 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由木质纤维素材料制备糖和/或发酵产物的方法。

Description

酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
发明领域
本发明涉及酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法。
发明背景
木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，并且为产生化石燃料的替代能源提供了有吸引力的平台。该材料可大量获得，并可被转化为有价值的产品，例如糖或生物燃料，诸如生物乙醇。
从木质纤维素材料生产发酵产物是本领域已知的，其通常包括预处理、水解、发酵和任选的回收发酵产物的步骤。
在水解(其可包括液化、预糖化和/或糖化步骤)期间，木质纤维素材料中存在的纤维素通过纤维素分解酶被部分(通常30-95％，依赖于酶活性和水解条件)转化为还原糖。水解通常在45-50℃的升高的温度和非无菌条件下在持续6-168小时的过程中进行(参见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。
通常，随后通过微生物(例如，酵母)将糖转化为有价值的发酵产物(例如，乙醇)。发酵在同一容器或不同容器中在单独的(优选厌氧的)方法步骤中进行。将发酵期间的温度调节至30-33℃以适应微生物(通常为酵母)的生长和乙醇生产。在该发酵过程期间，通过自水解步骤已存在的酶，剩余的纤维素材料被转化为还原糖，同时产生微生物生物质和乙醇。一旦纤维素材料被转化为可发酵糖并且所有可发酵糖被转化为乙醇、二氧化碳和微生物生物质，发酵完成。这可耗费长达6天。水解和发酵的总过程时间通常可达到13天。
通常，酶生产成本是来自木质纤维素材料的发酵产物的总生产过程中的主要成本因素(参见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。迄今为止，通过应用来自单一微生物来源或来自多种微生物来源(参见WO 2008/008793)的具有更宽和/或更高(比)水解活性的酶产物来实现酶生产成本的降低。这导致更低的酶需求、更快的转化速率和/或更高的转化产率，和因此更低的总生产成本。
除了优化酶之外，优化工艺设计也是降低发酵产物生产总成本的重要手段。
出于经济原因，因此期望包括新颖、创新的工艺配置，所述工艺配置旨在降低涉及木质纤维素材料的水解和发酵的方法中的总生产成本。
发明概述
本发明的一个目标是提供经改进的由木质纤维素材料制备糖产物和/或发酵产物的方法。另一目标是提供涉及水解的方法，其中水解的工艺条件被优化。优化存在于任何以下特征中。
本发明中进行的水解过程包括至少两个步骤：其中在第一温度下进行酶促水解的步骤和其中在第二温度下进行酶促水解的第二步骤，其中第二温度低于第一温度。在至少部分第二步骤期间，将氧加入水解中。
氧不仅刺激葡聚糖水解，还导致酶失活。这种失活可以通过在较低温度下应用氧来限制。在低温下应用氧对葡聚糖水解没有负面影响。因此，在低于最佳酶性能温度的温度下应用氧(通气)是有益的。
如果在最佳酶性能温度(最低可能酶失活时最高酶性能)下应用氧，那么非常精确仔细的氧添加和控制是必不可少的。这很困难且相较于降低温度下的氧添加更加昂贵，因为在低温下，酶失活有限或者甚至不存在。因此，降低温度下的氧添加允许廉价且易于控制的氧添加。
大规模乙醇生产设备通常含有数个木质纤维素原料水解容器(往往并行运行)以及数个于其中生产乙醇的发酵容器。为了降低成本，大规模乙醇生产设备通常只含有一个热交换器，以将水解后的生物质冷却至合适的发酵温度。如果在热交换器之后且在发酵之前应用氧添加，则仅需要一个氧添加系统。这种方案比将氧添加到每个单独的水解容器中便宜得多。
在乙醇发酵过程之前，可以将低温(例如，发酵温度)下的氧添加与酵母增殖相结合。因此，酵母增殖的增殖步骤可以与根据本发明的方法的第二阶段相结合。
降低温度下的氧添加导致降低的木质素氧化和因此减少的pH下降。所以，pH控制可以是非必要的。
发明详述
贯穿本说明书和所附权利要求书，词语“包括”和“包含”及其变型均被解释为包括性的。即，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可包括未具体指出的其他要素或整体。在本文中不使用数量词修饰时，指代一个/种或多于一个/种的(即，一个/种或至少一个/种的)对象。举例来说，“要素”可表示一个/种要素或多于一个/种的要素。
在液化和糖化相结合的情况下，第一阶段中使用的一个或多个容器被称为第一容器，第二阶段中使用的一个或多个容器被称为第二容器，发酵中使用的一个或多个容器被称为第三容器。在液化和糖化是分离的步骤的情况下，用于液化的一个或多个容器称为第一容器，糖化中使用的一个或多个容器称为第二容器，第二阶段中使用的一个或多个容器称为第三容器，发酵中使用的一个或多个容器称为第四容器。
第二阶段中使用的容器可以是容器，但也可以是管或任何其它连续系统。第二阶段也可以于发酵开始之前在一个或多个发酵容器中进行。氧可以通过鼓泡引入，但也可以通过从顶部充入一个或多个容器来引入，使得水解物下落进而将足够的氧引入水解物中。在一种实施方式中，在添加发酵微生物之前添加氧。第二阶段也可以在用于发酵微生物增殖的一个或多个容器(增殖容器)中进行。氧可以通过鼓泡引入，但也可以通过从顶部充入一个或多个增殖容器来引入，使得水解物下落进而将足够的氧引入水解物中。
本发明涉及由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物在一个或多个容器中酶促水解木质纤维素材料以获得糖产物，其中酶促水解至少包括：第一阶段，其中在第一温度下进行酶促水解；和第二阶段，其中在第二温度下进行酶促水解，其中第二温度低于第一温度，并且其中在至少部分第二阶段期间，将氧加入水解中。
本发明还涉及由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行如上所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法，(b)发酵糖产物以产生发酵产物，和(c)任选地，回收发酵产物。
在一种实施方式中，本发明的方法包括第一阶段，其中在第一温度下进行酶促水解。所述第一温度为50-90℃、优选地52-80℃、更优选地55-75℃、最优选地57-65℃。
根据本发明的方法的第一阶段可以是酶促水解，其中液化和糖化相结合。在一种实施方式中，第一阶段是无氧的。或者，根据本发明的方法的第一阶段可以是酶促水解，其中液化和糖化是分离的步骤。液化和糖化可以在不同的温度下进行，但也可以在单一温度(例如上述第一温度)下进行。在一种实施方式中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选在65-75℃的温度下进行，糖化优选在50-65℃的温度下进行。
本发明还涉及由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物在一个或多个容器中酶促水解木质纤维素材料以获得糖产物，其中所述酶促水解至少包括(a)第一阶段，所述第一阶段包括液化步骤和糖化步骤，其中所述液化步骤在第一温度下进行，所述糖化步骤在第二温度下进行，其中所述第二温度低于所述第一温度，和(b)第二阶段，其中酶促水解在第三温度下进行，其中所述第三温度低于所述第二温度，并且其中在至少部分第二阶段期间，将氧加入水解中。在一种实施方式中，第一阶段在一个或多个第一容器中进行。在一种实施方式中，第二阶段在一个或多个第二容器中进行。当液化和糖化是分离的步骤时，液化步骤可以在一个或多个第一容器中进行，并且糖化步骤可以在一个或多个第二容器中进行，并且第二阶段可以在一个或多个第三容器中进行。
在一种实施方式中，本发明的方法包括第二阶段，其中酶促水解在第二温度下进行。所述第二温度为20-49℃，优选地25-45℃，更优选地30-40℃。在其中液化和糖化是分离步骤的方法的情况下，第二阶段的温度被称为第三温度。在这种情况下，本发明的方法包括第二阶段，其中酶促水解在第三温度下进行。所述第三温度为20-49℃，优选地25-45℃，更优选地30-40℃。
在根据本发明的方法中，可以将木质纤维素材料添加到一个或多个第一容器中。在一种实施方式中，在添加木质纤维素材料之前，包含至少两种纤维素酶的酶组合物已经存在于一个或多个第一容器中。在另一种实施方式中，可以将包含至少两种纤维素酶的酶组合物添加到一个或多个第一容器中。在一种实施方式中，在添加包含至少两种纤维素酶的酶组合物之前，木质纤维素材料已经存在于一个或多个第一容器中。在一种实施方式中，将木质纤维素材料和包含至少两种纤维素酶的酶组合物同时添加到一个或多个第一容器中。存在于一个或多个第一容器中的酶组合物可以是含水组合物。
可以对本发明方法中使用的木质纤维素材料进行洗涤和/或预处理。
在一种实施方式中，在根据本发明的方法的第一阶段之后添加另外的酶。可以在第二阶段之前或期间添加另外的酶。在第一阶段包括单独的液化步骤和糖化步骤的情况下，可以在液化步骤期间和/或之后加入另外的酶。可以在糖化步骤之前和/或期间加入这些另外的酶。还可以在糖化步骤之后、在第二阶段之前和/或第二阶段期间，添加另外的酶。
在一种实施方式中，第一阶段需要12-200小时，优选地18-120小时，更优选地24-72小时。在其中液化和糖化是分离步骤的方法的情况下，液化步骤需要2-24小时，优选地4-18小时，更优选地4-12小时且/或糖化步骤需要10-200小时，优选地24-120小时小时，更优选地24-72小时。
在一种实施方式中，第二阶段需要2-72小时，优选地4-48小时，更优选地8-24小时。
在一种实施方式中，总水解时间(即第一阶段和第二阶段的时间)为14小时或更长、16小时或更长、18小时或更长、20小时或更长、30小时或更长、40小时或更长、50小时或更长、60小时或更长、70小时或更长、80小时或更长、90小时或更长、100小时或更长。
在一种实施方式中，总水解时间(即第一阶段和第二阶段的时间)为14-272小时、16-248小时、优选地20-224小时。由于酶组合物的稳定性，较长的水解反应时间可以具有相应较高的糖产率。
在根据本发明的方法中液化和糖化相结合的情况下，一个或多个第一容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10-1000cP之间、10-900cP之间、10-800cP之间、10-700cP之间、10-600cP之间、10-500cP之间、10-400cP之间、10-300cP之间、10-200cP之间、优选地10-100cP之间，且/或一个或多个第二容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10-1000cP之间、10-900cP之间、10-800cP之间、10-700cP之间、10-600cP之间、10-500cP之间、10-400cP之间、10-300cP之间、10-200cP之间、优选地10-100cP之间。
在根据本发明的方法中液化和糖化是分离的步骤的情况下，一个或多个第一容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10-1000cP之间、10-900cP之间、10-800cP之间、10-700cP之间、10-600cP之间、10-500cP之间、10-400cP之间、10-300cP之间、10-200cP之间、优选地10-100cP之间，且/或一个或多个第二容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10-1000cP之间、10-900cP之间、10-800cP之间、10-700cP之间、10-600cP之间、10-500cP之间、10-400cP之间、10-300cP之间、10-200cP之间、优选地10-100cP之间，且/或一个或多个第三容器中的木质纤维素材料的粘度保持在10-1000cP之间、10-900cP之间、10-800cP之间、10-700cP之间、10-600cP之间、10-500cP之间、10-400cP之间、10-300cP之间、10-200cP之间、优选地10-100cP之间。
可以在用于水解的温度下利用Brookfield DV III流变仪测定粘度。
在一种实施方式中，在至少部分第二阶段期间添加氧。可以在第二阶段连续或不连续地添加氧。在一种实施方式中，在第二阶段期间一次或多于一次添加氧。在一种实施方式中，可以在第二阶段的水解之前、在第二阶段的部分水解期间、在第二阶段的全部水解期间或其任何组合期间，添加氧。将氧添加到第二阶段中使用的一个或多个容器中。
可用多种形式添加氧。例如，氧可作为氧气、富氧气体(例如富氧空气)或空气而添加。也可以通过原位氧生成来添加氧。例如，可以通过电解生成氧，可以酶促地(例如通过添加过氧化物)产生氧，或可以用化学方法(例如通过氧生成体系，诸如KHSO5)产生氧。例如，通过过氧化氢酶由过氧化物产生氧。过氧化物可以以溶解的过氧化物的形式添加或通过酶促或化学反应生成。如果使用过氧化氢酶作为产生氧的酶，则可以使用用于水解的酶组合物中存在的过氧化氢酶或可以为此目的添加过氧化氢酶。
如何添加氧的实例包括但不限于通过以下方式添加氧：鼓泡、电解、化学添加氧、从顶部充入第二阶段中使用的一个或多个容器和/或用于发酵的一个或多个容器和/或用于发酵微生物增殖的一个或多个容器(将水解物投入罐中，从而将氧引入水解物中)以及将氧添加到所述一个或多个容器的顶部空间。将氧添加到容器的顶部空间时，可以提供水解反应所需的充足氧。通常，可以控制和/或改变添加到容器的氧的量。通过在所述容器中的部分水解时间期间仅添加氧，可以限制供应的氧。另一种选择是添加低浓度的氧，例如通过使用空气和再循环空气(离开容器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气。可以通过在水解时间的更长期间添加氧，通过添加较高浓度的氧或通过添加更多的空气来增加氧的添加量。控制氧浓度的另一种方法是添加耗氧剂和/或氧发生器。可以将氧引入(例如吹入)木质纤维素材料的液体水解容器内容物中。也可以将氧吹入容器的顶部空间。
在一种实施方式中，在将木质纤维素材料加入所述一个或多个容器之前和/或期间和/或之后，将氧添加到第二阶段中使用的一个或多个容器中。氧可以与进入水解容器的木质纤维素材料一起引入。氧可被引入将进入容器的材料流中，或者与通过容器的外环流的部分容器内容物一起引入。
在一种实施方式中，在第二阶段的酶促水解期间存在的木质纤维素材料中的氧浓度(DO)是至少0.0023mol/m3，优选地至少0.023mol/m3，更优选地至少0.046mol/m3，甚至更优选地至少0.115mol/m3，最优选地至少0.17mol/m3，特别地至少0.23mol/m3。0.23mol/m3对应于32℃时的100％DO。温度和压力会影响DO。
上文给出的优选的和示例性的mol/m3值涉及标准大气压和约32℃的温度。本领域技术人员基于本教导能够领会到有利的DO值。
在酶促水解中，无定形和结晶多糖或纤维素被水解为糖，例如葡萄糖。无定形多糖例如通过内切葡聚糖酶被转化为寡糖，然后寡糖可以通过纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶被转化为葡萄糖。结晶多糖的转化可以并行地或顺序地进行，甚至在大部分无定形多糖被水解时仍继续。在结晶多糖的水解期间，例如在将多糖降解为寡糖的过程中，与溶解性多糖单加氧酶组合加入氧是有益的。结晶葡聚糖结构可通过溶解性多糖单加氧酶打开。该类型的酶通过氧化糖苷键而打开该结构并使其可用于其他纤维素分解酶而进一步地将寡糖水解为葡萄糖。添加氧是非常有用的，尤其是在结晶多糖被酶转化的阶段。
本发明的方法显示出优势，尤其在中试工厂和工业规模时。在一种实施方式中，本发明的方法中使用的容器具有至少1m3的容积。优选地，所述容器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3的容积。通常，反应器小于3000m3或5000m3。本发明的方法中使用的容器可以具有相同的容积，但也可以具有不同的容积。
在一种实施方式中，本发明的方法中使用的酶组合物源自真菌，或本发明的方法中使用的酶组合物包含真菌酶。在一种实施方式中，酶组合物源自丝状真菌，或者所述酶组合物包含丝状真菌酶。“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CABInternational,University Press,Cambridge,UK中定义)。丝状真菌的特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖构成的菌丝壁。营养生长通过菌丝伸长进行，且碳分解代谢专性好氧。丝状真菌菌株包括但不限于Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Beauvaria、Cephalosporium、Ceriporiopsis、Chaetomiumpaecilomyces、Chrysosporium、Claviceps、Cochiobolus、Coprinus、Cryptococcus、Cyathus、Emericella、Endothia、Endothia mucor、Filibasidium、Fusarium、Geosmithia、Gilocladium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Myrothecium、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Podospora、Pyricularia、Rasamsonia、Rhizomucor、Rhizopus、Scylatidium、Schizophyllum、Stagonospora、Talaromyces、Thermoascus、Thermomyces、Thielavia、Tolypocladium、Trametes pleurotus、Trichoderma和Trichophyton的菌株。
丝状真菌的若干菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)),德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)),真菌生物多样性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))和农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL))。这些菌株的实例包括Aspergillus nigerCBS513.88、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO 4177、ATCC 1011、ATCC9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、P.chrysogenum CBS 455.95、Penicilliumcitrinum ATCC 38065、Penicillium chrysogenum P2、Talaromyces emersonii CBS393.64、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC26921或ATCC 56765或ATCC26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Chrysosporiumlucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500-D、ATCC44006和其衍生株。
本发明的方法有利地与源自Rasamsonia属的微生物的酶组合物组合使用，或者所述酶组合物包含Rasamsonia酶。
第一阶段的酶促水解优选在50-90℃进行。在该步骤中，优选热稳定的纤维素分解酶。本文所用的“热稳定”酶表示：酶的最适温度为50℃或更高，60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，85℃或更高。例如，它们可分离自嗜热微生物，或者可由本领域技术人员设计和人工合成。在一种实施方式中，多核苷酸可分离自或获自嗜热或耐热丝状真菌或者分离自非嗜热或非耐热但被发现热稳定的真菌。
“嗜热真菌”表示在50℃或更高的温度下生长的真菌。“耐热真菌”表示在45℃或更高(最大值接近50℃)的温度下生长的真菌。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是Humicola、Rhizomucor、Myceliophthora、Rasamsonia、Talaromyces、Thermomyces、Thermoascus或Thielavia细胞，优选地Rasamsonia细胞。优选的嗜热或耐热真菌是Humicola grisea var.thermoidea、Humicolalanuginosa、Myceliophthora thermophila、Papulaspora thermophilia、Rasamsoniabyssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia argillacea、Rasamsoniaeburnean、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cylindrospora、Rhizomucorpusillus、Rhizomucor miehei、Talaromyces bacillisporus、Talaromyces leycettanus、Talaromyces thermophilus、Thermomyces lenuginosus、Thermoascus crustaceus、Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus和Thielavia terrestris。
嗜热真菌不限于特定分类学等级并出现在真菌进化树各处。实例是Mucorales中的Rhizomucor，Sordariales中的Myceliophthora和Eurotiales中的Talaromyces、Thermomyces和Thermoascus(参见Mouchacca,1997)。Talaromyces物种大部分是嗜温的，但例外是Emersonii和Thermophila部分(section)的物种。Emersonii部分包括Talaromycesemersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces bacillisporus和Talaromyces leycettanus，它们全部在40℃下生长良好。Talaromyces bacillisporus耐热，Talaromyces leycettanus耐热至嗜热，Talaromyces emersonii和Talaromycesbyssochlamydoides尤其嗜热(参见Stolkand和Samson,1972)。Talaromyces部分Thermophila的唯一成员Talaromyces thermophilus在50℃下生长迅速(参见Stolk和Samson,1972)。这些嗜热的Talaromyces物种的目前分类主要基于表型和生理特征，例如它们在高于40℃时生长的能力、囊孢子颜色、子囊果覆盖物(ascornatal covering)的结构和特定无性型类型的形成。Stolk和Samson(1972)陈述：Emersonii部分的成员具有Paecilomyces(Talaromyces byssochlamydoides和Talaromyces leycettanus)或Penicillium cylindrosporum系列(Talaromyces emersonii和Talaromycesbacillisporus)其中之一的无性型。稍后，基于多种特征例如从端孔而非在颈(collula，neck)上形成分生孢子(Penicillium和Paecilomyces的特征)，Pitt(1979)将属于Penicillium cylindrosporum系列的物种转移至Geosmithia属。在Geosmithia属内，仅Geosmithia argillacea是耐热的，Stolk等人(1969)和Evans(1971)提出了与Talaromyces部分Emersonii成员的联系。Talaromyces内的嗜热Talaromyces物种与Trichocomaceae的系统发生关系未知(参见J.Houbraken,Antonie van Leeuwenhoek 2012年2月；101(2):403-21)。
Rasamsonia是包括耐热的和嗜热的Talaromyces和Geosmithia物种的新属(J.Houbraken等人，如上所述)。基于表型、生理和分子数据，Houbraken等人提出将Talaromyces emersonii、Talaromyces byssochlamydoides、Talaromyces eburneus、Geosmithia argillacea和Geosmithia cylindrospora物种转移至Rasamsonia新属。优选的嗜热真菌是Rasamsonia byssochlamydoides、Rasamsonia emersonii、Thermomyceslenuginosus、Talaromyces thermophilus、Thermoascus crustaceus、Thermoascusthermophilus和Thermoascus aurantiacus，其中Rasamsonia emersonii是最优选的。Talaromyces emersonii、Penicillium geosmithia emersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可交换使用。
应用于预处理的木质纤维素原料的Rasamsonia的纤维素分解酶在50-70℃范围内的温度下显示出最大转化速率。酶在这些环境下保持活性达14天及更久，而没有完全停止活性。通过使用最佳温度条件，最大量的还原糖能在尽可能短的水解时间内从木质纤维素材料(完全水解)释放出。以这种方式，在不到5天能够实现葡萄糖形式的纤维素的100％转化。发酵产物的理论最大产率(以g产物/克葡萄糖计的Yps最大)可来源于教科书式的生物化学。对乙醇而言，根据酵母中正常的糖酵解发酵通路，1摩尔葡萄糖(180g)产生2摩尔乙醇(＝2×46＝92g乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511g乙醇/g葡萄糖。对丁醇(MW 74g/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411g(异)丁醇/g葡萄糖。对乳酸而言，同型乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90g/摩尔)。根据该化学计量，Yps最大＝1g乳酸/g葡萄糖。对其它发酵产物而言，可以进行类似的计算。应用Rasamsonia的纤维素分解酶实现的成本降低是总处理时间减少的结果。
由于本发明方法中使用的酶的高稳定性，可以通过延长水解时间来延长酶的使用和降低酶剂量。例如，0.175mL酶/g木质纤维素材料干物质导致在72小时内从预处理的原料中释放理论最大值的约90％的还原糖。当使用0.075mL酶/g木质纤维素材料干物质时，在120小时内实现理论最大值的约90％转化。结果显示，由于酶活性的稳定性，降低酶剂量可通过延长水解时间补偿，以获得相同量的还原糖。通过使用稳定的(例如Rasamsonia的)纤维素分解酶实现的成本降低，导致较低的酶剂量但导致相似的水解转化产率。
在将木质纤维素材料转化为乙醇的常见方法中，处理步骤优选地在腐败性条件(septic condition)下进行以降低操作成本。污染微生物的污染和生长可因而发生并导致不期望的副作用，例如乳酸、甲酸和乙酸生产，基于底物的乙醇的产率损失，毒素和细胞外多糖的产生。这些效果可显著影响生产成本。高处理温度和/或短处理时间限制水解和发酵期间的污染风险。热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)能在高于60℃的温度下水解木质纤维素原料。在这些温度下，污染微生物引起不期望副作用的风险将极低至几乎为零。
在其中乙醇被生产的发酵步骤期间，温度典型地在30-38℃之间并且由于产量损失而优选地不被升高。通过应用短的发酵处理时间，污染的风险和作用和/或污染物的生长会尽可能多地被减小。使用稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可应用短的发酵时间，从而尽可能大地降低污染风险和/或污染物生长。以这种方式应用Rasamsonia的热稳定纤维素分解酶实现的成本降低导致更低的由污染造成的处理失败的风险。
热预处理后的第一个步骤是将预处理的材料冷却至酶具有最佳活性的温度。大规模时，这典型地通过添加(冷却)水实现，这除了降低温度外，还减少干物质含量。通过使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，可以实现成本降低，这是因为(i)更少需要对预处理材料冷却，因为在水解期间允许更高温度，和(ii)添加更少的水，这增加水解和发酵期间的干物质含量并因而增加乙醇工厂的乙醇生产能力(每体积每时间单位产生的量)。通过使用热稳定酶(比如Rasamsonia的那些)，成本降低也可通过使用比在有非热稳定酶的方法中所用的水具有更高温度的冷却水实现。
水解结束时，酶活性表现为低的，因为一旦几乎所有纤维素被转化，几乎没有还原糖被释放出。但是，存在的酶促活性的量仅减少少许，假设这主要是由于酶对底物的吸附。通过在水解后应用固液分离，例如离心、过滤、倾析(cantation)、沉降等等，溶液中的酶活性的60％或更多(例如70％)可被回收并被再利用用于在下一水解期间水解新的预处理的木质纤维素材料。
而且，固液分离后，溶液中的酶可从含有还原糖和来自酶促作用的其它水解产物的溶液中分离出。可通过包括但不限于超滤和微滤、离心、倾析、沉降的技术进行该分离，可首先将酶吸附到任何类型的载体上或不作此处理。例如，用0.175mL/g材料干物质的酶载量对预处理的材料水解20小时后，还原糖的理论最大量的50％被释出，相同水解72小时后，还原糖的理论最大量的90％被释出。通过离心和超滤，在渗余物中回收60-70％的酶活性，而滤液含有超过80％的释出的还原糖。通过再利用渗余物自身或被进一步纯化和/或浓缩后的渗余物，在下一水解步骤期间的酶剂量可被减少60-70％。以这种方式通过使用稳定纤维素分解酶(例如Rasamsonia的那些)实现的成本降低是降低的酶剂量的结果。
如上文所述的包括水解后再循环酶的方法可与发酵后再循环生产乙醇的微生物的方法组合，其中含还原糖的滤液作为底物(纯化的和/或浓缩的或稀释的)用于酶生产发酵和作为底物用于培养生产乙醇的微生物。
酶(比如来自Rasamsonia的那些)的热稳定性导致在糟水(thin stillage)中水解、发酵和真空蒸馏后剩余的纤维素分解活性。酶的总活性在三个连续的方法步骤期间降低。真空蒸馏后获得的糟水可因而被再利用作为酶来源，用于将预处理材料转化为乙醇的新开始的水解-发酵-蒸馏处理循环。糟水可被以浓缩形式或(未)稀释形式和/或被纯化并有或没有额外的酶补充的形式被使用。
在一种最佳方法中，在新处理循环中再利用酶之前，补充到糟水中的酶量等于在先前处理循环的三个连续处理步骤期间损失的活性量。以这种方式，避免超剂量的酶，并因此获得酶的最有效使用。而且，通过在第一处理循环中提供高酶剂量并补充等于在随后处理循环中的三个连续处理步骤期间损失的活性量的酶，可在每个处理循环中获得可能的最高水解速率，导致少于48小时的短水解时间和酶的最有效使用的组合。
通过在水解期间应用混合，酶变得更经常地与底物接触，这导致催化活性被更有效使用。这将导致酶剂量更低并因而导致成本更低，除非混合对酶具有负面作用。稳定酶(比如来自Rasamsonia的热稳定酶)是稳健的并可抵抗(局部)高剪切和高温环境，这是浆体剧烈混合期间的情况。在混合系统中使用稳定酶因而是有益的，并将导致剂量减少并因此导致成本降低。
在合适的微生物中表达和生产酶(例如至少2、3或4种不同纤维素酶)的一个优势可以为高的酶组合物产率，其可被用于本发明所述方法中。
在本发明的方法中，使用酶组合物。优选地，所述组合物是稳定的。本文中使用的“稳定酶组合物”表示：所述酶组合物在30小时水解反应时间后保持活性，优选地，在30小时水解反应时间后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小时的水解反应时间后保持活性。
可通过用合适的微生物(例如Rasamsonia emersonii或Aspergillus niger)发酵合适的底物制备酶组合物，其中酶组合物通过所述微生物生产。可改变微生物以改进或制造组合物。例如，可通过传统菌株改良程序或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可被原样使用以产生组合物或可被改变以增加产量或产生改变的组合物(其可包含异源酶例如纤维素酶，即这种微生物原本不产生的酶)。优选地，真菌更优选地丝状真菌被用来产生组合物。有利地，使用嗜热或耐热微生物。任选地，在酶组合物生产期间，使用诱导酶组合物中的酶表达的底物。
酶组合物被用来从包含多糖的木质纤维素材料中释放糖。主要的多糖为纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可在例如得自木材的木质纤维素材料中作为葡甘露聚糖存在。这些多糖向可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(acting in concert)的不同酶的作用下。糖产物表示木质纤维素材料的酶促水解产物。糖产物包含可溶性糖(包含单体和多聚体二者)。优选地，其包含葡萄糖。其它糖的实例为纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖产物可被原样使用或者可被进一步加工例如被回收和/或纯化。
另外，果胶和其它果胶类物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。
纤维素是由通过β-1,4键连接的葡萄糖残基构成的线性多糖。纤维素纤维的线性特性以及β-连接的葡萄糖(相对于α)的化学计量产生比淀粉的高度枝化α-连接结构更倾向于链间氢键结合的结构。因此，纤维素聚合物通常溶解度更小，并且形成与淀粉中存在的纤维相比更紧密结合的纤维。
以下更详细描述可被包括在用于本发明的稳定酶组合物中的酶。
溶解性多糖单加氧酶，内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)催化不溶性纤维素水解成产物例如纤维寡糖(纤维二糖作为主要产物)，而β-葡糖苷酶(BG)将寡糖(主要是纤维二糖和纤维三糖)转化成葡萄糖。
半纤维素是复杂聚合物，并且其组成常常在生物之间、组织类型之间大幅变化。通常，半纤维素的主要成分是β-1,4-连接的木糖(一种五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子处枝化，并且可以被与阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸的键取代或者通过乙酸酯化(和阿魏酸对阿拉伯糖的酯化)被取代。半纤维素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-连接的六碳糖(例如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和杂葡聚糖)和另外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于线性主链中，彼此通过β-键连接)的总称。
木聚糖酶与其它辅助酶例如α-L-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶一起催化半纤维素的水解。
果胶类物质包括果胶、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果胶是植物细胞壁中最复杂的多糖。它们围绕一定程度上散布着L-鼠李糖的α(1,4)-连接的D-半乳糖醛酸单元的核心链构建。在任何细胞壁中都存在符合所述描述的大量结构单元，并且通常认为在单个果胶分子中，不同结构单元的核心链彼此连续。结构单元的主要类型是：半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在O-2和O-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RGI)，其中半乳糖醛酸单元与带有(1,4)-连接的半乳聚糖和(1,5)-连接的阿拉伯聚糖侧链的鼠李糖单元交替。阿拉伯聚糖侧链可直接与鼠李糖结合，或者通过半乳聚糖链间接结合；木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)，在半乳糖醛酸的O-3上具有单个木糖基单元(与RGI紧密关联)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RGII)，含有罕见糖例如芹菜糖的特别复杂的小型单元。RGII单元可含有两个芹菜糖残基，所述芹菜糖残基在合适的离子条件下能够与硼酸盐可逆地形成酯。
本发明方法中使用的酶组合物优选地包含至少两种活性，但典型的组合物包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。典型地，本发明方法中使用的酶组合物包含至少两种纤维素酶。所述至少两种纤维素酶可以含有相同或不同的活性。本发明方法中使用的酶组合物还可以包含至少一种不同于纤维素酶的酶。优选地，所述至少一种其它酶具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的额外活性。这种辅助活性的实例在本文中被提及，包括但不限于半纤维素酶。
因此，本发明方法中使用的组合物可包含溶解性多糖单加氧酶活性、内切葡聚糖酶活性和/或纤维二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本发明中使用的组合物可包含每种活性种类中的多于一种的酶活性。例如，在本发明中使用的组合物可包含两种内切葡聚糖酶活性，例如内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和内切-β-1,4-葡聚糖酶活性。
本发明方法中使用的组合物可来源于真菌，例如丝状真菌例如Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii。在一种实施方式中，预期核心的一组(降解木质纤维素的)酶活性可来源于Rasamsonia emersonii。Rasamsonia emersonii能够提供本文中证明对木质纤维素材料的水解而言高度有效的活性组。如果需要，活性组可被来自其它来源的额外的酶活性补充。这种额外的活性可来源于经典来源和/或由经遗传改造的生物生产。
本发明方法中使用的组合物中的活性可以是热稳定的。本文中这表示：该活性的最适温度为60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，85℃或更高。本发明方法中使用的组合物中的活性一般不具有相同的最适温度，但是优选地将是热稳定的。
另外，本发明方法中使用的组合物中的酶活性可以能够在低pH下起作用。为了本发明目的，低pH表示5.5或更低，5或更低，4.9或更低，4.8或更低，4.7或更低，4.6或更低，4.5或更低，4.4或更低，4.3或更低，4.2或更低，4.1或更低，4.0或更低，3.9或更低，3.8或更低，3.7或更低，3.6或更低，3.5或更低的pH。
本发明方法中使用的组合物中的活性可以通过任何上述最适温度和pH值的组合来限定。
本发明方法中使用的酶组合物可包含来自不同于Rasamsonia的来源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。
例如，本发明方法中使用的酶组合物可包含β-葡糖苷酶(BG)，所述BG来自Aspergillus，例如Aspergillus oryzae，例如WO 02/095014中公开的那些或WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来自Aspergillus fumigatus，例如WO2005/047499中公开的SEQ ID NO：2或WO 2014/130812中的SEQ ID NO：5，或者Aspergillusfumigatusβ-葡糖苷酶变体，例如WO 2002/044915中公开的那些，例如具有以下取代的那些：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO：5进行编号)，或者Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachi。在另一种实施方式中，β-葡糖苷酶源自Penicillium，例如WO 2007/019442中作为SEQ ID NO：2公开的Penicillium brasilianum，或源自Trichoderma，例如Trichoderma reesei，例如US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554、US 2004/0102619中公开的那些。在一种实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。
例如，本发明方法中使用的酶组合物可包含来自以下的内切葡聚糖酶(EG)，Trichoderma，例如Trichoderma reesei；Humicola，例如Humicola insolens菌株；Aspergillus，例如Aspergillus aculeatus或Aspergillus kawachii；Erwinia，例如Erwinia carotovara；Fusarium，例如Fusarium oxysporum；Thielavia，例如Thielaviaterrestris；和/或Chrysosporium，例如Chrysosporium lucknowense菌株。在一种实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶。
例如，本发明方法中使用的酶组合物可包含纤维二糖水解酶I，所述纤维二糖水解酶I来自Aspergillus，例如Aspergillus fumigatus，例如WO 2011/057140中的SEQ ID NO：6或WO 2014/130812中的SEQ ID NO：6中公开的Cel7A CBH I；或来自Trichoderma，例如Trichoderma reesei。
例如，本发明方法中使用的酶组合物可包含纤维二糖水解酶II，所述纤维二糖水解酶II来自Aspergillus，例如Aspergillus fumigatus，例如WO 2014/130812中的SEQ IDNO：7；或来自Trichoderma，例如Trichoderma reesei；或来自Thielavia，例如Thielaviaterrestris，例如来自Thielavia terrestris的纤维二糖水解酶II CEL6A。
例如，本发明方法中使用的酶组合物可包含GH61多肽(溶解性多糖单加氧酶)，所述GH61多肽来自Thermoascus，例如Thermoascus aurantiacus，例如WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2或WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:1的那些；或来自Thielavia，例如Thielavia terrestris，例如WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:4的那些；或来自Aspergillus，例如Aspergillus fumigatus，例如WO2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的那些；或来自Penicillium，例如Penicillium emersonii，例如WO 2011/041397中描述为SEQ ID NO:2或WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:2的那些。
本发明方法中使用的酶组合物可包含一种、两种、三种、四种或更多种纤维素酶，例如溶解性多糖单加氧酶(LPMO)、内切葡聚糖酶(EG)、一种或两种外切纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶(BG)中的一种、两种、三种或四种或全部。本发明方法中使用的组合物可包含两种或更多种任何这些种类的纤维素酶。
本发明方法中使用的酶组合物可包含一种由本文所述的组合物提供的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，和由额外的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
在本文中使用时，纤维素酶是能够降解或改性纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将纤维素降解成更小的单元，部分地例如降解成纤维素糊精，或者完全降解成葡萄糖单体。根据本发明的纤维素酶可产生纤维素糊精与葡萄糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
溶解性多糖单加氧酶(LPMO)最近通过CAZy被分类在AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)中。如上面所提及的，溶解性多糖单加氧酶能够打开结晶葡聚糖结构。溶解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等,Journalof Biological Chemistry,第289卷,第5期,第2632-2642页)，GH61(糖苷水解酶家族61或有时被称为EGIV)蛋白是(溶解性)氧依赖性多糖单加氧酶(PMO’s/LPMO’s)。PMO和LPMO在本文可互换使用。文献中通常提及这些蛋白增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。基于一个家族成员中极低的内切-1,4-β-d-葡聚糖酶活性测量值，GH61最初被归类为内切葡聚糖酶。本文所使用的术语“GH61”将被理解为这样的酶家族，其共有将被归类到得到确认的CAZy GH分类系统的家族61(http://www.cazy.org/GH61.html)中的常见保守序列部分和折叠。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶EC 3.2.1家族的成员。GH61最近被CAZy重新归类在家族AA9(辅助活性家族9)中。GH61在本文中被用作纤维素酶的一部分。
CBM33(家族33碳水化合物结合模块)为溶解性多糖单加氧酶(见Isaksen等，Journal of Biological Chemistry,vol.289,no.5,pp.2632-2642)，CAZy最近已被重新分类为AA10(辅助活性家族10)中的CBM33。
如本文所用，半纤维素酶是能够降解或改性半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可以能够降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化下述过程的多肽：将半纤维素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体，例如己糖或戊糖单体。根据本发明的半纤维素酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
如本文所用，果胶酶是能够降解或改性果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化下述过程的多肽：将果胶降解成更小的单元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖单体。根据本发明的果胶酶可产生寡糖与糖单体的混合类群。这种降解将典型地通过水解反应而发生。
因此，本发明方法中使用的酶组合物可包含任何纤维素酶，例如溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解、从链末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以被称作纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纤维二糖水解酶，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶，微晶纤维素酶(avicelase)，外切-1,4-β-D-葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
如本文所用，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是能够催化纤维素、地衣淀粉或谷类β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。这种酶也可以被称作纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。
如本文所用，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端、非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可具有针对β-D-葡糖苷的广泛特异性，并且也可以水解以下一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可以被称作苦杏仁苷酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中1,4-β-D-葡糖苷键水解的任何多肽。这种多肽可作用于地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅含1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以被称作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的EC 3.2.1.6。当其还原基团参与待水解键的葡萄糖残基自身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代性名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷类β-D-葡聚糖。
本发明方法中使用的组合物可以包含任何半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
如本文所用，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可以被称作内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的选择是EC 3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylan endoxylanase)，其能够水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷键。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖的水解，从非还原性末端去除相继的D-木糖残基的任何多肽。这种酶也可以水解木二糖。这种酶也可以被称作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称作α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸(D-glucuronate)。这种酶也被称作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶也可水解可作为木聚糖中取代基存在的4-O-甲基化的葡糖醛酸。供替代的选择是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基连接的水解。
如本文所用，乙酰基木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木寡糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可催化来自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯基乙酸酯的乙酰基水解，但是一般不催化来自于三乙酰基丙三醇的乙酰基水解。这种多肽一般不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。
如本文所用，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：阿魏酸基-糖+H2O＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化来自酯化的糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。这种酶也可以被称作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。也可以被称作半纤维素酶辅助酶，因为其可帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。
如本文所用，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式反应的任何多肽：香豆酰基-糖+H(2)O＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。这种酶也可以被称作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也落入EC 3.1.1.73中，从而也可以被称作阿魏酸酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非还原性α-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-D-岩藻糖苷。所述酶也可以被称作蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以被称作外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。这种酶也可以被称作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本发明方法中使用的组合物可包含任何果胶酶，例如内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶甲基酯酶，内切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果胶乙酰基酯酶，内切-果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。
如本文所用，内切-多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以被称作多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶，果胶酶(pectinase)，内切多聚半乳糖醛酸酶，果胶酶(pectolase)，果胶水解酶，果胶多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所用，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化下述反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸(pectate)。这种酶也被称为果胶酯酶(pectinesterase)，果胶脱甲氧基酶，果胶甲氧基酶，果胶甲基酯酶，果胶酶，果胶酯酶(pectinoesterase)或果胶果基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
如本文所用，内切-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶，内切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果胶乙酰基酯酶在本文中被定义为下述任何酶，所述酶具有催化果胶GaIUA残基羟基处的乙酰基的脱乙酰的乙酰基酯酶活性。
如本文所用，内切-果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。所述酶也可被称为果胶裂解酶，果胶反式消除酶(trans-eliminase)，内切果胶裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果胶甲基反式消除酶，果胶溶解酶，PL，PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非还原性末端具有4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。这种酶也可被称为多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，内切果胶甲基反式消除酶，果胶酸反式消除酶，内切半乳糖醛酸反式消除酶，果胶酸裂解酶，果胶裂解酶，α-1,4-D-内切多聚半乳糖醛酸裂解酶，PGA裂解酶，PPase-N，内切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果胶反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原性α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。这种酶也可被称为α-L-鼠李糖苷酶T，α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原性末端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被称为外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n-1+D-半乳糖醛酸(D-galacturonate)。这种酶也可被称为半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan 1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-D-半乳糖醛酸酶，外切-D-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-D-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸(即脱酯化的果胶)的还原末端消除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳-4-糖醛酸基)-D-半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可被称为果胶酸二糖裂解酶，果胶酸外切裂解酶，外切果胶酸反式消除酶，外切果胶酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，PATE，外切-PATE，外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之间键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够以内切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通过β-消除切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰基酯酶是能够催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基主链的脱乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能够以外切方式，从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。这种酶也可被称为木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可以被称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键内切水解的任何多肽。这种酶也可被称为内切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶，内切-1,5-α-L-阿拉伯聚糖酶，内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；内切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
本发明方法中使用的酶组合物一般包含至少两种纤维素酶和任选地至少一种半纤维素酶和任选地至少一种果胶酶。本发明方法中使用的组合物可包含溶解性多糖单加氧酶(例如GH61)，纤维二糖水解酶，内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。这种组合物也可以包含一种或多种半纤维素酶和/或一种或多种果胶酶。
另外，本发明方法中使用的组合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸糖苷酶、扩展蛋白(expansin)、纤维素诱导蛋白或纤维素整合蛋白或类似蛋白质中的一种或多种(例如两种、三种、四种或所有)(这些也被称作上文的辅助活性)。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之间键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶归类为EC 3.4，它们适合在本发明方法中使用。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金属内切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，来限制水损失和病原体感染。这些脂质包括来自脂肪酸的蜡质，以及角质和木栓素(suberin)。
“木质酶”包括能够水解或分解木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本领域中已知解聚或以其它方式分解木质素聚合物的描述的其它酶。还包括在内的是能够水解在半纤维素糖(主要是阿拉伯糖)和木质素之间形成的键的酶。木质酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但是也能够催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以在本发明中使用的己糖基转移酶的例子是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可以能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。许多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可适合在本发明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.31)，透明质酸酶葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.36)，葡糖醛酰基-二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC3.2.1.139)。
本发明方法中使用的组合物可包含扩展蛋白或扩展蛋白样蛋白质，如膨胀因子(swollenin)(见Salheimo et al.,Eur.J.Biochem.269,4202-4211,2002)或膨胀因子样蛋白质。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素和其它细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质——膨胀因子含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。为了本发明的目的，扩展蛋白样蛋白质或膨胀因子样蛋白质可包含这种结构域中的一种或两种和/或可破坏细胞壁的结构(如破坏纤维素结构)，任选地不生产可检测量的还原糖。
本发明方法中使用的组合物可包含纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(见Foreman等人,J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)，纤维素/纤维体(cellulosome)整合蛋白质，例如cipA或cipC基因的多肽产物，或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，其可将纤维素分解亚基组织成多酶复合体。这通过两类互补结构域(即支架蛋白上的内聚结构域(cohesiondomain)和每个酶单元上的锚定结构域(dockerin domain))的相互作用完成。支架蛋白亚基还带有介导纤维体与其底物结合的纤维素结合模块(CBM)。为了本发明的目的，支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含这种结构域中的一种或两种。
本发明方法中使用的组合物可包含过氧化氢酶。术语“过氧化氢酶”是指催化两个过氧化氢转化为氧和两个水的过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC1.11.1.21)。可以基于以下反应，通过在240nm处监测过氧化氢的降解来测定过氧化氢酶活性：2H2O2→2H2O+O2。在25℃下，在pH为7.0的50mM磷酸盐中，利用10.3mM底物(H2O2)和约100单位酶/ml进行该反应。在16-24秒内采用分光光度法监测吸光度，这应该对应于0.45-0.4的吸光度降低。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为在pH7.0和25℃下每分钟降解一微摩尔的H2O2。
本发明方法中使用的组合物可由上文提到的每种酶种类的成员、一个酶种类的若干成员、或这些酶种类或辅助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是帮助木质纤维素降解的那些蛋白质)的任何组合构成。
在本发明的方法中使用的组合物可以由来自以下来源的酶构成：(1)供应商；(2)经克隆的表达酶的基因；(3)培养液(例如由培养基中微生物菌株的生长得到的，其中所述菌株向培养基中分泌蛋白质和酶)；(4)如(3)中培养的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中不同的酶可获自不同的来源。
酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并加入例如木质纤维素材料中。或者，酶可以在下述发酵中生产，所述发酵使用(预处理的)木质纤维素材料(例如玉米秆或麦秸)对生产酶的生物提供营养。通过这种方式，生产酶的植物自身可以作为木质纤维素材料，并且被添加进木质纤维素材料中。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时(即本身作为单一组合物)或分别或顺次提供。
在一种实施方式中，酶组合物可以是如下所述的完整发酵液(wholefermentation broth)。完整发酵液可以由非重组丝状真菌和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一种实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含一种或多种可与丝状真菌同源或异源的基因。在一种实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，其包含一种或多种可与丝状真菌同源或异源的基因，其中所述一种或多种基因编码可降解纤维素底物的酶。完整发酵液可包含任意所述多肽或其任何组合。
优选地，酶组合物为完整发酵液，其中细胞被杀死。完整发酵液可包含有机酸(用于杀死细胞)、被杀死的细胞和/或细胞碎片和培养基。
通常，在适于生产能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养丝状真菌。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基、温度范围以及适于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的其它条件是本领域已知的。可以通过使丝状真菌生长到静止期并将丝状真菌在限碳条件下维持足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段来制备完整发酵液。一旦丝状真菌将酶(例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶)分泌到发酵培养基中，便可以使用完整发酵液。本发明的完整发酵液可以包含丝状真菌。在一些实施方式中，完整发酵液包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级内容物。通常，完整发酵液包含丝状真菌生长至饱和、在限碳条件下培养以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)之后存在的已用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方式中，完整发酵液包含已用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，可以使用本领域已知的方法裂解、透化或杀死完整发酵液中存在的丝状真菌以产生细胞被杀死的完整发酵液。在一种实施方式中，完整发酵液是细胞被杀死的完整发酵液，其中含有丝状真菌细胞的完整发酵液被裂解或杀死。在一些实施方案中，通过凭借化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀死细胞，以产生细胞被杀死的丝状真菌的完整发酵液。在一些实施方式中，通过凭借化学和/或pH处理裂解丝状真菌并将细胞被杀死的发酵混合物的pH调节至合适的pH来杀死细胞。在一种实施方式中，完整发酵液包含第一有机酸成分，其包括至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，以及第二有机酸成分，其包括至少6个或更多碳的有机酸和/或其盐。在一种实施方式中，第一有机酸成分为醋酸、甲酸、丙酸、其盐或其任意组合，第二有机酸成分为苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或其任意组合。
如本文使用的术语“完整发酵液”指通过未进行或进行了最少回收和/或纯化的细胞发酵而产生的制备物。例如，完整发酵液是当微生物培养物生长至饱和时、在碳限制性条件下培养以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)并分泌至细胞培养基中而产生的。通常，完整发酵液是未分级的且包括已用过的细胞培养基、细胞外酶和微生物，优选为非存活的细胞。
如果需要的话，完整发酵液可以是分级的且可使用经分级内容物中的一种或多种。例如，可从完整发酵液去除杀死的细胞和/或细胞碎片以提供不含这些成分的组合物。
完整发酵液可进一步地包含防腐剂和/或抗微生物剂。这种防腐剂和/或试剂是本领域中是已知的。
通常，如本文所述的完整发酵液为液体，但也可含有不溶性成分，如杀死的细胞、细胞碎片、培养基成分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整发酵液。
在一种实施方式中，可以用丝状真菌不内源性表达或以相对低的水平表达的一种或多种酶活性补充完整发酵液，以改善纤维素底物降解，例如成为可发酵糖，例如葡萄糖或木糖。补充酶可以作为补充物添加到完整发酵液中，并且所述酶可以是单独的完整发酵液的组分，或者可以被纯化，或最低限度地回收并/或纯化。
在一种实施方式中，完整发酵液包含过表达一种或多种酶的重组丝状真菌发酵的完整发酵液，以改善纤维素底物的降解。或者，完整发酵液可以包含过表达一种或多种酶的重组丝状真菌发酵和非重组丝状真菌发酵的完整发酵液的混合物，以改善纤维素底物的降解。在一种实施方式中，完整发酵液包含过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌发酵的完整发酵液。或者，本方法和反应性组合物中使用的完整发酵液可以包含过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌发酵的完整发酵液和非重组丝状真菌发酵的完整发酵液的混合物。
如上所述，酶组合物存在于本发明方法的第一阶段和第二阶段中。这些酶组合物可以相同或可以不同。此外，如上所述，在根据本发明方法的第一阶段和/或第二阶段期间加入额外的酶。加入的酶可以是已存在于第一阶段和第二阶段中的酶。或者，它们可以是不同的酶。此外，在第一阶段期间添加的额外的酶与在根据本发明方法的第二阶段期间添加的额外的酶可以不同或可以相同。
本文中使用的木质纤维素材料包括任何木质纤维素材料和/或半纤维素材料。适于用于本发明方法的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质(virgin biomass)和/或非原始生物质如农业生物质，商业有机物，建筑和拆除碎片，市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。常见的生物质形式包括树木，灌木丛(shrubs)和草，小麦，麦秸，甘蔗，甘蔗秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energy cane)，玉米，玉米秆(corn stover)，玉米壳，玉米芯(corn cobs)，芸苔茎，大豆茎，高粱，玉米粒(包括来自玉米粒的纤维)，来自谷物如玉米、小麦和大麦研磨(包括湿磨和干磨)的通常称作“麸或纤维”的产物和副产物，以及市政固体废弃物，废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，和浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米壳，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，树叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，短期轮种木本作物(short-rotation woody crops)，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜浆，小麦麸皮(wheat midlings)，燕麦壳，和硬木材和软木材(不包括带有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括由农业加工(包括农业和林业活动)产生的有机废弃物材料，尤其包括林业木材废弃物。农业生物质可以是前述任一或其任何组合或混合物。
纤维素是具有式(C6H10O5)n的有机化合物，一种由几百到一万多个β(1→4)连接的D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。葡聚糖分子是通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖。在本文，对于通过糖苷键连接的D-葡萄糖单体的多糖而言，葡聚糖和纤维素可互换地使用。用于定量分析葡聚糖或多糖组成的方法在本领域是公知的且进行了描述的，并且例如概述于Carvalho de Souza等人，Carbohydrate Polymers 95(2013)657-663中。通常，葡聚糖的50％到70％是结晶纤维素，剩余部分是无定形纤维素。
在一种实施方式中，在酶促水解之前和/或期间预处理木质纤维素材料。预处理方法是本领域中已知的，其包括但不限于热、机械、化学修饰、生物修饰及其任意组合。通常，进行预处理以提高木质纤维素材料对酶促水解的可接近性和/或水解木质纤维素材料中的半纤维素和/或使木质纤维素材料中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素溶解。在一种实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理木质纤维素。预处理方法的实例包括但不限于蒸汽处理(例如在100-260℃、7-45bar的压强、中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下，在120-200℃、2-15bar的压强、酸性pH下，用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如，在存在有机溶剂和蒸汽的情况下，在160-200℃、7-30bar的压强、酸性pH下，用1-1.5％的H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如，在存在水/蒸汽的情况下，在60-160℃、1-10bar的压强、碱性pH下，用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(例如，在150-180℃、9-17bar的压强、碱性pH下，用5-15％的NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如，在60-140℃、8-20bar的压强、碱性pH下，用>15％的NH3处理5-30分钟)。
可以洗涤木质纤维素材料。在一种实施方式中，可以在预处理后洗涤木质纤维素材料。洗涤步骤可用于除去可充当发酵步骤和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。可按本领域技术人员已知的方式进行洗涤步骤。除了洗涤之外，还存在其它脱毒方法。预处理的木质纤维素材料也可以通过这些方法的任何(或任何组合)来脱毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、提取、吸附、中和、超施石灰(overliming)、添加还原剂、添加脱毒酶(例如漆酶或过氧化物酶)、添加能够使水解物脱毒的微生物。
本发明方法中使用的酶组合物可极其有效地水解木质纤维素材料，例如玉米秆、麦秸、甘蔗秸和/或蔗渣，然后其可被进一步转化为产物，例如乙醇、生物气、丁醇、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。此外，来自水解之后过程的中间产物(例如作为生物气生产中的中间体的乳酸)可被用作其它材料的结构单元。本发明利用乙醇生产进行示例，但这仅作为例证而非限制，提及的其它产物可被同样地良好生产。
在一种实施方式中，在第一阶段添加的酶组合物的量(本文中也称为酶剂量或酶负载量)低。在一种实施方式中，酶的量是6mg蛋白/g干物质重量或更低，5mg蛋白/g干物质或更低，4mg蛋白/g干物质或更低，3mg蛋白/g干物质或更低，2mg蛋白/g干物质或更低或1mg蛋白/g干物质或更低(表示为mg蛋白/g干物质形式的蛋白)。在一种实施方式中，酶的量是0.5mg酶/g干物质重量或更低，0.4mg酶组合物/g干物质重量或更低，0.3mg酶/g干物质重量或更低，0.25mg酶/g干物质重量或更低，0.20mg酶/g干物质重量或更低，0.18mg酶/g干物质重量或更低，0.15mg酶/g干物质重量或更低或0.10mg酶/g干物质重量或更低(表示为mg酶/g干物质形式的总纤维素酶)。由于酶的活性和稳定性，低酶剂量是可行的。如果还在第二阶段添加酶组合物，则在第一阶段和/或第二阶段中的酶促水解中添加的酶组合物的量可以不同或者可以相同。
第一阶段和/或第二阶段中的酶促水解期间的pH可由技术人员选择。在一种实施方式中，水解期间的pH可以是3.0-6.4。本发明的稳定酶可具有高至2个pH单位，高至3个pH单位，高至5个pH单位的宽pH范围。最适pH可位于pH 2.0至8.0，2.5至7.5，3.0-7.0，3.5-6.5，4.0-5.0，4.0-4.5的界限内或约4.2。第一阶段和第二阶段中的酶促水解中所使用的pH可以不同或者可以相同。第一阶段和第二阶段中的酶促水解中所使用的酶组合物的最适pH可以不同或者可以相同。
在一种实施方式中，进行水解步骤直到木质纤维素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被释放出。
显著地，本发明的方法可在水解反应中使用高水平的(木质纤维素材料的)干物质进行。在一种实施方式中，第一阶段的酶促水解结束时的干物质含量为5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或者39wt％或更高。在一种实施方式中，第一阶段的酶促水解结束时的干物质含量介于5wt％-40wt％、6wt％-40wt％、7wt％-40wt％、8wt％-40wt％、9wt％-40wt％、10wt％-40wt％、11wt％-40wt％、12wt％-40wt％、13wt％-40wt％、14wt％-40wt％、15wt％-40wt％、16wt％-40wt％、17wt％-40wt％、18wt％-40wt％、19wt％-40wt％、20wt％-40wt％、21wt％-40wt％、22wt％-40wt％、23wt％-40wt％、24wt％-40wt％、25wt％-40wt％、26wt％-40wt％、27wt％-40wt％、28wt％-40wt％、29wt％-40wt％、30wt％-40wt％、31wt％-40wt％、32wt％-40wt％、33wt％-40wt％、34wt％-40wt％、35wt％-40wt％、36wt％-40wt％、37wt％-40wt％、38wt％-40wt％、39wt％-40wt％之间。
在一种实施方式中，第二阶段的酶促水解结束时的干物质含量为5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高或者39wt％或更高。在一种实施方式中，第二阶段的酶促水解结束时的干物质含量介于5wt％-40wt％、6wt％-40wt％、7wt％-40wt％、8wt％-40wt％、9wt％-40wt％、10wt％-40wt％、11wt％-40wt％、12wt％-40wt％、13wt％-40wt％、14wt％-40wt％、15wt％-40wt％、16wt％-40wt％、17wt％-40wt％、18wt％-40wt％、19wt％-40wt％、20wt％-40wt％、21wt％-40wt％、22wt％-40wt％、23wt％-40wt％、24wt％-40wt％、25wt％-40wt％、26wt％-40wt％、27wt％-40wt％、28wt％-40wt％、29wt％-40wt％、30wt％-40wt％、31wt％-40wt％、32wt％-40wt％、33wt％-40wt％、34wt％-40wt％、35wt％-40wt％、36wt％-40wt％、37wt％-40wt％、38wt％-40wt％、39wt％-40wt％之间。
在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行根据本发明方法的发酵。可以在进行第二阶段的酶促水解的同一容器中进行发酵。或者，可以在一个或多个分开的容器中进行发酵。在另一个方面中，本发明因而包括这样的发酵方法，其中微生物被用于发酵包含糖(例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元的任何碳水化合物寡聚体或多聚体，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。为了从这种碳水化合物释放木糖或葡萄糖单元，可将适宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至发酵培养基或可通过经修饰的宿主细胞生产。在后者的情况下，经修饰的宿主细胞可被遗传工程改造，以生产并分泌这种碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚体或多聚体来源的另外优势是，其能在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度，例如通过使用限制速率的碳水化合物酶的量。这继而会防止对非葡萄糖的糖(例如木糖)代谢和运送所需体系的抑制。在一个优选的方法中，经修饰的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖二者，优选地同时发酵，这种情况下优选地使用经改造的宿主细胞，所述宿主细胞对葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生长(diauxic growth)。除了L-阿拉伯糖来源，任选地木糖(和葡萄糖)作为碳源之外，发酵培养基将进一步包含经修饰的宿主细胞生长所需的适宜成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成在本领域众所周知。
在相同条件下的发酵时间可比在常规发酵中更短，其中部分酶促水解在发酵期间仍必须参与。在一种实施方式中，就50g/l葡萄糖和来自木质纤维素材料的相应其它糖(例如50g/l木糖，35g/l的L-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖组合而言，发酵时间是100小时或更短，90小时或更短，80小时或更短，70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，可相应减少发酵时间。
发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法，所述发酵方法在没有氧或基本上没有氧被消耗的情况下进行，优选地少于5、2.5或1mmol/L/h、更优选地0mmol/L/h(即氧消耗未被检测出)的氧被消耗的情况下进行，并且其中有机分子既作为电子供体又作为电子受体。没有氧时，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不可被氧化磷酸化所氧化。为解决该问题，许多微生物使用丙酮酸盐或其衍生物之一作为电子和氢受体，因此再产生NAD+。因而，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸盐被用作电子(和氢受体)并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一种优选的实施方式中，发酵方法是厌氧的。厌氧方法是有利的，因为其比需氧方法更便宜：需要较少专门的设备。而且，预计厌氧方法给出比需氧方法更高的产品产率。在需氧条件下，通常生物质产率比在厌氧条件下更高。结果，通常在需氧条件下，期望的产物产率比在厌氧条件下低。
在另一实施方式中，发酵方法在限氧条件下进行。更优选地，发酵方法是需氧的并在限氧条件下进行。限氧发酵方法是这样的方法，其中氧消耗被从气体至液体的氧转移所限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际的混合/质量转移特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选地至少6mmol/L/h和甚至更优选地至少7mmol/L/h。
发酵方法优选地在对经修饰的细胞而言最佳的温度下运行。因而，对于大多数酵母或真菌细胞而言，发酵方法在低于42℃，优选地低于38℃下的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度下并在高于20℃、22℃或25℃的温度下进行。
在本发明的一种实施方式中，利用发酵微生物进行发酵。在一种实施方式中，在一个或多个容器中进行发酵。在一种实施方式中，在一个或多个发酵容器中进行第二阶段。在一种实施方式中，在将发酵微生物添加到一个或多个发酵容器之前进行第二阶段。
在一种实施方式中，第二阶段与发酵微生物的增殖步骤一起进行。这意味着在用于发酵微生物增殖的一个或多个容器中进行第二阶段。
在一种实施方式中，发酵微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。在一种实施方式中，所述方法是用于乙醇生产的方法，其中所述方法包括用能发酵至少一种C5糖的微生物发酵含糖培养基的步骤。微生物可以是原核或真核生物。用于所述方法中的微生物可以是经遗传修饰的微生物。合适生物的实例为酵母，例如Saccharomyces例如Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pastorianus或Saccharomyces uvarum，Hansenula、Issatchenkia、例如Issatchenkia orientalis、Pichia、例如Pichia stipites或Pichia pastoris、Kluyveromyce、例如Kluyveromyces fagilis、Candida、例如Candidapseudotropicalis或Candida acidothermophilum、Pachysolen、例如Pachysolentannophilus或细菌，例如Lactobacillus、例如Lactobacillus lactis、Geobacillus、Zymomonas、例如Zymomonas mobilis、Clostridium、例如Clostridium phytofermentans、Escherichia、例如E.coli、Klebsiella、例如Klebsiella oxytoca。在一种实施方式中，能发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一种实施方式中，酵母属于Saccharomyces属，优选地是Saccharomyces cerevisiae种。根据本发明方法中使用的酵母(例如Saccharomycescerevisiae)能够转化己(C6)糖和戊(C5)糖。根据本发明方法中使用的酵母(例如Saccharomyces cerevisiae)能够厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除了葡萄糖之外，酵母还能够厌氧利用L-阿拉伯糖和木糖。在一种实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化成期望的发酵产物，例如转化成乙醇。能够由L-阿拉伯糖产生乙醇的生物体(例如Saccharomyces cerevisiae菌株)可通过修饰宿主酵母引入来自合适来源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮糖二草酸酯)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因来产生。可将这些基因引入宿主细胞中以使所述宿主细胞能够利用阿拉伯糖。WO2003/095627中描述了这种方法。来自Lactobacillus plantarum的araA、araB和araD基因可以使用并公开在WO2008/041840中。来自Bacillus subtilis的araA基因以及来自Escherichia coli的araB和araD基因可以使用并公开在EP1499708中。在另一种实施方式中，araA、araB和araD基因可来源于Clavibacter、Arthrobacter和/或Gramella属中的至少一种，特别是Clavibacter michiganensis、Arthrobacter aurescens和/或Gramella forsetii中的一种，如WO 2009011591中所公开的那样。在一种实施方式中，酵母还可以包含一个或多个拷贝的木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶。
酵母可以包含一种或多种遗传修饰以允许酵母发酵木糖。遗传修饰的实例有引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许通过细胞中戊糖磷酸途径的通量增加。遗传工程酵母的实例描述于EP1468093和/或WO2006/009434中。
合适商业酵母的实例有RN1016，其是来自荷兰DSM的发酵木糖和葡萄糖的Saccharomyces cerevisiae菌株。
在一种实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是厌氧的。厌氧已在本文上文定义过。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法是需氧的。在另一优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵方法在限氧条件下进行，更优选地所述方法是需氧的和在限氧条件下进行。限氧条件已在本文上文定义过。
乙醇体积生产率优选地为至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小时。方法中基于L-阿拉伯糖和任选的木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比，对于葡萄糖、L-阿拉伯糖和任选的木糖，理论最大产率为0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。
在一个方面中，与已知乙醇发酵方法相比，导致乙醇生产的发酵方法具有若干优势：厌氧方法是可行的；限氧条件是可行的；可获得较高的乙醇产率和乙醇生产速率；使用的菌株可以能够使用L-阿拉伯糖和任选地木糖。
替代上述发酵方法，可使用至少两种有区别的细胞，这表示该方法是共发酵方法。如上所述的发酵方法的所有优选实施方式也是该共发酵方法的优选实施方式：发酵产物类别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源类别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、方法进行的温度、乙醇生产力、乙醇产率)。
可进行发酵方法而完全无需在发酵期间调节pH。也就是说，所述方法是不用添加任何酸或碱即可进行的方法。然而，这排除了可添加酸的预处理步骤。要点是本发明方法中使用的酶组合物能在低pH下起作用，因而不需要为了水解可发生而调整酸预处理原料的酸的pH。因此，本发明的方法可以是仅使用有机产物不需要无机化学输入的零废物方法。
可减少总反应时间(或水解步骤和发酵步骤合起来的反应时间)。在一种实施方式中，90％葡萄糖产率下的总反应时间为300小时或更少，200小时或更少，150小时或更少，140小时或更少，130小时或更少，120小时或更少，110小时或更少，100小时或更少，90小时或更少，80小时或更少，75小时或更少，或约72小时。相应地，在更低的葡萄糖产率下可达到更少总反应时间。
可以通过本发明的方法生产的发酵产物可以是源自发酵的任何物质，它们包括但不限于醇类(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃类(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)、环烷烃类(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)、烯烃类(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)以及气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充物、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶(例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶)。
根据本发明的方法任选地包括回收发酵产物。可以以本领域技术人员已知的方式从发酵液中分离发酵产物。对于每种发酵产物，技术人员能选择合适的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇从酵母发酵液中分离出。
针对若干木质纤维素材料发现了本发明的有益效果，因此认为对于各种木质纤维素材料的水解均存在所述有益效果。针对若干酶组合物发现了本发明的这种有益效果，因此认为对于各种水解酶组合物均存在所述有益效果。
实施例
实施例1
氧添加和降低的温度对葡萄糖产生和乙醇产生的影响
进行以下实验以证明酶促水解期间，在降低的温度下氧的影响。用1kg 20％w/w的酸预处理的玉米秆原料填充两个搅拌釜反应器。使用10％w/w的氨将pH调节至pH 4.5，并温度设定在62℃。使用船用式叶轮以60rpm的速度搅拌所得混合物。向混合物中加入含有溶解性多糖单加氧酶活性(GH61酶活性)的纤维素酶混合物(2.5mg/g干物质)，并孵育所得混合物120小时。
在62℃下的整个水解期间中测量溶解氧(DO)水平。水解期间的DO水平恒为0％，这暗示接近厌氧条件。在水解样品中测量葡萄糖酸形成。水解期间从混合物中取出的水解样品的上清液中葡萄糖酸的量为0.2g/l。在水解期间，葡萄糖酸水平不提高，表这暗示水解期间无GH61酶活性。
接下来，将温度降低至32℃。在60rpm的搅拌速度下，进一步孵育一个反应器(实验A)24小时。该反应器中的DO保持在0％DO。在250rpm的搅拌速度下，孵育另一个反应器(实验B)24小时，同时用流速为100ml/min的新鲜空气恒定更新反应器中的顶部空间。在此期间，该反应器中的DO约为100％。葡萄糖酸分析显示：实验B中葡萄糖酸浓度增加，而实验A中葡萄糖酸浓度保持不变。这暗示实验B中具有GH61酶活性，而实验A中没有。
接下来，使用10％w/w的氨将pH调节至pH 5.5，并加入0.5g/kg酵母水解物以开始发酵。发酵进行72小时，同时在发酵期间不控制pH。所得的葡萄糖形成如表1所示。
表1显示：在第二阶段酶促水解的情况下，其中温度相较于第一阶段水解降低(至32℃)，并且其中在第二阶段期间应用通气，葡萄糖产生大幅增加。
实验B(通气)中产生的乙醇的量比实验A(不通气)中产生的乙醇的量高约20％。
实施例2
水解时间、氧添加和降低的温度对葡萄糖产生和乙醇产生的影响
进行以下实验以证明酶促水解期间，在降低的温度下氧的影响。用1kg 20％w/w的酸预处理的玉米秆原料填充两个搅拌釜反应器。使用10％w/w的氨将pH调节至pH 4.5，并将温度设定在62℃。使用船用式叶轮以60rpm的速度搅拌反应混合物。向混合物中加入含有溶解性多糖单加氧酶活性(GH61酶活性)的纤维素酶混合物(2.5mg/g干物质)，并在实验A中孵育所得混合物120小时，在实验B中孵育所得混合物48小时。
在62℃下的整个水解期间中测量溶解氧(DO)水平。水解期间的DO水平恒为0％，这暗示接近厌氧条件。在水解样品中测量葡萄糖酸形成。水解期间从混合物中取出的水解样品的上清液中葡萄糖酸的量为0.2g/l。在水解期间，葡萄糖酸水平不提高，这暗示水解期间无GH61酶活性。
接下来，将温度降低至32℃。在250rpm的搅拌速度下，进一步孵育两个反应器24小时，同时用流速为100ml/min的新鲜空气恒定更新反应器中的顶部空间。在此期间，反应器中的DO约为100％。葡萄糖酸分析显示：在两个实验中，葡萄糖酸浓度均增加，这暗示两个实验中均具有GH61酶活性。
接下来，使用10％w/w的氨将pH调节至pH 5.5，并加入0.5g/kg酵母水解物以开始发酵。发酵进行72小时，同时在发酵期间不控制pH。所得的葡萄糖形成如表2所示。
表2显示：对于短水解时间和长水解时间而言，在第二阶段酶促水解的情况下，其中温度相较于第一阶段降低(至32℃)，并且其中在第二阶段期间应用通气，葡萄糖产生大幅增加。
实验A(长水解时间)中产生的乙醇的量与实验A(短水解时间)中产生的乙醇的量相同。这暗示：具有短水解时间的实验在发酵期间赶上，从而暗示在发酵期间形成了另外的单糖。
实施例3
在较低水解温度下，酶失活较少
评估了在通过纤维素酶混合物(2.7mg/g干物质)水解20wt％干物质的强酸预处理的玉米秆原料期间，水解温度对酶失活的影响。为此，在54℃和62℃下在两个分开的填充有1kg 20wt％干物质的强酸预处理的玉米秆原料的搅拌釜反应器中进行水解实验。用100ml/min的氮气流持续冲洗反应的顶部空间。使用船用式叶轮以100rpm搅拌这两个反应，并通过添加10％w/w的氨溶液将pH控制在pH 4.5。7小时和120小时之后，从两个反应中取出代表性的水解物样品(因此包括不溶物)。随后，将这些样品稀释千倍，并通过常规试验测定β-葡糖苷酶活性。
在该试验中，将0.4ml经稀释的水解物样品加入0.4ml在pH＝4.5的100mM乙酸钠缓冲液中的底物溶液中，所述底物溶液含有6mM 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。在60℃下孵育15分钟之后，通过添加0.8ml 1M碳酸钠溶液来终止反应，并在405nm波长下测定吸光度。使用对硝基酚的摩尔消光系数来计算β-葡萄糖苷酶活性。
表3列出了：对于两种温度而言，水解结束时(t＝120小时)存在的β-葡糖苷酶活性占水解7小时后测定的活性的百分比。水解7小时之后，在于两种不同温度下操作的水解物之间没有检测到β-葡糖苷酶活性的显著差异。表3中的数据清楚显示：低温水解物中的β-葡萄糖苷酶失活少得多。因此，水解温度在纤维素酶失活中起着重要作用；且在较低温度下，观察到了较少失活。
实施例4
在较低水解温度下，氧依赖性酶失活较少
在另一实验中，评估了水解期间氧对酶失活的影响。为此，在两种不同的温度(54℃和62℃)下，并且对于两种温度在需氧条件和厌氧条件下，进行四个水解实验。使用2.7mg/g干物质的纤维素酶混合物，在4个填充有1kg 20wt％干物质的强酸预处理的玉米秆原料的搅拌釜反应器中进行水解反应。用100ml/min的氮气流持续冲洗厌氧、无氧反应的顶部空间，而用含氧的正常空气(100ml/min)连续冲洗另一水解物顶部空间。使用船用式叶轮以100rpm搅拌所有反应，并通过添加10％w/w的氨溶液将pH控制在pH 4.5。7小时和120小时之后，从两个反应中取出代表性的水解物样品(因此包括不溶物)。随后，将这些样品稀释千倍，并通过常规试验测定内切葡聚糖酶活性。在该试验中，将0.2ml经稀释的水解物样品加入0.2ml在pH＝4.5的100mM乙酸钠缓冲液中的底物溶液中，所述底物溶液含有2wt％干物质AZO-CM-纤维素(Megazyme)。在60℃下孵育10分钟之后，通过添加1ml终止溶液来终止反应。通过以下方法来制备这种终止溶液：将40g乙酸钠和4g乙酸锌溶解在200ml pH＝5的水(用HCl调节)中，并将其与800ml 95％乙醇混合。添加停止溶液之后，将样品剧烈涡旋10秒，并以1000xg离心10分钟。将上清液转移到比色皿中，然后与空白(同样的程序，仅仅是不添加酶)一起测量590nm处的吸光度，并用于测定内切葡聚糖酶活性(以mAU/mg.sec计)。
表4列出了：对于所有4种条件而言，水解结束时(t＝120小时)存在的内切葡聚糖酶活性占水解7小时后测定的活性的百分比。在四种水解物的7小时样品之间没有检测到内切葡聚糖酶活性的显著差异。
表4中的数据显示：需氧水解样品中有更多的内切葡聚糖酶失活，这暗示了氧和酶失活之间的关系。此外，数据显示：在较低温度下，这种氧依赖性失活(以N2和O2水解反应之间的δ(Δ)计算)较少。
实施例5
在通气酶促水解酸预处理的玉米秆期间，降低温度的影响
该实施例显示了：在于通气条件下酶促水解预处理的玉米秆期间，降低温度的影响。
利用终浓度为17.1％干物质(w/w)的酸预处理的玉米秆进行水解反应。通过用水稀释浓缩的酸预处理的玉米秆溶液来制备酸预处理的玉米秆。随后，利用用10％(w/w)的NH4OH溶液将pH调节至pH 4.5。在工作体积为1升的搅拌的(250rpm)、pH受控且温度受控的反应器中进行酶促水解持续120小时。利用3.75mg TEC-210纤维素酶混合物/g干物质进行水解。根据WO 2011/000949中所述的接种和发酵程序来制备TEC-210纤维素酶混合物。
进行以下实验：
1.分两个阶段进行酶促水解。第一阶段，其中在氮气中在62℃的温度下进行酶促水解持续前48小时(以从反应中排除氧；第一阶段期间反应混合物中的溶解氧为0)。然后进行第二阶段，其中在氧中在48℃的温度下进行酶促水解持续72小时(以更新速度0.1vvm添加新鲜空气；第二阶段期间反应混合物中的溶解氧为100％)。
2.分两个阶段进行酶促水解。第一阶段，其中在氮气中在62℃的温度下进行酶促水解持续前48小时(以从反应中排除氧；第一阶段期间反应混合物中的溶解氧为0)。然后进行第二阶段，其中在氧中在62℃的温度下进行酶促水解持续72小时(以更新速度0.1vvm添加新鲜空气；第二阶段期间反应混合物中的溶解氧为100％)。
在水解结束时，取出样品，然后在冰上冷却，离心并立即用1450μl水稀释50μl每种上清液。随后过滤经稀释的上清液(0.45μm滤器，Pall PN454)，并如下所述分析滤液的糖含量。
通过下述方法测量经稀释样品的糖浓度：使用配备有Aminex HPX-87P柱(Biorad#1250098)的HPLC，用85℃的水以0.6ml/min的流速洗脱，并通过用葡萄糖标准溶液校正的来自示差折光检测(refractive index detection,R.I.)的葡萄糖信号的积分来定量。
结果展示在表5中。结果清楚显示：相较于分两个阶段进行酶促水解，并且在第二阶段，在通气条件下并且在不低于酶促水解第一阶段的温度的温度下进行酶促水解，在下述情况下形成了更多葡萄糖，其中分两个阶段进行酶促水解，并且在第二阶段，在通气条件下并且在低于酶促水解第一阶段的温度的温度下进行酶促水解。
表1：在高温和低温下，存在和不存在通气时的葡萄糖形成。
表2：在各种水解时间期间，在低温下，存在通气时的葡萄糖形成。
表3：水解物样品中的相对β-葡糖苷酶活性。
水解温度 7小时样品 120小时样品
54℃ 100％ 69％
62℃ 100％ 33％
表4：4个水解物样品中的相对内切葡聚糖酶活性。
表5：两阶段酶促水解过程中的葡萄糖形成。
*酶促水解结束时的葡萄糖形成。

Claims (20)

1.由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：使用包含至少两种纤维素酶的酶组合物在一个或多个容器中酶促水解所述木质纤维素材料以获得糖产物，其中所述酶促水解至少包括：
-第一阶段，其中在第一温度下进行所述酶促水解；和
-第二阶段，其中在第二温度下进行所述酶促水解，其中所述第二温度低于所述第一温度，并且其中在至少部分所述第二阶段期间，将氧加入水解中。
2.由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)进行根据权利要求1的方法，
b)发酵所述糖产物以产生发酵产物；和
c)任选地，回收所述发酵产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度为50-90℃。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述第二温度为20-49℃。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一阶段需要12-200小时。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述第二阶段需要2-72小时。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在一个或多个第一容器中进行所述第一阶段。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在一个或多个第二容器中进行所述第二阶段。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中将氧添加到所述一个或多个第二容器的顶部空间。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述一个或多个第一容器和/或一个或多个第二容器具有至少1m3的容积。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述酶组合物源自真菌且/或所述酶组合物包含真菌酶。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中在一个或多个容器中进行所述发酵。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的方法，其中在所述一个或多个发酵容器中进行所述第二阶段。
14.根据权利要求2-13中任一项所述的方法，其中在用于发酵微生物增殖的一个或多个容器中进行所述第二阶段。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第一阶段结束时的干物质含量为5重量％或更高。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第二阶段结束时的干物质含量为5重量％或更高。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中所述酶组合物是完整发酵液。
18.根据权利要求2-17中任一项所述的方法，其中利用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行所述发酵。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中在所述酶促水解之前和/或期间预处理所述木质纤维素材料。
20.根据权利要求2-19中任一项所述的方法，其中所述发酵产物是乙醇。
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