CN111278986A - 用于酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种由木质纤维素材料制备糖和/或发酵产物的方法。

Description

用于酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
技术领域
本申请涉及一种通过酶促水解由木质纤维素材料制备糖产物的方法和一种通过发酵糖制备发酵产物的方法。
背景技术
木质纤维素材料主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，并提供了用于产生矿物燃料的替代能源的有吸引力的平台。该材料是大量可得的，并且可以转化为有价值的产物，例如糖或生物燃料(例如生物乙醇)。
由木质纤维素材料生产发酵产物是在本领域中已知的，并且通常包括预处理、水解、发酵和任选地回收发酵产物的步骤。
在可包括液化、预糖化和/或糖化步骤的水解期间，木质纤维素材料中存在的纤维素被纤维素分解酶部分地(通常为30％至95％，取决于酶活性和水解条件)转化为糖。水解通常在45℃至50℃的升高的温度下和非无菌条件下，在持续6至168小时的过程期间进行(参见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。
通常，然后由微生物(如酵母)将糖转化为有价值的发酵产物，例如乙醇。发酵在相同或不同容器中以单独的，优选厌氧的过程步骤进行。将发酵期间的温度调节至30℃至33℃，以适应微生物(通常是酵母)的生长和乙醇生产。在发酵过程期间，剩余的纤维素材料通过自水解步骤已经存在的酶转化为糖，同时产生微生物生物质和乙醇。一旦纤维素材料被转化为可发酵的糖并且所有可发酵的糖被转化为乙醇、二氧化碳和微生物生物质，发酵完成。这可耗时达6天。通常，水解和发酵的整个过程的时间量可长达13天。
通常，在从木质纤维素材料生产发酵产物的整个过程中，酶的生产成本是主要的成本因素(参见Kumar,S.,Chem.Eng.Technol.32(2009),517-526)。迄今为止，通过施用来自单一或多种微生物源的具有更宽和/或更高的(比)水解活性的酶产物实现酶生产成本的降低(参见WO2008/008793)。这导致了更低的酶需求、更快的转化速率和/或更高的转化产率，并且因此降低了总生产成本。
除了酶优化之外，过程设计优化也是降低糖产物和发酵产物的总生产成本的关键工具。
出于经济原因，因此期望包括旨在降低涉及木质纤维素材料的水解和发酵的过程中的总生产成本的新颖且创新的方法配置。
发明概述
本申请的一个目的是提供一种由木质纤维素材料制备糖产物和/或发酵产物的改进方法。该方法通过用包含裂解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase)的酶组合物处理木质纤维素材料而得到了改进。之后，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，然后将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中。
发明详述
在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包括”和“包含”将被包含性地解释。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在传达可能包括未具体叙述的其他要素或整数。不使用数量词修饰时在本文中指代一个(种)或多于一个(种)(即，一个(种)或至少一个(种))。举例来说，“要素”可以表示一个要素或多于一个要素。
本申请涉及一种由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在包括以下步骤的方法中酶促水解木质纤维素材料以获得糖产物：(i)用包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物处理木质纤维素材料，(ii)将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，以及(iii)将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，以及(b)任选地，回收所述糖产物。
本申请还涉及一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法，(b)发酵糖产物以产生发酵产物；以及(c)任选地，回收发酵产物。
在一个实施方式中，将木质纤维素材料在酶促水解之前和/或期间，优选在酶促水解之前进行预处理。预处理方法是本领域中已知的，并且包括但不限于加热、机械、化学修饰、生物修饰，以及它们的任意组合。通常执行预处理是为了增强木质纤维素材料对酶促水解而言的可及性和/或水解半纤维素和/或溶解木质纤维素材料中的半纤维素和/或纤维素和/或木质素。在一个实施方式中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或稀酸或稀碱处理来处理木质纤维素材料。预处理方法的示例包括但不限于蒸汽处理(例如，在100-260℃、7-45巴的压力、中性pH下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下在120-200℃、2-15巴的压力、酸性pH下用0.1-5％的H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl处理2-30分钟)、有机溶剂处理(例如，在有机溶剂和蒸汽存在下在160-200℃、在7-30巴的压力、酸性pH下用1-1.5％的H2SO4处理30-60分钟)、石灰处理(例如，在水/蒸汽存在下在60-160℃、1-10巴的压力、碱性pH下用0.1-2％的NaOH/Ca(OH)2处理60-4800分钟)、ARP处理(在150-180℃、9-17巴的压力、碱性pH下用5-15％的NH3处理10-90分钟)、AFEX处理(例如，在60-140℃、8-20巴的压力、碱性pH下用>15％的NH3处理5-30分钟)。
木质纤维素材料可以被洗涤。在一个实施方式中，可以在预处理之后洗涤木质纤维素材料。洗涤步骤可用于去除可充当发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以技术人员已知的方式进行。除了洗涤，还存在其他解毒方法。木质纤维素材料也可以通过这些方法中的任何一种(或任何组合)进行解毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、萃取、吸附、中和、加灰过量(overliming)、添加还原剂、添加解毒酶(例如漆酶或过氧化物酶)、添加能够使水解产物解毒的微生物。在一个实施方式中，将经酶促水解的木质纤维素材料洗涤和/或解毒。
在如本文所述的方法中，可以将木质纤维素材料添加到生物反应器中，然后进行酶促水解。在一个实施方式中，在添加木质纤维素材料之前，包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物已经存在于生物反应器中。在另一实施方式中，可以将包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物添加到生物反应器中。在一个实施方式中，在添加包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物之前，木质纤维素材料已经存在于生物反应器中。在一个实施方式中，将木质纤维素材料和包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物两者同时添加到生物反应器中。包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物可以是水性组合物。
在一个实施方式中，由木质纤维素材料制备糖产物的方法包括至少液化步骤，其中木质纤维素材料在第一生物反应器中被酶促水解；以及至少糖化步骤，其中液化的木质纤维素材料在第一生物反应器中和/或在第二生物反应器中被水解。糖化可以在与液化相同的生物反应器(即第一生物反应器)中进行。糖化也可以在单独的生物反应器(即第二生物反应器)中进行。在酶促水解过程中，液化和糖化可以是分开的步骤。或者，可以将液化和糖化组合。液化和糖化可以在不同的温度下执行，但是也可以在单一温度下执行。在一个实施方式中，液化的温度高于糖化的温度。液化优选在60-75℃的温度下进行，并且糖化优选在50-65℃的温度下进行。在一个实施方式中，包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物可以用于液化步骤和/或糖化步骤中。
在一个实施方式中，如本文所述的方法的酶促水解耗时1至300小时、2至250小时、3至225小时、4至200小时、5至190小时、10至180小时、15至170小时、20至160小时，以及优选地25至150小时。
在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法期间添加氧。在一个实施方式中，首先用包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物处理木质纤维素材料，然后将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中。在一个实施方式中，如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(ii)的开始是在如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(i)开始之后1至100小时。这意味着将木质纤维素材料用包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物处理，然后在1至100小时之后将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中。在一个实施方式中，如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(ii)的开始是在如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(i)开始之后1至100小时、5至95小时、10至90小时、15至85小时、20至80小时，优选地25至70小时。
可以在酶促水解期间连续或不连续地添加氧。在一个实施方式中，当不连续地添加时，可以添加氧达总水解时间的1％-10％、1％-15％、1％-20％、1％-25％、1％-30％、1％-35％、1％-40％、1％-45％、1％-50％、1％-55％、1％-60％、1％-65％、1％-70％、1％-75％、1％-80％、1％-85％、1％-90％、1％-95％，或1％-99％。在一个实施方式中，当在水解过程的后半部分中添加时，可以添加氧达水解过程的后半部分的时间的1％-10％、1％-15％、1％-20％、1％-25％、1％-30％、1％-35％、1％-40％、1％-45％、1％-50％、1％-55％、1％-60％、1％-65％、1％-70％、1％-75％、1％-80％、1％-85％、1％-90％、1％-95％，或1％-99％。氧可以几种形式添加。例如，氧可以作为氧气、富氧气体(例如富氧空气)或空气添加。如何添加氧的示例包括但不限于借助于以下方式来添加氧：鼓泡、氧的化学添加、从顶部填充用于酶促水解的生物反应器(将水解产物投入生物反应器中，并因此将氧引入水解产物中)，以及将氧添加到生物反应器的顶部空间中。通常，可以控制和/或改变添加到生物反应器中的氧的量。通过仅在水解时间的部分期间添加氧，可以限制所供应的氧。另一种选择是添加低浓度的氧，例如通过使用空气和循环空气(离开生物反应器的空气)的混合物或通过用惰性气体“稀释”空气。通过在较长的水解时间段期间添加氧、添加较高浓度的氧或添加更多空气，可以实现氧添加量的增加。控制氧浓度的另一种方法是添加氧消耗剂和/或氧发生剂。可以将氧引入(例如吹入)生物反应器中，例如引入生物反应器中存在的木质纤维素材料中。
在一个实施方式中，在将木质纤维素材料添加到生物反应器中之前和/或期间和/或之后，将氧添加到用于酶促水解的一个或多个生物反应器中。可以将氧与进入一个或多个生物反应器的木质纤维素材料一起引入。可以将氧引入将进入一个或多个生物反应器的材料流中，或与一个或多个生物反应器的内容物的经过一个或多个生物反应器外部回路的部分一起引入。优选地，当生物反应器中存在木质纤维素材料时添加氧。优选地，当在生物反应器中存在包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物时添加氧。优选地，当在生物反应器中存在木质纤维素材料和包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物时添加氧。优选地，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中。优选地，当向混合物中添加氧时，所述混合物存在于生物反应器中。
在一个实施方式中，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，使得混合物中的溶氧(DO)水平在水解过程期间保持在饱和溶氧水平的0.1％-100％的水平。在一个实施方式中，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，使得混合物中的溶氧水平在水解过程期间保持在饱和溶氧水平的2.5％-99％的水平。在一个实施方式中，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，使得混合物中的溶氧水平在水解过程期间保持在饱和溶氧水平的5％-95％的水平。在一个实施方式中，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，使得混合物中的溶氧水平在水解过程期间保持在饱和溶氧水平的7.5％-90％的水平。在一个实施方式中，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，使得混合物中的溶氧水平在水解过程期间保持在饱和溶氧水平的10％-85％的水平。在一个实施方式中，将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，使得混合物中的溶氧水平在水解过程期间保持在饱和溶氧水平的13％-80％的水平。可以使用DO探头来测量DO。可以将探头浸入保持在水解温度下的混合物中。在一个实施方式中，探头已经被在相同温度下预先校准。可以连续或间隔地监测溶氧水平。
在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法期间添加附加的裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，首先用包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物处理木质纤维素材料，然后将氧添加到包含木质纤维素材料和酶组合物的混合物中，然后将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含木质纤维素材料和包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物的混合物中。在将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含木质纤维素材料和包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物的混合物中期间和/或之后，仍可将氧添加到所述混合物中。或者，可以在将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含木质纤维素材料和包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物的混合物中期间和/或之后停止氧添加。
在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(ii)开始之后1至100小时，将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含木质纤维素材料和酶组合物(包含裂解性多糖单加氧酶)的混合物中。换句话说，如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(ii)开始之后1至100小时开始。
在一个实施方式中，如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)的开始是在如本文所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(ii)开始之后1至100小时、5至95小时、10至90小时、15至85小时、20至80小时，优选地25至70小时。
在一个实施方式中，酶促水解在一个或多个生物反应器中进行。在一个实施方式中，如本文所述的方法中使用的一个或多个生物反应器的体积为至少1m3。优选地，生物反应器的体积为至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3。通常，一个或多个生物反应器将小于3000m3或5000m3。在一个实施方式中，一个或多个生物反应器的大小为10m3至5000m3。在如本文所述的方法的酶促水解中使用多个生物反应器的情况下，所述多个生物反应器可以具有相同的体积，但是也可以具有不同的体积。
在一个实施方式中，在如本文所述的方法中使用的包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物和/或附加的裂解性多糖单加氧酶来自真菌，优选丝状真菌。在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物中的酶来源于真菌，优选地丝状真菌，或者所述酶包括真菌酶，优选为丝状真菌酶。在本文所述的方法的酶促水解中使用的酶来源于真菌，或者在如本文所述的方法的酶促水解中使用的酶包括真菌酶。在一个实施方式中，酶组合物中的裂解性多糖单加氧酶和/或附加的裂解性多糖单加氧酶是真菌裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，酶组合物中的裂解性多糖单加氧酶和/或附加的裂解性多糖单加氧酶是相同的。在另一个实施方式中，它们不同。
“丝状真菌”包括亚门真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式(如由Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义的)。丝状真菌包括但不限于支顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomium paecilomyces、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、裸孢壳属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢霉属(Pyricularia)、Rasamsonia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、柱顶孢霉属(Scylatidium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、Trametes pleurotus、木霉属(Trichoderma)和毛癣菌属(Trichophyton)。在一个优选实施方式中，所述真菌是Rasamsonia，其中Rasamsonia emersonii是最优选的。因此，如本文所述的方法有利地与来源于Rasamsonia属微生物的酶组合应用，或者用于如本文所述的方法中的酶包括Rasamsonia酶。
在许多菌种保藏单位中几种丝状真菌菌株是公众可容易获得的，所述菌种保藏单位为例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)、德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH,DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、以及农业研究服务专利菌种保藏所(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)、北方地区研究中心(Northern Regional Research Center,NRRL)，以及俄罗斯科学院全俄微生物保藏中心(All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences，俄文缩写-VKM，英文缩写-RCM)，Moscow,Russia。
如本文所述的酶促水解过程优选在40-90℃下进行。优选地，用热稳定的酶进行如本文所述的方法。如本文所用的“热稳定的”酶是指该酶具有50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高，或甚至85℃或更高的最适温度。它们可以例如从嗜热微生物中分离出来，或者可以由技术人员设计并人工合成。在一个实施方式中，编码热稳定的酶的多核苷酸可以从嗜热或耐热的丝状真菌分离或获得，或从非嗜热或非耐热的真菌分离出，但被发现是热稳定的。“嗜热真菌”是指在50℃或更高温度下生长的真菌。“耐热的”真菌是指在45℃或更高，最大接近50℃的温度下生长的真菌。
合适的嗜热或耐热真菌细胞可以是腐质霉属、根毛霉属、毁丝霉属、Rasamsonia、篮状菌属、嗜热丝孢菌属、热子囊菌属或梭孢壳属细胞，优选地是踝节菌属细胞。优选的嗜热或耐热真菌是灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、嗜热团丝核菌(Papulaspora thermophilia)、丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)、Rasamsonia emersonii、嗜热赭褐白乔史密斯霉(Rasamsonia argillacea)、嗜热象牙白篮状菌(Rasamsonia eburnean)、Rasamsonia brevistipitata、嗜热柱孢白乔史密斯霉(Rasamsonia cylindrospora)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、杆孢篮状菌(Talaromyces bacillisporus)、Talaromycesleycettanus、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslenuginosus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)、嗜热栖热菌(Thermoascusthermophilus)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)和太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris)。
Rasamsonia是包括耐热和嗜热的篮状菌属和白乔史密斯霉属的新属。基于表型、生理学和分子数据，将物种埃默森篮状菌、丝衣霉状篮状菌(Talaromycesbyssochlamydoides)、象牙白篮状菌(Talaromyces eburneus)、赭褐白乔史密斯霉(Geosmithia argillacea)和柱孢白乔史密斯霉(Geosmithia cylindrospora)转移成新属Rasamsonia。埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、Penicillium geosmithiaemersonii和Rasamsonia emersonii在本文中可互换使用。
在如本文所述的方法中，使用了酶组合物。优选地，该组合物是稳定的。如本文所用的“稳定的酶组合物”是指酶组合物在30小时的水解反应时间后保持活性，优选在30小时的水解反应时间后保留其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。优选地，酶组合物在40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、150小时、200小时、250小时、300小时、350小时、400小时、450小时、500小时的水解反应时间后保持活性。
酶可以通过用合适的微生物(例如Rasamsonia emersonii或黑曲霉(Aspergillusniger))发酵合适的底物来制备，其中所述酶是由所述微生物产生的。可以改变微生物以改进或制造酶。例如，可以通过经典的菌株改良方法或通过重组DNA技术使微生物突变。因此，本文提及的微生物可以原样用于产生酶，或者可以经改变以增加产量或产生改变的酶，所述改变的酶可包括异源酶，例如纤维素酶，因此不是该微生物最初产生的酶。优选地，使用真菌，更优选地丝状真菌来产生酶。有利地，使用嗜热或耐热的微生物。任选地，使用诱导由产生酶的微生物进行酶表达的底物。
所述酶用于液化木质纤维素材料和/或从包含多糖的木质纤维素材料中释放糖。主要的多糖是纤维素(葡聚糖)、半纤维素(木聚糖、杂木聚糖和木葡聚糖)。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖存在，例如在木材来源的木质纤维素材料中。这些多糖成为可溶性糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用(actingin concert)的不同酶的作用下。糖产物是指木质纤维素材料的酶促水解产物。糖产物包含可溶性糖，包括单体和多聚体两者。优选地，糖产物包含葡萄糖。其他糖的示例是纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖。糖产物可以原样使用或可以进一步处理，例如回收和/或纯化。
此外，果胶和例如阿拉伯聚糖等其他果胶物质可占来自非木本植物组织的典型细胞壁干质量的可观的比例(干质量的约四分之一到一半可为果胶)。此外，木质纤维素材料可包含木质素。
在一个实施方式中，以真菌，优选Rasamsonia的全发酵液的形式添加包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物和/或附加的裂解性多糖单加氧酶。全发酵液可以由非重组和/或重组丝状真菌的发酵制备。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，所述重组丝状真菌包含可与所述丝状真菌同源或异源的一个或多个基因。在一个实施方式中，丝状真菌是重组丝状真菌，所述重组丝状真菌包含与丝状真菌可为同源或异源的一个或多个基因，其中所述一个或多个基因编码能够降解纤维素底物的酶。全发酵液可包含下述酶中的任一者，或它们的任何组合。
优选地，酶组合物是其中细胞被杀伤的全发酵液。全发酵液可包含有机酸(用于杀伤细胞)、被杀伤的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。
通常，丝状真菌在适于产生能够水解纤维素底物的酶的细胞培养基中培养。使用本领域已知的方法，在包含碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。适用于生长和纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶生产的合适的培养基、温度范围和其他条件是本领域中已知的。全发酵液可以通过使丝状真菌生长到固定相并使丝状真菌保持在有限的碳条件下达足以表达一种或多种纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的时间段来制备。一旦丝状真菌将例如纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的酶分泌到发酵培养基中，就可以使用全发酵液。本发明的全发酵液可包含丝状真菌。在一些实施方式中，全发酵液包括在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。通常，全发酵液包括用过的培养基和在丝状真菌生长至饱和后存在的细胞碎片，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(特别是纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶的表达)。在一些实施方式中，全发酵液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和丝状真菌。在一些实施方式中，存在于全发酵液中的丝状真菌可以使用本领域已知的方法进行裂解、透化或杀伤，以产生细胞被杀伤的全发酵液。在一个实施方式中，全发酵液是细胞被杀伤的全发酵液，其中全发酵液含有被裂解或杀伤的丝状真菌细胞。在一些实施方式中，通过化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀伤细胞，以产生丝状真菌发酵的细胞被杀伤的全发酵液。在一些实施方式中，通过用化学和/或pH处理裂解丝状真菌来杀伤细胞，并将细胞被杀伤的发酵混合物的pH调节至合适的pH。在一个实施方式中，全发酵液包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，所述第二有机酸组分包含至少6个或更多个碳有机酸和/或它们的盐。在一个实施方式中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、它们的盐或它们的任意组合，并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷甲酸、4-甲基戊酸、苯基乙酸，它们的盐或它们的任意组合。
如本文所用的术语“全发酵液”是指通过细胞发酵产生的制备物，所述制备物不进行或仅进行最小的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，宿主细胞对酶进行表达)并分泌到细胞培养基中时，会产生全发酵液。通常，全发酵液是未分级的，并且包含用过的细胞培养基、细胞外酶，以及微生物细胞，优选为不能存活的细胞。
如果需要的话，可以将全发酵液分级，并且可以使用分级的内容物中的一种或多种。例如，可以从全发酵液中去除被杀伤的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
全发酵液还可包含防腐剂和/或抗微生物剂。此类防腐剂和/或试剂是本领域中已知的。
如本文所述的全发酵液通常是液体，但是可包含不溶性组分，例如被杀伤的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施方式中，可以去除不溶性组分以提供澄清的全发酵液。
在一个实施方式中，可以向全发酵液中补充一种或多种酶活性，所述一种或多种酶活性不是内源性表达的，或者由丝状真菌以相对较低的水平表达，以改善将纤维素底物降解为例如可发酵的糖(例如葡萄糖或木糖)。可以将一种或多种补充酶作为补充物添加到全发酵液中，并且所述酶可以是单独的全发酵液的组分，或者可以被纯化，或者最小地回收和/或纯化。
在一个实施方式中，全发酵液包括过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的全发酵液。或者，全发酵液可包含非重组丝状真菌和过表达一种或多种酶以改善纤维素底物降解的重组丝状真菌的发酵的全发酵液的混合物。在一个实施方式中，全发酵液包括过表达β-葡糖苷酶的丝状真菌的发酵的全发酵液。或者，用于本发明方法和反应性组合物的全发酵液可包含非重组丝状真菌发酵的全发酵液和过表达β-葡糖苷酶的重组丝状真菌的发酵的全发酵液的混合物。
在一个实施方式中，包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物还包含选自由以下项组成的组的多肽：纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、内切木聚糖酶，以及它们的任意组合。在一个实施方式中，附加的裂解性多糖单加氧酶以酶组合物的形式添加。该酶组合物还可包含选自由以下项组成的组的多肽：纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、内切木聚糖酶，以及它们的任意组合。在下面更详细地描述了酶(可以存在于用于如本文所述的方法中的酶组合物中)。在另一个实施方式中，附加的裂解性多糖单加氧酶是作为单一酶添加的。可以纯化该单一酶。
用于本文所述方法中的酶组合物可包含至少两种活性，尽管通常组合物将包含多于两种活性，例如三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或甚至更多种活性。通常，用于如本文所述的方法的酶组合物包含至少两种纤维素酶。该至少两种纤维素酶可以包含相同或不同的活性。用于如本文所述的方法中的酶组合物还可包含至少一种除纤维素酶以外的酶。优选地，该至少一种其他酶具有辅助酶活性，即直接或间接导致木质纤维素降解的附加活性。此类辅助活性的示例在本文中提及，并且包括但不限于半纤维素酶。
在一个实施方式中，用于如本文所述的水解过程的酶组合物包含裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(i)中添加的裂解性多糖单加氧酶与在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)中添加的附加的裂解性多糖单加氧酶相同。在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(i)中添加的裂解性多糖单加氧酶与在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)中添加的附加的裂解性多糖单加氧酶不同。在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(i)中添加的裂解性多糖单加氧酶和在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)中添加的附加的裂解性多糖单加氧酶均以真菌的全发酵液的形式添加。所述全发酵液可以相同，但是替代地也可以不同。在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(i)中添加的裂解性多糖单加氧酶是以真菌的全发酵液的形式添加的，而在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)中添加的附加的裂解性多糖单加氧酶是作为纯化的酶添加的。
在一个实施方式中，在步骤(i)中添加的裂解性多糖单加氧酶与在步骤(iii)中添加的裂解性多糖单加氧酶的比率为10:1至1:10、5:1至1:8、2:1至1:6，优选地2:1至1:4。
在一个实施方式中，包含裂解性多糖单加氧酶的酶组合物可以包含多于一种裂解性多糖单加氧酶，即包含两种或更多种不同的裂解性多糖单加氧酶，例如来自不同真菌的裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，在如本文所述由木质纤维素材料制备糖产物的方法的步骤(iii)中添加的附加的裂解性多糖单加氧酶可以包含多于一种裂解性多糖单加氧酶，即包含两种或更多种不同的裂解性多糖单加氧酶，例如来自不同真菌的裂解性多糖单加氧酶。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含裂解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶。酶组合物可包含每个活性类别中的多于一种酶活性。例如，组合物可以包含两种内切葡聚糖酶，例如具有内切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶和具有内切-β-1,4-葡聚糖酶活性的内切葡聚糖酶。
用于在如本文所述的方法中使用的组合物可从真菌，例如丝状真菌，例如Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii获得。在一个实施方式中，一组核心酶可来源于Rasamsonia emersonii。如果需要的话，可以用来自其他源的附加酶补充所述一组酶。此类附加酶可来源于经典来源和/或由经基因修饰的生物产生。
另外，用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物中的酶可能够在低pH下工作。出于本发明的目的，低pH表示pH为5.5或更低、5或更低、4.9或更低、4.8或更低、4.7或更低、4.6或更低、4.5或更低、4.4或更低、4.3或更低、4.2或更低、4.1或更低、4.0或更低、3.9或更低、3.8或更低、3.7或更低、3.6或更低、3.5或更低。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含来自Rasamsonia的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们还可以包含来自除了Rasamsonia以外的源的纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。它们可以与一种或多种Rasamsonia酶一起使用，或者它们可以在不存在附加Rasamsonia酶的情况下使用。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含裂解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、一种或两者纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶。
用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含由如本文所述的组合物提供的一种类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性，以及由附加的纤维素酶/半纤维素酶/果胶酶提供的第二类型的纤维素酶活性和/或半纤维素酶活性和/或果胶酶活性。
如本文所用，纤维素酶是能够降解或修饰纤维素的任何多肽。能够降解纤维素的多肽是能够催化将纤维素分解成更小单元(部分分解为例如纤维糊精，或完全分解为葡萄糖单体)的过程的多肽。根据本发明的纤维素酶可产生纤维糊精和葡萄糖单体的混合群体。此类降解通常将通过水解反应发生。
如本文所用，半纤维素酶是能够降解或修饰半纤维素的任何多肽。也就是说，半纤维素酶可能够降解或修饰木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖中的一种或多种。能够降解半纤维素的多肽是能够催化将半纤维素分解成更小的多糖(部分分解为例如寡糖，或者完全分解为糖单体，例如己糖或戊糖单体)的过程的多肽。根据本发明的半纤维素酶可产生寡糖和糖单体的混合群体。此类降解通常将通过水解反应发生。
如本文所用，果胶酶是能够降解或修饰果胶的任何多肽。能够降解果胶的多肽是能够催化将果胶分解成更小单元(部分分解为例如寡糖，或完全分解为糖单体)的过程的多肽。根据本发明的果胶酶可产生寡糖和糖单体的混合群体。此类降解通常将通过水解反应发生。
因此，用于在如本文所述的方法中使用的酶组合物可包含以下酶中的一种或多种：裂解性多糖单加氧酶(例如GH61)、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶，以及β-葡糖苷酶。用于在如本文所述的方法中使用的组合物还可包含一种或多种半纤维素酶，例如内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯生物呋喃糖苷酶、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰酯酶、香豆酰基酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和/或β-甘露糖苷酶。用于在如本文所述的方法中使用的组合物还可包含一种或多种果胶酶，例如内切聚半乳糖醛酸酶、果胶-甲基酯酶、内切半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、果胶-乙酰基酯酶、内切果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、α-鼠李糖苷酶、外切半乳糖醛酸酶，外切聚半乳糖醛酸裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖酸酸水解酶，和/或木糖基半乳糖醛酸酶。另外，用于在如本文所述的方法中使用的组合物中可以存在以下酶中的一种或多种：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木质素酶、己糖基转移酶、葡糖醛酸酶、扩展蛋白(expansin)、纤维素诱导的蛋白或纤维素整合蛋白，或类似蛋白(这些在上文中称为辅助活性)。
如本文所用，裂解性多糖单加氧酶是最近被CAZy分类为AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)的酶。因此，存在AA9裂解性多糖单加氧酶和AA10裂解性多糖单加氧酶。裂解性多糖单加氧酶能够打开结晶的葡聚糖结构，并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解性多糖单加氧酶也可影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人，Journal of Biological Chemistry，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是裂解性多糖单加氧酶。GH61最初基于一个家庭成员中非常弱的内切1,4-β-d-葡聚糖酶活性而被分类为内切葡聚糖酶，但最近被CAZy重新分类为AA9家族。CBM33(家族33的碳水化合物结合模块)也是一种裂解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等人，Journal of BiologicalChemistry，第289卷，第5期，第2632-4642页)。CAZy最近将CBM33重新分类为AA10家族。
在一个实施方式中，裂解性多糖单加氧酶包括AA9裂解性多糖单加氧酶。这意味着酶组合物中的裂解性多糖单加氧酶中的至少一种和/或附加裂解性多糖单加氧酶中的至少一种是AA9裂解性多糖单加氧酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有裂解性多糖单加氧酶和/或所有附加裂解性多糖单加氧酶是AA9裂解性多糖单加氧酶。
在一个实施方式中，所述酶组合物包含来自热子囊菌属(例如橙色嗜热子囊菌)的裂解性多糖单加氧酶，例如在WO 2005/074656中描述为SEQ ID NO:2和在WO2014/130812及WO 2010/065830中描述为SEQ ID NO:1的裂解性多糖单加氧酶；或来自梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳)的裂解性多糖单加氧酶，例如在WO 2005/074647中描述为SEQ ID NO:8或在WO2014/130812及WO 2008/148131以及WO 2011/035027中描述为SEQ ID NO:4的裂解性多糖单加氧酶；或来自曲霉属(例如烟曲霉菌)的裂解性多糖单加氧酶，例如在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的裂解性多糖单加氧酶；或来自青霉菌属(例如埃默森青霉(Penicillium emersonii))的裂解性多糖单加氧酶，例如在WO 2011/041397中公开为SEQ ID NO:2或在WO2014/130812中公开为SEQ ID NO:2的裂解性多糖单加氧酶。其他合适的裂解性多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(参见WO 2009/085935、WO2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO 2011/005867)、热子囊菌属(参见WO 2011/039319)和甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(参见WO 2011/041504)。可包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于WO 98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO99/025847、WO 99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO 2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO 2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO 2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO 2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263，以及US 5,686,593(仅举几例)中。在一个优选的实施方式中，所述裂解性多糖单加氧酶来自Rasamsonia，例如Rasamsoniaemersonii(参见WO 2012/000892)。
在一个实施方式中，附加的裂解性多糖单加氧酶包含上述裂解性多糖单加氧酶中的一种。
如本文中所用，内切葡聚糖酶是能够催化纤维素、地衣多糖(lichenin)或谷类β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键的内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4，并且还可能够水解还含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。内切葡聚糖酶还可以称为纤维素酶、结晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶。
在一个实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶和/或GH7内切葡聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切葡聚糖酶中的至少一种是GH5内切葡聚糖酶或GH7内切葡聚糖酶。在酶组合物中存在更多的内切葡聚糖酶的情况下，这些内切葡聚糖酶可以是GH5内切葡聚糖酶、GH7内切葡聚糖酶，或GH5内切葡聚糖酶和GH7内切葡聚糖酶的组合。在一个优选的实施方式中，内切葡聚糖酶包括GH5内切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含来自以下的内切葡聚糖酶：木霉属，例如里氏木霉；腐质霉属，例如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；曲霉属，例如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或白曲霉(Aspergillus kawachii)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；镰刀菌属，例如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；梭孢壳属，例如太瑞斯梭孢壳；腐质霉属，例如灰腐质霉高温变种或特异腐质霉；白丝菌属(Melanocarpus)，例如热白丝菌(Melanocarpus albomyces)；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；毁丝霉属，例如嗜热毁丝霉；枝鼻菌属(Cladorrhinum)，例如多生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)；和/或金孢子菌属，例如鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选的实施方式中，内切葡聚糖酶来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的菌株(参见WO 01/70998)。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌内切葡聚糖酶，包括但不限于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)内切葡聚糖酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655、WO 00/70031、WO 05/093050)；嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(参见WO 05/093050)；以及嗜热裂孢菌内切葡聚糖酶V(参见WO 05/093050)。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可水解木二糖。β-木糖苷酶也可以称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
在一个实施方式中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这意味着酶组合物中的β-木糖苷酶中的至少一种是GH3β-木糖苷酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有β-木糖苷酶均为GH3β-木糖苷酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含来自粗糙脉孢菌、烟曲霉菌或里氏木霉的β-木糖苷酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的β-木糖苷酶(参见WO 2014/118360)。
如本文所用，内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可以被称为内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。替代物是EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。
在一个实施方式中，内切木聚糖酶包括GH10木聚糖酶。这意味着酶组合物中的内切木聚糖酶中的至少一种是GH10木聚糖酶。在一个实施方式中，酶组合物中的所有内切木聚糖酶均为GH10木聚糖酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含来自棘孢曲霉(参见WO 94/21785)、烟曲霉菌(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(参见WO 2011/041405)、青霉菌属(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/079210)、Talaromycesleycettanus、嗜热裂孢菌，或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(参见WO 2011/057083)的内切木聚糖酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的内切木聚糖酶(参见WO 02/24926)。
如本文所用，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。此类多肽可对β-D-葡糖苷具有宽特异性，并且还可以水解以下中的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷，或β-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为苦杏仁酶、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含来自曲霉属的β-葡糖苷酶，例如来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡糖苷酶，例如在WO 02/095014中公开的β-葡糖苷酶，或在WO 2008/057637中公开的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来自烟曲霉菌的β-葡糖苷酶，例如在WO 2005/047499中公开为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中公开为SEQID NO:5的β-葡糖苷酶，或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如在WO 2012/044915中公开的β-葡糖苷酶，例如具有以下取代的β-葡糖苷酶：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5进行编号)，或来自棘孢曲霉、黑曲霉或白曲霉的β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于青霉属，例如在WO 2007/019442公开为SEQ ID NO:2的巴西青霉(Penicillium brasilianum)；或来源于木霉属，例如里氏木霉，例如在US 6,022,725、US6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554、US 2004/0102619中描述的里氏木霉。在一个实施方式中，甚至可以使用细菌β-葡糖苷酶。在另一个实施方式中，β-葡糖苷酶来源于太瑞斯梭孢壳(WO 2011/035029)或囊状长毛盘菌(WO 2007/019442)。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的β-葡糖苷酶(参见WO 2012/000886)。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-糖苷键水解，从而从链末端释放纤维二糖的任何多肽。该酶也可以称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、结晶纤维素酶、外切-1,4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含来自曲霉属(例如烟曲霉菌)的纤维二糖水解酶I，例如在WO 2011/057140中以SEQ ID NO:6公开或在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:6公开的Cel7A CBH I；来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维二糖水解酶I；来自毛壳菌属(例如嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的纤维二糖水解酶I；来自篮状菌属(例如Talaromyces leycettanus)的纤维二糖水解酶I；或来自青霉菌属(例如埃默森青霉)的纤维二糖水解酶I。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的纤维二糖水解酶I(参见WO 2010/122141)。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含来自曲霉(例如烟曲霉)的纤维二糖水解酶II，例如在WO 2014/130812中以SEQ ID NO:7所示的纤维二糖水解酶II；或来自木霉属(例如里氏木霉)的纤维二糖水解酶II；或来自篮状菌属(例如Talaromycesleycettanus)的纤维二糖水解酶II；或来自梭孢壳属(例如太瑞斯梭孢壳)的纤维二糖水解酶II，例如来自太瑞斯梭孢壳的纤维二糖水解酶II CEL6A。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的纤维二糖水解酶II(参见WO2011/098580)。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含至少两种纤维素酶。该至少两种纤维素酶可以包含相同或不同的活性。所述酶组合物还可包含除纤维素酶以外的至少一种酶，例如半纤维素酶或果胶酶。在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含一种、两种、三种、四种或更多种类别的纤维素酶，例如一种、两种、三种或四种或全部是裂解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、一种或两种纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物包含裂解性多糖单加氧酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、β-葡糖苷酶、β-木聚糖酶和内切木聚糖酶。
在一个实施方式中，如本文所述的酶组合物还包含以下提及的酶中的一种或多种。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-键和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键水解的任何多肽。此类多肽可以作用于地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖，但不作用于仅包含1,3-键或1,4-键的β-D-葡聚糖。该酶也可以称为地衣多糖酶(licheninase)、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶、地衣聚糖酶(lichenase)或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是EC 3.2.1.6，被称为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶。当其还原基团参与要水解的键的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种酶会水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶、昆布多糖酶、1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷类β-D-葡聚糖。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可以称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。可包含在酶组合物中的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于来自黑曲霉、特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和大型亚灰树花菌(M.giganteus)(参见WO 2006/114094)的阿拉伯糖呋喃糖苷酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸酯。该酶也可以称为α-葡糖醛酸酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。这些酶还可以水解4-O-甲基化的葡糖醛酸，所述4-O-甲基化的葡糖醛酸也可以作为取代基存在于木聚糖中。替代物是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶(glucuronosidase)，其催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸基键的水解。可包含在酶组合物中的α-葡糖醛酸酶的示例包括但不限于来自棒曲霉(Aspergillusclavatus)、烟曲霉菌、黑曲霉、土曲霉(Aspergillus terreus)、特异腐质霉(参见WO 2010/014706)、黄灰青霉(Penicillium aurantiogriseum)(参见WO 2009/068565)和里氏木霉的α-葡糖醛酸酶。
如本文所用，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和木糖寡糖的去乙酰化的任何多肽。此类多肽可以催化来自聚合的木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、乙酸α-萘酯或乙酸对硝基苯酯的乙酰基的水解，但是通常不催化来自三乙酰基甘油的乙酰基的水解。此类多肽通常不作用于乙酰化的甘露聚糖或果胶。可包含在酶组合物中的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于来自棘孢曲霉(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、细丽毛壳(Chaetomium gracile)、特异腐质霉DSM 1800(参见WO2009/073709)、红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(参见WO 2005/001036)、嗜热毁丝霉(见WO 2010/014880)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)和太瑞斯梭孢壳NRRL 8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在一个优选的实施方式中，酶组合物包含来自Rasamsonia，例如Rasamsonia emersonii的乙酰木聚糖酯酶(参见WO 2010/000888)。
如本文所用，阿魏酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酰糖+H2O＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。阿魏酸酯酶通常可以催化来自酯化糖的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)的水解，所述酯化糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖，对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲酯通常是较差的底物。该酶也可以称为肉桂酰基酯水解酶、阿魏酸酯酶或羟基肉桂酰基酯酶。它也可以称为半纤维素酶辅助酶，因为它可以帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁的半纤维素和果胶。可包含在酶组合物中的阿魏酰酯酶(阿魏酸酯酶)的示例包括但不限于：来自特异腐质霉DSM 1800(参见WO 2009/076122)、费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌、黄灰青霉(参见WO 2009/127729)和太瑞斯梭孢壳(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酰酯酶。
如本文所用，香豆酰基酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰基糖+H(2)O＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。该酶也可以被称为反式-4-香豆酰基酯酶、反式-对香豆酰基酯酶、对香豆酰基酯酶或对香豆酸酯酶。该酶也落入EC3.1.1.73之内，因此也可以称为阿魏酰酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷中的末端非还原α-D-半乳糖残基水解的任何多肽，所述α-D-半乳糖苷包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。此类多肽也可能够水解α-D-岩藻糖苷。该酶也可以称为蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中的末端非还原β-D-半乳糖残基水解的任何多肽。此类多肽也可能够水解α-L-阿拉伯糖苷。该酶也可以称为外切-(1->4)-β-D-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中的1,4-β-D-甘露糖苷键的随机水解的任何多肽。该酶也可以称为甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶或内切-1,4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中的末端非还原β-D-甘露糖残基水解的任何多肽。该酶也可以称为甘露聚糖酶(mannanase)或甘露糖酶(mannase)。
如本文所用，内切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖(galacturonan)中的1,4-α-D-半乳糖醛酸键的随机水解的任何多肽。该酶也可以称为聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶(pectinase)、内切聚半乳糖醛酸酶、果胶酶(pectolase)、果胶水解酶、果胶聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶、内切半乳糖醛酸酶；内切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所用，果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化以下反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸酯。该酶也可以称为果胶酯酶、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲基酯酶、果胶酶、果胶酯酶或果胶果胶基水解酶(pectin pectylhydrolase)。
如本文所用，内切半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中的1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。该酶也可以被称为阿拉伯半乳聚糖内切-1,4-β-半乳糖苷酶、内切-1,4-β-半乳糖苷酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果胶乙酰基酯酶在本文中定义为具有乙酰基酯酶活性的任何酶，该酶催化果胶的GalUA残基的羟基处的乙酰基的去乙酰化。
如本文所用，内切果胶裂解酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖甲酯的清除性切割以产生在其非还原末端具有4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也称为果胶裂解酶、果胶反式消除酶(pectin trans-eliminase)；内切果胶裂解酶、聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶、果胶甲基反式消除酶、果胶裂解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-聚半乳糖醛酸聚糖的清除性切割以产生在其非还原末端具有4-脱氧-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基的寡糖的任何酶。该酶也可以称为聚半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸反式消除酶、聚半乳糖醛酸酯裂解酶、内切果胶甲基反式消除酶、果胶酸酯反式消除酶、内切半乳糖醛酸反式消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切聚半乳糖醛酸裂解酶、PGA裂解酶、PPase-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，α鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非还原α-L-鼠李糖残基水解的任何多肽。该酶也可以称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所用，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.82)是能够水解来自非还原末端的果胶，从而释放二半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶也可以称为外切-聚-α-半乳糖醛酸苷酶、外切聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切聚半乳糖苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸苷)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸)n-1+D-半乳糖醛酸酯。该酶也可以称为半乳聚糖1,4-α-半乳糖醛酸酶、外切聚半乳糖醛酸酶、聚(半乳糖醛酸)水解酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸酶、外切-D-半乳糖醛酸酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化从果胶酸根(即去酯化果胶)的还原末端清除性切割4-(4-脱氧-α-D-半乳糖-4-糖醛酰基)-D-半乳糖醛酸酯的任何多肽。该酶可被称为果胶二糖裂解酶、果胶外切裂解酶、外切果酸反式消除酶、外切果胶酸裂解酶、外切聚半乳糖醛酸反式消除酶、PATE、外切-PATE、外切-PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖还原末端-二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖酰-(1,4)-α-半乳糖醛酸]组成的严格交替鼠李半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳糖醛糖醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够通过β-消除在鼠李半乳糖醛酸聚糖中以内切方式切割α-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶是催化鼠李半乳糖醛酸聚糖中具有交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基的骨架的去乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖酸酸水解酶是能够以外切方式从严格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖结构的非还原末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木糖基半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木糖聚半乳糖醛酸的任何多肽。该酶也可以称为木糖聚半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。该酶也可以称为α-N-阿拉伯糖呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，内切阿拉伯聚糖酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中的1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的任何多肽。该酶也可以称为内切阿拉伯糖酶、阿拉伯聚糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、内切-α-1,5-阿拉伯糖苷酶；内切阿拉伯糖苷酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯聚糖水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽与其他部分(例如糖)之间的键的酶(糖肽酶)。许多蛋白酶根据EC 3.4进行了表征，并且适合用于如本文所述的方法中。蛋白酶的一些特定类型包括半胱氨酸蛋白酶，包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶；以及丝氨酸蛋白酶，包括糜蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶。
“脂酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯(包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等)的酶。在植物中，脂质被用作限制水分流失和病原体感染的结构组分。这些脂质包括来源于脂肪酸的蜡，以及角质和软木脂。
“木质素酶”包括能够水解或破坏木质素聚合物结构的酶。能够分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酰酯酶，以及其他本领域所述的已知用于解聚或以其他方式破坏木质素聚合物的酶。还包括能够水解在半纤维素糖(特别是阿拉伯糖)与木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下组的酶：木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酰酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应，但也能催化例如纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应的酶。可以使用的己糖基转移酶的示例是β-葡聚糖基转移酶。此类酶可能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡糖醛酸酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)的水解以产生醇的酶。许多葡糖醛酸酶已经被表征并且可适于使用，例如β-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、透明质酸-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.36)、葡糖醛酸基-二硫葡糖胺葡糖醛酸酶(3.2.1.56)、甘草酸β-葡糖醛酸基(3.2.1.128)或α-D-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)。
扩展蛋白参与植物细胞生长期间细胞壁结构的松弛。已经提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键，但不具有水解活性。认为它们通过这种方式允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。一种扩展蛋白样蛋白质膨胀因子(Swollenin)含有N端碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)和C端扩展蛋白样结构域。如本文所述，扩展蛋白样蛋白或膨胀因子样蛋白可包含此类结构域中的一者或两者和/或可破坏细胞壁的结构(例如破坏纤维素结构)，任选地不产生可检测量的还原糖。
纤维素诱导的蛋白质，例如cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(参见Foreman等人，J.Biol.Chem.278(34),31988-31997,2003)；纤维素/纤维素整合蛋白，例如cipA或cipC基因的多肽产物；或支架蛋白或支架蛋白样蛋白质。支架蛋白和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，所述多功能整合亚基可以将纤维素分解亚基组织成多酶复合物。这是通过两个互补类别的结构域(即支架蛋白上的内聚结构域和每个酶单位上的停靠结构域)的相互作用来完成的。支架蛋白亚基还带有纤维素结合模块(CBM)，所述CBM可介导纤维小体与其底物的附着。支架蛋白或纤维素整合蛋白可包含此类结构域中的一者或两者。
过氧化氢酶：术语“过氧化氢酶”是指催化两个过氧化氢转化为氧气和两个水的过氧化氢:过氧化氢氧化还原酶(EC 1.11.1.6或EC 1.11.1.21)。过氧化氢酶活性可以通过基于以下反应监测240nm处的过氧化氢的降解来确定：2H2O2→2H2O+O2。该反应是在25℃下在pH 7.0的50mM磷酸盐中用10.3mM底物(H2O2)和每ml约100单位的酶进行的。在16-24秒内用分光光度法监测吸光度，这应对应于吸光度从0.45降低到0.4。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解的一微摩尔H2O2。
如本文所用的术语“淀粉酶”是指水解淀粉(直链淀粉和支链淀粉中)的α-1,4-葡糖苷键的酶，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖苷酶(EC 3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)；以及水解α-1,6-糖苷键(为支链淀粉中支链点)的酶，例如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和极限糊精酶(EC 3.2.1.142)。
用于在如本文所述的方法中使用的组合物可以由来自以下的酶组成：(1)商业供应商；(2)克隆的表达酶的基因；(3)培养液(例如由于微生物菌株在培养基中生长而产生的培养液，其中菌株将蛋白质和酶分泌到培养基中)；(4)如在(3)中所生长的菌株的细胞裂解物；和/或(5)表达酶的植物材料。本发明组合物中的不同酶可以从不同源获得。
酶可以在微生物、酵母、真菌、细菌或植物中外源产生，然后分离并添加到例如木质纤维素材料中。或者，酶可以在使用(经预处理的)木质纤维素材料(例如玉米秸秆或小麦秸秆)的发酵中产生以向产生酶的生物体提供营养。以这种方式，产生酶的植物本身可以用作木质纤维素材料，并被添加到木质纤维素材料中。
在本文所述的用途和方法中，上述组合物的组分可以同时提供(即，本身作为单一组合物)或分开提供或顺序提供。
如本文所用的木质纤维素材料包括任何木质纤维素和/或半纤维素材料。适用于本文所述方法的木质纤维素材料包括生物质，例如原始生物质和/或非原始生物质，例如农业生物质、商业有机物、构建和拆除碎片、城市固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质的常见形式包括树木、灌木和草、小麦、小麦秸秆、甘蔗、甘蔗秆、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、能源甘蔗、玉米、玉米秸秆、玉米壳、玉米芯、玉米纤维、玉米粒、芸苔茎、大豆茎、甜高粱、来自谷物(例如玉米、小麦和大麦)的研磨(包括湿磨和干磨)的通常被称为“麸皮或纤维”的产物和副产物、酒糟(distillers dried grains)，以及城市固体废弃物、废纸和庭院废弃物。生物质也可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸，以及制浆造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、灌木、甘蔗、玉米和玉米壳、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、短期轮种木本作物、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、蔓藤、甜菜浆、小麦苗、燕麦壳，以及硬木和软木(不包括具有有害材料的木材)。另外，农业生物质包括从包括农业和林业活动在内的农业过程中产生的有机废物材料，特别地包括林业木材废物。农业生物质可以是单独的任何上述，或者是它们的任意组合或混合物。
在如本文所述的方法中使用的酶组合物可以极其有效地水解木质纤维素材料，例如玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗秆和/或甘蔗渣，所述水解产物可以随后进一步转化为产物，例如乙醇、沼气、丁醇、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。另外，来自水解后过程的中间产物(例如作为沼气生产中的中间体的乳酸)可以用作其他材料的结构单元。
在一个实施方式中，在(如本文所述的水解过程的)步骤(i)中添加的蛋白质(即，通过缩二脲测定法测定的酶组合物蛋白质(参见例如实施例1))的量为在经预处理的木质纤维素材料中1至40mg/g葡聚糖。优选地，在步骤(i)中添加的蛋白质的量为在经预处理的木质纤维素材料中2至30mg/g葡聚糖、在经预处理的木质纤维素材料中3至20mg/g葡聚糖、在经预处理的木质纤维素材料中4至18mg/g葡聚糖，优选地在经预处理的木质纤维素材料中5至15mg/g葡聚糖。
在一个实施方式中，在(如本文所述的水解过程的)步骤(iii)中添加的LPMO蛋白质(如通过TCA-缩二脲测定法测定的(参见例如实施例1))的量为在经预处理的木质纤维素材料中0.01至20mg/g葡聚糖。优选地，在步骤(iii)中添加的LPMO蛋白质的量是在经预处理的木质纤维素材料中0.02至15mg/g葡聚糖、在经预处理的木质纤维素材料中0.05至10mg/g葡聚糖、在经预处理的木质纤维素材料中0.1至8mg/g葡聚糖，优选地在经预处理的木质纤维素材料中0.2-5mg/g葡聚糖。
经预处理的木质纤维素材料中的葡聚糖的量是根据Carvalho de Souza等人(Carbohydrate Polymers,95(2013)657-663)描述的方法测量的。
酶促水解期间的pH可以由技术人员选择。在一个实施方式中，水解期间的pH为3.0至6.5、3.5至6.0，优选地4.0至5.0。
在一个实施方式中，酶促水解在40℃至90℃、45℃至80℃、50℃至70℃、55℃至65℃的温度下进行。
在一个实施方式中，进行酶促水解，直至木质纤维素材料中的可用糖的70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多被释放。
重要的是，可以使用具有高水平干物质的木质纤维素材料进行如所述的酶促水解过程。在一个实施方式中，干物质含量为5重量％或更高、6重量％或更高、7重量％或更高、8重量％或更高、9重量％或更高、10重量％或更高、11重量％或更高、12重量％或更高、13重量％或更高、14重量％或更高、15重量％或更高、16重量％或更高、17重量％或更高、18重量％或更高、19重量％或更高、20重量％或更高、21重量％或更高、22重量％或更高、23重量％或更高、24重量％或更高、25重量％或更高、26重量％或更高、27重量％或更高、28重量％或更高、29重量％或更高、30重量％或更高、31重量％或更高、32重量％或更高、33重量％或更高、34重量％或更高、35重量％或更高、36重量％或更高、37重量％或更高、38重量％或更高，或39重量％或更高。在一个实施方式中，酶促水解的干物质含量为5重量％-40重量％、6重量％-38重量％、7重量％-36重量％、8重量％-34重量％、9重量％-32重量％、10重量％-30重量％、11重量％-28重量％、12重量％-26重量％、13重量％-24重量％、14重量％-22重量％、15重量％-20重量％。
如上所述，本发明还涉及一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行如上所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法；(b)发酵糖产物以获得发酵产物；以及(c)任选地回收发酵产物。
在一个实施方式中，发酵(即步骤b)在一个或多个生物反应器中执行。在一个实施方式中，由产醇微生物进行发酵以产生醇。由产醇微生物进行发酵以产生醇可以在执行酶促水解的同一生物反应器中进行。或者，由产醇微生物进行发酵以产生醇可以在一个或多个单独的生物反应器中执行。
在一个实施方式中，发酵由酵母进行。在一个实施方式中，产醇微生物是酵母。在一个实施方式中，产醇微生物能够发酵至少C5糖和至少C6糖。
在另一方面中，本发明因此包括发酵过程，其中微生物用于发酵包含一种或多种糖的碳源，所述一种或多种糖为例如葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖。碳源可以包括任何碳水化合物寡聚体或聚合物，包括L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元，例如木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等。为了从此类碳水化合物中释放木糖或葡萄糖单元，可以将合适的糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等)添加到发酵培养基中，或者可以由经修饰的宿主细胞产生合适的糖酶。在后一种情况下，可以对修饰的宿主细胞进行基因工程化以产生和分泌此类糖酶。使用葡萄糖的低聚或聚合源的附加优点在于，其例如通过使用限速量的糖化酶，使得能够在发酵期间保持低的(较低的)游离葡萄糖浓度。这继而将防止抑制非葡萄糖的糖(例如木糖)的代谢和运输所需的系统。在一种优选的方法中，经修饰的宿主细胞发酵L-阿拉伯糖(任选地木糖)和葡萄糖两者，优选同时发酵，在这种情况下，优选使用对葡萄糖阻抑不敏感的经修饰的宿主细胞以防止二次生长。除了L-阿拉伯糖，任选地木糖(和葡萄糖)的源作为碳源之外，发酵培养基还将包含经修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物(例如酵母或丝状真菌)生长的发酵培养基的组成在本领域中是众所周知的。
发酵方法可以是需氧或厌氧发酵方法。厌氧发酵方法在本文中定义为在不存在氧或基本上不消耗氧，优选消耗小于5mmol/L/h、2.5mmol/L/h或1mmol/L/h，更优选0mmol/L/h(即无法检测到氧消耗)的情况下进行的发酵方法，并且其中有机分子充当电子供体和电子受体两者。在没有氧的情况下，在糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能被氧化磷酸化所氧化。为了解决该问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而使NAD+再生。因此，在优选的厌氧发酵过程中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并被还原为发酵产物，例如乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、氨基酸、1,3-丙-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施方式中，发酵过程是厌氧的。厌氧过程是有优势的，因为它比需氧过程便宜：需要更少的专用设备。此外，厌氧过程有望比需氧过程提供更高的产物产率。通常在需氧条件下的生物质产率要高于在厌氧条件下的生物质产率。结果，通常在需氧条件下的预期产物产率低于在厌氧条件下的预期产物产率。
在另一个实施方式中，发酵过程是在限氧条件下进行的。更优选地，发酵过程是需氧并且限氧条件下进行的。限氧发酵方法是氧消耗受到氧从气体到液体的转化限制的方法。限氧程度由进入气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/质量传递特性确定。优选地，在限氧条件下的方法中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选至少6mmol/L/h，并且甚至更优选至少7mmol/L/h。在一个实施方式中，醇发酵过程是厌氧的。
发酵过程优选在对所用微生物最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母或真菌细胞，发酵过程是在低于42℃，优选38℃或更低的温度下执行的。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，发酵过程优选在低于35℃、33℃、30℃或28℃的温度和高于20℃、22℃或25℃的温度下执行。在一个实施方式中，醇发酵步骤在25℃与35℃之间执行。
在一个实施方式中，用发酵微生物进行发酵。在本发明的一个实施方式中，用C5发酵微生物进行C5糖的醇(例如乙醇)发酵。在本发明的一个实施方式中，用C5发酵微生物或商业C6发酵微生物进行C6糖的醇(例如乙醇)发酵。适用于乙醇生产的市售酵母包括但不限于BIOFERMTM AFT和XR(NABC—North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)、FALITM(Fleischmann's Yeast,USA)、FERMIOLTM(DSM Specialties)、GERT STRANDTM(Gert Strand AB,Sweden)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology,WI,USA)。
在一个实施方式中，产醇微生物是能够发酵至少一种C5糖的微生物。优选地，它还能够发酵至少一种C6糖。在一个实施方式中，本申请描述了一种由木质纤维素材料制备乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：(a)执行如上所述的由木质纤维素材料制备糖产物的方法；(b)发酵糖产物以产生乙醇；以及(c)任选地回收乙醇。可以用能够发酵至少一种C5糖的微生物进行发酵。
产醇微生物可以是原核或真核生物。在该方法中使用的微生物可以是基因工程化的微生物。合适的产醇生物的示例是酵母，例如酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；汉逊酵母属(Hansenula)；伊萨酵母属(Issatchenkia)，例如东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)；毕赤酵母属(Pichia)，例如树干毕赤酵母(ichiastipites)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)；念珠菌属(Candida)，例如伪热带念珠菌(Candida pseudotropicalis)或酸性嗜热假丝酵母(Candida acidothermophilum)；管囊酵母属(Pachysolen)，例如嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)；或细菌，例如乳杆菌属(例如乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis))、芽孢杆菌属(Geobacillus)、发酵单胞菌属(Zymomonas)(例如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))、梭菌属(Clostridium)(例如Clostridium phytofermentans)、埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌(E.coli))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca))。在一个实施方式中，能够发酵至少一种C5糖的微生物是酵母。在一个实施方式中，酵母属于酵母属，优选地属于酿酒酵母物种。在根据本发明的方法中使用的酵母(例如，酿酒酵母)能够转化己糖(C6)和戊糖(C5)。在根据本发明的方法中使用的酵母(例如，酿酒酵母)可以厌氧发酵至少一种C6糖和至少一种C5糖。例如，除葡萄糖外，所述酵母还能够厌氧地使用L-阿拉伯糖和木糖。在一个实施方式中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核糖和/或木酮糖5-磷酸和/或转化为期望的发酵产物，例如转化为乙醇。能够从L-阿拉伯糖产生乙醇的生物，例如酿酒酵母菌株，可以通过以下方式产生：修饰宿主酵母，以引入来自合适的源的araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-核酮乙醛酸)和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因。可以将此类基因引入宿主细胞中，以使所述宿主细胞能够使用阿拉伯糖。在WO2003/095627中描述了此类方法。来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araA、araB和araD基因可以被使用，并在WO2008/041840中公开。来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的araA基因和来自大肠杆菌的araB和araD基因可被使用并且在EP1499708中公开。在另一个实施方式中，araA、araB和araD基因可来源于棒形杆菌属(Clavibacter)、节细菌属(Arthrobacter)和/或革兰菌属(Gramella)中的至少一种，特别是番茄细菌性溃疡病菌(Clavibactermichiganensis)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)和/或弗塞特革兰菌(Gramellaforsetii)中的一种，如在WO 2009011591中所公开的。在一个实施方式中，酵母还可以包含木糖异构酶基因的一个或多个拷贝，和/或木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶的一个或多个拷贝。
酵母可包含一种或多种遗传修饰以允许所述酵母发酵木糖。遗传修饰的示例是引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1基因；使醛糖还原酶(GRE3)基因缺失；过表达PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1，以允许增大通过细胞中的戊糖磷酸途径的通量。基因工程化的酵母的示例描述于EP1468093和/或WO2006/009434中。
合适的商业酵母的示例是RN1016，所述RN1016是来自DSM,the Netherlands的发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母菌株。
在一个实施方式中，用于生产乙醇的发酵过程是厌氧的。厌氧已经在本文先前定义。在另一个优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵过程是需氧的。在另一个优选的实施方式中，用于生产乙醇的发酵过程是在限氧条件下，更优选地需氧且限氧的条件下进行的。限氧条件已经在本文先前定义。
或者，对于上述发酵过程，可以使用至少两个不同的细胞，这意味着该过程是共发酵过程。如上所述的发酵过程的所有优选实施方式也是该共发酵过程的优选实施方式：发酵产物的身份、L-阿拉伯糖源和木糖源的身份、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、执行过程的温度、乙醇生产率、乙醇产率)。
可通过本发明的方法产生的发酵产物可以是源自发酵的任何物质。它们包括但不限于醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷，以及环辛烷)、烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯，以及辛烯)；以及气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)，以及一氧化碳(CO))。发酵产物还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特殊化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶(例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶)。在一个优选的实施方式中，在如本文所述的发酵过程中制备醇。在一个优选的实施方式中，在如本文所述的发酵过程中制备乙醇。
本文所述的方法可包括回收在该过程中制得的所有种类的产物，包括发酵产物，例如乙醇。可以按照技术人员已知的方式将发酵产物与发酵液分离。回收技术的示例包括但不限于色谱法、电泳程序、不同溶解度、蒸馏，或萃取。技术人员将因此能够针对每种发酵产物选择适当的分离技术。例如，可以以常规方式通过蒸馏(例如蒸汽蒸馏/真空蒸馏)将乙醇与酵母发酵液分离。
在一个实施方式中，本文所述的方法还产生能量、热、电和/或蒸汽。
已经发现了本发明对几种木质纤维素材料的有益效应，因此据信本发明对于水解所有种类的木质纤维素材料都存在有益效应。已经发现了本发明对几种酶的有益效应，因此据信本发明对所有种类的水解酶组合物都存在有益效应。
实施例
实施例1
在通气开始之前添加裂解性多糖单加氧酶(LPMO)
该实施例显示了在通气之前添加附加的LPMO对木质纤维素材料水解的效应。
根据WO2011/000949中所述的方法产生Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物和Rasamsonia emersoniiΔLPMO纤维素酶混合物(即两种全发酵液)。通过用本领域中已知的方法使编码LPMO的基因(参见WO2012/000892)从Rasamsonia emersonii菌株中缺失来制备Rasamsonia emersoniiΔLPMO菌株。此外，在实验中使用在WO2012/000892中所述的Rasamsonia emersonii裂解性多糖单加氧酶(LPMO)和在WO2012/000890中所述的Rasamsonia emersoniiβ-葡糖苷酶。
使用TCA-缩二脲方法确定LPMO的蛋白质浓度。简而言之，制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、8mg/ml和10mg/ml)以生成校准曲线。另外，用水制备LPMO样品的稀释液。将270μl的各个经稀释的样品(BSA和LPMO的经稀释的样品)转移到含有830μl的12％(w/v)三氯乙酸的丙酮溶液的10ml的试管中，并充分混合。随后，将试管在冰水上孵育一个小时，并在4℃和6000rpm下离心30分钟。弃去上清液，通过将试管倒置在纸巾上并在室温下静置30分钟来干燥沉淀。接下来，将3ml BioQuant Biuret试剂混合物添加到试管中的沉淀中，沉淀在混合时溶解，之后添加1ml水。将试管充分混合并在室温下孵育30分钟。在546nm处测量混合物的吸收，并且将水样品用作空白测量。将在校准线范围内在546nm处具有吸收值的LPMO稀释液用于经由BSA校准线计算LPMO样品的总蛋白质浓度。
使用缩二脲方法确定纤维素酶混合物的蛋白质浓度。将混合物样品基于重量用水稀释，并以>14000xg离心5分钟。制备牛血清白蛋白(BSA)稀释液(0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml和15mg/ml)以生成校准曲线。将每种稀释的蛋白质样品(BSA和混合物的稀释的蛋白质样品)的200μl上清液转移到1.5ml反应管中。加入800μl的BioQuantBiuret试剂并充分混合。将来自相同的经稀释的蛋白质样品的500μl添加至装有10KD过滤器的反应管中。将200μl流出物转移到1.5ml反应管中，添加800μl的BioQuant Biuret试剂并充分混合。接下来，将所有混合物(在10KD过滤之前和之后的经稀释的蛋白质样品与BioQuant混合)在室温下孵育至少30分钟。在546nm处测量混合物的吸收，并且将水样品用作空白测量。将在校准线范围内在546nm处具有吸收值的混合物稀释液用于经由BSA校准线计算混合物样品的总蛋白浓度。
使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物，在37℃和pH 4.4下测定酶促β-葡萄糖苷酶活性(WBDG)。pNP-β-D-吡喃葡萄糖苷的酶促水解导致了对硝基苯酚(pNP)和D-葡萄糖的释放。在碱性条件下测定的定量释放的对硝基苯酚是酶促活性的量度。在孵育10分钟后，通过添加1M碳酸钠来终止反应，并在405nm的波长下测定吸光度。利用对硝基苯酚的摩尔消光系数计算β-葡萄糖苷酶的活性。通过将10mM pNP储备溶液用100mM pH 4.400.1％BSA乙酸盐缓冲液稀释至pNP浓度为0.25mM、0.40mM、0.67mM和1.25mM，来制备对硝基苯酚校准线。底物是5.0mM pNP-BDG在乙酸盐缓冲液(100mM，pH 4.4)中的溶液。向3ml底物中添加200μl校准溶液和3ml 1M碳酸钠。使用乙酸盐缓冲液(100mM)作为空白测量在405nm下测量混合物的吸收。使用本领域已知的标准计算方案通过以下方式来计算pNP含量：绘制OD405对照具有已知浓度的样品的浓度的曲线，之后使用从校准线生成的方程式计算未知样品的浓度。将样品稀释至对应于介于1.7与3.3单位之间的活性的重量。向预热至37℃的3ml底物中添加200μl经稀释的样品溶液。将此记录为t＝0。在10.0分钟后，通过添加3ml 1M碳酸钠终止反应。将β-葡糖苷酶活性以WBDG单位/克酶液表示。一个WBDG单位被定义为在限定的测定条件(4.7mM pNPBDG，pH＝4.4和T＝37℃)下每秒从对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷释放出一纳摩尔对硝基苯酚的酶量。
经酸预处理的玉米秸秆(aCS)是通过将玉米秸秆在186℃下孵育6.7分钟制成的。在热处理之前，将玉米秸秆用H2SO4浸渍10分钟，以将预处理期间的pH设置为2.3。经预处理的木质纤维素材料中的葡聚糖的量是根据Carvalho de Souza等人(CarbohydratePolymers,95(013)657-663)描述的方法测量的。用最终浓度为17％(w/w)干物质的经酸预处理的玉米秸秆(aCS)来执行水解反应。经由用水稀释浓缩的原料溶液来制备原料溶液。随后，用10％(w/w)NH4OH溶液将pH调节至pH4.5。
在工作体积为1l的经搅拌、pH受控和温度受控的封闭反应器中进行水解反应。执行每次水解并将其控制在pH 4.5和62℃。在反应容器中装入17％(w/w)的原料(pH 4.5)，并以150rpm搅拌18小时，同时在62℃下用氮气流(100ml/min)持续更新顶部空间以使容器无氧。随后，开始水解反应，并进行以下实验：
1)在t＝0小时处，(a)在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物，以及(b)在经预处理的木质纤维素材料中添加836WBDG单位/g葡聚糖(对照反应)。
2)在t＝0小时处，在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物，在经预处理的木质纤维素材料中添加836WBDG/g葡聚糖，并在经预处理的木质纤维素材料中添加0.7mg Rasamsonia emersoniiLPMO蛋白质/g葡聚糖(在t＝0小时处进行LPMO蛋白质添加)。
3)在t＝0小时处，在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物，在经预处理的木质纤维素材料中添加836WBDG/g葡聚糖，并在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为0.7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersoniiΔLPMO-纤维素酶混合物(在t＝0小时处进行ΔLPMO-纤维素酶混合物添加)。
在t＝0小时处添加酶后，将每个水解容器保持厌氧6小时，在此之后以空气流(100ml/min)替换氮气流(100ml/min)，从而导致反应混合物中通过DO电极测量的的溶氧(DO)水平为5％(0.008mol/m3)。总水解时间为144小时。
在水解结束时，取出样品进行分析，所述样品立即以4000xg离心8min。将上清液经0.2μm尼龙滤器(whatman)过滤，并在4℃下贮存，直至如下所述分析糖含量。
根据2008年1月的NREL技术报告NREL/TP-510-42623，使用配备有Aminex HPX-87H柱的HPLC测量稀释样品中的糖浓度。结果呈现于表1中。
数据显示，在水解过程中添加附加的LPMO蛋白质是有益的，与不另外掺加任何事物或掺加等量的不含LPMO的纤维素酶混合物时相比，导致葡萄糖释放增加了6％。
实施例2
在通气开始之后添加裂解性多糖单加氧酶(LPMO)
该实施例显示了在通气开始之后添加附加的LPMO对木质纤维素材料水解的效应。
如实施例1所述进行实验，其中前提条件是进行以下实验：
1)在t＝0小时处，(a)在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物，以及(b)在经预处理的木质纤维素材料中添加836WBDG单位/g葡聚糖(对照反应)。
2)在t＝0小时处在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物并在经预处理的木质纤维素材料中添加836WBDG/g葡聚糖，并且在t＝24小时处在经预处理的木质纤维素材料中添加0.7mgRasamsonia emersonii LPMO蛋白质/g葡聚糖(在t＝24小时处进行LPMO蛋白质添加)。
3)在t＝0小时处在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersonii纤维素酶混合物并在经预处理的木质纤维素材料中添加836WBDG/g葡聚糖，并且在t＝24小时处在经预处理的木质纤维素材料中添加浓度为0.7mg蛋白质/g葡聚糖的Rasamsonia emersoniiΔLPMO-纤维素酶混合物(在t＝24小时处进行ΔLPMO-纤维素酶混合物添加)。
结果呈现于表2中。数据清楚地表明，与在通气开始后不另外掺加任何事物或掺加等量的不含LPMO的纤维素酶混合物时相比，在通气开始后添加LPMO蛋白质是有益的(葡萄糖释放增加了12％)。在通气开始后添加LPMO蛋白质(12％的额外葡萄糖释放)比在通气开始之前添加LPMO蛋白质(6％的额外葡萄糖释放)更有利。
表1：在通气开始之前添加LPMO蛋白质或ΔLPMO-纤维素酶混合物对水解过程结束(t＝144小时)处测得的葡萄糖释放的效应。
实验 葡萄糖释放(g/l)
没有LPMO掺加(对照反应) 50.9
在t＝0小时处掺加LPMO蛋白质 53.8
在t＝0处掺加ΔLPMO-纤维素酶混合物 50.9
表2：在通气开始之后添加LPMO蛋白质或ΔLPMO-纤维素酶混合物对水解过程结束(t＝144小时)处测得的葡萄糖释放的效应。
Figure BDA0002470823690000421
Figure BDA0002470823690000431

Claims (14)

1.一种由木质纤维素材料制备糖产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)预处理所述木质纤维素材料，
b)在包括以下步骤的方法中酶促水解经预处理的所述木质纤维素材料以获得所述糖产物：
i)首先用酶组合物处理所述木质纤维素材料，所述酶组合物包含裂解性多糖单加氧酶和选自由以下项组成的组的多肽：纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、内切木聚糖酶以及它们的任意组合；然后
ii)将氧添加到包含所述木质纤维素材料和所述酶组合物的混合物中；以及然后
iii)将附加的裂解性多糖单加氧酶添加到包含所述木质纤维素材料和所述酶组合物的混合物中；以及
c)任选地，回收所述糖产物。
2.一种由木质纤维素材料制备发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)执行根据权利要求1的方法；
b)发酵所述糖产物以产生所述发酵产物；以及
c)任选地，回收所述发酵产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述酶促水解中所述木质纤维素材料的干物质含量为10-40重量％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中包含裂解性多糖单加氧酶的所述酶组合物和/或所述附加的裂解性多糖单加氧酶来自真菌。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中包含裂解性多糖单加氧酶的所述酶组合物和/或所述附加的裂解性多糖单加氧酶是以真菌的全发酵液的形式添加的。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述真菌是Rasamsonia。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述发酵是通过酵母进行的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述酶促水解是在体积为至少10m3的生物反应器中进行的。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(ii)的开始是在步骤(i)开始之后1至100小时。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中添加的蛋白质的量是在经预处理的木质纤维素材料中1至40mg/g葡聚糖。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中添加的蛋白质的量是在经预处理的木质纤维素材料中0.01至20mg/g葡聚糖。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中添加的裂解性多糖单加氧酶与在步骤(iii)中添加的裂解性多糖单加氧酶的比率为10:1至1:10。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述酶促水解的pH为3.5至5.5。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述酶促水解的温度为50℃至70℃。
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