DE69836227T2

DE69836227T2 - Verfahren zur herstellung egiii-ähnlicher enzyme

Info

Publication number: DE69836227T2
Application number: DE69836227T
Authority: DE
Inventors: S. Benjamin Pacifica BOWER; Timothy San Carlos FOWLER; Ian Jay Palo Alto PHILLIPS
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-12-15
Also published as: CA2315017A1; EP1038008B1; DK1038008T3; EP1038008A2; WO1999031255A3; DE69836227D1; AU1726299A; WO1999031255A2; NZ505295A; CA2315017C; JP2003527065A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt auf Verfahren zum Erhalt von EGIII-ähnlichen bzw. -artigen Cellulasen, welche einzigartige, hochkonservierte Regionen mit einer bekannten nützlichen Cellulase gemeinsam haben. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erhalt von EGIII-Cellulasen aus Pilzen und Bakterien, die auf fünf wichtigen konservierten Aminosäuresequenzen, die auch in EGIII vorkommen, basieren.
2. Stand der Technik
Cellulasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse der β-D-glucosidischen Bindungen in Cellulosen fähig sind. Cellulolytische Enzyme sind traditionell in drei Hauptklassen eingeteilt worden: Endoglucanasen, Exoglucanasen oder Cellobiohydrolasen und β-Glucosidasen (Knowles, J. et al., (1987), TIBTECH 5, 255–261); und es ist bekannt, dass sie von einer großen Zahl von Bakterien, Hefen und Pilzen hergestellt werden.
Primär sind unter den Anwendungen, die für die Verwendung von cellulolytischen Enzymen entwickelt worden sind, jene, die den Abbau von (Holz-) Zellstoffbrei zu Zuckern für die Bioethanolproduktion, Gewebebehandlungen wie "Stonewashing" und "Biopolitur" und die Anwendung in Detergenzienzusammensetzungen betreffen. Somit ist von Cellulasen bekannt, dass sie bei der Behandlung von mechanischem Holzstoff nützlich sind (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16687). Zusätzlich ist bekannt, das Cellulasen als ein Futterzusatzstoff (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/04673) und bei der Naßvermahlung von Getreide nützlich sind.
Von primärer Wichtigkeit ist jedoch die Nutzung von Cellulasen bei der Behandlung von Geweben, d. h. in Detergenzienzusammensetzungen, um die Entfernung von Schmutz oder Grauschleier zu unterstützen (siehe z. B. Grossbritannien-Anmeldungen Nr. 2 075 028, 2 095 275 und 2 094 826, welche verbesserte Reinigungsleistung bei Inkorporation von Cellulase in Detergenzien darstellen) oder bei der Behandlung von Geweben vor dem Verkauf, um Anfühlen und Erscheinung des Gewebes zu verbessern. Somit stellt die Anmeldung Nr. 1 358 599, Grossbritannien, die Verwendung von Cellulase in Detergenzien zur Verringerung der Sprödigkeit von Baumwolle enthaltenden Stoffen dar, und Cellulasen werden in der Behandlung von Geweben zur Wiederherstellung verwendeter Stoffe durch Verleihen strahlenderer Farben genutzt (siehe z. B. The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report, Band 24, S. 54–61 (1986)). Zum Beispiel führt wiederholtes Waschen von Baumwolle enthaltenden Stoffen zu einem Grauschleier des Stoffes, wobei angenommen wird, dass dies aufgrund gerissener und ungeordneter Feinfasern, manchmal „pills" genannt, verursacht durch mechanische Einwirkung, auftritt. Dieser Grauschleier ist besonders auf farbigen Stoffen zu erkennen. Als eine Folge ist die Fähigkeit der Cellulase, die ungeordnete Oberschicht der Faser zu entfernen, und somit die Gesamterscheinung des Stoffs zu verbessern, von Wert gewesen.
Somit haben sich Cellulasen in vielen industriellen Verfahren als wirksam erwiesen. Demzufolge hat es in dem Gebiet einen Trend zur Suche nach spezifischen Cellulasezusammensetzungen oder Komponenten, die besonders wirksame Leistungsprofile in Bezug auf eine oder mehrere spezifische Anwendungen besitzen, gegeben. In dieser Sicht sind von Pilzen und Bakterien hergestellte (exprimierte) Cellulasen Gegenstand der Aufmerksamkeit gewesen. Zum Beispiel ist der Cellulase, die durch bestimmte Pilze, wie Trichoderma spp. (besonders Trichoderma longibrachiatum) hergestellt wird, viel Aufmerksamkeit zuteil geworden, weil ein vollständiges Cellulasesystem, welches zum Abbau kristalliner Formen von Cellulose fähig ist, leicht in großen Mengen über Fermentationsverfahren hergestellt wird. Dieser spezifische Cellulasekomplex ist extensiv analysiert worden, um die Art seiner spezifischen Komponenten und die Fähigkeit dieser Komponenten in industriellen Verfahren zu wirken, zu bestimmen. Zum Beispiel offenbaren Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, Seiten 234 ff (1988), dass komplette fungale Cellulasesysteme einige verschiedene Enzymklassifikationen, einschließlich jener, die als Exo-Cellobiohydrolasen (EC 3.2.1.91) ("CBH"), Endoglucanasen (EC 3.2.1.4) ("EG") und β-Glucosidasen (EC 3.2.1.21) ("BG") identifiziert worden sind, umfassen. Die fungalen Cellulaseklassifikationen von CBH, EG und BG können weiter ausgedehnt werden, um mehrfache Komponenten innerhalb jeder Klassifikation einzuschließen. Das U.S.-Patent Nr. 5 475 101 (Ward et al.) offenbart die Reinigung und die molekulare Klonierung von einem besonders nützlichen Enzym, genannt EGIII, welches von Trichoderma longibrachiatum abgeleitet wird.
Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/14953 offenbart Endoglucanasen, die durch eine Nukleinsäure, die jede beliebige aus einer Reihe von DNA-Sequenzen umfasst, von denen jede 20 Nukleotide aufweist, codiert werden.
Ooi et al., Curr. Genet., Band 18, S. 217–222 (1990) offenbaren die cDNA-Sequenz, die für Endoglucanase F1-CMC, gebildet von Aspergillus aculeatus, codiert, die die Aminosäurestränge NNLWG, ELMIW und GTEPFT enthält. Sakamoto et al., Curr. Genet., Band 27, S. 435–439 (1995) offenbart die cCNA-Sequenz, die die Endoglucanase CMCase-1 von Aspergillus kawachii IFO 4308, die die Aminosäurestränge ELMIW und GTEPFT enthält, codiert. Ward et al. offenbart die Sequenz von EGIII, das die Aminosäurestränge NNLWG, ELMIW und GTEPFT enthält. Zusätzlich werden zwei Cellulasesequenzen, eine aus Erwinia carotovara und Rhodothermus marinus in Saarilahti et al., Gene, Band 90, S. 9–14 (1990) und von Hreggvidsson et al., Appl. Environ. Microb., Band 62, Nr. 8, S. 3047–3049 (1996), welche den Aminosäurestrang ELMIW enthalten, offenbart. Jedoch keine dieser Referenzen offenbart oder legt nahe, dass diese Aminosäurestränge irgendeine besondere Relevanz bei der Identifikation oder Isolierung anderer Cellulasen aufweisen, und insbesondere wird nicht angemerkt, dass solche Cellulasen aus solch diversen Organismen, wie Bakterien, Actinomyceten und anderen Fadenpilzen, erhältlich sind.
Sakamoto et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 46: 538–544, 1996) offenbart die Klonierung von zwei Endo-1,4-β-Glucanasen von A. oryzae unter Verwendung von Primern, die mit anderen Aspergillussequenzen entworfen worden sind.
Trotz des Wissens im Fachgebiet bezüglich vieler Cellulasezusammensetzungen, die Anwendungen finden in einigen oder allen der oben genannten Bereiche, besteht ein fortwährender Bedarf für neue Cellulasezusammensetzungen mit verbesserten Eigenschaften, die nützlich sind, zum Beispiel, bei Gewebebehandlung, als eine Komponente in Detergenzienzusammensetzungen, bei der Behandlung von Zellstoffbrei und Papier, der Nahrungsmittelverarbeitung und bei der Umwandlung von Biomasse. Somit bleibt, während es eine wesentliche Verbesserung in Hinsicht des Verständnisses der Cellulasezusammensetzungen und ihrer Aktivitäten gegeben hat, ein Bedarf für alternative Cellulasezusammensetzungen, welche die vorteilhaften Wirkungen bekannter Cellulasezusammensetzungen beibehalten. Als Antwort auf diesen Bedarf, haben die Anmelder hierin überraschenderweise festgestellt, dass neuartige mikrobielle Enzyme, die mit einem Enzym, welches in industriellen Anwendungen nützlich ist, d. h. EGIII, verwandt sind, detektiert und erhalten werden können, dank der Anwesenheit von einzigartigen darin konservierten Sequenzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung war das Ergebnis intensiver Forschung durch die Erfinder davon, bezogen auf die Ermittlung, ob wertvolle Enzyme durch Verwendung von Routine-PCR-Technologien, basierend auf wichtigen und neu festgestellten konservierten Sequenzen, die in der Sequenz von EGIII festgestellt worden sind, detektiert werden können. Überraschenderweise haben die Erfinder hiervon festgestellt, dass diese konservierten Sequenzen nicht nur in EGIII, sondern auch in Enzymen, die von Organismen mit Klassifizierungen so divers wie filamentösen Pilzen bzw. Fadenpilzen, Bakterien und Actinomyceten abgeleitet werden, festgestellt werden. Durch Anwendung der vorliegenden Erfindung ist eine Reihe von Genen, die neuartige Cellulasen codieren, die mit EGIII dahingehend verwandt sind, dass sie die hierin beschriebenen konservierten Regionen besitzen, isoliert worden.
Demgemäß sieht die vorliegende Erfindung in einem Aspekt ein Verfahren zum Erhalt eines Gens vor, das eine EGIII-ähnliche Cellulase codiert, umfassend die folgenden Schritte:

(i) Herstellen von genomischer DNA aus einem Organismus von Interesse;
(ii) Herstellen eines DNA-Primers, der einen Aminosäurestrang codiert, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren der Folgenden: (a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly (b) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp (c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr; (d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-(Tyr/Phe); und (e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr;
(iii) Amplifizieren der genomischen DNA aus Schritt (i) durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA-Primern, codierend die Aminosäurestränge (a) und/oder (d) und (c) und/oder (e), unter Bedingungen, die zur Herstellung eines oder mehrerer Genfragmente aus der genomischen DNA geeignet sind;
(iv) Auswählen und Vereinigen der in Schritt (iii) amplifizierten Genfragmente und erneutes Amplifizieren unter Anwendung von DNA-Primern, die die Aminosäurestränge (a) und/oder (d) plus (b) codieren, oder unter Anwendung von DNA-Primern, die die Aminosäurestränge (c) und/oder (e) plus (b) codieren, um ein oder mehrere weitere Genfragmente herzustellen;
(v) Isolieren von der genomischen DNA der Gesamtheit oder eines Teils des Gens, welches einem oder mehreren der weiteren Genfragmente, die in Schritt (iv) hergestellt wurden, entspricht.

In einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird das obige Verfahren genutzt, um ein EGIII-ähnliches Enzym zu detektieren und umfasst das Markieren des DNA-Primers und das Mischen in Schritt (3) unter Bedingungen mit Standardstringenz, um eine Hybridisierung des DNA-Primers mit einer komplementären Sequenz innerhalb der genomischen DNA zu gestatten; und das anschließende Identifizieren und Isolieren des Gens, welches der komplementären Sequenz aus dem Organismus von Interesse entspricht, welches eine EGIII-Cellulase codiert.
Die mit den Methoden der vorliegenden Erfindung identifizierten Cellulasen können für die Gewebebehandlung, z. B. in Waschmitteldetergenzien oder in Zusammensetzungen für Stonewashing, zur Verringerung von Biomasse, bei der Produktion von Futtermittelzusätzen oder zur Behandlung von Futtermitteln, bei der Behandlung von Holzzellstoff für die Produktion von Papier oder auf Zellstoff basierenden Produkten sowie bei der Behandlung von Stärke während der Naßvermahlung von Getreide oder während des Trockenmahlens zur Erleichterung der Produktion von Glucose, Maissyrup mit hohem Fructosegehalt und/oder Alkohol verwendet werden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass ein wiederholbares Protokoll, welches die schnelle und einfache Isolation von Genen, die wertvolle Cellulaseenzyme codieren, festgestellt worden ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 illustriert die Aminosäuresequenz von EGIII von Trichoderma longibrachiatum.
2 illustriert Zweige des phylogenetischen Stammbaums der Pilze, wie er vom NCBI interpretiert wird.
3 illustriert einen Vergleich von einem Peptid mit 102 Resten, entnommen aus der Sequenz von EGIII, mit einem korrespondierenden Peptid von Fusarium equiseti [FUSEQIN]; Gliocladium roseum [GLIOIN]; Acremonium brachypenium [ACRHYPO] (hypothetische Proteinsequenz ohne Intron); Aspergillus kawachii [ASPKAWAI]; Aspergillus aculeatus [ASPACUI]; Humicola insolens [HUMIN]; Actinomycete (streptomyces) sp. 11AG8 [11AG8IN]; Erwinia carotovara [ERWCARIN]; Gliocladium roseum [GLIO314]; Gliocladium roseum [GLIOHYP] (hypothetische Proteinsequenz ohne Intron); Humicola grisea [HGRIS]; Rhodothermus marinus [RHMARIN]; Streptomyces lividans [SLIVINS]; Penicillium notatum [PENNOT]; Phanerochaete chrysosporium [PHANHYPO] (hypothetische Proteinsequenz ohne Intron); Emericel la desertoru [EMDESHYP] (hypothetische Proteinsequenz ohne Intron); Chaetomium brasiliense und [CHBRAS]; Myceliopthora thermophilia [MYCINS] (nur 27 Aminosäuren).
4 illustriert ein Diagramm, welches die prozentuale Ähnlichkeit von Proteinsequenzen, verglichen in 3, darstellt.
5 illustriert die DNA-Sequenz von EGIII aus Trichoderma longibrachiatum ohne Introns.
6 illustriert eine Anordnung der vollen Länge der Sequenz von 20 EGIII-ähnlichen Cellulasen in Ausrichtung auf EGIII, was äquivalente Residuen, basierend auf primärer Sequenzmodulierung anzeigt, einschließlich jener, abgeleitet von Trichoderma reesei, Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Aspergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasiliense, Fusarium equiseti, Fusarium javanicum (1), Fusarium javanicum (2), Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Emericella desertoru, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CeIB, Rhodothermus marinus und Erwinia carotovara.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Erhalt von Genen, welche ein EGIII-ähnliches Enzym codieren, welches cellulolytische Aktivität aufweist, und welches aus Organismen erhalten wird, und genauer gesagt aus anderen Organismen als Trichoderma spp., Humicola spp. und Erwinia carotovara sowie Rhodothermus marinus.
Innerhalb der Beschreibung werden bestimmte Begriffe offenbart, die nachfolgend zur Klärung der Art der beanspruchten Erfindung definiert werden.
„Cellulase" ist eine gut klassifizierte Kategorie von Enzymen im Fachgebiet, und schließt Enzyme, die in der Lage sind, Cellulosepolymere zu kürzeren Cello-Oligosaccharidoligomeren, Cellobiose und/oder Glucose zu hydrolysieren, ein. Gewöhnliche Beispiele von Cellulaseenzymen schließen Exocellobiohydrolasen und En doglucanasen ein, und können aus vielen Spezies cellulolytischer Organismen, besonders Pilze und Bakterien einschließend, erhalten werden.
„EGIII"-Cellulase bezieht sich auf die Endoglucanasekomponente, die in Ward et al., U.S.-Patent Nr. 5 475 101 und in Proceedings on the SecondTRICEL Symposium on Trichoderma Reesei Cellulases And Other Hydrolases, Suominen & Reinikainen Hrsg., Espoo Finnland (1993), S. 153–158 (Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Vol. B) beschrieben wird. Wie darin besprochen, wird EGIII von Trichoderma reesei (longibrachiatum) abgeleitet, und ist charakterisiert durch ein pH-Optimum von etwa 5,8, einen isoelektrischen Punkt (pI) von etwa 7,4 und ein Molekulargewicht von etwa 25 kDa. Das üblicherweise als EGII bezeichnete Enzym von Trichoderma reesei ist früher in der Literatur mit der Nomenklatur EGIII von einigen Autoren bezeichnet worden, dieses Enzym unterscheidet sich jedoch wesentlich von dem hierin definierien Enzym EGIII in Hinsicht des Molekulargewichts, des pI und des pH-Optimums.
„EGIII-ähnliches Enzym", „EGIII-ähnliches Protein" oder „EGIII-ähnliche Cellulase" gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet einerseits ein Enzym, welches eine cellulolytische Aktivität aufweist, umfassend eine Aminosäuresequenz, darin umfassend einen Aminosäurestrang, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren von:

(a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly
(b) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp
(c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr;
(d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)- (Tyr/Phe); und
(e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr;

In einer Ausführungsform weist das Enzym der Erfindung weiterhin wesentliche Struktur- und/oder Sequenz-Homologie zu EGIII auf. Somit hat in einem Aspekt in dieser Ausführungsform der Erfindung das Enzym mindestens 30 %, vorzugsweise mindestens 40 % und am meisten bevorzugt mindestens 60 % Aminosäurenidentität mit EGIII. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Homologie allein oft kein geeignetes Mass dafür ist, ob ein durch die hierin beschriebenen Verfahren identifiziertes Enzym ein EGIII-ähnliches Enzym darstellt. Demgemäß sollte, während homologe Enzyme tatsächlich durch die hierin beschriebenen und beispielhaft dargestellten Verfahren detektiert werden, der Grad der Homologie nicht als den Umfang der Erfindung einschränkend betrachtet werden.
Es ist in Betracht gezogen worden, dass die EGIII-ähnlichen Enzyme der Erfindung in vielen Organismen, die Cellulasen produzieren, gefunden werden können. Jedoch schließen wahrscheinliche Quellen von EGIII-ähnlichen Enzymen jene ein, die von bakteriellen oder pilzartigen Quellen kommen, und genauer gesagt von einem Actinomycet, einem Bazillus oder einem Fadenpilz. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym aus der Familie der Fadenpilze Metazoa gewonnen, vorzugsweise Euascomycetes. Innerhalb der Metazoa schließen fungale phylogenetische Klassifikationen, die EGIII-ähnliche Enzyme produzieren, die mitosporischen Pyrenomycetes (einschließlich Acremonium), Sordariales (einschließlich Thielavia), Hypocreales (einschließlich Nectriaceae wie Fusarium, Necitia, Verticillium, Myrothecium und Gliocladium; und Hypocrea) sowie Eurotiales (einschließlich mitosporische Trichocomaceae wie Aspergillus und Penicillium) ein.
Die Euascomycete gehört vorzugsweise zu Diaporthales, Halosphaeriales, Microascales, Ophiostomatales, Phyllachorales, Sordariales oder Xylariales. Auch gehört die Euascomycete vorzugsweise zu Hypocreales, umfassend Clavicipitaceae, Melanosporaceae, Nectriaceae, Niessliaceae oder mitosporische Hypocreales. Weiter gehört die Euascomycete vorzugsweise zu Hypocreaceae, worin diese Hypocreaceae Trichoderma nicht umfasst. Am meisten bevorzugt ist die Euascomycete Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliopthora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., Penicillium spp., Chaetomium spp., Emericella spp. und Phanerochaete spp. Spezifische Organismen, von denen angenommen wird, dass sie EGIII-ähnliche Enzyme aufweisen, schließen Chaetomium thermophilum var. therm., Chaetomium atrobrunneum, Chaetomium brasiliense, Chaetomium globosum, Chaetomium vitellium, Paecilomyces lilacinus, Chaetomium thermophilum var. Dissitum, Humicola insolens, Humicola brevis, Memnoniella ecchinata, Fusarium equiseti, Fusarium oxysporum, Fusarium stilboides, Myceliopthora thermophila, Fusarium javanicum, Humicola grisea var. thermoidea, Stibella thermophila, Melanocampus albomyces, Arthrobotrys superba, Myceliopthora hinunilea, Chaetomium pachypodiodes, Myrothecium verrucaria, Penicillium crysogenum, Malbranchea sulfurea, Lunulospora curvula, Emericella desertorum, Acremonium strictum, Cylindrocarpon heteronema und Ulocladium chartarum, ein.
Innerhalb der Actinomyceten ist für Streptomyces gezeig wordent, dass sie EGIII-ähnliche Enzyme besitzt. Wenn die Ursprungsspezies der EGIII-ähnlichen Cellulase Aspergillus ist, ist die spezifische Spezies ein Aspergillus, umfassend A. aeneus, A. anthodesmis, A. aureofulgens, A. aureolatus, A. avenaceus, A. awamorii, A. bisporus, A. brunneouniseriatus, A. campestris, A. caesiellus, A. candidus, A. carbonarius, A. cameus, A. cervinus, A. clavatroflavus, A. clavatoanicus, A. clavatus, A. conicus, A. conjunctus, A. crustosus, A. deflectus, A. dimorphicus, A. eburneocremeus, A. egyptiacus, A. ellipticus, A. elongatus, A. ficuum, A. flaschentraegeri, A. flavus, A. fumigatus, A. giganteus, A. glaucus, A. gorakhpurensis, A. gracilis, A. iizuke, A. itaconicus, A. japonicus, A. kambarensis, A. kanagawaensis, A. lanosus, A. leporis, A. longivesica, A. mellinus, A. multicolor, A. niger, A. nomius, A. nutans, A. ochraceus, A. pallidus, A. panamensis, A. parasiticus, A. parvulus, A. penicillioides, A. phialisepticus, A. phoenicis, A. proliferans, A. pulvinus, A. puniceus, A. raperi, A. recurvatus, A. restrictus, A. shirousami, A. sojae, A. sparsus, A. subolivaceus, A. subsessilis, A. tamarii, A. terreus, A. terricola, A. thomii, A. tubingensis, A. unguis, A. unilateralis, A. ustus, A. versicolor, A. wentii, A. xerophilus, A. zonatus, A. sp., ist.
Wie in den Ansprüchen dargelegt, können EGIII-ähnliche Enzyme gemäß Verfahren erhalten werden, welche DNA-Primer anwenden, die die folgenden Aminosäuresequenzen codieren:

(a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly
(b) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp
(c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr;
(d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-
(Tyr/Phe); und
(e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr

In der bevorzugten Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden degenerierte Primer, die mit den oben genannten Peptiden korrespondieren, hergestellt. Die Peptide werden mit einer genomischen DNA aus einem Zielorganismus (d. h. der Organismus, in welchem das EGIII-ähnliche Enzym gesucht wird) unter Bedingungen, die geeignet sind, um eine Standard-PCR-Reaktion zu starten, kombiniert. In diesem Verfahren ist es von Vorteil, degenerierte Primer auszuwählen, die mit den Peptiden(a) und/oder (d) und Primern, die mit (c) und/oder (e) korrespondieren, und die PCR mit diesen Peptiden durchzuführen. Nachdem die PCR-Reaktion durchgeführt worden ist, läßt man die entstandene DNA über ein Polyacrylamidgel laufen, und es werden Banden, die in ihrer Größe mit dem EGIII-Fragment, welches die Peptide (a) und/oder (d) zusätzlich zu (c) und/oder (e) umfasst, d. h. jene im Bereich von 400–1000 Basenpaaren bzw. bp, ausgewählt. Diese Fragmente werden vereinigt und reamplifiziert unter Verwendung von Primern, die mit den Peptiden (a) und/oder (d) korrespondieren, plus Primern, die mit dem Peptid (b) korrespondieren, oder, alternativ, unter Verwendung von Primern, die mit Peptid (c) und/oder (e) korrespondieren plus Primern, die mit Peptid (b) korrespondieren. Starke Banden der erwarteten Größe (im Fall EGIII-ähnlicher Enzyme werden die Banden mit dem Bereich von ungefähr 250–500 bp korrespondieren) werden ausgeschnitten und sequenziert. Die Sequenz wird dann verwendet, um exakt passende Primer zu entwerfen, und Verwendung dieser Primer, unter Nutzung der Technik, die als Rapid Amplification der genomischen DNA bezeichnet wird, endet mit dem Erhalt des Volllängengens, siehe z. B. Mizobuchi et al., BioTechniques, Band 15, Nr. 2, S. 215–216 (1993).
Zusätzlich ist es auch möglich, die degenerierten DNAs als Hybridisierungssonden gegen eine genomische Bibliothek, die von einem Zielorganismus erhalten worden ist, zu verwenden, um zu analysieren, ob ein gegebenes Fragment mit einer ähnlichen Sequenz im Zielorganismus korreliert. Ein nützlicher Hybridisierungsassay ist wie folgt: Genomische DNA aus einer bestimmten Zielquelle wird fragmentiert durch Verdauung mit einem Restriktionsenzym(en), z. B. EcoR I, Hind III, Bam HI, Cla I, Kpn I, Mlu I, Spe I, BgI II, Nco I, Xba I, Xho I und Xma I (bereitgestellt von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA und Boehringer Mannheim), gemäß den Anleitungen des Herstellers. Die Proben werden dann einer Elektrophorese über ein Agarosegel unterzogen (wie, z. B., 0,7 % Agarose), so dass die Trennung der DNA-Fragmente über die Größe sichtbar gemacht werden kann. Das Gel kann kurz in destilliertem H₂O gespült und daraufhin in einer geeigneten Lösung unter leichtem Schütteln von Guanidin gereinigt werden (wie, z. B., 0,25 M HCl), gefolgt von einer Denaturierung während 30 Minuten (z. B. in 0,4 M NaOH). Ein Renaturierungsschritt, in welchem das Gel in 1,5 M NaCl, 1M Tris, pH 7,0 unter leichtem Schütteln während 30 Minuten gelegt wird, kann eingeschlossen werden. Die DNA sollte dann auf eine geeignete, positiv geladene Membran, zum Beispiel die Maximum Strength Nytran Plus- Membran (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), unter Verwendung einer Transferlösung (wie, zum Beispiel, 6X SSC (900 mM NaCl, 90 mM Trinatriumcitrat)) transferiert werden. Nachdem der Transfer, im Allgemeinen nach etwa 2 Stunden oder mehr, vollständig ist, wird die Membran gespült und bei Raumtemperatur luftgetrocknet nach Verwendung einer Spüllösung (wie, zum Beispiel, 2X SSC [2X SSC = 300 mM NaCl, 30 mM Trinatriumcitrat]). Die Membran sollte dann vorhybridisiert werden (während ungefähr 2 Stunden oder mehr) in einer geeigneten Vorhybridisierungslösung (wie, zum Beispiel, eine wässrige Lösung, pro 100 ml enthaltend: 30–50 ml Formamid, 25 ml 20X SSPE (1X SSPE = 0,18 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM NaH₂PO₄, pH 7,7), 2,5 ml 20 % iges-SDS, 1 ml von 10 mg/ml gescherte DNA aus Heringssperma.
Eine zu den oben genannten Peptidsequenzen korrespondierende DNA-Sonde sollte mittels Elektrophorese in einem Agarosegel isoliert werden, das Fragment aus dem Gel exzisiert und aus der exzisierten Agarose rückgewonnen werden. Dieses gereinigte DNA-Fragment wird dann markiert (unter Verwendung, zum Beispiel, des Megaprime Markierungssystems gemäß den Anweisungen des Herstellers, um P³² in die DNA zu inkorporieren (Amersham International plc, Buckinghamshire, England)). Die markierte Sonde wird durch Erwärmen auf 95°C während 5 Minuten denaturiert und sofort der oben genannten Prähybridisierungslösung, die die Membran enthält, zugesetzt. Die Hybridisierungsreaktion sollte für eine angemessene Zeit und unter angemessenen Bedingungen, zum Beispiel während 18 Stunden bei 37°C unter leichtem Schütteln, voranschreiten. Die Membran wird gespült (zum Beispiel in 2X SSC/0,3 % SDS), und dann mit einer geeigneten Waschlösung und unter leichtem Schütteln gewaschen. Die gewünschte Stringenz wird eine Wiederspiegelung der Bedingungen sein, unter welchen die Membran (der Filter) gewaschen wird.
Spezifisch wird die Stringenz einer gegebenen Reaktion (d. h. der Grad der Homologie, der für eine erfolgreiche Hybridisierung nötig ist) stark von den Waschbedingungen abhängen, welchen der Filter vom Southern Blot nach der Hybridisierung unterzogen wird. "Niedere Stringenz" – Bedingungen, wie hierin definiert, umfassen das Waschen eines Filters von einem Southern Blot mit einer Lösung von 0,2X SSC/0,1 % SDS bei 20°C während 15 Minuten. Standardstringenzbedingungen umfassen einen weiteren Waschschritt, das Waschen des Filters von dem Southern Blot ein zweites Mal mit einer Lösung aus 0,2X SSC/0,1 % SDS bei 37°C während 30 Minuten umfassend.
Die DNA, die mit den oben entworfenen DNA-Primern hybridisiert und somit mit diesem Verfahren ein korrespondierendes EGIII-codierendes Gen identifizierte, kann durch Routineverfahren isoliert werden, und dazu verwendet werden, das korrespondierende EGIII-ähnliche Enzym gemäß Routinetechniken zu exprimieren. Ein bevorzugtes Klonierungsverfahren umfasst die schnelle Amplifizierung genomischer DNA-Enden, beschrieben in z. B. Mizobuchi et al., BioTechniques, Band 15, Nr. 2, S. 215–218 (1993). Nach Erhalt des klonierten Gens, werden Routineverfahren für den Einbau der DNA in einen Vektor, der dann in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden kann, genutzt. Die Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen führt dann zur Herstellung der EGIII-ähnlichen Cellulase, die wie für eine bestimmte Anwendung notwendig erhalten, gereinigt und zubereitet werden kann,.
Die EGIII-ähnlichen Enzyme werden vorzugsweise isoliert oder gereinigt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet Reinigung oder Isolierung im Allgemeinen, dass die EGIII-ähnliche Cellulase gegenüber ihrem natürlichen Zustand verändert wird, weil die EGIII-ähnliche Cellulase von einigen oder allen natürlich vorkommenden Substituenten, mit denen sie in der Natur verbunden ist, getrennt wird, z. B. dem Herkunftsorganismus oder anderen Cellulasen oder Enzymen, die vom Herkunftsorganismus in Verbindung mit der EGIII-Cellulase hergestellt werden. In ähnlicher Weise können die EGIII-ähnlichen Enzyme mit anderen Komponenten, die im natürlichen Zustand natürlicherweise nicht vorhanden sind, kombiniert werden. Die Isolierung oder die Reinigung kann gemäß im Fachgebiet bekannten Trennungstechniken, wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Trennung, Dialyse, Proteasebehandlung, Ammoniumsulfatfällung oder andere Proteinsalzfällungstechniken, Zentrifugieren, Größenausschlußchromatographie, Filtration, Mikrofiltration, Gelelektrophorese oder Trennung auf einem Gradienten zur Entfernung von ganzen Zellen, Zelltrümmern, Verunreinigungen, Fremdproteinen oder Enzymen, die in der letztendlichen Zusammensetzung unerwünscht sind, erfolgen.
"Cellulose enthaltendes Gewebe" bedeutet alle vernähten oder nicht vernähten Gewebe, Garne oder Fasern, hergestellt aus Baumwolle enthaltender oder Baumwolle nicht enthaltender Cellulose, oder aus Baumwolle oder keine Baumwolle enthaltenden Cellulosemischungen, einschließlich natürlicher Celluloseerzeugnisse und künstlich hergestellter Celluloseerzeugnisse (wie Jute, Flachs, Ramie, Rayon und Lyocell). Unter der Überschrift künstlich hergestellter cellulosehaltiger Gewebe sind regenerierte Gewebe, die im Fachgebiet gut bekannt sind, wie Rayon, eingeschlossen. Andere künstlich hergestellte Cellulose enthaltende Gewebe schließen chemisch modifizierte Cellulosefasern (z. B. durch Acetat derivatisierte Cellulose) und aus Lösungen gesponnene Cellulosefasern (z. B. Lyocell) ein. Spezifisch in die Definition der Cellulose enthaltenden Gewebe eingeschlossen ist jedes aus solchen Materialien hergestellte Garn oder jede Faser. Cellulose enthaltende Materialien werden oft in Mischungen mit Materialien wie Kunstfasern und natürlichen nicht-cellulosischen Fasern, wie Wolle und Seide, eingebaut.
"Baumwolle enthaltendes Gewebe" bedeutet vernähte oder nicht vernähte Gewebe, Garne oder Fasern, hergestellt aus reiner Baumwolle oder Baumwollmischungen, einschließlich gewebter Baumwollgewebe, gestrickter Baumwolle, Baumwolljeansstoffe, Baumwollgarne, Rohbaumwolle und dergleichen. Wenn Baumwollmischungen verwendet werden, ist die im Gewebe vorhandene Menge Baumwolle vorzugsweise mindestens 35 Gew.-% Baumwolle. Wenn als Mischungen verwendet, kann das im Gewebe verwendete Begleitmaterial eine oder mehrere Nichtbaumwollfasern einschließen, einschließlich cellulosischer oder synthetischer Fasern wie Polyamidfasern (zum Beispiel Nylon 6 und Nylon 66), Acrylfasern (zum Beispiel Polyacrylnitrilfasern) und Polyesterfasern (zum Beispiel Polyethylenterephthalat), Polyvinylalkoholfasern (zum Beispiel Vinylon), Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern und Aramidfasern.
"Stonewashing-Zusammensetzung" bedeutet eine Formulierung zur Verwendung beim Stonewashing von Cellulose enthaltenden Geweben. Stonewashing-Zusammensetzungen werden zur Modifikation von Cellulose enthaltenden Geweben vor der Präsentation zum Verkauf an die Verbraucher, d. h. während des Herstellungsprozesses, verwendet. Im Gegensatz dazu sind Detergenzienzusammensetzungen für die Reinigung von verschmutzter Kleidung bestimmt.
"Stonewashing" bedeutet die Behandlung des Cellulose enthaltenden Gewebes mit einer Cellulaselösung unter Schüttel- und Kaskadenbedingungen, d. h. in einer Waschmaschine mit rotierender Trommel, um dem Jeansstoff eine "stonewashed" Erscheinung zu übertragen. Die Cellulaselösung gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von Steinen in solchen im Fachgebiet anerkannten Verfahren entweder ganz oder teilweise funktionell ersetzen. Verfahren, um einem Jeansstoff eine "stonewashed" Erscheinung zu geben, werden im U.S.-Patent Nr. 4 832 864, welches hierin in seiner Gesamtheit als Referenz bezogen ist, beschrieben. Allgemein sind "Stonewashing"-Techniken bei mit Indigo gefärbten Baumwolljeansstoffen angewendet worden.
"Detergenzienzusammensetzung" bedeutet eine Mischung, welche zur Verwendung in einem Waschmedium für die Reinigung von verschmutzten Cellulose enthaltenden Geweben gedacht ist. Im Kontext mit der vorliegenden Erfindung können solche Zusammensetzungen zusätzlich zu Cellulasen und oberflächenaktiven Mitteln zusätzliche hydrolytische Enzyme, Builder bzw. Aufbaustoffe, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe, Inhibitoren für Balligwerden, Maskierungsmittel, Cellulaseaktivatoren, Antioxidantien und Solubilisierungsmittel enthalten. Solche Zusammensetzungen werden im Allgemeinen für die Reinigung von verschmutzter Kleidung verwendet und werden nicht im Herstellungsprozess genutzt, im Gegensatz zu den stonewashing-Zusammensetzungen. Cellulase umfassende Detergenzienzusammen setzungen sind zum Beispiel in Clarkson et al., U.S.-Patent Nr. 5 290 474 und in der EP Veröffentlichung Nr. 271 004 beschrieben.
"Derivat" bedeutet ein Protein, welches von einem Vorläuferprotein (z. B. das native Protein) durch Zusatz von einer oder mehreren Aminosäuren an entweder das C- oder N-terminale Ende oder an beide, Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren unterschiedlichen Stellen in der Aminosäuresequenz, Entfernung von einer oder mehreren Aminosäuren an einem oder an beiden Enden des Proteins oder an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz oder Einfügung von einer oder mehreren Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen der Aminosäuresequenz abgeleitet wird. Die Herstellung eines Enzymderivats wird vorzugsweise durch Modifikation einer DNA-Sequenz, die das native Protein codiert, Transformation dieser DNA-Sequenz in einen geeigneten Wirt und Expression der modifizierten DNA-Sequenz, um das Derivatenzym zu bilden, erreicht. Das Derivat der Erfindung schließt Peptide ein, die veränderte Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer Aminosäuresequenz eines Vorläuferenzyms (z. B. ein Wildtyp oder im nativen Zustand befindliches Enzym) umfassen, wobei die Peptide eine charakteristische Enzymnatur des Vorläuferenzyms beibehalten, die jedoch in manchem spezifischen Aspekt geänderte Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel kann ein Cellulasederivat ein erhöhtes pH-Optimum oder erhöhte Temperatur- oder Oxidations-Stabilität aufweisen, wird jedoch seine charakteristische cellulolytische Aktivität beibehalten. In ähnlicher Weise schließen Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung eine Cellulose bindende Domäne ein, von der Teile entweder zugesetzt, entfernt oder modifiziert wurden, in einer Weise, dass ihre Cellulose bindende Aktivität wesentlich verringert oder verstärkt wird. Es wird angenommen, dass Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung von einem DNA-Fragment abgeleitet werden können, welches ein Cellulasederivat codiert, worin die funktionelle Aktivität des exprimierten Cellulasederivats beibehalten wird. Zum Beispiel kann ein eine Cellulase codierendes DNA-Fragment weiter eine DNA-Sequenz oder einen Teil davon enthalten, die einen Anker oder Linker codiert, der an der Cellulase-DNA-Sequenz an entweder dem 5'- oder 3'-Ende hängt, worin die funktionelle Aktivität der codierten Cellulasedomäne beibehalten wird. Derivat schließt weiterhin die chemische Modifikation ein, um die Eigenschaften des Enzyms zu ändern.
"Expressionsvektor" bedeutet ein DNA-Konstrukt, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche in funktionsfähiger Weise an eine geeignete Regulationssequenz gebunden ist, die fähig ist, die Expression der DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Solche Regulationssequenzen können einen Promoter zur Bewirkung der Transkription, eine optionale Operatorsequenz zur Regulation der Transkription, eine Sequenz, die geeignete Ribosomenbindungsstellen auf der mRNA codiert, und Sequenzen, die die Beendigung der Transkription und der Translation regulieren, enthalten. Unterschiedliche Zelltypen werden vorzugsweise mit unterschiedlichen Expressionsvektoren genutzt. Ein bevorzugter Promoter für in Bacillus subtilis verwendete Vektoren ist der AprE-Promoter; ein bevorzugter, in E. coli verwendeter Promoter ist der Lac-Promoter, ein bevorzugter, in Saccharomyces cerevisiae verwendeter Promoter ist PGKI, ein bevorzugter, in Aspergillus niger verwendeter Promoter ist glaA und ein bevorzugter Promoter für Trichoderma reesei (longibrachiatum) ist cbhl. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach eine potentielle genomische Einfügung sein. Wenn er einmal in einen geeigneten Wirt transformiert ist, kann sich der Vektor replizieren und unabhängig vom Wirtsgenom funktionieren, oder er kann sich unter geeigneten Bedingungen, in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden Plasmid und Vektor manchmal austauschbar verwendet. Jedoch ist beabsichtigt, dass die Erfindung andere Formen von Expressionsvektoren einschließt, die gleichwertige Funktionen erfüllen, und die im Fachgebiet bekannt sind oder werden. Somit kann eine große Vielfalt von Wirts-/Expressionsvektorenkombinationen zur Expression der DNA-Sequenzen dieser Erfindung angewendet werden. Nützliche Expressionsvektoren können, zum Beispiel, aus Segmenten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen, wie verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, bestehen, z. B. Plasmiden von E. Coli, einschließlich von col E1, pCR1, pBR322, pMb9, pUC 19 und deren Derivaten, Plasmiden mit weiterem Wirtszellenbereich, z. B. RP4, Phagen-DNAs, z. B. den zahlreichen Derivaten des λ-Phagen, z. B. NM989, und anderen DNA-Phagen, z. B. M13 und filamentösen einzelsträngigen DNA-Phagen, Hefe-Plasmiden, wie dem 2μ-Plasmid oder Derivaten davon, in eukaryotischen Zellen nützlichen Vektoren, wie in Tierzellen nützliche Vektoren und Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet werden, wie Plas mide, die modifiziert worden sind, um Phagen-DNA oder andere Expressionsregulationssequenzen anzuwenden. Expressionstechniken unter Verwendung der Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung sind im Fachgebiet bekannt, und sind allgemein beschrieben in, zum Beispiel, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press (1989). Oft werden solche Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen der Erfindung einschließen, in einen einzelligen Wirt durch direkte Einführung in das Genom einer bestimmten Spezies durch ein Integrationsereignis transformiert (siehe z. B. Bennett & Lasure, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, S. 70–78, (1991) und darin zitierte Artikel, die die gezielte genomische Einführung in fungale Wirte beschreiben).
"Wirtsstamm" oder "Wirtszelle" bedeutet einen geeigneten Wirt für einen Expressionsvektor, der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. In der vorliegenden Erfindung nützliche Wirtszellen sind im Allgemeinen prokaryotische oder eukaryotische Wirte, einschließlich jedes transformierbaren Mikroorganismus, in welchem eine Expression erzielt werden kann. Spezifisch können Wirtsstämme Bacillus subtilis, Escherichia coli, Trichoderma reesei (longibrachiatum), Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus niger sein. Wirtszellen werden transformiert oder transfiziert mit Vektoren, die mit rekombinanten DNA-Techniken konstruiert werden. Solche transformierten Wirtszellen sind zu beidem in der Lage, der Replikation von Vektoren, die Swollenin und seine Varianten (Mutanten) codieren, oder der Expression des gewünschten Peptidprodukts. In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet "Wirtszelle" beides, die Zellen und die Protoplasten, die von den Zellen von Trichoderma sp. gebildet werden.
"Signalsequenz" bedeutet eine Sequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Teil eines Proteins gebunden sind, was die Sekretion der reifen Form des Proteins aus der Zelle nach außen erleichtert. Diese Definition einer Signalsequenz ist eine funktionelle. Der reifen Form des extrazellulären Proteins fehlt die Signalsequenz, welche während des Sekretionsprozesses abgespalten wird.
"DNA-Vektor" bedeutet eine Nukleotidsequenz, welche eines oder mehrere DNA-Fragmente oder Fragmente von DNA-Varianten umfasst, die ein EGIII-ähnliches Enzym oder Derivate, wie oben beschrieben, codieren, die nach Transformation in eine geeignete Wirtszelle verwendet werden können, um die Expression der EGIII-ähnlichen Cellulase zu bewirken.
"Funktionell gebunden an" bedeutet, dass eine regulatorische Region, wie ein Promoter, Terminator, Sekretionssignal- oder Enhancer-Region an ein strukturelles Gen gebunden ist und die Expression dieses Gens reguliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression, Reinigung und/oder Isolierung und Verwendung von EGIII-ähnlichen Enzymen und von Derivaten solcher EGIII-ähnlichen Enzyme. Diese Enzyme werden vorzugsweise durch Rekombinationsverfahren unter Verwendung des identifizierten und gemäß den oben beschriebenen Verfahren isolierten Gens hergestellt. Enzyme für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung können jedoch durch andere im Fachgebiet anerkannte Mittel, wie die Reinigung aus natürlichen Isolaten, gewonnen werden.
Ein Gedanke der Erfinder sieht vor, dass der zu transformierende Mikroorganismus für den Zweck der Expression eines EGIII-ähnlichen Enzyms vorteilhafterweise einen von Trichoderma sp. abgeleiteten Stamm umfassen kann. Somit umfasst ein bevorzugter Modus für die Herstellung EGIII-ähnlicher Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung die Transformation einer Trichoderma sp.-Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, welches mindestens ein Fragment einer DNA umfasst, die einen Teil oder die Gesamtheit des EGIII-ähnlichen Enzyms, detektiert wie oben beschrieben, codiert. Das DNA-Konstrukt wird im Allgemeinen funktional an einen Promoter gebunden sein. Die transformierte Wirtszelle läßt man dann unter Bedingungen wachsen, so dass das gewünschte Protein exprimiert wird. Nachfolgend wird das gewünschte Proteinprodukt bis zur substantiellen Homogenität gereinigt.
Tatsächlich kann es jedoch sein, dass das beste Expressionsvehikel für eine gegebene DNA, die ein EGIII-ähnliches Enzym codiert, verschieden sein kann. Somit kann es sein, dass es am vorteilhaftesten ist, ein Protein in einem Transformationswirt zu exprimieren, der eine phylogenetische Ähnlichkeit mit dem Ursprungsorganismus des EGIII-ähnlichen Enzyms aufweist. Demgemäß ist die vorliegende Beschreibung eines Trichoderma spp.-Expressionssystems nur für darstellende Zwecke bereitgestellt und als eine Option für die Expression des EGIII-ähnlichen Enzyms. Ein Fachmann kann jedoch geneigt sein, die DNA, die das EGIII-ähnliche Enzym codiert, in einer anderen Wirtszelle, falls geeignet, zu exprimieren, und es sollte so verstanden werden, dass der Ursprung des EGIII-ähnlichen Enzyms für die Bestimmung des optimalen Expressionswirts betrachtet wird. Zusätzlich wird der Fachmann in dem Gebiet fähig sein, das beste Expressionssystem für ein bestimmtes Gen durch Routinetechniken unter Verwendung der im Fachgebiet verfügbaren Werkzeuge auszuwählen.
In einer Ausführungsform umfasst der Stamm T. Reesei (longibrachiatum), welcher ein nützlicher Stamm für den Erhalt von überexprimiertem Protein ist. Zum Beispiel ist von RL-P37, beschrieben von Sheir-Neiss et al. in Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984), S. 46–53 bekannt, dass erhöhte Mengen von Cellulaseenzymen sezerniert werden. Funktionale Äquivalente von RL-P37 schließen den Trichoderma reesei (longibrachiatum)-Stamm RUT-C30 (ATCC Nr. 56765) und den Stamm QM9414 (ATCC Nr. 26921) ein. Es wird in Betracht gezogen, dass diese Stämme ebenfalls in der Überexprimierung von EGIII-ähnlichen Enzymen nützlich sein würden.
Wo es erwünscht ist, die EGIII-ähnliche Cellulase in der Abwesenheit von potentiell schädlicher nativer cellulolytischer Aktivität zu erhalten, ist es nützlich, einen Trichoderma-Wirtszellstamm zu erhalten, bei dem ein oder mehrere Cellulasegene vor der Einführung eines DNA-Konstrukts oder des Plasmids, welches das DNA-Fragment enthält, dass das EGIII-ähnliche Enzym codiert, deletiert worden ist (sind). Solche Stämme können durch das in U.S.-Patent Nr. 5 246 853 und in WO 92/06209, deren Offenbarungen hierin durch den Bezug darauf einbezogen sind, offenbarte Verfahren hergestellt werden. Durch die Expression eines EGIII-ähnlichen Enzyms in einem Wirtsmikroorganismus, dem ein oder mehrere Cellulasegene fehlen, werden die Identifikations- und nachfolgenden Reinigungsverfahren vereinfacht. Jedes Gen von Trichoderma sp., welches kloniert worden ist, kann deletiert werden, zum Beispiel die cbh1, cbh2, egl1 und egl3-Gene sowie jene, die das EGIII- und/oder EGV-Protein codieren (siehe jeweils z. B. U.S.-Patent Nr. 5 475 101 und WO 94/28117).
Gendeletion kann durch Einfügung einer Form des gewünschten abzuschaltenden oder zu zerstörenden Gens in ein Plasmid mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren vollbracht werden. Das Deletionsplasmid wird dann an einer geeigneten Restriktionsenzymstelle (-n) innerhalb der gewünschten, das Gen codierenden Region geschnitten, und die das Gen codierende Sequenz oder ein Teil davon wird mit einem selektierbaren Marker ersetzt. Flankierende DNA-Sequenzen am Ort des zu deletierenden oder zu zerstörenden Gens, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 und 2,0 kb, verbleiben auf jeder Seite des selektierbaren Markergens. Ein geeignetes Plasmid zur Deletion wird im Allgemeinen einzigartige Restriktionsenzymstellen darin aufweisen, um es dem Fragment, welches das deletierte Gen enthält, einschließlich der flankierenden DNA-Sequenzen, und dem selektierbaren Markergen zu ermöglichen, als ein einziges lineares Stück entfernt zu werden.
Ein selektierbarer Marker muss so ausgewählt werden, dass die Detektion des transformierten Fungus ermöglicht wird. Jedes selektierbare Markergen, welches im ausgewählten Mikroorganismus exprimiert wird, wird geeignet sein. Zum Beispiel wird bei Trichoderma sp. der selektierbare Marker so gewählt, dass die Anwesenheit des selektierbaren Markers in den Transformanten deren Eigenschaften nicht wesentlich beeinflussen wird. Solch ein selektierbarer Marker kann ein Gen sein, welches ein im Assay bestimmbares Produkt codiert. Es kann zum Beispiel eine funktionale Kopie von einem Trichoderma sp.-Gen verwendet werden, welche, wenn sie im Wirtstamm fehlt, dazu fuhrt, dass der Wirtstamm einen auxotrophen Phänotyp darstellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein pyr4^–-Derivatstamm von Trichoderma sp. mit einem funktionalen pyr4-Gen transformiert, welches somit einen selektierbaren Marker für die Transformation bereitstellt. Ein pyr4^–-Derivatstamm kann durch Auswahl von Trichoderma sp.-Stämmen, welche gegen Fluoroorotsäure (FOA) resistent sind, erhalten werden. Das pyr4-Gen codiert Orotidin-5'-monophosphat-Decarboxylase, ein Enzym, welches für die Biosynthese von Uridin erforderlich ist. Stämme mit einem intakten pyr4-Gen wachsen in einem Medium, welches kein Uridin enthält, sind aber gegenüber Fluororotsäure empfindlich. Es ist möglich, pyr4^–-Derivatstämme, die kein funktionales Orotidinmonophosphat-Decarboxylaseenzym besitzen und Uridin für das Wachstum benötigen, auszuwählen, indem nach FOA-Resistenz ausgewählt wird. Unter Verwendung der FOA-Auswahltechnik ist es auch möglich, Stämme zu erhalten, die Uridin benötigen und keine funktionale Orotatpyrophosphoribosyl-Transferase enthalten. Es ist möglich, diese Zellen mit einer funktionalen Kopie des dieses Enzym codierenden Gens zu transformieren (Berges and Barreau, Curr. Genet., 19, 1991, S. 359–365). Die Auswahl der Derivatstämme kann leicht unter Einsatz der FOA-Resistenztechnik, auf die vorangehend Bezug genommen wird, durchgeführt werden, und somit wird das pyr4-Gen vorzugsweise als selektierbarer Marker verwendet.
Um pyr4^–-Trichoderma sp. so zu transformieren, dass sie die Fähigkeit, ein oder mehrere Cellulasegene zu exprimieren, nicht aufweist, wird ein einzelnes DNA-Fragment, welches ein zerstörtes oder deletiertes Cellulasegen umfasst, dann aus dem Deletionsplasmid isoliert und zur Transformation eines geeigneten pyr^–Trichoderma-Wirtes verwendet. Dann werden die Transformanten identifiziert und ausgewählt, basierend auf ihrer Fähigkeit, das pyr4-Genprodukt zu exprimieren, und somit die Uridin-Auxotrophie des Wirtsstammes auszugleichen. Dann wird eine Southern Blot-Analyse mit den entstandenen Transformanten durchgeführt, um ein doppeltes Crossover-Integrationsereignis zu identifizieren und zu bestätigen, welches einen Teil oder die Gesamtheit der codierenden Region der genomischen Kopie des zu deletierenden Gens mit den selektierbaren pyr4-Markern ersetzt.
Obwohl die oben beschriebenen spezifischen Plasmidvektoren die Herstellung der pyr^–-Transformanten betreffen, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Vektoren beschränkt. Verschiedene Gene können im Trichoderma sp.-Stamm unter Verwendung der oben genannten Techniken deletiert und ersetzt werden. Zusätzlich können alle erhältlichen selektierbaren Marker, wie oben besprochen, verwendet werden. Tatsächlich kann jedwedes Trichoderma sp.-Gen, das kloniert und somit identifiziert worden ist, unter Nutzung der oben beschriebenen Strategie aus dem Genom entfernt werden.
Wie oben erwähnt, sind die verwendeten Wirtstämme Derivate von Trichoderma sp., welche kein oder ein nicht funktionales Gen oder Gene aufweisen, die mit dem ausgewählten selektierbaren Marker entsprechen. Wenn zum Beispiel der selektierbare Marker pyr4 ausgewählt worden ist, dann wird ein spezifischer pyr4^–-Derivatstamm als Empfänger in der Transformationsprozedur verwendet. In ähnlicher Weise können selektierbare Marker, die Trichoderma sp.-Gene umfassen, die äquivalent zu den Aspergillus nidulans-Genen amdS, argB, trpC, niaD sind, verwendet werden. Der korrespondierende Empfängerstamm muss daher ein jeweiliger Derivatstamm, wie argB^–, trpC^–, niaD^–, sein.
Die DNA, die das EGIII-ähnliche Enzym codiert, wird dann für die Einpassung in einen geeigneten Mikroorganismus vorbereitet. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst DNA, die ein EGIII-ähnliches Enzym codiert, all jene DNA, die notwendig ist, für ein Protein zu codieren, welches funktionelle cellulolytische Aktivität aufweist. Das DNA-Fragment oder das Varianten-DNA-Fragment, welches das EGIII-ähnliche Enzym oder Derivat codiert, kann funktional an eine fungale Promotersequenz gebunden sein, zum Beispiel, den Promoter des cbh1- oder des egl1-Gens.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass mehr als eine Kopie der DNA, die ein EGIII-ähnliches Enzym codiert, in den Stamm rekombiniert werden kann, um die Überexprimierung zu erleichtern. Die DNA, die die EGIII-ähnliche Cellulase codiert, kann durch die Konstruktion eines Expressionsvektors, der die DNA, die die Cellulase codiert, trägt, hergestellt werden. Der Expressionsvektor, der das eingefügte DNA-Fragment, das die EGIII-ähnliche Cellulase codiert, trägt, kann jeder Vektor sein, der fähig ist, sich autonom in einem gegebenen Wirtsorganismus zu replizieren, oder sich in die DNA des Wirts zu integrieren, typischerweise ein Plasmid. In bevorzugten Ausführungsformen werden zwei Typen von Expressionsvektoren zum Erhalt der Genexpression in Betracht gezogen. Die erste enthält DNA-Sequenzen, in welchen der Promoter, die das Gen codierende Region und die Terminator-Sequenz alle aus dem zu exprimierenden Gen stammen. Gen-Trunkierung kann, wo gewünscht, erzielt werden durch Entfernung unerwünschter DNA-Sequenzen (z. B. für nicht gewollte Domänen codierend), damit die zu exprimierende Domäne unter der Kontrolle ihrer eigenen transkriptionalen und trans lationalen regulatorischen Sequenzen verbleibt. Ein selektierbarer Marker ist auch auf dem Vektor enthalten, was die Auswahl für die Integration in den Wirt von mehrfachen Kopien der neuartigen Gensequenzen erlaubt.
Der zweite Typ des Expressionsvektors ist vorgefertigt und enthält Sequenzen, die für ein hohes Transkriptionsniveau erforderlich sind, sowie einen selektierbaren Marker. Es wird angenommen, dass die codierende Region für ein Gen oder einen Teil davon in diesen Expressionsvektor für allgemeine Zwecke eingefügt werden kann, so dass sie sich unter der transkriptionalen Regulation der Expressionskassetten-Promoter und – Terminator-Sequenzen befindet. Zum Beispiel ist pTEX ein solcher Vektor für allgemeine Zwecke. Gene oder Teile davon können in Stromabwärtsrichtung vom starken cbh1-Promoter eingefügt werden.
In dem Vektor soll die DNA-Sequenz, die das EGIII-ähnliche Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, in funktionsfähiger Weise an transkriptionale und translationale Sequenzen gebunden sein, d. h. eine geeignete Promotersequenz und Signalsequenz im Leserahmen zum strukturellen Gen. Der Promoter kann jedwede DNA-Sequenz sein, die transkriptionale Aktivität in der Wirtszelle zeigt, und kann von Genen abgeleitet werden, die Proteine codieren, die entweder homolog oder heterolog zur Wirtszelle sind. Das Signalpeptid stellt die extrazelluläre Produktion des EGIII-ähnlichen Enzyms oder der Derivate davon bereit. Die DNA, die die Signalsequenz codiert, ist vorzugsweise jene, die natürlicherweise mit dem zu exprimierenden Gen assoziiert ist, jedoch wird die Signalsequenz von jedem geeigneten Ursprung, zum Beispiel einer Exo-Cellobiohydrolase oder Endoglucanase von Trichoderma, in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Die verwendeten Verfahren, um die DNA-Sequenzen, die das EGIII-ähnliche Enzym codieren, mit dem Promoter zu ligieren, und der Einbau in geeignete Vektoren sind im Fachgebiet gut bekannt.
Der vorangehend beschriebene DNA-Vektor oder das DNA-Konstrukt kann in die Wirtszelle in Übereinstimmung mit bekannten Techniken, wie Transformation, Trans fektion, Mikroinjektion, Mikroporation, bio-ballistischen Beschuss und dergleichen eingefügt werden.
Bei der bevorzugten Transformationstechnik muss berücksichtigt werden, dass die Permeabilität der Zellwand für DNA bei Trichoderma sp. sehr gering ist. Demgemäß ist die Aufnahme der gewünschten DNA-Sequenz, des Gens oder Genfragments bestenfalls minimal. Es gibt eine Reihe von Verfahren, um die Permeabilität der Trichoderma sp.-Zellwand im Derivatstamm (d. h., dem ein funktionales Gen, welches mit dem verwendeten selektierbaren Marker korrespondiert, fehlt) vor dem Transformationsverfahren zu erhöhen.
Die bevorzugte Methode in der vorliegenden Erfindung, um Trichoderma sp. für die Transformation vorzubereiten, schließt die Herstellung von Protoplasten aus Pilzmycel ein. Das Mycel kann von gekeimten vegetativen Sporen erhalten werden. Das Mycel wird mit einem Enzym behandelt, welches die Zellwand unter Bildung von Protoplasten verdaut. Die Protoplasten werden dann durch die Anwesenheit eines osmotischen Stabilisators im Suspensionsmedium geschützt. Diese Stabilisatoren schließen Sorbitol, Mannitol, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und dergleichen ein. Normalerweise variiert die Konzentration dieser Stabilisatoren zwischen 0,8 M und 1,2 M. Es ist vorzuziehen, eine etwa 1,2 M Sorbitollösung im Suspensionsmedium zu verwenden.
Die Aufnahme der DNA in den Wirtstamm Trichoderma sp. hängt von der Calciumionenkonzentration ab. Im Allgemeinen werden zwischen etwa 10 mM CaCl₂ und 50 mM CaCl₂ in einer Aufnahmelösung verwendet. Neben dem Bedarf für das Calciumion in der Aufnahmelösung, sind im Allgemeinen andere Bestandteile, die eingeschlossen sind, ein Puffersystem, wie TE-Puffer (10 mM Tris, pH 7,4; 1 mM EDTA) oder 10 mM MOPS, pH 6,0 Puffer (Morpholinpropansulfonsäure) und Polyethylenglycol (PEG). Es wird angenommen, dass das Polyethylenglycol die Verschmelzung der Zellmembranen bewirkt, somit wird ermöglicht, dass die Inhalte des Mediums in das Zytoplasma des Trichoderma sp.-Stamms gelangen und die Plasmid-DNA in den Zellkern transferiert wird. Diese Fusion hinterläßt häufig eine Vielzahl von Kopien der Plasmid-DNA, die schonend in das Wirtschromosom integriert sind.
Normalerweise wird eine Suspension, die die Trichoderma sp.-Protoplasten oder Zellen enthält, die einer Permeabilitätsbehandlung bei einer Dichte von 10⁸ bis 10⁹/ml, vorzugsweise 2·10⁸/ml, unterzogen worden sind, bei der Transformation verwendet. Ein Volumen von 100 Mikrolitern dieser Protoplasten oder Zellen in einer geeigneten Lösung (z. B. 1,2 M Sorbitol; 50 mM CaCl₂) wird mit der gewünschten DNA vermischt. Im Allgemeinen wird eine hohe Konzentration von PEG der Aufnahmelösung zugesetzt. Von 0,1 bis 1 Volumenteil des 25%-PEG 4000 kann der Protoplastensuspension zugesetzt werden. Es ist jedoch vorzuziehen, etwa 0,25 Volumina der Protoplastensuspension zuzusetzen. Zusatzstoffe wie Dimethylsulfoxid, Heparin, Spermidin, Kaliumchlorid und dergleichen können ebenfalls der Aufnahmelösung zugesetzt werden und die Transformation unterstützen.
Im Allgemeinen wird die Mischung dann bei ungefähr 0°C während einer Dauer von zwischen 10 und 30 Minuten inkubiert. Zusätzliches PEG wird der Mischung dann zugegeben, um die Aufnahme des gewünschten Gens oder der gewünschten DNA-Sequenz weiter zu verstärken. Das 25%-PEG 4000 wird im Allgemeinen in Volumina vom 5 bis 15-fachen des Volumens der Transformationsmischung zugefügt; es können jedoch größere und kleinere Volumina geeignet sein. Das 25%-PEG 4000 beträgt vorzugsweise das 10-fache Volumen der Transformationsmischung. Nachdem das PEG zugesetzt wurde, wird die Transformationsmischung bei Raumtemperatur vor der Zugabe einer Sorbitol- und CaCl₂-Lösung inkubiert. Weiter wird die Protoplastensuspension dann geschmolzenen Aliquoten eines Wachstumsmediums zugefügt. Dieses Wachstumsmedium erlaubt nur das Wachstum der Transformanten. Jedes beliebige Wachstumsmedium kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, das für das Wachstum der gewünschten Transformanten geeignet ist. Wenn jedoch Pyr⁺-Transformanten ausgewählt worden sind, ist es vorzuziehen, ein Wachstumsmedium zu verwenden, welches kein Uridin enthält. Die nachfolgenden Kolonien werden auf einem von Uridin befreiten Wachstumsmedium transferiert und gereinigt.
An diesem Punkt können stabile Transformanten von instabilen Transformanten durch ihre schnellere Wachstumsrate und die Bildung kreisförmiger Kolonien mit einem eher glatten als zerfransten Rand auf festem Kulturmedium, welchem Uridin fehlt, unterschieden werden. Zusätzlich kann in manchen Fällen ein weiterer Stabilitätstest durchgeführt werden, indem man die Transformanten auf festem, nicht-selektivem Medium wachsen lässt (d. h. Uridin enthaltend), Sporen von diesem Kulturmedium gesammelt werden und der Prozentsatz dieser Sporen bestimmt wird, die nachfolgend auf selektivem Medium ohne Uridin keimen und wachsen werden.
In einer besonderen Ausführungsform des oben genannten Verfahrens werden die EGIII-ähnlichen Enzyme oder Derivate davon in aktiver Form aus der Wirtszelle nach Wachstum in flüssigen Medien entweder als ein Ergebnis der geeigneten posttranslationalen Prozessierung des neuartigen EGIII-ähnlichen Enzyms oder von Derivaten davon gewonnen.
Das exprimierte EGIII-ähnliche Enzym kann aus dem Medium durch herkömmliche Techniken, einschließlich Trennung der Zellen vom Medium durch Zentrifugieren, Filtrieren und Fällung der Proteine im Überstand oder Filtrat mit einem Salz, zum Beispiel Ammoniumsulfat, gewonnen werden. Zusätzlich können Chromatographieverfahren, wie Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie, verwendet werden. Antikörper (polyklonale oder monoklonale) können gegen das natürliche gereinigte EGIII-ähnliche Enzym gebildet werden, oder synthetische Peptide können aus Teilen des EGIII-ähnlichen Enzymmoleküls hergestellt werden und zur Bildung polyklonaler Antikörper verwendet werden.
Die Behandlung von Geweben gemäß der vorliegenden Erfindung zieht die Gewebebearbeitung oder -Reinigung mit einer Cellulase umfassenden Zusammensetzung in Betracht. Solche Behandlung schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Stonewashing, Modifikation der Struktur, des Anfühlens und/oder der Erscheinung von Cellulose haltigen Stoffen oder andere, während der Herstellung oder Reinigung/Rekonditionierung von cellulosehaltigen Stoffen verwendete Verfahren. Zusätzlich beabsichtigt die Behandlung innerhalb des Kontexts dieser Erfindung die Entfernung von "unreifer" oder "toter" Baumwolle aus Cellulosegewebe oder Cellulosefasern. Unreife Baumwolle ist wesentlich amorpher als reife Baumwolle und führt, wenn sie vorhanden ist, zu einem Stoff geringerer Qualität, zum Beispiel aufgrund von ungleichmäßiger Färbung. Die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Zusammensetzung schließt weiterhin eine Cellulasekomponente für die Verwendung beim Waschen eines verschmutzten Cellulose enthaltenden hergestellten Stoffs ein. Die Cellulase kann zum Beispiel in einer Detergenzienzusammensetzung für Waschmittel verwendet werden. Detergenzienzusammensetzungen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen spezielle Formulierungen wie Vorwaschmittel, Vorweichmittel und Farbwiederherstellungszusammensetzungen für den Hausgebrauch ein. Solche Zusammensetzungen zur Behandlung, wie hierin beschrieben, können in der Form eines Konzentrats, welches verdünnt werden muss, oder in der Form einer verdünnten Lösung oder einer Form, die direkt auf den cellulosehaltigen Stoff aufgetragen werden kann, vorliegen. Allgemeine Behandlungstechniken für die Cellulasebehandlung von Geweben werden zum Beispiel in der EP-Veröffentlichung Nr. 220 016 und den GB-Anmeldungen Nr. 1 368 599 und 2 095 275 beschrieben.
Die Behandlung eines cellulosischen Materials gemäß der vorliegenden Erfindung zieht weiterhin die Behandlung von Tiernahrung, Zellstoffbrei und/oder Papier, Nahrung und Getreide für im Fachgebiet bekannte Zwecke in Betracht. Von Cellulase ist zum Beispiel bekannt, das sie den Wert von Tiernahrung erhöht, die Entwässerbarkeit von Holzzellstoffbrei verbessert, Nahrungsmittelprodukte verbessert und Fasern in Getreide während des Verfahrens des Naßvermahlens oder des Trockenvermahlens des Getreides verringert.
Die Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Herstellung einer wässrigen Lösung, welche eine wirksame Menge Cellulase zusammen mit anderen optionalen Inhaltsstoffen, umfassend zum Beispiel einen Puffer, ein oberflächenaktives Mittel und/oder ein Entschweißungsmittel enthält. Eine wirksame Menge der Cellulaseenzymzusammensetzung ist eine Konzentration des Cellulaseenzyms, die für ihren beabsichtigten Zweck ausreicht. Somit ist zum Beispiel eine "wirksame Menge" Cellulase in einer Stonewashing-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung jene Menge, die den gewünschten Effekt herbeiführen wird, d. h. die Entstehung eines getragenen und verblassten Aussehens in den Nähten und auf den Stoffbahnen. In ähnlicher Weise ist eine "wirksame Menge" Cellulase in einer Zusammensetzung, die der Verbesserung des Anfühlens und/oder des Aussehens eines cellulosehaltigen Stoffes dienen soll, jene Menge, die messbare Verbesserungen im Anfühlen, z. B. Verbesserung der Glätte des Stoffs oder des Aussehens, z. B. die Entfernung von Pills und Fasern, welche dazu tendieren, die Schärfe in der Erscheinung eines Stoffes zu verringern, herbeiführt. Die Menge der verwendeten Cellulase hängt auch von der verwendeten Ausstattung ab, den angewendeten Bearbeitungsparametern (die Temperatur der Cellulasebehandlungslösung, die Dauer der Exposition zur Cellulaselösung und dergleichen) sowie der Cellulaseaktivität (z. B. wird eine bestimmte Lösung eine niedrigere Cellulasekonzentration benötigen wo eine aktivere Cellulasezusammensetzung verwendet wird, verglichen mit einer weniger aktiven Cellulasezusammensetzung). Die exakte Konzentration der Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung, zu welcher der zu behandelnde Stoff zugegeben wird, kann einfach durch den Fachmann, basierend auf den oben genannten Faktoren sowie dem gewünschten Resultat bestimmt werden. In Stonewashing-Verfahren ist es im Allgemeinen vorgezogen worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5000 ppm und am meisten bevorzugt etwa 10 bis zu 200 ppm des Gesamtproteins anwesend sein soll. In Zusammensetzungen für die Verbesserung des Anfühlens und/oder Aussehens eines cellulosehaltigen Stoffs ist es im Allgemeinen vorgezogen worden, dass die Cellulase in der wässrigen Behandlungslösung in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 2000 ppm und am meisten bevorzugt etwa 0,5 bis 200 ppm des Gesamtproteins vorliegen soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Behandlung wird ein solcher Puffer in der Zusammensetzung zur Behandlung eingesetzt, dass die Konzentration des Puffers ausreichend ist, den pH der Lösung innerhalb des Bereichs zu halten, in welchem die angewandte Cellulase Aktivität zeigt, was wiederum von der Art der verwendeten Cellulase abhängt. Die exakte Konzentration des verwendeten Puffers wird von mehreren Faktoren abhängen, welche der Fachmann problemlos berücksichtigen kann. Zum Beispiel werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Puffer sowie die Pufferkonzentration so ausgewählt, dass der pH der letztendlichen Cellulaselösung innerhalb des pH-Bereichs aufrechterhalten wird, der für die optimale Cellulaseaktivität erforderlich ist. Die Bestimmung des optimalen pH-Bereichs der Cellulasen der Erfindung kann gemäß gut bekannten Techniken gesichert werden. Geeignete Puffer mit pH-Werten innerhalb des Aktivitätsbereichs der Cellulase sind Fachleuten des Bereichs gut bekannt.
Zusätzlich zur Cellulase und einem Puffer kann die Behandlungszusammensetzung optional ein oberflächenaktives Mittel enthalten. Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen jedwede oberflächenaktive Mittel, die kompatibel mit der Cellulase und dem Stoff sind, ein, und umfassen zum Beispiel anionische, nicht-ionische und amphotere oberflächenaktive Mittel. Geeignete anionische oberflächenaktive Mittel für die Verwendung hierin schließen lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate; Alkansulfonate und dergleichen ein. Geeignete Gegenionen für anionische oberflächenaktive Mittel schließen Alkalimetallionen, wie Natrium und Kalium; Erdalkalimetallionen, wie Calcium und Magnesium; das Ammoniumion; und Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen der Kohlenstoffzahlen 2 oder 3 ein. Amphotere oberflächenaktive Mittel schließen quarternäre Ammoniumsalzsulfonate und amphotere oberflächenaktive Mittel vom Betaintyp ein. Solche amphoteren oberflächenaktiven Mittel haben beides, die positiv und die negativ geladenen Gruppen im selben Molekül. Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether sowie Alkanolamide höherer Fettsäuren oder Alkylenoxidaddukte davon sowie Fettsäure-Glycerinmonoester. Mischungen von oberflächenaktiven Mitteln können ebenfalls in den den Fachleuten bekannten Weisen verwendet werden.
Eine konzentrierte Cellulasezusammensetzung kann für die Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Solche Konzentrate enthalten konzentrierte Mengen der oben beschriebenen Cellulasezusammensetzung, Puffer und oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise in einer wässrigen Lösung. Wenn es so formuliert ist, kann das Cellulasekonzentrat einfach mit Wasser verdünnt werden, um so schnell und genau Cellulasezubereitungen herzustellen, die die erforderliche Konzentration jedes Bestandteils aufweisen. Wenn wässrige Konzentrate zubereitet werden, können diese Konzentrate verdünnt werden, um so zu der erforderlichen Konzentration der Komponenten in der Cellulaselösung, wie oben angedeutet, zu gelangen. Wie leicht zu erkennen ist, wer den solche Cellulasekonzentrate die einfache Zubereitung der Cellulaselösungen sowie den leicht durchzuführenden Transport der Zusammensetzung zum Verwendungsort erlauben. Das Behandlungskonzentrat kann in jedweder im Fachgebiet anerkannten Form vorliegen, wie zum Beispiel als Flüssigkeit, Emulsion, Gel oder Paste. Solche Formen sind Fachleuten gut bekannt.
Wenn ein festes Cellulasekonzentrat verwendet wird, kann die Cellulasezusammensetzung als Granulat bzw. Körnchen, als ein Pulver, ein Agglomerat oder eine feste Platte vorliegen. Die Körnchen können so zubereitet werden, dass sie Materialien enthalten, die die Auflösungsrate der Körnchen in das Waschmedium verringern. Solche Materialien und Körnchen werden im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart.
Andere Materialien können ebenfalls, wie gewünscht, verwendet werden mit oder plaziert werden in der Cellulasezusammensetzung der vorliegenden Erfindung, einschließlich von Steinen, Bimsstein, Füllstoffen, Lösungsmitteln, Enzymaktivatoren sowie Mitteln zur Verhinderung der Wiederanschmutzung, abhängig vom letztendlichen Gebrauch der Zusammensetzung.
Als Beispiel werden Stonewashing-Verfahren ausführlich beschrieben, jedoch können die beschriebenen Parameter einfach durch den Fachmann für andere Anwendungen, d.h Verbesserung des Anfühlens und/oder des Aussehens des Stoffs, modifiziert werden. Der Cellulose enthaltende Stoff wird mit der Cellulase enthaltenden Stonewashing-Zusammensetzung, die eine wirksame Menge Cellulase enthält, durch Vermischen der Behandlungszusammensetzung mit der Stonewashing-Zusammensetzung in Kontakt gebracht, und somit wird das Cellulaseenzym in die Nähe des Stoffs gebracht. Nachfolgend wird die wässrige Lösung, die die Cellulase und den Stoff enthält, gerührt. Wenn die Behandlungszusammensetzung eine wässrige Lösung ist, kann der Stoff direkt in der Lösung eingeweicht werden. In ähnlicher Weise wird, wenn die Stonewashing-Zusammensetzung ein Konzentrat ist, das Konzentrat in einem Wasserbad mit dem Cellulose enthaltenden Stoff verdünnt. Wenn die Stonewashing-Zusammensetzung in einer festen Form vorliegt, zum Beispiel als Vorwaschgel oder als fester Stab, kann die Sto newashing-Zusammensetzung durch direktes Auftragen der Zusammensetzung auf den Stoff oder in die Waschlauge in Kontakt gebracht werden.
Der Cellulose enthaltende Stoff wird mit der Stonewashing-Lösung unter Bedingungen inkubiert, die wirksam sind, die enzymatische Wirkung zu ermöglichen, um dem Cellulose enthaltenden Stoff eine stonewashed Erscheinung zu geben. Zum Beispiel können während des Stonewashings der pH-Wert, das Waschlaugenverhältnis, die Temperatur und die Reaktionszeit zur Optimierung der Bedingungen, unter welchen die Stonewashing-Zusammensetzung wirkt, eingestellt werden. "Wirksame Bedingungen" betreffen notwendigerweise den pH-Wert, das Waschlaugenverhältnis und die Temperatur, welche es dem Cellulaseenzym erlauben, effizient mit dem Cellulose enthaltenden Stoff zu reagieren, in diesem Fall zur Herstellung des stonewashed-Effekts. Jedoch sind solche Bedingungen problemlos vom Fachmann ermittelbar. Die für die Stonewashing-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wirksamen Reaktionsbedingungen sind im Wesentlichen gut bekannten Verfahren, die bei korrespondierenden Cellulasezusammensetzungen nach dem Stand der Technik genutzt werden, ähnlich. Demgemäß liegt es im Ermessen des Fachmanns, die Bedingungen zur Verwendung der Stonewashing-Zusammensetzungen zu maximieren.
Die Laugenverhältnisse während des Stonewashings, d. h., das hierin angewandte Gewichtsverhältnis der Lösung der Stonewashing-Zusammensetzung (d. h. der Waschlauge) zum Gewicht des Stoffes, ist im Allgemeinen eine Menge, die ausreicht, um den gewünschten Stonewashing-Effekt im Denimstoff zu erzielen und hängt vom genutzten Verfahren ab. Vorzugsweise betragen die Waschlaugenverhältnisse von etwa 4:1 bis etwa 50:1, stärker bevorzugt von etwa 5:1 bis etwa 20:1 und am meisten bevorzugt von etwa 10:1 bis etwa 15:1.
Die Reaktionstemperaturen während des Stonewashings mit den vorliegenden Stonewashing-Zusammensetzungen werden von zwei konkurrierenden Faktoren bestimmt. Erstens korrespondieren höhere Temperaturen im Allgemeinen mit erhöhter Reaktionskinetik, d. h. mit schnelleren Reaktionen, was verringerte Reaktionszeiten, verglichen mit den bei niedrigeren Temperaturen erforderlichen Reaktionszeiten, erlaubt. Demge mäß liegen die Reaktionstemperaturen im Allgemeinen bei mindestens 10°C und mehr. Zweitens ist die Cellulase ein Protein, welches Aktivität oberhalb einer gegebenen Reaktionstemperatur verliert, wobei diese Temperatur von der Art der verwendeten Cellulase abhängt. Somit wird, wenn man die Reaktionstemperatur zu hoch werden läßt, die cellulolytische Aktivität als ein Resultat der Denaturierung der Cellulase verloren. Während Standardtemperaturen für die Cellulaseverwendung im Fachgebiet im Allgemeinen im Bereich von 35°C bis 65°C liegen, Bedingungen, von welchen man erwarten würde, dass sie auch für die Cellulase der Erfindung geeignet sind, sollten die optimalen Temperaturbedingungen gemäß gut bekannter Techniken in Bezug auf die spezifisch verwendete Cellulase ermittelt werden.
Die Reaktionszeiten hängen von den spezifischen Bedingungen, unter welchen das Stonewashing durchgeführt wird, ab. Zum Beispiel werden alle, der pH-Wert, die Temperatur und die Konzentration der Cellulase die optimale Reaktionszeit beeinflussen. Im Allgemeinen betragen die Reaktionszeiten von etwa 5 Minuten bis etwa 5 Stunden, und vorzugsweise von etwa 10 Minuten bis etwa 3 Stunden und stärker bevorzugt von etwa 20 Minuten bis etwa 1 Stunde.
Gemäß einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, kann die Cellulase der Erfindung in einer Detergenzienzusammensetzung verwendet werden. Die Detergenzienzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind nützlich als Vorwaschzusammensetzungen, Vorweichzusammensetzungen oder zur Reinigung während des regulären Wasch- oder Spülzyklus. Vorzugsweise umfasst die Detergenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine wirksame Menge Cellulase, ein oberflächenaktives Mittel und schließt optional andere nachfolgend beschriebene Bestandteile ein.
Eine wirksame Menge angewandter Cellulase, die in den Detergenzienzusammensetzungen dieser Erfindung verwendet wird, ist eine Menge, die ausreicht, die gewünschten Effekte, von denen bekannt ist, dass sie von Cellulase auf cellulosehaltigen Stoffen herbeigeführt werden, zum Beispiel, De-Pilling, Weichmachen, Anti-Pilling, Entfernung von Fasern auf der Oberfläche, Antigrauschleierbildung und Reinigung, zu über tragen. Vorzugsweise wird die Cellulase in der Detergenzienzusammensetzung in einer Konzentration von etwa 10 ppm bis etwa 20000 ppm des Detergens verwendet.
Die Konzentration des in der Detergenzienzusammensetzung verwendeten Cellulaseenzyms wird vorzugsweise so ausgewählt, dass nach Verdünnung in einem Waschmedium die Konzentration des Cellulaseenzyms in einem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 1000 ppm, vorzugsweise von etwa 0,02 ppm bis etwa 500 ppm und am meisten bevorzugt von etwa 0,5 ppm bis etwa 250 ppm des Gesamtproteins liegt. Die in der Detergenzienzusammensetzung verwendete Menge des Cellulaseenzyms wird von dem Ausmaß der Verdünnung des Detergenz nach Zugabe zu Wasser, um eine Waschlösung zu bilden, abhängen.
Die Detergenzienzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in jedweder, im Fachgebiet anerkannten Form vorliegen, zum Beispiel als eine Flüssigkeit, in Körnchen, in Emulsionen, in Gelen oder in Pasten. Solche Formen sind dem Fachmann gut bekannt. Wenn eine feste Detergenzienzusammensetzung verwendet wird, wird die Cellulase vorzugsweise in Körnchen formuliert. Vorzugsweise können die Körnchen so formuliert werden, dass sie zusätzlich ein die Cellulase schützendes Mittel enthalten. Die Körnchen können so zubereitet werden, dass sie Materialien enthalten, die die Auflösungsrate der Körnchen in das Waschmedium verringern. Solche Materialien und Körnchen werden im U.S.-Patent Nr. 5 254 283 offenbart.
Die Detergenzienzusammensetzungen dieser Erfindung wenden ein oberflächenaktives Mittel an, d. h. ein oberflächenaktives Mittel, einschließlich von anionischen, nichtionischen und amphoteren oberflächenaktiven Mitteln, die für ihre Verwendung in Detergenzienzusammensetzungen gut bekannt sind.
Geeignete anionische oberflächenaktive Mittel für die Verwendung in der Detergenzienzusammensetzung dieser Erfindung schließen lineare oder verzweigte Alkylbenzolsulfonate; Alkyl- oder Alkenylethersulfate mit linearen oder verzweigten Alkylgruppen oder Alkenylgruppen; Alkyl- oder Alkenylsulfate; Olefinsulfonate und Alkansulfonate ein. Geeignete Gegenionen für anionische oberflächenaktive Mittel schließen Alkalime tallionen, wie Natrium oder Kalium; Erdalkalimetallionen, wie Calcium und Magnesium; das Ammoniumion; sowie Alkanolamine mit 1 bis 3 Alkanolgruppen der Kohlenstoffzahl 2 oder 3 ein. Amphotere oberflächenaktive Mittel schließen quarternäre Ammoniumsalzsulfonate und amphotere oberflächenaktive Mittel vom Betaintyp ein. Solche amphoteren oberflächenaktiven Mittel haben beides, positiv und negativ geladene Gruppen im selben Molekül. Nicht-ionische oberflächenaktive Mittel umfassen im Allgemeinen Polyoxyalkylenether sowie Alkanolamide höherer Fettsäuren oder Alkylenoxidaddukte davon, Fettsäuren-Glycerinmonoester und dergleichen. Geeignete oberflächenaktive Mittel für die Verwendung in dieser Erfindung werden in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart. Mischungen solcher oberflächenaktiver Mittel können ebenfalls verwendet werden. Das oberflächenaktive Mittel oder die Mischung der oberflächenaktive Mittel wird im Allgemeinen in den Detergenzienzusammensetzungen dieser Erfindung in einer Menge von etwa 1 Gew.-% bis etwa 95 Gew.-% der gesamten Detergenzienzusammensetzung und vorzugsweise von etwa 5 Gew.-% bis etwa 45 Gew.-% der gesamten Detergenzienzusammensetzung verwendet. Zusätzlich zu der Cellulasezusammensetzung und dem/den oberflächenaktiven Mittel/n können die Detergenzienzusammensetzungen dieser Erfindung optional eine oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten:
Hydrolasen mit Ausnahme von Cellulasen
Geeignete Hydrolasen schließen Carboxylatesterhydrolase, Thioesterhydrolase, Phosphatmonoesterhydrolase und Phosphatdiesterhydrolase, welche auf die Esterbindung wirken; Glycosidhydrolase, welche auf Glycosylverbindungen wirkt; ein Enzym, welches N-Glycosylverbindungen hydrolysiert; Thioetherhydrolase, welche auf die Etherbindung wirkt; und eine a-Amino-acylpeptidhydrolase, Peptidyl-Aminosäurehydrolase, Acyl-Aminosäurehydrolase, Dipeptidhydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase, welche auf die Peptidbindung wirkt, ein. Vorzuziehen unter diesen sind Carboxylatesterhydrolase, Glycosidhydrolase und Peptidyl-Peptid-Hydrolase. Geeignete Hydrolasen schließen ein (1) Proteasen, die zur Peptidyl-Peptid-Hydrolase gehören, wie Pepsin, Pepsin B, Rennin, Trypsin, Chymotrypsin A, Chymotrypsin B, Elastase, Enterokinase, Cathepsin C, Papain, Chymopapain, Ficin, Thrombin, Fibrinolysin, Renin, Subtilisin, Aspergillopeptidase A, Collagenase, Clostridiopeptidase B, Kallikrein, Gastrisin, Cathepsin D., Bromelin, Keratinase, Chymotrypsin C, Pepsin C, Aspergillopeptidase B, Urokinase, Carboxypeptidase A und B sowie Aminopeptidase; (2) Glycosidhydrolasen (Cellulase, die ein essentieller Bestandteil ist, wird von dieser Gruppe ausgeschlossen) α-Amylase, β-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Lysozym, Pektinase, Chitinase und Dextranase. Vorzuziehen unter ihnen sind α-Amylase und β-Amylase. Sie funktionieren in sauren bis neutralen Systemen, jedoch eine, die aus Bakterien erhalten worden ist, zeigt in einem alkalischen System hohe Aktivität; (3) Carboxylatesterhydrolase einschließlich von Carboxylesterase, Lipase, Pektinesterase und Chlorophyllase. Besonders wirksam unter ihnen ist die Lipase.
Von der Hydrolase, einer anderen als Cellulase, wird in die Detergenzienzusammensetzung soviel wie nötig für den Zweck inkorporiert. Sie sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,001 bis 5 Gew.-% und stärker bevorzugt 0,02 bis 3 Gew.-%, bezogen auf gereinigtes Protein, eingefügt werden. Dieses Enzym sollte in der Form von Körnchen, hergestellt aus rohem Enzym allein, oder in Kombination mit anderen Komponenten in der Detergenzienzusammensetzung verwendet werden. Körnchen des Rohenzyms werden in einer solchen Menge eingesetzt, dass das gereinigte Enzym 0,001 bis 50 Gew.-% der Körnchen ausmacht. Die Körnchen werden in einer Menge von 0,002 bis 20 und vorzugsweise 0,1 bis 10 Gew.-% verwendet. Wie mit Cellulasen können diese Körnchen so zubereitet werden, dass sie ein ein Enzym schützendes Mittel und ein die Auflösung verzögerndes Material enthalten.
Kationische oberflächenaktive Mittel und langkettige Fettsäuresalze
Solche kationischen oberflächenaktiven Mittel und langkettigen Fettsäuresalze schließen gesättigte oder ungesättigte Fettsäuresalze, Alkyl- oder Alkenylethercarbonsäuresalze, a-Sulfofettsäuresalze oder -Ester, oberflächenaktive Mittel vom Aminosäurentyp, oberflächenaktive Mittel vom Phosphatestertyp, quarternäre Ammoniumsalze, einschließlich jener mit 3 bis 4 Alkylsubstituenten und bis zu 1 phenylsubstituierten Alkylsubstituenten ein. Geeignete kationische oberflächenaktive Mittel und langkettige Fettsäuresalze werden in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart, wobei hierin diese Offenbarung durch Bezug darauf einbezogen ist. Die Zusammensetzung kann von etwa 1 bis etwa 20 Gew.-% solcher kationischer oberflächenaktiver Mittel und langkettiger Fettsäuresalze enthalten.
Aufbaustoffe
A. Zweiwertige Maskierungsmittel
Die Zusammensetzung kann von etwa 0 bis etwa 50 Gew.-% einer oder mehrerer Aufbaustoffkomponenten enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetallsalzen und Alkanolaminsalzen der folgenden Verbindungen: Phosphate, Phosphonate, Phosphoncarboxylate, Salze von Aminosäuren, hochmolekulare Elektrolyte von Aminopolyacetaten, nicht-dissoziierende Polymere, Salze von Dicarbonsäuren und Aluminiumsilicatsalze. Geeignete zweiwertige Maskierungsmittel werden in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart.
B. Alkalien oder anorganische Elektrolyte
Die Zusammensetzung kann von etwa 1 bis etwa 50 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 30 Gew.-%, bezogen auf die Zusammensetzung, von einem oder mehreren Alkalimetallsalzen der folgenden Verbindungen als den Alkalien oder anorganischen Elektrolyten enthalten: Silicate, Carbonate und Sulfate, sowie organischer Alkalien, wie Triethanolamin, Diethanolamin, Monoethanolamin und Triisopropanolamin.
Wiederanschmutzung verhindernde Mittel
Die Zusammensetzung kann von etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-% einer oder mehrerer der folgenden Verbindungen als Wiederanschmutzung verhindernde Mittel enthalten: Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose.
Unter diesen stellt eine Kombination von Carboxymethylcellulose und/oder Polyethylenglycol mit der Cellulasezusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine besonders nützliche, Schmutz entfernende Zusammensetzung bereit.
Bleichmittel
Die Verwendung der Cellulase der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem Bleichmittel wie Kaliummonopersulfat, Natriumpercarbonat, Natriumperborat, Natriumsulfat/Wasserstoffperoxid-Addukt sowie Natriumchlorid/Wasserstoffperoxid-Addukt oder/und eines photosensitiven bleichenden Farbstoffs, wie eines Zink- oder Aluminiumsalzes von sulfoniertem Phthalocyanin, verbessert weiter die Detergenzwirkung. In ähnlicher Weise können Bleichmittel und Bleichkatalysatoren, wie sie in der EP 684 304 beschrieben werden, benutzt werden.
Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe
Verschiedene Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe können in die Zusammensetzung, wenn nötig, eingefügt werden. Geeignete Bläuungsmittel und Fluoreszenzfarbstoffe werden in der Britischen Patentanmeldung Nr. 2 094 826 A offenbart.
Inhibitoren des Balligwerdens
Die folgenden Inhibitoren des Balligwerdens können in das pulverförmige Detergenz eingebaut werden: p-Toluolsulfonsäuresalze, Xylolsulfonsäuresalze, Essigsäuresalze, Sulfobernsteinsäuresalze, Talkum, fein pulverisiertes Silicat, amorphe Silicate, Lehm, Calciumsilicat (wie Micro-Cell von Johns Manville Co.), Calciumcarbonat und Magnesiumoxid.
Maskierungsmittel für die Cellulaseaktivität inhibierende Faktoren
Die Cellulasezusammensetzungen dieser Erfindung werden in manchen Fällen in der Anwesenheit von Kupfer-, Zink-, Chrom-, Quecksilber-, Blei-, Mangan- oder Silberionen oder deren Verbindungen deaktiviert. Verschiedene Metall-chelatisierende Mittel und Metall-ausfällende Mittel sind gegen diese Inhibitoren wirksam. Sie schließen, zum Beispiel, zweiwertige Metallionen maskierende Mittel, wie im obigen Punkt aufgeführt, mit Bezug zu optionalen Zusatzstoffen sowie Magnesiumsilicat und Magnesiumsulfat, ein.
Cellobiose, Glucose und Glucolacton wirken manchmal als Inhibitoren. Es wird bevorzugt, die gleichzeitige Anwesenheit dieser Saccharide mit der Cellulase soweit wie möglich zu vermeiden. Falls die gleichzeitige Anwesenheit nicht vermeidbar ist, ist es notwendig, den direkten Kontakt der Saccharide mit der Cellulase, zum Beispiel indem man sie beschichtet, zu vermeiden.
Langkettige Fettsäuresalze und kationische oberflächenaktive Mittel wirken in manchen Fällen als die Inhibitoren. Jedoch ist die gleichzeitige Anwesenheit dieser Substanzen mit der Cellulase zulässig, wenn ihr direkter Kontakt auf eine Weise wie Tablettierung oder Beschichtung verhindert wird.
Die oben genannten Maskierungsmittel und -Verfahren können, wenn nötig, in der vorliegenden Erfindung angewandt werden.
Cellulaseaktivatoren
Die Aktivatoren können in Abhängigkeit von der spezifischen Cellulase variieren. In der Anwesenheit von Proteinen, Cobalt und seinen Salzen, Magnesium und seinen Salzen sowie von Calcium und seinen Salzen, Kalium und seinen Salzen, Natrium und seinen Salzen oder von Monosacchariden wie Mannose und Xylose, werden viele Cellulasen aktiviert und ihre Reinigungskräfte beträchtlich verbessert.
Antioxidantien
Die Antioxidantien schließen zum Beispiel Tert-Butyl-hydroxytoluol, 4,4'-Butylidenbis (6-tert-butyl-3-methylphenol), 2,2'-Butylidenbis(6-tert-butyl-4-methylphenol), monostyrolisiertes Cresol, distyrolisiertes Cresol, monostyrolisiertes Phenol, distyrolisiertes Phenol und 1,1-Bis(4-hydroxy-phenyl)cyclohexan ein.
Lösungsvermittler
Die Lösungsvermittler schließen zum Beispiel niedere Alkohole wie Ethanol, Benzolsulfonatsalze, niedere Alkylbenzolsulfonatsalze, wie p-Toluolsulfonatsalze, Glycole, wie Propylenglycol, Acetylbenzol-Sulfonatsalze, Acetamide, Pyridindicarbonsäureamide, Benzoatsalze und Harnstoff, ein.
Die Detergenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einem breiten pH-Bereich vom sauren bis zum alkalischen pH genutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Detergenzienzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in schwach saurem, neutralem oder alkalischem Detergenzwaschmedium mit einem pH-Wert von etwa 5 bis zu nicht mehr als etwa 12 verwendet werden.
Neben den oben genannten Bestandteilen können, wenn gewünscht, Duftstoffe, Puffer, Konservierungsstoffe, Farbstoffe und dergleichen mit der Detergenzienzusammensetzung dieser Erfindung verwendet werden. Solche Komponenten werden herkömmlicherweise in bisher im Fachgebiet genutzten Mengen angewandt.
Wenn ein Detergenzgrundbestandteil, verwendet in der vorliegenden Erfindung, in der Form eines Pulvers vorliegt, kann es eines sein, welches mittels irgendeines der bekannten Herstellungsverfahren, einschießlich eines Sprühtrocknungsverfahrens und eines Granulierungsverfahrens, hergestellt worden ist. Besonders der durch das Sprühtrocknungsverfahren, Agglomerationsverfahren, Trockenmischverfahren oder die nicht-turmgebundenen Verfahren erhaltene Detergenzgrundbestandteil wird bevorzugt. Der durch das Sprühtrocknungsverfahren erhaltene Detergenzgrundbestandteil ist bezüglich der Herstellungsbedingungen nicht eingegrenzt. Der Detergenzgrundbestandteil, der durch das Sprühtrocknungsverfahren erhalten wird, besteht aus hohlen Körnchen, die durch Sprühen einer wässrigen Aufschlämmung von hitzebeständigen Bestandteilen, wie oberflächenaktiver Mittel und Aufbaustoffe, in einen heißen Raum erhalten werden. Nach dem Sprühtrocknen können Duftstoffe, Enzyme, Bleichmittel, anorganische alkalische Aufbaustoffe zugefügt werden. Dem hochdichten, körnchenförmigen Detergenzgrundbestandteil, wie er aus dem Sprühtrockungsverfahren oder dem Agglomerati onsverfahren erhalten wird, können verschiedene Bestandteile auch nach der Herstellung des Grundbestandteils zugesetzt werden.
Wenn der Detergenzgrundbestandteil eine Flüssigkeit ist, kann sie entweder eine homogene Lösung oder eine inhomogene Dispersion sein. Zum Fernhalten der Zersetzung der Carboxymethylcellulose durch die Cellulase im Detergens ist es wünschenswert, dass die Carboxymethylcellulose vor der Inkorporation in die Zusammensetzung granuliert oder beschichtet wird.
Die Detergenzienzusammensetzungen dieser Erfindung können mit cellulosehaltigen Stoffen, zum Beispiel verschmutzten Stoffen, in industriellen Anwendungen und in Haushaltsanwendungen bei Temperaturen, Reaktionszeiten und Laugenverhältnissen, wie sie herkömmlicherweise in dieser Umgebung angewandt werden, inkubiert werden. Die Inkubationsbedingungen, d. h. die wirksamen Bedingungen für die Behandlung cellulosehaltiger Stoffe mit Detergenzienzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung, sind von Fachleuten ohne weiteres ermittelbar. Demgemäß werden angemessene Bedingungen, die für die Behandlung mit den vorliegenden Detergenzien wirksam sind, jenen unter Verwendung ähnlicher Detergenzienzusammensetzungen, die bekannte Cellulasen einschließen, entsprechen.
Detergenzien gemäß der vorliegenden Erfindung können zusätzlich als Vorwaschmittel formuliert werden, in der geeigneten Lösung bei einem mittleren pH-Wert, wo ausreichend Aktivität existiert, um die gewünschten Verbesserungen, Weichmachen, DePilling, Anti-Pilling, Entfernung von Fasern auf der Oberfläche oder Reinigung bereitzustellen. Wenn die Detergenzienzusammensetzung eine Einweichmittelzusammensetzung ist (z. B. Vorwaschmittel oder Vorbehandlungsmittel), entweder als Flüssigkeits-, Spray-, Gel- oder Pastenzusammensetzung, wird das Cellulaseenzym im Allgemeinen mit etwa 0,0001 bis etwa 1 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Einweichmittel- oder Vorbehandlungsmittelzusammensetzung, verwendet werden. In solchen Zusammensetzungen kann ein oberflächenaktives Mittel optional eingesetzt werden und liegt, wenn eingesetzt, im Allgemeinen, in einer Konzentration von etwa 0,005 bis etwa 20 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht des Einweichmittels, vor. Der Rest der Zusammensetzung umfasst konventionelle im Einweichmittel verwendete Komponenten, d. h. Verdünnungsmittel, Puffer, andere Enzyme (Proteasen) und dergleichen in ihren üblichen Konzentrationen.
Es ist ein Ansinnen, dass Zusammensetzungen, die die hierin beschriebenen Cellulaseenzyme umfassen, im Hausgebrauch als alleinige Zusammensetzung, die geeignet ist, zur Wiederherstellung von Farbe bei verblichenen Stoffen, (siehe zum Beispiel das U.S.-Patent Nr. 4 738 682) sowie zur Verwendung in einem Fleckenentfernungsmittel und als Depilling- und als Anti-Pilling-Mittel (Vorbeugung gegen Pilling), verwendet werden kann.
Die Verwendung der Cellulase gemäß der Erfindung kann besonders wirksam in Futtermittelzusatzstoffen und in der Verarbeitung von Zellstoffbrei und Papier sein. Diese zusätzlichen industriellen Anwendungen werden zum Beispiel jeweils in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/16360 und dem finnischen erteilten Patent Nr. 87 372 beschrieben.
Um die vorliegende Erfindung und die Vorteile davon weiter darzustellen, werden die folgenden spezifischen Beispiele gegeben, wobei dies so zu verstehen ist, das sie zur Darstellung der vorliegenden Erfindung dargelegt werden und nicht in irgendeiner Weise zur Einschränkung ihres Umfangs gedeutet werden sollen.
BEISPIEL
Genomische DNA wurde für mehrere verschiedene Mikroorganismen zum Zweck der Durchführung einer PCR-Reaktion zur Bestimmung, ob EGIII-ähnliche Enzyme durch die DNA für einen bestimmten Organismus codiert werden, hergestellt.
Genomische DNA wird erhalten aus Acremonium brachypenium, Hinterlegungsnr. CBS 866.73; Chaetomium brasiliense, Hinterlegungsnr. CBS 140.50; Chaetomium vitellium, Hinterlegungsnr. CBS 250.85; Emericella desertoru, Hinterlegungsnr. CBS 653.73; Fusarium equiseti, Hinterlegungsnr. CBS 185.34; Gliocladium roseum, Hinterlegungsnr. CBS 443.65; Humicola grisea var. thermoidia, Hinterlegungsnr. CBS 225.63; Myceliopthora thermophilia, Hinterlegungsnr. ATCC 48102–48104; Penicillium notatum, Hinterlegungsnr. ATCC 9178, 9179 und Phanerochaete chrysosporium, Hinterlegungsnr. ATCC 28326 und gemäß Standardverfahren isoliert.
Die PCR wurde auf einem Standardgerät für PCR, wie der PCT-150 MicroCycler von MJ Research Inc., unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

1) 1 Minute bei 98°C während 1 Zyklus,
2) 1 Minute bei 94°C, 90 Sekunden bei 40°C, 1 Minute bei 72°C
3) Wiederholung von Schritt 2 während 30 Zyklen
4) 7 Minuten bei 72°C während 1 Zyklus
5) Verringern der Temperatur auf 15°C für Lagerung und weitere Analyse

Die folgenden DNA-Primer wurden für die Verwendung zur Amplifizierung der EGIII-ähnlichen Gene aus den Bibliotheken, aufgebaut aus den verschiedenen Mikroorganismen, konstruiert. Alle hierin verwendeten Symbole für Protein- und DNA-Sequenzen korrespondieren mit den IUPAC IUB Biochemical Nomenclature Commission-Codes. BOX 1: Primer die für (N/Q)NLWG codieren

Vorwärts-Primer FRG001:	AAY AAY YTN TGG GG
Vorwärts-Primer FRG002:	CAR AAY YTN TGG GG

BOX1': Primer die für NNN(F/L/Y/I/L/N/K)WG codieren

Vorwärts-Primer FRG010:

AAY AAY AAY HWI TGG GG

BOX2: Primer die für ELMIW codieren

Vorwärts-Primer FRG003:	GAR YTN ATG ATH TGG
Rückwärts-Primer FRG004:	CCA DAT CAT NAR YTC

BOX2': Primer die für YELMIW codieren

Vorwärts-Primer FRG011:	TAY GAR YTI ATG ATH TGG
Rückwärts-Primer FRG012:	CCA DAT CAT IAR YTC RTA

BOX3: Primer die für GTE(P/C)FT codieren

Rückwärts-Primer FRG005:	GTR AAN GGY TCR GTR CC
Rückwärts-Primer FRG006:	GTR AAN GGY TCR GTY CC
Rückwärts-Primer FRG007:	GTR AAN GGY TCY GTR CC
Rückwärts-Primer FRG008:	GTR AAN GGY TCY GTY CC
Rückwärts-Primer FRG009:	GTR AAR CAY TCN GTN CC

PCR-Bedingungen für die PWO-Polymerase (Boehringer Mannheim, Cat# 1644-947) umfassen eine 100 Mikroliter-Lösung, hergestellt aus 10 Mikroliter eines 10X-Reaktionspuffers (der 10X-Reaktionspuffer umfasst 100 mM Tris HCl, pH 8–8,5; 250 mM KCl; 50 mM (NH₄)₂SO₄; 20 mM MgSO₄); 0,2 mM von jedem aus dATP, dTTP, dGTP, dCTP (endgültige Konzentration), 1 Mikroliter von 100 Nanogramm/-Mikroliter genomische DNA, 1 Mikroliter PWO mit 1 Einheit pro Mikroliter, 500 mM Primer (endgültige Konzentration) und Wasser auf 100 Mikroliter. Die Lösung wird mit Mineralöl überschichtet.
Die PCR-Strategie war wie folgt: die Vorwärts-Primer für BOX1 und BOX1' wurden mit den Rückwärts-Primern von BOX3 in einer Mischung mit der gewünschten genomischen DNA-Probe kombiniert und auf einem Gel laufen gelassen, um Fragmente im Bereich von 400–1000 Basenpaaren zu erhalten. Die erhaltenen Fragmente wurden dann vereinigt, und der Pool wurde in zwei ungefähr gleichgroße Teile geteilt. Der erste Pool wurde mit den Vorwärts-Primern aus BOX1 und BOX1' zusammen mit den Rückwärts-Primern aus BOX2 kombiniert. Der zweite Pool wurde mit dem Vorwärts-Primer aus BOX2 zusammen mit den Rückwärts-Primern von BOX3 kombiniert. Fragmente, die die ungefähre Größe relativ zur EGIII-ähnlichen Cellulase in Anbetracht des Ortes der Primer innerhalb des Gens, aufwiesen, in diesem Fall entsprechend jenen, mit zwischen 250–500 Basenpaaren, wurden isoliert und sequenziert. Partielle Sequenzen für EGIII-ähnliche Cellulasegene werden in der 3 bereitgestellt.
Die isolierte und teilweise sequenzierte DNA und die korrespondierenden Aminosäuresequenzen (von ungefähr 100 Resten) wurden zur Bestimmung ihrer Relation zur EGIII analysiert. Die Ergebnisse dieses Sequenzvergleichs werden in 3 gezeigt. Wie in 3 gezeigt, existiert eine signifikante Sequenzhomologie zwischen den von den erhaltenen DNA-Fragmenten codierten Peptiden und korrespondierenden Peptidsequenzen von EGIII. Aufgrund dieser Homologie wurde von den Anmeldern gefolgert, dass die Art der zahlreichen konservierten Reste das Fragment als mit einem Cellulase codierenden Gen korrespondierend identifizieren. Darüber hinaus identifizierten die hohe Homologie und die hohe Konservierung der Reste, die mit den Peptiden (a), (b), (c) und/oder (d) korrespondieren, wie in EGIII, die Gene aus jedem der Organismen als ein EGIII-ähnliches Enzym codierend. Die 4 zeigt die prozentuale Ähnlichkeit der sequenzierten Proteinfragmente.
Aus den sequenzierten Fragmenten war es möglich, die RAGE-Technik (rapid amplification of genomic ends), um sehr schnell die Sequenz des Volllängengens zu erhalten, zu verwenden. Volllängengene wurden erhalten, und werden mit verschiedenen zusätzlichen EGIII-ähnlichen Cellulasesequenzen in 6 zur Verfügung gestellt. Wie in 6 gezeigt, umfassen Volllängengene, die aus Hypocrea schweinitzii, Aspergillus aculeatus, Aspergillus kawachii (1), Aspergillus kawachii (2), Aspergillus oryzae, Humicola grisea, Humicola insolens, Chaetomium brasiliense, Fusarium equiseti, Fusarium javanicum (1), Fusarium javanicum (2), Gliocladium roseum (1), Gliocladium roseum (2), Gliocladium roseum (3), Gliocladium roseum (4), Memnoniella echinata, Actinomycete 11AG8, Streptomyces lividans CeIB, Rhodothermus marinus, Emericella desertoru und Erwinia carotovara isoliert worden sind, alle eine signifikante Homologie mit EGIII aus Trichoderma reesei. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zum Erhalt eines Gens, das eine EGIII-ähnliche Cellulase codiert, umfassend die folgenden Schritte: (i) Herstellen von genomischer DNA aus einem Organismus von Interesse; (ii) Herstellen eines DNA-Primers, der einen Aminosäurestrang codiert, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem oder mehreren der Folgenden: (a) Asn-Asn-(Leu/Phe/Lys/Ile)-Trp-Gly (b) Glu-(Leu/Phe/Ile)-Met-Ile-Trp (c) Gly-Thr-Glu-Pro-Phe-Thr; (d) (Ser/Tyr/Cys/Trp/Thr/Asn/Lys/Arg)-(Val/Pro)-(Lys/Ala)-(Ser/Ala)-(Tyr/Phe); und (e) Lys-Asn-Phe-Phe-Asn-Tyr; (iii) Amplifizieren der genomischen DNA aus Schritt (i) durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von DNA-Primern, codierend die Aminosäurestränge (a) und/oder (d) und (c) und/oder (e), unter Bedingungen, die zur Herstellung eines oder mehrerer Genfragmente aus der genomischen DNA geeignet sind; (iv) Auswählen und Vereinigen der in Schritt (iii) amplifizierten Genfragmente und erneutes Amplifizieren unter Anwendung von DNA-Primern, die die Aminosäurestränge (a) und/oder (d) plus (b) codieren, oder unter Anwendung von DNA-Primern, die die Aminosäurestränge (c) und/oder (e) plus (b) codieren, um ein oder mehrere weitere Genfragmente herzustellen; (v) Isolieren von der genomischen DNA der Gesamtheit oder eines Teils des Gens, welches einem oder mehreren der weiteren Genfragmente, die in Schritt (iv) hergestellt wurden, entspricht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt (iii) ferner das Markieren des DNA-Primers und das Durchführen einer Hybridisierung zwischen dem markierten DNA-Primer und der genomischen DNA und das Detektieren der hybridisierten genomischen DNA, welche die Gesamtheit oder einen Teil einer EGIII-ähnlichen Cellulase codiert, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Genfragmente gewählt werden, indem die Amplifikationsprodukte auf einem Polyacrylamidgel laufen gelassen werden und Genfragmente eines geeigneten Größenbereichs gewählt werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Genfragmente im Größenbereich von 400–1000 Basenpaare in Schritt (iii) gewählt werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Genfragmente im Größenbereich von 250–500 Basenpaaren im Schritt (iv) gewählt werden.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, ferner das Sequenzieren von einem oder mehreren der Genfragmente, die in Schritt (iv) erzeugt wurden, umfassend.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genomische DNA aus einem Bakterium, Pilz oder Actinomyceten erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der Pilz ein filamentöser Pilz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der filamentöse Pilz zu den Euascomyceten gehört.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Euascomycete zu Plectomycete gehört.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Euascomycete zu Diaporthales, Halosphaeriales, Microascales, Ophiostomatales, Phyllachorales, Sordariales oder Xylariales gehört.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Euascomycete zu Hypocreales, umfassend Clavicipitaceae, Melanosporaceae, Nectriaceae, Niessliaceae oder zum Mitosporus Hypocreales, gehört.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Euascomycete zu Hypocreaceae gehört, wobei die Hypocreaceae nicht Trichoderma umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wo die Euascomycete Gliocladium spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Myceliophtora spp., Verticillium spp., Myrothecium spp., oder Penicillium spp. ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Euascomycete ein Aspergillus, umfassend A. aeneus, A. anthodesmis, A. aureofulgens, A. aureolatus, A. avenaceus, A. awamorii, A. bisporus, A. brunneouniseriatus, A. campestris, A. caesiellus, A. candidus, A. carbonarius, A. cameus, A. cervinus, A. clavatroflavus, A. clavatoanicus, A. clavatus, A. conicus, A. conjunctus, A. crustosus, A. deflectus, A. dimorphicus, A. eburneocremeus, A. egyptiacus, A. ellipticus, A. elongatus, A. ficuum, A. flaschentraegeri, A. flavus, A. fumigatus, A. giganteus, A. glaucus, A. gorakhpurensis, A. gracilis, A. iizuke, A. itaconicus, A. japonicus, A. kambarensis, A. kanagawaensis, A. lanosus, A. leporis, A. longivesica, A. mellinus, A. multicolor, A. niger, A. nomius, A. nutans, A. ochraceus, A. oryzae, A. pallidus, A. panamensis, A. parasiticus, A. parvulus, A. penicillioides, A. phialisepticus, A. phoenicis, A. proliferans, A. pulvinus, A. puniceus, A. raperi, A. recurvatus, A. restrictus, A. shirousami, A. sojae, A. sparsus, A. subolivaceus, A. subsessilis, A. tamarii, A. terreus, A. terricola, A. thomii, A. tubingensis, A. unguis, A. unilateralis, A. ustus, A. versicolor, A. wentii, A. xerophilus, A. zonatus, A. sp., ist.
Verfahren, welches die folgenden weiteren Schritt umfasst, nachdem das Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche durchgeführt worden ist und ein Gen erhalten wurde, das eine EGIII-ähnliche Cellulase codiert: (a) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Gen, das EGIII-ähnliche Cellulase codiert; (b) Kultivieren der das Gen umfassenden Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium unter stabilen Bedingungen zur Herstellung von Cellulase; (c) Erhalten der hergestellten Cellulase; und ggf. (d) Reinigen der Cellulase, um ein gereinigtes Cellulaseprodukt bereitzustellen.