BR112019010355B1 - Composição de enzimas - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição de enzimas, a um processo para a preparação da mesma e à utilização da composição de enzimas em hidrólise enzimática.

Description

Campo
[0001] A presente invenção refere-se a uma composição de enzi mas, a um processo para a preparação da mesma e à utilização da composição de enzimas em hidrólise enzimática.
Antecedentes
[0002] O material lignocelulósico é essencialmente composto de ce lulose, hemicelulose e lignina e proporciona uma plataforma atraente para a produção de fontes de energia alternativas aos combustíveis fósseis. O material está disponível em grandes quantidades e pode ser convertido em produtos valiosos, por exemplo, açúcares ou biocombus- tível, tal como bioetanol.
[0003] A produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico é conhecida na arte e geralmente inclui as etapas de pré- tratamento, hidrólise, fermentação, e opcionalmente recuperação dos produtos de fermentação.
[0004] Durante a hidrólise, a qual pode compreender as etapas de liquefação, pré-sacarificação e/ou sacarificação, a celulose presente no material lignocelulósico é parcialmente (tipicamente 30 a 95 %, dependendo das condições de hidrólise e da atividade enzimática) convertida em açúcares redutores por enzimas celulolíticas. A hidrólise tipicamente ocorre durante um processo que dura 6 a 168 horas sob temperaturas elevadas de 45 a 50°C e condições não estéres.
[0005] Comumente, os açúcares são convertidos em valiosos pro dutos de fermentação tais como etanol por micro-organismos como levedura. A fermentação ocorre em uma etapa do processo separada, de modo preferencial anaeróbica, que no mesmo recipiente ou em um recipiente diferente. A temperatura durante a fermentação é ajustada para 30 a 33°C de modo a conciliar o crescimento e a produção de etanol por micro-organismos, comumente leveduras. Durante o processo de fer-mentação, o material celulósico remanescente é convertido em açúcares redutores pelas enzimas já presentes da etapa de hidrólise, enquanto são produzidos biomassa microbiana e etanol. A fermentação é acabada assim que o material celulósico é convertido em açúcares fermentáveis e todos os açúcares fermentáveis são convertidos em etanol, dióxido de carbono e biomassa microbiana. Isto pode durar até 6 dias. Em geral, o tempo total do processo de hidrólise e fermentação pode montar até 13 dias.
[0006] O custo de produção enzimática é um fator de custo impor tante no processo de produção total de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico. Portanto, foram empreendidas várias abordagens para diminuir os custos de enzimas e composições de enzimas, por exemplo, aumentando a quantidade de enzimas produzidas por um micro-organismo de produção, modulação e construção de novas e aprimoradas enzimas por técnicas de mutagênese e exploração de diversidade genética.
[0007] Todas estas abordagens não aumentaram a atividade enzi- mática suficientemente para superar o alto custo de produção enzimá- tica no processo de produção total de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico. Uma desvantagem destas abordagens foi o foco sobre uma única enzima de cada vez, negligenciando as possíveis sinergias com outras enzimas celulolíticas.
[0008] Têm sido feitas várias tentativas para desenvolver composições de enzimas para maximizar a hidrólise enzimática de material lig- nocelulósico. Por exemplo, WO 2011/000949 descreve cepas mutantes de Talaromyces que produzem composições de enzimas específicas que podem ser usadas em hidrólise enzimática de material lignoceluló- sico.
[0009] No entanto, estas tentativas não tiveram êxito no desenvol vimento de composições de enzimas com performance suficientemente aprimorada para a hidrólise de biomassa lignocelulósica.
[00010] Portanto, apesar de muito esforço de pesquisa, continua a haver a necessidade de composições de enzimas aprimoradas que reduzam os custos totais de produção no processo envolvendo hidrólise e fermentação de material lignocelulósico.
Sumário
[00011] Um objeto da invenção é proporcionar uma composição de enzimas aprimorada, um processo de produção da composição de enzimas e utilização da composição de enzimas em um processo para a preparação de um produto de açúcar e/ou um produto de fermentação a partir de material lignocelulósico.
Descrição detalhada
[00012] Do início ao fim da presente especificação e nas reivindicações anexadas, as palavras “compreendem” e “incluem” e variações tais como "compreende", "compreendendo", "inclui" e “incluindo” devem ser interpretadas de maneira inclusiva. Isto é, estas palavras se destinam a transmitir a possível inclusão de outros elementos ou inteiros não especificamente mencionados, onde o contexto permitir. Os artigos “um” e “uma” são usados aqui, neste requerimento de patente, para referir a um ou a mais de um (isto é, a um ou no mínimo um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” pode significar um elemento ou mais de um elemento.
[00013] No contexto da invenção, “melhorada” e/ou “aumentada” é usado para indicar que uma composição de enzimas compreendendo uma endoglucanase e uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica, em que a endoglucanase está presente em uma fração relativa à endo- glucanase (EG) e à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica (LPMO) conforme definido por REG e em que a mono-oxigenase de polissacarí- deos lítica está presente em uma fração relativa à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica e à endoglucanase conforme definido por RLPMO, em que REG é de 0,05 a 0,34 e RLPMO é de 0,66 a 0,95 apresenta uma maior conversão de glucano e xilano sob o mesmo processo ou as mesmas condições do processo comparada com uma composição de enzimas compreendendo uma endoglucanase e uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica, em que a endoglucanase está presente em uma fração relativa à endoglucanase e à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica conforme definido por REGe em que a mono-oxigenase de polissa- carídeos lítica está presente em uma fração relativa à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica e à endoglucanase conforme definido por RLPMO, em que REG é abaixo de 0,05 ou acima de 0,34 e RLPMO é abaixo de 0,66 ou acima de 0,95.
[00014] A presente invenção refere-se a uma composição de enzimas compreendendo uma endoglucanase e uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica, em que a endoglucanase está presente em uma fração relativa à endoglucanase e à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica conforme definido por REGe em que a mono-oxigenase de polissa- carídeos lítica está presente em uma fração relativa à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica e à endoglucanase conforme definido por RLPMO, em que REGé de 0,05 a 0,34 e RLPMO é de 0,66 a 0,95. De modo preferencial, REG é de 0,06 a 0,30 e RLPMO é de 0,70 a 0,94. De modo mais preferencial, REGé de 0,08 a 0,28 e RLPMO é de 0,72 a 0,92.
[00015] A proporção de endoglucanase (REG), a qual é definida como o peso total de endoglucanases na composição de enzimas dividido pelo peso total de endoglucanases e o peso total de mono-oxigenases de polissacarídeos líticas na composição de enzimas, pode ser calculada pela fórmula: REG = total de EG / (total de EG + total de LPMO). A proporção de mono-oxigenases de polissacarídeos líticas (RLPMO), a qual é definida como o peso total de mono-oxigenases de polissacarí- deos líticas na composição de enzimas dividido pelo peso total de mono- oxigenases de polissacarídeos líticas e o peso total de endoglucanases na composição de enzimas pode ser calculada pela fórmula: RLPMO = total de LPMO / (total de EG + total de LPMO).
[00016] Conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, a composição de enzimas da presente invenção compreende uma endo- glucanase e uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica. Deve ser entendido que “uma endoglucanase” significa “no mínimo uma endoglu- canase” e que “uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica” significa “no mínimo uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica”. A composição de enzimas da presente invenção pode, portanto, compreender mais de uma endoglucanase e/ou mais de uma mono-oxigenase de po- lissacarídeos lítica. No caso de existirem várias endoglucanases e/ou várias mono-oxigenases de polissacarídeos líticas, REG se refere ao peso de todas as endoglucanases na composição de enzimas dividido pelo peso total de endoglucanases e mono-oxigenases de polissacarí- deos líticas na composição de enzimas e RLPMO se refere ao peso de todas as mono-oxigenases de polissacarídeos líticas na composição de enzimas dividido pelo peso total de endoglucanases e mono-oxigenases de polissacarídeos líticas na composição de enzimas.
[00017] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, mono- oxigenases de polissacarídeos líticas são enzimas que foram recentemente classificadas por CAZy na família AA9 (Família de Atividade Auxiliar 9) ou na família AA10 (Família de Atividade Auxiliar 10). Por conseguinte, existem mono-oxigenases de polissacarídeos líticas AA9 e mono-oxigenases de polissacarídeos líticas AA10. Mono-oxigenases de polissacarídeos líticas têm a capacidade de abrir uma estrutura de glu- cano cristalina e reforçar a ação de celulases sobre substratos de ligno- celulose. São enzimas tendo atividade de reforço celulolítico. As mono- oxigenases de polissacarídeos líticas também podem afetar celo-oligos- sacarídeos. De acordo com a literatura mais recente, (vide Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, p. 2632-2642), proteínas denominadas GH61 (família de hidrolase de glicosídeo 61 ou algumas vezes referidas como EGIV) são mono-oxigenases de polissa- carídeos líticas. GH61 foi originalmente classificada como endogluca- nase com base na medição da atividade de endo-1,4-β-d-glucanase muito fraca em um membro da família, porém recentemente foi reclas- sificada por CAZy na família AA9. CBM33 (módulo de ligação a carboi- drtatos da família 33) também é uma mono-oxigenase de polissacarí- deos lítica (vide Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642). CAZy foi recentemente reclassificada como CBM33 na família AA10.
[00018] Em uma modalidade, a mono-oxigenase de polissacarídeos lítica compreende uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica AA9. Isto significa que no mínimo uma das mono-oxigenases de polissacarí- deos líticas na composição de enzimas é uma mono-oxigenase de po- lissacarídeos lítica AA9. Em uma modalidade, todas as mono-oxigena- ses de polissacarídeos líticas na composição de enzimas são mono- oxigenases de polissacarídeos líticas AA9.
[00019] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica de Thermoascus, tal como Thermoascus aurantiacus, tal como a descrita em WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1 em WO 2014/130812 e em WO 2010/065830; ou de Thielavia, tal como Thielavia terrestris, tal como a descrita em WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 4 em WO 2014/130812 e em WO 2008/148131, e em WO 2011/035027; ou de Aspergillus, tal como Aspergillus fumigatus, tal como a descrita em WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 em WO 2014/130812; ou de Penicillium, tal como Penicillium emersonii, tal como a revelada como SEQ ID NO: 2 em WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 2 em WO 2014/130812. Outras mono-oxi- genases de polissacarídeos líticas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Trichoderma reesei (vide WO 2007/089290), Myceli- ophthora thermophila (vide WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (vide WO 2011/005867), Thermoascus sp. (vide WO 2011/039319), e Thermoascus crustaceous (vide WO 2011/041504). Outras enzimas celulolíticas que podem ser compreendidas na composição de enzimas são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5.457.046, US 5.648.263, e US 5.686.593, para citar apenas algumas. Em uma modalidade, preferencial, a mono-oxige- nase de polissacarídeos lítica é de Rasamsonia, por exemplo, Rasam- sonia emersonii (vide WO 2012/000892).
[00020] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende mono-oxigenase de polissacarídeos lítica em uma quantidade de 10% a 30% (em peso/ peso) da quantidade total de proteínas na composição de enzimas.
[00021] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, endo- glucanases são enzimas as quais são capazes de catalisar a endohi- drólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose, liquenina ou β-D- glucanos de cereais. Pertencem a EC 3.2.1.4 e também podem ser capazes de hidrolisar ligações 1,4- em β-D-glucanos também contendo li- gações 1,3-. Endoglucanases também podem ser referidas como celu- lases, avicelases, hidrolases de β-1,4-endoglucanos, β-1,4-glucanases, carboximetil celulases, celudextrinases, endo-1,4-β-D-glucanases, endo-1,4-β-D-glucanohidrolases ou endo-1,4-β-glucanases.
[00022] Em uma modalidade, a endoglucanase compreende uma en- doglucanase GH5 e/ou uma endoglucanase GH7. Isto significa que no mínimo uma das endoglucanases na composição de enzimas é uma endoglucanase GH5 ou uma endoglucanase GH7. No caso de haver mais endoglucanases na composição de enzimas, estas endoglucana- ses podem ser endoglucanases GH5, endoglucanases GH7 ou uma combinação de endoglucanases GH5 e endoglucanases GH7. Em uma modalidade preferencial, a endoglucanase compreende uma endoglu- canase GH5.
[00023] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma endoglucanase de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei; de Humicola, tal como uma cepa de Humicola insolens; de Aspergillus, tal como Aspergillus aculeatus ou Aspergillus kawachii; de Erwinia, tal como Erwinia carotovara; de Fusarium, tal como Fusarium oxysporum; de Thielavia, tal como Thielavia terrestris; de Humicola, tal como Humi- cola grisea var. thermoidea ou Humicola insolens; de Melanocarpus, tal como Melanocarpus albomyces; de Neurospora, tal como Neurospora crassa; de Myceliophthora, tal como Myceliophthora thermophila; de Cladorrhinum, tal como Cladorrhinum foecundissimum; e/ou de Chrysosporium, tal como uma cepa de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade preferencial, a endoglucanase é de Rasamsonia, tal como uma cepa de Rasamsonia emersonii (vide WO 01/70998). Em uma modalidade, pode ser usada mesmo uma endoglucanase bacteri- ana incluindo, mas não estando limitada a, endoglucanase de Acidother- mus cellulolyticus (vide WO 91/05039; WO 93/15186; US 5.275.944;WO 96/02551; US 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglu- canase III de Thermobifida fusca (vide WO 05/093050); e endogluca- nase V de Thermobifida fusca (vide WO 05/093050).
[00024] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende endoglucanase em uma quantidade de 3% a 5% (em peso/ peso) da quantidade total de proteínas na composição de enzimas. Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende endoglucanase em uma quantidade de 3% a 4,5 % (em peso/ peso) da quantidade total de proteínas na composição de enzimas.
[00025] Em uma modalidade, a composição de enzimas da presente invenção adicionalmente compreende uma hemicelulase. Em uma modalidade, a composição de enzimas adicionalmente compreende uma hemicelulase, em que a hemicelulase está presente em uma fração relativa à hemicelulase e à mono-oxigenase de polissacarídeos lítica conforme definido por RHC, em que RHC é de 0,15 a 0,65. De modo preferencial, RHCé de 0,20 a 0,60. De modo mais preferencial, RHCé de 0,22 a 0,55.
[00026] Conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, a composição de enzimas da presente invenção compreende uma hemi- celulase. Deve ser entendido que “uma hemicelulase” significa “no mínimo uma hemicelulase”. A composição de enzimas da presente invenção pode, portanto, compreender mais de uma hemicelulase.
[00027] Em uma modalidade, a hemicelulase compreende uma beta- xilosidase e/ou uma endoxilanase.
[00028] A proporção de hemicelulase (RHC), a qual é definida como o peso total de beta-xIlosidases e endoxIlanases na composição de enzimas dividido pelo peso total de beta-xIlosidases, endoxIlanases e mono- oxigenases de polissacarídeos líticas na composição de enzimas, pode ser calculada pela fórmula: RHC = (total de BX + total de EX) / (total de BX + total de EX + total de LPMO).
[00029] No caso de existirem várias beta-xilosidases e/ou várias en- doxilanases, RHC se refere ao peso de todas as beta-xilosidases e todas as endoxilanases na composição de enzimas dividido pelo peso total de todas as beta-xilosidases, todas as endoxilanases e todas as mono-oxi- genases de polissacarídeos líticas na composição de enzimas.
[00030] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, beta- xilosidases (EC 3.2.1.37) são polipeptídeos os quais são capazes de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D-xilanos, de modo a remover sucessivos resíduos de D-xilose dos términos não-redutores. Beta-xilosidases também podem hidrolisar xilobiose. Beta-xilosidase também pode ser referida como 1,4-β-xilosidase de xilano, xilohidrolase de 1,4-β-D-xilano, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.
[00031] Em uma modalidade, a beta-xilosidase compreende uma beta-xilosidase GH3. Isto significa que no mínimo uma das beta-xilosi- dases na composição de enzimas é uma beta-xilosidase GH3. Em uma modalidade, todas as beta-xilosidases na composição de enzimas são beta-xilosidases GH3.
[00032] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma beta-xilosidase de Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus ou Trichoderma reesei. Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas compreende uma beta-xilosidase de Rasamsonia, tal como Ra- samsonia emersonii (vide WO 2014/118360).
[00033] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-β-D-xilosidicas em xilanos. Esta enzima também pode ser referida como endo-1,4-β-xilanase ou xi- lanohidrolase de 1,4-β-D-xilano. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que é capaz de hi- drolisar ligações 1,4 xilosídicas em glucuronoarabinoxilanos.
[00034] Em uma modalidade, a endoxilanase compreende uma xila- nase GH10. Isto significa que no mínimo uma das endoxilanases na composição de enzimas é uma xilanase GH10. Em uma modalidade, todas as endoxilanases na composição de enzimas são xilanases GH10.
[00035] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma endoxilanase de Aspergillus aculeatus (vide WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (vide WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (vide WO 2011/041405), Penicillium sp. (vide WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (vide WO 2009/079210), Talaromyces leycet- tanus, Thermobifida fusca, ou Trichophaea saccata GH10 (vide WO 2011/057083). Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas compreende uma endoxilanase de Rasamsonia, tal como Rasam- sonia emersonii (vide WO 02/24926).
[00036] Em uma modalidade, a composição de enzimas adicionalmente compreende uma beta-glucosidase (BG), uma celobio-hidrolase I (CBHI) e uma celobio-hidrolase II (CBHII).
[00037] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-glicose não-redutores, terminais com liberação de β-D-glicose. Um polipeptídeo similar pode ter uma ampla especificidade para β-D-glucosideos e também pode hidrolisar um ou mais dos seguintes: um β-D-galactosideo, um a-L-arabinosídeo, um e-D-xilosídeo ou um e-D-fucosídeo. Esta enzima também pode ser referida como amigdalase, glucohidrolase de e-D-glucosídeo, celobiase ou gentobiase.
[00038] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma beta-glucosidase de Aspergillus, tal como Aspergillus oryzae, tal como a revelada em WO 02/095014 ou a proteína de fusão tendo atividade de beta-glucosidase revelada em WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, tal como a revelada como SEQ ID NO: 2 em WO 2005/047499 ou SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, tal como a revelada em WO 2012/044915, tal como uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando SEQ ID NO: 5 em WO 2014/130812 para numeração), ou Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger ou Aspergillus kawachi. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de Penicillium, tal como Penicillium brasilianum revelada como SEQ ID NO: 2 em WO 2007/019442, ou de Trichoderma, tal como Tri- choderma reesei, tais como as descritas em US 6.022.725, US 6.982.159, US 7.045.332, US 7.005.289, US 2006/0258554 US 2004/0102619. Em uma modalidade, pode ser usada mesmo uma betaglucosidase bacteriana. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ou Trichophaea sac- cata (WO 2007/019442). Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas compreende uma beta-glucosidase de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2012/000886).
[00039] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma celobio-hidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose a partir das extremidades das cadeias. Esta enzima também pode ser referida como celulase 1,4-β-celobiosi- dase, 1,4-β-celobio-hidrolase, celobio-hidrolase de 1,4-β-D-glucano, avicelase, exo-1,4-β-D-glucanase, exocelobiohidrolase ou exogluca- nase.
[00040] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma celobio-hidrolase I de Aspergillus, tal como Aspergillus fumigatus, tal como a Cel7A CBH I revelada na SEQ ID NO: 6 em WO 2011/057140 ou SEQ ID NO: 6 em WO 2014/130812; de Trichoderma, tal como Tri- choderma reesei; de Chaetomium, tal como Chaetomium thermophilum; de Talaromyces, tal como Talaromyces leycettanus ou de Penicillium, tal como Penicillium emersonii. Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas compreende uma celobio-hidrolase I de Ra- samsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2010/122141).
[00041] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma celobio-hidrolase II de Aspergillus, tal como Aspergillus fumigatus, tal como a celobio-hidrolase II de Aspergillus na SEQ ID NO: 7 em WO 2014/130812 ou de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou de Talaromyces, tal como Talaromyces leycettanus, ou de Thielavia, tal como Thielavia terrestris, tal como a celobio-hidrolase II CEL6A de Thi- elavia terrestris. Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas compreende uma celobio-hidrolase II de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2011/098580).
[00042] Uma composição de enzimas compreende de modo preferencial no mínimo duas atividades, embora tipicamente uma composição venha a compreender mais de duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou ainda mais atividades. Uma composição de enzimas pode compreender atividade de mais de uma enzima por classe de atividade. Por exemplo, uma composição de enzimas pode compreender atividades de duas endoglucanases, por exemplo, atividade de endo-1,3(1,4)-β glucanase e atividade de endo-β-1,4-glu- canase. Uma composição de enzimas pode compreender atividade de um tipo de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase.
[00043] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende no mínimo duas celulases. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma celulase é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de degradar ou de modificar celulose. As no mínimo duas celulases podem conter as mesmas atividades ou atividades diferentes. A composição de enzimas também pode compreender no mínimo uma enzima diferente de uma celulase, por exemplo, uma hemicelulase ou uma pectinase. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma hemicelu- lase é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de degradar ou de modificar hemicelulose. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma pectinase é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de degradar ou de modificar pectina. A no mínimo uma outra enzima pode ter uma atividade de enzima auxiliar, isto é, uma atividade adicional a qual, quer direta ou indiretamente leva a degradação da lignocelulose. Exemplos de similares atividades auxiliares são mencionados aqui, neste requerimento de patente.
[00044] Em uma modalidade, a composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, compreende uma, duas, três, quatro classes ou mais de celulase, por exemplo, uma, duas, três ou quatro ou todas de uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica (LPMO), uma endoglucanase (EG), uma ou duas celobiohidrolases (CBH) e uma beta-glucosidase (BG).
[00045] Em uma modalidade, a composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, compreende uma mono- oxigenase de polissacarídeos lítica, uma endoglucanase, uma celobio- hidrolase I, uma celobio-hidrolase II, uma beta-glucosidase, uma beta- xilosidase e uma endoxilanase.
[00046] Em uma modalidade, a composição de enzimas também compreende uma ou mais das enzimas abaixo mencionadas.
[00047] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma β-(1,3)(1,4)-glucanase (EC 3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em β-D- glucanos contendo ligações 1,3- e 1,4-. Um polipeptídeo similar pode agir sobre liquenina e β-D-glucanos de cereais, mas não sobre β-D-glu- canos contendo somente ligações 1,3- ou 1,4-. Esta enzima também pode ser referida como liqueninase, 4-glucanohidrolase de 1,3-1,4-β-D- glucano, β-glucanase, endo-β-1,3-1,4 glucanase, liquenase ou β-gluca- nase de ligações mistas. Uma alternativa para este tipo de enzima é EC 3.2.1.6, a qual é descrita como endo-1,3(4)-beta-glucanase. Este tipo de enzima hidrolisa ligações 1,3- ou 1,4- em beta-D-glucanase quando o resíduo de glicose, cujo grupo redutor está envolvido na ligação a ser hidrolisada, é o próprio substituído em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase, 3 (4) glucanohidrolase de 1,3- (1,3;1,4)-beta-D-glucano. Substratos incluem laminarina, lichenina e beta-D-glucanos de cereais.
[00048] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de agir sobre α-L-arabinofuranosideos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2)- e/ou (1,3)- e/ou (1,5)-, arabinoxilanos e arabinogalacta- nos. Esta enzima também pode ser referida como α-N-arabino- furanosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase. Exemplos de ara- binofuranosidases que podem ser compreendidas na composição de enzimas incluem, mas não estão limitados a, arabinofuranosidases de Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (vide WO 2006/114094 e a WO 2009/073383) e M. giganteus (vide WO 2006/114094).
[00049] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma α- D-glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar uma reação da seguinte forma: alfa-D-glucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Esta enzima também pode ser referida como alfa-glucuronidase ou alfa-glucosiduronase. Estas enzimas também podem hidrolisar ácido glucorônico 4-O-metilado, o qual também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC 3.2.1.131: alfa-1,2-glucuronosidase de xilano, a qual catalisa a hidrólise de ligações alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosilo. Exemplos de alfa-glu- curonidases que podem ser compreendidas na composição de enzimas incluem, mas não estão limitados a, alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Hu- micola insolens (vide WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (vide WO 2009/068565) e Trichoderma reesei.
[00050] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma esterase de acetil xilano (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Um polipeptídeo similar pode catalisar a hidrólise de grupos de acetilo de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, alfa-naftil acetato ou p-nitrofenil acetato, mas, tipicamente, não de triacetilglicerol. Um polipeptídeo similar tipicamente não age sobre manano ou pectina ace- tilados. Exemplos de esterases de acetil xilano que podem ser compreendidas na composição de enzimas incluem, mas não estão limitados a, esterases de acetil xilano de Aspergillus aculeatus (vide WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (vide WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (vide WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (vide WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum e Thielavia terrestris NRRL 8126 (vide WO 2009/042846). Em uma modalidade preferencial, a composição de enzimas compreende uma esterase de acetil xilano de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2010/000888).
[00051] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo + H2O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Tipicamente pode catalisar a hidrólise do grupo de 4-hidroxi-3-metoxicinamoil (feruloil) de um açúcar esterificado, o qual é geralmente arabinose em substratos ‘naturais’. Acetato de p-nitrofenol e ferulato de metilo são tipicamente substratos mais pobres. Esta enzima também pode ser referida como hidrolase de éster cinamoílico, esterase de ácido ferúlico ou hidroxicinamoil esterase. Também pode ser referida como uma enzima acessória de hemicelulase, uma vez que pode auxiliar as xilanases e as pectinases a decompor a pectina e a hemicelulose da parede das células vegetais. Exemplos de feruloil esterases (esterases de ácido ferúlico) que podem ser compreendidas na composição de enzimas incluem, mas não estão limitados a, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (vide WO 2009/076122), Ne- osartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (vide WO 2009/127729), e Thielavia terrestris (vide o WO 2010/053838 e o WO 2010/065448).
[00052] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma cumaroil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar uma reação da forma: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cuma- rato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarí- deo ou um polissacarídeo. Esta enzima também pode ser referida como trans-4-cumaroil esterase, trans-p-cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou esterase de ácido p-cumárico. Esta enzima também faz parte da EC 3.1.1.73, portanto, também pode ser referida como uma feruloil esterase.
[00053] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-D-galactose não-redutores, terminais em a-D-galactosídeos, incluindo oligossacarídeos de galactose, galactomananos, galactanos e arabinogalactanos. Um polipeptídeo similar também pode ser capaz de hidrolisar a-D-fucosídeos. Esta enzima também pode ser referida como melibiase.
[00054] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-galactose não-redutores, terminais em e-D-galactosídeos. Um polipeptídeo similar também pode ser capaz de hidrolisar a-L-arabinosídeos. Esta enzima também pode ser referida como exo-(1 ^4)-β-D-galactanase ou lactase.
[00055] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma β-mananose (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-β-D-manosidicas em ma- nanos, galactomananos e glucomananos. Esta enzima também pode ser referida como endo-1,4-β-manosidase de manano ou endo-1,4-ma- nanose.
[00056] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma β-manosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-manose não-redutores, terminais em e-D-manosídeos. Esta enzima também pode ser referida como mananose ou manase.
[00057] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma endo-poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-α-D-galactosidu- rônicas em pectato e outros galacturonanos. Esta enzima também pode ser referida como poligalacturonase despolimerase de pectina, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, hidrolase de pectina, poligalac- turonase de pectina, glicanohidrolase de poli-a-1,4-galacturonídeo, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou glicanohidrolase de poli(1,4-a-D-galacturonídeo).
[00058] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma metil esterase de pectina (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima a qual é capaz de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pectinesterase, desmetoxi- lase de pectina, metoxilase de pectina, metilesterase de pectina, pec- tase, pectinoesterase ou pectil-hidrolase de pectina.
[00059] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,4-e-D-galactosídicas em arabinogalactanos.A enzima também pode ser conhecida como endo-1,4-β-galactosidase de arabinogalactano, endo-1,4-β-galactanase, galactanase, arabinoga- lactanase ou 4-β-D-galactanohidrolase de arabinogalactano.
[00060] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma acetil esterase de pectina é definida aqui, neste requerimento de patente, como qualquer enzima a qual tem uma atividade de acetil esterase a qual catalisa a desacetilação dos grupos de acetila nos grupos de hidroxila de resíduos GalUA de pectina.
[00061] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma liase de endo-pectina (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminatória de éster metílico de (1 ^4)-α-D-galacturo- nano para dar oligossacarídeos com grupos de 4-desoxi-6-O-metil-α-D- galact-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como liase pectina, trans-eliminase de pec- tina; liase de endo-pectina, transeliminase de polimetilgalacturônico, metiltranseliminase de pectina, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou liase de (1 ^4)-6- O-metil-α-D-galacturonano.
[00062] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma liase de pectato (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminatória de (1 ^4)-α-D-galacturonano para dar oligossaca- rídeos com grupos de 4-desoxi-α-D-galact-4-enuronosil em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, transeliminase de ácido péctico, liase de poligalacturonato, metiltranseliminase de endopectina, transeliminase de pectato, transeliminase de endogalacturonato, liase de ácido péctico, liase péctica, liase de ácido a-1,4-D-endopoligalacturônico, li- ase de PGA, PPase-N, liase de ácido endo-a-1,4-poligalacturônico, li- ase de ácido poligalacturônico, trans-eliminase de pectina, trans-eliminase de de ácido poligalacturônico ou liase de (1 ^4)-α-D-galacturo- nano.
[00063] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma alfa ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-L-rhamnose não-redutores, terminais em a-L-ramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturo- nano. Esta enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L-ramnosidase N ou ramno-hidrolase de a-L-ramnosídeo.
[00064] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrólise de ácido péctico da extremidade não redutora, liberando digalacturo- nato. A enzima também pode ser conhecida como exo-poli-α-galacturo- nosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.
[00065] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-a-D-galacturonídeo) n + H2O = (1,4-a-D-galacturonídeo) n1 + D-ga- lacturonato. A enzima também pode ser conhecida como 1,4-α-galactu- ronidase de galacturano, exopoligalacturonase, hidrolase de poli(galac- turonato), exo-D-galacturonase, exo-D-galacturonanase, exopoli-D-ga- lacturonase ou galacturonohidrolase de poli(1,4-a-D-galacturonídeo).
[00066] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, liase de exopoligalacturonato (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar a clivagem eliminatória de 4-(4-desoxi-α-D-galact-4-enurono- sil)-D-galacturonato da extremidade redutora de pectato, isto é, pectina desesterificada. Esta enzima pode ser conhecida como pectato dissa- carídeo-liase, pectato exo-liase, transeliminase de ácido exopéctico, li- ase de exopectato, ácido exopoligalacturônico-trans-eliminase, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou extremidade redutora de (1 ^4)-α-D-galacturo- nano-dissacarídeo-liase.
[00067] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, hidro- lase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de hidrolisar a ligação entre o ácido galactosilurônico e ramnopiranosil em um modo endo- em estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas, consistindo no dissacarídeo [ácido (1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)- alfa-galactosilurônico].
[00068] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, liase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo o qual é qualquer poli- peptídeo o qual é capaz de clicar ligações α-L-Rha p -(1 —4)-α-D-Gal pA em um modo endo- em ramnogalacturonano por beta-eliminação.
[00069] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, acetil esterase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo o qual catalisa a desacetilação da espinha dorsal de resíduos de ácido galacturônico e ramnose alternados em ramnogalacturonano.
[00070] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, galac- turonohidrolase de ramnogalacturonano é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de hidrolisar o ácido galacturônico da extremidade não redutora de estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternadas em um modo exo-.
[00071] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, xilo- galacturonase é qualquer polipeptídeo o qual age sobre xilogalacturo- nano por clivagem da espinha dorsal de ácido galacturônico substituído com β-xilose em uma maneira endo-. Esta enzima também pode ser conhecida como hidrolase de xilogalacturonano.
[00072] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, uma α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de agir sobre a-L-arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos contendo ligações (1,2)- e/ou (1,3)- e/ou (1,5)-, arabinoxilanos e arabinogalacta- nos. Esta enzima também pode ser referida como α-N-arabino- furanosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.
[00073] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, endo- arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo o qual é capaz de catalisar a endohidrólise de ligações 1,5-a-arabinofuranosídicas em 1,5- arabinanos. A enzima também pode ser conhecida como endo-arabi- nase, endo-1,5-α-L-arabinosidase de arabinano, endo-1,5-α-L-arabina- nase, endo-α-1,5-arabanase; endo-arabanase ou 1,5-α-L-arabinanohi- drolase de 1,5-α-L-arabinano.
[00074] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídicas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptí- deos e outras porções, tais como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4 e são adequadas para uso nos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Alguns tipos específicos de proteases incluem, proteases de cisteína incluindo as proteases pepsina, papaína e serina incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.
[00075] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídeos, ácidos gra- xos e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgli- ceróis, e similares. Em plantas, lipídeos são usados como componentes estruturais para limitar a perda de água e infecção por patógeno. Estes lipídeos incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.
[00076] "Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou decompor a estrutura de polímeros de lignina. Enzimas que podem decompor lignina incluem peroxidases de lignina, peroxidases de manganês, laca- ses e feruloil esterases, e outras enzimas descritas na arte conhecidas para despolimerizar ou quebrar de modo diverso polímeros de lignina. Também são incluídas enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (notavelmente arabinose) e lignina. Ligninases incluem mas não estão limitadas ao seguinte grupo de enzimas: peroxidases de lignina (EC 1.11.1.14), peroxidases de manganês (EC 1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).
[00077] “Hexosiltransferase” (2.4.1-) inclui enzimas as quais são capazes de catalisar uma reação de transferase, mas as quais também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou produtos de degradação de celulose. Um exemplo de uma hexosiltrans- ferase a qual pode ser usada é uma β-glucanosiltransferase. Uma enzima similar também pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3)(1,4)glucano e/ou celulose e/ou um produto de degradação de celulose.
[00078] "Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucuronosídeo, por exemplo, β-glucuronosideo para produzir um álcool. Muitas glucuronidases têm sido caracterizadas e podem ser adequadas para uso, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialu- rono-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-di-sulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), β-glucuronidase de glicirrizinato (3.2.1.128) ou α- D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).
[00079] As expansinas estão implicadas no afrouxamento da estrutura da parede celular durante o crescimento das células vegetais. As expansinas têm sido propostas para romper a ligação de hidrogênio entre celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem terem atividade hidrolítica. Deste modo, imagina-se que possibilitem o deslizamento de fibras de celulose e o alargamento da parede celular. Swole- nina, uma proteína similar a expansina contém um domínio da Família 1 de Módulos de Ligação de Carboidratos N-terminal (CBD) e um domínio similar a expansina C-terminal. Conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, uma proteína similar a expansina ou proteína similar a swolenina pode compreender um ou ambos de similares domínios e/ou pode romper a estrutura das paredes celulares (tal como rompendo a estrutura de celulose), opcionalmente sem produzir quantidades de- tectáveis de açúcares redutores.
[00080] Uma proteína induzida por celulose, por exemplo, o produto polipeptídico do gene cip1 ou cip2 ou genes similares (vide Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), uma proteina de integração de celulose / celulossoma, por exemplo, o produto polipeptídico do gene cipA ou cipC, ou um scaffoldin ou uma proteina similar a scaffoldin. Scaffoldins e proteina de integração de celulose são unidades de integração multi-funcionais as quais podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo multi-enzimático. Isto é realizado pela interação das duas classes complementares de domínio, isto é, um domínio de coesão sobre o scaffoldin e um domínio doquerina sobre cada unidade enzimática. A subunidade de scaffoldin também carrega um módulo de ligação a celulose (CBM) que media a fixação do celulossoma a seu substrato. Um scaffoldin ou proteina de integração de celulose pode compreender um ou ambos de similares domínios.
[00081] Uma catalase; o termo "catalase" significa um peróxido de hidrogênio: oxidorredutase de peróxido de hidrogênio (EC 1.11.1.6 ou EC 1.11.1.21) que catalisa a conversão de dois peróxidos de hidrogênio para oxigênio e duas águas. A atividade de catalase pode ser determinada monitorando a degradação de peróxido de hidrogênio a 240 nm com base na seguinte reação: 2H2O2 ^ 2H2O + O2. A reação é conduzida em 50 mM de fosfato, pH 7,0, a 25°C com 10,3 mM de substrato (H2O2) e aproximadamente 100 unidades de enzima por ml. A absor- vência é monitorada espectrofotometricamente dentro de 16 a 24 segundos, o que deve corresponder a uma redução na absorvência de 0,45 a 0,4. Uma unidade de atividade de catalase pode ser expressa como um micromol de H2O2 degradado por minuto em pH 7,0 e 25°C.
[00082] O termo “amilase” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa enzimas que hidrolisam ligações alfa-1,4-glucosídi- cas em amido, tanto em amilose quanto em amilopectina, tais como alfa- amilase (EC 3.2.1.1), beta-amilase (EC 3.2.1.2), 1,4-alfa-glucosidase de glucano (EC 3.2.1.3), 1,4-alfa-maltotetraohidrolase glucano (EC 3.2.1.60), 1,4-alfa-maltohexaosidase de glucano (EC 3.2.1.98), 1,4-alfa- maltotriohidrolase de glucano (EC 3.2.1.116) e 1,4-alfa-maltohidrolase de glucano (EC 3.2.1.133), e enzimas que hidrolisam ligações alfa-1,6- glucosídicas, sendo os pontos de ramificação em amilopectina, tais como pululanase (EC 3.2.1.41) e limite dextinase (EC 3.2.1.142).
[00083] Uma composição de enzimas pode ser composta de um membro de cada uma das classes de enzimas mencionadas acima, vários membros de uma classe de enzimas, ou qualquer combinação destas classes de enzimas. Diferentes enzimas em uma composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, podem ser obtidas a partir de diferentes fontes.
[00084] Nos usos e processos descritos aqui, neste requerimento de patente, os componentes das composições descritas acima podem ser proporcionados concomitantemente (isto é, como uma única composição per se) ou separadamente ou sequencialmente.
[00085] Em uma modalidade, as enzimas na composição de enzimas são derivadas de um fungo, de modo preferencial um fungo filamentoso ou as enzimas compreendem uma enzima fúngica, de modo preferencial uma enzima de fungo filamentoso. Em uma modalidade preferencial, o fungo é Rasamsonia, com Rasamsonia emersonii sendo o mais preferencial. Em uma modalidade, um conjunto principal de enzimas de degradação de (ligno)celulose (isto é, celulases e/ou algumas hemice- lulases e/ou algumas pectinases) pode ser derivado de Rasamsonia emersonii. Caso necessário, o conjunto de enzimas pode ser suplementado com atividades enzimáticas adicionais de outras fontes. As atividades referidas podem ser derivadas de fontes clássicas e/ou produzidas por organismos geneticamente modificadios. Portanto, a composição de enzimas pode compreender uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de uma fonte diferente de Rasamsonia. Em uma modalidade, podem ser usadas junto com uma ou mais enzimas de Rasam- sonia ou podem ser usadas sem enzimas de Rasamsonia adicionais estando presentes.
[00086] "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (conforme definido por Hawks- worth et al., In, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede mi- celial composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento das hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeró- bico. Cepas de fungos filamentosos incluem, mas não estão limitadas a, cepas de Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauva- ria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceli- ophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Pe- nicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Sta- gonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, Trichoderma e Trichophyton.
[00087] Várias cepas de fungos filamentosos estão prontamente acessíveis ao público em uma série de coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mi- kroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Exemplos de similares cepas incluem Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus ory- zae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488- 14491, ATCC 11601, ATCC12892, Penicillium chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ou ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 ou ATCC 56765 ou ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense C1, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 e derivados das mesmas.
[00088] As enzimas (por exemplo, sob a forma de um caldo de fermentação inteiro) podem ser preparadas por fermentação de um substrato adequado com um micro-organismo adequado, por exemplo, um fungo filamentoso, em que as enzimas são produzidas pelo micro-organismo. O micro-organismo pode ser alterado para melhorar ou para produzir as enzimas. Por exemplo, o micro-organismo pode ser mutado por procedimentos de melhoramento de cepa clássicos ou por técnicas de DNA recombinante. Portanto, os micro-organismos mencionados aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados no estado em que se encontram para produzir as enzimas ou podem ser alterados para aumentar a produção ou para produzir enzimas alteradas, as quais podem incluir enzimas heterólogas, por exemplo, celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases, portanto enzimas que não são originalmente produzidas por aquele micro-organismo. De modo preferencial, um fungo, de modo mais preferencial um fungo filamentoso, é usado para produzir as enzimas. Vantajosamente, é usado um micro-organismo termofílico ou termotolerante. Opcionalmente, é usado um substrato que induz a expressão das enzimas pelo micro-organismo produtor de enzimas.
[00089] Em uma modalidade, a composição de enzimas compreende uma enzima “termoestável”. Uma enzima “termoestável” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa que a enzima tem uma temperatura ótima de 50oC ou superior, 60oC ou superior, 70oC ou superior, 75oC ou superior, 80oC ou superior, 85oC ou superior. Podem ser isoladas, por exemplo, a partir de micro-organismos termofílicos ou podem ser projetadas pelo perito na arte e sintetizadas artificialmente. Em uma modalidade, os polinucleotideos podem ser isolados ou obtidos a partir de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados a partir de fungos não termofílicos ou não termotolerantes, mas foi visto que são termoestáveis.
[00090] Por “fungo termofílico” se indica um fungo que cresce em uma temperatura de 50°C ou superior. Por “fungo termotolerante” se indica um fungo que cresce em uma temperatura de 45°C ou superior, tendo um máximo próximo a 50°C.
[00091] Células fúngicas termofílicas ou termotolerantes adequadas podem ser uma célula de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Ra- samsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, de modo preferencial uma célula de Rasamsonia. Fungos termofílicos ou termotolerantes preferenciais são Humicola grisea var. thermoidea, Hu- micola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora ther- mophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Ra- samsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.
[00092] Fungos termofílicos não estão restritos a uma ordem taxonô- mica específica e ocorrem todos sobre a árvore fúngica de vida. Exemplos são Rhizomucor nos Mucorales, Myceliophthora em Sordariales e Talaromyces, Thermomyces e Thermoascus nos Eurotiales (vide Mou- chacca, 1997). A maior parte das espécies de Talaromyces são mesófi- los, porém exceções são espécies dentro das seções Emersonii e Thermophila. A seção Emersonii inclui Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus e Talaromyces leycet- tanus, todos os quais crescem bem a 40°C. Talaromyces bacillisporus é termotolerante, Talaromyces leycettanus é termotolerante a termofí- lico, e Talaromyces emersonii e Talaromyces byssochlamydoides são verdadeiramente termofílicos (vide Stolk and Samson, 1972). O único membro de Talaromyces seção Thermophila, Talaromyces thermophilus, cresce rapidamente a 50°C (vide Stolk and Samson, 1972). A classificação corrente destas espécies de Talaromyces termofílicas é essencialmente baseada em caracteres fenotípicos e fisiológicos, tais como sua capacidade para crescer acima de 40°C, cor de ascósporos, a estrutura de cobertura ascornatal e a formação de um certo tipo de anamorfo. Stolk e Samson (1972) declararam que os membros da seção Emersonii têm anamorfos de ou Paecilomyces (Talaromyces bysso- chlamydoides e Talaromyces leycettanus) ou série Penicillium cylindros- porum (Talaromyces emersonii e Talaromyces bacillisporus). Posteriormente, Pitt (1979) transferiu as espécies pertencentes à série Penicil- lium cylindrosporum para o gênero Geosmithia, com base em vários ca- ráteres tais como a formação de conídios de poros terminais ao invés de sobre collula (gargalos), um caráter de Penicillium e Paecilomyces. Dentro do gênero Geosmithia, somente Geosmithia argillacea é termo- tolerante, e Stolk et al. (1969) e Evans (1971) propuseram uma conexão com membros de Talaromyces seção Emersonii. A relação filogenética da espécie Talaromyces temofíica dentro de Talaromyces e a Trichoco- maceae é desconhecida (vide J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek 2012 Feb; 101(2): 403-21).
[00093] Rasamsonia é um novo gênero compreendendo espécies de Talaromyces e Geosmithia termotolerantes e termofílicas (J. Houbraken et al., vida supra). Com base em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, Houbraken et al. propuseram transferir as espécies Tala- romyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora para Ra- samsonia gen. nov.
[00094] Fungos termofílicos preferenciais são Rasamsonia bysso- chlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Ta- laromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus e Thermoascus aurantiacus, com Rasamsonia emersonii sendo o mais preferencial. Talaromyces emersonii, Penicillium geos- mithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usados de modo inter- cambiável aqui, neste requerimento de patente.
[00095] Em uma modalidade, a composição de enzimas é um caldo de fermentação inteiro. Em uma modalidade, a composição de enzimas é um caldo de fermentação inteiro de um fungo, de modo preferencial um fungo filamentoso, de modo preferencial do gênero Rasamsonia. O caldo de fermentação inteiro pode ser preparado a partir da fermentação de fungos filamentosos não-recombinantes e/ou recombinantes. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombi- nante compreendendo um ou mais genes os quais podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo filamentoso. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante compreendendo um ou mais genes os quais podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo filamentoso, em que o um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar um substrato celulósico. O caldo de fermentação inteiro pode compreender qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui, neste requerimento de patente, ou qualquer combinação dos mesmos.
[00096] De modo preferencial, a composição de enzimas é um caldo de fermentação inteiro, em que as células estão mortas, isto é, são não viáveis. Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro compreende polipeptídeos, um ou mais ácidos orgânicos, células mortas e/ou fragmentos celulares, e meio de cultura.
[00097] Geralmente, os fungos filamentosos são cultivados em um meio de cultura celular adequado para produção de enzimas capazes de hidrolisar um substrato celulósico. A cultura ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte. Meios de cultura adequados, faixas de temperatura e ouitras condições adequadas para crescimento e produção de celulase e/ou hemicelulase e/ou pectinase são conhecidos na arte. O caldo de fermentação inteiro pode ser preparado por crescimento dos fungos filamentosos até a fase es- cationária e mantendo os fungos filamentosos sob condições de limitação de carbono por um período de tempo suficiente para expressar a uma ou mais celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases. Assim que enzimas, tais como celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases, são secretadas pelos fungos filamentosos dentro do meio de fermentação, pode ser usado o caldo de fermentação inteiro. O caldo de fermentação inteiro pode compreender fungos filamentosos. Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro compreende dos conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados ao final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação inteiro compreende o meio de cultura gasto e fragmentos celulares presentes depois dos fungos filamentosos crescerem até a saturação, incubados sob condições de limitação de carbono de modo a permitir a síntese de proteína (particularmente, expressão de celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases). Em algumas modalidades, o caldo de fermentação inteiro compreende o meio de cultura gasto celular, enzimas extracelulares e fungos filamentosos. As células fúngicas filamentosas presentes no caldo de fermentação inteiro podem ser mortas usando métodos conhecidos na arte para produzir um caldo de fermentação inteiro de células mortas. Por exemplo, a adição de ácido orgânico leva à destruição das células. Caso necessário, as células também podem ser lisadas e/ou permeabilizadas. Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro é um caldo de fermentação inteiro de células mortas, em que o caldo de fermentação inteiro contendo as células fúngicas filamentosas são destruídas. Em outras palavras, o caldo de fermentação inteiro compreende mais células não viáveis do que células viáveis, de modo preferencial somente células não viáveis. Em algumas modalidades, as células são mortas por lise dos fungos filamentosos por tratamento químnico e/ou de pH de modo a gerar o caldo inteiro de células mortas de uma fermentação dos fungos filamentosos. Em algumas modalidades, as células são mortas por lise dos fungos filamentosos por tratamento químnico e/ou de pH e ajustando o pH da mistura da fermentação de células mortas para um pH adequado. Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro é misturado com um ácido orgânico.
[00098] O termo "caldo de fermentação inteiro" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que não sofre nenhuma ou sofre mínima recuperação e/ou purificação. Por exemplo, caldos de fermentação inteiros são produzidos quando culturas microbianas crescem até a saturação, incubados sob condições de limitação de carbono de modo a permitir a síntese de proteína (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção dentro do meio de cultura celular. Tipicamente, o caldo de fermentação inteiro é não fracionado e compreende meio de cultura celular gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas, de modo preferencial não viáveis.
[00099] Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro pode ser fracionado e podem ser usados o um ou mais dos conteúdos fracionados. Por exemplo, as células mortas e/ou fragmentos celulares podem ser removidos de um caldo de fermentação inteiro de modo a proporcionar uma composição de enzimas que seja livre destes componentes.
[000100] O caldo de fermentação inteiro pode compreender adicionalmente um agente conservante e/ou antimicrobiano. Os agentes conservantes e/ou antimicrobianos são conhecidos natécnica. Em uma modalidade, o ácido orgânico usado para destruir as células também pode te a função de agente conservante e/ou antimicrobiano.
[000101] O caldo de fermentação inteiro conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é tipicamente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, fragmentos celulares, componentes do meio de cultura, e/ou uma ou mais enzimas insolúveis. Em algumas modalidades, componentes insolúveis podem ser removidos de modo a proporcionar um caldo de fermentação inteiro clarificado.
[000102] Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro pode ser suplementado com atividades de uma ou mais enzimas que não são expressas endogenamente, ou são expressas em um nível relativamente baixo pelos fungos filamentosos, para melhorar a degradação do substrato celulósico, por exemplo, para açúcares fermentáveis tais como glicose ou xilose. A uma ou mais enzimas suplementares podem ser adicionadas como um suplemento ao caldo de fermentação inteiro, isto é, são cravadas no caldo de fermentação inteiro. As enzimas adicionais podem ser suplementadas sob a forma de um caldo de fermentação inteiro, ou podem ser suplementadas como enzimas purificadas, ou minimamente recuperadas e/ou purificadas.
[000103] Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro pode ser suplementado com no mínimo outro caldo de fermentação inteiro. O outro caldo de fermentação inteiro pode ser derivado do mesmo tipo de fungo ou de outro tipo de fungo, por exemplo, um primeiro caldo de fermentação inteiro pode ser derivado de Rasamsonia, ao passo que um segundo caldo de fermentação inteiro pode ser derivado de Rasamsonia ou de Aspergillus.
[000104] Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro é um caldo de fermentação inteiro de uma fermentação de alguns fungos filamentosos recombinantes superexpressando uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Alternativamente, o caldo de fermentação inteiro é uma mistura de um caldo de fermentação inteiro de uma fermentação de um fungo filamentoso não-recombinante e um caldo de fermentação inteiro de um fungo filamentoso recombi- nante superexpressando uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Em uma modalidade, o caldo de fermentação inteiro é um caldo de fermentação inteiro de uma fermentação de alguns fungos filamentosos superexpressando beta-glucosidase. Alternativamente, o caldo de fermentação inteiro é uma mistura de um caldo de fermentação inteiro de uma fermentação de um fungo filamentoso não-recombinante e um caldo de fermentação inteiro de uma fermentação de alguns fungos filamentosos recombinantes superexpressando uma beta-glucosidase.
[000105] Em uma modalidade, a composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, tem um pH de 2,0 a 5,5. De modo preferencial, a composição de enzimas tem um pH de 2,5 a 5,0. De modo mais preferencial, a composição de enzimas tem um pH de 3,0 a 4,5. Por conseguinte, as enzimas na composição de enzimas são capazes de trabalhar em baixo pH.
[000106] Em uma modalidade, o um ou mais recipientes usados no processo para a preparação de uma composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, têm um volume de no mínimo 1 m3. De modo preferencial, os recipientes têm um volume de no mínimo 1 m3, no mínimo 2 m3, no mínimo 3 m3, no mínimo 4 m3, no mínimo 5 m3, no mínimo 6 m3, no mínimo 7 m3, no mínimo 8 m3, no mínimo 9 m3, no mínimo 10 m3, no mínimo 15 m3, no mínimo 20 m3, no mínimo 25 m3, no mínimo 30 m3, no mínimo 35 m3, no mínimo 40 m3, no mínimo 45 m3, no mínimo 50 m3, no mínimo 60 m3, no mínimo 70 m3, no mínimo 75 m3, no mínimo 80 m3, no mínimo 90 m3. Em geral, o um ou mais recipientes serão menores do que 300 m3.
[000107] No processo para a preparação de uma composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, uma população de células microbianas, por exemplo, células fúngicas filamentosas, é cultivada sob condições adequadas para o crescimento, em um meio líquido ou sólido. Em uma modalidade, as células microbianas são cultivadas em uma cultura de lote alimentado, em uma cultura em lote, em uma cultura contínua ou qualquer combinação das mesmas. De modo preferencial, os fungos filamentosos são cultivados em uma cultura de lote alimentado. Um perito na arte está bem ciente dos vários modos de cultura e suas condições. Em uma modalidade, a cultura é conduzida sob condições aeróbicas. Um perito na arte está bem ciente de desenhos de fermentadores para cultura aeróbica, tais como, por exemplo, tanques agitados e colunas de bolha.
[000108] A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um açúcar a partir de material lignocelulósico compreendendo as etapas de (a) hidrólise do material lignocelulósico com uma composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, de modo a obter o açúcar, e (b) opcionalmente, recuperação do açúcar.
[000109] A presente invenção também se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material ligno- celulósico, cujo processo compreende as etapas de (a) hidrólise do material lignocelulósico com uma composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, de modo a obter um açúcar, (b) fermentação do açúcar obtido por contato do açúcar obtido com um micro-organismo de fermentação, de modo a produzir o produto de fermentação, e (c) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação.
[000110] Depois de hidrólise enzimática, o material lignocelulósico hidro- lisado pode ser submetido a no mínimo uma separação de sólido/líquido.Os métodos e condições de separação de sólido/líquido vão depender do tipo de material lignocelulósico usado e estão bem dentro do escopo do especialista. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, centrifugação, separação ciclônica, filtração, decantação, peneiração e sedimentação. Em uma modalidade preferencial, a separação de sólido/líquido é realizada por centrifugação ou sedimentação. Durante a separação de só- lido/líquido, podem ser usados meios e/ou auxiliares para melhorar a separação.
[000111] Em uma modalidade, o material lignocelulósico é submetido a uma etapa de pré-tratamento antes da hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o material lignocelulósico é submetido a uma etapa de lavagem antes da hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o material lignocelulósico é submetido a no mínimo uma separação de sólido/lí- quido antes da hidrólise enzimática. Portanto, antes de submeter o material lignocelulósico a hidrólise enzimática, pode ser submetido a no mínimo uma separação de sólido/líquido. A separação de sólido/líquido pode ser feita antes e/ou depois da etapa de pré-tratamento. Métodos e condições adequados para uma separação de sólido/líquido foram descritos acima.
[000112] Em uma modalidade, o material lignocelulósico enzimatica- mente hidrolisado é submetido a uma etapa de separação de sólido/lí- quido seguida por uma etapa de detoxificação e/ou uma etapa de concentração.
[000113] Nos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, material lignocelulósico pode ser adicionado ao um ou mais recipientes. Em uma modalidade, a composição de enzimas já está presente dentro do um ou mais recipientes antes do material lignocelulósico ser adicionado. Em outra modalidade, a composição de enzimas pode ser adicionada ao um ou mais recipientes. Em uma modalidade, o material lignocelulósico já está presente dentro do um ou mais recipientes antes da composição de enzimas ser adicionada. Em uma modalidade, tanto o material lignocelulósico quanto a composição de enzimas são adicionados simultaneamente ao um ou mais recipientes. A composição de enzimas presente dentro do um ou mais recipientes pode ser uma composição aquosa.
[000114] Em uma modalidade, a hidrólise enzimática compreende no mínimo uma etapa de liquefação em que o material lignocelulósico é hidrolisado em no mínimo um primeiro recipiente, e uma etapa de sacarificação em que o material lignocelulósico liquefeito é hidrolisado dentro de no mínimo o primeiro recipiente e/ou dentro de no mínimo um segundo recipiente. A sacarificação pode ser feita dentro do mesmo recipiente que a liquefação (isto é, o no mínimo primeiro recipiente), também pode ser feita dentro de um recipiente separado (isto é, dentro de no mínimo o segundo recipiente). Portanto, na hidrólise enzimática, a liquefação e a sacarificação podem ser combinadas. Alternativamente, a liquefação e a sacarificação podem ser etapas separadas. A liquefação e a sacarificação podem ser realizadas em temperaturas diferentes, mas também podem ser realizadas em uma única temperatura. Em uma modalidade, a temperatura da liquefação é maior do que a temperatura da sacarificação. De modo preferencial a liquefação é realizada em uma temperatura de 60 a 85°C e de modo preferencial a sacarificação é realizada em uma temperatura de 50 a 65°C.
[000115] A hidrólise enzimática pode ser realizada em um ou mais recipientes, mas também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo. Isto também se aplica quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação. A etapa de liquefação pode ser realizada em um ou mais recipientes, mas também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo e/ou a etapa de sacarificação pode ser realizada em um ou mais recipientes, mas também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo. Exemplos de recipientes a serem usados incluem, mas não estão limitados a, recipientes agitados de lote alimentado, recipientes agitados descontínuos, recipientes agitados de fluxo contínuo com ultrafiltração, e reatores contínuos de coluna de fluxo em pistão. Pode ser feita agitação por um ou mais impulsores, bombas e/ou misturadores estáticos.
[000116] As enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas antes e/ou durante a hidrólise enzimática. Conforme indicado acima, quando o material lignocelulósico é submetido a uma separação de sólido/líquido antes da hidrólise enzimática, as enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas antes da separação de só- lido/líquido. Alternativamente, também podem ser adicionadas depois da separação de sólido/líquido ou antes e depois da separação de só- lido/líquido. As enzimas também podem ser adicionadas durante a hidrólise enzimática. No caso da hidrólise enzimática compreender uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação, enzimas adicionais podem ser adicionadas durante e/ou depois da etapa de liquefação. As enzimas adicionais podem ser adicionadas antes e/ou durante uma etapa de sacarificação. Enzimas adicionais também podem ser adicionadas depois da etapa de sacarificação.
[000117] Em uma modalidade, o tempo de hidrólise enzimática total é de 10 horas ou mais, 12 horas ou mais, 14 horas ou mais, 16 horas ou mais, 18 horas ou mais, 20 horas ou mais, 30 horas ou mais, 40 horas ou mais, 50 horas ou mais, 60 horas ou mais, 70 horas ou mais, 80 horas ou mais, 90 horas ou mais, 100 horas ou mais, 110 horas ou mais, 120 horas ou mais, 130 horas ou mais, 140 horas ou mais, 150 horas ou mais, 160 horas ou mais, 170 horas ou mais, 180 horas ou mais, 190 horas ou mais, 200 horas ou mais.
[000118] Em uma modalidade, o tempo de hidrólise enzimática total é de 10 a 300 horas, 16 a 275 horas, de modo preferencial 20 a 250 horas, de modo mais preferencial 30 a 200 horas, de modo o mais preferencial 40 a 150 horas.
[000119] A viscosidade do material lignocelulósico dentro do um ou mais recipientes usados para a hidrólise enzimática é mantida entre 10 e 4000 cP, entre 10 e 2000 cP, de modo preferencial entre 10 e 1000 cP.
[000120] No caso do processo compreender uma hidrólise enzimática compreendendo uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação, a viscosidade do material lignocelulósico na etapa de liquefação é mantida entre 10 e 4000 cP, entre 10 e 2000 cP, de modo preferencial entre 10 e 1000 cP e/ou a viscosidade do material lignocelulósico na etapa de sacarificação é mantida entre 10 e 1000 cP, entre 10 e 900 cP, de modo preferencial entre 10 e 800 cP.
[000121] A viscosidade pode ser determinada com um Reômetro Brookfield DV III em uma temperatura usada para a hidrólise.
[000122] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado durante no mínimo uma parte da hidrólise enzimática. O oxigênio pode ser adicionado de maneira contínua ou de maneira descontínua durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, oxigênio é adicionado uma ou mais vezes durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o oxigênio pode ser adicionado antes da hidrólise enzimática, durante a adição de material lignocelulósico a um recipiente usado para hidrólise en- zimática, durante a adição de enzima a um recipiente usado para hidrólise enzimática, durante uma parte da hidrólise enzimática, durante toda a hidrólise enzimática ou qualquer combinação dos acima. Oxigênio é adicionado ao um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática.
[000123] O oxigênio pode ser adicionado em várias formas. Por exemplo, o oxigênio pode ser adicionado como gás oxigênio, como gás enriquecido com oxigênio, tal como ar enriquecido com oxigênio, ou como ar. O oxigênio também pode ser adicionado por meio de produção de oxigênio in situ. Por exemplo, o oxigênio pode ser gerado por eletrólise, o oxigênio pode ser produzido enzimaticamente, por exemplo, pela adição de peróxido, ou oxigênio pode ser produzido quimicamente, por exemplo, por um sistema de geração de oxigênio tal como KHSO5. Por exemplo, oxigênio é produzido a partir de peróxido por catalase. O pe- róxido pode ser adicionado sob a forma de peróxido dissolvido ou gerado por uma reação enzimática ou química. No caso de catalase ser usada como enzima para produzir oxigênio, pode ser usada a catalase presente na composição de enzimas para a hidrólise ou pode ser adicionada catalase para este fim.
[000124] Exemplos de como adicionar oxigênio incluem, mas não estão limitados a, adição de oxigênio por meios de aspersão, eletrólise, adição química de oxigênio, preenchimento do um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática a partir da parte de cima (mergulhando o hidrolisado dentro do tanque e consequentemente introduzindo oxigênio dentro do hidrolisado) e adição de oxigênio ao espaço vazio superior (headspace) de um ou mais dos recipientes referidos. Quando oxigênio é adicionado ao espaço vazio superior do um ou mais recipientes, pode ser suprido o oxigênio suficiente necessário para a reação de hidrólise. Em geral, a quantidade de oxigênio adicionado ao um ou mais recipientes pode ser controlada e/ou variada. Também é possível a restrição do oxigênio suprido adicionando somente oxigênio durante parte do tempo de hidrólise no um ou mais recipientes referidos. Outra opção é adicionar oxigênio em uma baixa concentração, por exemplo, usando uma mistura de ar e ar reciclado (o ar que sai do recipiente) ou “diluindo” ar com um gás inerte. O aumento da quantidade de oxigênio adicionada pode ser obtido por adição de oxigênio durante períodos mais longos do tempo de hidrólise, adicionando o oxigênio em uma maior concentração ou adicionando mais ar. Outro modo de controlar a concentração de oxigênio é adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. O oxigênio pode ser introduzido, por exemplo, soprado, detro do conteúdo de material lignocelulósico líquido do recipiente da hidrólise. Também pode ser soprado dentro do espaço vazio superior do recipiente.
[000125] Em uma modalidade, oxigênio é adicionado ao um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática antes e/ou durante e/ou depois da adição do material lignocelulósico ao um ou mais recipientes referidos. O oxigênio pode ser introduzido junto com o material lignoce- lulósico que entra dentro do um ou mais recipientes da hidrólise. O oxigênio pode ser introduzido dentro do fluxo de material que vai entrar dentro do um ou mais recipientes ou com parte do conteúdo do um ou mais recipientes que passa um loop externo do um ou mais recipientes.
[000126] Em uma modalidade, o um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática e/ou na fermentação têm um volume de no mínimo 1 m3. De modo preferencial, os recipientes têm um volume de no mínimo 1 m3, no mínimo 2 m3, no mínimo 3 m3, no mínimo 4 m3, no mínimo 5 m3, no mínimo 6 m3, no mínimo 7 m3, no mínimo 8 m3, no mínimo 9 m3, no mínimo 10 m3, no mínimo 15 m3, no mínimo 20 m3, no mínimo 25 m3, no mínimo 30 m3, no mínimo 35 m3, no mínimo 40 m3, no mínimo 45 m3, no mínimo 50 m3, no mínimo 60 m3, no mínimo 70 m3, no mínimo 75 m3,no mínimo 80 m3, no mínimo 90 m3, no mínimo 100 m3, no mínimo 200 m3, no mínimo 300 m3, no mínimo 400 m3, no mínimo 500 m3, no mínimo 600 m3, no mínimo 700 m3, no mínimo 800 m3, no mínimo 900 m3, no mínimo 1000 m3, no mínimo 1500 m3, no mínimo 2000 m3, no mínimo 2500 m3. Em geral, o um ou mais recipientes serão menores do que 3000 m3 ou 5000 m3. No caso de serem usados vários recipientes na hidrólise enzimática, podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente. No caso da hidrólise enzimática compreender uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação separadas, o um ou mais recipientes usados para a etapa de liquefação e o um ou mais recipientes usados para a etapa de sacarificação podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.
[000127] A hidrólise enzimática de modo preferencial é feita em uma temperatura de 40°C ou mais, de modo preferencial de 45°C ou mais. Em uma modalidade, a hidrólise enzimática é feita em uma temperatura de 40 a 90°C, de modo preferencial de 45 a 90°C. Nesta etapa, são preferenciais enzimas celulolíticas termoestáveis.
[000128] Em um processo comum para converter material lignoceluló- sico em produtos de fermentação, de modo preferencial as etapas do processo são feitas sob condições sépticas para reduzir os custos operacionais. Portanto pode ocorrer contaminação e crescimento de microorganismos contaminantes e resultar em efeitos colaterais indesejáveis, tais como produção de ácido láctico, ácido fórmico e ácido acético, perdas de rendimento de produto de fermentação sobre substrato, produção de toxinas e polissacarídeos extracelulares. Estes efeitos podem afetar os custos de produção de modo significativo. Uma alta temperatura do processo e/ou um curto tempo do processo limitam o risco de contaminação durante a hidrólise e a fermentação. Enzimas termoestá- veis, como as de Rasamsonia, são capazes de hidrólise do material lig- nocelulósico em temperaturas de mais de 60°C. Nestas temperaturas, o risco de que um micro-organismo contaminante venha a causar efeitos colaterais indesejados é pequeno a quase zero.
[000129] Durante a etapa de fermentação, na qual, por exemplo, é produzido etanol, as temperaturas são tipicamente entre 30 a 38°C e de modo preferencial não são aumentadas devido a perdas de produção. Ao aplicar curtos tempos de processo de fermentação, os riscos e efeitos de contaminação e/ou crescimento de contaminantes são reduzidos tanto quanto possível. Com enzimas estáveis, como as de Rasamsonia, pode ser aplicado um curto tempo de fermentação e, portanto, os riscos de contaminação e/ou crescimento de contaminantes são reduzidos tanto quanto possível. A redução do custo obtida com a aplicação de enzimas celulolíticas termoestáveis de Rasamsonia deste modo, resulta em um menor risco de falhas do processo devido a contaminação.
[000130] A primeira etapa depois de pré-tratamento térmico é arrefecer o material pré-tratado até temperaturas em que as enzimas tenham uman atividade ótima. Em larga escala, isto é feito tipicamente adicionando água (resfriada), a qual, além de diminuir a temperatura, reduz o teor de matéria seca. Usando enzimas termoestáveis, como as de Ra- samsonia, pode ser obtido redução do custo, porque (i) é necessário menos resfriamento do material pré-tratado visto que são permitidas maiores temperaturas durante a hidrólise, e (ii) menos água é adicionada, o que aumenta o teor de matéria seca durante a hidrólise e a fermentação e, portanto, aumenta a capacidade de produção de etanol (quantidade produzida por unidade de tempo por volume) de uma planta de etanol. Usando enzimas termoestáveis, como as de Rasamsonia, também pode ser obtida redução do custo usando água de refrigeração tendo uma temperatura maior do que a água que é usada em um processo com enzima não termoestável.
[000131] Ao final da hidrólise, as atividades enzimáticas parecem ser baixas, já que poucos açúcares redutores são liberados, uma vez que quase toda a celulose é convertida. No entanto, a quantidade de atividade enzimática presente diminuiu somente um pouco, presumivelmente principalmente devido à absorção das enzimas ao substrato. Ao aplicar separação de sólido-líquido depois da hidrólise, tal como centrifugação, filtração, decantação, sedimentação, 60% ou mais (por exemplo, 70%) da atividade enzimática em solução pode ser recuperado e re-usado para hidrólise de um novo material lignocelulósico pré-tratado durante a hidrólise seguinte.
[000132] Além disso, depois da separação de sólido/líquido a enzima em solução pode ser separada da solução contendo açúcares redutores e de outros produtos de hidrólise das ações enzimáticas. Esta separação pode ser feita por técnicas incluindo, mas não limitadas a, ultra- e microfiltração, centrifugação, decantação, sedimentação, com ou sem primeira adsorção da enzima a um veículo de qualquer tipo. Por exemplo, depois de hidrólise do material pré-tratado com 0,175 ml/g de carga enzimática de matéria seca do material por 20 h, 50% da quantidade máxima teórica de açúcares redutores é liberado e depois da mesma hidrólise por 72 h, 90% da quantidade máxima teórica de açúcares redutores é liberado. Por centrifugação e ultrafiltração, foi recuperado 60 a 70% da atividade enzimática no retentado, enquanto que o filtrado continha mais de 80% dos açúcares redutores liberados. Reusando o retentado, ou no estado em que se encontra ou depois de purificação e/ou concentração adicional, a dosagem de enzimas durante a próxima etapa de hidrólise pode ser reduzida com 60 a 70%. A redução do custo obtida usando enzimas celulolíticas estáveis, tais como as de Rasam- sonia, deste modo é a consequência de uma menor dosagem de enzimas.
[000133] O processo incluindo reciclagem enzimática depois de hidrólise, conforme descrito acima, pode ser combinado com reciclagem do micro-organismo produtor do produto de fermentação depois de fermentação e com o uso dos açúcares redutores contendo filtrado como um substrato (purificado e/ou concentrado ou diluído) na propagação e cultura do micro-organismo produtor do produto de fermentação e o microorganismo produtor das enzimas para hidrólise. Os açúcares redutores contendo filtrado também podem ser usados como um substrato (purificado e/ou concentrado ou diluído) na produção do produto de fermentação pelo micro-organismo produtor do produto de fermentação e a produção das enzimas para hidrólise pelo micro-organismo produtor de enzimas.
[000134] A termoestabilidade de enzimas, como as de Rasamsonia, causa atividade celulolítica remanescente depois de hidrólise, fermentação e destilação a vácuo na vinhaça fina. A atividade total da enzima é reduzida durante as três etapas do processo sucessivas. A vinhaça fina obtida depois de destilação a vácuo pode ser, portanto, reusada como uma fonte de enzima para um ciclo do processo de hidrólise-fermentação-destilação recém iniciado de conversão de material pré-tra- tado em, por exemplo, etanol. A vinhaça fina pode ser usada ou em forma concentrada ou (não)diluída e/ou purificada e com ou sem suple- mentação de enzimas adicionais.
[000135] Em um processo ótimo, uma quantidade de enzima é suplementada na vinhaça fina, antes de seu reuso em um novo ciclo do processo, igual à quantidade de atividade perdida durante as três etapas do processo sucessivas do ciclo do processo anterior. Deste modo é evitada a super dosagem de enzima e, portanto, é obtido uso de enzima mais eficaz. Além disso, ao proporcionar alta dosagem de enzimas no primeiro ciclo do processo, e suplementação de enzima igual à quantidade de atividade perdida durante as três etapas do processo sucessivas nos ciclos seguintes do processo, podem ser obtidas as maiores taxas possíveis de hidrólise em cada ciclo do processo resultando em curtos tempos de hidrólise de menos de 48h em combinação com uso de enzimas mais eficaz.
[000136] Ao aplicar mistura durante a hidrólise, é aumentada a probabilidade de sucesso de uma ligação eficaz de enzima a substrato, a qual resulta em um uso mais eficaz da atividade catalítica. Isto vai resultar em algumas menores dosagens de enzimas e, portanto, em menores custos, a menos que a mistura tenha um efeito negativo sobre as enzimas. Enzimas estáveis, como as enzimas termoestáveis de Rasamso- nia, são robustas e podem resistir a circunstâncias de cisalhamento e temperaturas elevados (localmente), que é o caso durante intensiva mistura de lamas. O uso das mesmas em sistemas mistos é, portanto, benéfico e vai levar a redução da dosagem e, portanto, de custos.
[000137] De modo preferencial, as composições de enzimas usadas na hidrólise enzimática são estáveis. “Composições de enzimas estáveis” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, em relação a processos de hidrólise significa que as composições de enzimas mantêm atividade depois de 30 horas de tempo da reação de hidrólise, de modo preferencial no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sua atividade inicial depois de 30 horas de tempo da reação de hidrólise. De modo preferencial, a composição de enzimas mantém atividade depois de 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo da reação de hidrólise.
[000138] Enzimas estão presentes na etapa de liquefação e na etapa de sacarificação da hidrólise enzimática. Estas enzimas podem ser as mesmas ou podem ser diferentes. Além do mais, conforme descrito acima, enzimas adicionais podem ser adicionadas durante uma etapa de liquefação e a etapa de sacarificação. As enzimas adicionadas podem ser enzimas que já estão presentes na etapa de liquefação e na etapa de sacarificação. Alternativamente, podem ser enzimas diferentes. Além disso, as enzimas adicionais adicionadas durante uma etapa de liquefação podem diferir ou podem ser as mesmas que as enzimas adicionais adicionadas durante uma etapa de sacarificação.
[000139] Material lignocelulósico conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui qualquer material lignocelulósico e/ou hemice- lulósico. Material lignocelulósico adequado para uso nos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não-virgem tal como bio massa agrícola, orgânicos comerciais, detritos de construção e de demolição, resíduos sólidos municipais, papel usado e resíduos de jardim. Formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, palha de trigo, cana de açúcar, palha de cana, bagasço de cana de açúcar, switch grass, miscanto, cana energia, milho, palha de milho, cascas de milho, espigas de milho, caules de canola, caules de soja, sorgo sacarino, grãos secos de destiladores, grãos de milho incluindo fibra de grãos, produtos e sub-produtos de moagem de grãos, tais como milho, trigo e cevada (incluindo moagem a úmido e moagem a seco) frequentemente denominada “farelo ou fibra” bem como resíduos sólidos municipais, papel usado e resíduos de jardim. A biomassa também pode ser, mas não está limitada a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos municipais, papel usado, e resíduos de fábrica de polpa e papel. "Biomassa agrícola" inclui galhos, arbustos, canas, milho e cascas de milho, culturas de energia, florestas, frutos, flores, grãos, gramíneas, culturas herbáceas, folhas, casca, agulhas, toras, raízes, mudas, culturas lenhosas de curta rotação, arbustos, switch grass, árvores, legumes, cascas de frutas, videiras, polpa de beterraba sacarina, midlings de trigo, cascas de aveia, e madeiras de lei e macias (não incluindo madeiras com materiais nocivos). Além disso, biomassa agrícola inclui materiais de resíduos orgânicos geradois por processos agrícolas incluindo atividades agropecuárias e florestais, especificamente incluindo resíduos de madeira florestal. Biomassa agrícola pode ser qualquer uma das supracitadas de maneira singular ou em qualquer combinação ou mistura das mesmas.
[000140] Em uma modalidade, o material lignocelulósico é pré=tratado antes e/ou durante a hidrólise enzimática. Métodos de pré-tratamento são conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, calor, modificação mecânica, modificação química, modificação biológica e qualquer combinação dos acima. Tipicamente o pré-tratamento é realizado de modo a reforçar a acessibilidade do material lignocelulósico à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemice- lulose e/ou celulose e/ou lignina, no material lignocelulósico. Em uma modalidade, o pré-tratamento compreende tratar o material lignoceluló- sico com explosão a vapor, tratamento com água quente ou tratamento com ácido diluído ou base diluída. Exemplos de métodos de pré-tratamento incluem, mas não estão limitados a, tratamento com vapor (por exemplo, tratamento a 100 a 260°C, em uma pressão de 7 a 45 bar, em pH neutro, por 1 a 10 minutos), tratamento com ácido diluído (por exemplo, tratamento com 0,1 a 5% de H2SO4 e/ou SO2 e/ou HNO3 e/ou HCl, em presença ou ausência de vapor, em 120 a 200°C, em uma pressão de 2 a 15 bar, em pH acidífero, por 2 a 30 minutos), tratamento com organosolv (por exemplo, tratamento com 1 a 1,5 % de H2SO4 em presença de solvente orgânico e vapor, em 160 a 200°C, em uma pressão de 7 a 30 bar, em pH acidífero, por 30 a 60 minutos), tratamento com cal (por exemplo, tratamento com 0,1 a 2% de NaOH/Ca(OH)2 na presença de água / vapor a 60 a 160°C, em uma pressão de 1 a 10 bar, em pH alcalino, por 60 a 4800 minutos), tratamento ARP (por exemplo, tratamento com 5 a 15% de NH3, a 150 a 180°C, em uma pressão de 9 a 17 bar, em pH alcalino, por 10 a 90 minutos), tratamento AFEX (por exemplo, tratamento com > 15% de NH3, a 60 a 140°C, em uma pressão de 8 a 20 bar, em pH alcalino, por 5 a 30 minutos).
[000141] O material lignocelulósico pode ser lavado. Em uma modalidade, o material lignocelulósico pode ser lavado depois do pré-tratamento. A etapa de lavagem pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem agir como inibidores para a etapa de fermentação e/ou hidrólise. A etapa de lavagem pode ser conduzida em maneira de conhecimento do perito. Ao lado de lavagem, existem outros métodos de detoxificação. O material lignocelulósico também pode ser detoxificado por qualquer um (ou qualquer combinação) destes métodos os quais incluem, mas não estão limitados a, separação de sólido/lí- quido, evaporação a vácuo, extração, adsorção, neutralização, overliming, adição de agentes redutores, adição de enzimas detoxificantes tais como lacases ou peroxidases, adição de micro-organismos capazes de detoxificação de hidrolisados.
[000142] Em uma modalidade, o material lignocelulósico enzimatica- mente hidrolisado é lavado e/ou detoxificado. Em uma modalidade, a fração sólida e/ou a fração líquida obtidas depois da separação de só- lido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado é lavado e/ou detoxificado. Em uma modalidade, a fração líquida obtida depois da separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzima- ticamente hidrolisado é submetido a uma etapa de detoxificação e/ou uma etapa de concentração. A etapa de detoxificação pode ser feita por qualquer um dos métodos conforme descrito acima. A etapa de concentração pode ser feita por métodos de conhecimento geral de um perito na arte incluindo, mas não limitados a, centrifugação.
[000143] A composição de enzimas pode hidrolisdar de maneira extremamente eficaz o material lignocelulósico, por exemplo, palha de milho, palha de trigo, palha de cana, e/ou bagasço de cana de açúcar, o qual pode ser então adicionalmente convertido em um produto, tal como etanol, biogás, butanol, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de ração animal, um fármaco, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma matéria prima química. Adicionalmente, produtos intermediários de um processo depois da hidrólise, por exemplo, ácido láctico como intermediário na produção de biogás, podem ser usados como blocos de construção para outros materiais.
[000144] Em uma modalidade, a quantidade de composição de enzimas adicionada (aqui, neste requerimento de patente, também denominada dosagem de enzimas ou carga de enzimas) na hidrólise é baixa. Em uma modalidade, a quantidade de composição de enzimas é 10 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou inferior, 9 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou inferior, 8 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou inferior, 7 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou inferior, 6 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou inferior, 5 mg de proteína / g de matéria seca ou inferior, 4 mg de proteína / g de matéria seca ou inferior, 3 mg de proteína / g de matéria seca ou inferior, 2 mg de proteína / g de matéria seca ou inferior, ou 1 mg de proteína / g de matéria seca ou inferior (expressa como proteína em mg de proteína / g de matéria seca). Em uma modalidade, a quantidade de composição de enzimas é 5 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 4 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 3 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 2 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 1 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 0,5 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 0,4 mg composição de enzimas / g de peso de matéria seca ou inferior, 0.3 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 0,25 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 0,20 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 0,18 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior, 0,15 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior ou 0,10 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou inferior (expressa como total de enzimas celulase em mg de enzima / g de matéria seca).
[000145] Em uma modalidade, a composição de enzimas é usada na hidrólise enzimática em uma quantidade de 4,5 mg a 15 mg de proteína / grama de peso de matéria seca de glucanos no material lignoceluló- sico. Em uma modalidade, a composição de enzimas é usada na hidrólise enzimática em uma quantidade de 5 mg a 12 mg de proteína / grama de peso de matéria seca de glucanos no material lignocelulósico. Em uma modalidade, a composição de enzimas é usada na hidrólise enzi- mática em uma quantidade de 6 mg a 10 mg de proteína / grama de peso de matéria seca de glucanos no material lignocelulósico.
[000146] O pH durante a hidrólise enzimática pode ser escolhido pelo especialista. Em uma modalidade, o pH durante a hidrólise pode ser 3,0 a 6,5. As enzimas usadas podem ter uma ampla faixa de pH de até 2 unidades de pH, até 3 unidades de pH, até 5 unidades de pH. O pH ótimo pode se situar dentro dos limites de pH 2,0 a 8,0, 2,5 a 7,5, 3,0 a 7,0, 3,5 a 6,5, 4,0 a 5,0, 4,0 a 4,5 ou é de cerca de 4,2. O pH usado na etapa de liquefação da hidrólise enzimática e na etapa de sacarificação da hidrólise enzimática pode diferir ou pode ser o mesmo. No caso de serem usadas diferentes enzimas durante uma etapa de liquefação e a etapa de sacarificação, o pH ótimo das enzimas referidas pode diferir ou pode ser o mesmo.
[000147] Em uma modalidade, a etapa de hidrólise é conduzida até 70% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 95% ou mais do açúcar disponível no material lignocelulósico ser liberado.
[000148] De modo significativo, pode ser realizado um processo de hidrólise conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, usando altos níveis de matéria seca (do material lignocelulósico) na reação de hidrólise. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da hidrólise enzimática é de 5% em peso ou superior, 6% em peso ou superior, 7% em peso ou superior, 8% em peso ou superior, 9% em peso ou superior, 10% em peso ou superior, 11% em peso ou superior, 12% em peso ou superior, 13% em peso ou superior, 14% em peso ou superior,15% em peso ou superior, 16% em peso ou superior, 17% em peso ou superior, 18% em peso ou superior, 19% em peso ou superior, 20% em peso ou superior, 21% em peso ou superior, 22% em peso ou superior, 23% em peso ou superior, 24% em peso ou superior, 25% em peso ou superior, 26% em peso ou superior, 27% em peso ou superior, 28% em peso ou superior, 29% em peso ou superior, 30% em peso ou superior, 31% em peso ou superior, 32% em peso ou superior, 33% em peso ou superior, 34% em peso ou superior, 35 % em peso ou superior, 36% em peso ou superior, 37% em peso ou superior, 38% em peso ou superior ou 39% em peso ou superior. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da hidrólise enzimática é entre 5% em peso a 40% em peso, 6% em peso a 40% em peso, 7% em peso a 40% em peso, 8 % em peso a 40% em peso, 9% em peso a 40% em peso, 10% em peso a 40% em peso, 11% em peso a 40% em peso, 12% em peso a 40% em peso, 13% em peso a 40% em peso, 14% em peso a 40% em peso, 15% em peso a 40% em peso, 16% em peso a 40% em peso, 17% em peso a 40% em peso, 18% em peso a 40% em peso, 19% em peso a 40% em peso, 20% em peso a 40% em peso, 21% em peso a 40% em peso, 22% em peso a 40% em peso, 23% em peso a 40% em peso, 24% em peso a 40% em peso, 25% em peso a 40% em peso, 26% em peso a 40% em peso, 27% em peso a 40% em peso, 28% em peso a 40% em peso, 29% em peso a 40% em peso, 30% em peso a 40% em peso, 31% em peso a 40% em peso, 32% em peso a 40% em peso, 33% em peso a 40% em peso, 34% em peso a 40% em peso, 35% em peso a 40% em peso, 36% em peso a 40% em peso, 37% em peso a 40% em peso, 38% em peso a 40% em peso, 39% em peso a 40% em peso.
[000149] Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de liquefação da hidrólise enzimática é de 5% em peso ou superior, 6% em peso ou superior, 7% em peso ou superior, 8% em peso ou superior, 9% em peso ou superior, 10% em peso ou superior, 11% em peso ou superior, 12% em peso ou superior, 13% em peso ou superior, 14% em peso ou superior, 15% em peso ou superior, 16% em peso ou superior, 17% em peso ou superior, 18% em peso ou superior, 19% em peso ou superior, 20% em peso ou superior, 21% em peso ou superior, 22 % em peso ou superior, 23% em peso ou superior, 24% em peso ou superior, 25% em peso ou superior, 26% em peso ou superior, 27% em peso ou superior, 28% em peso ou superior, 29 % em peso ou superior, 30% em peso ou superior, 31 % em peso ou superior, 32 % em peso ou superior, 33% em peso ou superior, 34% em peso ou superior, 35% em peso ou superior, 36% em peso ou superior, 37% em peso ou superior, 38% em peso ou superior ou 39% em peso ou superior. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de liquefação da hidrólise enzi- mática é entre 5% em peso a 40% em peso, 6% em peso a 40% em peso, 7% em peso a 40% em peso, 8% em peso a 40% em peso, 9% em peso a 40% em peso, 10% em peso a 40% em peso, 11% em peso a 40% em peso, 12% em peso a 40% em peso, 13% em peso a 40% em peso, 14% em peso a 40% em peso, 15 % em peso a 40% em peso, 16% em peso a 40% em peso, 17% em peso a 40% em peso, 18% em peso a 40% em peso, 19% em peso a 40% em peso, 20% em peso a 40% em peso, 21% em peso a 40% em peso, 22% em peso a 40% em peso, 23 % em peso a 40% em peso, 24 % em peso a 40% em peso, 25% em peso a 40% em peso, 26% em peso a 40% em peso, 27% em peso a 40% em peso, 28% em peso a 40% em peso, 29% em peso a 40% em peso, 30% em peso a 40% em peso, 31% em peso a 40% em peso, 32% em peso a 40% em peso, 33% em peso a 40% em peso, 34% em peso a 40% em peso, 35% em peso a 40% em peso, 36% em peso a 40% em peso, 37% em peso a 40% em peso, 38% em peso a 40% em peso, 39% em peso a 40% em peso.
[000150] Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de sacarificação da hidrólise enzimática é de 5% em peso ou superior, 6% em peso ou superior, 7% em peso ou superior, 8% em peso ou superior, 9% em peso ou superior, 10% em peso ou superior, 11% em peso ou superior, 12% em peso ou superior, 13% em peso ou superior, 14% em peso ou superior, 15% em peso ou superior, 16% em peso ou superior, 17% em peso ou superior, 18% em peso ou superior, 19% em peso ou superior, 20% em peso ou superior, 21% em peso ou superior, 22% em peso ou superior, 23% em peso ou superior, 24% em peso ou superior, 25% em peso ou superior, 26% em peso ou superior, 27% em peso ou superior, 28% em peso ou superior, 29 % em peso ou superior, 30% em peso ou superior, 31% em peso ou superior, 32% em peso ou superior, 33% em peso ou superior, 34% em peso ou superior, 35% em peso ou superior, 36% em peso ou superior, 37% em peso ou superior, 38 % em peso ou superior ou 39% em peso ou superior. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de sacarificação da hidrólise enzimática é entre 5 % em peso a 40% em peso, 6% em peso a 40% em peso, 7% em peso a 40% em peso, 8% em peso a 40% em peso, 9% em peso a 40% em peso, 10% em peso a 40% em peso, 11% em peso a 40% em peso, 12% em peso a 40% em peso, 13% em peso a 40% em peso, 14% em peso a 40% em peso, 15% em peso a 40% em peso, 16% em peso a 40% em peso, 17% em peso a 40% em peso, 18% em peso a 40% em peso, 19 % em peso a 40% em peso, 20% em peso a 40% em peso, 21% em peso a 40% em peso, 22% em peso a 40% em peso, 23% em peso a 40% em peso, 24% em peso a 40% em peso, 25% em peso a 40% em peso, 26% em peso a 40% em peso, 27 % em peso a 40% em peso, 28% em peso a 40% em peso, 29% em peso a 40% em peso, 30% em peso a 40% em peso, 31% em peso a 40% em peso, 32% em peso a 40% em peso, 33% em peso a 40% em peso, 34% em peso a 40% em peso, 35% em peso a 40% em peso, 36% em peso a 40% em peso, 37 % em peso a 40% em peso, 38% em peso a 40% em peso, 39% em peso a 40% em peso.
[000151] Conforme descrito acima, a presente invenção também se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material lignocelulósico, cujo processo compreende as etapas de (a) hidrólise do material lignocelulósico com uma composição de enzimas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, de modo a obter um açúcar, (b) fermentação do açúcar obtido por contato do açúcar obtido com um micro-organismo de fermentação, de modo a produzir o produto de fermentação, e (c) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação.
[000152] Em uma modalidade, a fermentação (isto é, etapa b) é realizada em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, a fermentação é feita por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool. Em uma modalidade, a fermentação é feita por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico. A fermentação por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool pode ser feita no(s) mesmo(s) recipiente(s) em que a hidrólise enzimática é realizada. Alternativamente, a fermentação por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool e a fermentação por um microorganismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico podem ser realizadas em um ou mais recipientes separados, mas também podem ser feitas em um ou mais dos mesmos recipientes.
[000153] Em uma modalidade, a fermentação é feita por uma levedura. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool e/ou o micro-organismo produtor de ácido orgânico é uma levedura. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C5 e no mínimo um açúcar C6. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C6. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool e o micro-organismo produtor de ácido orgânico são micro-organismos diferentes. Em outra modalidade, o micro-organismo produtor de álcool e o micro-organismo produtor de ácido orgânico são o mesmo micro-organismo, isto é, o micro-organismo produtor de álcool também é capaz de produzir ácido orgânico tal como ácido succínico.
[000154] Em um aspecto adicional, a presente invenção, portanto, inclui processos de fermentação nos quais um micro-organismo é usado para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo açú- car(es), por exemplo, glicose, L-arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer oligo- ou polímero de carboidrato compreendendo unidades de L-arabinose, xilose ou glicose, tais como, por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinano e similares. Para a liberação de unidades de xilose ou glicose a partir de similares carboidratos, carboidrases apropriadas (tais como xilanases, glucanases, ami- lases e similares) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser manipulada geneticamente para produzir e excretar as erferidas carboidrases. Uma vantagem adicional de usar fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que isto permite manter uma concentração baixa ou menor de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, usando quantidades limitantes de taxa das carboidrases. Isto, por sua vez, vai evitar a repressão de sistemas requeridos para o metabolismo e o transporte de açúcares não- glicose, tais como xilose. Em um processo preferencial a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) quanto a glicose, de modo preferencial de maneira simultânea, em cujo caso, de modo preferencial, é usada uma célula hospedeira modificada, a qual é insensível a repressão de glicose para evitar o crescimento di- áuxico. Além de uma fonte de L-arabinose, opcionalmente xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação vai compreender adicionalmente o ingrediente apropriado requerido para o crescimento da célula hospedeira modificada. Composições de meios de fermentação para crescimento de micro-organismos tais como leveduras ou fungos filamentosos são bem conhecidos na técnica.
[000155] O tempo de fermentação pode ser mais curto do que em fermentação convencional nas mesmas condições, em que parte da hidrólise enzimática ainda tem que tomar parte durante a fermentação. Em uma modalidade, o tempo de fermentação é 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 70 horas ou menos, ou 60 horas ou menos, para uma composição de açúcar de 50 g/l de glicose e outros açúcares correspondentes do material lignocelulósico (por exemplo, 50 g/l de xilose, 35 g/l de L-arabinose e 10 g/l de galactose). Para composições de açúcar mais ciluídas, o tempo de fermentação pode ser reduzido correspondentemente. Em uma modalidade, o tempo de fermentação da etapa de produção de etanol é entre 10 e 50 horas para etanol composto de açúcares C6 e entre 20 e 100 horas para etanol composto de açúcares C5. Em uma modalidade, o tempo de fermentação da etapa de produção de ácido succínico é entre 20 e 70 horas.
[000156] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou um processo de fermentação anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é definido aqui, neste requerimento de patente, como um processo de fermentação realizado na ausência de oxigênio ou no qual é consumido substancialmente nenhum oxigênio, de modo preferencial menos de 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, de modo mais preferencial é consumido 0 mmol/L/h (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétrons quanto aceitadoras de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido na glicólise e formação de biomassa, não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. De modo a resolver este problema, muitos micro-organismos usam piruvato ou um de seus derivados como um elétron e aceitador de hidrogênio, deste modo regenerando NAD+. Portanto, em um processo de fermentação anaeróbico pre-ferencial, piruvato é usado como um elétron (e aceitador de hidrogênio) e é reduzido para produtos de fermentação tais como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido suc- cínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3- propano-diol, etileno, glicerol, butanol, alguns antibióticos de β-lactama e uma cefalosporina. Em uma modalidade, preferencial, o processo de fermentação é anaeróbico. É vantajoso um processo anaeróbico, uma vez que é mais barato do que os processos aeróbicos: é necessário menos equipamento especial. Além do mais, espera-se que os processos anaeróbicos proporcionem um maior rendimento de produto do que os processos aeróbicos. Sob condições aeróbicas, geralmente o rendimento de biomassa é maior do que sob condições anaeróbicas. Em consequência, geralmente, sob condições aeróbicas, o rendimento de produto esperado é menor do que sob condições anaeróbicas.
[000157] Em outra modalidade, o processo de fermentação é sob condições com limitação de oxigênio. De modo mais preferencial, o processo de fermentação é aeróbico e sob condições com limitação de oxigênio. Um processo de fermentação com limitação de oxigênio é um processo o qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de entrada de gás bem como das propriedades de transferência de mistura real / massa do equipamento de fermentação usado. De modo preferencial, em um processo sob condições com limitação de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de no mínimo 5,5, de modo mais preferencial no mínimo 6 e de modo ainda mais preferencial no mínimo 7 mmol/L/h.
[000158] Em uma modalidade, o processo de fermentação de álcool é anaeróbico, ao passo que o processo de fermentação de ácido orgânico é aeróbico, mas feito sob condições com limitação de oxigênio.
[000159] O processo de fermentação de modo preferencial é realizado em uma temperatura que é ótima para o micro-organismo usado. Portanto, para a maioria das leveduras ou células fúngicas, o processo de fermentação é realizado em uma temperatura a qual é de menos de 42°C, de modo preferencial 38°C ou inferior. Para levedura ou células hospedeiras fúngicas filamentosas, o processo de fermentação de modo preferencial é realizado em uma temperatura a qual é menor do que 35, 33, 30 ou 28°C e em uma temperatura a qual é maior do que 20, 22, ou 25°C. Em uma modalidade, a etapa de fermentação de álcool e a etapa de fermentação de ácido orgânico são realizadas entre 25°C e 35°C.
[000160] Em uma modalidade, as fermentações são conduzidas com um micro-organismo fermentador. Em uma modalidade, as fermentações alcoólicas (por exemplo, etanol) de açúcares C5 são conduzidas com um micro-organismo fermentador C5. Em uma modalidade, as fermentações alcoólicas (por exemplo, etanol) de açúcares C6 são conduzidas com um micro-organismo fermentador C5 ou um micro-organismo fermentador C6 comercial. Leveduras disponíveis comercialmente adequadas para produção de etanol incluem, mas não estão limitadas a, BIOFERM™ AFT e XR (NABC—North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), ETHANOL RED™ levedura (Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI™ (Fleischmann’s Yeast, EUA), FERMIOL™ (DSM Food Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e SUPERSTART™ e THERMOSACC™ levedura fresca (Ethanol Technology, WI, EUA).
[000161] Em uma modalidade, a propagação do micro-organismo produtor de álcool e/ou do micro-organismo produtor de ácido orgânico é realizada em um ou mais recipientes de propagação. Depois de propagação, o micro-organismo produtor de álcool e/ou o micro-organismo produtor de ácido orgânico pode ser adicionado a um ou mais recipientes de fermentação. Alternativamente, a propagação do micro-organismo produtor de álcool e/ou do micro-organismo produtor de ácido orgânico é combinada com a fermentação pelo micro-organismo produtor de álcool e/ou pelo micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir álcool e/ou ácido orgânico, respectivamente.
[000162] Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool é um micro-organismo que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C5. De modo preferencial, também é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C6. Em uma modalidade, a presente invenção também descreve um processo para a preparação de etanol a partir de material lignocelu- lósico, compreendendo as etapas de (a) realização de um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignoce- lulósico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, (b) fermentação do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para produzir etanol; e (c) opcionalmente, recuperação do etanol. A fermentação pode ser feita com um micro-organismo que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C5.
[000163] Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico é um micro-organismo que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C6. Em uma modalidade, a presente invenção descreve um processo para a preparação de ácido succínico a partir de material lig- nocelulósico, compreendendo as etapas de (a) realização de um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, (b) fermentação do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para produzir ácido succínico; e (c) opcionalmente, recuperação do ácido succínico. A fermentação pode ser feita com um micro-organismo que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C6.
[000164] Os micro-organismos produtores de álcool podem ser um organismo procariótico ou eucariótico. O micro-organismo usado no processo pode ser um micro-organismo manipulado geneticamente. Exemplos de organismos produtores de álcool adequados são leveduras, por exemplo, Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus ou Saccharomyces uvarum, Hansenula, Is- satchenkia, por exemplo, Issatchenkia orientalis, Pichia, por exemplo, Pichia stipites ou Pichia pastoris, Kluyveromyces, por exemplo, Kluyve- romyces fagilis, Candida, por exemplo, Candida pseudotropicalis ou Candida acidothermophilum, Pachysolen, por exemplo, Pachysolen tan- nophilus ou bactérias, por exemplo, Lactobacillus, por exemplo, Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, por exemplo, Zymomonas mo- bilis, Clostridium, por exemplo, Clostridium phytofermentans, Escherichia, por exemplo, E. coli, Klebsiella, por exemplo, Klebsiella oxytoca. Em uma modalidade, o micro-organismo que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C5 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de modo preferencial da espécie Saccharomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é capaz de converter açúcares hexoses (C6) e açúcares pentoses (C5). A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevi- siae, usada nos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, pode fermentar anaerobicamente no mínimo um açúcar C6 e no mínimo um açúcar C5. Por exemplo, a levedura é capaz de usar L- arabinose e xilose além de glicose anaerobicamente. Em uma modalidade, a levedura é capaz de converter L-arabinose em 5-fosfato de xi- lulose e/ou L-ribulose e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, em etanol. Organismos, por exemplo, cepas de Saccha- romyces cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidos por modificação de uma levedura hospedeira introduzindo os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloglioxa- lato) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Os genes referidos podem ser introduzidos em uma célula hospedeira de modo que seja capaz de usar arabinose. Uma abordagem similar é descrita em WO 2003/095627. Genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são revelados em WO 2008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são revelados em EP1499708. Em outra modalidade, os genes araA, araB e araD podem ser derivados a partir de no mínimo um dos gêneros Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens, e/ou Gramella forsetii, conforme revelado em WO 2009011591. Em uma modalidade, a levedura também pode compreender uma ou mais cópias do gene da xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias de xilose redu- tase e/ou xilitol desidrogenase.
[000165] A levedura pode compreender uma ou mais modificações genéticas para permitir à levedura fermentar xilose. Exemplos de modificações genéticas são a introdução de um ou mais entre xylA-gene, XYL1 gene e XYL2 gene e/ou XKS1-gene; deleção do gene da aldose redutase (GRE3); superexpressão de PPP-genes TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da via de fosfato de pentose na célula. Exemplos de levedura geneticamente manipulada são descritos em EP1468093 e/ou WO2006/009434.
[000166] Um exemplo de uma levedura comercial adequada é RN1016 que é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae de fermentação de xilose e glicose de DSM, Países Baixos.
[000167] Em uma modalidade, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbico. Anaeróbico já foi definido anteriormente aqui, neste requerimento de patente. Em outra modalidade, preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbico. Em outra modalidade, preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol é sob condições com limitação de oxigênio, de modo mais preferencial aeróbico e sob condições com limitação de oxigênio. Condições com limitação de oxigênio já foram definidas anteriormente aqui, neste requerimento de patente.
[000168] Alternativamente aos processos de fermentação descritos acima, podem ser usadas no mínimo duas células distintas, isto significa que este processo é um processo de co-fermentação. Todas as modalidades preferenciais dos processos de fermentação conforme descrito acima também são modalidades preferenciais deste processo de co-fer- mentação: identidade do produto de fermentação, identidade da fonte de L-arabinose e da fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições com limitação de oxigênio, temperatura na qual o processo está sendo realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol).
[000169] Os micro-organismos produtores de ácido orgânico podem ser um organismo procariótico ou eucariótico. O micro-organismo usado no processo pode ser um micro-organismo manipulado geneticamente. Exemplos de organismos produtores de ácido orgânico adequados são leveduras, por exemplo, Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae; fungos, por exemplo, cepas de Aspergillus, tais como Aspergillus niger e Aspergillus fumigatus, Byssochlamys nivea, Lentinus de- gener, Paecilomyces varioti e Penicillium viniferum; e bactérias, por exemplo, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succi- nogenes, Mannhei succiniciproducers MBEL 55E, Escherichia coli, Pro- pionibacterium species, Pectinatus sp., Bacteroides sp., tais como Bac- teroides amylophilus, Ruminococcus flavefaciens, Prevotella ruminicola, Succcinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinisolvens, Wolinella suc- cinogenes, e Cytophaga succinicans. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C6 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de modo preferencial da espécie Saccharomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de produção de ácido orgânico conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, é capaz de converter açúcares hexoses (C6). A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, pode fermentar anaerobicamente no mínimo um açúcar C6.
[000170] O tempo de reação total (ou o tempo de reação da etapa de hidrólise e da etapa de fermentação juntas) pode ser reduzido. Em uma modalidade, o tempo de reação total é 300 horas ou menos, 200 horas ou menos, 150 horas ou menos, 140 horas ou menos, 130 ou menos, 120 horas ou menos, 110 horas ou menos, 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 75 horas ou menos, ou cerca de 72 horas a 90% de produção de glicose. Correspondentemente, podem ser atingidos menores tempos de reação total em menor produção de glicose.
[000171] Produtos de fermentação que podem ser produzidos pelos processos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, podem ser qualquer substãncia derivada de fermentação. Incluem, mas não estão limitados a, álcool (tal como arabinitol, butanol, etanol, glice- rol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol, e xilitol); ácido orgânico (tal como ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido acrílico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glu- tárico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido maléico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico, e ácido xilônico); cetonas (tais como acetona); aminoácidos (tais como ácido aspártico, ácido glutâmico, gli- cina, lisina, serina, triptofano, e treonina); alcanos (tais como pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano), ci- cloalcanos (tais como ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, e cicloo- ctano), alquenos (tais como penteno, hexeno, hepteno, e octeno); e gases (tais como metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser uma proteína, uma vitamina, um fármaco, um suplemento de ração animal, uma especialidade química, uma matéria prima química, um plástico, um solvente, etileno, uma enzima, tal como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidorredutase, uma transferase ou uma xilanase. Em uma modalidade preferencial, um ácido orgânico e/ou um álcool é preparado nos processos de fermentação conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalidade preferencial, ácido succínico e/ou etanol é preparado nos processos de fermentação conforme descrito aqui, neste requerimento de patente.
[000172] Os efeitos benéficos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, são vistos para vários materiais lignocelulósicos e, portanto, acredita-se que estejam presentes para a hidrólise de todo tipo de materiais lignocelulósicos. Os efeitos benéficos são vistos para várias enzimas e, portanto, acredita-se que estejam presentes para todo tipo de composições de enzimas hidrolisantes.
EXEMPLOS Exemplo 1 Preparação de misturas de enzimas com diferentes REG e RLPMO
[000173] Uma única endoglucanase (EG) (vide WO 01/70998) e uma única mono-oxigenase de polissacarídeos lítica (LPMO) (vide WO 2012/000892) foram produzidas usando A. niger como hospedeiro de expressão de acordo com o método conforme descrito em WO 2014/202622. Adicionalmente, uma composição de celulase foi produzida de acordo com o método conforme descrito no Exemplo 3 de WO 2011/000949.
[000174] A concentração de proteínas da endoglucanase, mono-oxi- genase de polissacarídeos lítica e da composição de celulase foi determinada usando o seguinte ensaio de TCA-precipitação de acetona-biu- rético. Amostras de proteínas foram diluídas com água até uma concentração entre 2 e 8 mg/ml. Diluições (0, 1, 2, 5, 8 e 10 mg/ml) de albumina sérica bovina (BSA) foram feitas e incluídas como amostras de modo a gerar uma curva de calibração. De cada amostra de proteína diluída, 270 μl foi transferido para dentro de um tubo de 10 ml contendo 830 μl de uma solução a 12% (em peso / volume) de ácido tricloro acético em acetona e misturado completamente. Em seguida, os tubos foram incubados sobre água gelada por uma hora e centrifugados por 30 minutos a 4°C e 4000xg. O sobrenadante foi descartado e os péletes foram secos invertendo os tubos sobre um tecido e os deixando descansar por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, 3 ml de mistura de reagente BioQuant Biuret foi adicionado ao pélete no tubo e o pélete foi solubilizado depois de mistura seguinda por adição de 1 ml de água. O tubo foi misturado completamente e incubado em temperatura ambiente por 30 minutos. A absorção da mistura foi medida a 546 nm com uma amostra de água usada como uma medição em branco e a concentração de proteína foi calculada através da linha de calibração BSA.
[000175] Em seguida, foram preparadas diferentes misturas de enzimas. As misturas de enzimas que foram preparadas e sua composição estão listadas na Tabela 1. As percentagens indicam a quantidade relativa de cada componente (composição de celulase, endoglucanase e/ou mono-oxigenase de polissacarídeos lítica) da proteína total dosada em um teste de hidrólise (vide o Exemplo 2). Por exemplo, no caso de uma dosagem de enzima total de 2,5 mg de proteína por grama de matéria seca em um teste de hidrólise, a composição de celulase foi dosada a 100% para a mistura 0, e, portanto, a 2,5 mg/ g de matéria seca. Na mistura 1, 95% da proteína total foi dosado como composição de celu- lase (isto é, 2,375 mg/ g de matéria seca) e 5% da proteína total foi dosado como endoglucanase (isto é, 0,125 mg/ g de matéria seca) e assim por diante.
[000176] Na Tabela 2, é dada a quantidade total de endoglucanase, mono-oxigenase de polissacarídeos lítica, beta-xIlosidase e endoxIla- nase na mistura final. A quantidade total é um valor calculado usando as concentrações de proteína da única endoglucanase e mono-oxige- nase de polissacarídeos lítica (produzida em A. niger) e o teor de endo- glucanase, mono-oxigenase de polissacarídeos lítica, beta-xIlosidase e endoxIlanase na composição de celulase conforme determinado usando proteômica conforme descrito no Exemplo 14 de WO 2011/000949.
Exemplo 2 Performance de hidrólise de misturas de enzimas com diferentes REG e RLPMO
[000177] A atividade de hidrólise das misturas de enzimas foi determinada em um teste de hidrólise. A quantidade total de proteína dosada em cada experimento de hidrólise foi mantida constante a 2,5 mg/ g de matéria seca.
[000178] Para a preparação de palha de milho pré-tratada com ácido baixo, foi usado um reator de pré-tratamento em escala piloto operando em condições de estado estacionário de 186°C, duração da permanência de 6,7 minutos. Antes do tratamento de calor, a palha de milho foi impregnada com H2SO4 por 10 minutos para ajustar o pH a 2,5 (determinado em temperatura ambiente depois do pré-tratamento).
[000179] No teste de hidrólise, as misturas foram adicionadas à palha de milho pré-tratada com ácido baixo, incubadas por 72 horas em pH 4,5 em uma temperatura de 62°C e a atividade de hidrólise das misturas foi comparada através de sua capacidade para liberar glicose e xilose a partir da matéria prima de palha de milho. No teste, a concentração do material lignocelulósico foi ajustada para 15% (em peso/ peso) matéria seca e a concentração de celulase total foi de 2,5 mg de proteína por grama de matéria seca. A suspensão a 15% de matéria seca foi preparada por meio de diluição de uma suspensão mais concentrada com água e ajuste subsequente do pH da lama obtida para pH 4,5 com uma solução a 4 M de NaOH. As reações de hidrólise foram realizadas em um volume total de 20 g em frascos de centrífuga de 40 ml (Nalgene Oakridge). Foi feita incubação em uma incubadora de forno a 62°C (forno de hibridização Techne HB-1D), enquanto girando no ponto de ajuste 3. Depois de incubação por 72 horas em pH 4,5 e uma temperatura de 62°C, amostras de hidrolisado foram centrifugadas e o teor de glicose e xilose do sobrenadante foi analisado usando um sistema de cromatografia líquida de alta performance (High-Performance Liquid Chromatography System, Agilent 1100) equipado com um detector de índice de reflexão (Agilent 1260 Infinity). A separação dos açúcares foi feita usando uma coluna de 300 X 7,8 mm Aminex HPX-87P (Bio rad cat no 125-0098); Pré-coluna: Micro guard Carbo-P (Bio Rad cat no 125-0119); a fase móvel foi água grau de HPLC; taxa de fluxo de 0,6 ml/min e uma temperatura da coluna de 85°C. O volume de injeção foi de 10 μl. As amostras foram diluídas com água grau de HPLC até um máximo de 2,5 g/l de glicose e filtradas usando um filtro de 0,2 μm (Afridisc LC filtro de seringa de 25 mm, membrana de PVDF). A glicose e a xilose foram identificadas e quantificadas de acordo com o tempo de retenção, o qual foi comparado com o padrão externo de glicose (D-(+)-Glicose, Sigma cat no: G7528) variando a partir de 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 g/l e o padrão de xilose (xilose, Sigma) variando a partir de 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 g/l)
[000180] Subsequentemente, a concentração de glicose e xilose liberada a partir do material lignocelulósico pelas diferentes misturas de enzimas foi usada para comparar a performance de hidrólise das misturas. A glicose e a xilose liberadas pela composição de celulase foi usada como uma referência e a performance de todas as outras misturas foi calculada em relação à composição de celulase usando a seguinte fórmula:
[000181] Performance da mistura = (Total de glicose (g/l) + xilose (g/l) liberado pela mistura) / (Total de glicose (g/l) + xilose (g/l) liberado pela composição de celulase) * 100%
[000182] Para a composição de celulase (mistura 0) bem como as misturas de enzimas com adição única de endoglucanase e/ou adição única de mono-oxigenase de polissacarídeos lítica, foram calculadas três proporções.
[000183] A proporção de endoglucanase (REG), a qual é definida como o peso total de endoglucanases na mistura dividido pelo peso total de endoglucanases e o peso total de mono-oxigenases de polissacarídeos líticas na mistura, pode ser calculada pela fórmula: REG = total de EG/ (total de EG + total de LPMO).
[000184] A proporção de mono-oxigenases de polissacarídeos líticas (RLPMO), a qual é definida como o peso total de mono-oxigenases de polissacarídeos líticas na mistura dividido pelo peso total de mono-oxi- genases de polissacarídeos líticas e o peso total de endoglucanases na mistura pode ser calculada pela fórmula: RLPMO = total de LPMO/(total de EG + total de LPMO).
[000185] A proporção de hemicelulase (RHC), a qual é definida como o peso total de beta-xIlosidases e endoxIlanases na composição de enzimas dividido pelo peso total de beta-xIlosidases, endoxIlanases e mono- oxigenases de polissacarídeos líticas na composição de enzimas, pode ser calculada pela fórmula: RHC = (total de BX + total de EX) / (total de BX + total de EX + total de LPMO).
[000186] A performance de hidrólise das várias misturas de enzimas é mostrada na Tabela 3. Os dados mostram claramente que misturas tendo um REG e um RLPMO similares como as misturas de enzimas descritas em WO 2011/000949 (as misturas em WO 2011/000949 têm um REG de 0,35 a 0,62 e um RLPMO de 0,38 a 0,65) têm uma performance de hidrólise menor do que as misturas de enzimas da presente invenção que têm um REG de 0,05 a 0,34 e um RLPMO de 0,66 a 0,95.
[000187] As misturas de enzimas testadas que têm um REG fora da faixa de 0,05 a 0,34, um RLPMO fora da faixa de 0,66 a 0,95 e um RHC fora da faixa de 0,15 a 0,65, isto é, as misturas de enzimas 0, 1, 2 e 7, têm uma performance de hidrólise de 100% ou menor, ao passo que as misturas de enzimas que têm um REG de 0,05 a 0,34, um RLPMO de 0,66 a 0,95 e um RHC de 0,15 a 0,65, isto é, as misturas de enzimas 3, 4, 5 e 6, têm uma performance de hidrólise que é maior do que 100%. Portanto, as misturas referidas têm uma performance aprimorada.Tabela 1: Misturas de celulase.*As percentagens indicadas são percentagens em peso da composição de celulase, a EG e/ou a LPMO versus a proteína total na mistura final. Tabela 2: Misturas de celulase.Tabela 3. Performance de hidrólise de misturas de enzimas e valores para REG, RLPMO e RHC.

Claims (15)

1. Composição de enzimas, caracterizada pelo fato de que compreende uma endoglucanase, uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica e uma hemicelulase, em que a hemicelulase compreende uma beta-xilosidase (BX) e/ou uma endoxilanase (EX), e em que: a endoglucanase (EG) está presente de acordo com a seguinte fórmula com uma razão (REG) de 0,08 a 0,28:a mono-oxigenase de polissacarídeos lítica (LPMO) está presente de acordo com a seguinte fórmula com uma razão (RLPMO) de 0,72 a 0,92: a hemicelulase (HC) está presente de acordo com a seguinte fórmula com uma razão (RHC) de 0,22 a 0,55:
2. Composição de enzimas de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a endoglucanase compreende uma endoglucanase GH5 e/ou uma endoglucanase GH7.
3. Composição de enzimas de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a mono-oxigenase de polissacarídeos lítica compreende uma mono-oxigenase de polissacarídeos lítica AA9.
4. Composição de enzimas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a beta- xilosidase compreende uma beta-xilosidase GH3.
5. Composição de enzimas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a endoxilanase compreende uma endoxilanase GH10.
6. Composição de enzimas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a composição de enzimas compreende endoglucanase em uma quantidade de 3% a 5% (em peso/ peso) da quantidade total de proteínas na composição de enzimas.
7. Composição de enzimas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a composição de enzimas compreende mono-oxigenase de polissacarídeos lítica em uma quantidade de 10% a 30% (em peso/ peso) da quantidade total de proteínas na composição de enzimas.
8. Composição de enzimas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma beta-glucosidase, uma celobio-hidrolase I e uma celobio- hidrolase II.
9. Composição de enzimas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é um caldo de fermentação inteiro.
10. Processo para a preparação de um açúcar a partir de material lignocelulósico, caracterizado pelo fato de que compreende: a) hidrolisar o material lignocelulósico com uma composição de enzimas como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para obter o açúcar, e b) opcionalmente, recuperar o açúcar.
11. Processo para a produção de um produto de fermentação a partir de um material lignocelulósico, caracterizado pelo fato de que o processo compreende: a) hidrolisar o material lignocelulósico com uma composição de enzimas como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, de modo a obter um açúcar, b) fermentar o açúcar obtido por contato do açúcar obtido com um micro-organismo de fermentação, de modo a produzir o produto de fermentação, e c) opcionalmente, recuperar o produto de fermentação.
12. Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a composição de enzimas é usada em uma quantidade de 4,5 mg a 15 mg de proteína/grama de peso de matéria seca de glucanos no material lignocelulósico.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o material lignocelulósico é submetido ao pré-tratamento antes da hidrólise enzimática.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o pré-tratamento é tratamento com vapor, tratamento com ácido diluído, tratamento com organosolv, tratamento com cal, tratamento ARP ou tratamento AFEX.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o produto da fermentação é álcool e o micro-organismo de fermentação é um microorganismo produtor de álcool que é capaz de fermentar no mínimo um açúcar C5.
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