BR112017014958B1 - Processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico e produção de enzima - Google Patents

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Abstract

PROCESSO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE MATERIAL LIGNOCELULÓSICO E FERMENTAÇÁO DE AÇÚCARES. A invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico.

Description

Campo da Invenção
A invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico. Antecedentes da Invenção
O material lignocelulósico é primeiramente composto por celulose, hemicelulose e lignina e fornece uma plataforma atraente para gerar fontes químicas e de energia alternativas a combustíveis fósseis. O material está disponível em grandes quantidades e pode ser convertido em açúcares que podem ser novamente convertidos em produtos de fermentação valiosos, como biocombustível e ácidos orgânicos.
A produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico é conhecida na técnica e, em geral, inclui as etapas de pré-tratamento, hidrólise, fermentação e, opcionalmente, recuperação dos produtos de fermentação.
Durante a hidrólise, a qual pode compreender as etapas de liquefação, pré-sacarificação e/ou sacarificação, a celulose presente no material lignocelulósico é parcialmente (tipicamente 30 a 95 %, dependendo da atividade enzimática e das condições de hidrólise) convertida em açúcares redutores por enzimas celulolíticas. A hidrólise ocorre tipicamente durante um processo que dura de 6 a 168 horas (consultar Kumar, S., Chem. Eng. Technol. 32 (2009), 517-526) sob temperaturas elevadas de 45 a 70 °C e condições não estéreis. Comumente, os açúcares são, então, convertidos em produtos de fermentação valiosos, como etanol e ácido succínico, por micro-organismos, como levedura.
O ácido succínico é um ácido orgânico de quatro carbonos bem conhecido que tem um alto valor, já que pode ser usado como um precursor para muitos produtos químicos industriais importantes e produtos de consumo. Atualmente, o ácido succínico é produzido petroquimicamente a partir de butano através de anidrido maleico. No entanto, tem se dado muita atenção recentemente à produção microbiológica de ácido succínico com o uso de micro-organismos como uma alternativa à síntese química.
Nos últimos anos, em grande parte em resposta a um fornecimento de combustível instável e a esforços para reduzir emissões de dióxido de carbono, a produção de etanol a partir de recursos de biomassa renovável está se tornando extremamente importante do ponto de vista do ambiente global. O bioetanol é considerado uma boa alternativa de combustível, já que as culturas originais podem ser cultivadas de modo renovável e na maioria dos climas de todo o mundo. Além disso, o uso de bioetanol é, em geral, neutro em CO2.
Nos últimos anos, o conceito da biorrefinaria tem surgido. No conceito de biorrefinaria, os processos de conversão de biomassa e a tecnologia para produzir uma variedade de produtos, incluindo combustíveis, energia, produtos químicos e ração para gado, são integrados. Desse modo, obtém-se vantagem nas diferenças naturais na composição química e estrutural da matérias-primas de biomassa. Um gerenciamento e uma utilização cuidadosos de materiais, produtos e refugos são desejáveis, tornando o conceito de biorrefinaria um exemplo claro de simbiose industrial. Produzindo-se múltiplos produtos e integrando-se tratamento de refugo, biorrefinarias podem maximizar os valores derivados de matérias-primas de biomassa e tornar o processamento de biomassa em oportunidades reais.
A otimização de processos realizados em biorrefinarias e o projeto geral de biorrefinarias são ferramentas cruciais para aumentar a eficiência de biorrefinarias e reduzir seus custos gerais.
É desejável, no entanto, incluir conceitos, projetos e configurações de processo novos e inovadores que visam maximizar a saída de biorrefinarias e reduzir seus custos gerais.
Sumário da invenção
Um objetivo da invenção consiste em fornecer um processo integrado melhorado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico. A otimização e a melhora se devem a muitos recursos, incluindo, porém sem limitação, valorização de correntes laterais, separação de correntes, (re)utilização de certos materiais e correntes, condições de hidrólise enzimática e fermentações, integração de uma variedade de processos de conversão. De preferência, o processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico compreende as etapas de: - hidrólise enzimática do material lignocelulósico para obter o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, - separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para obter pelo menos uma fração sólida e pelo menos uma fração líquida, - fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida através de um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, - propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação de um micro-organismo produtor de enzima, e - produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
Descrição detalhada da invenção
Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações anexas, as palavras "compreender" e "incluir" e variações como "compreende", "que compreende", "inclui" e "que inclui" devem ser interpretadas de modo inclusivo. Ou seja, essas palavras são destinadas a expressar a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente citados, quando o contexto permite. Os artigos “um” e “uma” são usados no presente documento para se referir a um ou a mais de um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Com fins exemplificativos, “um elemento” pode significar um elemento ou mais de um elemento. O termo “micro-organismo”, como usado no presente documento, significa um ou mais micro-organismos. A menos que seja indicado de modo diferente, os termos “a pelo menos uma fração sólida” e “a pelo menos uma fração líquida” significam a pelo menos uma fração sólida e a pelo menos uma fração líquida, respectivamente, como obtidas após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado. Como descrito no presente documento, após uma separação de sólido/líquido, pelo menos uma fração sólida e pelo menos uma fração líquida são obtidas. “A pelo menos uma fração sólida” e “a pelo menos uma fração líquida” se referem ao resultado de uma etapa de separação e também podem ser substituídas pelos termos “a fração sólida” e “a fração líquida”, respectivamente.
A invenção se refere a um processo integrado de produção de álcool. O termo “processo integrado” é conhecido por uma pessoa versada na técnica e significa um processo em que duas ou mais etapas de processo relacionadas de pelo menos dois processos industriais separados, os quais podem ser realizados separadamente, são combinadas, para que pelo menos uma etapa de processo seja comum para esses dois processos. Além disso, em um "processo integrado", como definido no presente documento, correntes, frações e/ou porções produzidas e/ou obtidas em um processo industrial podem ser usadas em outro processo industrial, melhorando, desse modo, a eficiência geral do processo mais do que a soma de cada processo individual. O processo integrado otimiza a utilização de biomassa e reduz subprodutos que, de outro modo, exigiriam tratamento. Em outras palavras, o termo "processo integrado" significa uma combinação de pelo menos duas operações de unidade que exploram as interações entre diferentes unidades a fim de empregar recursos de modo eficaz, melhorar a eficiência de energia, melhorar o equilíbrio de material, maximizar o lucro e/ou minimizar os custos. Pelo menos uma das duas operações de unidade recebe material e/ou energia, e pode ser dependente desses, a partir da outra operação de unidade. Em um processo integrado, as interações entre diferentes operações de unidade são consideradas a partir do início, em vez de otimizá-las separadamente. A integração de processo não é limitada ao projeto de novas usinas, porém também abrange projetos de retroajuste, por exemplo, novas unidades a serem instaladas em uma usina antiga, e a operação de sistemas existentes. A presente invenção também fornece processos de produção de álcool e ácido orgânico, sendo que as unidades de tais processos são completamente integradas, e, então, os processos são de baixo custo, de operação simples e versáteis devido às alternativas e interconexões em suas etapas. O processo integrado é mais eficiente do ponto de vista de energia e materiais do que os processos individuais juntamente, e, como tal, exibe uma maior produtividade com utilização completa e valorização da biomassa lignocelulósica.
A presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, sendo que o processo compreende: - hidrólise enzimática do material lignocelulósico para obter o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, - separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para obter pelo menos uma fração sólida e pelo menos uma fração líquida, - fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida através de um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, - propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação de um micro-organismo produtor de enzima, e - produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
A presente invenção também se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, sendo que o processo compreende: - pré-tratamento do material lignocelulósico para obter material lignocelulósico pré-tratado, - hidrólise enzimática do material lignocelulósico pré- tratado para obter material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, - separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para obter pelo menos uma fração sólida e pelo menos uma fração líquida, - fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida através de um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, - propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação de um micro-organismo produtor de enzima, e - produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
Em uma modalidade, os processos integrados para produção de álcool de acordo com a presente invenção também podem compreender as etapas de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico e/ou propagação do micro-organismo produtor de ácido orgânico através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida. Nesse caso, o processo integrado da invenção pode ser considerado como um processo integrado para produção de álcool e produção de ácido orgânico. Em uma modalidade, a pelo menos uma fração líquida é usada como substrato na produção de um ácido orgânico pelo micro-organismo produtor de ácido orgânico. Em outras palavras, o micro-organismo produtor de ácido orgânico fermenta a pelo menos uma fração líquida para produzir um ácido orgânico. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico não fermenta a pelo menos uma fração sólida para produzir um ácido orgânico. Em uma modalidade, o álcool produzido pelo micro-organismo produtor de álcool é usado como um substrato na fermentação pelo micro-organismo produtor de ácido orgânico.
Em uma modalidade, a pelo menos uma fração líquida é usada como substrato na produção de álcool pelo micro-organismo produtor de álcool. Em outras palavras, o micro-organismo produtor de álcool fermenta a pelo menos uma fração líquida para produzir álcool. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool não fermenta a pelo menos uma fração sólida para produzir álcool. Em uma modalidade, a fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é usada como substrato na produção de álcool pelo micro-organismo produtor de álcool. Em uma modalidade, a pelo menos uma fração líquida e a fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado são usadas como substrato na produção de álcool pelo micro-organismo produtor de álcool. Em uma modalidade, o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado é usado como substrato na produção de álcool pelo micro-organismo produtor de álcool. Em outras palavras, o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, antes de ser submetido a uma separação de sólido/líquido, é usado como substrato na produção de álcool pelo micro-organismo produtor de álcool.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, como descrito no presente documento, sendo que o processo compreende a etapa de propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida. Se necessário, uma ou mais fontes externas de nutriente e carbono podem ser adicionadas antes e/ou durante a propagação. Condições para a propagação dependerão do tipo de micro-organismo usado e estão dentro do escopo da pessoa versada na técnica.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, como descrito no presente documento, sendo que o processo também compreende a etapa de propagação do micro-organismo produtor de ácido orgânico através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida. Se necessário, uma ou mais fontes externas de nutriente e carbono podem ser adicionadas antes e/ou durante a propagação. Condições para a propagação dependerão do tipo de micro-organismo usado e estão dentro do escopo da pessoa versada na técnica.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, como descrito no presente documento, sendo que o processo compreende a etapa de propagação de um micro-organismo produtor de enzima. Se necessário, uma ou mais fontes externas de nutriente e carbono podem ser adicionadas antes e/ou durante a propagação. Condições para a propagação dependerão do tipo de micro-organismo usado e estão dentro do escopo da pessoa versada na técnica.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, como descrito no presente documento, sendo que o processo compreende a etapa de produção de enzimas por um micro-organismo produtor de enzima. Se necessário, uma ou mais fontes externas de nutriente e carbono podem ser adicionadas antes e/ou durante a produção. Condições para a produção dependerão do tipo de micro-organismo usado e estão dentro do escopo da pessoa versada na técnica.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, sendo que o processo compreende: - hidrólise enzimática do material lignocelulósico para obter o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, - separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para obter pelo menos uma fração sólida e pelo menos uma fração líquida, - fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida através de um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico, - propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação do micro-organismo produtor de ácido orgânico através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação de um micro-organismo produtor de enzima, e - produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico, sendo que o processo compreende: - pré-tratamento do material lignocelulósico para obter material lignocelulósico pré-tratado, - hidrólise enzimática do material lignocelulósico pré- tratado para obter material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, - separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado para obter pelo menos uma fração sólida e pelo menos uma fração líquida, - fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida através de um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, - fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico, - propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação do micro-organismo produtor de ácido orgânico através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida, - propagação de um micro-organismo produtor de enzima, e - produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
Em uma modalidade, a hidrólise enzimática e a fermentação podem ser etapas separadas, porém também podem ser combinadas. Exemplos incluem, porém sem limitação, hidrólise e fermentação separadas (SHF), sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHF), hidrólise e cofermentação separadas (SHCF), hidrólise e cofermentação híbridas (HHCF), e conversão microbiana direta (DMC), também chamada, por vezes, bioprocessamento consolidado (CBP).
Em uma modalidade, o material lignocelulósico é submetido a pelo menos uma separação de sólido/líquido antes da hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o material lignocelulósico pré-tratado é submetido a pelo menos uma separação de sólido/líquido antes da hidrólise enzimática. Então, antes de submeter o material lignocelulósico e/ou material lignocelulósico pré-tratado à hidrólise enzimática, o mesmo pode ser submetido a pelo menos uma separação de sólido/líquido. Os métodos e as condições de separação de sólido/líquido dependerão do tipo de material lignocelulósico usado e estão dentro do escopo da pessoa versada na técnica. Exemplos incluem, porém sem limitação, centrifugação, separação ciclônica, filtração, decantação, peneiração e sedimentação. Durante a separação de sólido/líquido, meios e/ou auxiliares para melhorar a separação podem ser usados.
Em uma modalidade, a fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é submetida à hidrólise enzimática. A fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é submetida a uma separação de sólido/líquido adicional. Esse ciclo pode ser repetido diversas vezes.
Em outra modalidade, a fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é submetido à hidrólise enzimática, enquanto a fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é usada como substrato em pelo menos um dos processos de fermentação. Em uma modalidade, a fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é usada como substrato na propagação do micro-organismo produtor de álcool e/ou é usada como substrato na fermentação pelo micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool.
Antes de submeter o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado a uma etapa de separação de sólido/líquido, compostos adicionais, como um auxiliar de centrifugação, podem ser adicionados.
Em uma modalidade, as enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas antes de submeter o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado a uma etapa de separação de sólido/líquido. As enzimas acabam, então, parcialmente na fração líquida.
Em uma modalidade, uma parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Em uma modalidade, a parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado que é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima é a pelo menos uma fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado. Em uma modalidade, uma parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado e uma parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado são usadas na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Isso significa que uma parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado e/ou uma parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado são adicionadas ao micro-organismo produtor de enzima antes e/ou durante a propagação e/ou antes e/ou durante a produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Evidentemente, o micro-organismo produtor de enzima também pode ser adicionado à parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado e/ou à parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado. O material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado usado na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima não foi submetido à hidrólise enzimática. Em uma modalidade, a parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado que é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima não foi submetida a uma separação de sólido/líquido. Em outra modalidade, a parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado que é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima foi submetida a uma separação de sólido/líquido. No último caso, a fração sólida obtida após uma separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
Em uma modalidade preferencial, as enzimas produzidas pelo micro-organismo produtor de enzima são usadas na hidrólise enzimática do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado para obter o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado.
Em uma modalidade, a propagação do micro-organismo produtor de enzima e a produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima consistem em uma única etapa, o que significa que, durante a propagação do micro-organismo produtor de enzima, as enzimas já são produzidas pelo micro-organismo.
O material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado que é adicionado ao micro-organismo produtor de enzima antes e/ou durante a propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou antes e/ou durante a produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima pode concentrado antes da adição. Em uma modalidade, a parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado que é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima foi submetida a uma separação de sólido/líquido. A fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado pode ser usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Em uma modalidade, aquela fração líquida pode ser submetida a uma etapa de concentração antes de ser usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
O material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado que são adicionados ao micro-organismo produtor de enzima antes e/ou durante a propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou antes e/ou durante a produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima pode ser lavado antes da adição.
Em uma modalidade, a razão entre a parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado e a parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado que são usadas na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima está entre 1 % em peso: 99 % em peso e 99 % em peso: 1 % em peso. Evidentemente, a razão pode ser diferente caso uma ou mais fontes externas de carbono sejam usadas na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Em uma modalidade alternativa, quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação separadas (como descrito em mais detalhes abaixo), o produto da etapa de liquefação pode ser usado na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Isso pode ser realizado com ou sem a adição de material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado. Evidentemente, além disso, cada um dentre a combinação de parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, parte do material lignocelulósico pré-tratado, produto da etapa de liquefação e fonte externa de carbono e nutriente pode ser usado na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
A parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado e a parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado que são usadas na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima podem variar. A parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado que é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima pode ser de pelo menos 1 % em peso, pelo menos 2 % em peso, pelo menos 3 % em peso, pelo menos 4 % em peso, pelo menos 5 % em peso, pelo menos 6 % em peso, pelo menos 7 % em peso, pelo menos 8 % em peso, pelo menos 9 % em peso, pelo menos 10 % em peso, pelo menos 11 % em peso, pelo menos 12 % em peso, pelo menos 13 % em peso, pelo menos 14 % em peso, pelo menos 15 % em peso, pelo menos 20 % em peso do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado total.
A parte do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado que é usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima pode ser de pelo menos 1 % em peso, pelo menos 2 % em peso, pelo menos 3 % em peso, pelo menos 4 % em peso, pelo menos 5 % em peso, pelo menos 6 % em peso, pelo menos 7 % em peso, pelo menos 8 % em peso, pelo menos 9 % em peso, pelo menos 10 % em peso do material lignocelulósico total e/ou do material lignocelulósico pré-tratado total.
Juntamente ao material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado e ao material lignocelulósico e/ou ao material lignocelulósico pré-tratado, pelo menos uma fonte externa de carbono e nutriente pode ser usada na propagação do micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. A fonte externa de carbono e nutriente pode ter a função de indutor e/ou nutriente. Evidentemente, diversas fontes externas de nutriente e carbono diferentes podem ser adicionadas. As fontes de carbono e nutriente adequadas a propagação de um micro-organismo produtor de enzima e/ou na produção de enzimas por um micro-organismo produtor de enzima são conhecidas por uma pessoa versada na técnica.
Após a hidrólise enzimática, o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado é submetido a uma separação de sólido/líquido. Métodos para a separação de sólido/líquido incluem, porém sem limitação, centrifugação, separação ciclônica, filtração, decantação, peneiração e sedimentação. Durante a separação de sólido/líquido, meios e/ou auxiliares podem ser usados para melhorar a separação.
A separação de sólido/líquido resulta na pelo menos uma fração sólida e na pelo menos uma fração líquida. Em uma modalidade, a pelo menos uma fração sólida compreende entre 3 e 97 % em peso de açúcares C5. Em uma modalidade, a pelo menos uma fração líquida compreende entre 1 e 97 % em peso de açúcares C6.
Em uma modalidade, a hidrólise enzimática compreende pelo menos uma etapa de liquefação em que o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado são hidrolisados em pelo menos um primeiro recipiente, e uma etapa de sacarificação em que o material liquefeito é hidrolisado no pelo menos um primeiro recipiente e/ou em pelo menos um segundo recipiente. A sacarificação pode ser realizada no mesmo recipiente que a liquefação (isto é, o pelo menos um primeiro recipiente), também pode ser realizada em um recipiente separado (isto é, pelo menos um segundo recipiente). Então, na hidrólise enzimática dos processos integrados de acordo com a presente invenção, a liquefação e a sacarificação podem ser combinadas. Alternativamente, a liquefação e a sacarificação podem ser etapas separadas. A liquefação e a sacarificação podem ser realizadas a diferentes temperaturas, porém também podem ser realizadas a uma temperatura única. Em uma modalidade, a temperatura da liquefação é maior do que a temperatura da sacarificação. A liquefação é realizada, de preferência, a uma temperatura de 60 - 75 °C e a sacarificação é realizada, de preferência, a uma temperatura de 50 - 65 °C.
A hidrólise enzimática pode ser realizada em um ou mais recipientes, porém também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo. Isso também é verdadeiro quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação. A etapa de liquefação pode ser realizada em um ou mais recipientes, porém também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo e/ou a etapa de sacarificação pode ser realizada em um ou mais recipientes, porém também pode ser realizada em um ou mais tubos ou qualquer outro sistema contínuo. Exemplos de recipientes a serem usados na presente invenção incluem, porém sem limitação, recipientes agitados em batelada alimentada, recipientes agitados em batelada, recipientes agitados de fluxo contínuo com ultrafiltração, e reatores de coluna de fluxo pistonado contínuo. A agitação pode ser realizada por uma ou mais hélices, bombas e/ou misturadores estáticos.
Em uma modalidade, o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado podem ser adicionados a um ou mais recipientes usados para a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, as enzimas usadas na hidrólise enzimática já estão presentes nos um ou mais recipientes antes que o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré- tratado sejam adicionados. Em outra modalidade, as enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas aos um ou mais recipientes. Em uma modalidade, o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado já estão presentes nos um ou mais recipientes antes que as enzimas usadas na hidrólise enzimática sejam adicionadas. Em uma modalidade, tanto o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado quanto as enzimas usadas na hidrólise enzimática são adicionados simultaneamente aos um ou mais recipientes. As enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser uma composição aquosa. Esse parágrafo também é verdadeiro quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação.
As enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas antes e/ou durante a hidrólise enzimática. Como indicado acima, quando o material lignocelulósico e/ou o material lignocelulósico pré-tratado são submetidos a uma separação de sólido/líquido antes da hidrólise enzimática, as enzimas usadas na hidrólise enzimática podem ser adicionadas antes da separação de sólido/líquido. Alternativamente, também podem ser adicionadas após a separação de sólido/líquido ou antes e após a separação de sólido/líquido.
As enzimas também podem ser adicionadas durante a hidrólise enzimática. No caso em que a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação, as enzimas adicionais podem ser adicionadas durante e/ou após a etapa de liquefação. As enzimas adicionais podem ser adicionadas antes e/ou durante a etapa de sacarificação. As enzimas adicionais também podem ser adicionadas após a etapa de sacarificação.
Em uma modalidade, o tempo de hidrólise enzimática total é de 10 horas ou mais, 12 horas ou mais, 14 horas ou mais, 16 horas ou mais, 18 horas ou mais, 20 horas ou mais, 30 horas ou mais, 40 horas ou mais, 50 horas ou mais, 60 horas ou mais, 70 horas ou mais, 80 horas ou mais, 90 horas ou mais, 100 horas ou mais, 110 horas ou mais, 120 horas ou mais, 130 horas ou mais, 140 horas ou mais, 150 horas ou mais, 160 horas ou mais, 170 horas ou mais, 180 horas ou mais, 190 horas ou mais, 200 horas ou more.
Em uma modalidade, o tempo de hidrólise enzimática total é de 10 a 300 horas, 16 a 275 horas, de preferência, 20 a 250 horas, mais preferencialmente, 30 a 200 horas, com máxima preferência, 40 a 150 horas.
A viscosidade do material lignocelulósico nos um ou mais recipientes usados para a hidrólise enzimática é mantida entre 10 e 4000 cP, entre 10 e 2000 cP, de preferência, entre 10 e 1000 cP.
No caso em que o processo integrado compreende uma hidrólise enzimática que compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação, a viscosidade do material lignocelulósico na etapa de liquefação é mantida entre 10 e 4000 cP, entre 10 e 2000 cP, de preferência, entre 10 e 1000 cP e/ou a viscosidade do material lignocelulósico na etapa de sacarificação é mantida entre 10 e 1000 cP, entre 10 e 900 cP, de preferência, entre 10 e 800 cP.
A viscosidade pode ser determinada com um Reômetro Brookfield DV III na temperatura usada para a hidrólise.
Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado durante pelo menos uma parte da hidrólise enzimática. O oxigênio pode ser adicionado contínua ou descontinuamente durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado uma ou mais vezes durante a hidrólise enzimática. Em uma modalidade, o oxigênio pode ser adicionado antes da hidrólise enzimática, durante a adição de material lignocelulósico a um recipiente usado de hidrólise enzimática, durante a adição de enzima a um recipiente usado de hidrólise enzimática, durante uma parte da hidrólise enzimática, durante toda a hidrólise enzimática ou qualquer combinação desses. O oxigênio é adicionado aos um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática.
O oxigênio pode ser adicionado de diversas formas. Por exemplo, o oxigênio pode ser adicionado como gás oxigênio, gás enriquecido com oxigênio, como ar enriquecido com oxigênio, ou ar. O oxigênio também pode ser adicionado por meio de geração de oxigênio in situ. Por exemplo, o oxigênio pode ser gerado por eletrólise, o oxigênio pode ser produzido enzimaticamente, por exemplo, através da adição de peróxido, ou o oxigênio pode ser produzido quimicamente, por exemplo, através de um sistema gerador de oxigênio, como KHSO5. Por exemplo, o oxigênio é produzido a partir de peróxido por catalase. O peróxido pode ser adicionado na forma de peróxido dissolvido ou gerado por uma reação enzimática ou química. No caso em que a catalase é usada como enzima para produzir oxigênio, a catalase presente na composição enzimática para a hidrólise pode ser usada ou a catalase pode ser adicionada para esse propósito.
Exemplos de como adicionar oxigênio incluem, porém sem limitação, adição de oxigênio por meio de pulverização, eletrólise, adição química de oxigênio, enchimento dos um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática a partir do topo (imergindo o hidrolisado no tanque e introduzindo consequentemente o oxigênio no hidrolisado) e adição de oxigênio ao espaço vazio dos ditos um ou mais recipientes.
Quando o oxigênio é adicionado ao espaço vazio do recipiente (ou recipientes), oxigênio suficiente necessário para a reação de hidrólise pode ser fornecido. Em geral, a quantidade de oxigênio adicionada ao recipiente (ou recipientes) pode ser controlada e/ou variada. A restrição do oxigênio fornecido é possível adicionando-se apenas oxigênio durante a parte do tempo de hidrólise no dito recipiente (ou recipientes). Outra opção é adicionar oxigênio a uma baixa concentração, por exemplo, com o uso de uma mistura de ar e ar reciclado (ar que sai do recipiente) ou “diluindo-se” o ar com um gás inerte. O aumento da quantidade de oxigênio adicionado pode ser alcançado pela adição de oxigênio durante períodos mais longos do tempo de hidrólise, pela adição do oxigênio a uma maior concentração ou pela adição de mais ar. Outra maneira de controlar a concentração de oxigênio é adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. O oxigênio pode ser introduzido, por exemplo, soprado, no conteúdo líquido do recipiente de hidrólise de material lignocelulósico. Também pode ser soprado no espaço livre do recipiente.
Em uma modalidade, o oxigênio é adicionado aos um ou mais recipientes usados na hidrólise enzimática antes e/ou durante e/ou após a adição do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado aos ditos um ou mais recipientes. O oxigênio pode ser introduzido juntamente ao material lignocelulósico e/ou ao material lignocelulósico pré-tratado que entra no recipiente (ou recipientes) de hidrólise. O oxigênio pode ser introduzido na corrente de material que entra no recipiente (recipientes) ou com parte do conteúdo do recipiente (ou recipientes) que passa por um circuito externo do recipiente (ou recipientes).
Na hidrólise enzimática, polissacarídeos amorfos e cristalinos ou celulose são hidrolisados em açúcares, como glicose. Os polissacarídeos amorfos são, por exemplo, convertidos em oligossacarídeos por endoglucanases e, então, os oligossacarídeos podem ser convertidos em celobiohidrolases e beta-glucosidases em glicose. A conversão dos polissacarídeos cristalinos pode ocorrer em paralelo ou sequencialmente e continuar mesmo quando a maior parte dos polissacarídeos amorfos é hidrolisada. A adição de oxigênio em combinação com mono-oxigenases líticas de polissacarídeo é benéfica durante a hidrólise dos polissacarídeos cristalinos, por exemplo, na degradação dos polissacarídeos em oligossacarídeos. A estrutura cristalina de glucano pode ser aberta por mono-oxigenases líticas de polissacarídeo. Esse tipo de enzima abre a estrutura oxidando-se as ligações glicosídicas e tornando-as acessíveis para as outras enzimas celulolíticas para hidrólise adicional dos oligossacarídeos em glicose. A adição de oxigênio é muito útil, especialmente na fase em que os polissacarídeos cristalinos são convertidos em enzimas.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção tem um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m3, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 m3, pelo menos 800 m3, pelo menos 900 m3, pelo menos 1000 m3, pelo menos 1500 m3, pelo menos 2000 m3, pelo menos 2500 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 3000 m3 ou 5000 m3. No caso em diversos recipientes são usados na hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção, esses podem ter o mesmo volume, porém também podem ter um volume diferente. No caso em que a hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação separadas, o recipiente (ou recipientes) usado para a etapa de liquefação e o recipiente (ou recipientes) usado para a etapa de sacarificação podem ter o mesmo volume, porém também podem ter um volume diferente.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool tem um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m3, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 m3, pelo menos 800 m3, pelo menos 900 m3, pelo menos 1000 m3, pelo menos 1500 m3, pelo menos 2000 m3, pelo menos 2500 m3, pelo menos 3000 m3, pelo menos 3500 m3, pelo menos 4000 m3, pelo menos 4500 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 5000 m3.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico tem um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3, pelo menos 500 m3, pelo menos 600 m3, pelo menos 700 m3, pelo menos 800 m3, pelo menos 900 m3, pelo menos 1000 m3, pelo menos 1500 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 2000 m3.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na propagação do micro-organismo produtor de álcool por fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida têm um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 500 m3.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na propagação do micro-organismo produtor de ácido orgânico por fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida têm um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 150 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 200 m3.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na propagação de um micro-organismo produtor de enzima têm um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3, pelo menos 100 m3, pelo menos 200 m3, pelo menos 300 m3, pelo menos 400 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 500 m3.
Em uma modalidade, o recipiente (ou recipientes) usado na produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima tem um volume de pelo menos 1 m3. De preferência, os recipientes têm um volume de pelo menos 1 m3, pelo menos 2 m3, pelo menos 3 m3, pelo menos 4 m3, pelo menos 5 m3, pelo menos 6 m3, pelo menos 7 m3, pelo menos 8 m3, pelo menos 9 m3, pelo menos 10 m3, pelo menos 15 m3, pelo menos 20 m3, pelo menos 25 m3, pelo menos 30 m3, pelo menos 35 m3, pelo menos 40 m3, pelo menos 45 m3, pelo menos 50 m3, pelo menos 60 m3, pelo menos 70 m3, pelo menos 75 m3, pelo menos 80 m3, pelo menos 90 m3. Em geral, o recipiente (ou recipientes) será menor do que 100 m3.
Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de enzima é um fungo. Em uma modalidade, as enzimas são derivadas de um fungo filamentoso ou as enzimas compreendem uma enzima fúngica filamentosa. Em uma modalidade preferencial, o fungo é Rasamsonia, sendo que Rasamsonia emersonii é mais preferencial. As enzimas usadas na hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção são derivadas de um fungo ou as enzimas usadas na hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção compreendem uma enzima fúngica. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., Em Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido). Os fungos filamentosos são caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucano, quitosano, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo se dá por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Cepas fúngicas filamentosas incluem, porém sem limitação, cepas de Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Coprinus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylatidium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Trichoderma e Trichophyton.
Diversas cepas de fungos filamentosos são prontamente acessíveis ao público em diversas coleções de cultura, como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Exemplos de tais cepas incluem Aspergillus niger CBS 513.88, Aspergillus oryzae ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC14488-14491, ATCC 11601, ATCC12892, P. chrysogenum CBS 455.95, Penicillium citrinum ATCC 38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS 393.64, Acremonium chrysogenum ATCC 36225 ou ATCC 48272, Trichoderma reesei ATCC 26921 ou ATCC 56765 ou ATCC 26921, Aspergillus sojae ATCC11906, Chrysosporium lucknowense C1, Garg 27K, VKM F-3500-D, ATCC44006 e derivados dos mesmos.
A hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção é vantajosamente aplicada em combinação a enzimas derivadas de um micro-organismo do gênero Rasamsonia ou as enzimas usadas na hidrólise enzimática dos processos integrados da presente invenção compreendem uma enzima Rasamsonia.
A hidrólise enzimática do primeiro estágio é, de preferência, realizada a 50 - 90 °C. Nessa etapa, enzimas celulolíticas termoestáveis são preferenciais. Uma enzima “termoestável”, como usado no presente documento, significa que a enzima tem um ideal de temperatura de 50 oC ou superior, 60 oC ou superior, 70 oC ou superior, 75 oC ou superior, 80 oC ou superior, 85 oC ou superior. As mesmas podem ser, por exemplo, isoladas de micro-organismos termofílicos ou podem ser projetadas pela pessoa versada e artificialmente sintetizadas. Em uma modalidade, os polinucleotídeos podem ser isolados ou obtidos a partir de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados dos fungos não termofílicos ou não termotolerantes, porém foi constatado que são termoestáveis.
“Fungo termofílico” se refere a um fungo que cresce a uma temperatura de 50 °C ou maior. “Fungo termotolerante” se refere a um fungo que cresce a uma temperatura de 45°C ou maior, que tem um máximo próximo de 50 °C.
As células fúngicas termofílicas ou termotolerantes adequadas podem ser uma célula de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasamsonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, de preferência, uma célula de Rasamsonia. Os fungos termofílicos ou termotolerantes preferenciais são Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanuginosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argillacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.
Os fungos termofílicos não são restritos a uma ordem taxonômica específica e ocorre ao longo de toda a árvore da vida fúngica. Exemplos são Rhizomucor nos Mucorales,
Myceliophthora em Sordariales e Talaromyces, Thermomyces e Thermoascus nos Eurotiales (consultar Mouchacca, 1997). A maioria das espécies de Talaromyces são mesófilos, porém exceções são as espécies nas seções Emersonii e Thermophila. A seção Emersonii inclui Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces bacillisporus e Talaromyces leycettanus, sendo que todos se desenvolvem bem a 40 °C.
Talaromyces bacillisporus é termotolerante, Talaromyces leycettanus é termotolerante a termofílico, e Talaromyces emersonii e Talaromyces byssochlamydoides são verdadeiramente termofílicos (consultar Stolk e Samson, 1972). O único membro de Talaromyces seção Thermophila, Talaromyces thermophilus, se desenvolve rapidamente a 50 °C (consultar Stolk e Samson, 1972). A classificação atual dessas espécies termofílicas de
Talaromyces é principalmente baseada em características fenotípicas e fisiológicas, como sua habilidade de se desenvolver acima de 40 °C, cor de ascóporo, a estrutura de cobertura ascornatal e a formação de um certo tipo de anamorfo. Stolk e Samson (1972) declararam que os membros da seção Emersonii têm anamorfos de série Paecilomyces (Talaromyces byssochlamydoides e Talaromyces leycettanus) ou Penicillium cylindrosporum (Talaromyces emersonii e
Talaromyces bacillisporus). Posteriormente, Pitt (1979) transferiu as espécies que pertencem à série Penicillium cylindrosporum para o gênero Geosmithia, com base em várias características, como a formação de conídios de poros terminais em vez de collula (pescoços), uma característica de Penicillium e Paecilomyces. No gênero Geosmithia, apenas Geosmithia argillacea é termotolerante, e Stolk et al. (1969) e Evans (1971) propuseram uma conexão com membros de Talaromyces seção Emersonii. A relação filogenética da espécie Talaromyces termofílica em Talaromyces e a Trichocomaceae é desconhecida. (consultar J. Houbraken, Antonie van Leeuwenhoek fevereiro de 2012; 101(2): 403-421).
Rasamsonia é um novo gênero que compreende espécies de Talaromyces e Geosmithia termotolerantes e termofílicas (J.
Houbraken et al., vide supra). Com base em dados fenotípicos, fisiológicos e moleculares, Houbraken et al. propuseram transferir as espécies Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora para Rasamsonia gen. nov.
Os fungos termofílicos são Rasamsonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Thermomyces lenuginosus, Talaromyces thermophilus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus e Thermoascus aurantiacus, sendo que Rasamsonia emersonii é mais preferencial. Talaromyces emersonii, Penicillium geosmithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usados de modo alternado no presente documento.
As enzimas celulolíticas de Rasamsonia aplicadas em matéria-prima lignocelulósica pré-tratada mostram taxas de conversão máximas a uma temperatura na faixa de 50 a 70 °C.
As enzimas permanecem ativas sob essas circunstâncias por 14 dias e mais sem interrupção completa de atividade. Com o uso de condições ideais de temperatura, uma quantidade máxima de açúcares redutores pode ser liberada a partir de material lignocelulósico (hidrólise total) dentro do tempo de hidrólise mais curto possível. Desse modo, 100 % de conversão de celulose em glicose podem ser alcançados em menos de 5 dias. O rendimento máximo teórico (Yps máx em g de produto por grama de glicose) de um produto de fermentação pode ser derivado de livros de bioquímica. Para etanol, 1 mol de glicose (180 g) produz, de acordo com o caminho normal de glicólise-fermentação na levedura, 2 mols de etanol (= 2 x 46 = 92 g de etanol). O rendimento máximo teórico de etanol em glicose é, portanto, de 92/180 = 0,511 g de etanol/g de glicose. Para butanol (MW 74 g/mol) ou isobutanol, o rendimento máximo teórico é de 1 mol de butanol por mol de glicose. Então, Yps máx para (iso-)butanol = 74/180 = 0,411 g (iso-)butanol/g de glicose. Para o ácido láctico, o rendimento de fermentação para fermentação homoláctica é de 2 mols de ácido láctico (MW = 90 g/mol) por mol de glicose. De acordo com essa estequiometria, o Yps máx = 1 g de ácido láctico/g de glicose. O rendimento máximo teórico de ácido succínico em glicose é de 1,12 g de ácido succínico/g de glicose. Para outros produtos de fermentação, um cálculo similar pode ser realizado. A redução de custo alcançada aplicando-se enzimas celulolíticas de Rasamsonia é o resultado de uma redução de tempo total de processo.
Devido à alta estabilidade das enzimas usadas nos processos da presente invenção, é possível diminuir a dosagem de enzima e estender o uso da enzima prolongando-se os tempos de hidrólise. Por exemplo, 0,175 ml de enzima/g de matéria seca de material lignocelulósico resultam em liberação de aproximadamente 90 % do máximo teórico de açúcares redutores de material lignocelulósico pré-tratado em 72 h. Com o uso de 0,075 ml de enzima/g de matéria seca de material lignocelulósico, aproximadamente 90 % de conversão do máximo teórico são alcançados em 120 h. Os resultados mostram que, devido à estabilidade da atividade enzimática, a diminuição da dosagem de enzima pode ser compensada estendendo-se o tempo de hidrólise para obter a mesma quantidade de açúcares redutores. A redução de custo alcançada com o uso de enzimas celulolíticas estáveis, como aqueças de Rasamsonia, resulta em menores dosagens de enzima que resultam, no entanto, em rendimentos de conversão de hidrólise similares.
Em um processo comum para converter material lignocelulósico em etanol, etapas de processo são realizadas, de preferência, sob condições sépticas para diminuir os custos operacionais. A contaminação e o crescimento de micro-organismos contaminantes podem, portanto, ocorrer e resultar em efeitos colaterais indesejáveis, como a produção de ácido láctico, ácido fórmico e ácido acético, perdas de rendimento de etanol em substrato, produção de toxinas e polissacarídeos extracelulares. Esses efeitos podem afetar custos de produção de modo significativo. Uma alta temperatura de processo e/ou um curto tempo de processo limita o risco de contaminação durante a hidrólise e a fermentação. Enzimas termoestáveis, como aquelas de Rasamsonia, são capazes de hidrolisar o material lignocelulósico a temperaturas de mais de 60 °C. A essas temperaturas, o risco de que um micro-organismo contaminante cause efeitos colaterais indesejados é pequeno a quase zero.
Durante a etapa de fermentação, na qual etanol é produzido, temperaturas estão tipicamente entre 30 a 38°C e são, de preferência, não aumentadas devido a perdas de produção. Aplicando-se curtos períodos de processo de fermentação, os riscos e os efeitos de contaminação e/ou o crescimento de contaminantes são reduzidos tanto quanto possível. Com enzimas estáveis, como aquelas de Rasamsonia, um curto tempo de fermentação pode ser aplicado e, então, riscos de contaminação e/ou crescimento de contaminantes são reduzidos tanto quanto possível. A redução de custo alcançada aplicando-se enzimas celulolíticas termoestáveis de Rasamsonia desse modo resulta em um menor risco de falhas de processo devido à contaminação.
A primeira etapa após o pré-tratamento térmico consiste em resfriar o material pré-tratado a temperaturas em que as enzimas têm uma atividade ideal. Em uma maior escala, isso é tipicamente realizado adicionando-se água (resfriada), a qual, além de diminuir a temperatura, reduz o teor de matéria seca. Com o uso de enzimas termoestáveis, como aquelas de Rasamsonia, a redução de custo pode ser alcançada, devido ao fato de que (i) menos resfriamento do material pré-tratado é exigido, já que maiores temperaturas são permitidas durante a hidrólise, e (ii) menos água é adicionada, o que aumenta o teor de matéria seca durante a hidrólise e a fermentação e aumenta, então, a capacidade de produção de etanol (quantidade produzida por unidade de tempo por volume) de uma usina de etanol. Com o uso de enzimas termoestáveis, como aquelas de Rasamsonia, a redução de custo também pode ser alcançada com o uso de água de resfriamento que tem uma temperatura maior do que a água que é usada em um processo com enzima não termoestável.
No final da hidrólise, as atividades enzimáticas parecem ser baixas, já que poucos açúcares redutores são liberados após quase toda a celulose ter sido convertida. A quantidade de atividade enzimática presente, no entanto, diminuiu apenas um pouco, assumindo-se que isso se deve principalmente à absorção das enzimas pelo substrato. Aplicando-se separação de sólido-líquido após a hidrólise, como centrifugação, filtração, cantação, sedimentação, 60 % ou mais (por exemplo, 70 %) da atividade enzimática em solução podem ser recuperados e reutilizados para a hidrólise de um novo material lignocelulósico pré-tratado durante a próxima hidrólise. Além disso, após a separação sólido-líquido, a enzima em solução pode ser separada da solução que contém açúcares redutores e outros produtos de hidrólise das ações enzimáticas. Essa separação pode ser realizada por técnicas que incluem, porém sem limitação, ultra- e microfiltração, centrifugação, cantação, sedimentação, com ou sem a primeira adsorção da enzima em um carreador de qualquer tipo. Por exemplo, após a hidrólise de material pré-tratado com 0,175 ml/g de carga enzimática de matéria seca de material por 20 h, 50 % da quantidade máxima teórica de açúcares redutores são liberados e, após a mesma hidrólise por 72 h, 90 %da quantidade máxima teórica de açúcares redutores são liberados. Através de centrifugação e ultrafiltração, 60-70 % da atividade enzimática foram recuperados no retentado, embora o filtrado contivesse mais que 80 % dos açúcares redutores liberados. Através da reutilização do retentado, como tal ou após purificação e/ou concentração adicionais, a dosagem de enzima durante a próxima etapa de hidrólise pode ser reduzida a 60 a 70 %. A redução de custo alcançada com o uso de enzimas celulolíticas estáveis, como aquelas de Rasamsonia, desse modo, é a consequência de uma menor dosagem de enzima.
Os processos integrados da presente invenção podem ser combinados com reciclagem de enzima após a hidrólise, reciclagem do micro-organismo produtor de etanol após a fermentação e/ou reciclagem do micro-organismo produtor de ácido orgânico após a fermentação e/ou reciclagem do micro-organismo produtor de enzima após a produção das enzimas.
A termoestabilidade de enzimas, como aquelas de Rasamsonia, causa uma atividade celulolítica remanescente após hidrólise, fermentação e destilação a vácuo na vinhaça leve. A atividade total da enzima é reduzida durante as três etapas de processo sucessivas. A vinhaça fina obtida após a destilação a vácuo pode ser, então, reutilizada como uma fonte de enzima para um ciclo de processo de hidrólise- fermentação-destilação recém-iniciado de conversão de material pré-tratado em etanol. A vinhaça fina pode ser usada em forma concentrada ou diluída (ou não diluída) e/ou purificada e com ou sem suplementação de enzima adicional.
Em um processo ideal, uma quantidade de enzima é suplementada na vinhaça leve, antes de sua reutilização em um novo ciclo de processo, igual à quantidade de perda de atividade durante as três etapas de processo sucessivas do ciclo de processo anterior. Desse modo, a superdosagem de enzima é impedida e, então, um uso mais eficiente de enzima é obtido. Além disso, fornecendo-se uma alta dosagem de enzima no primeiro ciclo de processo e suplementando-se enzima igual à quantidade de perda de atividade durante as três etapas de processo sucessivas nos ciclos de processo seguintes, as taxas de hidrólise mais altas possíveis podem ser obtidas em cada ciclo de processo, resultando em curtos tempos de hidrólise de menos de 48 h em combinação com o uso mais eficiente de enzimas.
Aplicando-se mistura durante a hidrólise, as enzimas entram em contato mais frequentemente com os substratos, o que resulta em um uso mais eficiente da atividade catalítica. Isso irá resultar em menores dosagens de enzima e, então, em custos mais baixos, a menos que a mistura tenha um efeito negativo nas enzimas. As enzimas estáveis, como as enzimas termoestáveis de Rasamsonia, são robustas e podem resistir a circunstâncias (localmente) de alto cisalhamento e altas temperaturas, sendo que é esse o caso durante a mistura intensiva de pastas fluidas. O uso das mesmas em sistemas mistos é, portanto, benéfico e irá resultar na redução de dosagem e, desse modo, custos.
Uma vantagem de expressão e produção das enzimas (por exemplo, pelo menos duas, três ou quatro diferentes celulases) em um micro-organismo adequado pode ser um alto rendimento de composição enzimática que pode ser usado nos processos da presente invenção.
Nos processos da presente invenção, as composições enzimáticas são usadas. De preferência, as composições são estáveis. “Composições enzimáticas estáveis”, como usado no presente documento, significam que as composições enzimáticas retêm atividade após 30 horas de tempo de reação de hidrólise, de preferência, pelo menos 10%, 20 %, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ou 100 % de sua atividade inicial após 30 horas de tempo de reação de hidrólise. De preferência, a composição enzimática retém atividade após 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo de reação de hidrólise.
As enzimas podem ser preparadas por fermentação de um substrato adequado com um micro-organismo adequado, por exemplo, Rasamsonia emersonii ou Aspergillus niger, sendo que as enzimas são produzidas pelo micro-organismo. O micro-organismo pode ser alterado para melhorar ou para produzir as enzimas. Por exemplo, o micro-organismo pode ser mutacionado por procedimentos de melhoramento de cepa clássicos ou por técnicas de DNA recombinante. Portanto, os micro-organismos mencionados no presente documento podem ser usados como tais para produzir as enzimas ou podem ser alterados para aumentar a produção ou para produzir enzimas alteradas que pode incluir enzimas heterólogas, por exemplo, celulases, então, enzimas que não são originalmente produzidas por aquele micro-organismo. De preferência, um fungo, mais preferencialmente, um fungo filamentoso, é usado para produzir as enzimas. Vantajosamente, um micro-organismo termofílico ou termotolerante é usado. Opcionalmente, um substrato é usado, o qual induz a expressão das enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima.
As enzimas são usadas para liberar açúcares do material lignocelulósico que compreendem polissacarídeos. Os principais polissacarídeos são celulose (glucanos), hemiceluloses (xilanos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, um pouco de hemicelulose pode estar presente como glucomananas, por exemplo, em material lignocelulósico derivado de madeira. A hidrólise enzimática desses polissacarídeos em açúcares solúveis, incluindo tanto monômeros quando multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de diferentes enzimas que agem em conjunto. Por produto de açúcar, refere-se ao produto de hidrólise enzimática do material lignocelulósico. O produto de açúcar compreende açúcares solúveis, incluindo tanto monômeros quanto multímeros. De preferência, compreende glicose. Exemplos de outros açúcares são celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramnose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pentoses. O produto de açúcar pode ser usado como tal ou pode ser adicionalmente processado, por exemplo, recuperado, concentrado e/ou purificado.
Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas, como arabinanos, podem compor consideravelmente a proporção da massa seca de paredes celulares tipicamente provenientes de tecidos vegetais não lenhosos (cerca de um quarto à metade da massa seca pode ser composto por pectinas).
A celulose é um polissacarídeo linear composto por resíduos de glicose ligados por ligações β-1,4. A natureza linear das fibras de celulose, bem como a estequiometria da glicose β-ligada (em relação a α) gera estruturas mais suscetíveis à ligação de hidrogênio interfilamento do que as estruturas α-ligadas altamente ramificadas de amido. Dessa forma, os polímeros de celulose são, em geral, menos solúveis e eram fibras mais firmemente ligadas do que as fibras encontradas no amido. As enzimas que podem ser usadas na invenção são descritas em mais detalhes abaixo.
Monooxigenases líticas de polissacarídeo, endoglucanases (EG) e exocelobiohidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel em produtos como celo-oligossacarídeos (celobiose como um produto principal), enquanto β- glucosidases (BG) convertem os oligossacarídeos, principalmente celobiose e celotriose, em glicose.
A hemicelulose é um polímero complexo, e sua composição varia amplamente com frequência de organismo para organismo e de um tipo de tecido para outro. Em geral, um componente principal de hemicelulose é xilose β-1,4-ligada, um açúcar de cinco carbonos. No entanto, essa xilose é frequentemente ramificada em 0 a 3 e/ou 0 a 2 átomos de xilose, e pode ser substituída por ligações a arabinose, galactose, manose, ácido glucurônico, ácido galacturônico ou por esterificação a ácido acético (e esterificação de ácido ferúlico a arabinose). A hemicelulose também pode conter glucano, o qual é um termo geral para açúcares de seis carbonos β-ligados (como os glucanos e heteroglucanos β-(1,3)(1,4) mencionados anteriormente) e, adicionalmente, glucomananas (em que tanto a glicose quanto a manose estão presentes na cadeia principal linear, ligadas uma à outra por e-ligações).
As xilanases, juntamente a outras enzimas acessórias, por exemplo, α-L-arabinofuranosidases, feruloil e acetilxilano esterases, glucuronidases, e β-xilosidases, catalisam a hidrólise de hemicelulose.
Substâncias pécticas incluem pectinas, arabinanas, galactanas e arabinogalactanas. As pectinas são os polissacarídeos mais complexos na parede celular vegetal. As mesmas se acumulam ao redor de uma cadeia nuclear de unidades de D-ácido galacturônico α(1,4)-ligadas intercaladas até certo grau com L-ramnose. Em qualquer parede celular, há diversas unidades estruturais que são compatíveis com essa descrição, e considerou-se, de forma geral, que, em uma única molécula péctica, as cadeias nucleares de diferentes unidades estruturais são contínuas uma relação às outras. Os principais tipos de unidade estrutural são: galacturonana (homogalacturonana), os quais podem ser substituídos por metanol no grupo carboxila e acetato em O-2 e O-3; ramnogalacturonana I (RGI), em que unidades de ácido galacturônico se alternam com unidades de ramnose que portam cadeias laterais de galactana (1,4)-ligada e arabinana (1,5)- ligada. As cadeias laterais de arabinana podem ser fixadas diretamente a ramnose ou indiretamente através de cadeias de galactana; xilogalacturonana, com unidades individuais de xilosila em O-3 de ácido galacturônico (estreitamente associadas à RGI); e ramnogalacturonana II (RGII), uma unidade menor particularmente complexa que contém açúcares incomuns, por exemplo, apiose. Uma unidade de RGII pode conter dois resíduos de apiosila que, sob condições iônicas adequadas, podem formar de modo reversível ésteres com borato.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção compreendem, de preferência, pelo menos duas atividades, embora as enzimas compreendas tipicamente mais de duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou até mesmo mais atividades. Tipicamente, as enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção compreendem pelo menos duas celulases. As pelo menos duas celulases podem conter as mesmas atividades ou atividades diferentes. As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção também podem compreender pelo menos uma enzima diferente de uma celulase. De preferência, a pelo menos outra enzima tem uma atividade enzimática auxiliar, isto é, uma atividade adicional que, direta ou indiretamente, resulta em degradação de lignocelulose. Exemplos de tais atividades auxiliares são mencionados no presente documento e incluem, porém sem limitação, hemicelulases.
Dessa forma, enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreendem atividade de monooxigenase lítica de polissacarídeo, atividade de endoglucanase e/ou atividade de celobiohidrolase e/ou atividade de beta-glucosidase. As enzimas para uso na invenção podem compreender mais de uma atividade enzimática por classe de atividade. Por exemplo, as enzimas para uso na invenção podem compreender duas atividades de endoglucanase, por exemplo, atividade de endo-1,3(1,4)-β glucanase e atividade de endo-β-1,4-glucanase.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem ser derivadas de um fungo, como um fungo filamentoso, como Rasamsonia, como Rasamsonia emersonii. Em uma modalidade, um conjunto nuclear de atividades enzimáticas (degradadoras de lignocelulose) pode ser derivado de Rasamsonia emersonii. Rasamsonia emersonii pode fornecer um conjunto altamente eficaz de atividades, como demonstrado no presente documento, para a hidrólise de material lignocelulósico. Se necessário, o conjunto de atividades pode ser suplementado com atividades enzimáticas adicionais de outras fontes. Tais atividades adicionais podem ser derivadas de fontes clássicas e/ou produzidas por organismos geneticamente modificados.
As atividades enzimáticas para uso nos processos integrados da presente invenção podem ser termoestáveis. No presente documento, isso significa que a atividade tem um ideal de temperatura de 60 oC ou superior, 70 oC ou superior, 75 oC ou superior, 80 oC ou superior, 85 oC ou superior. As atividades para uso nos processos integrados da presente invenção não terão tipicamente o mesmo ideal de temperatura, porém, de preferência, serão, no entanto, termoestáveis.
Além disso, as atividades enzimáticas para uso nos processos da presente invenção podem ser capazes de funcionar a um baixo pH. Para os propósitos desta invenção, um baixo pH indica um pH de 5,5 ou inferior, 5 ou inferior, 4,9 ou inferior, 4,8 ou inferior, 4,7 ou inferior, 4,6 ou inferior, 4,5 ou inferior, 4,4 ou inferior, 4,3 ou inferior, 4,2 ou inferior, 4,1 ou inferior, 4,0 ou inferior, 3,9 ou inferior, 3,8 ou inferior, 3,7 ou inferior, 3,6 ou inferior, 3,5 ou inferior.
As atividades para uso nos processos integrados da presente invenção podem ser definidas por uma combinação de qualquer um dos valores de temperatura ideal e pH acima.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma celulase e/ou uma hemicelulase e/ou uma pectinase de uma fonte diferente de Rasamsonia. Podem ser usadas juntamente a uma ou mais enzimas de Rasamsonia ou podem ser usadas sem que enzimas de Rasamsonia adicionais estejam presentes.
Por exemplo, as enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma beta-glucosidase (BG) de Aspergillus, como Aspergillus oryzae, como aquela revelada no documento WO 02/095014, ou a proteína de fusão que tem atividade de beta-glucosidase revelada no documento WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, como aquela revelada como SEQ ID NO:2 no documento WO 2005/047499 ou SEQ ID NO:5 no documento WO 2014/130812 ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus, como aquela revelada no documento WO 2012/044915, como aquela com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (com o uso de SEQ ID NO: 5 no documento WO 2014/130812 para numeração), ou Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger ou Aspergillus kawachi. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de Penicillium, como Penicillium brasilianum revelada como SEQ ID NO:2 no documento WO 2007/019442, ou de Trichoderma, como Trichoderma reesei, como aquelas descritas no documento US 6.022.725, US 6.982.159, US 7.045.332, US 7.005.289, US 2006/0258554, US 2004/0102619. Em uma modalidade, até mesmo uma beta-glucosidase bacteriana pode ser usada. Em outra modalidade, a beta-glucosidase é derivada de Thielavia terrestris (documento WO 2011/035029) ou Trichophaea saccata (documento WO 2007/019442).
Por exemplo, as enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma endoglucanase (EG) de Trichoderma, como Trichoderma reesei; de Humicola, como uma cepa de Humicola insolens; de Aspergillus, como Aspergillus aculeatus ou Aspergillus kawachii; de Erwinia, como Erwinia carotovara; de Fusarium, como Fusarium oxysporum; de Thielavia, como Thielavia terrestris; de Humicola, como Humicola grisea var. thermoidea ou Humicola insolens; de Melanocarpus, como Melanocarpus albomyces; de Neurospora, como Neurospora crassa; de Myceliophthora, como Myceliophthora thermophila; de Cladorrhinum, como Cladorrhinum foecundissimum e/ou de Chrysosporium, como uma cepa de Chrysosporium lucknowense. Em uma modalidade, até mesmo uma endoglucanase bacteriana pode ser usada, incluindo, porém sem limitação, endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (consultar os documentos WO 91/05039; WO 93/15186; US 5.275.944; WO 96/02551; US 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III de Thermobifida fusca (consultar documento WO 05/093050); e endoglucanase V de Thermobifida fusca (consultar documento WO 05/093050).
Por exemplo, enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma celobiohidrolase I de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como a Cel7A CBH I revelada em SEQ ID NO:6 no documento WO 2011/057140 ou SEQ ID NO:6 no documento WO 2014/130812, ou de Trichoderma, como Trichoderma reesei.
Por exemplo, enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma celobiohidrolase II de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como aquela em SEQ ID NO:7 no documento WO 2014/130812 ou de Trichoderma, como Trichoderma reesei, ou de Thielavia, como Thielavia terrestris, como celobiohidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris.
Por exemplo, enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender um polipeptídeo GH61 (uma monooxigenase lítica de polissacarídeo) de Thermoascus, como Thermoascus aurantiacus, como aquela descrita no documento WO 2005/074656 como SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:1 no documento WO2014/130812 e no documento WO 2010/065830; ou de
Thielavia, como Thielavia terrestris, como aquela descrita no documento WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO:4 no documento WO2014/130812 e no documento WO 2008/148131, e no documento WO 2011/035027; ou de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus, como aquela descrita no documento WO 2010/138754 como SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO: 3 no documento WO2014/130812; ou de Penicillium, como Penicillium emersonii, como aquela revelada como SEQ ID NO:2 no documento WO 2011/041397 ou SEQ ID NO:2 no documento WO2014/130812. Outros polipeptídeos de GH61 adequados incluem, porém sem limitação, Trichoderma reesei (consultar documento WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (consultar documento WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (consultar documento WO 2011/005867), Thermoascus sp. (consultar documento WO 2011/039319), e Thermoascus crustaceous (consultar documento WO 2011/041504). Em um aspecto, o polipeptídeo GH61é usado na presença de um cátion metálico divalente de ativação solúvel de acordo com o documento WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de manganês. Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 é usado na presença de um composto de dioxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido a partir de um material celulósico pré-tratado, como palha de milho pré-tratada.
Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas nos processos integrados da presente invenção são descritas nos documentos WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, US 5.457.046, US 5.648.263, e US 5,686,593, para citar apenas alguns.
Além disso, exemplos de xilanases úteis nos processos integrados da presente invenção incluem, porém sem limitação, xilanases de Aspergillus aculeatus (consultar documento WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (consultar documento WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (consultar documento WO 2011/041405), Penicillium sp. (consultar documento WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (consultar documento WO 2009/079210), e Trichophaea saccata GH10 (consultar documento WO 2011/057083). Exemplos de beta- xilosidases úteis nos processos integrados da presente invenção incluem, porém sem limitação, beta-xilosidases de Neurospora crassa e Trichoderma reesei. Exemplos de acetilxilano esterases úteis nos processos da presente invenção incluem, porém sem limitação, acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (consultar documento WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (consultar documento WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (consultar documento WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (consultar documento WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum e Thielavia terrestris NRRL 8126 (consultar documento WO 2009/042846). Exemplos de feruloil esterases (ácido ferúlico esterases) úteis nos processos integrados da presente invenção incluem, porém sem limitação, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (consultar documento WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (consultar documento WO 2009/127729), e Thielavia terrestris (consultar documento WO 2010/053838 e WO 2010/065448). Exemplos de arabinofuranosidases úteis nos processos integrados da presente invenção incluem, porém sem limitação, arabinofuranosidases de Aspergillus niger, Humicola insolens DSM 1800 (consultar documento WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (consultar documento WO 2006/114094). Exemplos de alfa-glucuronidases úteis nos processos da presente invenção incluem, porém sem limitação, alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (consultar documento WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (consultar documento WO 2009/068565) e Trichoderma reesei.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma, duas, três, quatro classes ou mais de celulase, por exemplo, uma, duas, três ou quatro ou todas dentre uma monooxigenase lítica de polissacarídeo (LPMO), uma endoglucanase (EG), uma ou duas exo- celobiohidrolases (CBH) e uma beta-glucosidase(BG). As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender duas ou mais de qualquer uma dessas classes de celulase.
Enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender um tipo de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por enzimas, como descrito no presente documento, e um segundo tipo de atividade de celulase e/ou atividade de hemicelulase e/ou atividade de pectinase fornecida por uma celulase/hemicelulase/pectinase adicional.
Como usado no presente documento, uma celulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar celulose. Um polipeptídeo que é capaz de degradar celulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de ruptura da celulose em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em celodextrinas, ou completamente em monômeros de glicose. Uma celulase de acordo com a invenção pode resultar em uma população mista de celodextrinas e monômeros de glicose. Tal degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.
As mono-oxigenases líticas de polissacarídeo (LPMO) são recentemente classificadas por CAZy na família AA9 (Família de Atividade Auxiliar 9) ou família AA10 (Família de Atividade Auxiliar 10). Como mencionado acima, as mono- oxigenases líticas de polissacarídeo são capazes de abrir uma estrutura cristalina de glucano. As mono-oxigenases líticas de polissacarídeo também podem afetar os celo- oligossacarídeos. As proteínas de GH61 (família de glicosídeo hidrolase 61 ou, por vezes, denominada EGIV) são mono- oxigenases (líticas) de polissacarídeo dependentes de oxigênio (PMOs/LPMOs) de acordo com a literatura mais recente (consultar Isaksen et al., Journal of Biological Chemistry, vol. 289, n° 5, páginas 2632-2642). PMO e LPMO são usadas no presente documento de modo alternado. Frequentemente na literatura, essas proteínas são mencionadas por melhorarem a ação de celulases em substratos de lignocelulose. A GH61 foi originalmente classificada como endoglucanase com base na medição de uma atividade de endo-1,4-β-d-glucanase muito fraca em um membro da família. O termo "GH61", como usado no presente documento, deve ser compreendido como uma família de enzimas, a qual compartilha porções de sequência conservada comuns e dobramento a ser classificado na família 61 do sistema de classificação de CAZy GH bem estabelecido (http://www.cazy.org/GH61.html). A família de glicosídeo hidrolase 61 é um membro da família de glicosídeo hidrolases EC 3.2.1. As GH61 foram recentemente reclassificadas atualmente como CAZy na família AA9 (Família de Atividade Auxiliar 9). A GH61 é usada no presente documento como sendo parte das celulases.
A CBM33 (módulo de ligação de carboidrato da família 33) é uma monooxigenase lítica de polissacarídeo (consultar Isaksen et al, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, n° 5, páginas 2632-2642), A CAZy foi recentemente reclassificada como CBM33 em AA10 (Família de Atividade Auxiliar 10).
Como usado no presente documento, uma hemicelulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar hemicelulose. Ou seja, uma hemicelulase pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mais dentre xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanana e xiloglucano. Um polipeptídeo que é capaz de degradar uma hemicelulose é aquele que é capaz de catalisar o processo de ruptura da hemicelulose em polissacarídeos menores, parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, ou completamente em monômeros de açúcar, por exemplo, monômeros de açúcar hexose ou pentose. Uma hemicelulase de acordo com a invenção pode resultar em uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Tal degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.
Como usado no presente documento, uma pectinase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar pectina. Um polipeptídeo que é capaz de degradar pectina é aquele que é capaz de catalisar o processo de ruptura da pectina em unidades menores, parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, ou completamente em monômeros de açúcar. Uma pectinase de acordo com a invenção pode resultar em uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Tal degradação ocorrerá tipicamente por meio de uma reação de hidrólise.
Consequentemente, as enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender qualquer celulase, por exemplo, uma monooxigenase lítica de polissacarídeo (por exemplo, GH61), uma celobiohidrolase, uma endo-β-1,4-glucanase, uma beta-glucosidase ou uma β- (1,3)(1,4)-glucanase.
Como usado no presente documento, uma celobiohidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações 1,4-β-D-glucosidicas em celulose ou celotetraose, liberando celobiose das extremidades das cadeias. Essa enzima também pode ser denominada como celulase 1,4-β-celobiosidase, 1,4-β- celobiohidrolase, 1,4-β-D-glucano celobiohidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D-glucanase, exocelobiohidrolase ou exoglucanase.
Como usado no presente documento, uma endo-β-1,4- glucanase (EC 3.2.1.4) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de 1,4-e-D-ligações glucosídicas em celulose, liquenina ou β-D-glucanos de cereal. Tal polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar 1,4-ligações em β-D-glucanos que também contêm 1,3-ligações. Essa enzima também pode ser denominada como celulase, avicelase, β-1,4- endoglucano hidrolase, β-1,4-glucanase, carboximetil celulase, celudextrinase, endo-1,4-β-D-glucanase, endo-1,4-β- D-glucanohidrolase, endo-1,4-β-glucanase ou endoglucanase.
Como usado no presente documento, uma β-xilosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-glicose não redutora terminal com liberação de β-D-glicose. Tal polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β-D-glucosideos e também podem hidrolisar um ou mais dentre os seguintes: um β-D- galactosídeo, um α-L-arabinosideo, um β-D-xilosideo ou um β- D-fucosídeo. Essa enzima também pode ser denominada como amigdalase, β-D-glucosideo glucohidrolase, celobiase ou gentobiase.
Como usado no presente documento, uma β-(1,3)(1,4)- glucanase (EC 3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de 1,4-e-D-ligações glucosídicas em β-D-glucanos que contêm 1,3- e 1,4-ligações. Tal polipeptídeo pode atuar em liquenina e β-D-glucanos de cereal, porém, não em β-D-glucanos que contêm apenas 1,3- ou 1,4-ligações. Essa enzima também pode ser denominada como liqueninase, 1,3-1,4- β-D-glucano 4-glucanohidrolase, β-glucanase, endo-β-1,3-1,4 glucanase, liquenase ou β-glucanase de ligação mista. Uma alternativa para esse tipo de enzima é EC 3.2.1.6, a qual é descrita como endo-1,3(4)-beta-glucanase. Esse tipo de enzima hidrolisa 1,3- ou 1,4-ligações em beta-D-glucanose quando o resíduo de glicose cujo grupo redutor é envolvido na ligação a ser hidrolisada é substituído em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, laminarinase, 1,3-(1,3;1,4)- beta-D-glucano 3 (4) glucanohidrolase. Substratos incluem laminarina, liquenina e beta-D-glucanos de cereal.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender qualquer hemicelulase, por exemplo, uma endoxilanase, uma β-xilosidase, uma α-L- arabionofuranosidase, uma α-D-glucuronidase, uma acetil xilano esterase, uma feruloil esterase, uma coumaroil esterase, uma α-galactosidase, uma β-galactosidase, uma β- mananase ou uma β-manosidase.
Como usado no presente documento, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endohidrólise de 1,4-β-D-ligaQδes xilosídicas em xilanos. Essa enzima também pode ser denominada como endo-1,4-β- xilanase ou 1,4-β-D-xilano xilanohidrolase. Uma alternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilano endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar 1,4 ligações xilosídicas em glucuronoarabinoxilanos.
Como usado no presente documento, uma β-xilosidase (EC 3.2.1.37) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D-xilanos, para remover resíduos sucessivos de D-xilose dos terminais não redutores. Tais enzimas também podem hidrolisar xilobiose. Essa enzima também pode ser denominada como xilano 1,4-β-xilosidase, 1,4-β-D- xilano xilohidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.
Como usado no presente documento, uma α-L- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de atuar em α-L-arabinofuranosideos, α-L-arabinanos que contêm (1,2) e/ou (1,3)- e/ou (1,5)-ligações, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Essa enzima também pode ser denominada como α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.
Como usado no presente documento, uma α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da seguinte forma: alfa-D-glucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Essa enzima também pode ser denominada como alfa-glucuronidase ou alfa- glucosiduronase. Essas enzimas também podem hidrolisar 4-O- ácido glucorônico metilado, o qual também pode estar presente como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC 3.2.1.131: xilano alfa-1,2-glucuronosidase, o qual catalisa a hidrólise de ligações de alfa-1,2-(4-O-metil)glucuronosila.
Como usado no presente documento, uma acetil xilano esterase (EC 3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a desacetilação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Tal polipeptídeo pode catalisar a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, alfa-acetato de naftila ou p-acetato de nitrofenila, porém, tipicamente, não de triacetilglicerol. Tal polipeptídeo tipicamente não atua em manana acetilada ou pectina.
Como usado no presente documento, uma feruloil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo + H2O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode catalisar tipicamente a hidrólise do grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoila (feruloila) de um açúcar esterificado, o qual é usualmente arabinose em substratos "naturais". O p-acetado de nitrofenol e o ferulato de metila são tipicamente substratos mais pobres. Essa enzima também pode ser denominada como cinamoil éster hidrolase, ácido ferúlico esterase ou hidroxicinamoil esterase. Também pode ser denominada como uma enzima acessória hemicelulase, já que auxiliar xilanases e pectinases a romper a hemicelulose e a pectina da parede da célula vegetal.
Como usado no presente documento, uma coumaroil esterase (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: coumaroil-sacarídeo + H(2)O = coumarato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Essa enzima também pode ser denominada como trans-4-coumaroil esterase, trans-p- coumaroil esterase, p-coumaroil esterase ou p-ácido coumárico esterase. Essa enzima também está abrangida em EC 3.1.1.73, então, também pode ser denominada como uma feruloil esterase.
Como usado no presente documento, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-D-galactose não redutora terminal em a-D-galactosídeos, incluindo galactose oligossacarídeos, galactomananas, galactanas e arabinogalactanas. Tal polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar a-D-fucosídeos. Essa enzima também pode ser denominada como melibiase.
Como usado no presente documento, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-galactose não redutora terminal em e-D-galactosídeos. Tal polipeptídeo também pode ser capaz de hidrolisar a-L-arabinosídeos. Essa enzima também pode ser denominada como exo-(1->4)-β-D- galactanase ou lactase.
Como usado no presente documento, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de 1,4-e-D-ligações manosídicas em mananas, galactomananas e glucomananas. Essa enzima também pode ser denominada como manana endo-1,4-β-manosidase ou endo-1,4-mananase.
Como usado no presente documento, uma β-manosidase(EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-manose não redutora terminal em e-D-manosídeos. Essa enzima também pode ser denominada como mananase ou manase.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender qualquer pectinase, por exemplo, uma endopoligalacturonase, uma pectina metil esterase, uma endo-galactanase, uma beta galactosidase, uma pectina acetil esterase, uma endo-pectina liase, pectato liase, alfa- ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma expoligalacturonato liase, uma ramnogalacturonana hidrolase, uma ramnogalacturonana liase, uma ramnogalacturonana acetil esterase, uma ramnogalacturonana galacturonohidrolase, uma xilogalacturonase.
Como usado no presente documento, uma endo- poligalacturonase (EC 3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de 1,4-a-D-ligações galactosidurônicas em pectato e outras galacturonanas. Essa enzima também pode ser denominada como poligalacturonase pectina depolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pectolase, pectina hidrolase, pectina poligalacturonase, poli-a-1,4-galacturonídeo glicanohidrolase, endogalacturonase; endo-D-galacturonase ou poli(1,4-α-D- galacturonídeo) glicanohidrolase.
Como usado no presente documento, uma pectina metil esterase (EC 3.1.1.11) é qualquer enzima que é capaz de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima também pode ser conhecida como pectinesterase, pectina demetoxilase, pectina metoxilase, pectina metilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectina pectilhidrolase.
Como usado no presente documento, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endohidrólise de 1,4-e-D-ligações galactosídicas em arabinogalactanas. A enzima também pode ser conhecida como arabinogalactana endo-1,4-β-galactosidase, endo-1,4-β- galactanase, galactanase, arabinogalactanase ou arabinogalactana 4-β-D-galactanohidrolase.
Como usado no presente documento, uma pectina acetil esterase é definida no presente documento como qualquer enzima que tem uma atividade de acetil esterase que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila de resíduos de GalUA de pectina.
Como usado no presente documento, uma endo-pectina liase (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de éster metílico de (1-»4)-α-D-galacturonana para produzir oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-6-O-metil- α-D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras.
A enzima também pode ser conhecida como pectina liase, pectina trans-eliminase; endo-pectina liase, transeliminase polimetilgalacturônica, pectina metiltranseliminase, pectoliase, PL, PNL ou PMGL ou (1-»4)-6-O-metil-α-D- galacturonana liase.
Como usado no presente documento, uma pectato liase (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de (1-»4)-α-D-galacturonana para produzir oligossacarídeos com grupos 4-desoxi-α-D-galact-4-enuronosila em suas extremidades não redutoras. A enzima também pode ser conhecida como transeliminase poligalacturônica, ácido péctico transeliminase, poligalacturonato liase, endopectina metiltranseliminase, pectato transeliminase, endogalacturonato transeliminase, ácido péctico liase, liase péctica, a-1,4-D-ácido endopoligalacturônico liase, PGA liase, PPase-N, endo-a-1,4-ácido poligalacturônico liase, ácido poligalacturônico liase, pectina trans-eliminase, ácido poligalacturônico trans-eliminase ou (1-»4)-α-D-galacturonana liase.
Como usado no presente documento, uma alfa-ramnosidase (EC 3.2.l.40) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-L-ramnose não redutora terminal em a-L-ramnosídeos ou, de modo alternativo, em ramnogalacturonana. Essa enzima também pode ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L-ramnosidase N ou a-L-ramnosídeo ramnohidrolase.
Como usado no presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.l.82) é qualquer polipeptídeo capaz de hidrólise de ácido péctico da extremidade não redutora, liberando digalacturonato. A enzima também pode ser conhecida como exo- poli-α-galacturonosidase, exopoligalacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.
Como usado no presente documento, exo-galacturonase (EC 3.2.l.67) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar: (l,4-α- D-galacturonídeo)n + H2O = (1,4-a-D-galacturonídeo)n-1 + D- galacturonato. A enzima também pode ser conhecida como galacturana 1,4-α-galacturonidase, exopoligalacturonase, poli(galacturonato) hidrolase, exo-D-galacturonase, exo-D- galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(1,4-α-D- galacturonídeo) galacturonohidrolase.
Como usado no presente documento, exopoligalacturonato liase (EC 4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar clivagem eliminativa de 4-(4-desoxi-α-D-galact-4-enuronosil)- D-galacturonato da extremidade redutora de pectato, isto é, pectina desesterificada. Essa enzima pode ser conhecida como pectato dissacarídeo-liase, pectato exo-liase, ácido exopéctico transeliminase, exopectato liase, ácido exopoligalacturônico-trans-eliminase, PATE, exo-PATE, exo-PGL ou (l-*4)-α-D-galacturonana extremidade-redutora-disacarídeo- liase.
Como usado no presente documento, ramnogalacturonana hidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar a ligação entre ácido galactosilurônico e ramnopiranosila de uma maneira endo em estruturas de ramnogalacturonana estritamente alternantes, as quais consistem no dissacarídeo [(l,2-alfa-L-ramnoil-(l,4)-alfa-ácido galactosilurônico].
Como usado no presente documento, ramnogalacturonana liase é qualquer polipeptídeo que é capaz de clivar α-L-Rhap- (l-»4)-a-D-ligações Gal pA de uma maneira endo em ramnogalacturonana por beta-eliminação.
Como usado no presente documento, ramnogalacturonana acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da cadeia principal de resíduos alternantes de ramnose e ácido galacturônico em ramnogalacturonana.
Como usado no presente documento, a ramnogalacturonana galacturonohidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar ácido galacturônico da extremidade não redutora de estruturas de ramnogalacturonana estritamente alternantes de uma maneira exo.
Como usado no presente documento, xilogalacturonase é qualquer polipeptídeo que atua em xilogalacturonana clivando a cadeia principal de ácido galacturônico substituída por β- xilose de uma maneira endo. Essa enzima também pode ser conhecida como xilogalacturonana hidrolase.
Como usado no presente documento, uma α-L- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de atuar em a-L-arabinofuranosídeos, α-L-arabinanos que contêm (1,2) e/ou (1,3)- e/ou (1,5)-ligações, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Essa enzima também pode ser denominada como α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosidase ou arabinosidase.
Como usado no presente documento, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar endohidrólise de 1,5-a-ligações arabinofuranosídicas em 1,5- arabinanas. A enzima também pode ser conhecida como endo- arabinase, arabinana endo-1,5-α-L-arabinosidase, endo-1,5-α- L-arabinanase, endo-α-1,5-arabanase; endo-arabanase ou 1,5-α- L-arabinana 1,5-α-L-arabinanohidrolase.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção compreenderão tipicamente pelo menos duas celulases e opcionalmente pelo menos uma hemicelulase e opcionalmente pelo menos uma pectinase. As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma monooxigenase lítica de polissacarídeo (como GH61), uma celobiohidrolase, uma endoglucanase e/ou uma betaglucosidase. Tais enzimas também podem compreender uma ou mais hemicelulases e/ou uma ou mais pectinases.
Além disso, uma ou mais (por exemplo, duas, três, quatro ou todas) dentre uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase, uma glucuronidase, uma expansina, uma proteína induzida por celulose ou uma proteína de integração de celulose ou proteína similar podem estar presentes nas enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção (essas são denominadas como atividades auxiliares acima).
"Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações peptídicas (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções químicas, como açúcares (glicopeptidases). Muitas proteases são caracterizadas sob EC 3.4 e são adequadas para uso nos processos da presente invenção. Alguns tipos específicos de proteases incluem cisteína proteases que incluem pepsina, papaína e serina proteases, incluindo quimotripsinas, carboxipeptidases e metaloendopeptidases.
"Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídeos, ácidos graxos, e acilglicerídeos, incluindo fosfoglicerídeos, lipoproteínas, diacilgliceróis e similares. Em plantas, lipídios são usados como componentes estruturais para limitar a perda de água e a infecção por patógeno. Esses lipídios incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cutina e suberina.
"Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou romper a estrutura de polímeros de lignina. As enzimas que podem romper a lignina incluem lignina peroxidases, manganês peroxidases, lacases e feruloil esterases, e outras enzimas descritas na técnica conhecida por despolimerizar ou, de outro modo, romper os polímeros de lignina. Também são incluídas enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (a saber, arabinose) e lignina. As ligninases incluem, porém sem limitação, o seguinte grupo de enzimas: lignina peroxidases (EC 1.11.1.14), manganês peroxidases (EC 1.11.1.13), lacases (EC 1.10.3.2) e feruloil esterases (EC 3.1.1.73).
“Hexosiltransferase” (2.4.1-) inclui enzimas que são capazes de catalisar uma reação de transferase, porém que também podem catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, de celulose e/ou produtos de degradação de celulose. Um exemplo de uma hexosiltransferase que pode ser usada na invenção é uma β-glucanosiltransferase. Tal enzima pode ser capaz de catalisar a degradação de (1,3)(1,4)glucano e/ou celulose e/ou um produto de degradação de celulose.
"Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucoronosídeo, por exemplo, β-glucuronosideo, para produzir um álcool. Muitas glucuronidases foram caracterizadas e podem ser adequadas para uso na invenção, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialurono- glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), glicirrizinato β-glucuronidase (3.2.1.128) ou α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma expansina ou proteína semelhante à expansina, como uma swolenina (consultar Salheimo et al., Eur. J. Biochem. 269, 4202-4211, 2002) ou uma proteína semelhante à swolenina.
As expansinas são implicadas na perda da estrutura da parede celular durante o crescimento da célula vegetal. As expansinas foram propostas para romper a ligação de hidrogênio entre celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Desse modo, crê-se que permitem o deslizamento de fibras de celulose e a ampliação da parede celular. A swolenina, uma proteína semelhante à expansina, contém um domínio de Família 1 de Módulo de Ligação ao Carboidrato (CBD) N-terminal e um domínio semelhante à expansina C-terminal. Para os propósitos desta invenção, uma proteína semelhante à expansina ou proteína semelhante à swolenina pode compreender um ou ambos os tais domínios e/ou pode romper a estrutura de paredes celulares (como romper a estrutura de celulose), opcionalmente, sem produzir quantidades detectáveis de açúcares redutores.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem compreender uma proteína induzida por celulose, por exemplo, o produto de polipeptídeo do gene cip1 ou cip2 ou genes similares (consultar Foreman et al., J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), uma proteína de integração de celulose/celulossoma, por exemplo, o produto de polipeptídeo do gene cipA ou cipC, ou uma escafoldina ou uma proteína semelhante à escafoldina. As escafoldinas e proteínas de integração de celulose são subunidades de integração multifuncionais que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo multienzima. Isso é realizado pela interação de duas classes de domínio complementares, isto é, um domínio de coesão em escafoldina e um domínio de dockerina em cada unidade enzimática. A subunidade de escafoldina também porta um módulo de ligação de celulose (CBM) que media a fixação da celulossoma a seu substrato. Uma escafoldina ou proteína de integração de celulose para os propósitos desta invenção pode compreender um ou ambos os tais domínios.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção também podem compreender uma catalase. O termo "catalase" significa um peróxido de hidrogênio: peróxido de hidrogênio oxidoredutase (EC 1.11.1.6 ou EC 1.11.1.21) que catalisa a conversão de dois peróxidos de hidrogênio em oxigênio e duas águas. A atividade da catalase pode ser determinada monitorando-se a degradação de peróxido de hidrogênio a 240 nm com base na reação a seguir: 2H2O2 ^ 2H2O + O2. A reação é conduzida em fosfato 50 mM, pH 7,0, a 25 °C com substrato 10,3 mM (H202) e aproximadamente 100 unidades de enzima por ml. A absorbância é monitorada espectrofotometricamente em 16-24 segundos, o que deve corresponder a uma redução de absorbância de 0,45 a 0,4. Uma unidade de atividade de catalase pode ser expressa como um micromol de H202 degrado por minuto a pH 7,0 e 25 °C.
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem ser compostas por um membro de cada uma das classes de enzimas mencionadas acima, diversos membros de uma classe de enzima, ou qualquer combinação dessas classes de enzimas ou proteínas auxiliares (isto é, aquelas proteínas mencionadas no presente documento que não têm atividade enzimática per se, porém, no entanto, auxiliam na degradação lignocelulósica).
As enzimas para uso nos processos integrados da presente invenção podem ser compostas por enzimas de (1) fornecedores comerciais; (2) genes clonados que expressam enzimas; (3) caldo (como aquele resultante do crescimento de uma cepa microbiana em meios, sendo que as cepas secretam proteínas e enzimas nos meios; (4) lisados celulares de cepas desenvolvidas como em (3); e/ou (5) material vegetal que expressa enzimas. Diferentes enzimas podem ser obtidas a partir de diferentes fontes.
As enzimas podem ser produzidas exogenamente em micro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, então, isoladas e adicionadas, por exemplo, a material lignocelulósico (pré-tratado). Alternativamente, a enzima pode ser produzida em uma fermentação que usa material lignocelulósico (pré-tratado) (como palha de milho ou palha de trigo) para fornecer nutrição a um organismo que produz uma enzima (ou enzimas). Desse modo, as próprias plantas que produzem as enzimas podem funcionar como um material lignocelulósico e podem ser adicionadas ao material lignocelulósico.
Nos usos e processos descritos no presente documento, as enzimas descritas acima podem ser fornecidas simultaneamente (isto é, em uma única composição de enzimas) ou separada ou sequencialmente.
Em uma modalidade, as enzimas estão na forma de um caldo de fermentação integral. O caldo de fermentação integral pode ser preparado a partir de fermentação de fungos filamentosos não recombinantes e/ou recombinantes. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante que compreende um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo filamentoso. Em uma modalidade, o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante que compreende um ou mais genes que podem ser homólogos ou heterólogos ao fungo filamentoso em que os um ou mais genes codificam enzimas que podem degradar um substrato celulósico. O caldo de fermentação integral pode compreender qualquer um dos polipeptídeos ou qualquer combinação dos mesmos.
De preferência, a composição de enzimas é o caldo de fermentação integral em que as células são exterminadas. O caldo de fermentação integral pode conter ácido orgânico (ou ácidos orgânicos) (usados para exterminar as células), células exterminadas e/ou resíduos celulares, e meio de cultura.
Em geral, os fungos filamentosos são cultivados em um meio de cultura celular adequado para a produção de enzimas capazes de hidrolisar um substrato celulósico. O cultivo ocorre em um meio de nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, com o uso de procedimentos conhecidos na técnica. Os meios de cultura adequados, as faixas de temperatura e outras condições adequadas para crescimento e produção de celulase e/ou hemicelulase e/ou pectinase são conhecidos na técnica. O caldo de fermentação integral pode ser preparado cultivando- se os fungos filamentosos em fase estacionária e mantendo-se os fungos filamentosos sob condições de carbono limitantes por um período de tempo suficientes para expressar as uma ou mais celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases. Após as enzimas, como celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases, serem secretadas pelos fungos filamentosos no meio de fermentação, o caldo de fermentação integral pode ser usado. O caldo de fermentação integral da presente invenção pode compreender fungos filamentosos. Em algumas modalidades, o caldo de fermentação integral compreende os conteúdos não fracionados dos materiais de fermentação derivados no final da fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação integral compreende o meio de cultura utilizado e resíduos celulares presentes após os fungos filamentosos terem se desenvolvido até a saturação, incubados sob condições de carbono limitantes para permitir a síntese de proteína (particularmente, expressão de celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases). Em algumas modalidades, o caldo de fermentação integral compreende o meio de cultura celular utilizado, as enzimas extracelulares e fungos filamentosos. Em algumas modalidades, os fungos filamentosos presentes no caldo de fermentação integral podem ser lisados, permeabilizados ou exterminados com o uso de métodos conhecidos na técnica para produzir um caldo de fermentação integral com células exterminadas. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral é um caldo de fermentação integral com células exterminadas, sendo que o caldo de fermentação integral que contém as células de fungos filamentosos é lisado ou exterminado. Em algumas modalidades, as células são exterminadas lisando-se os fungos filamentosos por tratamento químico e/ou de pH para gerar o caldo integral com células exterminadas de uma fermentação dos fungos filamentosos. Em algumas modalidades, as células são exterminadas lisando-se os fungos filamentosos por tratamento químico e/ou de pH e ajustando-se o pH da mistura de fermentação com células exterminadas a um pH adequado. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um primeiro componente de ácido orgânico que compreende pelo menos um ácido orgânico de 1-5 carbonos e/ou um sal do mesmo e um segundo componente de ácido orgânico que compreende ácido orgânico com pelo menos 6 ou mais carbonos e/ou um sal do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um sal do mesmo, ou qualquer combinação dos mesmos e o segundo componente de ácido orgânico é ácido benzoico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido 4-metilvalérico, ácido fenilacético, um sal do mesmo, ou qualquer combinação desses.
O termo "caldo de fermentação integral" como usado no presente documento se refere a uma preparação produzida por fermentação celular que é submetida a nenhuma recuperação e/ou purificação ou a uma recuperação e/ou purificação mínima. Por exemplo, caldos de fermentação integrais são produzidos quando culturas microbianas são cultivadas até a saturação, incubadas sob condições de carbono limitantes para permitir síntese de proteína (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção em meio de cultura celular. Tipicamente, o caldo de fermentação integral é não fracionado e compreende meio de cultura celular utilizado, enzimas extracelulares e células microbianas, de preferência, não viáveis.
Se necessário, o caldo de fermentação integral pode ser fracionado e o um ou mais dos conteúdos fracionados podem ser usados. Por exemplo, as células exterminadas e/ou resíduos celulares podem ser removidos de um caldo de fermentação integral para fornecer uma composição que é livre desses componentes.
O caldo de fermentação integral pode compreender, ainda, um conservante e/ou agente antimicrobiano. Tais conservantes e/ou agentes são conhecidos na técnica.
O caldo de fermentação integral, como descrito no presente documento, é tipicamente um líquido, porém pode conter componentes insolúveis, como células exterminadas, resíduos celulares, componentes de meios de cultura, e/ou enzima insolúvel (ou enzimas insolúveis). Em algumas modalidades, os componentes insolúveis podem ser removidos para fornecer um caldo de fermentação integral clareado.
Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral pode ser suplementado com uma ou mais atividades enzimáticas que não são expressas endogenamente, ou expressas a um nível relativamente baixo pelos fungos filamentosos, para melhorar a degradação do substrato celulósico, por exemplo, em açúcares fermentáveis, como glicose ou xilose. A enzima suplementar (enzimas suplementares) pode ser adicionada como um suplemento ao caldo de fermentação integral e as enzimas podem ser um componente de um caldo de fermentação integral separado, ou podem ser purificadas, ou minimamente recuperadas e/ou purificadas.
Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso recombinante que superexpressa uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Alternativamente, o caldo de fermentação integral pode compreender uma mistura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso não recombinante e um fungo filamentoso recombinante que superexpressa uma ou mais enzimas para melhorar a degradação do substrato celulósico. Em uma modalidade, o caldo de fermentação integral compreende um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso que superexpressa beta-glucosidase. Alternativamente, o caldo de fermentação integral para uso nos presentes métodos e composições reativas pode compreender uma mistura de um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso não recombinante e um caldo de fermentação integral de uma fermentação de um fungo filamentoso recombinante que superexpressa uma beta-glucosidase.
As enzimas estão presentes na etapa de liquefação e na etapa de sacarificação da hidrólise enzimática. Essas enzimas podem ser iguais ou podem ser diferentes. Além disso, como descrito anteriormente, as enzimas adicionais são adicionadas durante a etapa de liquefação e a etapa de sacarificação dos processos integrados de acordo com a presente invenção. As enzimas adicionadas podem ser enzimas que já estão presentes na etapa de liquefação e na etapa de sacarificação. Alternativamente, podem ser enzimas diferentes. Além disso, as enzimas adicionais adicionadas durante a etapa de liquefação podem diferir ou pode ser igual às enzimas adicionais adicionadas durante a etapa de sacarificação dos processos integrados de acordo com a presente invenção.
O material lignocelulósico como usado no presente documento inclui qualquer material lignocelulósico e/ou hemicelulósico. O material lignocelulósico adequado para uso nos processos da presente invenção inclui biomassa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não virgem como biomassa agrícola, orgânicos comerciais, detritos de construção e demolição, refugo sólido urbano, papel residual e resíduos orgânicos. Formas comuns de biomassa incluem árvores, arbustos e gramas, trigo, palha de trigo, cana-de- açúcar, palha de cana-de-açúcar, bagaço de cana-de-açúcar, switch grass, miscanthus, cana-de-açúcar para produção de energia, milho, palha de milho, cascas de milho, espigas de milho, caules de canola, caules de soja, sorgo sacarino, grão de milho, incluindo fibra de grãos, produtos e subprodutos da moagem de grãos, como milho, trigo e cevada (incluindo moagem a úmido e moagem a seco) frequentemente denominados “farelo ou fibra”, bem como refugo sólido urbano, papel residual e resíduos orgânicos. A biomassa também pode ser, porém sem limitação, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, refugos sólidos urbanos, papel residual, e resíduos de moinho de papel e polpa. "Biomassa agrícola" inclui ramos, matas, talos, milho e cascas de milho, cultura para produção de energia, florestas, frutas, flores, grãos, gramas, culturas herbáceas, folhas, casca, acículas, toras, raízes, mudas, culturas lenhosas de curta rotação, arbustos, switch grasses, árvores, vegetais, cascas de furtas, videiras, polpa de beterraba sacarina, triguilhos, cascas de aveia, e madeiras rígidas e moles (não incluindo madeiras com materiais prejudiciais). Além disso, biomassa agrícola inclui materiais de refugo orgânico gerado em processos agrícolas, incluindo atividades de agricultura e silvicultura, incluindo especificamente refugo de madeira florestal. A biomassa agrícola pode ser qualquer uma daquelas mencionadas acima individualmente ou em qualquer combinação ou mistura das mesmas. Em uma modalidade preferencial, o material lignocelulósico é bagaço de cana-de-açúcar ou palha de cana- de-açúcar.
A celulose é um composto orgânico com a fórmula (C6H10O5)n, um polissacarídeo que consiste em uma cadeia linear de diversas centenas a mais de dez mil unidades de D- glicose β(1^4) ligadas. Uma molécula de glucano é um polissacarídeo de monômeros de D-glicose ligados por ligações glicosídicas. No presente documento, glucano e celulose são usados de modo alternado para um polissacarídeo de monômeros de D-glicose ligados por ligações glicosídicas. Métodos para a análise quantitativa de composições de glucano ou polissacarídeo são bem conhecidas e descritas na técnica e estão, por exemplo, resumidos em Carvalho de Souza et al.,
Carbohydrate Polymers 95 (2013) 657-663. Em geral, 50 a 70 % do glucano é celulose cristalina, o restante é celulose amorfa.
Em uma modalidade, o material lignocelulósico é pré- tratado antes e/ou durante a hidrólise enzimática. Os métodos de pré-tratamento são conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitação, modificação térmica, mecânica, química, modificação biológica e qualquer combinação das mesmas. O pré-tratamento é tipicamente realizado a fim de melhorar a acessibilidade do material lignocelulósico à hidrólise enzimática e/ou hidrolisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, no material lignocelulósico. Em uma modalidade, o pré-tratamento compreende tratar o material lignocelulósico com explosão de vapor, tratamento com água quente ou tratamento com ácido diluído ou base diluída. Exemplos de métodos de pré- tratamento incluem, porém sem limitação, tratamento de vapor (por exemplo, tratamento a 100-260 °C, a uma pressão de 700 4500 Kpa (7-45 bar), a um pH neutro, por 1-10 minutos), tratamento de ácido diluído (por exemplo, tratamento com 0,1 - 5 % de H2SO4 e/ou SO2 e/ou HNO3 e/ou HCl, na presença ou ausência de vapor, a 120-200 °C, a uma pressão de 200-1500 Kpa (2-15 bar), a um pH ácido, por 2-30 minutos), tratamento de organosolv (por exemplo, tratamento com 1 - 1,5 % de H2SO4 na presença de solvente orgânico e vapor, a 160-200 °C, a uma pressão de 700-3000 Kpa (7-30 bar), a um pH ácido, por 30-60 minutos), tratamento de cal (por exemplo, tratamento com 0,1 - 2 % de NaOH/Ca(OH)2 na presença de água/vapor a 60-160 °C, a uma pressão de 100-1000 Kpa (1-10 bar), a um pH alcalino, por 60-4800 minutos), tratamento de ARP (por exemplo, tratamento com 5 - 15 % de NH3, a 150-180 °C, a uma pressão de 900-1700 Kpa (9-17 bar), a um pH alcalino, por 10-90 minutos), tratamento de AFEX (por exemplo, tratamento com > 15 % de NH3, a 60-140 °C, a uma pressão de 800-2000 Kpa (8-20 bar), a um pH alcalino, por 5-30 minutos).
O material lignocelulósico pode ser lavado. Em uma modalidade, o material lignocelulósico pode ser lavado antes e/ou após o pré-tratamento. A etapa de lavagem pode ser realizada antes e/ou após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico e/ou do material lignocelulósico pré-tratado. Se realizado após a separação de sólido/líquido, a fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido pode ser lavada. A etapa de lavagem pode ser usada para remover compostos solúveis em água que podem atuar como inibidores para a etapa de fermentação e/ou hidrólise. A etapa de lavagem pode ser conduzida de uma maneira conhecida pela pessoa versada na técnica. Após a lavagem, existem outros métodos de desintoxicação. O material lignocelulósico pré-tratado também pode ser desintoxicado por qualquer um (ou qualquer combinação) desses métodos que incluem, porém sem limitação, separação de sólido/líquido, evaporação a vácuo, extração, adsorção, neutralização, sobredosagem de cal, adição de agentes redutores, adição de enzimas desintoxicantes, como lacases ou peroxidases, adição de micro-organismos capazes de desintoxicação de hidrolisados.
As enzimas usadas nos processos integrados da invenção pode hidrolisar de modo extremamente eficaz o material lignocelulósico, por exemplo, palha de milho, palha de trigo, palha de cana-de-açúcar, e/ou bagaço de cana-de-açúcar, o qual pode ser, então, adicionalmente convertido em um produto, como etanol, biogás, butanol, um plástico, um ácido orgânico, como ácido succínico, um solvente, um suplemento de ração animal, um produto farmacêutico, uma vitamina, um aminoácido, uma enzima ou uma matéria-prima química. Adicionalmente, produtos intermediários de um processo após a hidrólise, por exemplo, ácido láctico como intermediário em produção de biogás, podem ser usados como elemento estrutural para outros materiais. A presente invenção é exemplificada com a produção de etanol e ácido succínico, porém isso é realizado como exemplificação apenas, em vez de limitação, os outros produtos mencionados podem ser produzidos de forma igualmente satisfatória.
Em uma modalidade, a quantidade de enzima adicionada (no presente documento também denominada dosagem de enzima ou carga de enzima) é baixa. Em uma modalidade, a quantidade de enzima é de 10 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou menos, 9 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou menos, 8 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou menos, 7 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou menos, 6 mg de proteína / g de peso de matéria seca ou menos, 5 mg de proteína / g de matéria seca ou menos, 4 mg de proteína / g de matéria seca ou menos, 3 mg de proteína / g de matéria seca ou menos, 2 mg de proteína / g de matéria seca ou menos, ou 1 mg de proteína / g de matéria seca ou menos (expresso como proteína em mg de proteína / g de matéria seca). Em uma modalidade, a quantidade de enzima é de 5 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 4 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 3 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 2 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 1 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 0,5 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 0,4 mg de composição enzimática / g de peso de matéria seca ou menos, 0,3 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 0,25 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 0,20 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 0,18 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos, 0,15 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos ou 0,10 mg de enzima / g de peso de matéria seca ou menos (expressos como total de enzimas celulase em mg de enzima / g de matéria seca). Uma baixa dosagem de enzima é possível, devido à atividade e à estabilidade das enzimas. Quando a hidrólise enzimática compreende uma etapa de liquefação e uma etapa de sacarificação separadas, a enzima pode ser adicionada antes e/ou durante apenas uma das etapas ou antes e/ou durante ambas as etapas.
O pH durante a hidrólise enzimática pode ser escolhido pela pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, o pH durante a hidrólise pode ser de 3,0 a 6,4. As enzimas estáveis da invenção podem ter uma ampla faixa de pH de até 2 unidades de pH, até 3 unidades de pH, até 5 unidades de pH. O pH ideal está entre os limites de pH 2,0 a 8,0, 2,5 a 7,5, 3,0 a 7,0, 3,5 a 6,5, 4,0 a 5,0, 4,0 a 4,5 ou é de cerca de 4,2. O pH usado na etapa de liquefação da hidrólise enzimática e a etapa de sacarificação da hidrólise enzimática podem diferir ou podem ser iguais. No caso em que diferentes enzimas são usadas durante a etapa de liquefação e a etapa de sacarificação, o pH ideal das ditas enzimas podem diferir ou podem ser iguais.
Em uma modalidade, a etapa de hidrólise é conduzida até que 70 % ou mais, 80 % ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 92% ou mais, 95 % ou mais de açúcar disponível no material lignocelulósico sejam liberados.
De modo significativo, um processo da invenção pode ser realizado com o uso de altos níveis de matéria seca (do material lignocelulósico) na reação de hidrólise. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da hidrólise enzimática é de 5 % em peso ou superior, 6 % em peso ou superior, 7 % em peso ou superior, 8 % em peso ou superior, 9 % em peso ou superior, 10 % em peso ou superior, 11 % em peso ou superior, 12 % em peso ou superior, 13 % em peso ou superior, 14 % em peso ou superior, 15 % em peso ou superior, 16 % em peso ou superior, 17 % em peso ou superior, 18 % em peso ou superior, 19 % em peso ou superior, 20 % em peso ou superior, 21 % em peso ou superior, 22 % em peso ou superior, 23 % em peso ou superior, 24 % em peso ou superior, 25 % em peso ou superior, 26 % em peso ou superior, 27 % em peso ou superior, 28 % em peso ou superior, 29 % em peso ou superior, 30 % em peso ou superior, 31 % em peso ou superior, 32 % em peso ou superior, 33 % em peso ou superior, 34 % em peso ou superior, 35 % em peso ou superior, 36 % em peso ou superior, 37 % em peso ou superior, 38 % em peso ou superior ou 39 % em peso ou superior. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da hidrólise enzimática está entre 5 % em peso - 40 % em peso, 6 % em peso - 40 % em peso, 7 % em peso - 40 % em peso, 8 % em peso - 40 % em peso, 9 % em peso - 40 % em peso, 10 % em peso - 40 % em peso , 11 % em peso - 40 % em pes o, 12 % em peso - 40 % em peso , 13 % em peso - 40 % em peso, 14 % em peso - 40 % em peso , 15 % em peso - 40 % em peso, 16 % em peso - 40 % em peso, 17 % em peso - 40 % em peso, 18 % em peso - 40 % em peso, 19 % em peso - 40 % em peso, 20 % em peso - 40 % em peso, 21 % em peso - 40 % em peso, 22 % em peso - 40 % em peso, 23 % em peso - 40 % em peso, 24 % em peso - 40 % em peso, 25 % em peso - 40 % em peso, 26 % em peso - 40 % em peso, 27 % em peso - 40 % em peso, 28 % em peso - 40 % em peso, 29 % em peso - 40 % em peso, 30 % em peso - 40 % em peso, 31 % em peso - 40 % em peso, 32 % em peso - 40 % em peso, 33 % em peso - 40 % em peso, 34 % em peso - 40 % em peso, 35 % em peso - 40 % em peso, 36 % em peso - 40 % em peso, 37 % em peso - 40 % em peso, 38 % em peso - 40 % em peso, 39 % em peso - 40 % em pes o.
Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de liquefação da hidrólise enzimática é de 5 % em peso ou superior, 6 % em peso ou superior, 7 % em peso ou superior, 8 % em peso ou superior, 9 % em peso ou superior, 10 % em peso ou superior, 11 % em peso ou superior, 12 % em peso ou superior, 13 % em peso ou superior, 14 % em peso ou superior, 15 % em peso ou superior, 16 % em peso ou superior, 17 % em peso ou superior, 18 % em peso ou superior, 19 % em peso ou superior, 20 % em peso ou superior, 21 % em peso ou superior, 22 % em peso ou superior, 23 % em peso ou superior, 24 % em peso ou superior, 25 % em peso ou superior, 26 % em peso ou superior, 27 % em peso ou superior, 28 % em peso ou superior, 29 % em peso ou superior, 30 % em peso ou superior, 31 % em peso ou superior, 32 % em peso ou superior, 33 % em peso ou superior, 34 % em peso ou superior, 35 % em peso ou superior, 36 % em peso ou superior, 37 % em peso ou superior, 38 % em peso ou superior ou 39 % em peso ou superior. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de liquefação da hidrólise enzimática está entre 5 % em peso - 40 % em peso, 6 % em peso - 40 % em peso, 7 % em peso - 40 % em peso, 8 % em peso - 40 % em peso , 9 % em peso - 40 % em peso, 10 % em peso - 40 % em peso, 11 % em peso - 40 % em peso, 12 % em peso - 40 % em peso, 13 % em peso - 40 % em peso, 14 % em peso - 40 % em peso, 15 % em peso - 40 % em peso, 16 % em peso - 40 % em peso, 17 % em peso - 40 % em peso, 18 % em peso - 40 % em peso, 19 % em peso - 40 % em peso, 20 % em peso - 40 % em peso, 21 % em peso - 40 % em peso, 22 % em peso - 40 % em peso, 23 % em peso - 40 % em peso, 24 % em peso - 40 % em peso, 25 % em peso - 40 % em peso, 26 % em peso - 40 % em peso, 27 % em peso - 40 % em peso, 28 % em peso - 40 % em peso, 29 % em peso - 40 % em peso, 30 % em peso - 40 % em peso, 31 % em peso - 40 % em peso, 32 % em peso - 40 % em peso, 33 % em peso - 40 % em peso, 34 % em peso - 40 % em peso, 35 % em peso - 40 % em peso, 36 % em peso - 40 % em peso, 37 % em peso - 40 % em peso, 38 % em peso - 40 % em peso, 39 % em peso - 40 % em peso.
Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de sacarificação da hidrólise enzimática é de 5 % em peso ou superior, 6 % em peso ou superior, 7 % em peso ou superior, 8 % em peso ou superior, 9 % em peso ou superior, 10 % em peso ou superior, 11 % em peso ou superior, 12 % em peso ou superior, 13 % em peso ou superior, 14 % em peso ou superior, 15 % em peso ou superior, 16 % em peso ou superior, 17 % em peso ou superior, 18 % em peso ou superior, 19 % em peso ou superior, 20 % em peso ou superior, 21 % em peso ou superior, 22 % em peso ou superior, 23 % em peso ou superior, 24 % em peso ou superior, 25 % em peso ou superior, 26 % em peso ou superior, 27 % em peso ou superior, 28 % em peso ou superior, 29 % em peso ou superior, 30 % em peso ou superior, 31 % em peso ou superior, 32 % em peso ou superior, 33 % em peso ou superior, 34 % em peso ou superior, 35 % em peso ou superior, 36 % em peso ou superior, 37 % em peso ou superior, 38 % em peso ou superior ou 39 % em peso ou superior. Em uma modalidade, o teor de matéria seca ao final da etapa de sacarificação da hidrólise enzimática está entre 5 % em peso - 40 % em peso , 6 % em peso - 40 % em peso, 7 % em peso - 40 % em peso , 8 % em peso - 40 % em peso, 9 % em peso - 40 % em peso, 10 % em peso - 40 % em peso, 11 % em peso - 40 % em peso, 12 % em peso - 40 % em peso, 13 % em peso - 40 % em peso, 14 % em peso - 40 % em peso, 15 % em peso - 40 % em peso, 16 % em peso - 40 % em peso, 17 % em peso - 40 % em peso, 18 % em peso - 40 % em peso, 19 % em peso - 40 % em peso, 20 % em peso - 40 % em peso, 21 % em peso - 40 % em peso, 22 % em peso - 40 % em peso, 23 % em peso - 40 % em peso, 24 % em peso - 40 % em peso, 25 % em peso - 40 % em peso, 26 % em peso - 40 % em peso, 27 % em peso - 40 % em peso, 28 % em peso - 40 % em peso, 29 % em peso - 40 % em peso, 30 % em peso - 40 % em peso, 31 % em peso - 40 % em peso, 32 % em peso - 40 % em peso, 33 % em peso - 40 % em peso, 34 % em peso - 40 % em peso, 35 % em peso - 40 % em peso, 36 % em peso - 40 % em peso, 37 % em peso - 40 % em peso, 38 % em peso - 40 % em peso, 39 % em peso - 40 % em peso.
Em uma modalidade, as etapas de fermentação nos processos integrados de acordo com a presente invenção são realizadas em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, a fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool é realizada em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, a fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico é realizada em um ou mais recipientes. A fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool pode ser realizada no mesmo recipiente (ou recipientes) em que a hidrólise enzimática é realizada. Alternativamente, a fermentação da pelo menos uma fração sólida e/ou da pelo menos uma fração líquida por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool e a fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida por um micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir um ácido orgânico podem ser realizadas in um ou mais •recipientes separados, porém também podem ser realizadas em um ou mais dentre os mesmos recipientes.
Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5 e pelo menos um açúcar C6. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool e o micro-organismo produtor de ácido orgânico são micro-organismos diferentes. Em outra modalidade, o micro-organismo produtor de álcool e o micro-organismo produtor de ácido orgânico são o mesmo micro-organismo, isto é, o micro-organismo produtor de álcool também é capaz de produzir ácido orgânico, como ácido succínico. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool e/ou o micro-organismo produtor de ácido orgânico são uma levedura.
Em um aspecto adicional, a invenção inclui, então, processos de fermentação em que um micro-organismo é usado para a fermentação de uma fonte de carbono que compreende açúcar (ou açúcares), por exemplo, glicose, L-arabinose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer oligo- ou polímero de carboidrato que compreende unidades de L- arabinose, xilose ou glicose, como, por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinana e similares. Para a liberação de unidades de xilose ou glicose de tais carboidratos, carboidrases adequadas (como xilanases, glucanases, amilases e similares) podem ser adicionadas ao meio de fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para produzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional do uso de fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que permite a que se mantenha uma concentração baixa (ou mais baixa) de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, com o uso de quantidades limitantes de taxa dos carboidrases. Isso, por sua vez, irá impedir a repressão de sistemas exigidos para o metabolismo e o transporte de açúcares diferentes de glicose, como xilose. Em um processo preferencial, a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente, xilose) quanto a glicose, de preferência, simultaneamente, sendo que, em tal caso, de preferência, uma célula hospedeira modificada é usada, a qual é insensível à repressão de glicose para impedir crescimento diáuxico. Além de uma fonte de L-arabinose, opcionalmente, xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação irá compreender, ainda, o ingrediente adequado exigido para o crescimento da célula hospedeira modificada. As composições de meios de fermentação para o crescimento de micro-organismos, como leveduras ou fungos filamentosos, são bem conhecidas na técnica.
O tempo de fermentação pode ser mais curto do que na fermentação convencional nas mesmas condições, em que parte da hidrólise enzimática ainda tem que ocorrer durante a fermentação. Em uma modalidade, o tempo de fermentação é de 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 70 horas ou menos, ou 60 horas ou menos, para uma composição de açúcar de 50 g/l de glicose e outros açúcares correspondentes do material lignocelulósico (por exemplo, 50 g/l de xilose, 35 g/l de L-arabinose e 10 g/l de galactose). Para obter composições de açúcar diluídas, o tempo de fermentação pode ser proporcionalmente reduzido. Em uma modalidade, o tempo de fermentação da etapa de produção de etanol está entre 10 e 50 horas para o etanol composto por açúcares C6 e entre 20 e 100 horas para etanol composto por açúcares C5. Em uma modalidade, o tempo de fermentação da etapa de produção de ácido succínico está entre 20 e 70 horas.
O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é, no presente documento, definido como um processo de fermentação executado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, de preferência, menos que 5, 2,5 ou 1 mmol/l/h, mais preferencialmente, 0 mmol/l/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável), e em que moléculas orgânicas funcionam como doador de elétrons e aceptores de elétrons. Na ausência de oxigênio, o NADH produzido em glicólise e formação de biomassa não pode ser oxidado por fosforilação oxidativa. Para solucionar esse problema, muitos micro-organismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de elétrons e hidrogênio, recuperando, desse modo, NAD+. Dessa forma, em um •processo de fermentação anaeróbico preferencial, o piruvato é usado como um elétron (e aceptor de hidrogênio) e é reduzido a produtos de fermentação, como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidroxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, um aminoácido, 1,3-propano- diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico de β-lactama e uma cefalosporina. Em uma modalidade preferencial, o processo de fermentação é anaeróbico. Um processo anaeróbico é vantajoso, já que é menos dispendioso do que processos aeróbicos: menos equipamento especial é necessário. Além disso, espera-se que processos anaeróbicos resultem em um maior rendimento de produto do que os processos aeróbicos. Sob condições aeróbicas, usualmente, o rendimento de biomassa é maior do que sob condições anaeróbicas. Como consequência, usualmente sob condições aeróbicas, o rendimento de produto esperado é menor do que sob condições anaeróbicas.
Em outra modalidade, o processo de fermentação está sob condições de oxigênio limitado. Mais preferencialmente, o processo de fermentação é aeróbico e ocorre sob condições de oxigênio limitado. Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e pela composição do fluxo de gás entrante, bem como as propriedades reais de transferência de massa/mistura do equipamento de fermentação usado. De preferência, em um processo sob condições de oxigênio limitado, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos 5,5, mais preferencialmente, pelo menos 6 e, ainda mais preferencialmente, pelo menos 7 mmol/l/h.
Em uma modalidade, o processo de fermentação de álcool é anaeróbico, enquanto o processo de fermentação de ácido orgânico é aeróbico, porém é realizado sob condições de oxigênio limitado. O processo de fermentação é, de preferência, executado a uma temperatura que é ideal para a célula modificada. Dessa forma, para a maioria das células fúngicas ou de leveduras, o processo de fermentação é realizado a uma temperatura que é menor do que 42 °C, de preferência, 38 °C ou menor. Para células hospedeiras fúngicas filamentosas ou de levedura, o processo de fermentação é, de preferência, realizado a uma temperatura que é menor do que 35, 33, 30 ou 28 °C e a uma temperatura que é maior que 20, 22 ou 25°C. Em uma modalidade, a etapa de fermentação de álcool e a etapa de fermentação de ácido orgânico são realizadas entre 25 °C e 35 °C.
Em uma modalidade da invenção, as fermentações são conduzidas com um micro-organismo de fermentação. Em uma modalidade da invenção, as fermentações de álcool (por exemplo, etanol) de açúcares C5 são conduzidas com um micro-organismo de fermentação de C5. Em uma modalidade da invenção, as fermentações de álcool (por exemplo, etanol) de açúcares C6 são conduzidas com um micro-organismo de fermentação de C5 ou um micro-organismo de fermentação de C6 comercial. A levedura comercialmente disponível adequada para produção de etanol inclui, porém sem limitação, BIOFERM™ AFT e XR (NABC—North American Bioproducts Corporation, GA, EUA), levedura ETHANOL RED™ (Fermentis/Lesaffre, EUA), FALI™ (Fleischmann's Yeast, EUA), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, EUA). Em uma modalidade, as fermentações são realizadas em um ou mais recipientes. Em uma modalidade, as fermentações são realizadas nos um ou mais recipientes de fermentação. Em uma modalidade, a propagação do micro-organismo produtor de álcool e/ou do micro-organismo produtor de ácido orgânico através de fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida é realizada em um ou mais recipientes de propagação. Após a propagação, o micro-organismo produtor de álcool e/ou o micro-organismo produtor de ácido orgânico pode ser adicionado aos um ou mais recipientes de fermentação. Alternativamente, a propagação do micro-organismo produtor de álcool e/ou do micro-organismo produtor de ácido orgânico é combinada à fermentação da pelo menos uma fração líquida e/ou da pelo menos uma fração sólida pelo micro-organismo produtor de álcool e/ou pelo micro-organismo produtor de ácido orgânico para produzir álcool e/ou ácido orgânico, respectivamente.
Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de álcool é um micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5. De preferência, também é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6. Em uma modalidade, a invenção se refere a um processo integrado que compreende a produção de etanol, em que o processo compreende a etapa de fermentar um meio que contém açúcar (ou açúcares) com um micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5.
Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico é um micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6. Em uma modalidade, a invenção se refere a um processo integrado para a produção de ácido succínico, em que o processo compreende a etapa de fermentar um meio que contém açúcar (ou açúcares) com um micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6.
Os micro-organismos produtores de álcool podem ser um organismo procarionte ou eucarionte. O micro-organismo usado no processo pode ser um micro-organismo geneticamente modificado. Exemplos de organismos produtores de álcool adequados são leveduras, por exemplo, Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus ou Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, por exemplo, Issatchenkia orientalis, Pichia, por exemplo, Pichia stipites ou Pichia pastoris, Kluyveromyces, por exemplo, Kluyveromyces fagilis, Candida, por exemplo, Candida pseudotropicalis ou Candida acidothermophilum, Pachysolen, por exemplo, Pachysolen tannophilus ou bacteria, por exemplo, Lactobacillus, por exemplo, Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, por exemplo, Zymomonas mobilis, Clostridium, por exemplo, Clostridium phytofermentans, Escherichia, por exemplo, E. coli, Klebsiella, por exemplo, Klebsiella oxytoca. Em uma modalidade, o micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de preferência, da espécie Saccharomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de acordo com a presente invenção é capaz de converter açúcares hexose (C6) e açúcares pentose (C5). A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de acordo com a presente invenção podem fermentar anaerobicamente pelo menos um açúcar C6 e pelo menos um açúcar C5. Por exemplo, a levedura é capaz de usar L-arabinose e xilose, além de glicose, anaerobicamente. Em uma modalidade, a levedura é capaz de converter L-arabinose em L-ribulose e/ou 5-fosfato de xilulose e/ou em u m produto de fermentação desejado, por exemplo, em etanol. Organismos, por exemplo, cepas de Saccharomyces cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidos modificando-se uma levedura hospedeira que introduz os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloglioxalato) e araD (L-ribulose-5- P4-epimerase) a partir de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula hospedeira a fim de que essa seja capaz de usar arabinose. Tal abordagem é dada como descrito no documento WO2003/095627. Os genes araA, araB e araD de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são revelados no documento WO2008/041840. O gene araA de Bacillus subtilis e os genes araB e araD de Escherichia coli podem ser usados e são revelados no documento EP1499708. Em outra modalidade, os genes araA, araB e araD podem ser derivados de pelo menos um dentre o gênero Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular, um dentre Clavibacter michiganensis, Arthrobacter aurescens e/ou Gramella forsetii, como revelado no documento WO 2009011591. Em uma modalidade, a levedura também pode compreender uma ou mais cópias degene de xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias de xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase.
A levedura pode compreender uma ou mais modificações genéticas para permitir que a levedura fermente a xilose. Exemplos de modificações genéticas consistem em introdução de um ou mais dentre gene xylA, gene XYL1 e gene XYL2 e/ou gene XKS1; deleção do gene de aldose redutase (GRE3); superexpressão dos genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através do caminho de fosfato de pentose na célula. Exemplos de levedura geneticamente modificada são descritos nos documentos EP1468093 e/ou WO2006/009434.
Um exemplo de uma levedura comercial adequada e RN1016 que é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae que fermenta xilose e glicose de DSM, Holanda.
Em uma modalidade, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbico. Anaeróbico já foi definido anteriormente no presente documento. Em outra modalidade preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbico. Em outra modalidade preferencial, o processo de fermentação para a produção de etanol ocorre sob condições de oxigênio limitado, mais preferencialmente, aeróbico e sob condições de oxigênio limitado. As condições de oxigênio limitado já foram definidas anteriormente no presente documento.
A produtividade volumétrica de etanol é, de preferência, de pelo menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 5,0 ou 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em L- arabinose e, opcionalmente, xilose e/ou glicose no processo é, de preferência, de pelo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 98 %. O rendimento de etanol é definido, no presente documento, como uma porcentagem do rendimento máximo teórico, o qual, para glicose e L-arabinose e, opcionalmente, xilose é de 0,51 g de etanol por g de glicose ou xilose.
Em um aspecto, o processo de fermentação que resulta na produção de etanol, tem diversas vantagens em comparação aos processos de fermentações de etanol conhecidos: processos anaeróbicos são possíveis; condições de oxigênio limitado são possíveis; maiores rendimentos de etanol e taxas de produção de etanol podem ser obtidos; a cepa usada pode ser capaz de usar L-arabinose e, opcionalmente, xilose.
Alternativamente aos processos de fermentação descritos acima, pelo menos duas células distintas podem ser usadas, isso significa que esse processo é um processo de cofermentação. Todas as modalidades preferenciais dos processos de fermentação, como descrito acima, também são modalidades preferenciais desse processo de cofermentação: identidade do produto de fermentação, identidade de fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbicas ou anaeróbicas, condições de oxigênio limitado, temperatura na qual o processo está sendo realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol).
Os micro-organismos produtores de ácido orgânico podem ser um organismo procarionte ou eucarionte. O micro-organismo usado no processo pode ser um micro-organismo geneticamente modificado. Exemplos de organismos produtores de ácido orgânico adequados são leveduras, por exemplo, Saccharomyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae; fungos, por exemplo, cepas de Aspergillus, como Aspergillus niger e Aspergillus fumigatus, Byssochlamys nivea, Lentinus degener, Paecilomyces varioti e Penicillium viniferum; e bactérias, por exemplo, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannhei succiniciproducers MBEL 55E, Escherichia coli, espécie Propionibacterium, Pectinatus sp., Bacteroides sp., como Bacteroides amylophilus, Ruminococcus flavefaciens, Prevotella ruminicola, Succcinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinisolvens, Wolinella succinogenes e Cytophaga succinicans. Em uma modalidade, o micro-organismo produtor de ácido orgânico que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6 é uma levedura. Em uma modalidade, a levedura pertence ao gênero Saccharomyces, de preferência, da espécie Saccharomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de produção de ácido orgânico de acordo com a presente invenção é capaz de converter açúcares de hexose (C6). A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos de acordo com a presente invenção podem fermentar anaerobicamente pelo menos um açúcar C6.
Os processos de fermentação podem ser realizados sem qualquer exigência de ajustar o pH durante os processos. Ou seja, os processos são aqueles que podem ser realizados sem a adição de qualquer ácido (ou ácidos) ou base (ou bases). No entanto, isso exclui uma etapa de pré-tratamento, em que ácido pode ser adicionado. O ponto é que as enzimas usadas nos processos da invenção são capazes de atuar a um baixo pH e, portanto, não há nenhuma necessidade de ajustar o pH de ácido de uma matéria-prima ácida pré-tratada a fim de que a hidrólise ocorra. Consequentemente, os processos da invenção podem ser processos de refugo zero com o uso apenas de produtos orgânicos sem nenhuma exigência de insumo químico inorgânico.
O tempo total de reação (ou o tempo de reação da etapa de hidrólise e da etapa de fermentação juntas) pode ser reduzido. Em uma modalidade, o tempo total de reação é de 300 horas ou menos, 200 horas ou menos, 150 horas ou menos, 140 horas ou menos, 130 ou menos, 120 horas ou menos, 110 horas ou menos, 100 horas ou menos, 90 horas ou menos, 80 horas ou menos, 75 horas ou menos, ou cerca de 72 horas a 90 % de rendimento de glicose. Proporcionalmente, tempos totais de reação mais curtos podem ser alcançado a um rendimento de glicose mais baixo.
Outros produtos de fermentação que podem ser produzidos pelos processos integrados da invenção podem ser qualquer substância derivada de fermentação. Incluem, porém sem limitação, álcool (como arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol, e xilitol); ácido orgânico (como ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido acrílico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico, e ácido xilônico); cetonas (como acetona); aminoácidos (como ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, triptofano, e treonina); alcanos (como pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano e dodecano), cicloalcanos (como ciclopentano, ciclohexano, cicloheptano, e ciclooctano), alcenos (como penteno, hexeno, hepteno, e octeno); e gases (como metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser uma proteína, uma vitamina, um produto farmacêutico, um suplemento de ração animal, um produto químico especializado, uma matéria-prima química, um plástico, um solvente, etileno, uma enzima, como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidoredutase, uma transferase ou uma xilanase. Em uma modalidade preferencial, o ácido orgânico é ácido succínico e/ou o álcool é etanol.
Em uma modalidade, o álcool, o ácido orgânico, as enzimas, o micro-organismo produtor de enzima, o micro-organismo produtor de álcool e/ou o micro-organismo produtor de ácido orgânico são recuperados. Os processos integrados de acordo com a invenção compreendem a recuperação de todos os tipos de produtos produzidos durante os processos integrados, incluindo produtos de fermentação, como etanol e ácido succínico. Um produto de fermentação pode ser separado do caldo de fermentação de uma maneira conhecida pela pessoa versada na técnica. Exemplos de técnicas para recuperação incluem, porém sem limitação, cromatografia, procedimento eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Para cada produto de fermentação, a pessoa versada na técnica será, então, capaz de selecionar uma técnica de separação adequada. Por exemplo, o etanol pode ser separado de um caldo de fermentação de levedura por destilação, por exemplo, destilação a vapor/destilação a vácuo de modo convencional.
Em uma modalidade, os processos integrados da invenção também produzem energia, modificação térmica, eletricidade e/ou vapor.
Em uma modalidade, a fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, o refugo obtido após purificação/recuperação do ácido orgânico e/ou os sólidos obtidos após a destilação/recuperação do etanol podem ser usados na produção de eletricidade. A eletricidade pode ser produzida por incineração de qualquer um dos materiais mencionados acima. A eletricidade pode ser usada em qualquer uma das etapas dos processos integrados de acordo com a presente invenção.
Os efeitos benéficos da presente invenção são encontrados para diversos materiais lignocelulósicos e, portanto, acredita-se que estão presentes para a hidrólise de todo os tipos de materiais lignocelulósicos. Esses efeitos benéficos da presente invenção são encontrados para diversas enzimas e, portanto, acredita-se que estejam presentes para todos os tipos de composições enzimáticas de hidrólise. EXEMPLOS Exemplo 1
Processo integrado para produção de álcool e produção de ácido orgânico a partir de material lignocelulósico Uma batelada única de material lignocelulósico pré- tratado foi separada por centrifugação em uma fração sólida e uma fração líquida. A fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico pré-tratado foi lavada para obter uma polpa rica em celulose.
Parte da polpa foi submetida à hidrólise enzimática. Nesse caso, 64 kg de polpa de matéria seca foram hidrolisados em um vaso agitado de 400 litros adicionando-os a uma composição aquosa de 254 litros que contém enzimas celulolíticas de Rasamsonia (que estava a uma temperatura de 62 °C). A primeira dosagem de polpa resultou em 10% em p/p de matéria seca de pH 4,2, a qual foi liquefeita pelas enzimas em 3 horas. A partir daquele momento, porções de 5 kg de polpa de matéria seca foram adicionados a cada hora até que 350 kg de mosto fossem obtidos, enquanto o pH era ajustado a 4,2 com uma solução de amônia a 10 %. A hidrólise foi continuada durante a agitação a 62 °C por mais 4 dias e resultou em um hidrolisado rico em glicose.
O hidrolisado foi centrifugado para obter uma fração sólida e uma fração líquida. A fração sólida foi lavada com água. A água de lavagem foi adicionada à fração líquida e as frações de líquido combinadas foram concentradas por evaporação até que uma fração líquida concentrada final fosse obtida, a qual continha glicose a uma concentração de aproximadamente 450 g/kg.
Parte da fração líquida concentrada foi usada para a propagação de levedura geneticamente modificada que superproduz ácido succínico do gênero Saccharomyces cerevisae. O meio para a propagação da levedura era baseado em meio de glicose Verduyn e continha sulfato de amônio, fosfato de potássio, fosfato de magnésio, elementos traço e vitaminas e 8 g/kg da fração líquida concentrada como fonte de carbono (para o meio Verduyn, consultar Yeast 8, (1992), páginas 201-517). A propagação foi realizada por 68 horas em um vaso agitado a 30 °C com agitação contínua.
A cultura de semente então obtida foi adicionada para inocular um fermentador contendo meio Verduyn com, entre outros componentes, como ureia, biotina e carbonato de cálcio em concentrações definidas. Como fonte de carbono, a fração líquida concentrada foi adicionada alimentado-a durante a duração da fermentação a uma taxa de 16 ml/kg-h. Após 48 horas, a fermentação foi interrompida e o caldo foi centrifugado. O sobrenadante foi submetido à evaporação repetida, cristalização, polimento e secagem, resultando em cristais crus de ácido succínico.
Outra parte da fração líquida concentrada foi usada para propagação de um micro-organismo produtor de enzima e produção de enzimas pelo micro-organismo produtor de enzima. Um fermentador que contém meio mineral com 20 g/kg de concentrado e 40 g/kg de polpa de matéria seca sólida foi inoculado com o fungo Rasamsonia emersonii. Durante a primeira fase do processo de fermentação, também denominado como a fase de crescimento ou fase de propagação, a biomassa fúngica aumenta sem produção de proteína. Na segunda fase do processo de fermentação, também denominada como a fase de produção de enzima, as enzimas são produzidas. A fermentação foi realizada sob condições assépticas a 37 °C pH 6 por 120 horas, enquanto a fração líquida concentrada foi adicionada como alimentação. A concentração final de proteína obtida ao final da fermentação era de 65 g/kg de sobrenadante. O sobrenadante obtido mostrou atividade celulolítica.
Uma parte da fração líquida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico pré-tratado foi misturada com uma parte da fração líquida concentrada para obter uma mistura fermentável. Essa mistura foi fermentada com a cepa Saccharomyces cerevisae que fermenta pentose RN1016 e produziu 5,1 % em p/p de etanol após fermentação por 48 horas a pH 5,5.
Em um experimento separado, o hidrolisado rico em glicose como tal foi fermentado com a cepa Saccharomyces cerevisae RN1016 em uma fermentação de 34 horas a pH 4,2. O rendimento de etanol em açúcares foi de 90 %.
Exemplo 2
Processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico Uma batelada única de material lignocelulósico pré- tratado foi separada por centrifugação em uma fração sólida e uma fração líquida. A fração líquida foi armazenada a 4 °C até o uso na produção de etanol (consultar abaixo). A fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico pré-tratado foi lavada para obter uma polpa rica em celulose.
Parte da polpa foi submetida à hidrólise enzimática. Nesse caso, 64 kg de polpa de matéria seca foram hidrolisados em um vaso agitado de 400 litros adicionando-os a uma composição aquosa de 254 litros que contém enzimas celulolíticas de Rasamsonia (que estava a uma temperatura de 62 °C). A primeira dosagem de polpa resultou em 10% em p/p de matéria seca de pH 4,2, a qual foi liquefeita pelas enzimas em 3 horas. A partir daquele momento, porções de 5 kg de polpa de matéria seca foram adicionados a cada hora até que 350 kg de mosto fossem obtidos, enquanto o pH era ajustado a 4,2 com uma solução de amônia a 10 %. A hidrólise foi continuada durante a agitação a 62 °C por mais 4 dias e resultou em um hidrolisado rico em glicose.
O hidrolisado rico em glicose foi centrifugado para obter uma fração sólida e uma fração líquida. A fração sólida foi lavada com água. A água de lavagem foi adicionada à fração líquida e as frações de líquido combinadas foram concentradas por evaporação até que uma fração líquida concentrada final fosse obtida, a qual continha glicose a uma concentração de aproximadamente 450 g/kg.
A fração líquida obtida após o pré-tratamento do material lignocelulósico foi dividida em quatro porções iguais. A primeira porção foi mantida como tal (porção não diluída) e fermentada como tal. A segunda porção foi diluída a 70 % em p/p de sua concentração original com água e foi fermentada. A terceira porção foi diluída a 70 % em p/p com 13 % em p/p de fração líquida concentrada e 17 % em p/p água e foi fermentada. A quarta porção foi diluída a 70 % em p/p com 20 % em p/p de fração líquida concentrada e 10 % em p/p água e foi fermentada.
As porções foram fermentadas com a cepa Saccharomyces cerevisae que fermenta pentose RN1016 por 48 horas a pH 5,5 para produzir etanol e a concentração de etanol foi medida com o uso de HPLC. A concentração de etanol medida é expressa como % em p/p de material fermentado ao final da fermentação. Os resultados são mostrados na Tabela 1.
A Tabela 1 mostra que diluir a fração líquida obtida após o pré-tratamento do material lignocelulósico resulta em um maior rendimento de etanol. A Tabela 1 também mostra que rendimentos de produção de etanol ainda maiores obtidos quando a fração líquida obtida após o pré-tratamento do material lignocelulósico foi diluída com uma fração líquida concentrada obtida após a separação de sólido/líquido do hidrolisado em comparação a quando a fração líquida obtida após o pré-tratamento do material lignocelulósico foi diluída com água apenas.
Exemplo 3
Processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico O exemplo é realizado essencialmente como descrito no Exemplo 2 desde que a diluição não seja feita com a fração líquida concentrada, porém com a fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do hidrolisado. A fração sólida contém açúcares solúveis residuais (cerca de 17 % em p/p de sólidos totais na fração sólida) que são aprisionados na fração de açúcar insolúvel remanescente e na lignina presente na fração sólida.
A fração líquida é diluída a 70 % em p/p com a fração sólida. A diluição com a fração sólida resulta em uma maior concentração de etanol (cerca de 4 % em p/p de etanol).
Exemplo 4
Processo integrado para produção de enzimas por um micro-organismo produtor de enzima Uma batelada única de material lignocelulósico pré- tratado foi separada por centrifugação em uma fração sólida e uma fração líquida. A fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico pré-tratado foi lavada para obter sólidos ricos em celulose.
Parte dos sólidos foi usada como um substrato (denominado substrato A) para induzir a produção de enzima. Outra parte dos sólidos foi submetida à hidrólise enzimática como descrito no Exemplo 1. O hidrolisado obtido após a hidrólise enzimática foi centrifugado para obter uma fração sólida e uma fração líquida. A fração sólida (denominada substrato B) foi lavada com água e usada para induzir a produção de enzima.
A água de lavagem foi adicionada à fração líquida e a fração líquida resultante foi concentrada por evaporação até que uma fração líquida concentrada final fosse obtida, a qual continha glicose a uma concentração de aproximadamente 450 g/kg.
A fração líquida concentrada foi usada como uma fonte de carbono em dois processos de produção de enzima no fungo Rasamsonia. Em um processo, o substrato A foi usado como indutor de produção de enzima, enquanto, no outro processo, o substrato B foi usado como um indutor de produção de enzima. Os processos de produção consistiam em uma fase de crescimento e uma fase de produção de enzima. Ao final da fase de produção de enzima, a quantidade de enzima presente na fração líquida do caldo de fermentação foi determinada com o uso de um ensaio de determinação de proteína padrão e se mostrou ser de um nível comparável (50 +/- 5 g/l), demonstrando que tanto a fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido do material lignocelulósico pré- tratado como tal quanto a fração sólida obtida após a separação de sólido/líquido de um hidrolisado enzimático podem ser usadas como indutoras em produção de enzima. Tabela 1: Produção de etanol após uma fermentação de 48 horas de porções diluídas e não diluídas.

Claims (12)

1. Processo integrado para produção de álcool a partir de material lignocelulósico e produção de enzima, sendo que o processo é caracterizado por compreender: (a) pré-tratamento do material lignocelulósico por modificação térmica, mecânica, química, ou biológica para obtenção de um material lignocelulósico pré-tratado; (b) hidrólise enzimática do material lignocelulósico pré- tratado da etapa (a) para obter o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado, em que o oxigênio é adicionado durante a hidrólise, (c) separação de sólido/líquido do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado da etapa (b) para obter uma fração sólida e uma fração líquida, (d) fermentação de uma parte da fração sólida e/ou de uma parte da fração líquida da etapa (c) por um micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, (e) propagação do micro-organismo produtor de álcool através de fermentação de uma parte do material lignocelulósico pré-tratado da etapa (a) e uma parte da fração líquida e/ou de uma parte da fração sólida da etapa (d) pelo micro-organismo produtor de álcool para produzir álcool, em que o micro-organismo produtor de álcool é capaz de fermentar um açúcar C5 e um açúcar C6, (f) propagação de um fungo, e produção de enzimas pelo fungo, em que uma parte do material lignocelulósico pré- tratado da etapa (a) é usado na propagação do fungo e/ou na produção de enzimas pelo fungo e em que as enzimas produzidas pelo fungo são usadas na hidrólise enzimática da etapa (b).
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma parte do material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado da etapa (b) e uma parte do material lignocelulósico são usadas na propagação do fungo e/ou na produção de enzimas pelo fungo.
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática da etapa (b) compreende: - uma etapa de liquefação em que o material lignocelulósico pré-tratado é hidrolisado em um primeiro recipiente, e - uma etapa de sacarificação em que o material liquefeito lignocelulósico da etapa anterior é hidrolisado no primeiro recipiente e/ou em um segundo recipiente.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o álcool, as enzimas, o fungo e/ou o micro-organismo produtor de álcool são recuperados.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o material lignocelulósico pré-tratado da etapa (a) é submetido a uma separação de sólido/líquido antes da hidrólise enzimática.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o fungo da etapa (f) é Rasamsonia.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as enzimas da etapa (f) estão na forma de um caldo de fermentação integral.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o microorganismo produtor de álcool da etapa (d) é uma levedura.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo produtor de álcool é Saccharomyces cerevisiae.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o material lignocelulósico enzimaticamente hidrolisado da etapa (b) compreende um teor de matéria seca de 5% em peso, em relação ao peso total.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que álcool é etanol.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a hidrólise enzimática da etapa (b) e a fermentação da etapa (d) são combinadas.
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