PT1319079E - Xilanases de talaromyces - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "XILANASES DE TALAROMYCES" Área da Invenção A presente invenção relaciona-se com novas xilanases, tais como aquelas das xilanases de Talaromyces e o seu uso na degradação do xilano na celulose. As xilanases encontram uso na panificação, na ração animal (para melhorar a conversão da ração) e na produção de papel.

Antecedentes da invenção A composição da parede celular vegetal é complexa e variável e contém vários biopolímeros de carboidratos. Os polissacarideos são principalmente encontrados na forma de longas cadeias de celulose (o principal componente estrutural da parede celular vegetal), de hemicelulose (compreendendo várias cadeias de β-xilano, tais como xiloglucanos), de pectina e de lignina. As hemiceluloses mais abundantes são os xilanos e os seus derivados tais como arabinoxilano e xiloglucano.

As hemiceluloses vegetais incluem o xilano, o arabinoxilano, o glucuronoarabinoxilano e o xiloglucano. 0 xilano (Registo CAS no. 9014-63-5) consiste de uma coluna vertebral de unidades de D-xilanopiranosilo β-l,4-ligadas, opcionalmente substituídas com cadeias laterais tais como arabinose e/ou resíduos de ácido glucurónico. A estrutura é: -A) -β-D-Xilp- (1 -A) -β-D-Xilp (2<-lA) - (1-4) -β-D-Xilp- (1^4) -β-D-Xilp(3<-lB) - (1- 2 (Xilp = unidade de xilopiranosilo; A = unidade de cx-(4-0)-metilo-(D-glucuronopiranosilo), por vezes um acetilo; e B = unidade de a-(L-arabinofuranosilo), por vezes um acetilo).

Os xilanos podem representar mais do que 30% do peso seco de plantas terrestres. Por isso o xilano é um importante componente de materiais de fontes naturais que são usados em processos industriais variando entre panificação, melhoria da conversão de ração animal e produção de papel.

Existem diferenças básicas entre monocotiledóneas (e.g. cereais e gramineas) e dicotiledóneas (e.g. trevo, colza e soja) e entre a semente e as partes vegetativas da planta. As monocotiledóneas são caracterizadas pela presença de um complexo de arabinoxilano como a principal coluna vertebral da hemicelulose, e a principal estrutura da hemicelulose nas dicotiledóneas é um complexo de xiloglucano. São encontradas concentrações mais altas de pectina em dicotiledóneas do que em monocotiledóneas. As sementes são geralmente elevadas nas substâncias peptidicas mas relativamente baixas no material celulósico.

Enzimas que degradam a celulose são usadas para o processamento de material vegetal em alimentos bem como aplicações de ração ou como um aditivo de alimentos ou de ração devido à sua capacidade de atuar sobre os principais substituintes da parede celular vegetal. A maioria das enzimas que degradam a celulose disponíveis para a indústria parecem ser xilanases com um peso molecular relativamente baixo e uma estabilidade moderada a temperaturas mais altas. No entanto, para certas aplicações, é desejável usar uma xilanase com uma 3 termoestabilidade relativamente alta. Se uma xilanase é para ser usada como um aditivo de ração animal, então uma termoestabilidade alta é preferencial devido às condições de temperatura alta aplicadas durante a peletização da ração animal.

Sumário da Invenção

Uma nova xilanase é agora proporcionada, a qual é capaz de clivar o β-D-xilano tal como o presente no material vegetal. A xilanase pode também ser capaz de hidrolisar o arabinoxilano (ou ter atividade de arabinoxilanase) e um arilo^-D-xilopiranosídeo (ou ter atividade de xilosidase).

Conformemente, a presente invenção proporciona um polipéptido de β-xilanase (isolado) compreendendo: (i) a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2; ou (ii) uma variante com pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2a qual é capaz de clivar o xilano; ou (iii) uma variante da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2 a qual tem até 50 substituições de aminoácidos e a qual é capaz de clivar o xilano, ou (iv) um fragmento da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2 a qual é capaz de clivar o xilano.

De acordo com outro aspeto da invenção, é proporcionado um polinucleótido o qual compreende: 4 (a) a sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase ou o seu complemento ou (b) uma sequência codificando um polipéptido tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes; (c) um fragmento de pelo menos 100 nucleótidos da sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase ou o seu complemento; (d) uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência codificante da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase; (e) a sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase ou o seu complemento ou a sequência madura da SEQ ID No. 1 modificada por até 100 substituições de nucleótidos; (f) uma sequência codificando uma xilanase que é degenerada como resultado do código genético da sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 ou o seu complemento; (g) uma sequência que codifica um polipéptido tendo atividade de xilanase, a qual é: (1) a sequência codificante dos nucleótidos 69 a 1224 da SEQ ID No. 1 ou (2) uma sequência que é degenerada como resultado do código genético no que diz respeito à sequência definida em (1); ou 5 (h) uma sequência complementar de um polinucleótido definido em (g). A invenção também proporciona: um vetor (e.g. de expressão) que compreende um polinucleótido da invenção e que pode ser capaz de expressar um polipéptido da invenção; uma linha celular compreendendo um vetor da invenção; um método de produção de um polipéptido da invenção o qual compreende a manutenção de uma linha celular da invenção sob condições adequadas para a obtenção da expressão do polipéptido e, se necessário, o isolamento do polipéptido; um método de degradação do β-D-xilano, compreendendo o método o contacto de um material compreendendo o β-D-xilano com um polipéptido da invenção; e um método de identificação de um composto que modula a atividade de xilanase, o qual compreende o contacto de um polipéptido da invenção com um composto de teste na presença de β-D-xilano e a monitorização ou deteção de qualquer modulação da atividade.

Breve Descrição das Sequências A SEQ ID No. 1 é a sequência de ADN codificando a xilanase da invenção de Talaromyces emersonii; A SEQ ID No. 2 é a sequência de aminoácidos da xilanase; e As SEQ ID Nos. 3 e 4 são iniciadores de RCP artificiais que hibridam com a SEQ ID No. 1.

Descrição Detalhada da Invenção A.

Polinucleótidos 6 A presente invenção proporciona um polinucleótido (e.g. isolado e/ou purificado) codificando um polipéptido da invenção. A presente invenção proporciona portanto um polinucleótido codificando uma xilanase cuja sequência de aminoácidos é estabelecida na SEQ ID No. 2 (tal como a sequência madura dos aminoácidos 23 a 408) . A presente invenção proporciona ainda um polinucleótido codificando um polipéptido tendo uma homologia da sequência de aminoácidos substancial com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No. 2. Também incluido é um polinucleótido selecionado de: (a) um polinucleótido compreendendo a sequência de nucleótidos (por exemplo, dos polinucleótidos 69 a 1224) estabelecida na SEQ ID No. 1, ou o seu complemento; (b) um polinucleótido compreendendo uma sequência de polinucleótidos que é degenerada como resultado do código genético de um polinucleótido definido em (a) , (b) ou (c) .

Um polinucleótido da invenção também inclui um polinucleótido que: (a) codifica um polipéptido tendo atividade de xilanase, cujo polinucleótido é: (1) a sequência codificante da SEQ ID No. 1 (por exemplo, dos polinucleótidos 69 a 1224); (2) a sequência que é degenerada como resultado do código genético no que diz respeito à sequência definida em (1) ou 7 (b) é a sequência complementar de um polinucleótido definido em (a).

As referências à SEQ ID No. 1 podem ser substituídas pela sequência codificante madura (polinucleótidos 69 a 1224) a não ser que o texto requeira de maneira diferente.

Sequências hibridizáveis 0 termo "capaz de hibridação" significa que o polinucleótido alvo da invenção pode hibridar com o ácido nucleico usado como uma sonda (por exemplo, a sequência de nucleótidos estabelecida na SEQ ID No. 1, ou um seu fragmento ou o seu complemento) a um nivel significativamente superior ao conhecido. A invenção também inclui sequências de nucleótidos que codificam a xilanase ou suas variantes bem como sequências de nucleótidos que são complementares daquelas. A sequência de nucleótidos pode ser ARN ou ADN e portanto inclui ADN genómico, ADN sintético ou cADN. Preferencialmente a sequência de nucleótidos é uma sequência de ADN e mais preferencialmente uma sequência de cADN. Tipicamente um polinucleótido da invenção compreende uma sequência contigua de nucleótidos a qual é capaz de hibridar sob condições seletivas com a sequência codificante ou o complemento da sequência codificante (e.g. madura) da SEQ ID No. 1. Tais nucleótidos podem ser sintetizados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica1.

Um polinucleótido da invenção pode hibridar com a sequência codificante ou o complemento da sequência codificante (e.g. madura) da SEQ ID No. 1 a um nivel significativamente superior ao conhecido. Pode ocorrer uma hibridação conhecida, por exemplo, devido a outros cADNs presentes numa biblioteca de cADN. 0 nivel do sinal (e.g. gerado pela interação entre um polinucleótido da invenção e a sequência codificante ou complemento da sequência codificante) é tipicamente de pelo menos 10 vezes, preferencialmente de pelo menos 100 vezes, tão intenso como as interações entre outros polinucleótidos e a sequência codificante (e.g. madura) da SEQ ID No. 1. A intensidade da interação pode ser medida, por exemplo, pela radiomarcação da sonda, e.g. com 32P. A hibridação seletiva pode tipicamente ser alcançada usando condições de baixa estringência (cloreto de sódio 0,3 M e citrato de sódio 0,03 M a cerca de 40°C), de média estringência (por exemplo, cloreto de sódio 0,3 M e citrato de sódio 0,03 M a cerca de 50°C) ou de alta estringência (por exemplo, cloreto de sódio 0,3 M e citrato de sódio 0,03 M a cerca de 60°C) . A hibridação pode ser levada a cabo sob quaisquer condições adequadas conhecidas na técnica1 e, como um guia, a baixa estringência pode ser 2xCPM a 55°C, a média estringência pode ser 0,5 a l,0xCPM a 60°C e a alta estringência pode ser 0,1 ou 0,2xCPM a 60°C ou mais alta (e.g. a 68°C), todas com DSP de 0,5%.

Modificações

Os polinucleótidos da invenção podem compreender ADN ou ARN. Eles podem ser de cadeia única ou dupla. Eles podem também ser polinucleótidos que incluem dentro deles um ou mais nucleótidos sintéticos ou modificados. Um número de diferentes tipos de modificações dos polinucleótidos é conhecido na técnica. Estas incluem colunas vertebrais de metilofosfonato e de fosforotioato e/ou adição de cadeias de acridina ou de polilisina nas extremidades 3" e/ou 5" da molécula. Para os propósitos da presente invenção, é para ser entendido que os polinucleótidos descritos aqui podem ser modificados por qualquer método disponível na técnica. 9 É para ser entendido que pessoas peritas podem, usando técnicas de rotina, fabricar substituições de nucleótidos que não afetam a sequência de polipéptidos codificada pelos polinucleótidos da invenção para refletir o uso de codões de qualquer organismo hospedeiro particular, por exemplo no qual os polipéptidos da invenção estão a ser expressos. A sequência codificante (e.g. madura) da SEQ ID No. 1 pode ser modificada por substituições de nucleótidos, por exemplo, de ou até 1, 2 ou 3 a 10, 25, 50 ou 100 substituições. O polinucleótido pode alternativamente ou adicionalmente ser modificado por uma ou mais inserções e/ou deleções e/ou por uma extensão numa ou em ambas as extremidades. O polinucleótido modificado geralmente codifica um polipéptido que tem atividade de xilanase. Podem ser feitas substituições degeneradas e/ou podem ser feitas substituições que resultariam numa substituição de aminoácidos conservativa quando a sequência modificada é traduzida, por exemplo como discutido com referência a polipéptidos mais tarde.

Homólogos

Uma sequência de nucleótidos que seja capaz de seletivamente hibridar com (e.g. o complemento da) a sequência codificante de ADN da SEQ ID No. 1 (ou os nucleótidos 69-1224) pode ter pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência (ou homologia) com a sequência codificante da SEQ ID No. 1. Isto pode ser numa região de pelo menos 20, preferencialmente pelo menos 30 ou 60, por exemplo pelo menos 100, pelo menos 200, mais preferencialmente pelo 10 menos 300 nucleótidos contíguos ou otimamente ao longo do comprimento total da SEQ ID No. 1.

Qualquer combinação dos acima mencionados graus de homologia e tamanho mínimo pode ser usada para definir os polinucleótidos da invenção, com as combinações mais estrigentes (i.e. maior homologia ao longo de comprimentos mais longos) a serem preferenciais. Portanto, por exemplo, um polinucleótido que é pelo menos 80% ou 90% homólogo ao longo de 25, preferencialmente ao longo de 30 nucleótidos forma um aspeto da invenção, assim como um polinucleótido que é pelo menos 90% homólogo ao longo de 40 nucleótidos.

As sequências de homólogos de polinucleótidos (ou de proteínas) têm tipicamente pelo menos 95% de homologia, preferencialmemte pelo menos 97% ou 99% de homologia, por exemplo, ao longo de uma região de pelo menos 20, 25, 30, 100 mais nucleótidos contíguos (ou aminoácidos). A homologia pode ser calculada com base da identidade de aminoácidos (por vezes referida como "homologia em bruto").

Por exemplo, o Pacote UWGCG proporciona o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular a homologia (por exemplo usado nas suas configurações padrão5) . Os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser usados para calcular a homologia ou para alinhar sequências (tal como identificar sequências equivalentes ou correspondentes, por exemplo nas suas configurações padrão6'7) . O software para realizar análises BLAST está publicamente disponível através do Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (http://www.ncbi.ntm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares de 11 sequência com pontuação alta (PSPs) pela identificação de pequenas palavras de comprimento W na sequência de consulta que ou correspondem a ou satisfazem uma pontuação de limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra com o mesmo comprimento numa sequência da base de dados. 0 T é referido como o limiar de pontuação da palavra da vizinhança6,7. Esta palavra da vizinhança inicial atua como sementes para o inicio de pesquisas para encontrar PSPs contendo-as. Os acertos na palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência para tão longe quanto a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As extensões para os acertos na palavra em cada direção são interrompidas quando: a pontuação de alinhamento cumulativa caia pela quantidade X do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vá para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais resíduos de alinhamentos de valor negativo; ou a extremidade de qualquer das sequências é alcançada. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. 0 programa BLAST usa como configurações um comprimento de palavra (W) de 11, alinhamentos da matriz de pontuação BLOSUM628 (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as cadeias. 0 algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências9. Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menor soma (P(N)), a qual proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleótidos ou de aminoácidos poderia ocorrer por acaso. Por exemplo, uma sequência é considerada similar a outra sequência se a probabilidade da 12 menor soma da primeira sequência em comparação com a da segunda sequência é menor do que 1, preferencialmente menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor do que cerca de 0,01, e ainda mais preferencialmente menor do que cerca de 0,001.

Iniciadores e Sondas

Os polinucleótidos da invenção incluem e podem ser usados como um iniciador, e.g. um iniciador da RCP, um iniciador para uma reação de amplificação alternativa, uma sonda, ou os polinucleótidos podem ser clonados em vetores. Tais iniciadores, sondas e outros fragmentos terão pelo menos ou até 20, 25, 30 ou 40, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleótidos de comprimentos. Eles terão tipicamente até 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 200 ou 300 nucleótidos de comprimento, ou este número (mesmo até menos nucleótidos do que 5 ou 10 nucleótidos) exceto a sequência codificante (e.g. madura) da SEQ ID No. 1.

Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo um fabrico passo a passo da sequência de aminoácidos desejada um nucleótido de cada vez. Técnicas para alcançar isto usando técnicas automatizadas estão prontamente disponíveis na técnica. Exemplos de iniciadores da invenção são estabelecidos nas SEQ ID Nos. 3 e 4.

Polinucleótidos mais longos irão geralmente ser produzidos usando meios recombinantes, por exemplo usando técnicas de clonagem de RCP (reação em cadeia da polimerase). Isto envolverá o fabrico de um par de iniciadores (e.g. de cerca de 15-30 nucleótidos) para a região da xilanase que é desejada que seja clonada, pondo os iniciadores em contacto 13 com mARN ou cADN obtido de uma célula alvo (e.g. de levedura, bacteriana, vegetal, procariótica ou fúngica), preferencialmente de uma estirpe de Talaromyces, realizando uma reação em cadeia da polimerase sob condições que provoquem a amplificação da região desejada, isolando o fragmento amplificado (e.g. pela purificação da mistura reacional num gel de agarose) e recuperando o ADN amplificado. Os iniciadores podem ser desenhados para conter locais de reconhecimento da enzima de restrição adequados de modo a que o ADN amplificado possa ser clonado num vetor de clonagem adequado.

Tais técnicas podem ser usadas para obter toda ou parte da sequência da xilanase descrita aqui. Clones genómicos correspondendo ao cADN da SEQ ID No. 1 ou o gene da xilanase contendo, por exemplo, intrões e regiões promotoras estão também no âmbito da invenção e podem também ser obtidos de uma maneira análoga (e.g. meios recombinantes, RCP, técnicas de clonagem), começando com ADN genómico de uma célula fúngica, de levedura, bacteriana, vegetal ou procariótica.

Os polinucleótidos ou iniciadores podem transportar um marcador revelador, e.g. um marcador radioativo ou não radioativo. Marcadores adequados incluem radioisótopos tais como 32P ou 35S, marcadores enzimáticos, ou outros marcadores proteicos tais como a biotina. Tais marcadores podem ser adicionados aos polinucleótidos ou iniciadores da invenção e podem ser detetados usando técnicas conhecidas per se.

Os polinucleótidos, marcados ou não marcados, podem ser usados em testes baseados em ácido nucleico para a deteção 14 ou sequenciação da xilanase ou uma sua variante numa amostra (e.g. fúngica). Tais testes para deteção geralmente compreendem pôr uma amostra (e.g. fúngica) contendo ADN em contacto com uma sonda ou um iniciador da invenção sob condições de hibridação e a deteção de qualquer dúplex formado entre a sonda e o ácido nucleico na amostra. Tal deteção pode ser alcançada usando técnicas tais como RCP ou pela imobilização da sonda num suporte sólido, removendo o ácido nucleico na amostra que não esteja hibridado com a sonda, e depois detetando o ácido nucleico que foi hibridado com a sonda. Alternativamente, a amostra de ácido nucleico pode ser imobilizada num suporte sólido, e a quantidade de sonda ligada a um tal suporte pode ser detetada.

As sondas da invenção podem ser convenientemente empacotadas na forma de um conjunto de teste num contentor adequado. Em tais conjuntos, a sonda pode estar ligada a um suporte sólido onde o formato de ensaio para o qual o conjunto é desenhado requer tal ligação. 0 conjunto pode também conter reagentes adequados para o tratamento da amostra a ser sondada, a hibridação da amostra com o ácido nucleico da amostra, reagentes de controlo, instruções, e similares.

Preferencialmente, o polinucleótido da invenção é obtenivel do mesmo organismo que o polipéptido, tal como um fungo, em particular um fungo do género Talaromyces.

Os polinucleótidos da invenção também incluem variantes da sequência da SEQ ID No. 1 que tem atividade de xilanase. As variantes podem ser formadas por adições, substituições 15 e/ou deleções e podem ter a capacidade de clivar um polimero de β-D-xilano.

Produção dos polinucleótidos

Os polinucleótidos que não têm 100% de identidade com (e.g. a sequência codificante madura da) a SEQ ID No. 1 mas são abrangidos pelo âmbito da invenção podem ser obtidos de um número de maneiras. Portanto, as variantes da sequência da xilanase descritas aqui podem ser obtidas por exemplo por sondagem de bibliotecas de ADN genómico elaboradas de uma gama de organismos, por exemplo aqueles discutidos como fontes dos polipéptidos da invenção. Adicionalmente, outros homólogos fúngicos, vegetais ou procarióticos da xilanase podem ser obtidos e tais homólogos e seus fragmentos serão em geral capazes de hibridar com a SEQ ID No. 1. Tais sequências podem ser obtidas pela sondagem de bibliotecas de cADN ou de bibliotecas de ADN genómico de outras espécies, e pela sondagem de tais bibliotecas com sondas compreendendo toda a ou parte da SEQ ID No. 1 sob condições de média a alta estringência (como descrito anteriormente). Sondas de ácido nucleico compreendendo toda a ou parte da SEQ ID No. 1 podem ser usadas para sondar bibliotecas de cADN de outras espécies, tais como aquelas descritas como fontes dos polipéptidos da invenção.

Homólogos das espécies podem também ser obtidos usando RCP degenerada a qual irá usar iniciadores desenhados para se direcionarem a sequências dentro das variantes e dos homólogos codificando sequências de aminoácidos conservadas. Os iniciadores podem conter uma ou mais posições degeneradas e serão usados a condições de estringência mais baixas do que aquelas usadas para as 16 sequências de clonagem com iniciadores de sequência única contra sequências conhecidas.

Alternativamente, tais polinucleótidos podem ser obtidos por mutagénese sitio-especifica das sequências de xilanase ou das suas variantes. Isto pode ser útil onde por exemplo sejam requeridas mudanças de codão silenciosas às sequências para otimizar as preferências do codão por uma célula hospedeira particular na qual as sequências de polinucleótidos estão a ser expressas. Outras mudanças de sequência podem ser desejadas de modo a introduzir locais de reconhecimento da enzima de restrição, ou a alterar a propriedade ou a função dos polipéptidos codificados pelos polinucleótidos. A invenção inclui polinucleótidos de cadeia dupla compreendendo um polinucleótido da invenção e o seu complemento. A presente invenção também proporciona polinucleótidos codificando os polipéptidos da invenção descritos abaixo. Uma vez que tais polinucleótidos irão ser úteis como sequências para a produção recombinante dos polipéptidos da invenção, não é necessário que eles sejam capazes de hibridar com a sequência da SEQ ID No. 1, embora isso seja geralmente desejável. Caso contrário, tais polinucleótidos podem ser marcados, usados, e fabricados como descrito acima se desejado. Fragmentos de ADN podem ser preparados 33 34 usando a técnica de RCP com iniciadores específicos. B. Polipéptidos A presente invenção relaciona-se com uma xilanase (e.g. (substancialmente) purificada e/ou isolada) e suas 17 variantes. Os polipéptidos da invenção podem consistir essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2, ou uma parte dela (tal como a sequência madura das posições 23 a 408), ou uma sua variante. Os polipéptidos podem também ser codificados por um polinucleótido da invenção como descrito acima. As referências à SEQ ID No. 2 podem ser substituídas com somente a sequência madura (residuos Ala23 a Leu408 ) a não ser que o contexto requeira de outra maneira.

Os polipéptidos da invenção podem ser ativos em ambos o arabinoxilano e o arilo-p-D-xilosídeo (tais como tendo atividade de arabinoxilanase e de xilosidase).

Um polipéptido da invenção pode ser numa forma isolada ou substancialmente purificada. Será entendido que o polipéptido pode ser misturado com transportadores ou diluentes os quais não interferirão com o propósito pretendido e/ou com a função do polipéptido e ainda ser considerado como substancialmente isolado. O polipéptido irá geralmente estar compreendido numa preparação na qual mais do que 20%, e.g. mais do que 30%, 40%, 50%, 80%, 90%, 95% ou 99%, por peso do polipéptido na preparação, é um polipéptido da invenção. Estas são composições relativamente puras: para algumas aplicações, o polipéptido pode estar presente na composição em até 10%, 5%, 2%, 1% ou mesmo não mais do que 0,5%. Métodos de rotina podem ser empregues para purificar e/ou sintetizar as proteínas de acordo com a invenção1. Para algumas formulações (e.g. para usos não farmacêuticos), a quantidade de polipéptido presente pode ser pequena, por exemplo de 0,01 a 10%, tal como de 0,1 a 5%, ou 2% ou mesmo de 0,2 a 1%. 18

Preferencialmente, o polipéptido da invenção é obtenivel de um microrganismo que possui um gene codificando uma enzima com atividade de xilanase. Mais preferencialmente, o microrganismo é um fungo, e otimamente um fungo filamentoso. Os organismos preferenciais são portanto do género Talaromyces, tais como da espécie Talaromyces emersonii (e.g. CBS 393.64 ou 814.70).

Atividade

Um polipéptido da invenção pode ter uma ou mais das seguintes características, nomeadamente ele: (1) possui atividade de β-D-xilanase; (2) tem uma gama de pH ótima de 2 a 6, tal como de 3 a 5, otimamente de 3,5 a 5,0; (3) tem uma atividade ótima a uma temperatura de 50°C a 95°C, tal como de 70 a 90°C, otimamente de 75 a 85°C; (4) tem um peso molecular (desglicosilado) de 30 a 50 kDa, preferencialmente de 35 a 45 kDa, otimamente de 40 a 44 kDa ou (glicosilado) de 50 a 75 kDa, preferencialmente de 55 a 70 kDa, otimamente de 60 a 66 kDa: e/ou (5) tem um ponto isoelétrico de 3,0 a 3,6. O polipéptido pode ter a atividade de EC.3.2.1.8. Preferencialmente, o polipéptido é da Família 10 (antigamente tipo-F). "Atividade de xilanase" é definida como a capacidade de clivar a celulose ou um polímero de β-D-xilano (por exemplo como encontrado em plantas e.g. aveia ou cevada). A atividade permite portanto a clivagem do β-D-xilano, tal como entre terminais de xilopiranosilo adjacentes e/ou 19 unidades não terminais. Preferencialmente, a clivagem ocorre numa ligação [xilopiranosilo (1-4) xilopiranosilo]. 0 polipéptido pode preferencialmente clivar entre duas unidades adjacentes (e.g. não substituídas). Ele pode portanto ter atividade endo (i.e. ser uma endoxilanase) . 0 polímero substrato pode ou não ser substituído. Ele pode também ter atividade exo (i.e. ser uma exoxilanase) , tal como clivagem de unidades de xilopiranosilo terminais. Preferencialmente, o polipéptido não terá atividade de glucanase.

Os polipéptidos da invenção podem também ser ativos no (ou apresentar atividade de) arabinoxilano. 0 arabinoxilano é um subconjunto do xilano, com cadeias laterais de L-arabino-furanosilo ligadas ao C-2 ou ao C-3, ou a ambos, dos resíduos da cadeia principal dos xilos. 0 arabinoxilano tem um Registo CAS No. 98513-12-3. Ele pode ter a estrutura (l->4)-β-D-xilano com ramos de α-L-arabinose ligados ao 3. Este tipo de xilano é normalmente encontrado no xilano de espelta de aveia.

Esta atividade é a capacidade de hidrolisar arabinoxilano não tratado. Isto significa que o arabinoxilano não foi tratado ou modificado, por exemplo ele não foi tratado com uma arabinofuranosidase. Esta enzima pode remover as cadeias laterais da arabinose. Os polipéptidos da invenção são capazes de hidrolisar (clivar) o arabinoxilano que não tenha sido anteriormente tratado com arabinofuranosidase. 0 arabinoxilano pode ser encontrado em espeltas de aveia, e nesta especificação a atividade do polipéptido (UEX, bem como atividade de HAPHB) é determinada no arabinoxilano de farinha de trigo (com uma razão arabinose:xilose de 41:59). 20

Um ensaio para o arabinoxilano (como o substrato) é descrito mais tarde nos Exemplos.

Os polipéptidos da invenção podem também ter atividade de xilosidase, por exemplo serem capazes de hidrolisar (e.g. arilo)-β-D-xilosideos substituídos (também conhecidos como xilopiranosideos). Por exemplo, eles podem ser capazes de hidrolisar o 4-metiloumbeliferilo^-D-xilopiranosídeo (Registo CAS No. 6734-33-4, obtenível da Sigma Chemical Co) . Esta atividade é a capacidade de libertar o marcador fluorescente do substrato. Eles podem também hidrolisar o (ser ativos no) 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo-p-D- xilopiranosídeo (Registo CAS No. 207606-55-1). A combinação da atividade em ambos o arabinoxilano e um arilo-β-Ό-xilosídeo é incomum36'37 e é uma nova combinação de atividades para um polipéptido tendo atividade de xilanase.

Variantes e Homólogos

Um polipéptido da invenção pode compreender a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID No. 2 ou uma sequência substancialmente homóloga, ou um fragmento de qualquer sequência e pode ter atividade de xilanase. Em geral, a sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente mostrada na SEQ ID No. 2 é preferencial.

Em particular, o polipéptido da invenção pode compreender: a. a sequência de polipéptidos (madura) da SEQ ID No. 2 (resíduos 23 a 408) ou a sequência inteira da SEQ ID No. 2; 21 b. uma proteína com pelo menos 90, pelo menos 95, pelo menos 98 ou pelo menos 99% de identidade de sequência com (a) .

Uma variante pode ser uma que ocorra naturalmente, por exemplo em células fúnqicas, bacterianas, de levedura ou vegetais e a qual pode funcionar de uma maneira substancialmente similar à proteína da SEQ ID No. 2, por exemplo, tem atividade de xilanase. Similarmente, um homólogo de espécie da proteína será a proteína equivalente que ocorre naturalmente noutra espécie e a qual pode funcionar como uma xilanase. As variantes incluem variantes alélicas quer da mesma estirpe do polipéptido da invenção, quer de uma estirpe diferente, mas do mesmo género, ou da mesma espécie.

As variantes e os homólogos de espécie podem ser obtidos seguindo os procedimentos descritos aqui para a produção do polipéptido da SEQ ID No. 2 e realizando tais procedimentos numa fonte celular adequada, por exemplo uma célula bacteriana, de levedura, fúngica ou vegetal. Será também possível usar uma sonda como definido acima para sondar bibliotecas feitas de células de levedura, bacterianas, fúngicas ou vegetais de modo a obter clones incluindo as variantes ou os homólogos de espécie. Os clones podem ser manipulados por técnicas convencionais para gerar um polipéptido da invenção que pode depois ser produzido por técnicas recombinantes ou sintéticas conhecidas per se. O polipéptido da invenção tem preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência com a proteína da SEQ ID No. 2, mais preferencialmente pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com aquela, por 22 exemplo ao longo de uma região de pelo menos 40, 60, 100, 150, 200, 300 ou 400 aminoácidos contíguos ou ao longo do comprimento total da SEQ ID No. 2. A sequência do polipéptido da SEQ ID No. 2 e das variantes e homólogos de espécie pode portanto ser modificada para proporcionar polipéptidos da invenção. As substituições de aminoácidos podem ser feitas, por exemplo de ou até 1, 2 ou 3 a 10, 20, 30, 50 substituições. O mesmo número de deleções ou de inserções pode também ser feito. Estas mudanças podem ser feitas fora das regiões críticas à função do polipéptido e por isto podem ainda resultar numa enzima ativa. O polipéptido modificado geralmente retém atividade como uma xilanase.

Os polipéptidos da invenção incluem fragmentos dos polipéptidos de comprimento total acima mencionados e das suas variantes, incluindo fragmentos da sequência estabelecida na SEQ ID No.2. Tais fragmentos retêm tipicamente atividade como uma xilanase. Os fragmentos podem ter pelo menos 50, 50, 70, 80, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos de comprimento ou podem ter este número de aminoácidos exceto a sequência de comprimento total (mostrada na SEQ ID no. 2) . Os fragmentos ou as variantes compreendem ou representam uma região de ligação ao β-D-xilano ou uma região de clivagem do β-D-xilano.

Os polipéptidos da invenção podem se necessário ser produzidos por meios sintéticos embora usualmente eles serão fabricados recombinantemente como descrito abaixo. Eles podem ser modificados por exemplo pela adição de resíduos de histidina ou de uma etiqueta T7 para auxiliar na sua identificação ou na sua purificação ou pela adição 23 de uma sequência sinalizadora para promover a sua secreção de uma célula. 0 termo "variantes" refere-se a polipéptidos que podem ter o mesmo caráter essencial ou a mesma funcionalidade biológica básica da xilanase, e incluem variantes alélicas. 0 caráter essencial da xilanase é que ela é uma enzima que pode clivar as ligações 1-4 no β-D-xilano. Um polipéptido tendo o mesmo caráter essencial da xilanase pode ser identificado usando um ensaio de degradação da celulose como descrito posteriormente.

As variantes da SEQ ID No. 2 também incluem sequências que variam da SEQ ID No. 2 mas as quais não são necessariamente derivadas da proteína de xilanase que ocorre naturalmente. Estas variantes podem ser descritas como tendo uma % de homologia com a SEQ ID No. 2 ou como tendo um número de substituições dentro desta sequência. Alternativamente, a variante pode ser codificada por um polipéptido que híbrida com a SEQ ID No. 1.

As variantes podem ser definidas de uma maneira similar às variantes da SEQ ID No. 1. Portanto, as variantes podem compreender sequências de variante derivadas de outras estirpes de Talaromyces. Outras variantes podem ser identificadas de outras estirpes de Talaromyces procurando por atividade de xilanase e clonando e sequenciando como antes. As variantes podem incluir a deleção, modificação ou adição de aminoácidos únicos ou de grupos de aminoácidos dentro da sequência proteica, contanto que o péptido mantenha a funcionalidade biológica básica da xilanase. 24

Podem ser feitas substituições conservativas, por exemplo de acordo com a seguinte Tabela. Os aminoácidos no mesmo bloco na segunda coluna e preferencialmente na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos uns pelos outros. Preferencialmente as substituições não afetam a dobragem ou a atividade do polipéptido.

ALIFÁTICAS Não polares GAP I L V Polares não carregados C S T M N Q Polares carregados D E K R AROMÁTICAS H F W Y

Modificações

Os polipéptidos da invenção podem ser quimicamente modificados, e.g. modificados pos-translacionalmente. Por exemplo, eles podem ser glicosilados (uma ou mais vezes, pelo mesmo ou por diferentes açúcares) ou compreender resíduos de aminoácidos modificados. Eles podem também ser modificados pela adição de resíduos de histidina (para auxiliar na sua purificação) ou pela adição de uma sequência sinalizadora (para promover a inserção na membrana celular) . 0 polipéptido pode ter uma ou mais extensões amino(N)- ou carboxilo(C)-terminais, tais como um resíduo de metionina amino-terminal, um pequeno péptido ligante de até cerca de 20-25 resíduos, ou uma (pequena) extensão que facilita a purificação, tal como uma polihistidina ou uma etiqueta T7, um epítopo antigénico ou um domínio de ligação14 (e.g. à maltose) (e.g. no C-terminal). Estas extensões podem ou não ser adicionadas através de um ligante. 25

Um polipéptido da invenção pode ser marcado com um marcador revelador. 0 marcador revelador pode ser qualquer marcador adequado que permita que o polipéptido seja detetado. Marcadores adequados incluem radioisotopos, e.g. I, S, enzimas, anticorpos, polinucleótidos e ligantes tais como a biotina.

Os polipéptidos podem ser modificados para incluir aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou para aumentar a estabilidade do polipéptido. Quando as proteínas ou os péptidos são produzidos por meios sintéticos, tais aminoácidos podem ser introduzidos durante a produção. As proteínas ou péptidos podem também ser modificados seguindo quer a produção sintética, quer a recombinante.

Os polipéptidos da invenção podem também ser produzidos usando, ou compreendendo, (um ou mais) D-aminoácidos. Em tais casos, os resíduos de aminoácido podem ser ligados usando a sequência N a C convencional como descrito nesta aplicação.

Um número de modificações da cadeia lateral é conhecido na técnica e podem ser feitas às cadeias laterais das proteínas ou dos péptidos da presente invenção. Tais modificações incluem, por exemplo, modificações de aminoácidos pela alquilação redutora pela reação com um aldeído seguida pela redução com NaBlU, pela amidinação com metilacetimidato ou pela acilação com anidrido acético.

As sequências proporcionadas pela presente invenção podem também ser usadas como materiais de partida para a construção de enzimas de "segunda geração". As xilanases de "segunda geração" podem ser aquelas que foram alteradas por 26 técnicas de mutagénese (e.g. mutagénese sítio-especifica), as quais têm propriedades que diferem daquelas das xilanases de tipo selvagem ou das xilanases recombinantes tais como aquelas produzidas pela presente invenção. Por exemplo, a temperatura ou o pH ótimos, a atividade especifica, a afinidade do substrato ou a termoestabilidade podem ser alterados de modo a serem mais adequados para aplicação num processo definido.

Os aminoácidos essenciais à atividade das xilanases da invenção, e portanto preferencialmente sujeitos a substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagénese sitio-especifica ou mutagénese de rastreio da alanina10. Na última técnica, as mutações são introduzidas em todos os resíduos na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade biológica (e.g. atividade de xilanase) para identificar resíduos de aminoácido que sejam críticos para a atividade da molécula. Os locais da interação enzima-substrato podem também ser determinados pela análise da estrutura cristalina como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia ou marcação de foto-afinidade11'12'13 ou modelação molecular. 0 uso de células hospedeiras de levedura e fúngicas deverá proporcionar tais modificações pós-translacionais (e.g. processamento proteolítico, miristilação, glicosilação, truncamento, e fosforilação da tirosina, da serina ou da treonina) como pode ser necessário para conferir atividade biológica ótima aos produtos de expressão recombinantes da invenção. 27

Os polipéptidos da invenção podem ser proporcionados numa tal forma que eles estão fora do seu ambiente celular natural. Portanto, eles podem ser substancialmente isolados ou purificados, como discutido acima, ou numa célula na qual eles não ocorram na natureza, e.g. uma célula de outra espécie fúngica, de animais, de levedura ou de bactéria. C. Aspetos Recombinantes A invenção também proporciona vetores compreendendo um polinucleótido da invenção, incluindo vetores de clonagem e de expressão, e métodos para crescer, transformar ou transfectar tais vetores numa célula hospedeira adequada, por exemplo sob condições nas quais a expressão de um polipéptido da invenção ocorra. Também proporcionadas são células hospedeiras compreendendo um polinucleótido ou um vetor da invenção em que o polinucleótido é heterólogo ao genoma da célula hospedeira. 0 termo "heterólogo", usualmente no que diz respeito à célula hospedeira, significa que o polinucleótido não ocorre naturalmente no genoma da célula hospedeira ou que o polipéptido não é naturalmente produzido por aquela célula. Preferencialmente, a célula hospedeira é uma célula de levedura, por exemplo uma célula de levedura do género Kluyveromyces ou Saccharomyces ou uma célula fúngica, por exemplo do género Aspergillus.

Os polinucleótidos da invenção podem ser incorporados num vetor replicável recombinante, por exemplo um vetor de clonagem ou de expressão. 0 vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico numa célula hospedeira compatível. Portanto, numa forma de realização adicional, a invenção proporciona um método para fabricar polinucleótidos da invenção pela introdução de um 28 polipéptido da invenção num vetor replicável, introduzindo o vetor numa célula hospedeira compativel, e crescendo a célula hospedeira sob condições que provocam a replicação do vetor. 0 vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas são descritas abaixo em conexão com os vetores de expressão.

Vetores 0 polinucleótido da invenção pode ser inserido numa cassete de expressão. 0 vetor no qual a cassete de expressão ou o polinucleótido da invenção é inserido pode ser qualquer vetor que possa convenientemente ser sujeito a procedimentos de ADN recombinante, e a escolha do vetor irá frequentemente depender da célula hospedeira na qual ele se destina a ser introduzido. Portanto, o vetor pode ser um vetor autonomamente replicável, i.e. um vetor que existe como uma entidade extracromossomal, a replicação da qual é independente da replicação cromossomal, e.g. um plasmideo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado em conjunto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(ais) ele foi integrado.

Preferencialmente, um polinucleótido da invenção num vetor está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora a qual é capaz de proporcionar a expressão da sequência codificante pela célula hospedeira, i.e. o vetor é um vetor de expressão. 0 termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão numa relação que permite que eles funcionem na sua maneira pretendida. Uma sequência reguladora tal como um promotor, um potenciador ou outro sinal regulador da expressão "operacionalmente ligada" a uma sequência codificante está 29 posicionada de uma tal maneira que a expressão da sequência codificante é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controlo ou as sequências são arranjadas de modo a funcionarem em conjunto para o seu propósito pretendido, por exemplo a transcrição inicia-se num promotor e prosseque através da sequência de ADN codificando o polipéptido. 0 vetor pode ser um vetor plasmidico, cósmico, virai ou fáqico, usualmente fornecido com uma oriqem de replicação, opcionalmente com um promotor da expressão do polinucleótido e opcionalmente com um potenciador e/ou um requlador do promotor. Uma sequência de terminação pode estar presente, assim como uma sequência de poliadenilação. 0 vetor pode conter um ou mais genes marcadores selecionáveis, por exemplo um gene da resistência à ampicilina (no caso de um plasmideo bacteriano) ou um gene de resistência à neomicina (para um vetor de mamifero). Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo para a produção de ARN ou usados para transfectar ou para transformar uma célula hospedeira. Eles podem compreender dois ou mais polinucleótidos da invenção, por exemplo para sobreexpressão. A sequência de ADN codificando o polipéptido é preferencialmente introduzida no hospedeiro adequado como parte de uma cassete (ou um constructo) de expressão na qual a sequência de ADN está operacionalmente ligada a sinais de expressão os quais são capazes de direcionar a expressão da sequência de ADN nas células hospedeiras. Para a transformação do hospedeiro adequado com o constructo de expressão, estão disponíveis procedimentos de transformação os quais são bens conhecidos da pessoa perita3'4. 0 30 constructo de expressão pode ser usado para a transformação do hospedeiro como parte de um vetor transportando um marcador selecionável, ou o constructo de expressão pode ser cotransformado como uma molécula separada em conjunto com o vetor carregando um marcador selecionável. O vetor pode compreender um ou mais genes marcadores selecionáveis.

Os marcadores selecionáveis preferenciais15'16 incluem mas não estão limitados a aqueles que complementam um defeito na célula hospedeira ou que conferem resistência a um medicamento. Eles incluem e.g. genes marcadores versáteis que podem ser usados para transformação da maioria dos fungos filamentosos e das leveduras tais como genes de acetamidase ou cADNs (os genes amdS, niaD, facA ou cADNS de A. nidulans, A. oryzae, ou A. niger) , ou genes proporcionando resistência a antibióticos como resistência a G418, a higromicina, a bleomicina, a canamicina, a fleomicina ou a benolimo (benA). Alternativamente podem ser usados marcadores de seleção específicos tais como marcadores auxotróficos que requerem estirpes hospedeiras mutantes correspondentes: e.g. URA3 (de S. cerevisiae ou de genes análogos de outras leveduras) , pyrG ou pyrA (de A. nidulans ou de A. niger) , argB (de A. nidulans ou de A. niger) ou trpC. Numa forma de realização preferencial, o marcador de seleção é deletado da célula hospedeira transformada depois da introdução do constructo de expressão de modo a se obterem células hospedeiras transformadas capazes de produzir o polipéptido que estão 21 22 livres de genes marcadores de seleção '

Outros marcadores incluem ATP sintetase, subunidade 9 (oliC) , orotidina-5'-fosfato-descarboxilase (pvrA) , o gene de resistência a G418 bacteriano (isto pode também ser 31 usado em levedura, mas não em fungos) , o gene de resistência à ampicilina (E. coli), o gene de resistência à neomicina (Bacillus) e o gene uidA de E. coli, codificando a β-glucuronidase (GUS). Os vetores podem ser usados in vitro, por exemplo para a produção de ARN ou usados para transfectar ou para transformar uma célula hospedeira.

Para a maioria dos fungos filamentosos e das leveduras, o vetor ou o constructo de expressão são preferencialmente integrados no genoma da célula hospedeira de modo a se obterem transformantes estáveis. No entanto, para certas leveduras, estão também disponíveis vetores episomais nos quais o constructo de expressão pode ser incorporado para expressão estável e de alto nível, exemplos destes incluem vetores derivados dos plasmídeos 2μ e pKDl de Saccharomyces e de Kluyveromyces, respetivamente, ou vetores contendo uma sequência AMA (e.g. AMAI de Aspergillus3,20) . No caso de os constructos de expressão serem integrados no genoma da célula hospedeira, os constructos são integrados quer em loci aleatórios no genoma, quer em loci alvos predeterminados usando recombinação homóloga, caso em que os loci alvos compreendem preferencialmente um gene altamente expresso. Um gene altamente expresso é um gene cujo mARN pode compor pelo menos 0,01% (p/p) do mARN celular total, e.g. sob condições induzidas, ou alternativamente, um gene cujo produto de gene pode compor pelo menos 0,2% (p/p) da proteína celular total, ou, no caso de um produto de gene secretado, pode ser secretado até um nível de pelo menos 0,05 g/L. Um número de exemplos de genes expressos altamente adequados é proporcionado abaixo. 32

Um vetor ou constructo de expressão para uma dada célula hospedeira pode compreender os seguintes elementos operacionalmente ligados uns aos outros numa ordem consecutiva da extremidade-5' à extremidade-3' relativamente à cadeia codificante da sequência codificando o polipéptido da primeira invenção: (1) uma sequência promotora capaz de direcionar a transcrição da sequência de ADN codificando o polipéptido na célula hospedeira dada; (2) opcionalmente, uma sequência sinalizadora capaz de direcionar a secreção do polipéptido da célula hospedeira dada para um meio de cultura; (3) uma sequência de ADN codificando uma forma do polipéptido madura e preferencialmente ativa; e preferencialmente também (4) uma região de terminação da transcrição (terminadora) capaz de terminar a transcrição a jusante da sequência de ADN codificando o polipéptido. A jusante da sequência de ADN codificando o polipéptido, pode existir uma região 3" não traduzida contendo um ou mais locais de terminação da transcrição (e.g. um terminador). A origem do terminador é menos critica. 0 terminador pode e.g. ser nativo da sequência de ADN codificando o polipéptido. No entanto, preferencialmente um terminador de levedura é usado em células hospedeiras de levedura e um terminador fúngico filamentoso é usado em células hospedeiras fúngicas filamentosas. Mais preferencialmente, o terminador é endógeno à célula hospedeira (na qual a sequência de ADN codificando o polipéptido é para ser expressa). 33 A expressão aumentada do polinucleótido codificando o polipéptido da invenção pode também ser alcançada pela seleção de regiões reguladoras heterólogas, e.g. promotor, lider de secreção e/ou regiões terminadoras, as quais podem servir para aumentar os níveis de expressão e, se desejado, de secreção da proteína de interesse do hospedeiro de expressão e/ou para proporcionar o controlo induzível da expressão do polipéptido da invenção. Além do promotor nativo do gene codificando o polipéptido da invenção, outros promotores podem ser usados para direcionar a expressão do polipéptido da invenção. 0 promotor pode ser selecionado pela sua eficácia no direcionamento da expressão do polipéptido da invenção no hospedeiro de expressão desejado.

Os promotores/potenciadores e outros sinais reguladores de expressão podem ser selecionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para a qual o vetor de expressão é desenhado. Por exemplo, podem ser usados promotores procarióticos, em particular aqueles adequados para uso em estirpes de E. coli. Quando a expressão é levada a cabo em células de mamífero, podem ser usados promotores de mamífero. Também podem ser usados promotores específicos de tecidos, por exemplo promotores específicos de células hepatócitas. Também podem ser usados promotores virais, por exemplo a repetição terminal longa do vírus de leucemia murina de Moloney (RTL VLMM), o promotor da RTL do virus do sarcoma de Rous (VSR), o promotor de SV40 (e.g. antigénio T grande), o promotor IP do citomegalovírus (CMV) humano, os promotores do vírus herpes simples ou de adenovírus, os promotores do VHS tais como os promotores IP do VSH, ou os promotores do VPH, particularmente a região reguladora a montante (RRM) do VPH. Os promotores de levedura incluem os 34 promotores GAL4 e ADH de S. cerevisiae, os promotores nmtl e adh de S. pombe. Os promotores de mamífero incluem o promotor da metalotioneína o qual pode ser induzido em resposta a metais pesados tais como cádmio ou promotores de β-actina. Os promotores específicos de tecido, em particular os promotores específicos da célula endotelial ou neuronal (por exemplo os promotores DDAHI e DDAHII), são especificamente preferenciais.

Uma variedade de promotores15,16 pode ser usada em que estes sejam capazes de direcionar a transcrição nas células hospedeiras da invenção. Preferencialmente, a sequência do promotor é derivada de um gene altamente expresso como previamente definido. Exemplos de genes altamente expressos preferenciais dos quais os promotores são preferencialmente derivados e/ou os quais estão compreendidos em loci alvos predeterminados preferenciais para a integração de constructos de expressão incluem mas não estão limitados a genes codificando enzimas glicolíticas tais como triose-fosfato isomerases (TFI), gliceraldeído-fosfato desidrogenases (GAFDI), fosfoglicerato cinases (FGC), piruvato cinases (PIC ou PCI), álcool desidrogenases (ADI), bem como genes codificando amilases, glucoamilases, proteases, xilanases, celobiohidrolases, β-galactosidases, álcool (metanol) oxidases, fatores de elongamento e proteínas ribossomais. Exemplos específicos de genes altamente expressos adequados incluem e.g. o gene LAC4 de Kluyveromyces sp., os genes de metanol oxidase (AOX e MOX) de Hansenula e de Pichia, respetivamente, os genes de glucoamilase (glaA) de A. niger e de A. awamori, o gene de TAKA-amilase de A. oryzae, o gene gpdA de A. nidulans e os genes de celobiohidrolase de T. reesei. 35

Exemplos de promotores constitutivos e/ou induziveis fortes que são preferenciais para uso em hospedeiros de expressão fúngicos15,16'35 são aqueles que são obteníveis dos genes fúngicos para os promotores da xilanase (xlnA) , da fitase, da ATP-sintetase, da subunidade 89 (oliC) , da triose-fosfato isomerase (tpi), da álcool desidrogenases (AdhA) , da α-amilase (amy) , da amiloglucosidase (AG - do gene glaA), da acetamidase (amdS) e da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (gpd) .

Exemplos de promotores de levedura fortes são aqueles obteníveis dos genes para álcool desidrogenase, lactase, 3-fosfoglicerato cinase e triose-fosfato isomerase.

Exemplos de promotores bacterianos fortes são os promotores da α-amilase e da SPo2 bem como os promotores dos genes de protease extracelulares. 0 promotor nativo do gene codificando uma xilanase pode ser substituído por um promotor que seja regulado diferentemente do promotor nativo.

Promotores adequados para células vegetais incluem os promotores da nopalina sintase (nos), da octopina sintase (ocs), da manopina sintase (mas), da subunidade pequena da ribulose (sup rubisco), da histona, a actina do arroz, da faseolina, do 35S e do 19D do vírus do mosaico da couve-flor (VMCF) e do circovírus. Todos estes promotores estão prontamente disponíveis na técnica. 0 vetor pode ainda incluir sequências flanqueando o polinucleótido originando o ARN que compreende sequências homólogas com sequências genómicas eucarióticas, 36 preferencialmente sequências genómicas de mamifero, ou sequências genómicas virais. Isto irá permitir a introdução dos polinucleótidos da invenção no genoma de células eucarióticas ou de vírus por recombinação homóloga. Em particular, um vetor plasmídico compreendendo a cassete de expressão flanqueada por sequências virais pode ser usado para preparar um vetor virai adequado para distribuição dos polinucleótidos da invenção a uma célula de mamífero. Outros exemplos de vetores virais adequados incluem vetores virais do herpes simples18'19 e retrovírus, incluindo lentivírus, adenovírus, vírus adenoassociados e vírus de VPH (tais como VPH-16 e VPH-18) . As técnicas de transferência génica usando estes vírus são conhecidas daqueles peritos na técnica. Os vetores de retrovírus por exemplo podem ser usados para integrar estavelmente os polinucleótidos originando o ARN antissenso no genoma do hospedeiro. Os vetores de adenovírus deficientes na replicação por contraste permanecem epissomais e portanto permitem uma expressão transiente. 0 vetor pode conter um polinucleótido da invenção orientado numa direção antissenso para proporcionar a produção de ARN antissenso. Isto pode ser usado para reduzir, se desejável, os níveis de expressão do polipéptido. Células hospedeiras e Expressão

Num aspeto adicional, a invenção proporciona um processo para preparação de um polipéptido de acordo com a invenção o qual compreende o cultivo de uma célula hospedeira (e.g. transformada ou transfectada com um vetor de expressão como descrito acima) sob condições para proporcionar a expressão (pelo vetor) de uma sequência codificando o polipéptido, e opcionalmente a recuperação do polipéptido expresso. Os 37 polinucleótidos da invenção podem ser incorporados num vetor replicável recombinante, e.g. um vetor de expressão. 0 vetor pode ser usado para replicar o ácido nucleico numa célula hospedeira compatível. Portanto, numa forma de realização adicional, a invenção proporciona um método para fabricar um polinucleótido da invenção pela introdução de um polinucleótido da invenção num vetor replicável, introduzindo o vetor numa célula hospedeira compatível, e crescendo a célula hospedeira sob condições que provocam a replicação do vetor. 0 vetor pode ser recuperado da célula hospedeira. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias tais como E. coli, levedura, linhas celulares de mamifero e outras linhas celulares eucarióticas, por exemplo células de inseto tais como células Sf9 e células fúngicas (e.g. filamentosas).

Preferencialmente, o polipéptido é produzido como um proteína secretada, caso em que a sequência de ADN codificando uma forma madura do polipéptido no constructo de expressão está operacionalmente ligada a uma sequência de ADN codificando uma sequência sinalizadora. Preferencialmente, a sequência sinalizadora é nativa (homóloga) da sequência de ADN codificando o polipéptido. Alternativamente, a sequência sinalizadora é estranha (heteróloga) à sequência de ADN codificando o polipéptido, caso em que a sequência sinalizadora é preferencialmente endógena à célula hospedeira na qual a sequência de ADN é expressa. Exemplos de sequências sinalizadoras adequadas para células hospedeiras de levedura são as sequências sinalizadoras derivadas de genes do fator-α de levedura. Similarmente, uma sequência sinalizadora adequada para células hospedeiras fúngicas filamentosas é e.g. uma sequência sinalizadora derivada de um gene de 38 amiloglucosidase (AG) fúngico filamentoso, e.g. o gene glaA de A. niger. Isto pode ser usado em combinação com o promotor de amiloglucosidase (também chamado (gluco)amilase) ele mesmo, bem como em combinação com outros promotores. Podem também ser usadas sequências sinalizadoras híbridas dentro do contexto da presente invenção.

Sequências líder secretoras heterólogas preferenciais são aquelas originando do gene de amiloglucosidade fúngico (AG) (glaA - ambas as versões dos aminoácidos 18 e 24 e.g. de Aspergillus) , o gene do fator-α (leveduras e.g. Saccharomyces e Kluyveromyces) ou o gene da a-amilase (Baccilus) .

Os vetores podem ser transformados ou transfectados numa célula hospedeira adequada como descrito acima para proporcionar a expressão de um polipéptido da invenção. Este processo pode compreender o cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão como descrito acima sob condições que proporcionem a expressão pelo vetor de uma sequência codificante codificando o polipéptido.

Um aspeto adicional da invenção proporciona portanto células hospedeiras transformadas ou transfectadas com ou compreendendo um polinucleótido ou um vetor da invenção. Preferencialmente, o polinucleótido é transportado num vetor para a replicação e a expressão do polinucleótido. As células serão escolhidas para serem compatíveis com o referido vetor e podem por exemplo ser células procarióticas (por exemplo bacterianas), fúngicas, de levedura ou vegetais. 39

Um hospedeiro heterólogo pode também ser escolhido em que o polipéptido da invenção é produzido numa forma a qual é substancialmente livre de outras enzimas que degradam a celulose. Isto pode ser alcançado escolhendo um hospedeiro que não produza normalmente tais enzimas como Kluyveromyces lactís. A invenção engloba processos para a produção do polipéptido da invenção por meio de expressão recombinante de uma sequência de ADN codificando o polipéptido. Para este propósito, a sequência de ADN da invenção pode ser usada para amplificação de genes e/ou para mudança de sinais de expressão, tais como promotores, sequências sinalizadoras da secreção, a fim de permitir a produção económica do polipéptido numa célula hospedeira homóloga ou heteróloga adequada. Uma célula hospedeira homóloga é uma célula hospedeira que é da mesma espécie ou que é uma variante dentro da mesma espécie da espécie da qual a sequência de ADN é derivada. Células hospedeiras adequadas são preferencialmente microrganismos procarióticos tais como bactérias, ou mais preferencialmente organismos procarióticos, por exemplo, fungos, tais como leveduras ou fungos filamentosos, ou células vegetais. Em geral, células de levedura são preferenciais sobre células fúngicas porque elas são mais fáceis de manipular. No entanto, algumas proteinas são quer pobremente secretadas de leveduras, quer em alguns casos não processadas corretamente (e.g. hiperglicosilação em levedura). Nesses casos, um organismo hospedeiro fúngico deve ser selecionado. 40 A célula hospedeira pode sobreexpressar o polipéptido, e técnicas de engenharia de sobreexpressão são bem conhecidas3. O hospedeiro pode portanto ter duas ou mais cópias do polinucleótido codificante (e o vetor pode portanto ter duas ou mais cópias conformemente).

Bactérias do género Bacillus são muito adequadas como hospedeiros heterólogos devido à sua capacidade de secretar proteínas no meio de cultura. Outras bactérias adequadas como hospedeiros são aquelas dos géneros Streptomyces e Pseudomonas. Uma célula hospedeira de levedura preferencial para a expressão da sequência de ADN codificando o polipéptido é dos géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowi, e Schizosaccharomyces. Mais preferencialmente, uma célula hospedeira de levedura é selecionada do grupo consistindo nas espécies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (também conhecida como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, e Schizosaccharomyces pombe.

As mais preferenciais são, no entanto, células hospedeiras fúngicas (e.g. filamentosas). Células hospedeiras fúngicas filamentosas preferenciais são selecionadas do grupo consistindo nos géneros Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, e Talaromyces. Mais preferencialmente, uma célula hospedeira fúngica filamentosa é das espécies Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, ou uma espécie do Grupo de Aspergillus niger23. Estas incluem mas não estão limitadas a Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus 41 foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicas, Aspergillus oryzae e Aspergillus ficuum, e consistindo ainda nas espécies Trichoderma reesei, Fusarium graminearum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thermophilum, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosphorum e Thielavia terrestris. Exemplos de hospedeiros de expressão preferenciais dentro do âmbito da presente invenção são fungos tais como espécies de Aspergillus ' e espécies de Trichoderma; bactérias tais como espécies de Bacillus26'21, e.g. Bacillus subtillis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, espécies de Pseudomonas; e leveduras tais como espécies de Kluyveromyces28, e.g. Kluyveromyces lactis29 e espécies de Saccharomyces, e.g. Saccharomyces cerevisiae. Células hospedeiras de acordo com a invenção incluem células vegetais, e a invenção estende-se assim a organismos transgénicos, tais como plantas e suas partes, os quais contém uma ou mais células da invenção. As células podem expressar heterologamente o polipéptido da invenção ou podem heterologamente conter um ou mais dos polinucleótidos da invenção. A planta transgénica (ou geneticamente modificada) pode portanto ter inserida (e.g. estavelmente) no seu genoma uma sequência codificando um ou mais dos polipéptidos da invenção. A transformação de células vegetais pode ser realizada usando técnicas conhecidas, por exemplo usando um plasmídeo Ti ou Ri de Agrobacterium tumefaciens. 0 plasmídeo (ou o vetor) pode portanto conter sequências necessárias para infetar uma planta, e podem ser empregues derivados dos plasmídeos Ti e/ou Ri. 42

Alternativamente pode ser efetuada infeção direta de uma parte de uma planta, tal como uma folha, uma raiz ou um caule. Nesta técnica, a planta a ser infetada pode ser ferida, por exemplo cortando a planta com uma lâmina ou perfurando a planta com uma agulha ou esfregando a planta com um abrasivo. A ferida é depois inoculada com a Agrobacterium. A planta ou a parte da planta pode depois ser crescida num meio de cultura adequado e permitida desenvolver numa planta madura. A regeneração das células transformadas em plantas geneticamente modificadas pode ser alcançada usando técnicas conhecidas, por exemplo pela seleção dos brotos transformados usando um antibiótico e pela subcultura dos brotos num meio contendo os nutrientes apropriados, hormonas vegetais e similares17.

Cultura das células hospedeiras e produção recombinante A invenção também inclui células que foram modificadas para expressar a xilanase ou uma sua variante. Tais células incluem linhas celulares eucarióticas mais altas transientes ou preferencialmente estáveis, tais como células de mamifero ou células de inseto, células eucarióticas mais baixas, tais como levedura e células fúngicas (e.g. filamentosas) ou células procarióticas tais como células bacterianas. É também possivel que as proteinas da invenção sejam transientemente expressas numa linha celular ou numa membrana, tal como por exemplo num sistema de expressão de baculovirus. Tais sistemas, os quais são adaptados para expressar as proteinas de acordo com a invenção, estão também incluidos dentro do âmbito da presente invenção. 43

De acordo com a presente invenção, a produção do polipéptido da invenção pode ser efetuada pela cultura de hospedeiros de expressão microbianos, os quais foram transformados com um ou mais polinucleótidos da presente invenção, num meio de fermentação de nutrientes convencional.

As células hospedeiras recombinantes de acordo com a invenção podem ser cultivadas usando procedimentos conhecidos na técnica. Para cada combinação de um promotor e de uma célula hospedeira, estão disponíveis condições de cultura que são favoráveis à expressão da sequência de ADN codificando o polipéptido. Depois de se alcançar a densidade ou o titulo celular desejada(o) do polipéptido, a cultura é interrompida e o polipéptido é recuperado usando procedimentos conhecidos. 0 meio de fermentação pode compreender um meio de cultura conhecido contendo uma fonte de carbono (e.g. glucose, maltose, melaços, etc), uma fonte de nitrogénio (e.g. sulfato de amónio, nitrato de amónio, cloreto de amónio, etc), uma fonte de nitrogénio orgânica (e.g. extrato de levedura, extrato de malte, peptona, etc) e fontes de nutriente inorgânicas (e.g. fosfato, magnésio, potássio, zinco, ferro, etc). Opcionalmente pode ser incluído um indutor (e.g. celulose, pectina, maltose, maltodextrina ou xilogalacturonano). A seleção do meio apropriado pode ser baseada na escolha do hospedeiro de expressão e/ou baseada nos requerimentos reguladores do constructo de expressão. Tais meios são conhecidos daqueles peritos na técnica. 0 meio pode, se desejado, conter componentes adicionais favorecendo os 44 hospedeiros de expressão transformados sobre outros microrganismos potencialmente contaminantes. A fermentação pode ser realizada ao longo de um período de 0,5-30 dias. Pode ser um processo de mistura, contínuo ou descontínuo, apropriadamente a uma temperatura na gama entre 0 e 45°C e, por exemplo, a um pH entre 2 e 10. Condições de fermentação preferenciais são uma temperatura na gama entre 20 e 37°C e/ou um pH entre 3 e 9. As condições apropriadas são usualmente selecionadas com base na escolha do hospedeiro de expressão e da proteína a ser expressa.

Após a fermentação, se necessário, as células podem ser removidas do caldo de fermentação por meio de centrifugação ou de filtração. Depois de a fermentação ter parado ou após a remoção das células, o polipéptido da invenção pode depois ser recuperado e, se desejado, purificado e isolado por meios convencionais. (D). Usos da xilanase e métodos de processamento de materiais contendo planta ou celulose (e.g. xilanase)

Os polipéptidos da invenção que possuem atividade de xilanase podem ser usados para tratar material fúngico ou vegetal incluindo polpa vegetal e extratos vegetais. Por exemplo, eles podem ser usados para tratar cereais, legumes, frutas ou seus extratos. Convenientemente o polipéptido da invenção é combinado com transportadores adequados (sólidos ou líquidos) ou com diluentes incluindo tampões para produzir uma composição/preparação enzimática. O polipéptido pode ser ligado a ou misturado com um transportador, e.g. imobilizado num transportador sólido. Portanto, a presente invenção proporciona num aspeto 45 adicional uma composição compreendendo um polipéptido da invenção. Este pode estar numa forma adequada para empacotamento, para transporte e/ou para armazenamento, preferencialmente onde a atividade de xilanase seja retida. As composições podem ser na forma de pasta, de liquido, de emulsão, de pó, de flocos, de granulado, de pastilha ou de outro extrudido. A composição pode compreender adicionalmente ingredientes tais como uma ou mais enzimas, por exemplo pectinases, incluindo endoarabinases e ramnogalacturonase, celulases, (outras) xilanases, galacturonases, mananases e/ou xiloglucanases. 0 polipéptido é tipicamente estavelmente formulado na forma quer líquida, quer seca. Tipicamente, o produto é fabricado como uma composição que irá opcionalmente incluir, por exemplo, um tampão de estabilização e/ou um conservante. As composições podem também incluir outras enzimas capazes de digerir material vegetal ou celulose, por exemplo outras celuloses, e.g. (β-D-)glucanases. Para certas aplicações, podem ser preferenciais a imobilização da enzima numa matriz sólida ou a incorporação nas ou dentro das partículas transportadoras. A composição pode também incluir uma variedade de outras enzimas que degradam material vegetal, por exemplo celulases e outras pectinases.

Os polipéptidos e as composições da invenção podem portanto ser usados num método de processamento de material vegetal para degradar ou para modificar os constituintes celulósicos (e.g. xilano) das paredes celulares do material vegetal ou fúngico. Portanto, num aspeto adicional, a presente invenção proporciona um método de degradação ou de modificação de uma célula vegetal, que compreende o 46 contacto da célula vegetal ou fúngica com um polipéptido ou com uma composição da invenção. A invenção também proporciona um método de processamento de um material vegetal, que compreende o contacto do material vegetal com um polipéptido ou com uma composição da invenção para degradar ou para modificar a celulose no material (vegetal). Preferencialmente, o material vegetal é uma polpa vegetal ou um extrato vegetal, tal como sucos.

Em particular, a degradação compreende preferencialmente a clivagem das subunidades de xilano de um componente celulósico da parede celular vegetal. 0 material vegetal é preferencialmente um cereal, um legume, uma fruta ou polpa ou extrato de legume ou de fruta. A presente invenção proporciona ainda um material vegetal processado obtenivel pelo contacto de um material vegetal com um polipéptido ou com uma composição da invenção. A presente invenção também proporciona um método para reduzir a viscosidade de um extrato vegetal, que compreende o contacto do extrato vegetal com um polipéptido ou com uma composição da invenção numa quantidade eficaz na degradação da celulose (ou do xilano) contido no extrato vegetal.

Materiais vegetais e contendo celulose incluem polpa vegetal, partes de plantas e extratos vegetais. No contexto desta invenção, um extrato de um material vegetal é qualquer substância que pode ser derivada de material vegetal por extração (mecânica e/ou quimica), por processamento ou por outras técnicas de separação. 0 extrato pode ser sumo, néctar, de base, ou concentrados dos mesmos. 0 material vegetal pode compreender ou ser derivado 47 de legumes, e.g., cenouras, aipos, alhos, leguminosas ou plantas leguminosas (soja, semente de soja, ervilhas) ou fruta, e.g. fruta pomóidea ou de semente (maçãs, peras, marmelos, etc), uvas, tomates, citrinos (laranja, limão, lima, tangerina), melões, ameixas, cerejas, groselhas-pretas, groselhas-vermelhas, framboesas, morangos, mirtilos, ananás e outras frutas tropicais, árvores e suas partes (e.g. pólen, de pinheiros), ou cereal (aveia, cevada, trigo, milho, arroz) . 0 material (a ser hidrolisado) pode também ser residuos da agricultura, tais como polpa de beterraba sacarina, espigas de milho, palha de trigo, cascas de nozes (da terra), ou materiais recicláveis, e.g. papel (desperdiçado).

Os polipéptidos da invenção podem portanto ser usados para tratar material vegetal incluindo polpa vegetal e extratos vegetais. Eles podem também ser usados para tratar géneros alimentícios líquidos ou sólidos ou ingredientes do género alimentício comestível, ou ser usados na extração de café, óleos vegetais, amido ou como um espessante em alimentos.

Tipicamente, os polipéptidos da invenção são usados como uma composição/preparação enzimática como descrito acima. A composição será geralmente adicionada à polpa vegetal obtenível por por exemplo processamento mecânico tal como esmagamento ou moagem do material vegetal. A incubação da composição com a planta será tipicamente levada a cabo por um tempo entre 10 minutos a 5 horas, tal como 30 minutos a 2 horas, preferencialmente durante cerca de 1 hora. A temperatura de processamento é preferencialmente 10-55°C, e.g. de 15 a 25°C, otimamente cerca de 20°C e pode-se usar 10-300 g, preferencialmente 30-70 g, otimamente cerca de 50 g de enzima por tonelada de material a ser tratado. Toda(s) 48 a(s) enzima(s) e as suas composições usadas podem ser adicionadas sequencialmente ou ao mesmo tempo à polpa vegetal. Dependendo da composição da preparação enzimática, o material vegetal pode primeiramente ser macerado (e.g. até um puré) ou liquefeito. Usando os polipéptidos da invenção, os parâmetros de processamento tais como o rendimento da extração, a viscosidade do extrato e/ou a qualidade do extrato podem ser melhorados. Alternativamente, ou adicionalmente ao acima, um polipéptido da invenção pode ser adicionado ao suco bruto obtido da pressão ou da liquefação da polpa vegetal. 0 tratamento do suco bruto será levada a cabo numa maneira similar à polpa vegetal no que diz respeito à dosagem, à temperatura e ao tempo de retenção. Mais uma vez, podem ser incluídas outras enzimas tais como aquelas discutidas previamente. Condições de incubação típicas são as descritas no parágrafo prévio. Logo que o suco bruto tenha sido incubado com os polipéptidos da invenção, o suco é depois centrifugado ou (ultra)filtrado para produzir o produto final.

Após o tratamento com o polipéptido da invenção, o produto (final) pode ser tratado com calor, e.g. a 100°C durante um tempo entre 1 minuto a 1 hora, sob condições para inativar parcialmente ou completamente o(s) polipéptido(s) da invenção.

Uma composição contendo um polipéptido da invenção podem também ser usada durante a preparação dos purés de fruta ou de legumes. 0 polipéptido da invenção pode também ser usado no fabrico de cerveja, no fabrico de vinho, na destilaria e na 49 panificação. Pode portanto ser usado na preparação de bebidas alcoólicas tais como vinho e cerveja. Por exemplo, pode melhorar a filtrabilidade ou a transparência (de cervejas, do mosto ou do vinho). A proteina pode auxiliar na remoção de substâncias orgânicas dissolvidas do caldo ou do meio de cultura, por exemplo onde os desperdícios da destilaria de origem orgânica são bioconvertidos em biomassa microbiana. A xilanase pode melhorar a filtrabilidade e/ou reduzir a viscosidade em xaropes de glucose, tais como de cereais produzidos por liquefação (e.g. com α-amilase).

Na panificação, o polipéptido pode melhorar a estrutura da pasta, modificar a sua adesividade ou a sua maciez, melhorar o volume do pão e/ou a estrutura granulada ou conferir melhores características texturais tais como quebra, trituração ou qualidade de grânulos. 0 polipéptido pode ser adicionado numa quantidade de 100 a 3.000, tal como de 150 a 2.000, otimamente se 200 a 1.600, UEX/kg de farinha.

Os polipéptidos encontram uso num número de áreas industriais devido à sua atividade de xilanase. Estas podem incluir não só a produção de álcool, mas também a biometanização, o fabrico de pão e a panificação, a higiene dental (por exemplo composições dentais ou orais), o tratamento ou fabrico de couro, o fabrico de papel, os produtos farmacêuticos, o chá, a preparação ou o tratamento de têxteis, e o tratamento de desperdício. Um aspeto da invenção é portanto um alimento ou um género alimentício compreendendo o polipéptido, tal como um bebida alcoólica, pão, pasta ou chá. O polipéptido pode ser formulado em composições adequadas para qualquer um destes usos. O 50 polipéptido pode estar presente numa composição aquosa (e.g. água quente), preferencialmente com um ou mais fungicidas, de modo a tratar material vegetal (e.g. bolbos), especialmente para controlar insetos parasiticos, ácaros e nematoides. Como o polipéptido da invenção pode degradar o xilano, eles podem ser adicionados a alimentos ou a géneros alimentícios (por exemplo pelo consumo por humanos). A invenção também inclui composições farmacêuticas ou veterinárias que compreendem o polipéptido da invenção e o transportador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

Os polipéptidos da invenção podem também apresentar atividade antifúngica. Eles podem ser capazes de degradar paredes celulares fúngicas, e portanto podem ser empregues na lise celular fúngica, de modo a abrir as células. Isto pode libertar proteínas intracelulares. De tal modo, os polipéptidos podem ser usados para preparar extratos de levedura e/ou fúngicos. E. Rações Animais A invenção relaciona-se adicionalmente com géneros alimentícios ou uma composição ou aditivo da ração animal compreendendo um ou mais polipéptidos da invenção. 0 polipéptido pode estar presente na ração a uma concentração diferente da sua concentração natural. As quantidades preferenciais são de 0,6 a 35, tais como de 1,5 a 15, preferencialmente de 3 a 15, mg por kg de ração.

Adequadamente o polipéptido da invenção está presente na ração de 1.000 a 50.000 UEX/kg de ração, tal como de 2.500 a 25.000 UEX/kg, otimamente de 5.000 a 20.000 UEX/kg. 51 A invenção também se relaciona com um processo para a preparação de uma composição de ração animal, o processo compreendendo a adição de um(a) ou mais substância(s) ou ingrediente(s) de ração comestíveis, adequadamente contendo xilano, um polipéptido da invenção. Os polipéptidos podem ser adicionados à composição de ração animal separadamente das substâncias ou dos ingredientes da ração, individualmente ou em combinação com outros aditivos da ração. 0 polipéptido pode ser uma parte integral de um (a) das substâncias ou dos ingredientes.

Os polipéptidos da invenção podem também ser adicionados a rações animais ricas em celulose para melhorar a desagregação da parede celular vegetal para uma utilização melhorada dos nutrientes vegetais pelo animal. Os polipéptidos da invenção podem ser adicionados à ração ou à silagem se dietas pré-imersão ou molhadas são preferenciais. Vantajosamente, os polipéptidos da invenção podem continuar a degradar a celulose na ração in vivo. Polipéptidos baseados em fungos da invenção em particular têm geralmente um pH ótimo menor e são capazes de libertar nutrientes importantes em tais ambientes ácidos como o estômago de um animal. A invenção portanto também contempla rações (e.g. animais) e géneros alimentícios compreendendo um ou mais polipéptidos da invenção.

Os polipéptidos da invenção podem também ser usados durante a produção de substitutos (ou substituintes) lácteos da soja. Estes substitutos lácteos podem ser consumidos por ambos os humanos e os animais. Um problema típico durante a preparação destes substitutos lácteos é a elevada viscosidade da pasta de soja, resultando na necessidade de uma diluição indesejável da pasta até uma concentração de 52 sólidos secos de 10 a 15%. Uma preparação enzimática contendo um polipéptido da invenção pode ser adicionada à, ou durante o processamento da, pasta, possibilitando um processamento a uma concentração de sólidos secos mais alta (tipicamente 40 a 50%) . A enzima pode também ser usada na preparação de produto(s) saboroso(s), e.g. de soja. A composição pode adicionalmente compreender (particularmente quando está a ser formulada para uso em ração animal) um ou mais iónoforos, agentes oxidantes, surfatantes, aminoácidos protegidos do rume, potenciadores enzimáticos ou enzimas que possam ser produzidas no trato gastrointestinal dos animais a serem alimentados.

Quando adicionados a rações (incluindo a silagem) para ruminantes ou animais monogástricos (e.g. aves de capoeira e suinos), as rações podem compreender cereais tais como cevada, trigo, milho, centeio ou aveia ou subprodutos cerealíferos tais como farelo de trigo ou farelo de milho, ou outros materiais vegetais tais como sojas e outras leguminosas. A(s) enzima(s) pode(m) significativamente melhorar a desagregação de paredes celulares vegetais o que leva à melhor utilização dos nutrientes vegetais pelo animal. Como consequência, a taxa de crescimento e/ou a conversão da ração podem ser melhoradas. Os polipéptidos da invenção podem ser adicionados à ração (diretamente ou como um aditivo ou um ingrediente) ou um ingrediente da ração tratado (e.g. celulose/xilano) pode ser adicionado em vez disso. A proteína pode reduzir a viscosidade da ração (contendo xilano): a proteína pode continuar a hidrolisar o xilano in vivo. As proteínas da invenção são particularmente 53 aplicáveis a rações animais uma vez que elas podem ainda estar ativas sob condições altamente ácidas, tais como no estômago de animais.

Um método particularmente preferencial para a adição (exógena) da xilanase modificada é a adição do polipéptido da invenção como material vegetal transgénico e/ou semente (e.g. transgénica). 0 polipéptido pode portanto ter sido sintetizado através de expressão génica heteróloga, por exemplo o gene codificando a enzima desejada pode ser clonado num vetor de expressão vegetal, sob controlo dos sinais de expressão vegetais apropriados, e.g. um promotor especifico do tecido, tal como um promotor especifico da semente. 0 vetor de expressão contendo o gene codificando o polipéptido pode ser subsequentemente transformado em células vegetais, e as células transformadas podem ser selecionadas para regeneração em plantas inteiras. As plantas transgénicas assim obtidas podem ser crescidas e colhidas, e aquelas partes das plantas contendo o polipéptido heterólogo (para a planta) podem ser incluidas numa das composições, quer como tal, quer após processamento adicional. Métodos gerais para a expressão (heteróloga) de enzimas em plantas (transgénicas), incluindo métodos para expressão especifica de semente de enzimas, são conhecidos30. 0 polipéptido heterólogo pode estar contido na semente das plantas transgénicas ou pode estar contido noutras partes da planta tais como raizes, caules, folhas, madeira, flores, casca e/ou fruta. A planta pode ser uma monocot ou uma dicot. Plantas adequadas incluem cereais, tais como aveia, cevada, trigo, milho e arroz. Preferencialmente o polinucleótido da invenção é estavelmente incorporado no genoma vegetal. 54 A adição do polipéptido na forma de material vegetal transgénico, e.g. em semente transgénica pode requerer o processamento do material vegetal de modo a tornar a enzima disponível, ou pelo menos melhorar a sua disponibilidade. Tais técnicas de processamento podem incluir várias técnicas mecânicas (e.g. moagem e/ou trituração) ou tratamentos termomecânicos tais como extrusão ou expansão. A presente invenção também se relaciona portanto com um processo para promoção do crescimento e/ou para conversão da ração num animal monogástrico ou não ruminante, o processo compreendendo a alimentação ao animal com o polipéptido da invenção. Animais adequados incluem animais de quinta, monogástricos e/ou não ruminantes tais como porcos (ou leitões), aves de capoeira (tais como galinhas, perus), vitelos ou bezerro ou animais aquáticos (e.g. marinhos) (por exemplo peixe).

Ensaios para Enzimas que Degradam a Celulose

Também no âmbito da presente invenção é o uso de polipéptidos de acordo com a invenção em métodos de rastreio para identificar compostos que podem atuar como antagonistas que podem modular a xilanase. Em termos gerais, tais métodos de rastreio podem envolver o contacto de um polipéptido da invenção com um composto de teste e depois a medição da atividade ou a incubação de um polipéptido da invenção com uma substância de teste e depois a deteção de qualquer modulação da atividade de xilanase. Agentes que se ligam aos polipéptidos da presente invenção podem também ser identificados. A atividade moduladora pode ser determinada pelo contacto das células expressando um polipéptido da invenção com uma 55 substância sob investigação e pela monitorização do efeito mediada pelos polipéptidos. As células expressando o polipéptido podem estar in vitro e preferencialmente o ensaio é levado a cabo in vitro usando células expressando o polipéptido recombinante.

Os ensaios e os substratos descritos têm permitido a identificação e a confirmação da atividade de xilanase. Estes ensaios podem ser usados para detetar outras enzimas que degradam a celulose, por exemplo aquelas com atividade de xilanase. 0 substrato que pode ser usado para este ensaio pode compreender xilano.

Outro aspeto da invenção relaciona-se com um ensaio para identificação ou deteção de um polipéptido que é capaz de degradar a celulose. A atividade pode ser uma xilanase, ou, pode ser pectina liase, poligalacturonase, esterase, celulase, xiloglucanase, galactonase, arabinanase ou ramnogalacturonase. Este ensaio pode compreender: (a) proporcionar, como um substrato para um composto candidato (usualmente um polipéptido), um substrato adequado (como descrito); e (b) contactar o substrato com o composto candidato, e detetar se quaisquer produtos da atividade de xilanase são produzidos.

Os ensaios acima podem ser empregues para identificar moduladores da atividade de xilanase. Tais compostos podem reduzir o amaciamento da fruta, o qual pode permitir melhor sabor e desenvolvimento da cor da fruta e podem também permitir maior vida de prateleira e/ou de expedição. Portanto estes ensaios podem ser usados para identificar 56 inibidores dos polipéptidos da invenção que podem ser capazes de inibir o amaciamento da fruta.

Aspetos e caracteristicas preferenciais de um aspeto da invenção são aplicáveis a outro aspeto mutatis mutandis. A invenção irá agora ser descrita com referência aos seguintes Exemplos os quais pretende-se que sejam somente ilustrativos e não limitantes.

EXEMPLOS

Procedimentos gerais Técnicas de clonagem molecular padrão tais como isolamento de ADN, eletroforese de gel, modificações de restrição enzimática de ácidos nucleicos, análises de Southern, transformação de E. coli, surgimento de colónias e hidridações de filtro, etc, foram realizadas usando técnicas padrão.1,2 Foram obtidos oligodexosinucleótidos sintéticos da ISOGEN Bioscience (Maarssen, Holanda). Foram realizadas análises de sequência de ADN num sequenciador de ADN 373A da Applied Biosystems, de acordo com as instruções do fornecedor. A marcação e as hibridações de ADN foram conduzidas de acordo com os sistemas de marcação e de deteção de ácido nucleico diretas ECL™ (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Inglaterra) ou de acordo com as técnicas de marcação radioativa padrão.1

EXEMPLO 1: Isolamento de ARN de T. emersonii e sintese de cADN A estirpe de T. emersonii CBS 393.64 foi fermentada sob condições indutoras do xilano. A vários pontos de tempo, 57 foram colhidos micélio e sobrenadantes da cultura por filtração usando o envoltório filtrante Miracloth. 0 micélio foi lavado extensivamente com água desmineralizada e espremido entre toalhas de papel para remover a água excessiva. 0 micélio dos diferentes pontos de tempo (com base nas medições de celulase nos sobrenadantes da cultura) foi congelado imediatamente em nitrogénio liquido e moido até um pó fino usando um almofariz e um pilão. 0 pó resultante foi transferido para um tubo estéril de 50 mL e foi pesado: para cada 1-1,2 g de micélio moido, 10 mL de reagente TRIzol (Gibco/BRL) foram adicionados (max. 25 mL por tubo). O pó micelial foi imediatamente solubilizado por mistura vigorosa (utilização de vortex, 1 min), seguida de 5 minutos de incubação a temperatura ambiente com mistura ocasional. Um volume de 0,2 (TRIzol original) de clorofórmio (portanto 2 mL para cada 10 mL de TRIzol usado originalmente) foi adicionado, usado em vortex e deixado a temperatura ambiente durante 10 minutos. Subsequentemente, a mistura foi centrifugada a 4°C, 6000 g durante 30 minutos. A fase aquosa no topo foi transferida para um novo tubo e o ARN total foi precipitado pela adição de um volume de 0,5 (TRIzol original) de álcool isopropílico (portanto 5 mL de álcool isopropílico para cada 10 mL de TRIzol usado originalmente). Após 10 minutos de precipitação a temperatura ambiente, o ARN foi recuperado por centrifugação durante 30 minutos a 6000 g. Na remoção do sobrenadante, a pastilha de ARN foi lavada com um volume de etanol a 70%. Após a remoção do etanol, a pastilha de ARN foi seca ao ar. A pastilha de ARN seca foi dissolvida em 3 mL de tampão de GTS (Tris-Cl 100 mM, pH 7,5, tiocianato de guanidina 4 M, lauril sarcosinato de sódio a 0,5%). Foram usados 10 pL de solução de ARN para determinar a qualidade e a concentração dos ácidos nucleicos. 58

Uma análise de Northern foi realizada3 e o ARN isolado adicionalmente purificado.1'3 Para ao isolamento do mARN, foi usado um protocolo modificado (usando fluxo de gravidade em vez de centrifugação) do conjunto de purificação PHARMACIA (Cat no. 27-9258-02) .3 Para a síntese de cADN, o CONJUNTO de Síntese do cADN STRATAGENE foi usado de acordo com as instruções do fabricante, exceto para um número de otimizações para usar os vetores pGBIN com o grandes mudanças como foi previamente descrito. A quantidade de cADN sintetizado foi estimada por precipitação de ATC e subsequentemente analisada através de eletroforese em géis de agarose alcalinos.3 EXEMPLO 2: Preparação de uma biblioteca de cADN do mARN de T. emersonii O conjunto de cADN obtido no Exemplo 1 foi embotado, ligado com adaptadores e digerido por enzimas de restrição.3 A clonagem do cADN no vetor de expressão pGBFIN-113 requer a presença de um local EcoRI na extremidade-5' e de um local Xhol na extremidade-3' do cADN. Assim sendo, a primeira cadeia inicial de oligonucleótidos e as sequências adaptadoras usados (Pharmacia) foram escolhidas para satisfazer os pré-requisitos estabelecidos para o vetor de expressão.

Os cADNs obtidos foram separados através de fracionamento por tamanho através de uma matriz SEPHAROSE CL-2B, na qual os tamanhos dos conjuntos individuais obtidos foram analisados através de eletroforese de gel não desnaturante.3 Dois conjuntos de cADNs, obtidos através de 59 limites de exclusão de 0,5 kb e a 1,0 kb respetivamente, foram selecionados para construção da biblioteca de cADN em pGBFIN-11. Para o pGBFIN-11, foi preparado um conjunto do vetor pGBFIN-11 (ligação conhecida <1%) completamente duplamente digerido (EcoRI-Xhol). Os conjuntos de cADN selecionados foram ligados ao vetor pGBFIN-11 e transformados em células bacterianas de E. coli XLIO-Gold para gerar duas bibliotecas de cADN primárias. As frequências de transformação dos dois conjuntos foram ambas >1,OxlO6.

De uma fração de ambas as bibliotecas de cADN de E. coli, foram selecionadas colónias aleatoriamente e foi isolado ADN plasmidico. A análise deste ADN plasmídico demonstrou que ambas as bibliotecas de cADN tinham percentagens de inserção entre 90 e 95%.

Além disso, foram realizados surgimentos de colónias a partir de uma fração da biblioteca e os filtros gerados foram subsequentemente hibridados com o gene gdpA de T. emersonii, codificando o gene da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. De seguida, o ADN plasmidico foi isolado e através de análise de restrição foi demonstrado que todos os plasmideos continham inserções únicas na orientação correta. A sequenciação das extremidades 5' dos cAdDN dentro destes plasmideos contendo gpdA de T. emersonii demonstrou que >85% foram de comprimento total. EXEMPLO 3: Transformação da biblioteca de expressão de A. niger

Foi isolado ADN da biblioteca de cADN de E. coli como descrito anteriormente. 0 ADN plasmidico total foi digerido durante 4 horas a 37 °C com Not 1 para remover sequências 60 plasmídicas derivadas da E. coli. Após a purificação, o ADN foi dissolvido em água desmineralizada estéril. Múltiplas transformações de DS2978 de A. niger foram realizadas3 usando 1.5xl07 a 3.0xl07 de protoplastos e 10 yg de ADN plasmidico por transformação. Foram selecionados transformantes para a presença do marcador de seleção andS pelo crescimento em acetamida como a única fonte de N. Uma vez que ambos o marcador de seleção amdS e a cassete de expressão do cADN estão presentes no fragmento integrante, o crescimento em acetamida é indicativo da presença da uma cassete de expressão do cADN.

Após aproximadamente 7-10 dias de incubação a 30°C, foram purificados 10.000 transformantes: os transformantes de Aspergillus niger foram transferidos roboticamente (automatizador selecionador de colónias Flexys™) das placas de transformação para 96 poços MTP Master Plates Placas (MPs) contendo 150 yL por poço de meio seletivo (MS) solidificado (por 1000 mL: 0,52 g de KC1, 1,52 g de K2HPO4, 0,52 g de MgS04, 20 g de glucose, 1 g de acetamida, tampão MÊS 0,1 M, 15 g de agar, 1 mL de solução de oligoelemento (contendo, por litro: 2,2 g de ZnS04/7H20, 1,1 g de H3BO3, 0,5 g de FeS04/7H20, 0,17 g de CoC12/6H20, 0,16 g de CuS04/5H20, 0,15 g de NaMo04/2H20, 5,0 g de AEDT, pH 6,5)) a pH 5,5. Os transformantes foram crescidos em MS durante 5 dias a 34°C. O conjunto de PMs assim gerado foi usado para inocular as MPs para crescimento e subsequente deteção enzimática e placas de reserva (PRs) da biblioteca de cADN que foram armazenadas a -80°C. EXEMPLO 4: Análise da biblioteca de expressão de T. emersonii 61 PMs com 5 dias de crescimento foram usadas como molde de replicação e as réplicas semeadas em placas de meio seletivo (MS) fresco, contendo 0,075% de AZCL-xilano (contendo por litro: 0,52 g de KC1, 1,52 g de K2HPO4, 0,52 g de MgSCU, 20 g de glucose, 1 g de acetamida, tampão MÊS 0,1 M, 15 g de agar, 1 mL de solução de oligoelemento (por 1 litro: 2,2 g de ZnS04/7H20, 1,1 g de H3BO3, 0,5 g de FeS04/7H20, 0,17 g de CoCl2/6H20, 0,16 g de CuS04/5H20, 0,15 g de NaMoC>4/2H20, 5,0 g de AEDT, pH 6,5)) a pH 5,5, 0,75 g de AZCL-xilano (Megazyme, Austrália).

Uma vez inoculadas, as placas foram inoculadas a 34°C durante 48 horas e depois durante 6 horas a 65°C. As placas foram contadas antes e depois da incubação a alta temperatura. As colónias positivas exibindo atividade de xilanase mostraram um halo difuso azul.

Os clones de xilanase positivos deste primeiro rastreio foram reinoculados em meio MS fresco e crescidos durante 5 dias a 34°C. A placa de molde assim obtida foi depois replicada em meio seletivo e em meio seletivo contendo 0,075% (p/v) de AZCL-xilano (Megazyme). A placa de AZCL- xilano foi tratada como previamente descrito.

As placas de MS foram incubadas durante 48 horas a 34°C e subsequentemente foram preenchidas com xilano de espelta de aveia contendo agar de topo (5 g de agarose, 0,5 g de xilano de espelta de aveia (ref Sigma: X0627)) preparado em 1 litro de tampão fosfato 50 nM (pH 7) . Uma vez o agar de topo solidificado, as placas foram colocadas a 65°C durante 4 horas. Para a visualização da atividade, as placas foram coradas com uma solução de vermelho do Congo (10 g de vermelho do Congo em 1 litro de tampão fosfato pH 7,0) 62 durante 15 minutos. A solução corante foi descartada e as placas foram lavadas com NaCl 1M. Este passo de lavagem foi repetido duas vezes. Os clones positivos apareceram pela formação de um halo de depuração pálido no fundo de vermelho (de Congo). Finalmente, 9 clones de xilanase positivos foram identificados.

Os transformantes de Aspergillus produtores de xilanase, como identificados no ensaio de placa de xilanase, foram crescidos em fermentação de frasco agitado3. Amostras do meio foram tomadas após 5 dias de fermentação e analisadas quanto à atividade de xilanase como se segue. 0 sobrenadante (pré-diluído quando necessário) foi diluído 5 vezes em tampão de acetato de sódio 0,25 M, pH 4,5. Foram transferidos 20 pL de sobrenadante diluído para pratos de microtitulação e foram adicionados e misturados cuidadosamente pipetando para cima e para baixo 50 pL de substrato (4% (p/v) de Azul Brilhante de Remazol (ABR)-Xilano (dissolvido a 70°C em água desmineralizada). A mistura reacional foi incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente. A reação foi interrompida pela adição de 200 pL de etanol a 96% e pela incubação durante 10 minutos a temperatura ambiente. Após a reação ter sido terminada, as placas de microtitulação foram centrifugadas durante 10 minutos a 2500 rpm numa centrífuga GPK Beckman a temperatura ambiente. Foram transferidos 100 pL do sobrenadante para um novo prato de microtitulação e a absorvância da cor azul foi medida espetrofotometricamente a 620 nm num leitor da Anthos (Proton e Wilton). A atividade específica foi calculada a partir de uma curva de calibração usando um padrão de xilanase dissolvido em tampão de acetato de fosfato 0,25 M e pH 4,5. 63 EXEMPLO 5: Análise genética dos transformantes positivos

Os transformantes positivos (reconfirmados) identificados no Exemplo 4 foram crescidos em meio liquido, o micélio foi colhido e o ADN total (cromossomal) foi isolado usando o Sistema de Isolamento Puregene (Biozym B.V.) para o isolamento de ADN de fungos filamentosos. 0 isolamento e a purificação de ADN foram realizados de acordo com o protocolo dos fabricantes, mas ligeiramente modificado: foram repetidos os passos 3 e 4 de precipitação proteica. 0 ADN cromossomal foi usado como um modelo numa reação de RCP usando iniciadores 12207 (SEQ ID No. 4) e 11937 (SEQ ID No. 3) para amplificar a(s) inserção(ões) presente(s) na cassete de expressão integrada no ADN cromossomal.

Foram realizadas RCPs diretas nos transformantes de acordo com uma versão adaptada de um protocolo conhecido4 exceto que o micélio obtido foi subsequentemente tratado com Glucanex™ (Novo Nordisk) a concentrações de 5 mg/mL em vez de com NOVOzyme.

As reações de RCP continham tampão B eLONGase™ (Life Technologies, Breda, Holanda), dNTPs (200 μΜ de cada), 1 pL de Mistura Enzimática elongate™, 1-5 pL do modelo, e 10-30 pmol de cada oligo, num volume final de 50 pL. A quantidade ideal de oligos foi determinada experimentalmente para cada mistura comprada. Em média, foram usados 10 a 30 pmol. As reações foram realizadas com as seguintes condições de ciclo: lx(2 min) 94°C, 35x(l min 94°C, 1 min 55°C, 6 min 72°C), lx(7min 72 °C). As amostras foram carregadas em géis de agarose para análises de produtos de RCP. 64 0 produto de RCP assim obtido foi subclonado no vetor de clonagem pcr2.1 de E. coli (Invitrogen, de acordo com as instruções do fabricante), resultando no plasmideo pGBXEA-1. A estirpe de E. coli abrigando o plasmideo pGBXEA-1 foi depositada no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda sob o número de acesso CBS 102183. O produto de RCP subclonado foi sequenciado. A sequência de nucleótidos resultante da região codificante está representada na SEQ ID No. 1 e a sequência de aminoácidos deduzida da proteina na SEQ ID No. 2. Esta proteina foi denominada XEA. EXEMPLO 6: Caracterização da xilanase de Talaromyces emersonii

Definição de Unidade de Endoxilanase (UEX) para esta especificação A unidade de atividade de xilanase (UEX) é definida como a quantidade de enzima (endol endo-1,4^-xilanase de Asp. niger31) que liberta 4,53 ymol de açúcares redutores (medidos como equivalentes da xilose) por minuto sob as condições de ensaio. As condições de ensaio compreendem: 5 mg/mL de arabinoxilano de farinha de trigo (Megazyme, Austrália, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) em tampão de citrato de sódio 100 mM (pH 3,5), temperatura 40°C, a um tempo de reação de 60 minutos. As reações foram interrompidas pela adição de NaOH 1M. A deteção foi feita colorimetricamente a 420 nm após a incubação das amostras com Fe-III-hexacianeto durante 15 minutos em água fervente. 0 reagente de hexacianoferrato foi feito pela dissolução de 1,17 g de KFe(CN) e 19,5 g de carbonato de sódio anidro em 1 litro de água. 65

Ensaio Viscométrico

Adicionalmente à determinação absoluta da atividade de xilanase acima foi usado um método relativo que seguiu a diminuição da viscosidade de uma solução de arabinoxilano de trigo (Megazyme, Austrália, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) após adição de certa quantidade de enzima. 0 arabinoxilano de trigo foi dissolvido em tampão de citrato de sódio 0,425 M (pH 3,5) até uma concentração de 8,3 mg/mL. O substrato foi incubado a 55°C durante 10 minutos. Subsequentemente uma pequena quantidade de enzima (na gama de 0,01-0,05 Unidades/mL) foi adicionada e permitiu-se que a reação prosseguisse. Após 60 minutos de tempo de reação, a viscosidade da amostra foi determinada relativamente a uma referência que foi incubada com um padrão de endoxilanase de Aspergillus niger31 de atividade UEX conhecida. As atividades absolutas em UEX para o padrão foram determinadas pelo método de açúcar redutor usando Fe-III-hexacianeto como descrito acima. A viscosidade foi determinada manualmente usando um dispositivo de viscosidade de queda de esfera Haake.

Análise da Atividade dos Açúcares Redutores A atividade enzimática de acordo com a definição XPU foi medida pela deteção de açúcares redutores usando hidrazida do ácido 4-hidroxi-benzoico (HAPHB). Um XPU de atividade é definido como a quantidade de enzima requerida para libertar uma ymol de açúcares redutores produzidos por minuto do arabinoxilano de trigo a pH 5,0 e 60°C durante 15 minutos, usando uma curva de calibração da D(+)xilose. Este é um ensaio conhecido32 com uma modificação ao reagente HAPBH como se segue: citrato de trisódio 0,05 M, Na2SC>3 0,1 M, CaCl2 0,02 M, NaOH 0,5 M e hidrazida do ácido p-hidroxi-benzoico (HAPHB) 0,1 M. O pH final foi 12. O reagente contendo HAPHB em solução alcalina, armazenado a temperatura ambiente, é usado dentro de um dia. A absorvância foi medida a 420 nm. Foi preparado um branco pela adição de 100 pL de tampão de acetato de sódio 0,1 M em vez de solução enzimática. A atividade de xilanase foi ensaiada pela mistura de 100 pL de solução enzimática (diluida) com 400 pL de arabinoxilano de trigo a 0,35% (Megazyme) em tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0). Os copos de Eppendorf com o substrato foram pré-incubados durante 5 minutos a 60°C. A reação é iniciada pela adição da solução enzimática. Após 15 minutos, a adição de 1,0 mL do reagente-HAPHB termina a reação. Os copos de Eppendorf foram aquecidos durante 5 minutos a 100°C e depois arrefecidos em gelo. As amostras foram centrifugadas à velocidade apropriada de modo a girar quaisquer materiais sólidos e.g. 1 minuto a velocidade total numa Microcentrifuga E da Beckman. A absorvância foi medida a 420 nm. Foi preparado um branco pela adição de 100 pL em vez da solução enzimática. A gama de medição é de 0,01-0,1 XPU/mL.

Purificação da xilanase

Foram adicionados 10,45 g de sulfato de amónio a 43 mL de caldo livre celular e colocados numa coluna de Etilo Sepharose™ usando a Coluna ÃKTA explorer 100 (Pharmacia Biotech): 15 Fonte ETH (código 17-0146-01, Pharmacia

Biotech) (D = 1,6 cm, 1 = 4,8 cm, V = 9,6 mL). A coluna foi equilibrada com acetato de sódio 100 mM e com sulfato de amónio saturado a 40% e pH 5,0. A eluição foi usando um gradiente linear originando acetato de sódio 100 mM (pH 5,0) em 20 volumes de coluna. Tamanho da fração: 5 mL. Caudal: 10 mL/minuto. Comprimentos de onda monitorizados: 280, 254, 214 nm. As frações foram testadas quanto à 67 xilanase e analisadas em CLAR-Cromatografia de Exclusão por Tamanho (CET).

As frações de xilanase mais puras foram adicionadas a uma coluna S200 Sephacryl de acordo com as seguintes condições. Equipamento ÀKTA explorer 100 (Pharmacia Biotech). Coluna: HiPrep 16/60 Sephacryl S200 HR (Pharmacia Biotech). O equilibrio e a eluição foram realizados com acetato de sódio 100 mM (pH 5,0). Caudal: 1 mL/min. Tamanho de fração: 4 mL. Comprimentos de onda monitorizados: 280, 254, 214 nm. A pureza das frações de eluição foi analisada por CLAR-CET, SDS-PAGE e PAGE nativa.

Concentração proteica

A concentração proteica foi determinada pela medição da DO280. A xilanase (madura) de T. emersonii contém 11 resíduos de Trp (posições 72, 108, 115, 121, 148, 300, 302, 308, 322, 377 e 385) e 23 resíduos de Tyr (posições 36, 51, 109, 141, 146, 161, 167,169, 174, 192, 193, 196, 200, 218, 281, 306, 316, 326, 332, 348, 395, 403 e 404). O coeficiente de extinção molar calculado foi de 89530 M_1.cirf 1. O peso molecular foi de 41.637 g/mol. A DO280 para 1 mg/mL XEA foi 2,15.

Atividade Especifica da Xilanase de T. emersonii (XEA) A atividade específica foi determinada usando o método HAPHB de açúcar redutor a 40°C e a 60°C. A atividade específica para a XEA foi 150 XPU e 500 XPU a estas duas temperaturas respetivamente. A concentração proteica foi determinada pela análise da DO280.

Temperatura (°C)

Atividade Específica (XPU/mg) 68 40 150 60 500

Sequência N-terminal A sequência de aminoácidos N-terminal da XEA madura purificada verificou-se ser: Ala-Gly-Leu-Asn-Thr-Ala (na sequência madura, este primeiro resíduo Ala é Ala23 na SEQ ID No. 2).

Ponto Isoelétrico (PIE)

Equipamento: sistema Phast (Pharmacia Biotech), IEF 3-9

Phastgels (Pharmacia Biotech). Os géis foram corridos e corados (Coomassie) de acordo com protocolos de sistema Phast padrão proporcionados pelo fabricante. 0 PIE determinado por focagem isoelétrica usando PhastGel IEF3-9 foi cerca de 3,3.

Peso Molecular

Uma eletroforese SDS-PAGE foi realizada usando o sistema Phast (Pharmacia Biotech), Phastgels (Pharmacia Biotech), tiras de SDS-tampão/tiras de tampão nativas (Pharmacia Biotech).

Tratamento de amostra: um volume de tampão (Tris-HCl 500 mM e pH 6,8, SDS a 10%, azul de bromofenol a 10%) foi misturado com 4 volumes de amostra e fervido durante 3 minutos. Os géis foram corridos e corados (Coomassie e Silver) de acordo com métodos de sistema Phast padrão. O peso molecular de SDS-PAGE usando marcadores do peso molecular (Pharmacia) foi cerca de 63 kD. O peso molecular calculado com base da composição de aminoácidos é de 41.637 Daltons. 69

Adicionalmente, o peso molecular foi determinado por cromatografia de permeação de gel usando padrões do peso molecular de filtração de gel (BIORAD, cat. no. 151-1901). O peso molecular determinado por CET-Alto Desempenho foi de 42 kD (a CET-AD foi conduzida usando uma coluna TSK G3000SW (cat. no. 05103, Toso Haas)). As amostras foram eluidas em fosfato de sódio 0,1 M (pH 7) a 1 mL/min a temperatura ambiente. A deteção foi realizada a 280 nm. O peso molecular mais alto como observado por SDS-PAGE parece ser uma sobrestimação. É provavelmente causada por glicosilação da xilanase.

Desglicosilação

Foram misturados 5pL de enzima purificada (ca. 5 mg/mL) com 20 pL de SDS a 0,5% e com 25 pL de mercaptoetanol a 1%. A mistura foi fervida durante 4 minutos. Depois de arrefecer, foram adicionados 20 pL de N-glicosidase F (500 U/mL) e 20 pL de Triton X-100 a 3% em tampão de fosfato de sódio 1M (pH 7,0) . Foi depois incubado durante a noite a 37°C e a desglicosilação analisada com SDS-PAGE. A sequência de aminoácidos sugere 2 locais de glicosilação (Asn56 e Ass123, ver SEQ ID No. 2). A SDS-PAGE mostra que a xilanase tratada com N-glicosidase F migra mais e que o peso molecular é menor do que o da xilanase não tratada ou pré-tratada (fervida com SDS-PAGE e β-mercaptoetanol). Assim, o peso molecular surpreendentemente alto observado no SDS-PAGE é provavelmente causado por glicosilação.

Perfis de Temperatura e de pH 0 caldo livre celular foi analisado quanto à atividade de xilanase a diferentes pH e temperaturas. A atividade de 70 xilanase foi analisada com o método dos açúcares redutores usando HAPHB a pH 4 a várias temperaturas (ver Tabela IA) ou a 60°C a diferentes pHs (Tabela 1B). A Tabela IA mostra que a temperatura ótima da XEA é por volta dos 80°C. A Tabela 1B mostra que o pH ótimo da XEA é entre pH 4 e pH 5 (existem duas colunas de figuras pois as experiências foram conduzidas duas vezes).

Tabela IA: Dependência da Temperatura da Xilanase

Temperatura (°C) Atividade (μΜ xilose/15 min) Atividade relativa (%) 30 20-30 10 40 40-50 19 50 90-100 40 60 120-130 52 70 195-205 83 80 235-245 100 90 65-75 29

Tabela 1B: Dependência de pH PH Atividade (μΜ xilose/15 min) Atividade (μΜ xilose/15 min) 3,0 118,1 123,4 3, 5 141,8 127,8 4,0 145,2 148,3 4,5 140,8 149,1 5, 0 117,9 124,8 5, 5 91,7 99,1 6,0 57,3 60,1 71

Termoes tabi 1 idade

Análise de Calorimetria Diferencial de Varrimento (CDV) da temperatura de desnaturação A temperatura de desnaturação da XEA foi determinada usando CDV. As condições de medição usadas foram com tampão de acetato de sódio (pH 5), 2-4 mg/mL, e uma taxa de aquecimento de 2,5°C/min. A temperatura de desnaturação (Td) da XEA verificou-se que era de 80,1°C.

Medição da T50 T50 é a temperatura à qual 50% de atividade residual permanece após 20 minutos de incubação e logo é uma medida da termoestabilidade. As incubações T50 foram realizadas como se segue. A amostra de xilanase foi diluída de modo a que a concentração final de xilanase estivesse dentro da gama de medição para o teste de HAPBH (unidades XPU) . Depois ela foi diluída com tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0) contendo 1 mg/mL de BSA para evitar uma ligação específica e desnaturação em superfícies dos tubos. O tampão foi pré-aquecido a 60, 70, 80, 85 e 90°C em termomisturadores durante 5 minutos e subsequentemente a xilanase adicionada. As amostras foram aquecidas durante 20 minutos e arrefecidas em gelo. A atividade foi medida usando o teste de HAPHB.

Na Tabela 2, é mostrada a percentagem de atividade residual no que diz respeito ao controlo não incubado após 20 minutos de incubação à temperatura dada. Desta tabela, a T50 pode ser derivada: foi 82 °C. 72

Tabela 2: Termoestabilidade da xilanase XEA

Temperatura (°C) Atividade residual (%) 40 100 50 104 60 103 70 99 75 90 80 85 85 8 90 1

Adicionalmente, os valores de T50 foram medidos a diferentes pHs e na presença de AEDT. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3: Determinação da influência do pH e de metais iónicos na estabilidade da XEA (1 pH 7 e 8: poucos pontos de dados na área da temperatura baixa) pH T50 (°C) 3 73 3,5 77 4 80 4,5 80 5 81 5 (+ AEDT) 81 6 75 71 <72 81 <72 A XEA é mais estável na área de pH de pH 4 até pH 5. Abaixo de pH 3,5 e acima de pH 5,5, a termoestabilidade começa a declinar mas é ainda significativamente melhor do que a maioria das xilanases fúngicas presentemente conhecidas. A presença de AEDT não influencia a T50. Isto significa que a 73 estabilidade da XEA não é dependente de metais iónicos positivos que estão complexados pelo AEDT. EXEMPLO 7: Uso da xilanase de Talaromyces (XEA) em ração animal

Foi realizado um estudo usando frangos de corte machos (Cobb) . Entre os dias 1 e 5 de idade, eles foram mantidos em compartimentos e foram oferecidos uma ração de inicio de frango de corte comercial. À idade de 5 dias, as animais foram aleatoriamente distribuídos por 54 jaulas, com base nos seus pesos individuais. 15 frangos de corte foram alojados por jaula entre os dias 5-19 de idade. No dia 19, o número de animais por jaula foi reduzido para 12. Seis jaulas foram alocadas a um tratamento. Uma vez que a jaula é a unidade experimental, isto significa que existiram seis replicações por tratamento.

As jaulas foram estabelecidas num aviário artificialmente aquecido, iluminado e ventilado, usando um sistema de jaula com 3 andares. Cada jaula tinha uma área de pavimento de 0,98 m2, e tinha um piso de rede. O espaço era iluminado 24 horas/dia, mas a intensidade da luz era gradualmente diminuída durante o ensaio. Também a temperatura era diminuída gradualmente: de 28°C durante a primeira semana a 23°C durante a semana final. A humidade durante o ensaio foi mantida a aproximadamente 60%. Os animais foram vacinados de acordo com o programa de vacinação normal contra a Bronquite e a Doença de Newcastle.

Nove tratamentos foram incluídos neste ensaio. A uma dieta baseada em trigo (ver Tabela 4), nenhuma enzima foi adicionada (controlo), ou uma quantidade igual a aproximadamente 2500, 5000, 10000 ou 25000 UEX/kg de ração 74 de quer da endoxilanase de Talaromyces (XEA) , quer de uma endoxilanase de Aspergillus niger (Endol, uma θηάο-1,4-β-endoxilanase31 comercialmente disponível da DSM N.V., Agri Ingredients, Delft, Holanda) como um controlo. As enzimas foram adicionadas à ração na forma de um produto granulado que foi misturado numa pré-mistura antes de misturá-lo na dieta. As dietas foram oferecidas ad libitum aos animais na forma de pastilhas. Durante o processo de peletização, a temperatura das pastilhas não excedeu aproximadamente 70°C. Também estava disponível água livremente. 0 ganho de peso corporal (GPC) e a razão da conversão da ração (RCR) foram determinados para os períodos de 5-19 dias de idade e de 5-33 dias de idade.

Tabela 4: Composição da ração e conteúdos dos principais nutrientes

Ingrediente Conteúdo (%) Trigo 50,0 Centeio 10,0 Farinha de soja 20,0 Sojas (torradas) 1,5 Mandioca 1, 69 Farinha de carne e osso 5, 5 Farinha de peixe 2,0 Gordura animal combinada 6,0 Pré-mistura mineral e vitamínica 1,0 Calcário 0, 85 Fosfato monocálcico 0, 75 Sal 0,3 L-lisina.HC1 0,16 DL-metionina 0,22 L-treonina 0,03 EMfrangos Corte (MJ/ kg) 12,0 Proteína bruta (%) 21,4 Gordura bruta (%) 8,5 Lisina digestível (%) 1,06 Metionina + cisteína digestíveis (%) 0,78 * A dieta continha níveis de vitamina e de oligominerais comuns na Holanda. Nenhuns promotores de crescimento antibióticos nem coccidiostáticos foram adicionados às dietas. 75

Os resultados deste ensaio são apresentados na Tabela 5 a qual mostra o GPC e a RCR médios dos frangos de corte durante dois períodos. As adições enzimáticas são indicadas em unidades de atividade (UEX). À medida que o GPC aumenta, a RCR diminui pois a RCR é a quantidade de ração (g) necessária para o crescimento.

Tabela 5 GPC (g/ave) RCR (g/g) 5-19 dias 5-33 dias 5-19 dias 5-33 dias Controlo 647 1665 1,486 1,749 Talaromyces (XEA, invenção) + 2500 UEX/kg 668 1696 1,447 1,666 + 5000 UEX/kg 683 1757 1,419 1,647 + 10000 UEX/kg 662 1736 1,444 1,673 + 25000 UEX/kg 67 6 1731 1,429 1,656 Endol de Aspergillus niger (para comparação) + 2500 UEX/kg 682 1742 1,440 1,659 + 5000 UEX/kg 682 1730 1,458 1,704 + 10000 UEX/kg 672 1686 1,417 1,662 + 25000 UEX/kg 696 1743 1,466 1,685

Ambos o crescimento e o GPC melhoraram significativamente (P<0,05) para as dietas contendo as enzimas, ambos após 14 dias de período experimental como após o período experimental total. Algumas diferenças foram observadas entre as diferentes dosagens, mas a enzima XEA foi tão boa como (se não melhor do que) a enzima comercialmente disponível. EXEMPLO 8: Desempenho da panificação da endoxilanase de Talaromyces emersonll (XEA) A preparação de pão de forma num processo de panificação padrão foi realizada pela mistura de 3500 g de farinha de trigo (uma mistura de 80% de farinha de trigo Kolobri e de 76 20% de farinha de trigo Ibis (Menebra, Holanda) a cerca de 21°C), 77 g de levedura prensada (Konings), 70 g de sal, 25 ppm de ácido ascórbico, 10 ppm de α-amilase fúngica Fermizyme™P2oo (DSM N.V., Bakery Ingredients, Delft, Holanda) e diferentes quantidades da enzima de endoxilanase XEA e 2030 mL de água (8-15°C) num misturador em espiral (Hobart) durante 2 minutos (a velocidade 1) e durante cerca de 6 minutos (a velocidade 2) para colocar em 125 Wh (watt-horas) de energia. A temperatura da massa foi 28°C. A usinabilidade da massa foi analisada manualmente por um padeiro qualificado.

Diretamente após a mistura, a massa foi dividida em 6 peças cada uma com 875 g, arredondadas e impermeabilizadas durante 35 minutos numa câmara de impermeabilização a 34°C e 85% de HR (humidade relativa). No final deste período, as massas foram moldadas e cozidas e foi-lhes dada uma impermeabilização final de 75 minutos numa câmara de impermeabilização a 38°C e 87% de HR. Mais tarde, as massas completamente impermeabilizadas são cozidas num forno elétrico a 210°C durante 30 minutos. Depois do arrefecimento a temperatura ambiente, os volumes dos pães foram determinados pelo método de deslocação da colza. Após 16-24 horas de armazenamento em sacos de polietileno selados a temperatura ambiente, a qualidade de grânulos foi avaliada por um padeiro qualificado. Os resultados são mostrados na Tabela 6. 77

Tabela 6 Nível de dosagem de XEA (UEX/kg de farinha) Volume do pão (mL) (%) Manuseamento da massa Desempenho da panificação (escala 0-10) Qualidade do grânulo (escala 0-10) 0 4123 100 fácil, não pegajosa 6 6 176 4420 107 mais fácil, não pegajosa 7 7 527 4756 115 mais fácil, não pegajosa 7,5 7 1581 4794 116 fácil, um pouco pegajosa 7,5 7,5 A qualidade das massas foi muito boa. Somente na dosagem mais alta da endoxilanase XEA, foi experienciada um pouco de viscosidade durante o manuseamento da massa. No entanto, esta pouca viscosidade não influenciou a usinabilidade da massa. Todas as massas contendo endoxilanase XEA foram muito flexíveis e fáceis de manusear.

Destes resultados de panificação, foi concluído que a endoxilanase XEA é muito eficaz na melhoria da qualidade do pão, tanto em termos do volume de pão e em termos de qualidade do grânulo. Apesar dos grandes volumes dos pães, a estrutura granulada era ainda muito regular e fina. EXEMPLO 9 e EXEMPLO COMPARATIVO 10: Comparação do desempenho da panificação da enzima (XEA) de Talaromyces emersonii com endoxilanase de Asp. niger 0 desempenho de panificação da XEA foi comparado na produção de pão de forma holandês com uma endoxilanase de Aspergillus niger correntemente usada. Esta endoxilanase de A. niger foi fornecida na sua forma comercialmente disponível, i.e. Fermizyme™ HSPeooo· A Fermizyme™ HSP é uma 78 boa enzima para aplicação na fabricação de pão, mas pode introduzir viscosidade da massa e não proporciona sempre uma melhoria do volume de pão suficiente. 0 procedimento exato do Exemplo 7 foi repetido exceto que foram usadas diferentes quantidades quer da endoxilanase XEA, quer da Fermizyme™ HSP6ooo-

Os resultados são apresentados na Tabela 7.

Tabela 7

Exemplo No. Nível de dosagem (UEX/kg de farinha) Volume do pão (mL) (%) Manuseamento da massa Quebra & trituração (escala 0-10) Qualidade do grânulo (escala 0-10) 9: endoxilanase XEA 0 4170 100 bom, não pegajosa 6 6 264 4430 106 bom, não pegajosa 6, 5 7,5 528 4647 111 bom, não pegajosa 7 7,5 1056 4761 114 flexível, não pegajosa 7,5 8 1584 4880 117 flexível, um pouco frouxa, não pegaj osa 5# 7,5 10 : _ . TM Fermizyme HSP 6ooo 0 4170 100 bom, não pegaj osa 6 6 264 4304 103 flexível, não pegajosa 6,5 6 528 4355 104 flexível, um pouco pegajosa 6, 5 7 1056 4539 109 flexível, pegajosa, um pouco frouxo 7 7,5 1584 4698 113 flexível, pegajosa, um pouco frouxa 7,5 8 # o volume de pão era muito grande, então foi formada a forma de pão em cogumelo 79

Dos resultados, é claro que a endoxilanase XEA não introduziu viscosidade na massa, e melhorou o volume de pão numa extensão maior do que o obtido pela introdução de Fermizyme™ HSP. Além disso, menos unidades de endoxilanase/kg de farinha foram necessárias para alcançar um certo nivel no volume de pão quando a XEA foi usada em vez da Fermizyme™ HSP. A qualidade de quebra e da trituração foi similar a volumes equivalentes. A estrutura granulada obtida pela adição de XEA foi pelo menos tão boa como a obtida com Fermizyme™ HSP.

Globalmente, a endoxilanase XEA resolve alguns dos problemas na fabricação de massa e de pão usando Fermizyme™ HSP. Nenhuma viscosidade foi introduzida na massa, os volumes de pão obtidos foram maiores e a estrutura granulada, apesar dos maiores volumes, era ainda muito regular e fina. EXEMPLO 11: Ensaios de Estabilidade da Peletização

Amido de milho (4543 g) foi colocado num amassador-K Erweka™. Depois, 1069 g de um ultrafiltrado da fermentação contendo a xilanase da invenção (mistura XEA 502-8 m a qual tinha 43.553 UEX/g e 6,7% de matéria seca) foram adicionados ao amido durante a mistura para obter uma mistura seca que tinha à volta de 15.000 UEX/g (quando seca até 94% de matéria seca). Após o liquido ter sido adicionado, a mistura foi continuada durante uns 10 minutos adicionais.

Numa câmara de secagem a vácuo (40°C) , a mistura foi seca durante 12 horas até 95,4% de matéria seca. Foi depois moida num moinho Erweka™ da Freewitt através de uma grade de 1 mm. Isto foi o Exemplo 11A. 80 A mesma receita foi repetida usando a Mistura OP 0036 Lyxasan™ (contendo a endo-1,4^-endoxilanase31 comercialmente disponível da DSM N.V., Agri Ingredients, Delft, Holanda). Às 5885 g de amido, foram adicionadas 1984 g de UF (ultrafiltrado) com 42.550 UEX/g e matéria seca a 3,7%. Esta mistura foi seca até matéria seca a 94% e moída como no Exemplo 11A (isto forma o Exemplo Comparativo 11B) . A terceira amostra é um produto comercialmente revestido chamado Biofeed Wheat CT, o qual está comercialmente disponível da Novo Nordisk, Dinamarca. Este contém uma xilanase do tipo-G de Thermomyces lanuginosis e tem um revestimento de gordura (Exemplo Comparativo 11C).

Todas as três amostras foram testadas num ensaio de peletização a três temperaturas diferentes. A uma ração animal (a composição é mostrada na Tabela 8 abaixo), foi adicionada a mistura enzimática a duas concentrações diferentes, 0,24% (11A) e 0,1% (11B, 11C). Após mistura, a ração foi aquecida por vapor num condicionador até 65°C, 75°C ou 85°C e subsequentemente transformada em pastilhas através de uma placa espelhada de 65 mm de espessura com orifícios de 5 mm de diâmetro. Foi arrefecida imediatamente. A atividade residual nas pastilhas foi depois medida e os resultados dos testes de estabilidade são mostrados na Tabela 9. 81

Tabela 8: Composição da Ração Animal

Matérias-primas Conteúdo (%) Milho 20,00 Trigo 30,00 Soja (tratada pelo calor) 10,00 Soja (farinha) (46,7 cp) 22,50 Tapioca 5, 07 Farinha de Peixe (70% cp) 1,50 Farinha de Penas (hidrolisada) 1, 00 Óleo de soja 1, 30 Gordura Animal 4, 50 Pré-mistura mineral/ vitaminica (Milho) 1, 00 Calcário 1,300 Fosfato monocálcico 1,20 Sal 0,32 L-lisina 0,12 DL-metionina 0,19

Tabela 9: Estabilidades de Peletização das Enzimas

Atividade Residual (%) Exemplo 11A Exemplo Comparativo 11B Exemplo Comparativo 11C 65 °C 84 64 86 75 °C 82 16 83 85°C 66 4 56

Como pode ser visto, a estabilidade a altas temperaturas (85°C) da proteina XEA da invenção deu resultados de estabilidade consideravelmente melhores do que o produto comercial correntemente comercializado. EXEMPLO 12: Atividade de Arilo-p-D-xilosideos

Os dois substratos 5-bromo-4-cloro-3-indoxilo^-D-xilopiranosídeo (Reg CAS No. 207606-55-1, também chamado X-b-D-xil) e 4-metiloumbeliferilo-p-D-xilopiranosideo (Reg CAS No. 6734-33-4, também chamado 4-UM-b-D-xil) foram 82 utilizados de modo a se rastrear a atividade de xilosidase. Eles foram diretamente adicionados ao meio. As estirpes compondo a biblioteca foram organizados no formato de placa de 96 poços. Desse modo, a placa mestre foi facilmente replicada nos meios de deteção. A biblioteca foi crescida em meio seletivo (0,52 g/L de KC1, 1,52 g/L de K2HPO4, 0,52 g/L de MgSCb, glucose a 2%, acetamida 10 mM, 1/1000 de oligoelementos (2,2 g de ZnS04/7H20, 1,1 g de H3BO3, 0,5 g de FeS04/7H20, 0,17 g de CoC12/6H20, 0,16 g de CuS04/5H20, 0. 15.g de NaMo04/2H20, 5,0 g de AEDT, pH ajustado a 6,5 com KOH e filtro esterilizado de 0,45 pm), pH ajustado com KOH (10 N a 6) contendo quer X-b-D-xil, quer 4-UM-b-D-xil (a uma concentração de 200 mg/L e de 150 mg/L respetivamente). O X-b-D-xil tinha sido previamente dissolvido num volume minimo de demetiloformamida (DMF). As placas foram incubadas a 33°C durante 48 horas e depois incubadas durante 6 horas a 65°C. Os placas foram contadas antes e depois da incubação de 6 hr, a 65°C. As placas de X-xil foram analisadas diretamente com base na presença (ou não) de um halo azul turquesa que se verificou que estava presente. A deteção da atividade de xilosidase nas placas de 4-MU-xil foi verificada pela colocação da placa sob luz ultravioleta com um comprimento de onda de 310 nm. Os clones positivos apareceram rodeados de um halo fluorescente azul.

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Progress in 42 (1995) 85

<212> ADN <312> Talaromyces emersonii <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (1227)

<4 0 0> 1 gfet cqc ete *3t ees gte ttf «te «c« tec ate gea fgc tct 99« Mafc 1 Vai Axg Leu Ser 5 Pro Vai Le» Lá» Ma m ser Ile Ala Qly Ser 15 51y ehg ccct «ta «C€ cs a gca g«a m «to aa« SG& qee aaá gcc ato Fw> L®U ftla 30 Qln. Ala Ala La» 25 Asb Thr Ala ÃXa Lys 30 Àla lie ggc etg Saâ; ta* ttt 39« Svã g«g acc ga« ase cc* «ag otg 83« gac Oly La» Lys 35 Tyr Phs siy TAx Ala 40 Ehr Mp· ASn Pxe Glu 45 LCU ser Aap 300 9=9 ta* 9 »9 aeg C»f «te aác aae ®«9 cag fãt fcfcu 999 «eg ttg Thr Ma .50 Tyx Slu Thr SlS xm 55 Asá Aà» íhr 01B AsO 60 PAe 01 y Gin Leu a cg «cg 9=9 aat tcg atg «mg tgg gat gee aee β*β cee g»g «ag thr €5 Fxo Ma Asm Ser M®t 70 Lys fxp A.sp Ala Thr 75 01» Pro Glu «1b Ãsa @0 qtc ttC açg ttt «9= 9« 99» Sly g»t «»f aii goo a&c ttg 9«c aag 9«S v*l Fhe 7hr Pha •Ser 05 Ma Asp 91b XI* 90 Ais A$n ‘Leu Ála Lys 95 Ma ãat 99« «9 ttg «99 tg* eat e&fc ctt gtt *m tá« aat. «ag tt« Asm «Xy S1.R Hat ISO Leu Arg çys ais Asrs 10$ Ls» Vai 1 *P Tyx Aan 110 Ç:lrs Leu eçg gte aee »§t ggs te» tgg sce aac g«o «cg ct« ctt get Pxe Ser ftp 11$ v*.l TLr Ser Gly Ser 120 **P Thx ASB 91« Thx 135 Leu Ls» Ala ges afeg aag aat eaç Me a«« ase gte gtt açe «ai tse asg 99« fBâÇ Ma Met Lys Asa Eis £Xe Tfex 135 As» Vai vai Thr ais uo tyr Lys «ty Sl« tge iac 9« tgg gêt gtc #.± ã,at gvg qee etc sa« gac §9« ace cy» H5 fyc Ma T;t:p -fefi Vai 150 Val ÃS» 01 o Ma La» 155 Aso Aap Ãsp gay Thr ISO 4S m m 340 388 33$ 3 m 432 86 tae cgç age aac 9 te ttc tas eag ta o Tyx Arg Ser Ajm Vai léS &ha Tyr ein Tyr ate qcc fcfcc «o© acg geç gee gee gee li© li© Fbe Ala ISO Thr Alá Aia Ala Àia 185 tas: sac spe fep 1PS tae ááe ate gag tae zcg fyr Mn Tyr Asa Ik Slu Tyr ZOO fr© «Stf sac et 9 gtc a.a,g gt-9 gtg eag tef 01¾ Mn 210 i>©a VM L-vs Mv Vai 2XS Gin Ser Stc «:gc ctg ca9 tcq tfec ate 9*9 Vai 01 γ zn hea Gin ã&S- M.s 230 Fhe li© vai tcc cag cag -amg aae a *1? gee gee ttc Ser Gin Gin Qlv .Mn 24S Alá Ala Ph® gee ate acc gm etc gac afce ege atg Ma lie Thr GXk 260 L©«. Àsp Xis Axg het 265 ctg etg a.eg e&g cag gee aec gac ia© Mo Leu 'Thr 275 Gin ela Ala Thr Aãp 280 Tyr gee esc ase aeg 93« íge qt© gge ©te Ala &sn 2S0 Thr Lys eiy Cys Vai 255 Giy n« aag tao teg tm S*9 sec age acc ttc LyS Tyr 30S S»r Trp Vai Pre 310 Ssx Thr KtMS esc hgg g a a gee aa.c tas eag asg aag Pr© Trp Ãap Ala Asn Tyr Síb 325 1V3 tya act qqg etfc SI 340 cag aeg ate acc age The Giy Mu Sla Thr Vai Thr Smr 345 ac§ acg tet gtc gea. aeçs qqe meg seg Thr Thr Ser 355 Vai Sly Thr Giy Thr 300 Thr 99« ««9 act Ws gtg gee eao eat tgg Giy Thr .370 Thr ®iy Vai Ala Gin 375 Hiã Trp t tapar aet: ggt ecf aeg gtt toe gea agt Trp Thr MS 61y hm Thr Vai 3SÕ Cys Ala 8©r aat gsg tat tae teg cag tgt etg taa Asn =Cii sí Tyr Tyr Ssr Gía Cys hsu ate 11© 270 vgt siy gag; Giu geg Ala tae Tyr ate Ile 175 ese Pre 320 gae Àsp eee Pr© a»c Asa gee aag Ala Lvs 130 etg l©a tas fw 57 p Giy gee Ala s&g hyâ g«9 Ala 205 ssg Thr geg Ai* gsg Ai* â24 fcSMS? Tyr ggc Giy S«5 Ala 220 ege Arg afec 21© gas Mp ggc Sly 672 gge eiy g&g Gic 23S acíj Thr see Aro age Ser ace: Thr age 3©r 240 720: aeg Thr 2S0 fcg Ala cfcg !<.·©© gge gtc Giy Vai 9^g Slu 255 çte Vai 76? cag Gin ctg t.©u CCS Pr o qag âiâ aeg Thr 270 £{ãs Glti gee Ma 816 eag Gl.g age Sqr aec Thr 9tg Vai 265 c&g Glrà gee Ma tgc Cys 864 age Thr gtc Vai tgg Trp 300 gas tgg Aap Trp âcc Thr gáe Asp 91Z teg Set 9β* Giy 315 tat Tyr gg* Giy gac Aap gee Ai a tgt Cys 320 §60 cce Ala tsé gaa Giy ãte etc 2006 Prc Tyr Gl» li© h©« 330 336 acc sec tac ate ate teg seg 1056 Thr Thr fvr 11» n© Ssr fr» 350 aes tsg age ggs 99«· ©ge 99« 1104 fhr S©r Sar Siy 61 y Ssr Giy 3SS gag eag tge ggt 99« etg 99« 1152 Giã Glh Çys Siv 360 61 y i-rsu Giy gge tac aet tge aet gt.c ate 1206 Giy Tyr Thr Cys Thr Vai IX® 3§S 490 1227 405 87

<210> 2 <211> 408 <212> PRT <213> Talaromyces emersonii <400> 2

Met 1 Vai Arg Leu Ser 5 Pro Vai Leu Leu Ala 10 Ser Ile Ala Gly Sor ÍS Gly .Leu Pro Leu Ma 30 Gin Ala Ai.a Gly Leu 25 Asn Thr Ala Ala Lys 30 Ala lie Gly Leu Ly.s 35 Tyr Fha Gly Thr Ais 40 Thr Asp Asn Pro Glu 45 Leu Ser Asp Thr Ala 50 Tyr Glu Thr Gin Leu 55 Asn Asn Thr Gin Asp 60 Phe Gly Gin Leu Thr 65 Pro· Ale As ή Ser Het 70 Lys Trp Asp Ara Thr 75 Glu Pro Glu Gin Asn 90 Vai Fhô Thr Phe Ser 85 Ala Gly Asp Gin Ila 90 Ala Aan Leu Ala Lys 95 Ala As-n Gl.y Gin Met 100 Leu Arg Cys Kls Asn 105 Lsu Vai Trp Tyr Asn 110 Gin Leu Pro Ser Trp 115 Vai Thr Ser Gly Ser 120 Trp Thr Asn Glu Thr 125 Lrfíu Leu Ala Ala He t 130 Lys ftSEl Hi.s He Thr 135 Asn Vai Vai Thr Eis 140 Tyr Lys Gly Gin Cys 145 Tyr Ala Trp Asp Vai 150 Vai As π Glu Ara Leu 155 Asn Asp Asp Gly Thr 160 88

Tyr Arq Ser Asn Vai 165 Phe Tyr Gin Tyr Ile 170 Gly Glu Ala Tyr Ile 175 Pro Ile Ala P h s Ala Thr 180 Ala Ala Ala Ala 185 Asp Pro Asn Ala Lys 190 Leu Tyr Tyr As xi Asp 195 Tyr Asm. lie Glu Tyr 2Ò0 Pro Gly Ala Lys Ala 205 Thr Ala Ala Gin A s ri 210 Leu Vai Lys Leu Val 7»·? «j •N» A- «1 Gin Ser Tyr Gly Ais 220 Arg Ile Asp Gly Vai 225 Gly Leu Gin Ser Hl s 230 Phe Ile Val Gly Glu 235 Thr Pro •Ser Thr Ser 240 Ser Gin Gin Gin Asn 245 Het Ala Ala Phe Thx 250 Ala Leu Gly Val Glu 255 Val Ala 21® Thr Glu Leu 200 Asp lie Ara Hat 205 Gin Leu Pro Glu Thr 270 Glu Ala lêu Leu Thr 2.75 Gin Gin Ala Thr 280 Tyr Gin Ser Thr val 285 Glu Ala Cys Ala Asn 250 Thr Lys Gly Cys Val 295 Gly Ile Thr val Trp 300 ASp Trp Thr Asp Lys 305 Tyr Ser Trp Val Pro 310 Ser Thr Phe Ser Gly 315 Tyr Gly Asp Ai a Cys 320 Pro Trp Asp Ale Asn Tyr Gin Lys Lys Pro Ala Tyr Glu Gly lie Leu 325 330 335 Thr Gly Leu Gly Gin 340 Thr val Thr Ser 34 5 Thr Thr Tyr Ile Ile 350 Ser Pro Thr Thx Ser 355 Vai Gly Thr Gly Thr 380 Thr Thr Ser Ser Gly 365 Gly Ser Giy Gly Thr 370 Thr Gly Val ÃXs Gin 375 H :i s Trp Glu Gin Cys 380 Gly Gly Leu Gly Trp 385 Thr Gly Pro Thr Val 390 Cys Ala Ser Gly Tyr 395 Thr Cys Thr Val 11® 400 Asn Glu Tyr Tyr Ser Gin Cys Leu 405

<210> 3 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial 89 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador #1 <400> 3 tatagcgaaa tggattgatt gtacgctc 28

<210> 4 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador #2 <400> 4 atccccagca tcattacacc tcagtg 26

Lisboa, 6 de Dezembro de 2012

Claims (25)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido de xilanase compreendendo: (i) a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2; ou (ii) uma variante de pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2 a qual é capaz de clivar o xilano; ou (iii) uma variante da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2 a qual tem até 50 substituições de aminoácidos e a qual é capaz de clivar o xilano, ou (iv) um fragmento da sequência de aminoácidos dos aminoácidos 23 a 408 da SEQ ID No. 2 a qual é capaz de clivar o xilano.

2. Um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 em que a variante (ii) tem pelo menos 95% de identidade ou o fragmento de (iv) tem pelo menos 150 aminoácidos em comprimento ou a variante de (iii) tem até 30 substituições de aminoácidos.

3. Um polipéptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que cliva as ligações (1-4) ou as unidades de xilopiranosilo em B-D-xilano.

4. Um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que tenha atividade de arabinoxilanase e de xilosidase.

5. Um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que é obtenível de (a) um 2 fungo; ou (b) um organismo do género Talaromyces, opcionalmente da espécie Talaromyces emersonii.

6. Um polinucleótido compreendendo: (a) a sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1, codificando uma xilanase ou o seu complemento ou (b) uma sequência codificando um polipéptido tendo atividade de xilanase de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes; (c) um fragmento de pelo menos 100 nucleótidos da sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase ou o seu complemento; (d) uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência codificante da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase (e) a sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 codificando uma xilanase ou o seu complemento ou a sequência madura da SEQ ID No. 1 modificada em até 100 substituições de nucleótidos; (f) uma sequência codificando uma xilanase que é degenerada como resultado do código genético da sequência de ácido nucleico da SEQ ID No. 1 ou do seu complemento. (g) uma sequência que codifica um polipéptido tendo atividade de xilanase, que é: (1) a sequência codificante dos nucleótidos 69 a 1224 da SEQ ID No. 1 ou (2) a sequência que é degenerada como resultado do código genético no que diz respeito a uma sequência definida em (1), ou 3 (h) uma sequência complementar de um polinucleótido definido em (g).

7. Uma sequência de acordo com a reivindicação 6 em que o fragmento em (c) tem pelo menos 200 bases de comprimento ou a identidade em (d) é de pelo menos 98% ou o número de nucleótidos modificados em (e) é de até 50 .

8. Um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, que é uma sequência de ADN.

9. Um vetor compreendendo uma sequência de polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8.

10. Um vetor de acordo com a reivindicação 9, que é um vetor de expressão, tal como onde a sequência de ADN de acordo com a reivindicação 8 está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora.

11. Uma célula hospedeira, que compreende, como uma sequência heteróloga, um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8.

12. Uma célula hospedeira, que expressa, como uma proteína heteróloga, um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

13. Uma célula hospedeira transformada com um vetor da reivindicação 9.

14. Um processo de produção de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o processo 4 compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13 sob condições que proporcionam a expressão do polipéptido.

15. Uma composição compreendendo um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

16. Uma composição de acordo com a reivindicação 15, que compreende ainda um polipéptido tendo atividade de celulase, de endoarabinanase, de ramnogalacturonase e de poligalacturonase.

17. Um método de tratamento de um material vegetal ou contendo xilano, o método compreendendo o contacto do material com uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou uma composição de acordo com a reivindicação 15 ou com a reivindicação 16.

18. Um método de acordo com a reivindicação 17 em que o tratamento compreende a degradação, a hidrólise ou a modificação do xilano no material ou a degradação ou modificação das paredes celulares vegetais.

19. Um método de acordo com a reivindicação 17 ou 18 em que o tratamento compreende a clivagem de subunidades de xilopiranosilo orp-D-xilano e/ou o material compreende uma planta, polpa vegetal, extrato vegetal ou um género alimentício comestível ou ingrediente dele.

20. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, que reduz a viscosidade do 5 material, degrada ou hidrolisa o xilano contido no material ou melhora a transparência ou a filtrabilidade do material.

21. Uso de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou uma composição de acordo com a reivindicação 15 ou a reivindicação 16 num método de tratamento de material vegetal, melhorando a filtrabilidade e/ou reduzindo a viscosidade de liquidos contendo xilano, melhorando a filtrabilidade ou clarificando liquidos alcoólicos como cerveja e vinho ou sumos de fruta ou de legumes, na hidrólise de residuos da agricultura, na reciclagem de materiais como papel contentor no fabrico de papel para espessamento de géneros alimentícios e/ou na extração de materiais desejáveis como café, óleo vegetal ou amido, processamento de polpa, suco ou extrato vegetal, melhorando o volume de pão, a qualidade do pão ou reduzindo a viscosidade da massa.

22. Uma ração, preferencialmente ração, alimento ou género alimentício animal compreendendo um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

23. 0 uso de um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 na fabricação de álcool, no fabrico de cerveja e de vinho, na destilação, na reciclagem, na biometanização, na higiene dental, no tratamento do couro, no fabrico de papel, no tratamento de sumos de frutas ou de legumes ou do extrato, no tratamento ou fabrico de têxteis, na panificação ou fabrico de pão, no tratamento de bolbos 6 vegetais, na preparação de alimento ou géneros alimentícios ou numa ração animal.

24. Um alimento ou género alimentício de acordo com a reivindicação 22, que é uma bebida alcoólica, pão, massa ou chá.

25. Um organismo vegetal transgénico ou sua parte, compreendendo uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13. Lisboa, 6 de Dezembro de 2012