CZ2003798A3 - Polypeptid s aktivitou xylanázy, sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid, způsob přípravy a použití polypeptidu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových xylanáz, jako například xylanáz z Talaromyces, a jejich použití při degradace xylanu v celulóze. Xylanázy nacházejí použití v pekárenství, v živočišné výrobě jako přísady do krmivá (zlepšuje konverzi krmivá) a při výrobě papíru.

Dosavadní stav techniky

Složení stěny rostlinné buňky je značně složité a variabilní a obsahuje několik sacharidových biopolymerů. Polysacharidy se hlavně vyskytují ve formě dlouhých řetězců celulózy (což je hlavní strukturální složka stěny rostlinné buňky), hemicelulózy (obsahující různé β-xylanové řetězce, jako například xyloglukonany) pektin a lignin. Nejhojnější hemicelulózy jsou xylany a jejich deriváty jako například arabinoxylan a xyloglykan.

K rostlinným hemicelulózám patří xylan, arabinoxylan, glukuronoarabinoxylan a xyloglukan. Xylan (CAS rejstřík, č. 9014-63-5) se skládá z hlavního řetězce β-1,4-vázaných D-xylopyranosylových jednotek, volitelně substituovaných postranními řetězci, jako je například arabinózový zbytek a/nebo zbytek kyseliny glukuronové. Struktura je tedy následuj ící:

-.4) -β-D-Xylp- (l-»4) -β-D-Xylp (2-1 A) - (1-.4)-β-D-Xylp- (1^4) -β-D-Xylp (3<-lB) - (1^ kde Xylp xylopyranosylová jednotka, A = a-(4-0)-methyl• · · · • · · · • · • · · · • · ····· ·· · • · · · · ···· ·

- 2 D-glukuronopyranosylová jednotka, případně acetylová skupina, a B = α-L-arabinofuranosylová jednotka, případně acetylová skupina.

Xylany mohou představovat více než 30% suché hmotnosti suchozemských rostlin. Xylan je proto důležitou složkou surovin a materiálů z přírodních zdrojů, které jsou používány v průmyslové výrobě, a to např. v pekárenství, pro zlepšení konverze krmiv (pro zvířata) a při výrobě papíru.

Existují základní rozdíly mezi jednoděložnými rostlinami (např. obilniny a trávy) a dvojděložnými rostlinami (např. jetel, řepka olejka, sója) a také mezi semenem (zrnem) a vegetativní části rostliny. Jednoděložné rostliny jsou charakteristické výskytem arabinoxylanového komplexu jako hlavního hemicelulózového řetězce, a hlavní strukturou hemicelulózy u dvojděložných rostlin je xyloglukanový komplex. U dvojděložných rostlin byly zjištěny také vyšší koncentrace pektinu než u jednoděložných rostlin. Semena zpravidla mají vysoký obsah peptidových látek, ale relativně nízký obsah celulózových látek.

Enzymy degradující celulózu jsou používány při zpracování rostlinných surovin v potravinách a krmivěch, jako aditiva do potravin nebo krmiv kvůli jejich schopnosti působit na hlavní složky buněčné stěny rostlinné buňky.

Většina enzymů degradace celulózy dostupná pro průmysl jsou zřejmě xylanázy s relativně nízkou molekulovou hmotností a průměrnou stabilitou při vyšší teplotě. Nicméně, pro určité aplikace je potřeba použít xylanázu s relativně vysokou thermostabilitou. Jestliže xylanáza má být použita jako aditivum do krmivá, pak je výhodná vysoká termostabilita, protože podmínky vysoké teplota se užívají při výrobě peletovaného/granulovaného krmivá.

• · · ·

- 3 Podstata vynálezu

Překládaný vynález poskytuje novou xylanázu, která je schopná štěpit β-D-xylan, který je přítomen v rostlinném materiálu. Xylanáza je také schopna hydrolyzovat arabinoxylan (nebo má arabinoxylanázovou aktivitu) a aryl-p-D-xylopyranosid (nebo má xylosidázovou aktivitu).

V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje (izolovaný) polypeptid s aktivitou β-xylanázy obsahující:

(i) aminokyselinovou sekvence uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2, nebo (ii) variantu (i), která je schopná štěpit β-D-xylan, nebo (iii) fragment z (i) nebo (ii), který je schopný štěpit β-D-xylan.

Další aspekt vynálezu poskytuje polynukleotid, který obsahuj e:

(a) nukleovou kyselinu mající sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 1, nebo sekvenci kódující polypeptid podle vynálezu, (b) sekvenci, která je komplementární nebo která hybridizuje se sekvencí definovanou (a), (c) fragment sekvence definované v (a) nebo (b), (d) sekvence mající alespoň 60% identitu se sekvencí definovanou v (a), (b) nebo (c), nebo (e) sekvence, která je v důsledku genetického kódu degenerovanou sekvencí ke kterýkoliv sekvenci • · ·

- 4 ···· · · · · ··· ·· ·· definované v (a) až (d).

A dále předkládaný vynález poskytuje následující:

vektor (expresní vektor), který obsahuje polynukleotid podle vynálezu a který je schopen exprimovat polypeptid podle vynálezu, buněčnou linie obsahující vektor podle vynálezu, způsob přípravy polypeptidu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje udržování buněčné linie podle vynálezu v podmínkách vhodných pro trvalou expresi polypeptidu, a jestliže je to nutné, izolaci polypeptidu, způsob degradace β-D-xylanu, kterýžto způsob zahrnuje kontaktování materiálu/suroviny obsahující β-D-xylan s polypeptidem podle vynálezu, a způsob identifikace sloučeniny modulující aktivitu xylanázy, kterýžto způsob zahrnuje kontaktování polypeptidu podle vynálezu s testovanou sloučeninou v přítomnosti β-D-xylanu a sledování nebo detekci jakékoliv modulace aktivity.

Stručný popis sekvencí

SEKVENCE ID. Č. 1 je DNA sekvence kódující xylanázu podle vynálezu pocházející z Talaromyces emersonii,

SEKVENCE ID. Č. 2 je aminokyselinová sekvence xylanázy, a

SEKVENCE ID. Č. 3 a 4 jsou syntetické PCR primery, které hybridizují se SEKVENCÍ ID. Č. 1.

• · · ·

- 5 Podrobný popis vynálezu

A. Polynukleotidy

Předkládaný vynález poskytuje (izolovaný a/nebo purifikovaný) polynukleotid kódující polypeptid podle vynálezu. Předkládaný vynález tak poskytuje polynukleotid kódující xylanázu, jejíž aminokyselinová sekvence je uvedena v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2 (zralá sekvence od aminokyseliny 23 do aminokyseliny 408). Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotid kódující polypeptid mají podstatnou aminokyselinovou sekvenční homologii s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2. Také je zahrnut polynukleotid vybraný ze skupiny obsahující:

(a) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci (například od polynukleotidů 69 až do 1224) uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 1, nebo jeho komplement, (b) polynukleotid obsahující nukleotidou sekvenci schopnou (např. selektivně) hybridizovat s nukleotidovou sekvencí uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 1, nebo jeho fragment, (c) polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci schopnou (např. selektivně) hybridizovat s komplementem (tj. komplementární sekvencí) nukleotidové sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 1, nebo jeho fragment, a/nebo (d) polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci, která je v důsledku genetického kódu degenerovanou sekvencí k polynukleotidů definovanému v (a) , (b) nebo (c).

• · « ·

- 6 Polynukleotid podle vynálezu také zahrnuje polynukleotid který:

(a) kóduje polypeptid mající xylanázovou aktivitu, kterýžto polynukleotid je:

(1) kódující sekvence SEKVENCE ID. Č. 1 (například polynukleotidy 69 až 1224) (2) sekvence, která hybridizuje selektivně s kompiementem sekvence definované v (1), nebo (3) sekvence, která je v důsledku genetického kódu degenerovanou sekvencí vzhledem k sekvenci definované v (1) nebo (2), nebo (b) je sekvencí komplementární k polynukleotidu definovanému v (a).

Odkazy na SEKVENCI ID. Č. 1 mohou být nahrazeny zralou kódující sekvencí (polynukleotidy 69 až 1224), pokud popis specificky nevyžaduje jinak.

Hybridizovatelné sekvence

Termín schopný hybridizovat (nebo „schopný hybridizace) znamená, že cílový polynukleotid podle vynálezu může hybridizovat s nukleovou kyselinou použitou jako sonda (například nukleotidovou sekvencí uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 1, nebo s jejím fragmentem nebo jejím kompiementem) v hladině (v množství) významně vyšší než je hladina (množství) pozadí (šumu). Vynález také zahrnuje nukleotidové sekvence, které kódují xylanázu, nebo jejich varianty, stejně jako nukleotidové sekvence, který jsou k nim komplementární. Nukleotidové sekvence může být RNA nebo DNA a tedy zahrnuje genomovou DNA, syntetickou DNA nebo cDNA. Výhodně nukleotidové • · • ·

- 7 sekvence je DNA sekvence a nejvýhodněji je to cDNA sekvence.

Typicky sekvenci selektivních komplementem polynukleotid nukleotidů, podmínek kóduj ící podle vynálezu obsahuje souvislou která je schopná hybridizovat za s kódující sekvencí nebo jejím (zralé) sekvence uvedené zde jako

SEKVENCE ID. Č. 1. Takové nukleotidy mohou být syntetizovány některou z metod, které jsou odborníkům dobře známy.

Polynukleotid podle vynálezu může hybridizovat s kódující sekvencí nebo komplementem kódující (zralé) SEKVENCE ID. Č. 1 než hladina pozadí. Pozadí (šum) například v důsledku jiné v hladině významně vyšší hybridizace může nastat cDNA přítomné cDNA knihovně. Hladina signálu (tj . hladina způsobená interakcí mezi polynukleotidem podle vynálezu a kódující sekvencí nebo komplementem kódující sekvence) je typicky alespoň lOx, výhodně alespoň lOOx intenzivnější než signál interakce mezi jiným polynukleotidem a kódující sekvencí SEKVENCE ID. Č. 1. Intenzita interakce může být změřena, například radioaktivním značením sondy, např. pomocí ³²P. Selektivní hybridizace může být typicky dosažena použitím podmínek nízké stringence (0,3M chlorid sodný a 0,03M citrát sodný, přibližně 40 °C), střední stringence (například,

0,3M chlorid sodný a 0,03M citrát sodný v přibližně 50 °C) nebo vysoké stringence (například, 0,3M chlorid sodný a 0,03M citrát sodný, přibližně 60 °C) . Hybridizace může být prováděna v jakýchkoliv vhodných podmínkách, které jsou v oboru známy, jako vodítko lze užít např. podmínky, kdy nízká

stringence může	: být	např.	2 x SSC v	55
může být např.	0,5	až 1,0	x SSC v	60
může být např.	0,1	nebo 0,	.2 x SSC v	60
(např. 68 °C),	vždy	s 0,5%	SDS.

• ·

Modifikace

Polynukleotidy podle vynálezu mohou být DNA nebo RNA. Jsou buďto jednoduché (jednovláknové) nebo dvojvláknové. Mohou to také být polynukleotidy, který obsahují jeden nebo více syntetických nebo modifikovaných nukleotidů. Odborníkům je známa celá řada různých typů modifikací polynukleotidů. Tyto modifikace zahrnují methylfosfonátový a fosforothioátový základní řetězec a/nebo adici akridinového nebo polylysinového řetězce na 3' a/nebo 5' konec molekuly. Pro účely předkládaného vynálezu se termínem polynukleotid tomto textu rozumí polynukleotid, který může být modifikovaný jakýmkoliv způsobem v oboru známým.

Je jasné, že odborník může snadno s použitím rutinní techniky provést nukleotidové substituce, které neovlivní sekvenci polypeptidu kódovaného polynukleotidem podle vynálezu, s ohledem na využití kodonů v konkrétním ve kterém polypeptidy podle vynálezu s ohledem hostitelském organismu, jsou exprimovány.

Kódující (zralá) sekvence SEKVENCE ID. Č. 1 může být modifikována nukleotidovou substitucí, například 1, 2 nebo 3 až 10, 25, 50 nebo 100 substitucemi. Polynukleotid může být alternativně nebo dodatečně modifikován jednou nebo více inzercemi a/nebo delecemi a/nebo extenzí (prodloužením) buď jednoho nebo obou konců. Modifikovaný polynukleotid obecně kóduje polypeptid, který má xylanázovou provedeny degenerované substituce, aktivitu. Mohou být které ke je vedou konzervativním aminokyselinovým substitucím, když modifikovaná sekvence translatována, například jak bude ještě diskutováno ve vztahu k polypeptidům později.

toto·· • to to to to to to toto to • · · · · · · · to ·

- 9 Homology

Nukleotidové sekvence, která je schopná selektivně hybridizovat s (např. komplementem) DNA kódující SEKVENCE ID. Č. 1 (nebo nukleotidy 69 až 1224) má alespoň 70%, alespoň 75%, alespoň 80%, alespoň 90%, alespoň 95%, alespoň 98% nebo alespoň 99% sekvenční identitu (nebo homologii) s kódující sekvencí SEKVENCE ID. Č. 1. Toto může platit pro úsek alespoň 20, výhodně alespoň 30 nebo 60, například alespoň 100, alespoň 200, výhodněji alespoň 300 souvislých nukleotidů, nebo optimálně pro celou SEKVENCI ID. Č. 1.

Kterákoliv kombinace výše uvedené míry homologie a minimální velikosti může být použita k definování polynukleotidu podle vynálezu, přičemž výhodnější je přísnější kombinace (tj. vyšší homologie v delším úseku). Tak například polynukleotid, který je alespoň z 80 % nebo 90 % homologní s úsekem 25, výhodně 30 nukleotidů, tvoří jeden aspekt vynálezu, stejně jako polynukleotid, který je alespoň z 90 % homologní v úseku 40 nukleotidů.

Homology polynukleotidů (nebo proteinů) typicky mají alespoň 70% sekvenční homologii, výhodně alespoň 80%, 90%, 95%, 97% nebo 99% homologii, například v úseku alespoň 20, 25, 30, 100 a více souvislých nukleotidů (nebo aminokyselin). Homologie může být vypočtena na základě aminokyselinové identity (někdy označované jako hard homology, tj . tvrdá homologie).

Například programový soubor UWGCG poskytuje program BESTFIT, který může být použit pro výpočet homologie (například se použije se základním nastavením výchozích hodnot⁵) . Algoritmy PILEUP a BLAST mohou být použity k výpočtu homologie nebo k přiřazení (porovnání) sekvencí (jako například identifikace ekvivalentní nebo odpovídající • · • · · · sekvence, například při výchozí hodnotě nastavení parametrů ⁶'⁷).

Software pro analýzu BLAST je veřejně dostupný přes Národní Centrum Pro Biotechnologické Informace (http://www, nebi.nim.nih.gov/). Tento algoritmus zahrnuje nejdříve identifikaci párů s vysokým skóre (HSPS) , identifikaci krátkých slov délky W v dotazované sekvenci, které se shodují nebo splňují podmínku určité prahové hodnoty (skóre) T, když jsou porovnány se slovem stejné délky v databázi sekvencí.

6,7

Hodnota T je nazývána práh skóre sousedního slova

Tento maximální dosažen hodnotu, klesá z nejvyšší dosažené nález počátečního sousedního slova slouží jako počátek pro zahájení vyhledávání HSPS, které je obsahují. Nálezy slova se rozšiřují v obou směrech po každé sekvenci, dokud nemůže být zvýšeno kumulativní skóre porovnání. Rozšiřování pro slova v každém směru se zastaví, když: narůstající porovnání skóre odpadává množství X z její narůstající kumulativní skóre hodnoty, kumulativní skóre klesá na kvůli nahromadění jednoho nebo více přiřazených zbytků s negativním skóre, nebo je dosažen konec jedné či druhé sekvence. Parametry algoritmu BLAST jako je W, T a X určují senzitivitu a rychlost porovnávání sekvencí. Byl použit program BLAST s výchozím nastavením parametrů: délka slova (W) 11, přiřazení skórovací matice⁸ BLOSUM62 (B) 50, očekávání (E) 10, M = 5, N = 4, a srovnávána byla obě vlákna.

Algoritmus BLAST umožňuje provést statistickou analýzu podobnosti mezi dvěma sekvencemi. Jedna míra podobnosti poskytovaná algoritmem BLAST pravděpodobností (P(N)), která pravděpodobnosti, s jakou přiřazení shody dvěma nukleotidovým nebo aminokyselinovým sekvencím nastane náhodně. Tak například je nejmenší součet poskytuje indikaci

- 11 sekvence je považována za podobnou jiné sekvenci jestliže nejmenši součet pravděpodobnosti při srovnáni první sekvence a druhé sekvence je menší než přibližně 1, výhodně menší než přibližně 0,1, výhodněji menší než přibližně 0,01, a nejvýhodněji menší než přibližně 0,001.

• ♦ ····· ·« · • · · · · · · · · · ·»· · · · ···» ···· · · · · · · · ·· ··

Primery a sondy

Polynukleotidy vynálezu mohou být použity jako primery, např. PCR primery, primery pro alternativní amplifikační reakce, sondy, nebo mohou být polynukleotidy klonovány do vektorů. Takové primery, sondy a jiné fragmenty jsou dlouhé alespoň 20, 25, 30 nebo 40, například alespoň 25, 30 nebo 40 nukleotidů. Typicky jsou dlouhé až 30, 40, 50, 60, 70, 100,

150, 200 nebo 300 nukleotidů, nebo tento počet nukleotidů (až jen několik málo, jako např. 5 nebo 10 nukleotidů) krátké úseky kódující (zralé) sekvence SEKVENCE ID. Č. 1.

Obecně, primery se připravují syntetickým způsobem, který zahrnuje postupnou přípravu požadované sekvence nukleové kyseliny po jednotlivých nukleotidech k dispozici automatizované techniky pro Příklady primerů podle vynálezu jsou sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 3 a 4.

Odborníkům jsou takovou přípravu, uvedeny v seznamu připravují použitím využívá metoda PCR

Delší polynukleotidy se obecně rekombinantních technik, například se (polymerázová řetězová reakce) klonování. Při této metodě se připraví dvojice (pár) primerů (např. velikosti přibližně 15 až 30 nukleotidů) k úseku xylanázového genu, který má být klonován, primery se kontaktují s mRNA nebo cDNA získanou z cílových buněk (např. kvasinek, bakteriálních, rostlinných, prokaryotických nebo houbových), výhodně buněk kmenu

Talaromyces, provede se polymerázová řetězová reakce • · ···· · · · · ··· · · ··

- 12 v podmínkách, které poskytnou amplifikaci požadovaného úseku, amplifikovaný fragment se izoluje (např. tím, že se reakční směs purifikuje na agarózovém gelu) a izoluje se amplifikovaná DNA. Primery mohou být zkonstruovány tak, že obsahují vhodná rozpoznávací místa restrikčních enzymů, takže amplifikovaná DNA může být snadno klonována do vhodného klonovacího vektoru.

Takové techniky mohou být použity pro přípravu celé nebo částečné xylanázové sekvence popisované v tomto textu. Genomové klony odpovídající cDNA SEKVENCI ID. Č. 1 nebo gen xylanázy obsahující například, introny a promotorovy úsek, spadají také do rozsahu vynálezu a mohou být získány analogickým způsobem (např. rekombinantní technikou, PCR, klonováním), vyjde-li se z genomové DNA z houby, kvasinky, bakterie, rostliny nebo prokaryotické buňky.

Polynukleotidy nebo primery mohou nést detekční značka, např. radioaktivní nebo neradioaktivní značka. Vhodné značky zahrnují radioizotopy jako například ³²P nebo ³⁵S, enzymové značky nebo proteinové značky jako je například biotin. Takové značky mohou být přidány k polynukleotidů nebo primeru podle vynálezu a mohou být detekovány způsoby, které jsou odborníkovi známé.

Polynukleotidy, značené nebo neznačené, se používají v testech založených na nukleových kyselinách pro detekci nebo sekvencování genu xylanázy nebo jeho variant ve vzorcích (např. hub) . Takové testy pro detekci obecně zahrnují kroky přivedení vzorku (např. houby), který domněle obsahuje DNA, do kontaktu se sondou nebo primerem podle vynálezu za hybridizačních podmínek a detekci jakéhokoliv duplexu (dvojšroubovice) vytvořeného mezi sondou a nukleovou kyselinou ze vzorku. Taková detekce může být provedena s použitím techniky jako například PCR nebo tím, že se imobilizuje sonda

- 13 na pevné fázi, odstraní se nukleová kyselina ve vzorku, která není hybridizována se sondou, a pak se detekuje nukleová kyselina, která hybridizuje se sondou. Jinak může být vzorek nukleové kyseliny imobilizován na pevná fázi a množství sondy navázané na pevné fázi pak může být detekováno.

Sondy podle vynálezu mohou příhodně být zabaleny ve formě testovací soupravy (kitu) ve vhodné nádobě. V takové soupravě může být sonda navázána na pevnou fázi, jestliže formát testu, pro který je souprava konstruována, vyžaduje takovou vazbu. Souprava může také obsahovat vhodná činidla pro ošetření vzorku, který má být zkoušen se sondou, pro hybridizaci sondy s nukleovou kyselinou ve vzorku, kontrolní činidla, návod k použití apod..

Výhodně, polynukleotid podle vynálezu je získatelný ze stejného organizmu jako polypeptid, například z houby, konkrétně houby rodu Talaromyces.

Pólynukleotidy sekvence SEKVENCE aktivitu. Varianty a/nebo delecí a mají podle vynálezu také zahrnují varianty

ID. Č. 1, které projevují xylanázovou mohou být připraveny adicí, substitucí schopnost štěpit polymerní β-D-xylan.

Příprava polynukleotidů

Polynukleotidy, které nemají 100% identitu s kódující (zralou) SEKVENCÍ ID. Č. 1, ale spadají do rozsahu předkládaného vynálezu, mohou být získány celou řadou způsobů. Tak např. varianty xylanázové sekvence popisované v tomto textu mohou být získány například prohledáváním genomových DNA knihoven z různých organismů, například těch, které byly diskutovány jako zdroje polypeptidů podle vynálezu. Kromě toho další houbové, rostlinné nebo prokaryotické homology • · · ·

- 14 xylanázy mohou být získány a takové homology a/nebo jejich fragmenty obecně budou hybridizovat se SEKVENCÍ ID. Č. 1. Takové sekvence mohou být získány screeningem cDNA knihovny nebo genomové DNA knihovny jiného biologického druhu užitím sond obsahujících celou SEKVENCI ID. Č. 1 nebo její část v podmínkách střední nebo vysoké stringence (jak bylo popsáno výše) . Sondy nukleové kyseliny obsahující celou SEKVENCI ID. Č. 1 nebo její část mohou být použity pro screening cDNA knihoven jiných biologických druhů, jako například druhů popsaných jako zdroje pro polypeptidy podle vynálezu.

Druhové homology mohou také být získány s použitím degenerované PCR, kdy se použijí primery navržené k cílovým sekvencím uvnitř variant a homologů kódující konzervativní Primery obsahují jednu nebo více aminokyselinové sekvence, degenerovaných stringencí než poloh používají jaká se užívá se v podmínkách s nižší pro klonování sekvence s jednoduchými primery pro známou sekvenci.

Alternativně takové polynukleotidy mohou být získány místně cílenou mutagenezí z xylanázové sekvence nebo její varianty. Toto může být využito tam, kde je potřeba například měnit umlčené kodony v sekvenci pro optimalizaci preferenčního využití kodonů pro konkrétní hostitelskou buňku, ve které jsou polynukleotidové sekvence exprimovány. Jiné sekvenční změny mohou být požadovány proto, aby se vnesla nová rozpoznávací místa restrikčních enzymů, nebo aby se změnily vlastnosti nebo funkce polypeptidu kódovaného polynukleotidem.

Vynález zahrnuje dvojvláknový polynukleotidy obsahující polynukleotid podle vynálezu a jeho komplement (komplementární sekvenci).

Předkládaný vynález dále poskytuje polynukleotidy kódující polypeptidy podle vynálezu popsané dále. Protože takové • «

- 15 polynukleotidy jsou použitelné jako sekvence pro rekombinantní produkci polypeptidů podle vynálezu, není nutné, aby hybridizovaly se SEKVENCÍ ID. Č. 1, ačkoli obecně je tato vlastnost žádoucí. Jinak takový polynukleotid může být značen, použit, a připraven jak bylo popsáno výše, jestliže je to třeba. DNA fragmenty mohou být připraveny s použitím PCR techniky se specifickými primery.

B. Polypeptidy týká (např.

(v podstatě) xylanázy a jejích variant, sestávají v podstatě z

Předkládaný vynález se purifikované a/nebo izolované;

Polypeptidy podle vynálezu aminokyselinové sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2, nebo její části (jako například zralá sekvence zahrnující polohy 23 až 408), nebo jejích variant. Polypeptidy jsou kódovány polynukleotidy podle vynálezu, jak bylo popsáno výše. Odkazy na SEKVENCI ID. Č. 2 mohou být nahrazeny odkazem pouze na zralou sekvenci (zbytky Ala²³ až Leu⁴⁰⁸ ), ledaže to kontext vyžaduje jinak.

Polypeptidy podle vynálezu mohou projevovat aktivitu jak na arabinoxylanu tak i na aryl-p-D-xylosidech (například mají arabinoxylanázovou a xylosidázovou aktivitu).

Polypeptid podle vynálezu může být v izolované nebo v podstatě purifikované formě. Je samozřejmé, že polypeptid může být smíchán s nosičem nebo ředidlem, které nenarušují zamýšlený účel a funkci polypeptidu, a přitom je polypeptid stále považován za v podstatě izolovaný. To znamená, že sem patří obecně polypeptidový preparát, ve kterém je více než 20 %, např. více než 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 %, 95 % nebo 99 % (hmotnostních) polypeptidu v preparátu polypeptidu podle vynálezu. Toto jsou relativně čisté preparáty, pro některé • « • · · · · · ·· ··· ··

- 16 aplikace polypeptid může být přítomen v preparátu nejvýše v množství 10%, 5%, 2%, 1% nebo dokonce méně 0,5 %. Obvyklé rutinní postupy¹ mohou být použity k purifikaci a/nebo syntéze proteinů podle vynálezu. Pro některé formulace (např. pro jiné než farmaceutické použití) množství polypeptidů přítomné v preparátu může být malé, například jen 0,01 až 10 %, například 0,1 až 5 %, nebo 2 % nebo dokonce jen 0,2 až 1 %.

Výhodně je polypeptid podle vynálezu připravitelný z mikroorganizmu, který obsahuje gen kódující enzym s aktivita xylanázy. Výhodněji je tento mikroorganizmus houba a nejvýhodněji vláknitá houba. Výhodné organizmy jsou rodu Talaromyces, jako například druh Talaromyces emersonii (např. CBS 393.64 nebo 814.70) .

Aktivita

Polypeptid podle vynálezu má jednu nebo více následujících vlastností, zejména:

(1) má β-D-xylanázovou aktivitu, (2) má pH optimum v rozsahu 2 až 6, jako například 3 až 5, optimálně 3,5 až 5,0, (3) má teplotní optimum aktivity při teplotě 50 °C až 95 °C, například 70 až 90 °C, optimálně 75 až 85 °C, (4) má molekulová hmotnost (v deglykosylované formě) 30 až 50 kDa, výhodně 35 až 45 kDa, optimálně 40 až 44 kDa nebo (v glykosylované formě) 50 až 75kDa, výhodně 55 až 70kDa, optimálně 60 až 66kDa, a/nebo (5) má izoelektrický bod 3,0 až 3,6.

Polypeptid má aktivitu EC. 3.2.1.8. Výhodně je polypeptid • · • •toto • · ·· · · • · · ·

- 17 z rodiny 10 (dříve typu F) .

Xylanázová aktivita (příp. aktivita xylanázy) je definovaná jako schopnost štěpit celulózu nebo β-D-xylanový polymer (například jak byla zjištěna v rostlinách např. ovsu nebo ječmenu). Aktivita tak umožňuje štěpení β-D-xylanů, například mezi sousedními xylopyranosylovými koncovými a/nebo nekoncovými jednotkami.

Výhodně ke štěpení dochází ve vazbě [xylopyranosyl (1-4) xylopyranosyl]. Polypeptid výhodněji štěpí mezi dvěma sousedními (např. nesubstituovanými) jednotkami. Takže může mít endo-aktivitu (tzn. že se jedná o endoxylanázu). Polymer, který je substrátem, může být substituovaný nebo nemusí. Enzym může mít také exo-aktivitu (tj. jde o exoxylanázu), jako například enzym štěpící koncové xylopyranosylové jednotky. Výhodně polypeptid nemá glukanázovou aktivitu.

Polypeptidy podle vynálezu mohou také působit (nebo projevovat aktivitu) na arabinoxylan. Arabinoxylan představuje podmnožinu xylanů, s L-arabino-furanosylovým postranním řetězcem navázaným na C-2 nebo C-3, nebo oba, xylózové zbytky hlavního řetězce. Arabinoxylan má registrační číslo CAS: 98513-12-3. Může mít např. strukturu (l->4)-β-D-xylanu s 3-navázaným α-L-arabinózovým postranním řetězcem. Tento typ xylanu se normálně vyskytuje v xylanech ovsa.

Tato aktivita představuje schopnost hydrolyzovat neošetřený arabinoxylan. To znamená arabinoxylan, který nebyl nijak ošetřen ani modifikován, například nebyl podroben působení arabinofuranosidázy. Tento enzym může odstranit arabinózové postranní řetězce. Polypeptidy podle vynálezu jsou schopné hydrolyzovat (štěpit) arabinoxylany, které nebyly předtím podroben působení arabinofuranosidázy.

Arabinoxylan se vyskytuje ve špaldě a ovsu, a v tomto * < 9 · · ·

- 18 popisu je aktivita polypeptidu (EXU stejně jako PAHBAH aktivita) určována na arabinoxylanu z pšeničné mouky (s poměrem 41:59 arabinóza:xylóza). Test na arabinoxylan (jako substrát) je popsaný dále v příkladech.

Polypeptidy podle vynálezu mají xylosidázovou aktivitu, například jsou schopné hydrolyzovat substituované (např. arylovou skupinou) β-D-xylosidázy (také známé jako xylopyranosidy). Například jsou schopné hydrolyzovat

4-methylumbelliferyl-p-D-xylopyranosid (registr, č. 6734-33-4, získatelný od firmy SIGMA Chemical Co) . Tato aktivita je schopnost uvolňovat fluorescenční značku ze substrátu. Může také hydrolyzovat (být účinný na) 5-brom-4-chlor-3-indoxyl-pD-xylopyranosid (registr. č. CAS 207606-55-1). Kombinace aktivity působící na arabinoxylan a aryl-p-D-xylosid je neobvyklá^36,37 a je novou kombinací aktivit u polypeptidu, který má xylanázovou aktivitu.

Varianty a homology

Polypeptid podle vynálezu obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2 nebo v podstatě homologní sekvenci nebo fragment kterékoliv z těchto sekvencí, a má xylanázovou aktivitu. Obecně je výhodná přirozeně se vyskytující aminokyselinová sekvence uvedená zde jako SEKVENCE ID. Č. 2.

Konkrétně polypeptid podle vynálezu obsahuje:

a) (zralou) polypeptidovou sekvenci uvedenou zde v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2 (zbytky 23 až 408) nebo celou SEKVENCI ID. Č. 2,

b) přirozeně se vyskytující variantu nebo její druhový homolog, nebo

- 19 44 »·4· 4» 4444 ·· ··»»

4« · · · · 4 4 4 · * 4 · · 4 44 · ··*« 4 · 4 4 4 • 444 44 44 44« 4* 4«

c) protein s alespoň 70%, alespoň 75%, alespoň 80%, alespoň 90%, alespoň 95%, alespoň 98% nebo alespoň 99% sekvenční identitou s (a) nebo (b).

Varianta se vyskytuje buďto přirozeně, např. u hub, baktérií, kvasinek, nebo rostlinných buněk, a působí v podstatě podobné jako působí protein mající SEKVENCI ID. Č. 2, například má xylanázovou aktivitu. Podobně druhové homology proteinu jsou rovnocenné proteiny, které se přirozeně vyskytují u jiných biologických druhů a působí jako xylanáza. Varianty zahrnují alelické varianty buďto téhož kmene jako polypeptid podle vynálezu nebo z jiného kmene, ale stejného biologického rodu nebo stejného biologického druhu.

Varianty a druhové homology mohou být připraveny následujícími postupy, popsanými v tomto textu pro přípravu polypeptidů majícího SEKVENCI ID.

postupů na kvasinkové, vhodný houbové použití sondu, jak

C.

buněčný zdroj,

2, a aplikací takových například bakteriální, nebo rostlinné buňky. Je také možné byla definována výše, pro screening knihoven připravených z kvasinkových, bakteriálních, houbových nebo rostlinných buněk a tak získat klony obsahující varianty nebo druhové homology. Klony pak mohou být zpracovány obvyklými způsoby, aby byl získán polypeptid podle vynálezu, který pak může být připraven rekombinantními nebo syntetickými technikami, které jsou odborníkům známy.

Polypeptid podle vynálezu má výhodně alespoň 70% sekvenční identitu s proteinem SEKVENCE ID. Č. 2, výhodněji alespoň 80%, alespoň 90%, alespoň 95%, alespoň 97% nebo alespoň 99% sekvenční identitu, například v úseku velikosti alespoň 40, 60, 100, 150, 200, 300 nebo 400 souvislých aminokyselin nebo v rozsahu kompletní SEKVENCE ID. Č. 2.

Sekvence polypeptidů SEKVENCE ID. Č. 2 a jeho variant

- 20 99 9··· 9« 9999 ·· ·«·· • * · · » « · ·

9 9 9 9 9 9 99 · • » 9 9 · 9 9 9 9 · ··· 99 9 9999

9999 99 99 9·· 99 99 a druhových homologů může být modifikována, a tak poskytnout polypeptidy podle vynálezu. Substituce aminokyselin může být provedena například v rozsahu 1, 2 nebo 3 až 10, 20, 30, 50 nebo 100 substituovaných aminokyselin. Také může být proveden stejný počet deleci nebo inzercí. Tyto změny mohou být prováděny vně úseků rozhodujících pro funkci polypeptidu, takže se i po změnách zachovává účinný enzym. Modifikovaný polypeptid si obecně zachovává aktivitu jako xylanáza.

Polypeptidy podle vynálezu zahrnují fragmenty výše uvedených kompletních polypeptidů (polypeptidů plné délky) a jejich variant, včetně fragmentů sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 2. Takové fragmenty typicky zachovávají aktivitu xylanázy. Fragmenty jsou alespoň 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200 nebo 250 aminokyselin dlouhé nebo o tento počet aminokyselin zkrácená kompletní sekvence (uvedená jako SEKVENCE ID. Č. 2). Fragmenty nebo varianty zahrnují nebo reprezentují vazebný úsek pro β-D-xylan nebo úsek štěpící β-Dxylan.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být, jestliže je to potřeba, připraveny syntetickým způsobem, ačkoli obvykle jsou připravována rekombinantně, jak to bude ještě dále popsáno. Mohou být modifikovány například připojením histidinových zbytků nebo tzv. T7 značky („His tag a „T7 tag), což napomáhá při jejich identifikaci nebo purifikaci, nebo mohou být modifikovány připojením signální sekvence, která podporuje jejich sekreci z buňky.

Termín v podstatě biologickou varianty se týká polypeptidů, které mají stejné základní vlastnosti nebo základní funkci jako xylanáza, a zahrnují alelické je to, že se jedná o varianty. Základní vlastností xylanázy enzym, který může štěpit vazbu l->4 v β-D-xylanu. Polypeptid ·· 4···

- 21 ·· »··· ·· ···· •· · · · · · _e • · to » tototo ·· · • · · · to ·«·· · • ·· ·· · ·*·· ···· toto >· ·>· ·# ·· mající stejné základní vlastnosti jako xylanáza může být identifikován pomocí testu degradace celulózy, jak je popsán dále.

Varianty SEKVENCE ID. Č. 2 také zahrnují sekvence, které se liší od SEKVENCE ID. Č. 2, ale které nejsou nutně odvozeny z přirozeně se vyskytujícího xylanázového proteinu. Tyto varianty mohou být popsány jako sekvence mající určitou procentuální homologii se SEKVENCÍ ID. Č. 2 nebo mající určitý počet substitucí uvnitř této sekvence. Alternativně varianta může být kódována polynukleotidem, který hybridizuje se sekvencí uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 1.

Varianty mohou být definovány podobným způsobem jako varianty SEKVENCE ID. Č. sekvence pocházející z

1. Takže varianty zahrnují varianty jiných kmenů Talaromyces. Další varianty mohou být identifikovány z jiných kmenů Talaromyces tím, že se vyhledává xylanázová aktivita a pak se klonují a sekvencují, jak bylo popsáno výše. Varianty mohou obsahovat delece, modifikace nebo adice jednotlivých aminokyselin nebo skupin aminokyselin uvnitř proteinové sekvence, dokud si peptid zachovává základní biologickou funkci xylanázy.

Konzervativní substituce mohou být provedeny např. podle následující tabulky. Aminokyseliny v stejném bloku ve druhém sloupci a výhodně ve stejném řádku ve třetím sloupci mohou být vzájemně substituovány. Výhodně substituce aminokyselin neovlivňují svinutí („folding) nebo aktivitu polypeptidu.

	Nepolární	G	A	P
I	L	V
ALIFATICKÉ	Polární - bez náboje	C	S	T M
		N	Q
	Polární - nabité	D	E
		K	R
		H	F	W Y
AROMATICKÉ

- 22 Modifikace

Polypeptidy podle vynálezu mohou být chemicky modifikované, např. post-translačně modifikované. Například mohou být glykosylované (jednou nebo vícekrát, stejnými nebo různými sacharidy) nebo mohou obsahovat modifikované aminokyselinové zbytky. Mohou také být modifikované navázáním histidinových zbytků (napomáhá purifikaci) nebo přidáním signální sekvence (podporuje inzerci do buněčné membrány). Polypeptid může mít jednu nebo více N- (neboli amino-) nebo C- (neboli karboxy-) koncových extenzí, jako je například amino-koncový methioninový zbytek, malý spojovací peptid (tzv. linker) velikosti přibližně 20 až 25 zbytků, nebo (malou) extenzi usnadňující purifikaci, jako je například polyhistidin nebo T7 značka („tag), antigenní epitop nebo vazebná doména¹⁴ (např. pro maltózu) (např. na C-konci). Takovéto extenze mohou být připojeny prostřednictvím spojovací sekvence (linkeru) nebo i bez ní.

Polypeptid podle vynálezu může být značen pomocí detekovatelné značky. Detekovatelná značka je jakákoliv vhodný značka, který dovoluje, aby polypeptid mohl být detekován. Vhodné značka štítky zahrnují radioizotopy, např. ¹²⁵I, ³⁵S, enzymy, protilátky, polynukleotidy a linkery jako je například biotin.

Polypeptidy mohou být modifikována např. tak, že obsahují aminokyseliny, které se přirozeně nevyskytují, aby se tak zvýšila stabilita polypeptidu. Když jsou proteiny nebo peptidy připraveny syntetickým způsobem, tyto „nepřirozené aminokyseliny mohou být do polypeptidu inkorporovány v průběhu přípravy. Proteiny nebo peptidy mohou být modifikovány až následně po přípravě syntetickým nebo rekombinantním způsobem.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být také připraveny tak, • · · · • · · ·

- 23 že obsahují jednu nebo více D-aminokyselin. V takovém případě aminokyselinové zbytky jsou navázány v obvyklém N-C sledu, jak bylo popsáno výše.

Celá řada modifikací vedlejších (postranních) řetězců je odborníkům známa a může být tedy použita i pro postranní řetězce proteinů nebo peptidů podle předkládaného vynálezu. Takové modifikace zahrnují, například, modifikace aminokyselin redukční alkylací, kdy probíhá reakce s aldehydem následovaná redukcí s NaBH₄, amidací s methylacetimidátem nebo acylací s acetanhydridem.

Sekvence poskytované podle předkládaného vynálezu mohou také být použity jako výchozí látky pro konstrukci tzv. enzymů druhé generace. Xylanázy „druhé generace jsou enzymy , které jsou změněny technikami mutageneze (např. místně cílená mutageneze) , a mají tu vlastnost, že se liší od xylanázy divokého typu nebo rekombinantní xylanázy, například připravené podle předkládaného vynálezu. Například, teplotní optimum nebo pH optimum, specifická aktivita, substrátová afinita nebo teplotní stabilita mohou být změněny, aby byl enzym lépe přizpůsoben pro aplikaci v daném procesu.

Aminokyseliny nezbytné pro aktivitu xylanázy podle vynálezu, které jsou proto výhodně subjektem substituce, mohou být identifikovány postupy, které jsou v oboru známy, jako je například místně cílená mutageneze nebo alaninová skenovací mutageneze¹⁰. V druhém z uvedených postupů jsou mutace vnášeny za každým zbytkem v molekule a výsledné mutované molekuly jsou pak testovány na biologickou aktivitu (např. xylanázovou aktivitu), aby byly identifikovány aminokyselinové zbytky, které jsou rozhodující pro aktivitu molekuly. Místa interakce enzym-substrát mohou také být určena analýzou krystalové struktury, která se provádí takovými technikami jak nukleární • · · ·

- 24 magnetická resonance, krystalografie nebo fotoafinitní značení, a nebo molekulárním modelováním.

Lze očekávat, že použití kvasinkových a houbových hostitelských buněk poskytne takové posttranslační modifikace (např. proteolytické opracování, myristilaci, glykosylaci, zkrácení, a případně fosforylaci tyrosinu, šeřinu nebo threoninu), které jsou potřebné pro dosažení optimální biologické aktivity produktů rekombinantní exprese podle předkládaného vynálezu.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být poskytovány v takové formě, kdy jsou mimo své přírodní buněčné prostředí. Takže jsou v podstatě izolované nebo purif ikované, jak bylo již diskutováno výše, nebo jsou v buňce, ve které se však v přírodě nevyskytují, např. v buňce jiného houbového druhu, zvířete, kvasinky nebo baktérie.

C. Rekombinantní aspekty

Vynález také poskytuje vektory obsahující polynukleotid podle vynálezu, včetně klonovacích a expresních vektorů, a způsoby kultivace, transformace nebo transfekce takových vektorů do vhodných hostitelských buněk, například v podmínkách, kdy nastane exprese polypeptidu podle vynálezu. Vynález poskytuje také hostitelské buňky obsahující polynukleotid nebo vektor podle vynálezu, kde polynukleotid je heterologní vzhledem ke genomu hostitelské buňky. Termín heterologní, obvykle ve vztahu k hostitelské buňce, znamená, že polynukleotid se přirozeně nevyskytuje v genomu hostitelské buňky, nebo že polypeptid není přirozeně produkován buňkou. Výhodně je hostitelská buňka kvasinková buňka, například buňka kvasinky rodu Kluyveromyces nebo Saccharomyces, nebo je to houbová buňka, například houby rodu Aspergillus.

- 25 Polynukleotidy podle vynálezu mohou být vloženy do rekombinantních replikovatelných vektorů, například klonovacích nebo expresních vektorů. Vektor tak může být použit pro replikaci nukleové kyseliny v kompatibilní hostitelské buňce. Takže v dalším provedení vynález poskytuje způsob přípravy polynukleotidů podle vynálezu tím, že se vloží polynukleotid podle vynálezu do replikovatelného vektoru, vektor se vnese do kompatibilní hostitelské buňky a hostitelská buňka se kultivuje v podmínkách, které umožňují replikaci vektoru. Vektor se pak izoluje z hostitelské buňky. Vhodné hostitelské buňky jsou popsány dále v souvislosti s expresními vektory.

Vektory

Polynukleotid podle vynálezu může být vložen do expresní kazety. Vektor, do kterého je expresní kazeta nebo polynukleotid podle vynálezu vložen, může být jakýkoliv vektor, který může být dále zpracován technikami rekombinantní DNA, přičemž volba vektoru často závisí na hostitelské buňce, do které má být zaveden. Takže vhodný vektor je autonomně se replikující vektor, tj. vektor, který existuje jako extrachromozomová entita, jehož replikace je nezávislá na replikaci chromozómu, jako je např. plazmid. Jinak vektor může být také takový vektor, který po vnesení do hostitelské buňky se integruje do hostitelského buněčného genomu a replikuje se společně s chromozómem, do kterého je integrovaný.

Výhodně je polynukleotid podle vynálezu ve vektoru operativně spojen s regulační sekvencí, která je schopná umožnit expresi kódující sekvence v hostitelské buňce, tj . vektor je expresní vektor. Termín operativně spojen se týká vzájemného spojení, kde spojené složky vykonávají • · · · · ·

- 26 předpokládané funkce. Regulační sekvence jako je například promotor, enhancer (zesilovač) nebo jiný signál regulace exprese operativně spojený s kódující sekvencí je umístěn tak, že exprese kódující sekvence je dosaženo v podmínkách kompatibilních s kontrolní sekvencí uspořádány tak, že fungují v souladu účelem, například na promotoru se nebo sekvence jsou s jejich zamýšleným zahájí transkripce a pokračuje po celé DNA sekvenci kódující polypeptid.

Vektor může být plazmidový, kosmidový, virový nebo fágový vektor, obvykle vybavený replikačním počátkem, volitelně promotorem pro expresi polynukleotidů a volitelně také enhancerem a/nebo regulátorem promotoru. Terminátorová sekvence může být také přítomná, stejně jako polyadenylační sekvence. Vektor může volitelně obsahovat jeden nebo více genů pro selekční markéry, například gen rezistence k ampicillinu (v případ bakteriálního plazmidu) nebo gen rezistence k neomycinu (pro savčí vektor). Vektory mohou být použity také in vitro, například pro produkci RNA, nebo použity pro transfekci nebo transformaci hostitelské buňky. Mohou obsahovat i dva nebo více polynukleotidů podle vynálezu, například pro dosažení nadměrné exprese („overexprese).

DNA sekvence kódující polypeptid podle vynálezu je výhodně vnesena do vhodného hostitele jako součást expresní kazety (nebo konstruktu), kde DNA sekvence je operativně spojena s expresními signály, které jsou schopné řídit expresi DNA sekvence v hostitelských buňkách. Pro transformaci vhodného hostitele expresním konstruktem jsou k dispozici postupy transformace, které jsou odborníkům dobře známy³'⁴. Expresní konstrukt může být použit pro transformaci hostitele jako součást vektoru nesoucího selekční markér nebo expresní konstrukt může být kotransformován jako oddělená molekula • · · • »

- 27 společně s vektorem nesoucím ukazovatel. Vektor může obsahovat jeden nebo více genů pro selekční markéry.

K výhodným selekčním markérům¹⁵'¹⁶ patří, aniž by tento výčet byl omezující, takové, které komplementuji defekt v hostitelské buňce nebo poskytují rezistenci k léčivu. Patří sem např. univerzální markerové geny, které mohou být použity při transformaci většiny vláknitých hub a kvasinek, jako například gen nebo cDNA acetamidázy (geny amdS, niaD, facA nebo cDNA z A. nidulans, A. oryzae, nebo A. niger) , nebo geny poskytující rezistenci k antibiotikům jako například G418, hygromycinu, bleomycinu, kanamycinu, phleomycinu nebo benomylu (benA). Jinak mohou být užity specifické selekční markéry jako například auxotrofní markéry, které vyžadují odpovídající mutantu hostitelského kmene, např. URA3 (ze S. cerevisiae nebo analogický gen z jiné kvasinky), pyrG nebo pyrA (z A. nidulans nebo A. niger), argB (z A. nidulans nebo A. niger) nebo trpC. Ve výhodném provedení je selekční markér odstraněn z transformovaných hostitelských buněk po zavedení expresního konstruktu, takže jsou získány transformované hostitelské buňky schopné produkovat polypeptid, které jsou bez genů pro selekční markéry^21,22.

Další markéry představují ATP synthetáza, podjednotka 9 (oliC), orotidin-5¹-fosfátedekarboxyláza (pvrA), bakteriální gen rezistence k G418 (ten může také být použit v kvasinkách, ale ne v houbách), gen rezistence k ampicillinu (E. coli), gen rezistence k neomycinu (Bacillus) a gen uidA z E. coli kódující β-glukuronidázu (GUS). Vektory mohou být použity in vitro, například pro produkci RNA nebo pro transfekci nebo transformaci hostitelských buněk.

Pro většinu vláknitých hub a kvasinek je vektor nebo expresní konstrukt výhodně vložen do genomu hostitelské buňky,

- 28 aby se získaly stabilní transformanty. Nicméně pro některé kvasinky jsou dostupné také vhodné episomální vektory, do kterých může být expresní konstrukt vložen, a které umožní stabilní a vysokou hladinu exprese, například vektory pocházející plazmidů 2μ a pKDl Saccharomyces a Kluyveromyces, v daném pořadí, nebo vektory obsahující AMA sekvence (např. AMAl z Aspergillus^3,20). V případě, kdy expresní konstrukty jsou integrovány v genomu hostitelských buněk, konstrukty jsou buďto integrovány do náhodných lokusů genomu nebo v předem určených cílových místech s využitím homologní rekombinace, přičemž v tomto druhém případě cílová místa jsou výhodně místa genů s vysokou hladinou exprese. Gen s vysokou hladinou exprese je gen, jehož mRNA představuje alespoň 0,01 % (hmotnost.) celkové buněčné mRNA, např. v indukovaných podmínkách, nebo alternativně gen, jehož genový produkt tvoří alespoň 0,2 % (hmotnost.) celkového buněčného proteinu, nebo v případě secernovaného genového produktu, je secernován v hladině alespoň 0,05 g/1. Řada příkladů vhodných genů s vysokou hladinou exprese je uvedena dále.

Vektor nebo expresní konstrukt pro danou hostitelskou buňku obsahuje následující prvky operativně spojené v řadě ve směru od 5'-konce 3'-konci kódujícího vlákna sekvence kódující polypeptid podle vynálezu:

(1) promotorové sekvence (promotor) schopná řídit transkripci DNA sekvence kódující polypeptid v dané hostitelské buňce, (2) volitelně signální sekvence schopná řídit sekreci polypeptidu z dané hostitelské buňky do kultivační média, (3)DNA sekvence kódující zralou a výhodně aktivní polypeptidu, a výhodně také formu

- 29 (4)Terminační úsek transkripce (terminátor) schopný ukončit transkripci „downstream od DNA sekvence kódující polypeptid.

„Downstream (po směru transkrioce) od DNA sekvence kódující polypeptid může být 3' neranslatovaný úsek obsahující jedno nebo více míst ukončení transkripce (např. terminátor). Původ terminátoru není příliš kritický. Terminátor může např. být nativní k DNA sekvenci kódující polypeptid. Tudíž výhodně je užit kvasinkový terminátor v kvasinkových hostitelských buňkách a terminátor z vláknitých hub je použit v hostitelských buňkách vláknitých hub. Výhodněji je terminátor endogenní k hostitelské buňce (v které má být DNA sekvence kódující polypeptid exprimována).

Zesílení exprese polynukleotidu kódujícího polypeptid podle vynálezu může být dosaženo výběrem heterologního regulačního úseku, např. promotoru, sekreční vedoucí sekvence a/nebo terminátoru, které mohou zvyšovat expresi a, jestliže je to požadováno, také sekreci požadovaného proteinu z expresního hostitele a/nebo také poskytovat indukovatelnou expresi polypeptidu podle vynálezu.

Kromě promotoru nativního k genu kódujícímu polypeptid podle vynálezu může být použit i jiný promotor pro řízení exprese polypeptidu podle vynálezu. Promotor může být vybrán pro svou účinnost v řízení exprese polypeptidu podle vynálezu v požadovaném expresním hostiteli.

Promotory/enhancery a jiné expresní regulační signály mohou být vybrány tak, aby byly kompatibilní s hostitelskou buňkou, pro kterou je konstruován expresní vektor. Například prokaryotický promotory může být použit zejména výhodně pro expresi ve kmenech E. coli. Když je exprese prováděna v savčích buňkách, výhodně je použit savčí promotor. Tkáňově • · • · specifické promotory, jako je například promotor specifický pro hepatocyty, se také používají. Virové promotory mohou také být použity, například promotor z dlouhé koncové repetice (LTR) Moloneyho viru myší leukémie (MoMLV LTR), promotor z LTR viru Rousova sarkomu (RSV), promotor SV40 (např. velkého antigenu T) , IE promotor z humánního cytomegaloviru (CMV), promotor viru herpes simplex nebo promotor adenoviru, promotor HSV jako například HSV IE promotory, nebo promotory HPV, konkrétně protisměrného regulačního úseku HPV (URR). Kvasinkové promotory zahrnují promotory GAL4 a ADH ze S. cerevisiae, promotory nmt 1 a adh ze S. pombe. Savčí promotory zahrnují metallothioneinový promotor, který může být indukován v reakci na těžké kovy, například kadmium, a βaktinový promotor. Tkáňově specifické promotory, konkrétně např. promotory specifické pro endotelové nebo neuronové buňky (například promotory DDAHI a DDAHII) jsou obzvláště výhodné.

Může být použita celá řada promotorů¹⁵'¹⁶, které jsou schopné řídit transkripci v hostitelských buňkách podle vynálezu.

Výhodně promotorové s vysokou hladinou exprese, jak byl výše definován. Příklady výhodných genů s vysokou hladinou exprese, ze kterých pocházejí výhodně promotory, a/nebo které jsou obsaženy ve výhodný předurčených cílových místech pro integraci expresních konstruktů, zahrnují, ale bez omezení, geny kódující glykolytické enzymy jako například triosofosfátisomerázy (TPI), glyceraldehydfosfátdehydrogenázy rátkinázy (PGK), pyruvátkinázy (PYK dehydrogenázy (ADH), stejně jako geny kódující amylázy, glukoamylázy, proteázy, xylanázy, celobiohydrolázy, β-galaktosidázy, alkohol(methanol) oxidázy, elongační faktory a sekvence pocházejí z genu (GAPDH), fosfoglycenebo PKI), alkoholribosomální proteiny. Specifickým příkladem vhodných genů s vysokou hladinou exprese jsou např. gen LAC4 z Kluyveromyces

- 31 • · · ·

sp. , geny methanoloxidázy (AOX a MOX) z Pansenula a Pichia, v daném pořadí, geny glukoamylázy (glaA) z A. niger a A. awamori, gen TAKA-amylázy A. oryzae, gen gpdA z A. nidulans a gen celobiohydrolázy z T. reesei.

Příkladem silného konstitutivního a/nebo indukovatelného promotoru, který je výhodný pro použití v houbovém expresním hostiteli ^15,16,36 jsou takové promotory, které jsou získatelné z houbových genů xylanáza (xlnA), fytázy, ATP-syntetázy, podjednotka 9 (oliC), triosofosfátisomerázy (tpi), alkoholdehydrogenázy (AdhA) , oí-amylázy (amy) , amyloglukosidázy (AG z genu glaA), acetamidázy (amdS) a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (gpd).

Příklady získatelné z glycerátkinázy silného kvasinkového promotoru jsou genů alkoholdehydrogenázy, laktázy, a triosofosfátisomerázy.

promotory 3-fosfoPříklady silného bakteriálního promotoru jsou promotory oí-amylázy a SPo2 stejně jako promotory z genů extracelulárních proteáz.

Nativní promotor genu kódujícího xylanázu může být nahrazen promotorem, který je regulován odlišně od nativního promotoru.

Promotory vhodné pro rostlinné buňky zahrnují promotory nopalinsyntázy (nos), oktopinsyntázy (ocs), manopinsyntázy (mas), malé podjednotky ribulosobisfosfátkarboxylázy (rubisco ssu) , histonu, rýžového aktinu, faseolinu, 35S a 19S viru mozaiky květáku (CMV) a promotory genů cirkoviru. Všechny uvedené promotory jsou snadno dostupné pro odborníky.

Vektor může dále obsahovat sekvence obklopující polynukleotid, které dávají vzniknout RNA zahrnující sekvence homologní s eukaryotickými genomovými sekvencemi, výhodně se

- 32 savčí genomovou sekvencí nebo virovou genomovou sekvencí. To umožní zavedení polynukleotidu podle vynálezu do genomu eukaryotických buněk nebo virů homologní rekombinací. Konkrétně, plazmidový vektor obsahující expresní kazetu obklopenou virovými sekvencemi může být použit pro přípravu virového vektoru vhodného pro přenos polynukleotidu podle vynálezu do savčích buněk. Jiné příklady vhodného virového vektory zahrnují virové vektory herpes simplex¹⁸'¹⁹ a retroviry, včetně lentivirů, adenovirů, adeno-asociovaných virů a HPV virů (jako například HPV-16 nebo HPV-18). Techniky přenosu genů pomocí těchto virů jsou odborníkům známy. Retrovirové vektory například mohou být použity k trvalé integraci polynukleotidu, ze kterého vzniká antisense RNA, do hostitelského genomu. Replikačně defektní adenovirové vektory naproti tomu zůstávají episomální a proto umožňují jen přechodnou (tranzientní) expresi.

Vektor může obsahovat polynukleotid podle vynálezu orientovaný v antisense směru poskytující tak antisense RNA. To může být využito ke snížení, jestliže je to žádoucí, hladiny exprese polypeptidů.

Hostitelské buňky a exprese

V dalším aspektu vynález poskytuje způsob přípravy polypeptidů podle hostitelské buňky vynálezu, který zahrnuje kultivaci (např. transformované nebo transfekované expresním vektorem jak byl popsán výše) poskytují expresi (vektoru) kódující za podmínek, které sekvence kódující polypeptid, a volitelně izolaci exprimovaného polypeptidů.

Polynukleotid podle vynálezu rekombinantního replikovatelného může být zaveden do vektoru, např. expresního vektoru.

Vektor může být použit pro replikaci nukleových » · · ·4 · • · · · · 4

- 33 kyselin v kompatibilní hostitelské buňce. Tak v dalším provedení vynález poskytuje způsob přípravy polynukleotidu podle vynálezu tak, že se polynukleotid podle vynálezu vloží do replikovatelného vektoru, vektor se vnese do kompatibilní hostitelské buňky a hostitelská buňka se kultivuje za podmínek, které umožňují replikaci vektoru. Vektor může být izolován z hostitelské buňky. Vhodné hostitelské buňky zahrnují baktérie, jako například E. coli, kvasinky, savčí buněčné linie a jiné eukaryotické buněčné linie, například hmyzí buňky jako například buňky Sf9 a houbové buňky (např. vláknitých hub).

Výhodně je polypeptid podle vynálezu připravován jako secernovaný protein, v takovém případě je DNA sekvence kódující zralou formu polypeptidu v expresním konstruktu operativně spojena s DNA sekvencí kódující signální sekvenci. Výhodně je signální sekvence nativní (homologní) k DNA sekvenci kódující polypeptid. Alternativně signální sekvence je cizorodá (heterologní) k DNA sekvenci kódující polypeptid, v takovém případě signální sekvence je výhodně endogenní k hostitelské buňce, ve které je DNA sekvence exprimována. Příklady vhodné signální sekvence pro kvasinkové hostitelské buňky jsou signální sekvence pocházející z kvasinkových genů α-faktoru. Podobně vhodné signální sekvence pro hostitelské buňky vláknitých hub jsou např. signální sekvence pocházející z genu amyloglukosidázy (AG) z vláknité houby, např. gen glaA z A. niger. Ta může být použita v kombinaci se samotným promotorem genu amyloglukosidázy (také zvaným (gluk)amylázy) , stejně jako v kombinaci s jiným promotory. Hybridní signální sekvence může být také použita při provedení předkládaného vynálezu.

Výhodné heterologní vedoucí sekvence pro sekreci jsou ·· · ·

- 34 sekvence pocházející z houbového genu pro amyloglukosidázu (AG) (glaA - jak verze s 18 tak i 24 aminokyselinami, např. z Aspergillus} , genu α-faktoru (z kvasinek, např. Saccharomyces a Kluyveromyces} nebo gen α-amylázy (Bacillus}.

Vektory mohou být transformovány nebo transfekovány do vhodných hostitelských buněk, jak bylo popsáno výše, pro expresi polypeptidu podle vynálezu. Tento postup může zahrnovat kultivaci hostitelských buněk transformovaných expresním vektorem, který byl popsán výše, za podmínek, které umožňují expresi vektoru kódujícího sekvenci kódující polypeptid.

Další aspekt vynálezu tak poskytuje hostitelské buňky transformované nebo transfekované nebo obecně obsahující polynukleotid nebo vektor podle vynálezu. Výhodně je polynukleotid podle vynálezu nesen vektorem pro replikaci a expresi polynukleotidu. Buňky se vyberou tak, aby byly kompatibilní s uvedeným vektorem a mohou to být například prokaryotické (například bakteriální) , houbové, kvasinkové nebo rostlinné buňky.

Také může být zvolen heterologní hostitel, kde je polypeptid podle vynálezu produkován ve formě, která je v podstatě bez ostatních enzymů degradujících celulózu. Toho lze dosáhnout tak, že se vybere hostitel, který normálně neprodukuje takový enzym, jako například Kluyveromyces lactis.

Vynález zahrnuje způsoby přípravy polypeptidu podle vynálezu využitím rekombinantní exprese DNA sekvence kódující polypeptid. Pro tento účel může být použita DNA sekvence podle vynálezu pro genovou amplifikaci a/nebo výměnu expresních signálů, jako jsou například promotory, signální sekvence pro sekreci, aby byla možná ekonomická produkce polypeptidu ve vhodné homologní nebo heterologní hostitelské buňce. Homologní

- 35 »· *» · hostitelská buňka je hostitelská buňka, která je stejného biologického druhu nebo která je variantou v rámci stejného biologického druhu jako je druh ze kterého DNA sekvence pocházej i.

Vhodné hostitelské buňky jsou výhodně prokaryotické mikroorganizmy jako například baktérie nebo výhodněji eukaryotické organizmy, například houby, jako například kvasinky nebo vláknité houby, nebo rostlinné buňky. Obecně, kvasinkové buňky jsou výhodnější než houbové buňky, protože se s nimi snadněji zachází. Avšak některé proteiny jsou z kvasinek buďto špatně secernovány nebo v některých případech nejsou správně opracovány (např. hyperglykosylace v kvasinkách). V takových případech je třeba volit houbový hostitelský organizmus.

Hostitelská buňka může nadměrně exprimovat polypeptid, přičemž metody genetického inženýrství pro dosažení nadměrné exprese („overexprese) jsou odborníkům dobře známy³. Hostitel tak může obsahovat dvě nebo více kopií sekvence kódující polynukleotid (a vektor tudíž obsahuje dvě nebo více kopií).

Baktérie rodu Bacillus jsou velmi vhodné jako heterologní hostitelé kvůli jejich schopnosti secernovat proteiny do kultivační média. Další baktérie vhodné jako hostitelé jsou baktérie rodů Streptomyces a Pseudomonas. Výhodné kvasinkové hostitelské buňky pro expresi DNA sekvence kódující polypeptid patří k rodům Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, a Schizosaccharomyces.

Výhodnější kvasinkové hostitelské buňky jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří druhy Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (také známá jako Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica a Schizosaccharomyces pombe.

- 36 Nejvýhodnější jsou nicméně např. houbové hostitelské buňky, např. buňky vláknitých hub. Výhodný hostitelské buňky vláknitých hub jsou vybraný ze skupiny, kterou tvoří rody Fusarium, Disporotrichum,

Neurospora, Thermoascus,

Aspergillus, Penicillium,

Trichoderma, Acremonium,

Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia a Talaromyces.

Výhodněji hostitelské buňky vláknitých hub patří k druhu Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, nebo jde o druhy ze skupiny Aspergillus niger²³. Do této skupiny patří, aniž by však výčet byl omezující, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae a Aspergillus ficuum, a dále druhy Trichoderma reesei, Fusarium gramínarum, Penicillium chrysogenum, Acremonium alabamense, Neurospora crassa, Myceliophtora thernaophilurri, Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum a Thielavia terrestris.

Příklady výhodných expresních hostitelů v rozsahu předkládaného vynálezu jsou houby jako například druhy rodu Aspergillus²^'²⁵ a druhy rodu Trichoderma, baktérie jako například druhy rodu Bacillus²⁶'²¹, jako jsou např. Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, druhy rodu Pseudomonas a také kvasinky jako například druhy rodu Kluyveromyces²⁸, např. Kluyveromyces lactis, a druhy rodu Saccharomyces, např. Saccharomyces cerevisiae.

Hostitelské buňky podle vynálezu zahrnují také rostlinné buňky a vynález proto zahrnuje i transgenní organismy, jako například rostliny a jejich části, které obsahují jeden nebo více buněk podle vynálezu. Buňky mohou heterologně exprimovat polypeptid podle vynálezu nebo mohou heterologně obsahovat ♦ · to to to to ·· to « « · a > · • to

- 37 • · · • t * · · » · · • ·« · >«.

• toto ♦ jeden nebo více polynukleotidů podle vynálezu. Transgenní (nebo geneticky modifikovaná) rostlina má tedy vloženou (např. trvale) do svého genomu sekvenci kódující jeden nebo více polypeptidů podle vynálezu. Transformace rostlinných buněk může být prováděna postupy, které jsou odborníkům známy, např. například s použitím Ti nebo Ri plazmidů z Agrobacterium tumefaciens. Plazmid (nebo vektor) obsahuje sekvence nutné pro infekci rostliny, a mohou být použity deriváty Ti a/nebo Ri plazmidů.

Alternativně může být provedena přímá infekce části rostliny, jako například listu, kořenu nebo stonku. Při tomto způsobu infekce se rostlina poraní, například tím, že se nařeže holící čepelkou nebo se nabodá jehlou nebo se ošetří abrazivním přípravkem. Rána se pak infikuje Agrobacteriem. Rostlina nebo její část se pak pěstuje ve vhodném kultivační médiu a ponechá se vyvinout do zralé rostliny. Regenerace transformovaných buněk až do fáze geneticky modifikovaných rostlin může být dosažena pomocí postupů, které jsou odborníkům známy, například selekcí transformovaných výhonků s použitím antibiotika a přenesením výhonků na médium obsahující vhodné živiny, rostlinné hormony apod.¹⁷.

Kultivace hostitelských buněk a rekombinantní produkce

Vynález také zahrnuje buňky, které byly modifikovány, aby exprimovaly xylanázu nebo její variantu. Takové buňky zahrnují přechodné (tj. přechodně transformované), nebo výhodně stabilní (stabilně transformované) vyšší eukaryotické buněčné linie, jako například linie savčích buněk nebo hmyzích buněk, nižší eukaryotické buňky, jako například kvasinky houbové buňky, např. buňky vláknitých hub, nebo prokaryotické buňky jako například bakteriální buňky.

- 38 Proteiny podle vynálezu mohou být přechodně (transientně) exprimovány v buněčné linii nebo na membráně, jako například v bakulovirovém expresním systému. Takové systémy, které jsou přizpůsobeny pro expresi proteinů podle vynálezu jsou také zahrnuty do rozsahu předkládaného vynálezu.

Podle předkládaného vynálezu produkce polypeptid podle vynálezu může být prováděna tak, že se kultivuje mikrobiální expresní hostitel, který byl transformován jedním nebo více polynukleotidy podle předkládaného vynálezu, v obvyklém živném fermentačním médiu.

·* ··«· ···· ····

Rekombinantní hostitelské buňky podle vynálezu se kultivují standardními postupy známými v oboru. Pro každou kombinaci promotoru a hostitelsl^é buňky jsou dostupné kultivační podmínky, které napomáhají expresi DNA sekvenci kódující polypeptid. Po dosažení požadované buněčné hustoty nebo titru polypeptidů se kultivace zastaví a polypeptid se izoluje známými postupy.

Fermentační médium zahrnuje známá kultivační média obsahující zdroj uhlíku (např. glukóza, sladový cukr, melasa atd.), zdroj dusíku (např. síran amonný, dusičnan amonný, chlorid amonný atd.), zdroj organického dusíku (např. kvasinkový extrakt, sladový extrakt, pepton atd.) a zdroje anorganických živin (např. fosfát, hořčík, draslík, zinek, železo atd.). Volitelně obsahuje i induktor (např. celulózu, pektin, sladový cukr, maltodextrin nebo xylogalakturonan).

Výběr vhodného média je založen na volbě expresního hostitelského systému a/nebo je založen na regulačních požadavcích odborníkům obsahovat expresního konstruktu.

Taková známa. Médium může, další složky, které jestliže je média jsou to potřeba, zvýhodňují transformovaný expresní hostitelský systém proti potenciálně kontaminujícím • · • · · · · · • · • · · ·

- 39 • · · ·

mikroorganizmům.

Fermentace může být prováděna po dobu 0,5 až 30 dnů. Může to být dávková, kontinuální nebo doplňovaná dávková kultivace, výhodně při teplotě v rozsahu mezi 0 a 45 1C, a při pH mezi 2 a 10. Výhodné fermentační podmínky jsou teplota v rozsahu mezi 20 a 37 1C a hodnoty pH mezi 3 a 9. Vhodné podmínky jsou obvykle vybrány na základě zvoleného expresního hostitele a proteinu, který má být exprimován.

Po fermentace, jestliže je to nutné, mohou být buňky odstraněny z fermentačního bujónu pomocí centrifugace nebo filtrace. Po zastavení fermentace nebo po odstranění buněk může pak být získán polypeptid podle vynálezu, a jestliže ke to požadováno, dále purifikován a izolován obvyklými postupy.

D. Použití xylanáz a způsoby zpracovací rostlinných materiálů nebo celulózy (např. materiálu obsahujícího xylan) k ošetření Výhodně je

Polypeptidy podle vynálezu, které mají xylanázovou aktivitu, mohou být používány k působení na houbový nebo rostlinný materiál, jako jsou např. rostlinná vláknina a rostlinné extrakty. Například mohou být použity obilnin, zeleniny, plodů nebo jejich extraktů, polypeptid podle vynálezu kombinován s vhodným nosičem (ve formě tuhé látky nebo kapaliny) nebo ředidlem, včetně pufrů, čímž vznikne enzymatický přípravek/enzymatický preparát. Polypeptid může být navázán na nosič nebo s ním smíchán, např. imobilizován na pevný nosič. Takž předkládaný vynález poskytuje v dalším aspektu přípravek obsahující polypeptid podle vynálezu. Ten může být ve formě vhodné transportu a/nebo uskladnění, výhodně aby byl, xylanázová aktivita. Přípravky podle vynálezu mohou být ve formě pasty, kapaliny, emulze, prášku, vloček, granulátu, k balení, zachována

- 40 pelet nebo v jiné extrudované formě.

Přípravek podle vynálezu může dále obsahovat další složky jako například jeden nebo více enzymů, například pektinázy, jako je např. endo-arabinanáza a rhamnogalakturonáza, celuláza, (jiná) xylanáza, galakturonáza, mananáza a/nebo xyloglukanáza. Polypeptid je typicky trvale formulován buďto v kapalné nebo suché (tuhé) formě. Typicky je produkt formulován jako přípravek, který volitelně obsahuje například stabilizační pufr a/nebo konzervační činidlo. Přípravky mohou také obsahovat jiné enzymy schopné štěpit rostlinné látky nebo celulózu, například další celulázy, např. (β-D-)glukanázy. Pro určité aplikace je výhodná imobilizace enzymu na matrici z tuhé látky (na pevném nosiči) nebo inkorporace na částice nebo do částic pevného nosiče. Přípravek může také obsahovat celou řadu dalších enzymů štěpících (degradujících) rostlinný materiál, například celulázy a další pektinázy.

Polypeptidy a přípravky podle vynálezu mohou být proto použity ve způsobech zpracování rostlinného materiálu, kdy je třeba degradovat nebo modifikovat celulózové složky (např. xylan) buněčné stěny rostlinného nebo houbového materiálu. Takže v dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob degradace nebo modifikace rostlinných buněk, kdy způsob zahrnuje kontaktování rostlinných nebo houbových buněk s polypeptidem nebo přípravkem podle vynálezu.

Vynález také poskytuje způsob zpracování rostlinných materiálů, kdy způsob zahrnuje kontaktování rostlinného materiálu s polypeptidem nebo přípravkem podle vynálezu, aby se degradovala nebo modifikovala celulóza v (rostlinném) materiálu. Výhodně je rostlinná drť nebo kaše nebo rostlinný extrakt, jako jsou například džusy.

A zejména degradace výhodně obsahuje štěpení xylanových • · • · · ·

- 41 podjednotek celulózové složka stěny rostlinné buňky. Rostlinný materiál je výhodně kaše nebo extrakt z rostlin nebo poldů, výhodně obilnin, zeleniny nebo ovoce. Předkládaný vynález dále poskytuje zpracovaný rostlinný materiál připravitelný tím, že se kontaktuje rostlinný materiál s polypeptidem nebo přípravkem podle vynálezu.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob pro snížení viskozity rostlinného extraktu, kterýžto způsob zahrnuje kontaktování rostlinného extraktu s polypeptidem nebo přípravkem podle vynálezu v množství účinném pro degradaci celulózy (nebo xylanu) obsaženého v rostlinném extraktu.

Rostlinné materiály a materiály obsahující celulózu zahrnují rostlinnou vlákninu, části rostlin a rostlinné extrakty. V kontextu tohoto vynálezu je rostlinný extrakt jakákoliv látka, která může být získána z rostlinného materiálu extrakcí (mechanickým a/nebo chemickým způsobem), zpracováním nebo jinými separačními technikami. Extraktem ta může být džus, nektar, báze nebo koncentrát vyrobený z rostlinného materiálu. Rostlinný materiál obsahuje nebo pochází ze zeleniny, např., mrkve, celeru, cibule, luštěnin (sója, sojové boby, hrách), nebo ovoce, např., jádrovin nebo peckovin (jablka, hrušky, kdoule atd.), hroznů, rajčat, citrusových plodů (pomeranče, citróny, mandarínky, limety,), melounů, švestek, třešní, černého a červeného rybízu, malin, jahod, brusinek, ananasu a jiného tropického ovoce, stromů a jejich částí (např. pylu, z borovic) nebo obilnin (oves, ječmen, pšenice, kukuřice, rýže). Materiál (který má být hydrolyzován) může také být zemědělský odpad, jako například drť z cukrové řepy, kukuřičných klasů, pšeničné slámy, (namleté) skořápky ořechů, nebo recyklovatelné materiály, jako např. (odpadní) papír.

• · · · • · · ·

- 42 Polypeptidy podle vynálezu tak mohou být použity k působení na rostlinné materiály jako jsou např. rostlinné vlákniny a rostlinné extrakty. Mohou také být použity k ošetření potravin v tuhém nebo kapalném stavu, nebo jedlých přísad do potravin, nebo mohou být použity pro extrakci kávy, olejnin, škrobu, a nebo mohou být použity jako zahušťovadla potravin.

Typicky jsou polypeptidy podle vynálezu používány jako enzymatické přípravky/preparáty jak bylo popsáno výše. Přípravek podle vynálezu se obecně přidává k rostlinné vláknině připravené například mechanickým zpracováním jako například drcením nebo mletím rostlinného materiálu. Inkubace přípravku s rostlinným materiálem se typicky provádí po dobu 10 minut až 5 hodin, jako například 30 minut až 2 hodiny, výhodně přibližně 1 hodinu. Zpracování se provádí výhodně při teplotě 10 až 55 °C, např. 15 až 25 °C, optimálně přibližně při 20 °C, a užije se 10 až 300 g, výhodně 30 až 70 g, optimálně přibližně 50 g enzymu na 1 tunu materiálu, který má být ošetřen. Všechny používané enzymy nebo přípravky mohou být přidávány postupně nebo současně k rostlinné vláknině. V závislosti na enzymatickém preparátu může být rostlinný materiál nejdříve vyluhován/macerován (např. do získání vlákniny) nebo převeden do tekuté formy. Užitím polypeptidu podle vynálezu lze zlepšit parametry zpracování jako například výtěžek extrakce, viskozitu extraktu a/nebo kvalitu extraktu.

Alternativně nebo navíc k výše popsanému polypeptid podle vynálezu může být přidán k surovému džusu získanému lisováním nebo zkapalněním rostlinné vlákniny. Ošetření surového džusu se provádí podobným způsobem jako u rostlinné vlákniny, pokud jde o dávky, teplotu a dobu působení. A také, stejně jako bylo uvedeno výše, mohou být přidány i další enzymy. Typické • · ·

- 43 inkubace podmínky jsou stejné jak byly popsány v předchozím odstavci.

Po té, co byl džus inkubován s polypeptidy podle vynálezu, džus se pak centrifuguje nebo (ultra) filtruje, čímž se získá konečný produkt.

Po ošetření polypeptidem podle vynálezu (konečný) produkt může být dále tepelně ošetřen, např. zahříván při 100 °C po dobu 1 minuty až 1 hodiny za podmínek, které vedou k částečné nebo úplně deaktivaci polypeptidu (polypeptidů) podle vynálezu.

Přípravek obsahující polypeptid podle vynálezu může také být použit pro přípravu ovocných nebo zeleninových pyré.

Polypeptid podle vynálezu může také být použit v pivovarnictví, ve vinařství, lihovarnictví nebo v pekárenství. Může se použít při přípravě alkoholických nápojů jako je například víno a pivo. Například tak může být zlepšena filtrovatelnost nebo čirost (piva nebo mladého vína). Protein může napomáhat při odstranění rozpuštěných organických látek z živného bujónu nebo kultivační média, například tam, kde se lihovarnický odpad organického původu biologicky přeměňuje na mikrobiální biomasu. Xylanáza může zlepšit filtrovatelnost a/nebo snížit viskozitu glukózových sirupů, jako například sirupů připravovaných z obilnin zkapalněním (např. pomocí a-amylázy)

V pekárenství může polypeptid podle vynálezu napomoci ke zlepšení struktury těsta, modifikovat jeho lepivost nebo vláčnost, zlepšit objem bochníku a/nebo zlepšit drobivost, nebo poskytnout lepší texturu a kvalitativní vlastnosti jako například lámavost, drobivost a řezatelnost. Polypeptid může být přidáván v množství 100 až 3,000, například 150 až 2,000, optimálně 200 až 1,600 EXU/kg mouky.

• · · ·

- 44 Polypeptidy podle vynálezu vzhledem k jejich xylanázové aktivitě nacházejí použití v řadě průmyslových oblastí kvůli. Ty zahrnují nejen produkci alkoholu, ale také biomethanaci (bioprodukci methanu), přípravu těsta a pečení, zubní hygienu (například zubní nebo orální přípravky), činění kůží a kožedělnou výrobu, výrobu papíru, výrobu léčiv, čaje, ve výrobě nebo ošetřování tkanin, při zpracování odpadů. Jeden aspekt předkládaného vynálezu poskytuje proto potravina nebo krmivo, které obsahuje polypeptid podle vynálezu, jako například alkoholický nápoj, chléb, těsto nebo čaj. Polypeptid může být formulován do vhodného přípravku pro kterékoliv z výše zmíněných použití. Polypeptid může být formulován do vodného přípravku (např. v horké vodě), výhodně s jedním nebo více fungicidy, pro ošetřování rostlinného materiálu (např. cibulí a hlíz), obzvláště pro ochranu proti parazitickému hmyzu, roztočům a nematodům (hlísticím).

Jelikož polypeptidy podle vynálezu degradují xylan, mohou být přidávány k jídlu nebo potravinám (například pro lidi). Vynález také zahrnuje farmaceutický a veterinární přípravky, které obsahují polypeptid podle vynálezu a farmaceuticky nebo veterinárně přijatelný nosič.

Polypeptidy podle vynálezu může také projevovat protiplísnovou účinnost. Mohou být schopny degradovat buněčné stěny houbových buněk, a tak mohou být používány pro lýzu buněčné stěny houbových buněk, aby byla buňka „otevřena, což může uvolnit intracelulární proteiny. Stejným způsobem mohou být polypeptidy podle vynálezu použity při přípravě kvasinkových a/nebo houbových extraktů.

E. Krmivo pro zvířata

Vynález se dále týká krmiv nebo krmných směsí pro zvířata • · • · · ·

- 45 nebo aditiv do krmiv obsahujících jeden nebo více polypeptidů podle vynálezu. Polypeptid může být přítomen v krmení v koncentraci odlišné množství je 0,6 až 35, od přírodní koncentrace. Výhodné například 1,5 až 15, výhodně 3 až 15 mg na 1 kg krmivá. Výhodně je polypeptid podle vynálezu přítomen v krmivu v dávce 1,000 až 50,000 EXU/kg krmivá, například 2,500 až 25,000 EXU/kg, optimálně 5,000 až 20,000 EXU/kg.

Vynález se také týká způsobu výroby krmných směsí pro zvířata, kdy způsob zahrnuje přidání polypeptidu podle vynálezu k jedné nebo více jedlých látek nebo složek potravy, které obsahují xylan. Polypeptidy může být přidány ke krmným směsím pro zvířata odděleně od vlastního krmivá, individuálně nebo v kombinaci s dalšími krmivovými aditivy. Polypeptid může být integrální součástí jedné z krmných substancí nebo složek krmivá.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být přidávána ke krmivům bohatým na celulózu pro zlepšení rozpadu stěn rostlinných buněk, což vede ke zlepšení využití rostlinných živin zvířetem. Polypeptidy podle vynálezu mohou být přidány ke krmivu nebo siláži, jestliže je výhodné namáčení nebo čerstvé (mokré) krmivo. Výhodně polypeptidy podle vynálezu mohou pokračovat v degradaci celulózy z krmivá in vivo. Polypeptidy podle vynálezu pocházející z hub mají obecně nižší pH optimum a jsou tak schopné uvolňovat důležité živiny i v tak kyselém prostředí jako je žaludek zvířete.

Vynález se také týká potravin nebo krmivá obsahujících jeden nebo více polypeptidů podle vynálezu.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být také použity při výrobě mléčných náhrad (nebo náhražek) ze sójových bobů. Tyto mléčné náhrady mohou být určeny pro spotřebu lidmi nebo do

- 46 krmiv pro zvířata. Typickým problémem během přípravy takových mléčných náhrad je vysoká viskozita suspenze ze sójových bobů, což má za důsledek nežádoucí ředění suspenze na koncentraci sušiny tuhé látky 10 až 15%. Enzymatický preparát obsahující polypeptid podle vynálezu může být přidán k suspenzi, na začátku nebo během zpracování, což umožní zpracování suspenze s vyšší koncentrací (typicky 40 až 50%) sušiny tuhé látky. Enzym může také být použit při výrobě lahůdkových produktů ze sójových bobů.

Přípravek podle vynálezu může dále obsahovat, zejména jestliže je formulován pro použití v krmivu pro zvířat, jeden nebo více ionoforů, oxidačních činidel, surfaktantů, rumen (žaludek přežvýkavců) chránících aminokyselin, enzymatické zesilovače nebo enzymy, které mohou být tvořeny přirozeně v gastrointestinálním traktu zvířat, která mají být krmena.

Když se přidává do krmivá (včetně siláže) pro přežvýkavce (se složeným žaludkem) nebo pro monogastrická (s jednoduchým žaludkem) zvířata (např. drůbež nebo prasata), krmivo obsahuje obilniny jako například ječmen, pšenici, kukuřici, žito nebo oves, nebo obilninové vedlejší produkty jako například pšeničné otruby nebo kukuřičné otruby, nebo jiné rostlinné materiály jako například sojové boby nebo jiné luštěniny. Enzymy pak mohou významně zlepšit degradaci rostlinných buněčných stěn, což vede k lepšímu využití rostlinných živin zvířetem. V důsledku toho pak dosahují lepších přírůstků a/nebo se zlepší koeficient konverze krmivá. Polypeptidy podle vynálezu může být přidány ke krmivu (přímo nebo jako aditivum nebo složka krmivá) nebo se místo toho přidá do krmivá složka (např. celulóza/xylan), která již byla podobena působení enzymu.

Protein může redukovat viskozitu krmivá (obsahujícího • · · · · · • · · ·

xylan): protein může pokračovat v hydrolýze xylanu in vivo. Proteiny podle vynálezu jsou zejména vhodné pro krmivá pro zvířata, neboť mohou být účinné i v silně kyselých podmínkách, jaké jsou například v žaludku zvířat.

Zvláště výhodný způsob pro (exogenní) přidání modifikované xylanázy je přidání polypeptidu podle vynálezu jakožto transgenního rostlinného materiálu a/nebo (např. transgenního) zrna (semena). Polypeptid podle vynálezu je pak syntetizován prostřednictvím heterologní genové exprese, například gen kódující požadovaný enzym může být klonován do rostlinného expresního vektoru pod kontrolou vhodného rostlinného expresního signálu, např. tkáňově-specifického promotoru, jako například promotoru specifického pro semena. Expresní vektor obsahující gen kódující polypeptid je následně transformován do rostlinných buněk a transformované buňky jsou pak selektovány pro regeneraci celých rostlin. Takto získané transgenní rostliny jsou pak pěstovány a sklizeny, a ty části rostlin obsahující heterologní (vzhledem k rostlině) polypeptid, mohou být pak zahrnuty do přípravku, buď jako takové, a nebo po dalším zpracování. Obecné metody (heterologní) exprese enzymů v (transgenních) rostlinách, včetně metod exprese enzymů specifickou pro semena, jsou odborníkům dobře známy³⁰. Heterologní polypeptid může být obsažen v semenu transgenní rostliny nebo může být obsažen v jiné části rostliny jako například v kořenu, stonku, listech, dřevu, kvetu, kůře a/nebo plodech. Rostlina může být buďto jednoděložná nebo dvouděložná. Vhodné rostliny jsou např. obilniny, jako například oves, ječmen, pšenice, kukuřice a rýže.

Výhodně je polynukleotid podle vynálezu trvale vložen do rostlinného genomu.

• · · ·

- 48 Přidání polypeptidů ve formě transgenního rostlinného materiálu, např. v transgenním semenu, může vyžadovat zpracování rostlinného materiálu tak, aby se enzym stal dostupným nebo aby se alespoň zlepšila jeho dostupnost. K takovým technikám zpracování patří různé mechanické (např. mletí a/nebo drcení) techniky nebo termomechanické postupy jako například extruze nebo expanze.

Předkládaný vynález se také týká způsobu podporování růstu a/nebo zlepšení konverze krmivá u monogastrických nebo nepřežvýkavých zvířat, kterýžto způsob zahrnuje krmení zvířete polypeptidem podle vynálezu. Vhodná zvířata zahrnují chovaná monogastrická nebo nepřežvýkavá zvířata jako například prasata (nebo selata), drůbež (jako například kuřata, krůty), telata nebo i vodní živočichy (například ryby).

Testy enzymů degradujících celulózu

Předmětem předkládaného vynálezu je také použití polypeptidů podle vynálezu při testovacích metodách (screeningu) pro identifikaci sloučenin, které mohou působit jako agonisté nebo antagonisté, a které mohou modulovat xylanázu. V obecných termínech takové metody screeningu zahrnují kontaktování polypeptidů podle vynálezu s testovanou sloučeninou a pak měření aktivity, nebo inkubování polypeptid podle vynálezu s testovanou sloučeninou a pak detekci jakékoliv modulace xylanázové aktivity. Činidla, která se váží na polypeptidy podle předkládaného vynálezu, mohou být identifikována vazebnými testy.

Modulátorové aktivita může být určena kontaktováním buněk exprimujících polypeptid podle vynálezu s testovanou látkou a monitorováním účinků zprostředkovaných polypeptidy. Buňky exprimující polypeptid mohou být in vitro a výhodně, test je • · · · • · • · • · • · «4

- 49 prováděn in vitro s použitím buněk exprimujících rekombinantní polypeptid.

Testy a substráty popisované v tomto textu umožňují identifikaci a potvrzení xylanázové aktivity. Tyto testy mohou být použit i pro detekci jiných enzymů degradujících celulózu, například enzymů s xylanázovou aktivitou. Substráty, které mohou být použity pro takové testy, zahrnují tedy i xylan.

Další aspekt vynálezu se týká testu pro identifikaci nebo detekci polypeptidů, který je schopný degradovat celulózu. Aktivita může být xylanáza, nebo to může být pektinlyáza, polygalakturonáza, esteráza, celuláza, xyloglukanáza, galaktonáza, arabinanáza nebo rhamnogalakturonáza. Test zahrnuje kroky:

(a) poskytnutí jakožto substrátu pro testovanou sloučeninu (obvykle polypeptid), vhodný substrát (jak bylo výše popsáno), a (b) kontaktování substrát s testovanou sloučeninou a detekování toho, zda se vytvoří jakýkoliv produkty xylanázové aktivity.

Výše popsané testy mohou být použity k identifikaci modulátorů xylanázové aktivity.

Takové sloučeniny mohou zmírňovat nežádoucí měknutí ovoce, které si pak zachovává lepší chuť a barvu a má proto vyšší přepravní a skladovací dobu. Testy také mohou být použity k identifikaci inhibitorů polypeptidů podle vynálezu, které by mohly inhibovat nežádoucí měknutí ovoce.

Výhodné vlastnosti a charakteristiky jednoho aspektu vynálezu jsou vhodné i pro další aspekty vynálezu mutatis mutandis.

Vynález bude dále podrobněji popsán a vysvětlen pomocí • · «· · • · ·

- 50 následujících příkladů, které mají ilustrativní funkci a nijak neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Obecné postupy

Standardní techniky molekulárního klonování, jako je například izolace DNA, gelová elektroforéza, enzymatické restrikční modifikace nukleových kyselin, Southern analýzy, transformace E. coli, přenosy otiskem kolonií na filtr a hybridizace na filtru apod., byly prováděny s použitím standardních technik¹'². Syntetické oligodeoxynukleotidy byly získány od firmy ISOGEN Bioscience (Maarssen, Nizozemí). Analýzy sekvencováním DNA byly prováděny na DNA sekvenačním zařízení Applied Biosystems 373A, podle instrukcí dodavatele.

Značení a hybridizace DNA byly prováděny podle protokolu pro přímé značení nukleových kyselin a detekčních systémů ECL™ (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Anglie) nebo podle standardních technik radioaktivního značení¹.

Příklad 1

Izolace RNA z T. emersonii a syntéza cDNA

Kmen CBS 393,64 T. emersonii byl fermentován v podmínkách indukujících syntézu xylanu. V několika časových bodech bylo sklízeno mycelium a tkáňové supernatanty filtrací s použitím filtrační membrány Miracloth. Mycelium bylo důkladně promyto demineralizovanou vodou a vymačkáno mezi papírové ručníky, aby « · · ·

- 51 ·♦· · ·* se odstranila nadbytečná voda. Mycelium z vybraných časových bodů (na základě měření celulázy v tkáňových supernatantech) bylo okamžitě zmraženo v kapalném dusíku a bylo namleto na jemný prášek s použitím třecí misky a tloučku. Výsledný prášek byl přenesen do sterilní zkumavky o objemu 50 ml a zvážen: na každý lg až 1,2 g mletého mycelia bylo přidáno 10 ml činidla TRIzol (Gibco/BRL) (maximálně 25 ml na zkumavku). Prášek z mycelia byl bezprostředně solubilizován důkladným mícháním (třepání na vortexu, 1 minuta), následovala inkubace při teplotě místnosti po dobu 5 minut s příležitostným mícháním. Bylo přidáno 0,2 objemu (původního TRIzolu) chloroformu (tak 2 ml na každých 10 ml TRIzolu použitých původně), třepáno na vortexu a ponecháno při teplotě místnosti po dobu 10 minut.

Následně byla směs stočena ve 4 °C, 6 000 g po dobu minut. Horní vodná fáze byla přenesena do čerstvé zkumavky a celková RNA byla precipitována přidáním 0,5 objemu (původního TRIzolu) isopropylalkoholu (tak 5 ml isopropylalkoholu na každých 10 ml TRIzolu použitých původně). Po 10 minutách precipitace při teplotě místnosti byla RNA získána centrifugací po dobu 30 minut v 6 000 g. Při odstranění supernatantu byl RNA pelet promyt jedním objem 70% ethanolu. Po odstranění ethanolu byl RNA pelet usušen na vzduchu. Usušený RNA pelet byl rozpuštěn ve 3 ml pufru GTS (100 mM Tris-Cl, pH 7,5, 4M guanidiumthiokyanát, 0,5% laurylsarkosinát sodný). 10 μΐ RNA roztoku bylo použito pro určení kvality a koncentrace nukleových kyselin.

Byla prováděna Northern analýza³ a izolovaná RNA byla dále purifikována¹'³. Pro izolaci mRNA byl použit modifikovaný použitím toku v důsledku gravitace místo z purifikační soupravy PHARMACIA (kat č.

protokol (s centrifugace)

27-9258-02)³ pro syntézu cDNA byla použita souprava STRATAGENE

- 52 *··· *··♦ • · ο ·»τ * cDNA Synthesis KIT podle instrukcí výrobce, kromě počtu optimalizací pro použití pGBFIN vektorů s hlavními změnami, jak byly popsány dříve³.

Množství syntetizované cDNA bylo odhadnuto precipitací s TCA a následovně analyzováno prostřednictvím elektroforézy na alkalických agarózových gelech³.

Příklad 2

Příprava cDNA knihovny z mRNA T. emersonii

Pool cDNA získaný v příkladu 1 byl opatřen slepými konci, ligován s adaptéry a štěpen restrikčním enzymem³.

Klonování cDNA do expresního vektoru pGBFIN-11³ vyžaduje přítomnost EcoRI místa na 5'-konci a Xhol místa na 3'-konci cDNA. Proto byly použité oligonukleotidy jako očka pro první vlákno a adaptérové sekvence (Pharmacia) voleny tak, aby vyhověly předpokladům pro expresní vektor.

Získané cDNA byly odděleny prostřednictvím frakcionace podle velikostí na SEPHAROSE CL-2B matrici, po které velikost jednotlivých získaných poolů byla analyzována prostřednictvím nedenaturující gelové elektroforézy. Dva pooly cDNA, získané pomocí limitů ve velikosti 0,5 kb a 1,0 kb, v daném pořadí, byly vybrány pro konstrukci cDNA knihovny v pGBFIN-11. Co se týče pGBFIN-11, byl připraven pool kompletně dvojitě štěpených (EcoRI-Xhol) pGBFIN-11 vektorů (ligace pozadí < 1%). Vybrané cDNA pooly byly ligovány do pGBFIN-11 vektoru a transformovány do bakteriálních buněk E. coli XLIO-Gold za vzniku dvou ·· ··*·

- 53 • * « · • · »·♦· ·· *··· • ·« primárních cDNA knihoven. Frekvence transformací těchto dvou poolů byla u obou > 1,0 x 10⁶.

Z frakce obou E. coli cDNA knihoven byly náhodně vybírány kolonie a byla izolována plazmidová DNA. Analýza této plazmidové DNA prokázala, že obě cDNA knihovny měly procento inzerce mezi 90 a 95 %.

Kromě toho byly prováděny otisky kolonií z frakce knihovny a vytvořené filtry byly následně hybridizovány s gpdA genem z T. emersonii, kódujícím gen glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy. Dále byla izolována plazmidová DNA a restrikční analýzou bylo dokázáno, že všechny plazmidy obsahovaly jeden inzert ve správné orientaci. Sekvencování 5'-konců cDNAs v těchto plazmidech obsahujících gpdA T. emersonii prokázalo, že > 85 % bylo kompletní.

Příklad 3

Transformace expresní knihovny do A. niger

DNA byla izolována z E. coli cDNA knihovny tak, jak bylo popsáno dříve. Celková plazmidová DNA byla štěpena Notl po dobu 4 hodin ve 37 °C, aby se odstranily plazmidové sekvence pocházející z E. coli. Po purifikaci byla DNA rozpuštěna ve sterilní demineralizované vodě.

Mnohonásobné A. niger DS2978 transformace byly prováděny³ s použitím 1,5 x 10⁷ až 3,0 x 10⁷ protoplastů a 10 pg plazmidové DNA na transformaci. Transformanty byly vybírány na přítomnost amdS selekčního markéru růstem na acetamid jako jediného zdroje N. Protože jak amdS selekční markér, tak cDNA

- 54 expresní kazeta jsou přítomny na integrujícím fragmentu, růst na acetamidu svědčí pro přítomnost cDNA expresní kazety.

Po přibližně 7 až 10 dnech inkubace ve 30 °C bylo purifikováno 10 000 transformant: transformanty Aspergillus niger byly přeneseny s pomocí robota (automatický sběrač kolonií Flexys™) z transformační destiček na 96-jamkové MTP Master („hlavní) destičky (MP) obsahující 150 μΐ ztuženého selektivního média (SM) na jamku (na 1000 ml: 0,52 g KC1, 1,52 g K₂HPO₄, 0,52 g MgSO₄, 20 g glukózy, 1 g acetamidu, 0,lM MES pufr, 15 g agaru, 1 ml roztoku stopových prvků (obsahující na litr: 2,2 g ZnSO₄/7H₂O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO₄/7H₂O, 0,17 g CoCl₂/6H₂0, 0,16 g CuSO₄/5H₂O, 0,15 g

NaMo0₄/2H₂0, 5,0 g EDTA, pH 6,5), pH 5,5. Transf ormanty byly pěstovány na SM po dobu 5 dnů ve 34 °C. Takto vytvořený soubor

MP byl použit pro	inokulaci destičky	MTP pro růst a následnou detekci
enzymem uloženy	a záložní v -80 °C.	(BP) cDNA knihovny,	které byly
Příklad	4
Analýza	expresní knihovny T.	emersonii
5	dnů staré	pěstované	MP byly použity jako	replikační
templáty a repliky	nanesené	na destičky s čerstvým	selektivním

médiem (SM), obsahující 0,075% AZCL-xylan (obsahující na litr: 0,52 g KC1, 1,52 g K₂HPO₄, 0,52 g MgSO₄, 20 g glukózy, 1 g acetamidu, 0,lM MES pufru, 15 g agaru, 1 ml roztoku stopových prvků (obsahující na litr: 2,2 g ZnSO₄/7H₂O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO₄/7H₂O, 0,17 g CoC1₂/6H₂0, 0,16 g CuSO₄/5H₂O, 0,15 g • · • · · · • · • · · ·

- 55 NaMo0₄/2H20, 5,0 g EDTA, pH 6,5), pH 5,5, 0,75 g AZCL-xylanu (Megazyme, Austrálie).

Jakmile byly inokulovány, byly destičky inkubovány ve 34 °C po dobu 48 hodin a pak po dobu 6 hodin v 65 °C. Destičky byly vyhodnocovány před a po inkubaci ve vysoké teplotě. Pozitivní kolonie projevující xylanázovou aktivitu vykazovaly modré difúzní zabarvení („auru).

Pozitivní xylanázové klony z tohoto prvního screeningu byly opět inokulovány na čerstvé SM médium a pěstovány po dobu 5 dnů ve 34 °C. Takto získaná templátová destička pak byla replikována na selektivním médiu a na selektivním médiu obsahujícím 0,075% (hmotnost/objem) AZCL-xylanu (Megazyme). Destička s AZCL-xylanem byla ošetřena tak, jak bylo popsáno dříve.

SM destičky byly inkubovány po dobu 48 hodin ve 34 °C a následovně byly převrstveny top-agarem obsahujícím xylan z ovsa (5 g agaróza, 0,5 g xylanu z ovsa (Sigma ref: X0627)) připravený v 1 litru 50mM fosfátového pufru (pH 7). Jakmile horní agar ztuhnul, byly destičky umístěny v 65 °C po dobu 4 hodin. Pro vizualizaci aktivity byly destičky obarveny s roztokem konžské červeně (10 g konžské červeně v 1 litru fosfátového pufru, pH 7,0) po dobu 15 minut. Barvicí roztok byl odstraněn a destičky byly promyty IM NaCl. Tento krok promytí byl dvakrát opakován. Pozitivní klony byly identifikovány tím, že vytvářely vybledlé okolí („auru) na pozadí konžské červeně. Nakonec bylo identifikováno 9 pozitivních xylanázových klonů.

Transformanty Aspergillus produkující xylanázu, jak byly identifikovány xylanázovým destičkovým testem, byly kultivovány ve fermentačních třepacích lahvích³. Vzorky média

- 56 byly odebírány po 5 dnech fermentace a analyzovány na xylanázovou aktivitu dle následujícího popisu.

Supernatant (předem naředěný, když bylo nutné) byl naředěn 5 krát v 0,25M pufru acetátu sodném, pH 4,5. 20 μΐ naředěného supernatantu bylo přeneseno na mikrotitrační destičky a 50 μΐ substrátu (4% (hmotnost/objem) Remazol Brilliant Blue RBBxylan (rozpuštěno v 70 °C v demineralizované vodě) bylo přidáno a mícháno důkladně pipetováním nahoru a dolů. Reakční směs byla inkubována po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Reakce byla zastavena přidáním 200 μΐ 96% ethanolu a inkubací po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Poté, co reakce byla ukončeny, byly mikrotitrační destičky stočeny po dobu 10 minut ve 2500 rpm v centrifuze Beckman GPK při teplotě místnosti. 100 μΐ supernatantu bylo přeneseno na nové mikrotitrační destičky a absorbance modré barvy byla měřena spektrofotometricky v 620 nm ve čtecím zařízení Anthosreader (Proton and Wilton).

Specifická aktivita byla vypočtena z kalibrační křivky s použitím xylanázového standardu rozpuštěného v 0,25M pufru acetátu sodném, pH 4,5.

Příklad 5

Genetická analýza pozitivních transformant

Pozitivní (opětně potvrzené) transformanty identifikované v příkladu 4 byly pěstovány v tekutém médiu, mycelium bylo sklízeno a celková (chromozomální) DNA byla izolována s použitím izolačního systému Puregene (Biozym Β. V.) pro izolaci DNA z vláknitých hub. Izolace a purifikace DNA byly prováděny podle protokolu dodavatele, ale mírně modifikovány; kroky 3 a 4 precipitace proteinu byly opakovány.

Chromozomální DNA byla použita jako templát v PCR reakci s použitím primerů 12207 (sekvence id. č. 4) a 11937 (sekvence id. č. 3) pro amplifikaci inzertu (inzertů) přítomného v expresní kazetě integrované do chromozomální DNA.

Přímé PCR na transformantách byly prováděny podle upravené verze známého protokolu⁴ kromě toho, že získané mycelium bylo následně ošetřeno Glukanex™ (Novo Nordisk) v koncentracích 5 mg/ml místo NOVOzymu.

TM pufr (Life

PCR reakce obsahovaly eLONGase Technologies, Breda, Nizozemí), směs dNTP (200 μΜ každého), 1 μΐ enzymové směsi eLONGase™, 1-5 μΐ templátu a 10-30 pmol každého oligonukleotidu, v konečném objemu 50 μΐ. Optimální množství oligonukleotidu bylo určeno experimentálně pro každou zakoupenou dávku. V průměru bylo použito 10 až 30 pmol. Reakce byly prováděny s následujícími podmínkami cyklů: lx (2 minuty) 94 °C, 35x (1 minuta 94 °C, 1 minuta 55 °C, 6 minut 72 °C) , lx (7 minut 72 °C) . Vzorky byly naneseny na agarózové gely pro analýzy PCR produktů.

Takto získaný PCR produkt byl subklonován do klonovacího vektoru E. coli pcr2.1 (Invitrogen, podle instrukcí dodavatele), což mělo za následek plazmid pGBXEA-1. Kmen

E. coli obsahující plazmid pGBXEA-1 byl uložen v Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Nizozemí, pod přístupovým číslem CBS 102183.

Subklonovaný PCR produkt byl sekvencován. Výsledná nukleotidová sekvence kódujícího úseku je ukázána v sekv. id. č. 1 a odvozená aminokyselinová sekvence proteinu v sekv. id. č. 2. Tento protein byl nazván XEA.

- 58 Příklad 6

Charakterizace xylanázy Talaromyces emersonii

Definice endoxylanázové jednotky (EXU) pro tento popis

Jednotka xylanázové aktivity (EXU) je definována jako množství enzymu (endol endo-1,4-p-xylanázy z Asp. niger³¹) , které uvolňuje 4,53 pmol redukujících cukrů (měřených jako ekvivalenty xylózy) za 1 minutu v testovacích podmínkách. Testovací podmínky zahrnují: 5 mg/ml arabinoxylanu z pšeničné mouky (Megazyme, Austrálie, 2/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) ve lOOmM pufru citrátu sodném (pH 3,5), teplota 40 °C, v reakčním čase 60 minut. Reakce byly zastaveny přidáním 1M NaOH. Detekce byla prováděna kolorimetricky ve 420 nm po inkubaci vzorků s Fe (III) hexakyanidem po dobu 15 minut ve vařící se vodě. Hexakyanoželezité činidlo bylo vytvořeno rozpouštěním 1,17 g KFe(CN) a 19,5 g bezvodého uhličitanu sodného v 1 litru vody.

Viskozimetrický test

Kromě výše uvedeného absolutního stanovení xylanázové aktivity, byl použit relativní způsob, který sledoval pokles viskozity roztoku pšeničného arabinoxylanu (Megazyme, Austrálie, 22/11 Ponderosa Parade, Warriewood NSW 2101) po přidání určitého množství enzymu. Pšeničný arabinoxylan byl rozpuštěn v 0,425M pufru citrátu sodném (pH 3,5) na koncentraci 8,3 mg/ml. Substrát byl inkubován v 55 °C po dobu 10 minut. Následně bylo přidáno malé množství enzymu (v rozsahu 0,01-0,05 jednotek/ml) a reakce byla ponechána pokračovat. Po 60 minutách reakční doby byla určována viskozita vzorku relativně k referenčnímu vzorku, který byl • · · 4 • ·

- 59 inkubován se standardem Aspergillus niger endo-xylanázy³¹ o známé EXU aktivitě. Absolutní aktivity v EXU pro standard byly určeny metodou redukujících cukrů s použitím Fe(III)hexakyanidu, jak bylo popsáno výše. Viskozita byla určována ručně s použitím Haakeova přístroje (s padající kuličkou) na měření viskozity.

Analýza aktivity redukující cukry

Enzymová aktivita podle XPU definice byla měřena detekcí redukujících cukrů s použitím hydrazidu 4-hydroxybenzoové kyseliny (PAHBAH). Jedna XPU aktivity je definována jako množství enzymu vyžadovaného pro uvolnění 1 pmol redukujících cukrů vytvořeného za minutu ze pšeničného arabinoxylanu v pH 5,0 a v 60 °C během 15 minut, s použitím kalibrační křivky D(+)xylózy. To je známý test³² s modifikací na PAHBAH činidlo tak, jak následuje: 0,05M citrát sodný, O,1M Na₂SO3, 0,02M CaCl₂, 0,5M NaOH a O,1M hydrazid p-hydroxybenzoové kyseliny (PAHBAH). Konečné pH bylo 12. Činidlo obsahující PAHBAH v alkalickém roztoku, uloženo při teplotě místnosti, bylo použito během jednoho dne. Absorbance byla měřena ve 420 nm. Slepý vzorek byla připravena přidáním 100 μΐ 0,1Μ pufru acetátu sodného místo roztoku enzymu. Xylanázová aktivita byla testována smícháním 100 μΐ (naředěného) roztoku enzymu se 400 μΐ 0,35 % pšeničného arabinoxylanu (Megazyme) v 0,lM pufru acetátu sodném (pH 5,0). Eppendorfovy zkumavky se substrátem byly preinkubovány po dobu 5 minut v 60 °C. Reakce začala přidáním roztoku enzymu. Po 15 minutách reakci ukončilo přidání 1,0 ml činidla PAHBAH. Eppendorfovy zkumavky byly zahřívány po dobu 5 minut ve 100 °C, a pak byly ochlazeny na ledu. Vzorky byly stočeny vhodnou rychlostí, aby se všechny pevné látky usadily na dno, např. 1 minuta plnou rychlostí

- 60 v centrifuze Beckman Microfuge E. Absorbance byla měřena ve 420 nm. Slepý vzorek byl připraven přidáním 100 μΐ pufru místo roztoku enzymu. Rozsah měření je 0,01-0,1 XPU/ml.

Purifikace xylanázy

10,45 g sulfátu amonného bylo přidáno ke 43 ml média bez buněk a naneseno na kolonu Ethyl Sepharose™ s použitím kolony pro Akta Explorer 100 (Pharmacia Biotech) 15 ETH Source (kód 17-0146-01, Pharmacia Biotech) (D=l,6 cm, 1=4,8 cm, V=9,6 ml. Kolona byla ekvilibrována lOOmM acetátem sodným a 40% saturovaným sulfátem amonným, pH 5,0. Eluce používala lineární gradient vedoucí k lOOmM acetátu sodnému (pH 5,0) ve 20 objemech kolony. Velikost frakce: 5 ml. Rychlost průtoku: 10 ml/minuta. Monitorované vlnové délky: 280, 254, 214 nm. Frakce byly testovány na xylanázu a analyzovány HPLC vylučovací chromatografií (SEC).

Nejčistější xylanázové frakce byly dány na kolonu Sephacryl S200 podle následujících podmínek. Přístroj Akta

Explorer 100 (Pharmacia Biotech). Kolona: HiPrep

Sephacryl S200 HR (Pharmacia Biotech)

16/60 eluce byly prováděny acetátem sodným Velikost frakce:

Ekvilibrace a (pH 5,0). Rychlost 4 ml. Monitorované lOOmM průtoku: 1 ml/minuta.

vlnové délky: 280, 254, 214 nm. Čistota elučních frakcí byla analyzována HPLC-SEC, SDS-PAGE a nativní PAGE.

Koncentrace proteinu

Koncentrace proteinu byla určována měřením OD280. Xylanáza (zralá) z T. emersonii obsahuje 11 zbytků Trp (polohy 72, 108, 115, 121, 148, 300, 302, 308, 322, 377 a 385) a 23 zbytků Tyr (polohy 36, 51, 109, 141, 146, 161, 167, 169, 174, 192, 193, ·· ···· · · ···· ·· ···· • · · · · * · · • · ····· ·· ·

- 61 196, 200, 218, 281, 306, 316, 326, 332, 348, 395, 403 a 404).

Vypočtený molární extinkční koeficient byl 8 9530 M^_1. cm^-1.

Molekulová hmotnost byla 41,637 g/mol. OD280 po dobu 1 mg/ml

XEA byla 2,15.

Specifická aktivita xylanázy z T. emersonii (XEA)

Specifická aktivita byla určována s použitím PAHBAH metody redukce cukrů ve 40 °C a 60 °C. Specifická aktivita pro XEA byla 150 XPU a 500 XPU v těchto dvou teplotách, v daném pořadí. Koncentrace proteinu byla určována analýzou OD280.

Teplota (°C)	Specifická aktivita (XPU/mg)
40	150
60	500

N-koncová sekvence

N-koncová aminokyselinová sekvence purifikované zralé XEA byla zjištěna jako: Ala-Gly-Leu-Asn-Thr-Ala (ve zralé sekvenci tento první Ala zbytek je Ala²³ v sekv. id. č. 2) .

Izoelektrický bod (IEP)

Vybavení: systém Phast (Pharmacia Biotech), přeformované gely IEF 3-9 Phastgel (Pharmacia Biotech). Gely byly použity a obarveny (Coomassie) 'podle standardních protokolů systému Phast poskytovaných výrobcem. IEP určený izoelektrickou fokusací s použitím PhastGel IEF3-9 byl přibližně 3,3.

• · · · ·

Molekulová hmotnost

Elektroforézy SDS-PAGE byly prováděny s použitím systému Phast (Pharmacia Biotech), přeformovaných gelů Phastgel (Pharmacia Biotech), a také pásků s SDS-pufrem/pásů s nativním pufrem (Pharmacia Biotech).

Ošetření vzorku: jeden objem pufru (500mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% SDS, 0,1 % bromfenolová modř) byl smíchán se 4 objemy vzorku a udržován ve varu po dobu 3 minut. Gely byly prováděny a obarveny (Coomassie nebo stříbrem) podle standardních metod systému Phast. Molekulová hmotnost na SDS-PAGE s použitím standardů molekulové hmotnosti (Pharmacia) byla přibližně 63 kD. Molekulová hmotnost vypočtená na základě složení aminokyseliny je 41 637 D.

(HP-SEC byla 05103, Toso

Kromě toho byla molekulová hmotnost určována gelovou chromatografii s použitím standardů molekulové hmotnosti pro gelovou filtraci (BIORAD, kat. č. 151-1901). Molekulová hmotnost určená vysokoúčinnou SEC byla 42 kD.

prováděna s použitím kolony TSK G3000SW (kat. č.

Haas). Vzorky byly eluovány v 0,lM fosfátu sodném (pH 7) rychlostí 1 ml/minuta při teplotě místnosti. Detekce byla prováděna ve 280 nm) . Vypadá to, že vysoká molekulová hmotnost, jak pozorována na SDS-PAGE, je nadhodnocena. To je pravděpodobně způsobeno glykosylací xylanázy.

Deglykosylace μΐ purifikovaného enzymu (ca. 5 mg/ml) bylo smícháno s 20 μΐ 0,5% SDS a 25 μΐ 1% merkaptoethanolu. Směs byla udržována ve varu po dobu 4 minut. Po ochlazení bylo přidáno 20 μΐ N-glykosidázy F (500U/ml a 20 μΐ 3% Triton X-100 v 1M pufru fosfátu sodného (pH 7,0). Směs pak byla inkubována přes • · · * · · · ·

- 63 noc ve 37 °C a deglykosylace byla analyzována SDS-PAGE. Aminokyselinová sekvence svědčí pro 2 glykosylační místa (Asn⁵⁶ a Asn¹²³, viz SEKVENCE ID. Č. 2) .

SDS-PAGE ukazuje, že N-glykosidázou F ošetřená xylanáza migruje dále a molekulová hmotnost je nižší než u neošetřené nebo předem ošetřené (udržované ve varu s SDS a β-merkaptoethanolem) xylanázy. Takže překvapivě vysoká molekulová hmotnost pozorovaná na SDS-PAGE je pravděpodobně způsobena glykosylaci.

Profil pH a teploty

Médium bez buněk bylo analyzováno na xylanázovou aktivitu při různých pH a teplotách. Xylanázová aktivita byla analyzována metodou redukujících cukrů s použitím PAHBAH v pH 4 při různých teplotách (viz tabulka IA) nebo v 60 °C v různých pH (tabulka 1B) . Tabulka IA ukazuje, že teplotní optimum XEA je asi 80 °C. Tabulka 1B ukazuje,že pH optimum XEA je mezi pH 4 a pH 5 (existují dva sloupce čísel, protože experimenty byly prováděny dvakrát).

Tabulka IA: Závislost xylanázy na teplotě

Teplota (°C)	Aktivita (μΜ xylózy/ 15minut)	Rel. aktivita (%)
30	20-30	10
40	40-50	19
50	90-100	40
60	120-130	52
70	195-205	83
80	235-245	100
90	65-75	29

- 64 Tabulka IB: Závislost na pH

pH	Aktivita (μΜ xylózy/15 minut)	Aktivita (μΜ xylózy/15 minut)
3,0	118,1	123,4
3,5	141,8	127,8
4,0	145,2	148,3
4,5	140,8	149,1
5, 0	117,9	124,8
5,5	91,7	99,1
6, 0	57,3	60,1

Termostabilita

Diferenční skenovací kalorimetrická (DSC) analýza teploty rozvinutí

Teplota rozvinutí („unfolding) XEA byla určována s použitím DSC. Použité podmínky měření byly s pufrem acetátu sodného (pH 5), 2-4 mg/ml a rychlost zahřívání 2,5 °C/minuta. Teplota rozvinutí (Td) XEA byla zjištěna 80,1 °C.

Měření T50

T50 je teplota, ve které zbývá 50 % reziduální aktivity po 20 minutách inkubace a je tak mírou termostability. Inkubace T50 byly prováděny tak, jak je dále popsáno. Vzorek xylanázy byl naředěn tak, že konečná koncentrace xylanázy byla v rozsahu měření pro test PAHBAH (XPU jednotky). Pak byla naředěna 0, IM pufrem acetátem sodným (pH 5,0) obsahujícím 1 mg/ml BSA, aby se zabránilo denaturaci a oí-specif ické vazbě

- 65 na povrch zkumavky. Pufr byl předehřát na 60, 70, 80, 85 a °C v termomixérech po dobu 5 minut a pak byla přidána xylanáza. Vzorky byly zahřívány po dobu 20 minut a ochlazeny na ledu. Aktivita byla měřena s použitím testu PAHBAH.

V tabulce 2 je ukázáno procento reziduální aktivity vzhledem k neinkubované kontrole po 20 minutách inkubace v dané teplotě. Z této tabulky může být odvozena T50: byla 82 °C.

Tabulka 2

Termostabilita XEA xylanázy

Teplota (°C)	Reziduální aktivita (%)
40	100
50	104
60	103
70	99
75	90
80	85
85	8
90	1

Kromě toho hodnoty T50 byly měřeny v různých pH a v přítomnosti EDTA. Výsledky jsou prezentovány v tabulce 3.

- 66 φφφφ • · φ ·

Tabulka 3

Stanovení vlivu pH a kovových iontů na stabilitu XEA. (¹ pH 7 a 8: příliš málo dat v oblasti nízkých teplot)

pH	T50 (°C)
3	73
3,5	77
4	80
4,5	80
5	81
5 (+EDTA)	81
6	75
71	< 72
81	< 72

XEA je nejstabilnější v oblasti pH od pH 4 do pH 5. Pod pH

3,5 a nad pH 5,5 začíná termostabilita klesat, ale je stále významně lepší než u většiny v současnosti známých houbových xylanáz. Přítomnost EDTA neovlivňuje T50. To znamená, že stabilita XEA není závislá na pozitivních kovových iontech, které jsou v komplexu s EDTA.

Příklad 7

Použití xylanázy Talaromyces (XEA) v krmivu

Pokus byl prováděn s použitím samců brojlerů (Cobb). Ve věku 1 až 5 dnů byli drženi v ohrádkách s podlahou a dostávali počáteční („startér) komerční stravu pro brojlery. Ve věku 5

- 67 ·· 9 9 9 9 dnů byla zvířata náhodně rozdělena do 54 klecí na základě jejich individuální hmotnosti. 15 brojlerů bylo ubytováno v jedné kleci od 5 až 19 dnů věku. V den 19 byl počet zvířat v klecích redukován na 12. Jednomu ošetření bylo přiděleno šest klecí. Protože klec je experimentální jednotka, znamená to, že bylo šest opakování na každé ošetření.

Klece byly zbudovány v uměle zahřívané, osvětlené a ventilované budově pro chov brojlerů, s použitím třístupňového systému klecí. Každá klec měla podlahovou plochu 0,98 m² a měla drátěnou podlahu. Místnost byla osvětlena 24 hodin/den, ale intenzita světla během pokusu postupně klesala. Také teplota klesala postupně: od 28 °C během prvního týdne na 23 °C během posledního týdne. Vlhkost během pokusu byla udržována na přibližně 60 %. Zvířata byla očkována podle normálního očkovacího programu proti infekční bronchitidě a nemoci New Castle.

v tomto pokusu bylo zahrnuto devět druhů ošetření. K dietě založené na pšenici (viz tabulka 4) nebyl přidán žádný enzym (kontrolní) nebo množství rovnající se přibližně 2 500, 5 000, 10 000 nebo 25 000 EXU/kg krmení buď endoxylanázy Talaromyces (XEA) nebo endoxylanázy Aspergillus niger (Endol, endo-l,4-pendoxylanáza³¹ komerčně dostupná od firmy DSM N. V., Agri Ingredients, Delft, Nizozemí) jako kontroly. Enzymy byly přidány do krmení ve formě granulovaného produktu, který byl přimíchán do směsi před vmícháním do krmení. Krmení bylo nabídnuto ad libitum zvířatům ve formě pelet. Během přípravy pelet teplota pelet nepřekročila přibližně 70 °C. Voda byla také volně dostupná.

Přírůstky tělesné hmotnosti (BWG) a koeficient konverze krmivá („feed conversion ratio, FCR) byly určovány pro období 5 až 19 dnů věku a 5 až 33 dnů věku.

- 68 ·· ···· ··»·

Tabulka 4

Složení krmivá a obsah hlavních živin

Složka	Obsah(%)
Pšenice	50,0
Žito	10,0
Sojová mouka	20,0
Plnotučná sója (pražená)	1,5
Maniok	1,69
Masová a kostní moučka	5,5
Rybí moučka	2,0
Směsný živočišný tuk	6,0
Směs minerálů a vitamínů*	1,0
Vápenec	0,85
Fosfát vápenatý	0. 75
Sůl	0,3
L-lysin.HCI	0,16
DL-methionin	0,22
L-threonin	0,03
MEbroiler (MJ/kg)	12,0
Surový protein (%)	21, 4
Surový tuk (%)	8,5
Stravitelný lysin (%)	1,06
Stravitelný methionin + cystein (%)	0,78

* Krmivo obsahovalo hladiny vitamínů a stopových prvků, jak je běžné v Nizozemí. Ke krmení nebylo přidáno žádné antibiotikové aditivum podporující růstu ani přípravek proti coccidióze.

Výsledky tohoto pokusu jsou ukázány v tabulce 5, která ukazuje průměrné BWG a FCR brojlerů ve dvou obdobích. Přidání • · • · · ·

- 69 enzymu je uvedeno v jednotkách aktivity (EXU) . Jak se BWG zvyšuje, tak FCR klesá, protože FCR je množství krmivá (g) potřebné pro růst.

Tabulka 5

	BWG (g/pták)	FCR (g/g)
	5-19 dnů	5-33 dnů	5-19 dnů	5-33 dnů
Kontroly	647	1665	1,486	1,749
Talaromyces (XEA, podle vynálezu)
+ 2 500 EXU/kg	668	1696	1,447	1,666
+ 5 000 EXU/kg	683	1757	1,419	1, 647
+ 10 000 EXU/kg	662	1736	1,444	1,673
+ 25 000 EXU/kg	676	1731	1,429	1,656
Aspergillus niger Endol (pro srovnání)
+ 2 500 EXU/kg	682	1742	1,440	1,659
+ 5 000 EXU/kg	682	1730	1,458	1,704
+ 10 000 EXU/kg	672	1686	1,417	1,662
+ 25 000 EXU/kg	696	1743	1,466	1, 685

Jak růst, tak FCR se významně (P < 0,05) zlepšily u krmení obsahujícího enzymy, po 14 dnech experimentálního období i po celkovém experimentálním období. Mezi různými dávkami bylo pozorováno několik rozdílů, ale enzym XEA byl stejně dobrý (jestliže ne lepší než) jako komerčně dostupný enzym.

- 70 ···· · » ·· ··· ·· ··

Příklad 8

Účinek endoxylanázy Talaromyces emersonii (XEA) při pečení

Příprava formového chleba standardním pečicím postupem byla prováděna smícháním 3 500 g pšeničné mouky (směs 80 %

Kolibri a 20 % Ibis pšeničné mouky (Meneba, Holandsko) v přibližně 21 °C), 77 g komprimovaných (Konings) kvasinek, g soli, 25 ppm askorbové kyseliny, 10 ppm houbové a-amylázy Fermizyme™P₂oo_ř (DSM Ν. V., Bakery Ingredients, Delft, Nizozemí) a různého množství enzymu endoxylanázy XEA a 2 030 ml vody (8-15 °C) ve spirálovém mixéru (Hobart) po dobu 2 minut (v rychlosti 1) a po dobu přibližně 6 minut (v rychlosti 2) příkonem 125 Wh (Watthodin) . Teplota těsta byla 28 °C. Vhodnost těsta pro strojové zpracování těsta byla analyzována ručně kvalifikovaným pekařem.

Přímo po míchání bylo těsto rozděleno na 6 kusů, každý po 87 5 g, zakulaceno a ponecháno kynout po dobu 35 minut ve skříňce pro kynutí ve 34 °C a 85% RH (relativní vlhkost) . Na konci tohoto období bylo těsto vytvarováno a vloženo do forem a ponecháno naposledy kynout 75 minut ve skříňce pro kynutí v 38 °C a 87% RH. Poté bylo plně vykynuté těsto pečeno v elektrické troubě ve 210 °C po dobu 30 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti byly určeny objemy bochníků chleba metodou nahrazení řepkovým semenem. Po 16 až 24 hodinách uskladnění v uzavřených polyethylenových sáčcích při teplotě místnosti byla vyhodnocena kvalita střídky kvalifikovaným pekařem. Výsledky jsou ukázány v tabulce 6.

- 71 Tabulka 6

Dávka XEA (EXU/kg mouky)	Obj em bochníku	Manipulace s těstem	Pečicí výkon (škála 0-10)	Kvalita střídky (škála 0-10)
(ml)	(%)
0	4123	100	snadná, nelepkavé	6	6
176	4420	107	snadněj ší, nelepkavé	7	7
527	4756	115	snadněj ší, nelepkavé	7,5	7
1581	4794	116	snadná, málo lepkavé	7,5	7,5

Kvalita těsta byla velmi dobrá. Pouze při nej vyšší dávce endoxylanázy XEA byla během zacházení s těstem zaznamenána malá lepivost. Nicméně tato malá lepivost neovlivňovala strojové zpracování těsta. Všechna těsta obsahující endoxylanázu XEA byla velmi ohebná a snadno ovladatelná.

z těchto pečicích výsledků bylo uzavřeno, že endoxylanáza XEA je velmi účinná pro zlepšování kvality chleba, jak co se týče objemu bochníku, tak co se týče kvality střídky. Navzdory velkému objemu bochníků byla struktura střídky ještě velmi pravidelná a jemná.

• · · · • · · ·

- 72 Příklad 9 a srovnávací příklad 10

Srovnání pečicího výkonu enzymu Talaromyces emersonii (XEA) s endoxylanázou z Asp. niger

Pečicí výkon XEA byl srovnáván s houbovou endoxylanázou z Aspergillus niger nyní používanou v holandské produkci formového chleba. Tato endoxylanáza A. niger byla dodávána v čisté komerčně dostupné forma, t j . Fermizyme™HSP₆ooo · Fermizyme™HSP je dobrý enzym pro aplikaci při přípravě těsta, ale může vnést lepivost těsta a neposkytuje vždy dostatečné zvýšení objemu bochníku.

Přesný postup z příkladu 7 byl opakován kromě toho, že byla použita odlišná množství buď endoxylanázy XEA nebo • TM

Fermizyme HSPgooo·

Výsledky jsou ukázány v tabulce 7 (na následující straně).

Z výsledků je jasné, že endoxylanáza XEA nevnesla do těsta lepivost a zlepšila objem bochníku do větší míry, než bylo dosaženo přidáním Fermizyme™HSP. Kromě toho bylo zapotřebí méně jednotek endoxylanázy na kg mouky pro dosažení určité hladiny objemu bochníku, když byla použita XEA místo Fermizyme™HSP. Kvalita, co se týče lámavosti a drobivosti, byla podobná v totožných objemech. Struktura střídky dosažená přidáním XEA byl přinejmenším tak dobrá jako dosažená pomocí Fermizyme™HSP.

Celkově endoxylanáza XEA řeší některé z problémů při přípravě těsta a zhotovení chleba s použitím Fermizyme™HSP. Do těsta nebyla vnesena žádná lepivost, získané objemy bochníku byly větší a struktura střídky, navzdory větším objemům, byla ještě velmi pravidelná a jemná.

- 73 Tabulka 7

Příklad č.	Dávka XEA (EXU/kg mouky)	Objem bochníku (ml) (%)	Manipulace s těstem	Lámavost a drobivost (škála 010)	Kvalita střídky (škála 0-10)
9: endoxylanáza XEA	0	4170	100	Dobrá, nelepkavé	6	6
264	4430	106	Dobrá, nelepkavé	6, 5	7,5
528	4647	111	Dobrá, nelepkavé	7	7,5
1056	4761	114	Pružné, nelepkavé	7,5	8
1584	4880	117	Pružné, trochu chabé, nelepkavé	5 *	7,5
10: Fermizyme™ HSPgooo	0	4170	100	Dobrá, nelepkavé	6	6
264	4304	103	Pružné, nelepkavé	6, 5	6
528	4355	104	Pružné, trochu lepkavé	6, 5	7
1056	4539	109	Pružné, lepkavé, trochu chabé	7	7,5
1584	4698	113	Pružné, lepkavé, trochu chabé	7,5	8

^# objem bochníku byl příliš velký, takže vzniklý chléb měl tvar houby.

• · « «

- 74 Příklad 11

Zkoušky stability pelet

543 g kukuřičného škrobu bylo umístěno do hnětače

Erweka™ Z. Pak bylo ke škrobu přidáno 1 069 g ultrafiltrační formy fermentu obsahující xylanázu podle vynálezu (dávka XEA 502-8m, která měla 43 553 EXU/g a 6,7 % suché hmoty) během míchání za zisku vlhké směsi, která měla kolem 15 000 EXU/g (když usušena na 94 % suché hmoty). Poté, co byla přidána kapalina, míchání pokračovalo dalších 10 minut.

Ve vakuové sušičce (40 °C) byla směs sušena po dobu 12 hodin na 94,5 % suché hmoty. Ta pak byla mleta v mlýnku Erweka™ Freewitt přes 1 mm síto. To byl příklad 11A.

Stejný recept byl opakován s použitím Lyxasan dávka

OP 0036 dostupnou

Nizozemí) (obsahující endo-1,4-p-endoxylanázu³¹ komerčně od firmy DSM N. V., Agri Ingredients, Delft, K 5 885 g škrobu bylo přidáno 1 984 g UF (ultrafiltrát) s 42 550 EXU/g a 3,7 % suché hmoty. Tato směs byla usušena na 94 % suché hmoty a mleta jako v příkladu 11A (to je komparativní příklad 11B) .

Třetí vzorek je komerční potažený produkt nazvaný Biofeed Wheat CT, který je komerčně dostupný od firmy Novo Nordisk, Dánsko. Obsahuje G-typ xylanázy z Thermomyces lanuginosis a má tukový obal (komparativní příklad 11C).

Všechny tři vzorky byly testovány v peletovacím pokusu ve třech různých teplotách. Ke zvířecímu krmení (složení je ukázáno v tabulce 8 níže) byla přidána enzymová směs ve dvou různých koncentracích, 0,24% (11A) a 0,1% (11B, 11C). Po smíchání bylo krmení zahříváno v páře v kondicionéru na 65 °C, 75 °C nebo 85 °C a následně peletováno přes 65 mm silnou • · * · · · · · · ·· · • · · · · ···· ···· · » · · ··· · 4 ··

- 75 lisovací desku s otvory 5 mm v průměru. Okamžitě bylo ochlazeno. Pak byla měřena reziduální aktivita v peletách a výsledky testů stability jsou ukázány v tabulce 9.

Tabulka 8

Složení krmivá

Suroviny	Obsah (%)
Kukuřice	20,00
Pšenice	30,00
Sojové boby (tepelně ošetřené)	10,00
Sojové boby (mouka) (46,7 cp)	22,50
Čirok	5,07
Rybí moučka (70% cp)	1,50
Péřová moučka (hydrolyzovaná)	1,00
Sojový olej	1,30
Živočišný tuk	4,50
Vitamínová/minerální směs (Kukuřice)	1,00
Vápenec	1,30
Fosfát vápenatý	1,20
Sůl	0,32
L-lysin	0,12
DL-methionin	0,19

Jak lze vidět podle výsledků, stabilita při vysoké teplotě (85 °C) XEA protein podle vynálezu je mnohem lepší než stabilita v současnosti dostupného komerčního produktu.

• ·

- 76 • · ·» · « I

Tabulka 9

Peletovací stabilita enzymů

Reziduální aktivita (%)	Příklad 11A	Komparativní příklad 11B	Komparativní příklad 11C
65 °C	84	64	86
75 °C	82	16	83
85 °C	66	4	56

Přiklad 12

Aktivita na aryl-p-D-xylosidech

Dva substráty 5-brom-4-chlor-3-indoxyl-3-D-xylopyranosid (CAS Reg. č. 207606-55-1, také nazývaný X-b-D-xyl) a

4-umbelliferyl-p-D-xylopyranosid (CAS Reg. č. 6734-33-4, také nazývaný 4-MU-b-D-xyl) byly použity pro screening xylosidázové aktivity. Byly přidány přímo do média. Kmeny tvořící knihovnu byly uspořádány ve formátu 96-jamkové destičky. Tímto způsobem byla hlavní (master) destička snadno replikována na detekční média. Knihovna byla pěstována na selektivním médiu (0,52 g/1 KC1, 1,52 g/1 K₂HPO₄, 0,52 g/1 MgSO₄, 2% glukóza, lOmM acetamid, 1/1000 stopových prvků (2,2 g ZnSO₄/7H₂O, 1,1 g H3BO3, 0,5 g FeSO₄/7H₂O, 0,17 g CoCl₂/6H₂0, 0,16 g CuSO₄/5H₂O, 0,15 g NaMo0₄/2H₂0, 5,0 g EDTA, pH upraveno na 6,5 s KOH a sterilizováno filtrací 0,45 pm) , pH upraveno s KOH (10N na 6) obsahujícím buď X-b-D-xyl nebo 4-MU-b-D-xyl (v koncentraci 200 mg/1 a 150 mg/1 v daném pořadí). X-b-D-xyl byl dříve rozpuštěn v minimálním objemu dimethylformamidu (DMF). Destičky byly inkubovány ve 33 °C po dobu 48 hodin, a pak byly inkubovány po • · · ·

- 77 dobu 6 hodin v 65 °C. Destičky byly hodnoceny před a po 6 hodinách inkubace v 65 °C. X-xyl destičky byly analyzovány přímo na základě přítomnosti (nebo nepřítomnosti) tyrkysové modrého zabarvení (aury), které bylo zjišťováno. Detekce xylosidázové aktivity na 4-MU-xyl destičkách byla kontrolována umístěním destičky ve vlnové délce 310 nm UV světla. Pozitivní klony se jevily jako obklopené aurou modré fluorescence.

- 78 ···· · » ··

Citované publikace

Všechny uvedené publikace jsou formou odkazu zahrnuty v předkládané přihlášce.

1. Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York

2. Innis et al. (1990)PCR protocols, a guide to methods and applicationsAcademic Press, San Diego

3. WO-A-99/32617

4. van Zeijl, C. et al. (1998) J. of Biotechnol. 59: 221-224

5. Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395

6. Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300

7. Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215: 403-10

8. Henikoff and Henikoff (1992) Proč. Nati. Acad Sci. USA 89:10915-10919)

9. Karlin and Altschul (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787

10. Cunningham and Wells, Science, 244,1081-1085,1989

11. de Vos et al. (Science, 255,306-312,1992)

12. Smith et al. (J. Mol. Biol., 224,899-904,1992)

13. Wlodaver et al. (FEBS Lett., 309,59-64,1992)

14. Ford et al, Protein Expression and Purification, 2,95107,1991

15. Goosen et al,Transformation and Gene Manipulation in Filamentous Fungi: an overview. In: Handbook of Applied Mycology, Vol. 4 (1992)

16. Romanos et al, Yeast 8: 423-488 (1992)

- 79 ΕΡ-Α-0,449,375

WO-A-98/04726

WO-A-98/30707

Alenkso and Clutterbuck, Fungal Genet. Biol 21: 373-397 (1997)

EP-A-0,635,574

WO-A-98/46772

Raper and Fennell, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965

EP-A-0,184,433

EP-A-0,284,603

EP-A-0,134,048

EP-A-0,253,455

EP-A-0,096,340

EP-A-0,301,670

EP-A-0,449,375

EP-A-0,463,706 (Gist-brocades Β. V.)

Lever, M., Powell, J. C. , Killip, M., Smáli, C. W. (1973) J. Lab. Clin. Med. 82: 649-655

US-A-4,683,202

Saiki et al, Science 239: 487-491 (1988)

Davies et al,Aspergillus : 50 years on, Progress in

Industrial Microbiology, 29: 527-560 (1994)

Tuohy et al, Biochem J. 290: 515-523 (1993)

Tuohy et al, Bioresource Technology 50: 37-42 (1995)

- 80 Seznam sekvencí <160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1227 <212> DNA <213> Talaromyces emersonii <220>

<221> CDS <222> (1) . . (1227) <400> 1

atg Met 1

gtt Val

cgc Arg

ctc Leu

agt Ser 5

cca gtc ttg

ctc gcc tcc atc gca ggc

tet Ser 15

ggc Gly

48

Pro

Val

Leu

Leu

Ala 10

Ser

Ile Ala

Gly

ctg

cct

cta

gcc

cáa

gca

gca

ggc

ctc

aac

aca

gcc

gcc

aaa

gcc

atc

96

Leu

Pro

Leu

Ala

Gin

Ala

Ala

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Ala

Lys

Ala

Ile

20

25

30

ggc

ctg

aaa

tac

ttt

ggc

aca

gcg

acc

gac

aac

ccc

gag

ctg

agc

gac

144

Gly

Leu

Lys

Tyr

Phe

Gly

Thr

Ala

Thr

Asp

Asn

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

35

40

45

acc

gcg

tac

gag

acg

cag

ctc

aac

aac

acg

cag

gat

ttc

ggg

cag

ttg

192

Thr

Ala

Tyr

Glu

Thr

Gin

Leu

Asn

Asn

Thr

Gin

Asp

Phe

Gly

Gin

Leu

50

55

60

acg

ccg

gcg

aat

tcg

atg

aag

tgg

gat

gcc

acc

gag

ccc

gag

cag

aat

240

Thr

Pro

Ala

Asn

Ser

Met

Lys

Trp

Asp

Ala

Thr

Glu

Pro

Glu

Gin

Asn

65

70

75

80

gtc

ttc

acg

ttt

agc

gcc

ggc

gat

cag

att

gcc

aac

ttg

gcc

aag

gcg

288

Val

Phe

Thr

Phe

Ser

Ala

Gly

Asp

Gin

Ile

Ala

Asn

Leu

Ala

Lys

Ala

85

90

95

aat

ggc

cag

atg

ttg

cgg

tgt

cat

aat

ctt

gtt

tgg

tac

aat

cag

ttg

336

Asn

Gly

Gin

Met

Leu

Arg

Cys

His

Asn

Leu

Val

Trp

Tyr

Asn

Gin

Leu

100

105

110

ccg

tcg

tgg

gtc

acc

agt

ggc

tcc

tgg

acc.

aac

gag

acg

ctg

ctt

get

384

Pro

Ser

Trp

Val

Thr

Ser

Gly

Ser

Trp

Thr

Asn

Glu

Thr

Leu

Leu

Ala

115

120

125

gcc

atg

aag

aat

cac

atc

acc

aac

gtc

gtt

acc

cat

tac

aag

ggc

cag

432

Ala

Met

Lys

Asn

His

Ile

Thr

Asn

Val

Val

Thr

His

Tyr

Lys

Gly

Gin

130

135

140

tgc

tac

gca

tgg

gat

gtc

gtt

aat

gag

gcc

ctc

aac

gac

gac

ggc

acc

480

Cys

Tyr

Ala

Trp

Asp

Val

Val

Asn

Glu

Ala

Leu

Asn

Asp

Asp

Gly

Thr

145

150

155

160

tac cgc agc aac gtc ttc tac cag tac atc ggt

gag gcg Glu Ala

tac Tyr

atc ccc

528

Tyr Arg Ser Asn Val 165

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Ile 170

Gly

Ile 175

Pro

atc

gcc

ttc

gcg

acg

gcc

gcc

gcc

gcc

gac

ccc

aac

gcc

aag

ctg

tac

576

Ile

Ala

Phe

Ala

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

Asp

Pro

Asn

Ala

Lys

Leu

Tyr

18 0

185

190

tac

aac

gac

tac

aac

atc

gag

tac

ccg

ggg

gcc

aag

gcg

acg

gcg

gcg

624

Tyr

Asn

Asp

Tyr

Asn

Ile

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ala

Lys

Ala

Thr

Ala

Ala

195

200

205

cag aac Gin Asn 210

ctg Leu

gtc aag ctg gtg

cag Gin

tcg tac ggc gcg cgc atc

gac Asp

ggc Gly

672

Val

Lys

Leu

Val 215

Ser Tyr Gly

Ala 220

Arg

Ile

gtc

ggc

ctg

cag

tcg

cac

ttc

atc

gtg

ggc

gag

acg

ccc

agc

acc

agc

720

Val

Gly

Leu

Gin

Ser

His

Phe

Ile

Val

Gly

Glu

Thr

Pro

Ser

Thr

Ser

225

230

235

240

tcc

cag

cag

cag

aac

atg

gcc

gcc

ttc

acg

gcg

ctg

ggc

gtc

gag

gtc

768

Ser·

Gin

Gin

Gin

Asn

Met

Ala

Ala

Phe

Thr

Ala

Leu

Gly

Val

Glu

Val

245

250

255

gcc

atc

acc

gag

ctc

gac

atc

cgc

atg

cag

ctg

ccc

gag

acg

gaa

gcc

816

Ala

Ile

Thr

Glu

Leu

Asp

Ile

Arg

Met

Gin

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Ala

260

265

270

ctg

ctg

acg

cag

cag

gcc

acc

gac

tac

cag

agc

acc

gtg

cag

gcc

tgc

864

Leu

Leu

Thr

Gin

Gin

Ala

Thr.

Asp

Tyr

Gin

Ser

Thr

Val

Gin

Ala

Cys

275

'280

285

gcc

aac

acc

aag

ggc

tgc

gtc

ggc

atc

acc

gtc

tgg

gac

tgg

acc

gac

912

Ala

Asn

Thr

Lys

Gly

Cys

Val

Gly

Ile

Thr

Val

Trp

Asp

Trp

Thr

Asp

290

295

300

aag

tac

tcg

tgg

gtg

ccc

agc

acc

ttc

tcg

ggc

tat

ggc

gac

gcc

tgt

960

Lys

Tyr

Ser

Trp

Val

Pro

Ser

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ala

Cys

305

310

315

320

ccc

tgg

gac

gcc

aac

tac

cag

aag

aag

ccc

gcg

tac

gaa

ggc

atc

ctc

1008

Pro

Trp

Asp

Ala

Asn

Tyr

Gin

Lys

Lys

Pro

Ala

Tyr

Glu

Gly

Ile

Leu

325

330

335

act

ggg

ctt

gga

cag

acg

gtc

acc

agc

acc

acc

tac

atc

atc

tcg

ccg

1056

Thr

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Val

Thr

Ser

Thr

Thr

Tyr

Ile

Ile

Ser

Pro

340

345

350

acg

acg

tet

gtc

gga

acg

ggc

acg

acg

acc

tcg

agc

ggc

gga

agc

ggc

1104

Thr

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

355

360

365

ggc

acg

act

ggc

gtg

gcc

cag

cat

tgg

gag

cag

tgc

ggt

gga

ctg

ggc

1152

Gly

Thr

Thr

Gly

Val

Ala

Gin

His

Trp

Glu

Gin

Cys

Gly

Gly

Leu

Gly

370

375

380

tgg

act

ggt

ccg

acg

gtt

tgc

gca

agt

ggc

tac

act

tgc

act

gtc

atc

1200

Trp

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Cys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Cys

Thr

Val

Ile

385

390

395

4 00

aat

gag

tat

tac

tcg

cag

tgt

ctg

taa

1227

Asn

Glu

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Cys

Leu

405 • · · ·

- 82 <210> 2 <211> 408 <212> PRT

213>

Talaromyces

emersonii

<400> 2

Met

Val

Arg

Leu

Ser

Pro

Val

Leu

Leu

Ala

Ser

Ile

Ala

Gly

Ser

Gly

1

5

10

15

Leu

Pro

Leu

Ala

Gin

Ala

Ala·

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Ala

Lys

Ala

Ile

20

25

30

Gly

Leu

Lys

Tyr

Phe

Gly

Thr

Ala

Thr

Asp

Asn

Pro

Glu

Leu

Ser

Asp

35

40

45

Thr

Ala

Tyr

Glu

Thr

Gin

Leu

Asn

Asn

Thr

Gin

Asp

Phe

Gly

Gin

Leu

50

55

60

Thr

Pro

Ala

Asn

Ser

Met

Lys

Trp

Asp

Ala

Thr

Glu

Pro

Glu

Gin

Asn

65

70

75

80

Val

Phe

Thr

Phe'

Ser

Ala

Gly

Asp

Gin

Ile

Ala

Asn

Leu

Ala

Lys

Ala

85

90

95

Asn

Gly

Gin

Met

Leu

Arg

Cys

His

Asn

Leu

Val

Trp

Tyr

Asn

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Ser

Trp

Val

Thr

Ser

Gly

Ser

Trp

Thr

Asn

Glu

Thr

Leu

Leu

Ala

115

120

125

Ala

Met

.Lys

Asn

His

Ile

Thr

Asn

Val

Val

Thr

His

Tyr

Lys

Gly

Gin

130

135

140

Cys

Tyr

Ala

Trp

Asp

Val

Val

Asn

Glu

Ala

Leu

Asn

Asp

Asp

Gly

Thr

145

150

155

160

Tyr

Arg

Ser

Asn

Val

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Ile

Gly

Glu

Ala

Tyr

Ile

Pro

165

170

175

Ile

Ala

Phe

Ala

Thr

Ala

Ala

Ala

Ala

Asp

Pro

Asn

Ala

Lys

Leu

Tyr

180

185

190

Tyr

Asn

Asp

Tyr

Asn

Ile

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ala

Lys

Ala

Thr

Ala

Ala

195

200

205

Gin

Asn

Leu

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ser

Tyr

Gly

Ala

Arg

Ile

Asp

Gly

210

.215

220

Val

Gly

Leu

Gin

Ser

His

Phe

Ile

Val

Gly

Glu

Thr

Pro

Ser

Thr

Ser

225

230

235

240

Ser

Gin

Gin

Gin

Asn

Met

Ala

Ala

Phe

Thr

Ala

Leu

Gly

Val

Glu

Val

245

250

255

Ala

Ile

Thr

Glu

Leu

Asp

Ile

Arg

Met

Gin

Leu

Pro

Glu

Thr

Glu

Ala

260

265

270

Leu

Leu

Thr

Gin

Gin

Ala

Thr

Asp

Tyr

Gin

Ser

Thr

Val

Gin

Ala

Cys

275

280

285

Ala

Asn

Thr

Lys

Gly

Cys

Val

Gly

Ile

Thr

Val

Trp

Asp

Trp

Thr

Asp

290

295

300

Lys

Tyr

Ser

Trp

Val

Pro

Ser

Thr

Phe

Ser

Gly

Tyr

Gly

Asp

Ala

Cys

305

310

315

320

• · · ·

Pro

Trp Asp

Ala Asn 325

Tyr

Gin

Lys

Lys

Pro Ala Tyr Glu Gly Ile

Leu

330

335

Thr

Gly

Leu

Gly

Gin

Thr

Val

Thr

Ser

Thr

Thr

Tyr

Ile

Ile

Ser

Pro

340

345

350

Thr

Thr

Ser

Val

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Thr

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Gly

355

360

365

Gly

Thr

Thr

Gly

Val

Ala

Gin

His

Trp

Glu

Gin

Cys

Gly

Gly

Leu

Gly

370

375

380

Trp

Thr

Gly

Pro

Thr

Val

Cys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Cys

Thr

Val

Ile

385

390

395

400

Asn

Glu

Tyr

Tyr

Ser

Gin

Cys

Leu

405 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer #1 <400> 3 tatagcgaaa tggattgatt gtacgctc <210> 4 <211> 26 <212> DNA

213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 4 atccccagca tcattacacc tcagtg

Claims (27)

PATENTOVÉ NÁROKY
1. (1) kódující sekvence nukleotidů 69 až 1224 v SEKVENCI ID. Č. 1, (2) sekvence, která selektivně hybridizuje s komplementem sekvence definované v (1), nebo (3) sekvenci, která je v důsledku degenerace genetického kódu degenerovaná vzhledem k sekvenci definované v (1) nebo (2), nebo (b) sekvenci komplementární k polynukleotidu definovanému v (a).

   1. Xylanázový polypeptid obsahující:

   (I) aminokyselinovou sekvenci aminokyselin 23 až 408 ze sekvence uvedené v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2, nebo (II) variantu (I), která je schopná štěpit xylan, nebo (III) fragment z (I) nebo (III), který je schopen štěpit xylan.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kde varianta (II) má alespoň 70 nebo 80% identitu s aminokyselinovou sekvencí aminokyselin 23 až 408 ze SEKVENCE ID. Č. 2 a/nebo fragment podle (III) je dlouhý alespoň 150 aminokyselin.
3. 3. Polypeptid podle nároku 1 nebo 2, který štěpí (l-»4) vazby nebo přilehlé xylopyranosylové jednotky v β-D-xylanu.
4. 4 4 4 4 4 4 4 · »4» 4 4 4 4 « • · 4 4 4 «4

   - 87

   4 444 * * 44 4· 4 4 • 4 · - · 1

   4. Polypeptid, který má arabinoxylanázovou a xylosidázovou aktivitu.
5. 5. Polypeptid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, který je připravitelný z (a) houby, nebo (b) organizmu rodu Talaromyces, volitelně z druhu Talaromyces emersonii.
6. 6.

   Polynukleotid obsahující:

   (a)nukleovou v seznamu sekvenci kyselinu, sekvencí kóduj ící která má sekvenci uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 1 nebo polypeptid podle kteréhokoliv z předchozích nároků, • · • · « · * · « · · ·

   (b)sekvenci, která je komplementární k sekvenci definované (a) nebo s ní hybridizuje, (c)fragment velikosti alespoň 100 nukleotidů ze sekvence podle (a) nebo (b), (d)sekvence mají alespoň 70% identitu se sekvencí

   definovanou (a), (b) nebo (c), nebo (e)sekvenci, která je v důsledku degenerace genetického kódu degenerovaná vzhledem ke kterékoliv ze sekvencí definovaných v (a) až (d).
7. 7. Sekvence podle nároku 6, kde hybridizace podle (b) je za stringentních podmínek, fragment podle (c) má délku alespoň 200 bází a/nebo identita podle (d) je alespoň 80%.
8. 8. Polynukleotid podle nároku 7, který obsahuje:

   (a) sekvenci, která kóduje polypeptid mající xylanázovou aktivitu, což je:
9. 9 · • 00«

   0 · • · « ·

   0 » · ·

   - 86

   9. Polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8, který je sekvencí DNA.
10. 10. Vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9.
11. 11. Vektor podle nároku 10, který je expresním vektorem, kde je DNA sekvence podle nároku 9 operativně spojena s regulační sekvencí.
12. 12. Hostitelská buňka, která obsahuje jakožto heterologní sekvenci polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9.
13. 13. Hostitelská buňku, která exprimuje jakožto heterologní protein polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
14. 14. Hostitelská buňka transformovaná DNA sekvencí podle nároku 8 nebo vektorem podle nároku 10.
15. 15. Způsob přípravy polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14 v podmínkách, které umožňují expresi polypeptidu.
16. 16. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
17. 17. Přípravek podle nároku 16, vyznačující se tím, že dále obsahuje polypeptid mající celulázovou, endoarabinanázovou, rhamnogalakturonázovou nebo polygalakturonázovou aktivitu.
18. 18. Způsob ošetření rostlinného materiálu nebo materiálu obsahujícího xylan vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy je materiál v kontaktu s proteinem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo přípravkem podle nároku 16 nebo nároku 17.
19. 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že ošetření zahrnuje kroky degradace, hydrolýzy nebo modifikovat xylanu v ošetřovaném materiálu nebo degradaci nebo modifikaci stěny rostlinných buněk.
20. 20. Způsob podle nároku 18 nebo 19 vyznačující se tím, že ošetření zahrnuje krok štěpení xylopyranosylových nebo β-D-xylanových podjednotek a/nebo materiálu, který zahrnuje rostliny, rostlinnou vlákninu, rostlinný extrakt nebo potravinu nebo její jedlou přísadu.
21. 21. Zpracovaný materiál vyznačující se tím, že byl získán kontaktem rostlinného materiálu nebo materiálu obsahujícího xylan s polypeptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo přípravkem podle nároku 16 nebo 17, nebo byl tento materiál získán způsobem podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20.
22. 22. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22 v y z n a č u jící s e tím, že snižuj e viskozitu materiálu, degraduj e nebo hydrolyzuje xylan obsažený v materiálu nebo zlepší j asnost nebo filtrovatelnost materiálu.
23. 23. Použití polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 nebo přípravku podle nároku 16 nebo 17 při ošetření rostlinného materiálu ke zlepšení filtrovatelnosti a/nebo snížení viskozity kapaliny obsahujících xylan, zlepšení filtrovatelnosti nebo čirosti alkoholického nápoje, např. piva nebo vína, nebo ovocných či zeleninových džusů, k hydrolýze zemědělských odpadů, pro recyklování materiálů, např. obsahujících papír, v papírenské výrobě, pro zahušťování potravin a/nebo extrahování požadovaných surovin, např. kávy, *· »··* ·» ··«· • · · » · » φ · * · · · · • · · » · ·

    99 999 9 • · · 9 9 9

    99 9 9

    - 88 rostlinných olejů, škrobu), zpracovávání rostlinné vlákniny, džusu nebo extraktu, ke zlepšení objemu bochníku, kvality chleba nebo ke snížení lepivosti těsta.
24. 24. Krmivo, potravinářská surovina nebo potravina vyznačující se tím, že obsahují polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
25. 25. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 při výrobě piva nebo vína, destilaci alkoholu, recyklaci, biomethanaci, zubní hygieně, činění kůží, výrobě papíru, opracování ovocných nebo zeleninových džusů nebo extraktů, výrobě a ošetřování textilií, pekárenství a výrobě chleba, ošetřování cibulí rostlin, přípravě jídel, potravin nebo krmiv.
26. 26. Potravinářská surovina nebo potravina podle nároku 24 vyznačující se tím, že je to alkoholický nápoj, chléb, těsto nebo čaj.
27. 27. Transgenní organismus, jako je například rostlina nebo její část, který obsahuje buňku podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14.