JPH10295372A - β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 - Google Patents
β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途Info
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- JPH10295372A JPH10295372A JP9122809A JP12280997A JPH10295372A JP H10295372 A JPH10295372 A JP H10295372A JP 9122809 A JP9122809 A JP 9122809A JP 12280997 A JP12280997 A JP 12280997A JP H10295372 A JPH10295372 A JP H10295372A
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- xylan
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 β−１，３−キシランに対する分解活性を有
する新規なβ−１，３−キシラナーゼを得る。 【解決手段】 β−１，３−キシランを分解し、主にキ
シロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖
類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオ
ース（５糖類）ならびにキシロヘキサオース（６糖類）
まで低分子化する反応を触媒するβ−１，３−キシラナ
ーゼ。このβ−１，３−キシラナーゼはアルカリゲネス
属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）から産生され
る。
する新規なβ−１，３−キシラナーゼを得る。 【解決手段】 β−１，３−キシランを分解し、主にキ
シロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖
類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオ
ース（５糖類）ならびにキシロヘキサオース（６糖類）
まで低分子化する反応を触媒するβ−１，３−キシラナ
ーゼ。このβ−１，３−キシラナーゼはアルカリゲネス
属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）から産生され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β−１，３−キシ
ラナーゼ活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新
規微生物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いた
オリゴ糖、プロトプラストの製造方法に関するものであ
る。
ラナーゼ活性を有する新規酵素、この酵素を産生する新
規微生物、この酵素の製造方法、及びこの酵素を用いた
オリゴ糖、プロトプラストの製造方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】キシランには、イネ科植物やトウモロコ
シ穂軸のヘミセルロースの主要部分を占めるβ−１，４
−キシランと、紅藻や緑藻の細胞壁に含まれるβ−１，
３−キシランとがある。β−１，４−キシランについて
は、β−１，４−キシラナーゼ（エンド−１，４−β−
キシラナーゼ）が、パルプの漂白に用いる塩素の消費量
を減らすパルプ漂白用酵素として実用化が始まってい
る。
シ穂軸のヘミセルロースの主要部分を占めるβ−１，４
−キシランと、紅藻や緑藻の細胞壁に含まれるβ−１，
３−キシランとがある。β−１，４−キシランについて
は、β−１，４−キシラナーゼ（エンド−１，４−β−
キシラナーゼ）が、パルプの漂白に用いる塩素の消費量
を減らすパルプ漂白用酵素として実用化が始まってい
る。
【０００３】また、食品分野では広葉樹キシランからの
β−１，４−キシロオリゴ糖の生産が行われている。こ
のβ−１，４−キシロオリゴ糖は、甘さは砂糖の３０％
ほどで、不凍効果、ビフィズス菌増殖活性、保水性向
上、食品の腐敗防止等の機能がある食品素材として利用
されている。
β−１，４−キシロオリゴ糖の生産が行われている。こ
のβ−１，４−キシロオリゴ糖は、甘さは砂糖の３０％
ほどで、不凍効果、ビフィズス菌増殖活性、保水性向
上、食品の腐敗防止等の機能がある食品素材として利用
されている。
【０００４】一方、ある種の紅藻や緑藻の細胞壁に含ま
れる海藻特有の多糖類であるβ−１，３−キシランやそ
の分解物であるβ−１，３−キシロオリゴ糖について
は、セルロースやデンプンなどの多糖や前述のβ−１，
４−キシラン及びその分解物であるβ−１，４−キシロ
オリゴ糖と比べて、非常に研究が立ち後れており、今だ
市販されておらず、海藻細胞壁の構造研究ならびにβ−
１，３−キシラナーゼの酵素学的研究に大きな支障をき
たしている。
れる海藻特有の多糖類であるβ−１，３−キシランやそ
の分解物であるβ−１，３−キシロオリゴ糖について
は、セルロースやデンプンなどの多糖や前述のβ−１，
４−キシラン及びその分解物であるβ−１，４−キシロ
オリゴ糖と比べて、非常に研究が立ち後れており、今だ
市販されておらず、海藻細胞壁の構造研究ならびにβ−
１，３−キシラナーゼの酵素学的研究に大きな支障をき
たしている。
【０００５】図１はβ−１，３−キシランの化学構造を
示す説明図である。図に示す通り、β−１，３−キシラ
ンは、不溶性の中性多糖類であり、D-キシロースがβ−
１，３−結合( 即ち、３−０−β−D-xylopyranosyl-D-
xylose) で、直線状に繋がって形成されている。
示す説明図である。図に示す通り、β−１，３−キシラ
ンは、不溶性の中性多糖類であり、D-キシロースがβ−
１，３−結合( 即ち、３−０−β−D-xylopyranosyl-D-
xylose) で、直線状に繋がって形成されている。
【０００６】近年、海洋生物資源としての海藻類の有効
利用の観点から、また、新規素材物質としてのβ−１，
３−キシロオリゴ糖の製造方法の観点から、強力な分解
力を有するβ−１，３−キシラン分解酵素やβ−１，３
−キシラナーゼ産生能を有する新規な微生物の探索が行
われているが、本酵素についての知見は非常に乏しいの
が現状である。
利用の観点から、また、新規素材物質としてのβ−１，
３−キシロオリゴ糖の製造方法の観点から、強力な分解
力を有するβ−１，３−キシラン分解酵素やβ−１，３
−キシラナーゼ産生能を有する新規な微生物の探索が行
われているが、本酵素についての知見は非常に乏しいの
が現状である。
【０００７】以上のように、海藻特有の多糖類であるβ
−１，３−キシランやその分解物であるβ−１，３−キ
シロオリゴ糖の有効な調製法の確立が望まれている。
−１，３−キシランやその分解物であるβ−１，３−キ
シロオリゴ糖の有効な調製法の確立が望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋
性細菌が海藻多糖の成分であるβ−１，３−キシランを
効率よく分解し、β−１，３−キシランから大量のキシ
ロオリゴ糖を調製する上で優れた酵素を生産する細菌で
あることを見出し、更に、本細菌からβ−１，３−キシ
ラナーゼを単離精製することにより、本発明を完成する
にいたった。
情に鑑み、鋭意研究の結果、海底泥中より分離した海洋
性細菌が海藻多糖の成分であるβ−１，３−キシランを
効率よく分解し、β−１，３−キシランから大量のキシ
ロオリゴ糖を調製する上で優れた酵素を生産する細菌で
あることを見出し、更に、本細菌からβ−１，３−キシ
ラナーゼを単離精製することにより、本発明を完成する
にいたった。
【０００９】即ち、本発明は、β−１，３−キシランに
対する分解活性を有する新規なβ−１，３−キシラナー
ゼを得ることを目的とする。また、このβ−１，３−キ
シラナーゼを産生する新規な微生物を得ることを別の目
的とする。更に、このβ−１，３−キシラナーゼを産生
する微生物を用いたβ−１，３−キシラナーゼの製造方
法を得ることを別の目的とする。また、このβ−１，３
−キシラナーゼを用いる用途として、キシロオリゴ糖の
製造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方法を得
ることを目的とする。
対する分解活性を有する新規なβ−１，３−キシラナー
ゼを得ることを目的とする。また、このβ−１，３−キ
シラナーゼを産生する新規な微生物を得ることを別の目
的とする。更に、このβ−１，３−キシラナーゼを産生
する微生物を用いたβ−１，３−キシラナーゼの製造方
法を得ることを別の目的とする。また、このβ−１，３
−キシラナーゼを用いる用途として、キシロオリゴ糖の
製造方法及び海藻細胞のプロトプラストの製造方法を得
ることを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された
発明に係るβ−１，３−キシラナーゼは、β−１，３−
キシランを分解し、主にキシロビオース（２糖類）、キ
シロトリオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖
類）、キシロペンタオース（５糖類）ならびにキシロヘ
キサオース（６糖類）まで低分子化する反応を触媒する
酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述する。
発明に係るβ−１，３−キシラナーゼは、β−１，３−
キシランを分解し、主にキシロビオース（２糖類）、キ
シロトリオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖
類）、キシロペンタオース（５糖類）ならびにキシロヘ
キサオース（６糖類）まで低分子化する反応を触媒する
酵素である。具体的な理化学的性質は後に詳述する。
【００１１】また、本請求項２に記載された発明に係る
β−１，３−キシラナーゼ産生微生物は、請求項１に記
載されたβ−１，３−キシラナーゼを産生する新規な海
洋性細菌としてアルカリゲネス属菌株XY-234（Alcalige
nes sp. XY-234）を開示するものである。
β−１，３−キシラナーゼ産生微生物は、請求項１に記
載されたβ−１，３−キシラナーゼを産生する新規な海
洋性細菌としてアルカリゲネス属菌株XY-234（Alcalige
nes sp. XY-234）を開示するものである。
【００１２】更に、本請求項３に記載された発明に係る
β−１，３−キシラナーゼの製造方法は、請求項１に記
載されたβ−１，３−キシラナーゼを製造する方法であ
って、β−１，３−キシラナーゼを産生する微生物をβ
−１，３−キシランを炭素源として培養し、その培養上
清液から分離して精製するものである。
β−１，３−キシラナーゼの製造方法は、請求項１に記
載されたβ−１，３−キシラナーゼを製造する方法であ
って、β−１，３−キシラナーゼを産生する微生物をβ
−１，３−キシランを炭素源として培養し、その培養上
清液から分離して精製するものである。
【００１３】また、本請求項４に記載された発明に係る
キシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１に記載されたβ
−１，３−キシラナーゼで、β−１，３−キシランを基
質として作用させるものである。
キシロオリゴ糖の製造方法は、請求項１に記載されたβ
−１，３−キシラナーゼで、β−１，３−キシランを基
質として作用させるものである。
【００１４】更に、本請求項５に記載された発明に係る
海藻細胞のプロトプラストの製造方法では、請求項１に
記載されたβ−１，３−キシラナーゼを海藻に作用させ
るものである。
海藻細胞のプロトプラストの製造方法では、請求項１に
記載されたβ−１，３−キシラナーゼを海藻に作用させ
るものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明におけるβ−１，３−キシ
ラナーゼは、主にキシロビオース（２糖類）、キシロト
リオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖類）、
キシロペンタオース（５糖類）ならびにキシロヘキサオ
ース（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒する特徴
を有する酵素であって、下記理化学的性質を有する。
ラナーゼは、主にキシロビオース（２糖類）、キシロト
リオース（３糖類）、キシロテトラオース（４糖類）、
キシロペンタオース（５糖類）ならびにキシロヘキサオ
ース（６糖類）にまで低分子化する反応を触媒する特徴
を有する酵素であって、下記理化学的性質を有する。
【００１６】(a）分子量 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による
測定の結果は、 分子量59,000である。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、4.0 である。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 D-キシロースがβ−１，３−結合したβ−１，３−キシ
ランにのみ特異的に作用する。キシロビオース，パラニ
トロフェニルβ−キシロピラノシド，β−１，４−キシ
ラン，β−１，４−グルカン，β−１，３−グルカン，
β−１，４−マンナン，寒天，並びにポルフィランには
作用しない。 (e) 至適温度 40℃ (f）至適ｐＨ ｐＨ7.5 (g) ｐＨ安定性 ｐＨ 6.0〜11.0 (h) 熱安定性 40℃まで安定
測定の結果は、 分子量59,000である。 (b) 等電点 等電点電気泳動の結果は、4.0 である。 (c) 溶解性 水溶性である。 (d) 作用 D-キシロースがβ−１，３−結合したβ−１，３−キシ
ランにのみ特異的に作用する。キシロビオース，パラニ
トロフェニルβ−キシロピラノシド，β−１，４−キシ
ラン，β−１，４−グルカン，β−１，３−グルカン，
β−１，４−マンナン，寒天，並びにポルフィランには
作用しない。 (e) 至適温度 40℃ (f）至適ｐＨ ｐＨ7.5 (g) ｐＨ安定性 ｐＨ 6.0〜11.0 (h) 熱安定性 40℃まで安定
【００１７】本発明のβ−１，３−キシラナーゼは微生
物を用いて生産される。このβ−１，３−キシラナーゼ
は、この酵素を生産する微生物を培養して、微生物の内
部又は培養上清から分離することができる。この酵素を
生産する微生物としては、例えば、本発明では新たに海
底泥中から分離されたアルカリゲネス属菌株XY-234（Al
caligenes sp. XY-234）を用いることができる。このア
ルカリゲネス属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）
は生工研菌寄第１６１８４号（平成９年４月７日寄託)
として既に寄託されている。
物を用いて生産される。このβ−１，３−キシラナーゼ
は、この酵素を生産する微生物を培養して、微生物の内
部又は培養上清から分離することができる。この酵素を
生産する微生物としては、例えば、本発明では新たに海
底泥中から分離されたアルカリゲネス属菌株XY-234（Al
caligenes sp. XY-234）を用いることができる。このア
ルカリゲネス属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）
は生工研菌寄第１６１８４号（平成９年４月７日寄託)
として既に寄託されている。
【００１８】尚、本発明のβ−１，３−キシラナーゼを
製造する方法及びその用途に用いる微生物としては、前
記アルカリゲネス属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-2
34）とその変種、変異株に限定されるものではなく、前
記β−１，３−キシラナーゼ生産能を有するものであれ
ば良い。
製造する方法及びその用途に用いる微生物としては、前
記アルカリゲネス属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-2
34）とその変種、変異株に限定されるものではなく、前
記β−１，３−キシラナーゼ生産能を有するものであれ
ば良い。
【００１９】具体的なβ−１，３−キシラナーゼの製造
方法としては、このβ−１，３−キシラナーゼを産生す
る微生物をβ−１，３−キシランを炭素源として培養
し、その培養上清液から分離して精製するものである。
この培地は、炭素源としてβ−１，３−キシランを含む
他に、窒素源、無機化合物等栄養素を適当量含有するも
のであれば、天然培地、合成培地の何れも使用する事が
できる。
方法としては、このβ−１，３−キシラナーゼを産生す
る微生物をβ−１，３−キシランを炭素源として培養
し、その培養上清液から分離して精製するものである。
この培地は、炭素源としてβ−１，３−キシランを含む
他に、窒素源、無機化合物等栄養素を適当量含有するも
のであれば、天然培地、合成培地の何れも使用する事が
できる。
【００２０】具体的なβ−１，３−キシランを含む炭素
源としては、緑藻イワヅタ属や紅藻アマノリ属から分離
したβ−１，３−キシランを用いることもできる。
源としては、緑藻イワヅタ属や紅藻アマノリ属から分離
したβ−１，３−キシランを用いることもできる。
【００２１】また、窒素源としては、通常の培地の組成
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、各種アミノ
酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニ
ウム塩、硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２
種以上を用いることができる。
で用いるものが使用できる。例えば、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、カザミノ酸、各種アミノ
酸、尿素等の動植物等の加水分解物や各種無機アンモニ
ウム塩、硝酸塩等の有機又は無機窒素源を、１種又は２
種以上を用いることができる。
【００２２】更に、無機化合物としては、培養される微
生物の必須無機塩として、ナトリウム，マグネシウム，
カルシウム，鉄，マンガン等のリン酸，塩酸塩，硫酸
塩，炭酸塩，酢酸塩等を１種以上用いることができる。
生物の必須無機塩として、ナトリウム，マグネシウム，
カルシウム，鉄，マンガン等のリン酸，塩酸塩，硫酸
塩，炭酸塩，酢酸塩等を１種以上用いることができる。
【００２３】培養は、目的のβ−１，３−キシラナーゼ
を産生する微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選
択される。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養，
通気攪拌培養等により大量に培養することができ、良好
である。
を産生する微生物の培養に応じた培養方法及び条件が選
択される。例えば、好気性微生物であれば、振盪培養，
通気攪拌培養等により大量に培養することができ、良好
である。
【００２４】微生物の培養によって産生されたβ−１，
３−キシラナーゼは、通常の方法によって、分離・ 精製
される。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌
体を通常用いられている手段によって破砕してβ−１，
３−キシラナーゼを抽出して精製される。また、培養液
中に産生されたβ−１，３−キシラナーゼは、微生物を
濾過・ 遠心分離等の方法で除去して精製される。
３−キシラナーゼは、通常の方法によって、分離・ 精製
される。例えば、菌体中に酵素を保有する場合には、菌
体を通常用いられている手段によって破砕してβ−１，
３−キシラナーゼを抽出して精製される。また、培養液
中に産生されたβ−１，３−キシラナーゼは、微生物を
濾過・ 遠心分離等の方法で除去して精製される。
【００２５】精製方法としては、通常用いられる精製方
法を利用することができる。例えば、塩析，溶媒沈殿に
より、β−１，３−キシラナーゼを沈殿させて溶媒中か
ら分離して、精製することができる。また、沈殿させた
ものを更にイオン交換クロマトグラフィ，ゲルクロマト
グラフィ，等電点電気泳動等により、更に精製すること
もできる。
法を利用することができる。例えば、塩析，溶媒沈殿に
より、β−１，３−キシラナーゼを沈殿させて溶媒中か
ら分離して、精製することができる。また、沈殿させた
ものを更にイオン交換クロマトグラフィ，ゲルクロマト
グラフィ，等電点電気泳動等により、更に精製すること
もできる。
【００２６】得られたβ−１，３−キシラナーゼの用途
としては、オリゴ糖の生産や研究試薬として利用するこ
とができる。例えば、β−１，３−キシランを基質とし
て作用させることにより、キシロオリゴ糖を製造するこ
とができる。このβ−１，３−キシランから得られるキ
シロオリゴ糖は、海藻細胞壁の構造研究やβ−１，３−
キシラナーゼの酵素学的性質を解明する上での研究用試
薬として利用できるのは前述の通りである。
としては、オリゴ糖の生産や研究試薬として利用するこ
とができる。例えば、β−１，３−キシランを基質とし
て作用させることにより、キシロオリゴ糖を製造するこ
とができる。このβ−１，３−キシランから得られるキ
シロオリゴ糖は、海藻細胞壁の構造研究やβ−１，３−
キシラナーゼの酵素学的性質を解明する上での研究用試
薬として利用できるのは前述の通りである。
【００２７】また、得られたβ−１，３−キシラナーゼ
の研究試薬の用途としては、例えば、アマノリ等の海藻
にβ−１，３−キシラナーゼを作用させることにより、
容易にプロトプラストを単離することができる。
の研究試薬の用途としては、例えば、アマノリ等の海藻
にβ−１，３−キシラナーゼを作用させることにより、
容易にプロトプラストを単離することができる。
【００２８】
１．海底泥中よりのアルカリゲネス(Alcaligenes) 菌の
採取 海底泥中に生息する微生物からβ−１，３−キシラナー
ゼ活性の高い微生物を分離選択した。具体的には、海底
泥に生息する海洋性微生物を単離し、個々の微生物をβ
−１，３−キシランを炭素源とする培地中で培養し、β
−１，３−キシラナーゼ活性を測定したところ、β−
１，３−キシラナーゼ活性の最も高い微生物（Strain n
o.XY-234）を得た。
採取 海底泥中に生息する微生物からβ−１，３−キシラナー
ゼ活性の高い微生物を分離選択した。具体的には、海底
泥に生息する海洋性微生物を単離し、個々の微生物をβ
−１，３−キシランを炭素源とする培地中で培養し、β
−１，３−キシラナーゼ活性を測定したところ、β−
１，３−キシラナーゼ活性の最も高い微生物（Strain n
o.XY-234）を得た。
【００２９】尚、本実施例におけるβ−１，３−キシラ
ナーゼ活性の測定は次のように行われた。１％のβ−
１，３−キシランを含む100mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ 7.
5）の０．５mlに酵素液０．５mlを加え、３８℃で10mim
反応させ、生じた還元糖の増加をソモジ・ ネルソン（S
omogyi-Nelson）法で測定した。酵素活性の１unitは上
記反応条件で、１分間に１μmol のD-キシロースに相当
する還元力を生ずる酵素量と定義した。
ナーゼ活性の測定は次のように行われた。１％のβ−
１，３−キシランを含む100mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ 7.
5）の０．５mlに酵素液０．５mlを加え、３８℃で10mim
反応させ、生じた還元糖の増加をソモジ・ ネルソン（S
omogyi-Nelson）法で測定した。酵素活性の１unitは上
記反応条件で、１分間に１μmol のD-キシロースに相当
する還元力を生ずる酵素量と定義した。
【００３０】２．菌学的性質 このβ−１，３−キシラナーゼ活性の最も高い微生物
は、Bergeys' Manual Systematic Bacteriology の記載
に準拠して同定を行ったところ、次に示す結果からアル
カリゲネス(Alcaligenes) に属していることが判明し
た。この微生物の形態は、 次の表１に示すものである。
また、表２に生理学的試験結果を示す。この表１及び表
２の結果より、本微生物は海洋性細菌アルカリゲネス(A
lcaligenes)sp．であることが確認された。尚、本細菌
をアルカリゲネス(Alcaligenes) sp.XY-234と命名し
た。
は、Bergeys' Manual Systematic Bacteriology の記載
に準拠して同定を行ったところ、次に示す結果からアル
カリゲネス(Alcaligenes) に属していることが判明し
た。この微生物の形態は、 次の表１に示すものである。
また、表２に生理学的試験結果を示す。この表１及び表
２の結果より、本微生物は海洋性細菌アルカリゲネス(A
lcaligenes)sp．であることが確認された。尚、本細菌
をアルカリゲネス(Alcaligenes) sp.XY-234と命名し
た。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】即ち、グラム陰性で側毛を有し、ＯＦテス
トでは発酵性がなく、カタラーゼならびにオキシダーゼ
テスト陽性、グルコース培地から酸、ならびにガス非産
生で、ＧＣ含量６１．５％であった。
トでは発酵性がなく、カタラーゼならびにオキシダーゼ
テスト陽性、グルコース培地から酸、ならびにガス非産
生で、ＧＣ含量６１．５％であった。
【００３４】アルカリゲネス(Alcaligenes) sp. XY-234
の酵素生成と炭素源としての糖やアミノ酸の利用性等を
調べた。結果を次の表３と表４に示す。
の酵素生成と炭素源としての糖やアミノ酸の利用性等を
調べた。結果を次の表３と表４に示す。
【００３５】
【表３】
【００３６】
【表４】
【００３７】３．培養 本細菌(Alcaligenes sp.XY-234) は、酵素産生のための
誘導物質として、β−１，３−キシランを必要とし、そ
の濃度を０．３％とし、その他、0.3%ポリペプトン、0.
1%酵母エキス、3%塩化ナトリウム、0.5%硫酸マグネシウ
ム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.04%リン酸水素一カ
リウムの組成からなる培地を用いて、２５℃、４日間、
振盪培養した場合、1,000ml の培地から65units のβ−
１，３−キシラナーゼを得ることができた。
誘導物質として、β−１，３−キシランを必要とし、そ
の濃度を０．３％とし、その他、0.3%ポリペプトン、0.
1%酵母エキス、3%塩化ナトリウム、0.5%硫酸マグネシウ
ム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.04%リン酸水素一カ
リウムの組成からなる培地を用いて、２５℃、４日間、
振盪培養した場合、1,000ml の培地から65units のβ−
１，３−キシラナーゼを得ることができた。
【００３８】４．β−１，３−キシラナーゼの精製 産生されたβ−１，３−キシラナーゼを精製した。即
ち、本細菌を上記の条件で大量培養し、遠心分離して得
られた培養上清液に７５％飽和になるように固形硫酸ア
ンモニウムを加えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、
生じた沈殿を少量の 50mM ＭＥＳ緩衝液ｐＨ 7.5に溶解
し、同緩衝液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用
いた。
ち、本細菌を上記の条件で大量培養し、遠心分離して得
られた培養上清液に７５％飽和になるように固形硫酸ア
ンモニウムを加えた。４℃で１日放置後、遠心分離し、
生じた沈殿を少量の 50mM ＭＥＳ緩衝液ｐＨ 7.5に溶解
し、同緩衝液で透析後、透析内液を塩析酵素液として用
いた。
【００３９】塩析酵素液を陰イオン交換クロマトグラフ
ィー(Q-Sepharose FF), ゲル濾過クロマトグラフィー(T
oyopearl HW-55) ，疎水クロマトグラフィー(Ether-Toy
opearl 650s)，陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono
Q HR 5/5) で分画したところ、ポリアクリルアミドディ
スク電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と
で均一に精製されていることが判明した。
ィー(Q-Sepharose FF), ゲル濾過クロマトグラフィー(T
oyopearl HW-55) ，疎水クロマトグラフィー(Ether-Toy
opearl 650s)，陰イオン交換クロマトグラフィー(Mono
Q HR 5/5) で分画したところ、ポリアクリルアミドディ
スク電気泳動とＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と
で均一に精製されていることが判明した。
【００４０】５．β−１，３−キシラナーゼの酵素学的
性質 得られたβ−１，３−キシラナーゼの分子量、等電点、
溶解性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度を測定した。
結果を次の表５に示す。
性質 得られたβ−１，３−キシラナーゼの分子量、等電点、
溶解性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度を測定した。
結果を次の表５に示す。
【００４１】
【表５】
【００４２】また、精製β−１，３−キシラナーゼのβ
−１，３−キシラン、キシロビオース、キシロトリオー
ス、キシロテトラオース、キシロペンタオースに対する
作用様式を調べた。その結果を表６に示す。
−１，３−キシラン、キシロビオース、キシロトリオー
ス、キシロテトラオース、キシロペンタオースに対する
作用様式を調べた。その結果を表６に示す。
【００４３】
【表６】
【００４４】６．β−１，３−キシランからのキシロオ
リゴ糖の製造 β−１，３−キシランからオリゴ糖を調製する方法とし
て酸による加水分解がある。しかしながら、酸加水分解
法は100 ℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、
オリゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よく
オリゴ糖を調製することが困難である。それに対して、
前記β−１，３−キシラナーゼを用いる方法では室温で
効率よくオリゴ糖を調製することが可能である。
リゴ糖の製造 β−１，３−キシランからオリゴ糖を調製する方法とし
て酸による加水分解がある。しかしながら、酸加水分解
法は100 ℃での加熱を要し、また、反応時間が長いと、
オリゴ糖が更に単糖に分解されてしまうため、効率よく
オリゴ糖を調製することが困難である。それに対して、
前記β−１，３−キシラナーゼを用いる方法では室温で
効率よくオリゴ糖を調製することが可能である。
【００４５】すなわち、100ml 容三角フラスコに1%β−
１，３−キシランを含む20mM酢酸緩衝液を20ml注入し、
アルカリゲネス(Alcaligenes) sp. XY-234のβ−１，３
−キシラナーゼ溶液(0.65unit/ml) を1.5ml 加え、37
℃、24時間反応させた。反応フラスコを沸騰水浴中に15
分間浸漬して反応を停止し、冷却後遠心分離した。得ら
れた上澄液を蒸留水で平衡化した活性炭カラム（２×４
０cm）に通した。最初蒸留水で溶出し、次いで、９，１
４，２９，５０及び７５％のエタノールで段階的にオリ
ゴ糖を溶出した。
１，３−キシランを含む20mM酢酸緩衝液を20ml注入し、
アルカリゲネス(Alcaligenes) sp. XY-234のβ−１，３
−キシラナーゼ溶液(0.65unit/ml) を1.5ml 加え、37
℃、24時間反応させた。反応フラスコを沸騰水浴中に15
分間浸漬して反応を停止し、冷却後遠心分離した。得ら
れた上澄液を蒸留水で平衡化した活性炭カラム（２×４
０cm）に通した。最初蒸留水で溶出し、次いで、９，１
４，２９，５０及び７５％のエタノールで段階的にオリ
ゴ糖を溶出した。
【００４６】７．アマノリからのプロトプラストの製造 7.1 アマノリからのプロトプラストの調製 わが国で広く食用に供されているアマノリの優良産業品
種の開発を行う上で、細胞融合や遺伝子操作によるバイ
オテクノロジーは優れた手法である。バイオテクノロジ
ーを行うためには酵素で細胞壁を溶解し、プロトプラス
トを作出する方法の開発が必要とされている。前記、β
−１，３−キシラナーゼと我々が別に開発したβ−マン
ナナーゼならびにβ−アガラーゼ（特開平８−２９４３
８９号公報、及び、Arakiら，J.Gen.Appl.Microbiol.,3
8,343(1992)、Arakiら，Appliedand Environmental Mic
robiology,61,4454(1995)参照）を用いることにより、
アマノリから多量のプロトプラストを作出することが可
能である。
種の開発を行う上で、細胞融合や遺伝子操作によるバイ
オテクノロジーは優れた手法である。バイオテクノロジ
ーを行うためには酵素で細胞壁を溶解し、プロトプラス
トを作出する方法の開発が必要とされている。前記、β
−１，３−キシラナーゼと我々が別に開発したβ−マン
ナナーゼならびにβ−アガラーゼ（特開平８−２９４３
８９号公報、及び、Arakiら，J.Gen.Appl.Microbiol.,3
8,343(1992)、Arakiら，Appliedand Environmental Mic
robiology,61,4454(1995)参照）を用いることにより、
アマノリから多量のプロトプラストを作出することが可
能である。
【００４７】具体的にはアマノリ１ｇを5%パパインと、
0.5Mマンニトール含有 20mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ 7.5）
30mlを入れた100ml 容ビーカーに加え、22℃、15分間振
盪した。葉状体を0.5Mマンニトール、2%NaClを含む20mM
MES緩衝液(pH7.5) で５回洗浄後、メスで数mm片に切断
した。次いで、20ml容三角フラスコに分注した8.0mlの
細胞壁溶解酵素液( β−１，４−マンナナーゼ、β−
１，３−キシラナーゼ、β−アガラーゼの各1.0unit )
に葉状体断片を投入し、22℃で振とうした。未分解の葉
状体断片を取り除くために40μm のナイロンネットで濾
別し、ネットを通過したプロトプラストを遠心分離(TOM
Y LC−121 、70×g 5 分間) して集め、次いで、0.5M、
および0.2Mのマンニトールを含む各ASP12(NTA ）培地で
順次遠心洗浄した。
0.5Mマンニトール含有 20mM ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ 7.5）
30mlを入れた100ml 容ビーカーに加え、22℃、15分間振
盪した。葉状体を0.5Mマンニトール、2%NaClを含む20mM
MES緩衝液(pH7.5) で５回洗浄後、メスで数mm片に切断
した。次いで、20ml容三角フラスコに分注した8.0mlの
細胞壁溶解酵素液( β−１，４−マンナナーゼ、β−
１，３−キシラナーゼ、β−アガラーゼの各1.0unit )
に葉状体断片を投入し、22℃で振とうした。未分解の葉
状体断片を取り除くために40μm のナイロンネットで濾
別し、ネットを通過したプロトプラストを遠心分離(TOM
Y LC−121 、70×g 5 分間) して集め、次いで、0.5M、
および0.2Mのマンニトールを含む各ASP12(NTA ）培地で
順次遠心洗浄した。
【００４８】
【発明の効果】本発明は以上説明した通り、β−１，３
−キシラナーゼは、β−１，３−キシランを分解してキ
シロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオー
ス、キシロペンタオース、キシロヘキサオースなどへの
低分子化反応を触媒する等の特徴を有する新規な酵素で
あり、本発明ではこのβ−１，３−キシラナーゼを得る
ことができる。
−キシラナーゼは、β−１，３−キシランを分解してキ
シロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオー
ス、キシロペンタオース、キシロヘキサオースなどへの
低分子化反応を触媒する等の特徴を有する新規な酵素で
あり、本発明ではこのβ−１，３−キシラナーゼを得る
ことができる。
【００４９】また、本発明では、このβ−１，３−キシ
ラナーゼを産生する新規な微生物アルカリゲネス属菌株
XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）を得ることができ
る。
ラナーゼを産生する新規な微生物アルカリゲネス属菌株
XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）を得ることができ
る。
【００５０】更に、このβ−１，３−キシラナーゼを産
生する微生物をβ−１，３−キシランを炭素源にして培
養し、その培養上清液から分離して精製することによ
り、製造することができる。
生する微生物をβ−１，３−キシランを炭素源にして培
養し、その培養上清液から分離して精製することによ
り、製造することができる。
【００５１】また、このβ−１，３−キシラナーゼを用
いる用途として、本発明のβ−１，３−キシラナーゼ
は、β−１，３−キシランを基質として作用させること
により、キシロオリゴ糖を製造することができる。この
β−１，３−キシランから得られるオリゴ糖は海藻細胞
壁多糖の研究用試薬として有用である。
いる用途として、本発明のβ−１，３−キシラナーゼ
は、β−１，３−キシランを基質として作用させること
により、キシロオリゴ糖を製造することができる。この
β−１，３−キシランから得られるオリゴ糖は海藻細胞
壁多糖の研究用試薬として有用である。
【００５２】更に、本発明のβ−１，３−キシラナーゼ
は、アマノリに作用させることにより、容易にアマノリ
細胞壁を溶解し、プロトプラストを単離することができ
るという効果がある。
は、アマノリに作用させることにより、容易にアマノリ
細胞壁を溶解し、プロトプラストを単離することができ
るという効果がある。
【図１】β−１，３−キシランの化学構造を示す説明図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:05）
Claims (5)
- 【請求項１】 β−１，３−キシランを分解し、主にキ
シロビオース（２糖類）、キシロトリオース（３糖
類）、キシロテトラオース（４糖類）、キシロペンタオ
ース（５糖類）並びにキシロヘキサオース（６糖類）に
まで低分子化する反応を触媒する酵素であって、下記理
化学的性質を有するβ−１，３−キシラナーゼ。 (a) 分子量；59,000 (b) 等電点；4.0 (c) 溶解性；水溶性 (d) 作用；D-キシロースがβ−１，３−結合したβ−
１，３−キシランにのみ特異的に作用し、キシロビオー
スやパラニトロフェニルβ- キシロピラノシドならびに
β−１，４−キシラン、β−１，４−グルカン、β−
１，３−グルカン、β−１，４−マンナン、寒天、ポル
フィランには作用しない。 (e) 至適温度；４０℃ (f) 至適ｐＨ；ｐＨ 7.5 (g) ｐＨ安定性；ｐＨ６．０〜１１．０ (h) 熱安定性；４０℃まで安定 - 【請求項２】 新規な海洋性細菌であるアルカリゲネス
属菌株XY-234（Alcaligenes sp. XY-234）。 - 【請求項３】 β−１，３−キシラナーゼを産生する能
力を有するアルカリゲネス属に属する微生物をβ−１，
３−キシランを炭素源として培養し、その培養上清液か
ら分離・採取することを特徴とするβ−１，３−キシラ
ナーゼの製造方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載されたβ−１，３−キシ
ラナーゼで、β−１，３−キシランを基質として作用さ
せることを特徴とするキシロオリゴ糖の製造方法。 - 【請求項５】 請求項１に記載されたβ−１，３−キシ
ラナーゼを海藻に作用させることを特徴とする海藻細胞
のプロトプラストの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9122809A JPH10295372A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9122809A JPH10295372A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10295372A true JPH10295372A (ja) | 1998-11-10 |
Family
ID=14845183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9122809A Pending JPH10295372A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10295372A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004509626A (ja) * | 2000-09-21 | 2004-04-02 | デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ | タラロマイセスのキシラナーゼ |
| JP2013063051A (ja) * | 2011-09-20 | 2013-04-11 | Meiji Univ | オリゴ糖の製造方法 |
-
1997
- 1997-04-28 JP JP9122809A patent/JPH10295372A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004509626A (ja) * | 2000-09-21 | 2004-04-02 | デーエスエム・ナムローゼ・フェンノートシャップ | タラロマイセスのキシラナーゼ |
| JP4878428B2 (ja) * | 2000-09-21 | 2012-02-15 | ベーアーエスエフ・アクチエンゲゼルシャフト | タラロマイセスのキシラナーゼ |
| JP2013063051A (ja) * | 2011-09-20 | 2013-04-11 | Meiji Univ | オリゴ糖の製造方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040415 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060712 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061101 |