WO2009119252A1 - セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法 - Google Patents

セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2009119252A1
WO2009119252A1 PCT/JP2009/053748 JP2009053748W WO2009119252A1 WO 2009119252 A1 WO2009119252 A1 WO 2009119252A1 JP 2009053748 W JP2009053748 W JP 2009053748W WO 2009119252 A1 WO2009119252 A1 WO 2009119252A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
supernatant
cellulose
dried product
mixture
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/053748
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
和郎 福田
Original Assignee
アサヒビール株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アサヒビール株式会社 filed Critical アサヒビール株式会社
Priority to CN2009801108561A priority Critical patent/CN101981178B/zh
Priority to EP09723651A priority patent/EP2261318A4/en
Priority to JP2010505477A priority patent/JPWO2009119252A1/ja
Priority to CA2719282A priority patent/CA2719282A1/en
Priority to US12/934,924 priority patent/US20110027839A1/en
Publication of WO2009119252A1 publication Critical patent/WO2009119252A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Definitions

  • the present invention relates to a method for saccharifying cellulose, and more particularly to a method for saccharifying cellulose using a filamentous fungus culture mixture that exhibits cellulolytic activity.
  • cellulose is mainly degraded by microorganisms, and it is known that various microorganisms such as bacteria and filamentous fungi produce cellulose-degrading enzymes.
  • microorganisms secrete a plurality of cellulose-degrading enzymes outside the cells, and cellulose is degraded into glucose mainly through cellooligosaccharides and cellobiose by the cooperative action of various cellulose-degrading enzymes having different mechanisms of action.
  • Cellulolytic enzymes are generally called cellulases as a general term for enzymes that hydrolyze cellulose.
  • Trichoderma is the most promising enzyme source for cellulase and is widely used all over the world.
  • birch fungus Aspergillus kawachi is Japan's unique shochu fungus and is widely used for saccharification of cereal raw materials.
  • Aspergillus kawachi is not particularly excellent in the ability to produce cellulase, and there are few examples of use for cellulose saccharification.
  • Non-Patent Document 1 describes that as a result of degradation of cellulose using a culture supernatant of Aspergillus aculeatus in combination with a commercially available cellulase enzyme, a synergistic effect is observed in the degradation efficiency. Yes.
  • Non-patent document 2 describes that a cellulase derived from cells of the genus Trichoderma and a cellulase derived from Aspergillus acreatus exhibit a synergistic effect on the ability to purify monosaccharides from cellulose.
  • Aspergillus acreatas inherently has a high ability to produce cellulase and is different in nature from Aspergillus kawachi.
  • an enzyme agent is used, which is high in cost and complicated in operation.
  • the reported degradation saccharification efficiency is considerably lower than the level that is expected to be profitable when implemented on a large scale, and the efficiency is insufficient for the purpose of practical use. J. et al. Ferment. Technol. 57, 151-159, 1979 Fermentation Engineering, 60, 333-341, 1982
  • the present invention solves the above-mentioned conventional problems, and an object of the present invention is to provide a method for enzymatically saccharifying cellulosic substances very efficiently, simply and inexpensively.
  • the present invention provides a mixture of Trichoderma filamentous fungus culture medium or supernatant and Aspergillus kawachii culture, or a dried product thereof, which exhibits cellulolytic activity. This achieves the above object.
  • the Aspergillus kawachi culture is a culture solution or a supernatant.
  • the Aspergillus kawachi culture is a solid culture or extract.
  • the cellulase activity of the Trichoderma filamentous fungus culture solution or supernatant is 50 U / ml or more, and the Aspergillus kawachi culture solution, supernatant or solid culture extract has a hemicellulase activity of 50 Uml. That's it.
  • the mixing ratio of the Trichoderma filamentous fungus culture solution or supernatant to the Aspergillus kawachi culture, supernatant or solid culture extract is from 10:90 to 90:10 in a volume ratio. Range.
  • the Trichoderma filamentous fungus is Trichoderma reesei or Trichoderma viride.
  • the Trichoderma filamentous fungus is Trichoderma reesei.
  • the present invention also provides a method for producing glucose, comprising a step of saccharifying a cellulose raw material using the above mixture or dried product.
  • the saccharification is performed under conditions of 30 to 70 ° C. and pH of 3 to 7.
  • the filamentous fungus culture mixture of the present invention has a very high ability to decompose and saccharify cellulose. Therefore, it can be used as it is for saccharification of cellulose, and there is no need to use an enzyme agent. As a result, cellulose can be saccharified at low cost by a simple operation.
  • Trichoderma filamentous fungi are known as an enzyme source of cellulase necessary for saccharification of cellulose.
  • the Trichoderma genus fungus used in the present invention is not particularly limited as long as it produces cellulase.
  • Preferred Trichoderma filamentous fungi are Trichoderma reesei or Trichoderma viride. Particularly preferred is Trichoderma reesei.
  • Trichoderma filamentous fungus cultures or supernatants are used in combination with Aspergillus kawachi cultures, a synergistic effect is observed in cellulolytic activity. If this synergistic effect is utilized, the ability to decompose and saccharify cellulose in a filamentous fungus culture solution or supernatant can be remarkably enhanced.
  • the bacteriological properties of the fungi Trichoderma reesei and Trichoderma viride include, for example, EG Simmons, Abstract Second International Mycological Congress (EG (Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress) Miami, Florida, USA (March 1977, p. 618).
  • a culture solution or a supernatant solution of Trichoderma filamentous fungi may be prepared by a usual method. That is, the spore, mycelium of a strain, or a preculture obtained by culturing in advance is inoculated into a liquid medium and cultured. For example, when spore culture
  • carbon source of the medium cellulose powder, cellobiose, straw paper, general paper, sawdust, bran, rice bran, bagasse, soybean meal, coffee cake, starch, lactose and the like are used.
  • nitrogen source organic nitrogen-containing materials such as inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate and ammonium nitrate, urea, amino acids, meat extract, yeast extract, polypeptone, and proteolysate are used.
  • KH 2 PO 4 , MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, Fe 2 Cl 3 ⁇ 6H 2 O, MnCl 2 ⁇ 4H 2 O, ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, etc. are used.
  • a medium containing organic micronutrients is used.
  • a normal aeration and agitation culture apparatus is used, and the medium is used for culturing for 4 to 10 days at a culture temperature of 20 to 33 ° C., preferably 28 to 30 ° C. and a culture pH of 4 to 6.
  • a Trichoderma filamentous fungus culture solution is obtained.
  • the cells are removed from the culture solution by a known method such as centrifugation or filtration to obtain a Trichoderma filamentous fungus culture supernatant.
  • Trichoderma filamentous fungus culture medium or culture supernatant examples include cellulase, hemicellulase, and mannanase.
  • the cellulase activity of the obtained culture solution or culture supernatant is 10 U / ml or more, preferably 50 U / ml or more, for example 50 to 150 U / ml, 80 to 120 U / ml, more preferably about 100 U / ml.
  • the cellulase activity of the culture solution or the culture supernatant is less than 10 U / ml, the time required for cellulose degradation increases.
  • the cellulase activity can be quantified by the dinitrosalicylic acid (DNS) method based on the amount of reducing sugar produced by hydrolysis using carboxymethylcellulose (CMC) as a substrate.
  • DNS dinitrosalicylic acid
  • 1% CMC substrate solution dissolved low-viscosity manufactured by Sigma in 100 mM acetate buffer (pH 5)
  • DNS reagent including dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, sodium potassium tartrate tetrahydrate 22.5%, lactose monohydrate 0.3%)
  • the reaction stop solution is accurately heated in a boiling water bath for 15 minutes.
  • the amount of reducing sugar corresponding to glucose is quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of cellulase activity is expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • Aspergillus kawachi is also called gonococcus and is a fungus that has been used for brewing and fermented food production since ancient times, and is a safe microorganism.
  • Microorganisms belonging to the genus Aspergillus are known to produce ⁇ -amylase and are used to saccharify starch.
  • the bacteriological properties of the filamentous fungus Aspergillus kawachi are described in, for example, Yakugaku, edited by Hideya Murakami, March 25, 1987, Item 78.
  • the culture of Aspergillus kawachi may be prepared by a conventional method.
  • the culture of Aspergillus kawachi may be a solid culture obtained by solid culture, or a culture solution or supernatant obtained by liquid culture.
  • the Aspergillus kawachi culture is a solid culture obtained by immersing a solid culture in water or saline to extract the components, and then filtering to remove insoluble components such as cells. It may be an extract.
  • the culture of Aspergillus kawachi is preferably a culture solution or a supernatant.
  • the spore, mycelium of the strain, or a preculture solution obtained by culturing in advance is inoculated into a liquid medium and cultured.
  • cultivation it is preferable to culture
  • the culture temperature is 30 to 40 ° C., and the culture period is 3 to 7 days.
  • the carbon source that can be used is preferably maltose or starch, and about 2% is appropriate.
  • Peptone is preferable as the nitrogen source, and about 0.5% is appropriate.
  • yeast extract, corn steep liquor, monopotassium phosphate, magnesium sulfate and the like are required.
  • maltose or starch is preferable as the above carbon source, but any other normal culture medium for molds can be applied.
  • a normal aeration and agitation culture apparatus For a liquid culture, a normal aeration and agitation culture apparatus is used, and the medium is used for culturing at a culture temperature of 30 to 40 ° C., preferably 35 to 38 ° C. and a culture pH of 4 to 6 for 2 to 4 days. In this way, an Aspergillus kawachi culture solution is obtained. Subsequently, the cells are removed from the culture solution by a known method such as centrifugation or filtration to obtain an Aspergillus kawachi culture supernatant.
  • the spore and mycelium of the strain are inoculated into a solid medium and cultured.
  • cultivation it is preferable to culture
  • the culture temperature is 30 to 40 ° C., and the culture period is 3 to 7 days.
  • the solid medium that can be used is preferably starch raw materials such as cereals and beans such as rice, barley, rice bran, rice bran, etc. in addition to bran, but bran is particularly preferably used.
  • solid culture uses a method using a lid or the like, or a mechanical iron making apparatus, inoculates the strain by steaming the medium, and culture temperature is 30-40 ° C., preferably 35-38. Incubate at 4 ° C. and culture pH 4-6 for 2-4 days. In this way, an Aspergillus kawachi solid culture is obtained. The culture is then immersed in water to extract components, and the cells are removed by filtration to obtain an Aspergillus kawachi solid culture filtrate.
  • enzymes contained in Aspergillus kawachi culture solution or culture supernatant, solid culture or extract include cellulase, hemicellulase, mannanase, pectinase, and protease.
  • the resulting culture, culture supernatant or solid culture extract has a hemicellulase activity of 10 U / ml or more, preferably 50 U / ml or more, for example 50 to 150 U / ml, 80 to 120 U / ml, more preferably about 100 U. / Ml.
  • hemicellulase activity of the culture solution, the culture supernatant solution or the solid culture extract is less than 10 U / ml, the time required for cellulose degradation increases.
  • the hemicellulase activity can be quantified by increasing the absorbance at 540 nm by reacting DNS with a reducing sugar produced by enzymatic hydrolysis using oat spelts-derived xylan as a substrate.
  • 1% xylan substrate solution (Sigma, Xylan, from oat spelts dissolved in 200 mM acetate buffer (pH 4.5)) was added to 1.9 ml of the culture solution or culture supernatant solution at 40 ° C.
  • 4 ml of DNS reagent (containing 0.75% dinitrosalicylic acid, 1.2% sodium hydroxide, 22.5% sodium potassium tartrate tetrahydrate, 0.3% lactose monohydrate)
  • the reaction stop solution is accurately heated in a boiling water bath for 15 minutes.
  • the amount of reducing sugar corresponding to xylose is quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of hemicellulase activity is expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to 1 ⁇ mol of xylose per minute under the reaction conditions of 40 ° C. and 10 minutes.
  • a culture solution or culture supernatant of Trichoderma spp. And a culture of Aspergillus kawachi are mixed to obtain a mixture exhibiting cellulolytic activity of the present invention.
  • Both the culture solution and the culture supernatant can be used for preparing the mixture of the present invention.
  • the preparation of the culture solution does not require an operation for removing the cells, and the preparation method is simple.
  • the microbial cells are not substantially present in the culture supernatant, and the storage stability is excellent.
  • the mixing method of the Trichoderma filamentous fungus culture solution or supernatant and Aspergillus kawachi culture is not particularly limited.
  • the solid culture may be directly added to and mixed with a Trichoderma filamentous fungus culture medium, or the solid culture extract may be mixed with a Trichoderma filamentous fungus culture medium. May be mixed with.
  • the Aspergillus kawachi culture is a liquid culture or a supernatant, they may be mixed directly.
  • the Trichoderma filamentous fungus culture solution and the Aspergillus kawachi culture may be mixed after filtration, or may be filtered after mixing.
  • the mixing ratio of Trichoderma filamentous fungus culture solution or supernatant and Aspergillus kawachi culture solution, supernatant solution or solid culture extract is, for example, 10:90 to 90:10, preferably 20:80 in volume ratio. 80:20, more preferably 30:70 to 70:30, 40:60 to 60:40, and still more preferably 50:50. If the mixing ratio is less than 10:90 or exceeds 90:10, the saccharification efficiency of cellulose is lowered. Moreover, this mixture can also be made into a dried material, and a dried material can be prepared by methods usually performed, such as freeze-drying.
  • the cellulose raw material can be decomposed and saccharified using the above mixture.
  • Cellulose is a molecular chain in which glucose is polymerized by ⁇ -1,4-glucoside bonds or derivatives thereof (for example, carboxymethyl cellulose or the like that has been derivatized such as carboxymethylation, aldehyde formation, or esterification), Or what they combined (cellulose fiber etc.) is said.
  • the cellulose raw material is preferably a water-insoluble fibrous material containing cellulose. Its origin may be plant or animal, and examples of animals and plants that produce it include bagasse, beer straw, wood, bamboo, straw, rice straw, corn cob, cotton, ramie, kenaf, beet, squirt, and bacterial cellulose. Etc.
  • the present invention includes a regenerated cellulosic material obtained by chemically and physically dissolving or swelling the natural cellulosic material once and then regenerating it. Further, a cellulose derivative material obtained by chemically modifying a cellulose material may be used.
  • these cellulose materials are natural cellulose materials such as pulp, cellulose powder and crystalline cellulose, regenerated cellulose materials such as rayon, various regenerated cellulose materials such as alkali cellulose and phosphoric acid swollen cellulose, carboxymethylcellulose sodium. Any of various cellulose derivative-based raw materials may be used. However, in order to use the obtained glucose for pharmaceuticals, foods, and cosmetics, it is more preferable to use natural cellulosic materials. Even if one kind of cellulosic material is used as a raw material, a mixture of two or more kinds can be used.
  • the cellulose saccharification method may be a known method and is not particularly limited.
  • the cellulose raw material is suspended as a substrate in an aqueous medium, the above mixture is added, and the mixture is stirred or shaken. Meanwhile, there is a method in which the saccharification reaction is performed by heating.
  • a dried product thereof or a solution obtained by dispersing or dissolving the dried product in water may be used.
  • the cellulose raw material is preferably delignified in advance.
  • the reaction conditions such as the suspension method, the stirring method, the method for adding the mixture, the order of addition, and the concentration thereof are appropriately adjusted so that glucose can be obtained in a higher yield.
  • the pH and temperature of the reaction solution may be within the range where the enzyme is not inactivated.
  • the temperature is 30 to 70 ° C., and the pH is 3 to 7. Range may be sufficient.
  • the pressure, temperature and pH are also adjusted as appropriate so that glucose can be obtained in a higher yield, as described above.
  • the temperature is 50-60 in acetic acid or phosphate buffer at normal pressure. It is preferably carried out in the range of 4 ° C. and pH 4-6.
  • the reaction time is generally 6 to 147 hours, preferably 24 to 72 hours.
  • An aqueous solution containing glucose is obtained by saccharification of cellulose.
  • the obtained aqueous solution can be subjected to purification treatment such as decolorization, desalting, enzyme removal, etc., as necessary.
  • the purification method is not particularly limited as long as it is a known method. For example, activated carbon treatment, ion exchange resin treatment, chromatography treatment, microfiltration, ultrafiltration, reverse osmosis filtration and other filtration treatments, crystallization treatment, etc. are used. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the aqueous solution mainly composed of glucose purified by the above method can be used as it is, but if necessary, it may be solidified by drying.
  • the drying method is not particularly limited as long as it is a known method, but for example, spray drying, freeze drying, drum drying, thin film drying, shelf drying, airflow drying, vacuum drying, etc. may be used, and these may be used alone. You may use, or may combine 2 or more types.
  • Example 1 Trichoderma reesei QM9414 (NBRC 31329) was cultured on potato dextrose agar at 28 ° C. for 7 days to sufficiently form spores.
  • Part 1 platinum ears were made of crystalline cellulose (product name: Theolas, manufactured by Asahi Kasei Chemicals): 1 g, KH 2 PO 4 : 0.2 g, (NH 4 ) 2 SO 4 : 0.14 g, CaCl 2 ⁇ 2H 2 O: 0.
  • the cellulase activity of the obtained supernatant was measured by the above method and found to be 50 U / ml.
  • Aspergillus kawachi (NBRC4308) was cultured on a potato dextrose agar medium at 37 ° C. for 4 days to sufficiently form spores.
  • the 1 platinum ear was inoculated into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask containing 3 g of wheat bran, 0.5 g of K 2 HPO 4 and 100 ml of water, and cultured with shaking at 37 ° C. for 3 days. On the third day, the culture solution was filtered to obtain a supernatant.
  • the hemicellulase activity of the supernatant obtained by the above method was measured and found to be 50 U / ml.
  • the cellulose raw material used for saccharification was delignified by the following method. Each of beer straw, rice straw, straw and bagasse was finely pulverized, suspended in 0.3N NaOH, treated at 120 ° C. for 15 minutes, thoroughly washed with water, and dried. Cellulose powder (Nippon Paper Chemical Co., Ltd., trade name: KC Flock W-50) was directly subjected to saccharification.
  • the saccharification of the cellulose raw material is from cellulose raw material: 0.3 g, Trichoderma reesei culture supernatant: 4.75 ml, Aspergillus kawachi culture supernatant: 4.75 ml, 1M acetate buffer (pH 4.8): 0.2 ml
  • the resulting solution (cellulose raw material 3% solution) was saccharified by shaking at 50 ° C., pH 4.8 for 24 to 48 hours, and the produced glucose was measured with Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries).
  • Trichoderma reesei culture supernatant 9.5 ml
  • Aspergillus kawachi culture supernatant 9.5 ml were used as controls. The results are shown in FIGS.
  • Example 2 Saccharification efficiency was compared by changing the mixing ratio of Trichoderma reesei culture supernatant and Aspergillus kawachi culture supernatant. Both culture supernatants were prepared in the same manner as in Example 1.
  • Bagasse 1 g, Mixture of culture supernatant: 8.8 ml, 1M acetate buffer (pH 4.8): 0.2 ml (bagasse 10% solution) is shaken at 50 ° C., pH 4.8, 24 hours The glucose produced by saccharification was measured. The results are shown in FIG. The mixing ratio shown on the horizontal axis of the graph is a volume ratio.
  • Example 3 Trichoderma reesei broth and Aspergillus kawachi broth were obtained in the same manner as in Example 1 except that filtration was not performed. Subsequently, various mixtures in which the mixing ratio of both culture solutions was changed were prepared, and saccharification efficiency was compared.
  • Cellulose powder (trade name: KC Flock): 1 g, mixture of culture solution: 8.8 ml, 1M acetate buffer (pH 4.8): 0.2 ml of a solution (cellulose powder 10% solution) at 50 ° C., pH 4.8, Saccharification was carried out for 24 hours, and the produced glucose was measured.
  • the results are shown in FIG.
  • the mixing ratio shown on the horizontal axis of the graph is a volume ratio.
  • Beer cake 0.3 g, mixture of culture supernatant: 9.5 ml, 1M acetate buffer (pH 4.8): 0.2 ml of a solution (beer cake 3% solution) at 50 ° C., pH 4.8, 24 hours
  • the resulting glucose was measured by shaking and saccharification.
  • the results are shown in FIG.
  • the mixing ratio shown on the horizontal axis of the graph is a volume ratio.
  • Example 5 Various Aspergillus fungus culture supernatants were used in combination with Trichoderma reesei culture supernatants to compare the synergistic effects of saccharification efficiency. Trichoderma reesei culture supernatant prepared in the same manner as in Example 1 was used.
  • Aspergillus awamori NBRC4388
  • Aspergillus niger NBRC31125
  • Aspergillus saitoi ATCC11363
  • Aspergillus oryzae RIB40
  • Aspergillus Aperus Each was cultured on a potato dextrose agar medium at 37 ° C. for 4 days to sufficiently form spores.
  • Each 1 platinum ear was inoculated into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask containing wheat bran: 3 g, K 2 HPO 4 : 0.5 g, and 100 ml of water, and cultured with shaking at 37 ° C. for 3 days. On the third day, the culture solution was filtered to obtain a supernatant.
  • Cellulose powder 0.5 g, Mixture of Aspergillus filamentous fungus and Trichoderma reesei culture supernatant (mixing ratio is 50:50): 9.3 ml, 1M acetate buffer (pH 4.8): liquid consisting of 0.2 ml ( The 5% cellulose powder) was saccharified by shaking at 50 ° C., pH 4.8 for 24 hours, and the produced glucose was measured.
  • Trichoderma reesei culture supernatant 9.3 ml
  • Aspergillus culture supernatant 9.3 ml were used in place of the mixed culture supernatant, respectively. The result is shown in FIG.
  • Reference example 1 The cellulase derived from the genus Trichoderma was examined for synergistic effects with cellulase derived from Aspergillus kawachi.
  • a cellulase preparation derived from Trichoderma reesei (Sigma) and a cellulase preparation derived from Trichoderma viride (Sigma) were each dissolved in water to prepare a 1% cellulase solution.
  • Delignified bagasse 0.5 g, 1% cellulase solution: 4.65 ml, Aspergillus kawachi culture supernatant: 4.65 ml, 1 M acetate buffer (pH 4.8): 0.2 ml (bagasse 5% solution) was saccharified by shaking at 50 ° C. and pH 4.8 for 24 hours, and the produced glucose was measured. Aspergillus kawachi culture supernatant was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Example 6 Trichoderma reesei culture supernatant was obtained in the same manner as in Example 1.
  • Aspergillus kawachi (NBRC4308) was cultured on a potato dextrose agar medium at 37 ° C. for 4 days to sufficiently form spores.
  • the platinum loop was inoculated into a medium treated with a petri dish containing 50 g of bran adjusted to 50% moisture in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes, and cultured at 36 ° C. for 3 days to obtain a solid culture.
  • 5 times the weight of 0.5% saline was added, and after standing overnight, the cells were removed by filtration to obtain a solid culture filtrate.
  • the hemicellulase activity of the obtained solid culture filtrate was measured by the above method and found to be 90 U / ml.
  • the cellulose raw material used for saccharification was delignified by the following method. Each bagasse was finely pulverized, suspended in 0.3N NaOH, treated at 120 ° C. for 15 minutes, thoroughly washed with water, and dried. Cellulose powder (Nippon Paper Chemical Co., Ltd., trade name: KC Flock W-50) was directly subjected to saccharification.
  • the saccharification of the cellulose raw material is from cellulose raw material: 0.65 g, Trichoderma reesei culture supernatant: 4.6 ml, Aspergillus kawachi solid culture filtrate: 4.6 ml, 1M acetate buffer (pH 4.8): 0.2 ml
  • the resulting solution (cellulose raw material 6.5% solution, volume ratio of culture supernatant and solid culture filtrate is 50%: 50%) was saccharified and produced by shaking at 50 ° C., pH 4.8 for 24 hours.
  • Glucose was measured with Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries).
  • Trichoderma reesei culture supernatant 9.2 ml
  • Aspergillus kawachi solid culture filtrate 9.2 mlg were used as controls.
  • the result is shown in FIG.
  • the mixing ratio shown on the horizontal axis of the graph is a volume ratio.

Abstract

　本発明の課題は、セルロース性物質を極めて効率よく、簡便、安価に酵素糖化する方法を提供することである。課題の解決手段は、セルロース分解活性を示す、トリコデルマ（Trichoderma）属糸状菌培養液または上清液とアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）培養物との混合物、またはその乾燥物である。

Description

セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法
  本発明はセルロースを糖化する方法に関し、特にセルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物を用いてセルロースを糖化する方法に関する。
  セルロース資源を有効利用するために、近年、セルロースを効率的に糖化する方法が探索されている。自然界ではセルロースは主として微生物によって分解されており、細菌や糸状菌などの様々な微生物がセルロース分解酵素を生産することが知られている。
  これらの微生物は菌体外に複数のセルロース分解酵素を分泌し、セルロースはそれらの作用機構の異なる各種セルロース分解酵素の協同作用により、主に、セロオリゴ糖、セロビオースを経てグルコースへと分解される。セルロース分解酵素は、一般に、セルロースを加水分解する酵素の総称としてセルラーゼと呼ばれている。
  セルラーゼの酵素源としては、トリコデルマ属が最も有望であり、世界中で広く利用されている。一方、白麹菌アスペルギルス・カワチは我が国独自の焼酎麹菌であり、穀類原料の糖化に広く利用されている。しかし、アスペルギルス・カワチはセルラーゼ分泌生産能にとりわけ優れているわけではなく、セルロースの糖化に利用された例はほとんどない。
  非特許文献１には、アスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus）の培養上清液を市販のセルラーゼ酵素と組み合わせて用いてセルロースの分解を行った結果、分解効率に相乗効果が認められることが記載されている。
  非特許文献２には、トリコデルマ属の菌体起源のセルラーゼとアスペルギルス・アクレアータス起源のセルラーゼとを併用することにより、セルロースからの単糖精製能力に相乗作用を示すことが記載されている。
  しかしながら、アスペルギルス・アクレアータスは本来高いセルラーゼ分泌生産能を有し、アスペルギルス・カワチとは性質が異なっている。これらの従来技術では酵素剤が使用されており、コストが高く、操作が煩雑である。しかも、報告されている分解糖化効率は大規模に実施して採算が見込まれるレベルよりかなり低く、実用化を目的とする場合は効率が不十分である。
Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、５７巻、１５１～１５９頁、１９７９年 醗酵工学、６０巻、３３３～３４１頁、１９８２年
  本発明は上記従来の問題を解決するものであり、その目的とするところは、セルロース性物質を極めて効率よく、簡便、安価に酵素糖化する方法を提供することにある。
  本発明は、セルロース分解活性を示す、トリコデルマ（Trichoderma）属糸状菌培養液または上清液とアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）培養物との混合物、またはその乾燥物を提供するものであり、そのことにより上記目的が達成される。
　ある一形態においては、上記アスペルギルス・カワチ培養物は、培養液または上清液である。
  ある一形態においては、上記アスペルギルス・カワチ培養物は、固体培養物または抽出液である。
  ある一形態においては、上記トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液のセルラーゼ活性は５０Ｕ／ｍｌ以上であり、上記アスペルギルス・カワチ培養液、上清液または固体培養物抽出液のヘミセルラーゼ活性は５０Ｕｍｌ以上である。
  ある一形態においては、上記トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液と上記アスペルギルス・カワチ培養液、上清液または固体培養物抽出液との混合割合は、体積比で１０：９０～９０：１０の範囲である。
  ある一形態においては、上記トリコデルマ属糸状菌はトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）である。
  ある一形態においては、上記トリコデルマ属糸状菌はトリコデルマ・リーセイである。
  また、本発明は、上記混合物または乾燥物を用いてセルロース原料を糖化する工程を包含する、グルコースの製造方法を提供する。
  ある一形態においては、上記糖化は３０～７０℃及びｐＨ３～７の条件で行われる。
  本発明の糸状菌培養物混合物はセルロースを分解糖化する能力が非常に高い。そのため、セルロースの糖化にそのまま使用することができ、酵素剤を使用する必要がない。その結果、簡便な操作で安価にセルロースを糖化することができる。
  トリコデルマ属糸状菌はセルロースの糖化に必要なセルラーゼの酵素源として知られている。本発明に使用するトリコデルマ属糸状菌はセルラーゼを生産するものであれば特に限定されない。好ましいトリコデルマ属糸状菌はトリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデである。特に好ましくは、トリコデルマ・リーセイである。
  これらのトリコデルマ属糸状菌培養液または上清液は、アスペルギルス・カワチ培養物と組み合わせて使用すると、セルロース分解活性に相乗効果が認められる。この相乗効果を利用すれば、糸状菌培養液または上清液のセルロースの分解糖化能力を顕著に高めることができる。
  糸状菌トリコデルマ・リーセイおよびトリコデルマ・ビリデの菌学的性質は、例えば、イー・ジー・シモンズ，アブストラクト・セカンド・インターナショナル・マイコロジカル・コングレス（E.G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress） 米国フロリダ州タンパ，１９７７年８月，６１８頁）に記載されている。
  トリコデルマ属糸状菌の培養液または上清液は通常行われる方法で調製すればよい。すなわち、菌株の胞子、菌糸、または予め培養して得られた前培養液を液体培地に接種し培養する。例えば、胞子を培養する場合は、親株をポテトデキストロース寒天培地上で培養し、胞子を予め十分形成させることが好ましい。その際、培養温度は２０～３３℃、培養期間は４～１０日である。
  培地の炭素源としては、セルロースパウダー、セロビオース、瀘紙、一般紙類、オガクズ、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー粕、澱粉、ラクトース等が使用される。窒素源としては、硫安、硝安等の無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白分解物等の有機窒素含有物が使用される。無機塩類としては、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｆｅ２Ｃｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ等が使用される。必要ならば有機微量栄養物を含有する培地が使用される。
  液体培養には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、前記培地を使用して、培養温度２０～３３℃好ましくは、２８～３０℃、培養ｐＨ４～６で、４～１０日間培養する。このようにして、トリコデルマ属糸状菌培養液が得られる。ついでこの培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去してトリコデルマ属糸状菌培養上清液が得られる。
  トリコデルマ属糸状菌培養液または培養上清液に含まれる酵素類は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼが挙げられる。
  得られる培養液または培養上清液のセルラーゼ活性は１０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上、例えば５０～１５０Ｕ／ｍｌ、８０～１２０U／ｍｌ、より好ましくは約１００Ｕ／ｍｌである。培養液または培養上清液のセルラーゼ活性が１０Ｕ／ｍｌ未満であるとセルロースの分解に要する時間が増大する。
  尚、上記セルラーゼ活性は、カルボキシメチルセルロース（CMC）を基質として加水分解により生じた還元糖量を、ジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS）法により定量することができる。
  より具体的には、１％CMC基質溶液（シグマ社製low viscosityを１00ｍM酢酸緩衝液（ｐH5）に溶解）１ｍｌに培養液または培養上清液１ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（ジニトロサリチル酸０．７５％、水酸化ナトリウム１．２％、酒石酸ナトリウムカリウム４水和物２２．５％、乳糖１水和物０．３％を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止する。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱する。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量する。１単位のセルラーゼ活性は、１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表す。
  アスペルギルス・カワチは麹菌とも呼ばれ、古くから醸造や発酵食品の製造などに使われてきたカビ類であり、安全な微生物である。アスペルギルス属に属する微生物はα－アミラーゼを生産することが知られ、デンプンを糖化するのに用いられている。
  糸状菌アスペルギルス・カワチの菌学的性質は、例えば、麹学、村上英也編著、昭和62年3月25日、７８項に記載されている。
　アスペルギルス・カワチの培養物は通常行われる方法で調製すればよい。例えば、アスペルギルス・カワチの培養物は、固体培養を行って得られる固体培養物であってよく、液体培養を行って得られる培養液または上清み液であってもよい。また、このアスペルギルス・カワチの培養物は、固体培養物を水や食塩水などに浸して成分を抽出し、その後、濾過などして菌体などの不溶成分を除去して得られる、固体培養物抽出液であってもよい。
　尚、工業的規模で取り扱う場合の利便性を考慮すると、アスペルギルス・カワチの培養物は培養液または上清液が好ましい。
  アスペルギルス・カワチの液体培養を行う場合は、菌株の胞子、菌糸、または予め培養して得られた前培養液を液体培地に接種し培養する。例えば、胞子を培養する場合は、親株をポテトデキストロース寒天培地上で培養し、胞子を予め十分形成させることが好ましい。その際、培養温度は３０～４０℃、培養期間は３～７日である。
  使用できる炭素源は、マルトースまたはデンプンが好ましく、２％程度が適当である。窒素源としては、ペプトンが好ましく、０.５％程度が適当である。この他、イーストエキス、コーンスティープリカー、およびリン酸一カリウム、硫酸マグネシウム等を必要とする。ただし、上記の炭素源はマルトースあるいはデンプンが好ましいが、それ以外は通常のカビ類の培養培地であればいずれも適用可能である。
  液体培養には通常の通気撹拌培養装置が用いられ、前記培地を使用して、培養温度３０～４０℃、好ましくは、３５～３８℃、培養ｐＨ４～６で、２～４日間培養する。このようにして、アスペルギルス・カワチ培養液が得られる。ついでこの培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去してアスペルギルス・カワチ培養上清液が得られる。
　アスペルギルス・カワチの固体培養を行う場合は、菌株の胞子、菌糸を固体培地に接種し培養する。例えば、胞子を培養する場合は、親株をポテトデキストロース寒天培地上で培養し、胞子を予め十分形成させることが好ましい。その際、培養温度は３０～４０℃、培養期間は３～７日である。
　使用できる固体培地は、ふすまの他に米、大麦、粟、稗等の穀類や豆類等のでんぷん原料が好ましいが、特に好ましくはふすまが使用される。
  固体培養には焼酎麹の製造方法と同様、麹蓋等を用いる方法や機械製麹装置が用いられ、前記培地を蒸して菌株を接種し、培養温度３０～４０℃、好ましくは、３５～３８℃、培養ｐＨ４～６で、２～４日間培養する。このようにして、アスペルギルス・カワチ固体培養物が得られる。ついでこの培養物を水に浸して成分を抽出し、濾過により菌体を除去してアスペルギルス・カワチ固体培養濾過液が得られる。
  アスペルギルス・カワチ培養液または培養上清液、固体培養物または抽出液に含まれる酵素類は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼが挙げられる。
  得られる培養液、培養上清液または固体培養物抽出液のヘミセルラーゼ活性は１０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは５０Ｕ／ｍｌ以上、例えば５０～１５０Ｕ／ｍｌ、８０～１２０U／ｍｌ、より好ましくは約１００Ｕ／ｍｌである。培養液、培養上清液または固体培養物抽出液のヘミセルラーゼ活性が１０Ｕ／ｍｌ未満であるとセルロースの分解に要する時間が増大する。
  尚、上記ヘミセルラーゼ活性は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量することができる。
  より具体的には１％キシラン基質溶液（シグマ社製Xylan,from oat speltsを200ｍM酢酸緩衝液（ｐH4.5）に溶解）1.9ｍｌに培養液または培養上清液0.1ｍｌを加えて、４０℃にて正確に１０分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬（0.75％ジニトロサリチル酸、1.2％水酸化ナトリウム、22.5％酒石酸ナトリウムカリウム４水和物、0.3％乳糖１水和物を含む）４ｍｌを加えてよく混合し、反応を停止する。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で１５分間正確に加熱する。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量する。１単位のヘミセルラーゼ活性は、４０℃、１０分間の反応条件下で、1分間に１μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表す。
  トリコデルマ属糸状菌の培養液または培養上清液とアスペルギルス・カワチの培養物を混合して、本発明のセルロース分解活性を示す混合物が得られる。培養液も培養上清液も同様に、本発明の混合物の調製に用いることができる。尚、培養液は調製するのに菌体を除去する操作が不要であり、調製方法が簡便である。他方、培養上清液には菌体が実質的に存在せず、保存安定性に優れる。
  トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液とアスペルギルス・カワチ培養物との混合方法は特に制限されない。例えば、アスペルギルス・カワチ培養物が固体培養物である場合、固体培養物をそのままトリコデルマ属糸状菌培養液などに添加して混合してよく、または固体培養物抽出液をトリコデルマ属糸状菌培養液などと混合してもよい。また、例えば、アスペルギルス・カワチ培養物が液体培養物または上清液である場合、直接両者を混合すればよい。トリコデルマ属糸状菌培養液とアスペルギルス・カワチ培養物は、それぞれ濾過した後に混合しても、また混合後に濾過しても良い。
  トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液とアスペルギルス・カワチ培養液、上清液または固体培養物抽出液との混合割合は、体積比で、例えば１０：９０～９０：１０、好ましくは２０：８０～８０：２０、より好ましくは３０：７０～７０：３０、４０：６０～６０：４０、更に好ましくは５０：５０である。混合割合が１０：９０未満であったり、９０：１０を超えるとセルロースの糖化効率が低下する。また、この混合物は乾燥物とすることもでき、乾燥物は凍結乾燥など通常行なわれる方法で調製することができる。
  上記混合物を用いて、セルロース原料を分解し、糖化することができる。セルロースとは、グルコースがβ－１，４－グルコシド結合により重合した分子鎖若しくはその誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースなどの、カルボキシメチル化、アルデヒド化、若しくはエステル化などの誘導体化が為されたもの）、又はそれらが複数結合したもの（セルロース繊維など）を言う。
  セルロース原料は、セルロースを含有する水不溶性繊維質物質であることが好ましい。その由来は、植物性でも動物性でもよく、それを産生する動植物としては、例えば、バガス、ビール粕、木材、竹、麦わら、稲わら、コーンコブ、コットン、ラミー、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。
  これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム等の各種セルロース誘導体系原料のいずれでもよい。但し、得られるグルコースを医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
  セルロースの糖化方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース原料を水性媒体中に懸濁させ、上記混合物を添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。セルロース分解活性を示す上記混合物の代わりにその乾燥物、または乾燥物を水に分散もしくは溶解した液を用いてもよい。
  セルロース原料は、予め脱リグニンしておくことが好ましい。懸濁方法、攪拌方法、上記混合物の添加方法、添加順序、それらの濃度等の反応条件は、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整される。
  その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は３０～７０℃、ｐＨは３～７の範囲でよい。また、この圧力、温度、ｐＨについても、上記同様、グルコースがより高収率で得られるよう適宜調整されるものであるが、常圧で、酢酸またはリン酸緩衝液中で、温度５０～６０℃、ｐＨ４～６の範囲で行うことが好ましい。反応時間は一般に６～１４７時間、好ましくは２４～７２時間である。
  セルロースの糖化により、グルコースを含有する水溶液が得られる。得られた水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
  上記の方法で精製されたグルコースを主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
  以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
  実施例１
  トリコデルマ・リーセイQM9414（NBRC 31329）をポテトデキストロース寒天培地上で２８℃、７日間培養して胞子を充分形成させた。その１白金耳を、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名セオラス）：１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４：０．２ｇ、(ＮＨ４)２ＳＯ４：０．１４ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０３ｇ、ポリペプトン０．２ｇ、酵母エキス０．０５ｇ、ツイーン８０：０．１ｍｌ、微量元素液（Ｈ３ＢＯ４  ６ｍｇ、(ＮＨ４)６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ、ＦeＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、ＣuＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ４０ｍｇ、ＭnＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解及び懸濁した液）：０．１ｍｌ、水：１００ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接種して、２８℃、７日間振とう培養した。７日目に培養液を濾過し、上清液を得た。
  上述の方法により、得られた上清液のセルラーゼ活性を測定したところ、５０Ｕ／ｍｌであった。
  一方、アスペルギルス・カワチ（NBRC4308）をポテトデキストロース寒天培地上で３７℃、４日間培養して胞子を充分形成させた。その１白金耳を、小麦ふすま：３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ、水１００ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接種して、３７℃、３日間振とう培養した。３日目に培養液を濾過し、上清液を得た。
  上述の方法により、得られた上清液のヘミセルラーゼ活性を測定したところ、５０Ｕ／ｍｌであった。
  糖化に供するセルロース原料は、以下の方法で脱リグニン処理を行った。ビール粕、稲わら、麦わら、バガスをそれぞれ微粉砕し、０．３ＮのＮａＯＨに懸濁して、１２０℃、１５分間処理し、水で充分に洗浄後、乾燥した。セルロース粉末（日本製紙ケミカル製  商品名ＫＣフロックＷ－５０）は、そのまま糖化に供した。
  セルロース原料の糖化は、セルロース原料：０．３ｇ、トリコデルマ・リーセイ培養上清液：４．７５ｍｌ、アスペルギルス・カワチ培養上清液：４．７５ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（セルロース原料３％液）を５０℃、ｐＨ４．８、２４～４８時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースをグルコースＣII-テストワコー（和光純薬工業）で測定した。混合した培養上清液の替わりに、対照としてトリコデルマ・リーセイ培養上清液：９．５ｍｌ、アスペルギルス・カワチ培養上清液：９．５ｍｌをそれぞれ単独で用いた。その結果を図１～５にそれぞれ示す。
  実施例２
  トリコデルマ・リーセイ培養上清液とアスペルギルス・カワチ培養上清液の混合割合を変化させ、糖化効率を比較した。両培養上清液は実施例１と同様にして調製したものを用いた。
  バガス：１ｇ、培養上清液の混合物：８．８ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（バガス１０％液）を５０℃、ｐＨ４．８、２４時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースを測定した。結果を図６に示す。グラフの横軸に示された混合割合は体積比である。
  実施例３
  濾過を行わないこと以外は実施例１と同様にして、トリコデルマ・リーセイ培養液及びアスペルギルス・カワチ培養液を得た。次いで、両培養液の混合割合を変化させた各種混合物を調製し、糖化効率を比較した。
  セルロース粉末（商品名  ＫＣフロック）：１ｇ、培養液の混合物：８．８ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（セルロース粉末１０％液）を５０℃、ｐＨ４．８、２４時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースを測定した。結果を図７に示す。グラフの横軸に示された混合割合は体積比である。
  実施例４
  トリコデルマ・リーセイ培養上清液とアスペルギルス・カワチ培養上清液の混合割合を変化させ、糖化効率を比較した。両培養上清液は実施例１と同様にして調製したものを用いた。
  ビール粕：０．３ｇ、培養上清液の混合物：９．５ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（ビール粕３％液）を５０℃、ｐＨ４．８、２４時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースを測定した。結果を図８に示す。グラフの横軸に示された混合割合は体積比である。
  実施例５
  種々のアスペルギルス属糸状菌培養上清液について、トリコデルマ・リーセイ培養上清液と組み合わせて用い、糖化効率の相乗効果を比較した。トリコデルマ・リーセイ培養上清は実施例１と同様にして調製したものを用いた。
  アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori、NBRC4388）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger、NBRC31125）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi、ATCC11363）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae、RIB40）、アスペルギルス・アクレアータス（Aspergillus aculeatus、NBRC5330）をそれぞれポテトデキストロース寒天培地上で３７℃、４日間培養して胞子を充分形成させた。各々、その１白金耳を、小麦ふすま：３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ、水１００ｍｌを含む５００ｍｌ容バッフル付三角フラスコに接種して、３７℃、３日間振とう培養した。３日目に培養液を濾過し、それぞれ上清液を得た。
  セルロース粉末：０．５ｇ、アスペルギルス属糸状菌とトリコデルマ・リーセイ培養上清液の混合（混合比は５０：５０）：９．３ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（セルロース粉末５％液）を５０℃、ｐＨ４．８、２４時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースを測定した。対照として、混合した培養上清液の替わりに、トリコデルマ・リーセイ培養上清液：９．３ｍｌ、アスペルギルス属培養上清液：９．３ｍｌをそれぞれ単独で用いた。その結果を図９に示す。
  参考例１
  トリコデルマ属由来のセルラーゼについて、アスペルギルス・カワチ由来のセルラーゼとの相乗効果を調べた。トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ製剤（シグマ社）とトリコデルマ・ビリデ由来のセルラーゼ製剤（シグマ社）をそれぞれ水に溶解し、１％セルラーゼ液を調整した。脱リグニンバガス：０．５ｇ、１％セルラーゼ液：４．６５ｍｌ、アスペルギルス・カワチ培養上清液：４．６５ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（バガス５％液）を５０℃、ｐＨ４．８、２４時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースを測定した。アスペルギルス・カワチ培養上清液は実施例１と同様にして調製したものを用いた。
  対照として、混合した培養上清液の替わりに、１％セルラーゼ液：９．３ｍｌ、アスペルギルス・カワチ培養上清液：９．３ｍｌをそれぞれ単独で用いた。その結果を図１０に示す。
  これら、実施例及び参考例の結果から、トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液をアスペルギルス・カワチ培養液または上清液と組み合わせた場合にセルロース分解活性に相乗効果が認められ、糸状菌培養液または上清液のセルロースの分解糖化能力が顕著に高められた。
　実施例６
　実施例１と同様の方法でトリコデルマ・リーセイ培養上清液を得た。
　アスペルギルス・カワチ（NBRC4308）をポテトデキストロース寒天培地上で３７℃、４日間培養して胞子を充分形成させた。その１白金耳を、５０％水分に調整したふすま５０ｇを含むシャーレをオートクレーブで１２１℃、１５分間処理した培地に接種し、３６℃、３日間培養し固体培養物を得た。固体培養物に対して５倍重量の０．５％食塩水を加え、一晩放置後、濾過し菌体を除去して固体培養濾過液を得た。
　上述の方法により、得られた固体培養濾過液のヘミセルラーゼ活性を測定したところ、９０Ｕ／ｍｌであった。
　糖化に供するセルロース原料は、以下の方法で脱リグニン処理を行った。バガスをそれぞれ微粉砕し、０．３ＮのＮａＯＨに懸濁して、１２０℃、１５分間処理し、水で充分に洗浄後、乾燥した。セルロース粉末（日本製紙ケミカル製  商品名ＫＣフロックＷ－５０）は、そのまま糖化に供した。
　セルロース原料の糖化は、セルロース原料：０．６５ｇ、トリコデルマ・リーセイ培養上清液：４．６ｍｌ、アスペルギルス・カワチ固体培養濾過液：４．６ｍｌ、１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．８）：０．２ｍｌからなる液（セルロース原料６．５％液、培養上清液と固体培養濾過液の体積比は５０％：５０％）を５０℃、ｐＨ４．８、２４時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースをグルコースＣII-テストワコー（和光純薬工業）で測定した。混合した培養液の替わりに、対照としてトリコデルマ・リーセイ培養上清液：９．２ｍｌ、アスペルギルス・カワチ固体培養濾過液：９．２ｍｌｇをそれぞれ単独で用いた。その結果を図１１に示す。グラフの横軸に示された混合割合は体積比である。
ビール粕を糖化した場合に、反応時間に対して生成したグルコースの濃度をプロットしたグラフである。 稲わらを糖化した場合に、反応時間に対して生成したグルコースの濃度をプロットしたグラフである。 麦わらを糖化した場合に、反応時間に対して生成したグルコースの濃度をプロットしたグラフである。 バガスを糖化した場合に、反応時間に対して生成したグルコースの濃度をプロットしたグラフである。 セルロース粉末を糖化した場合に、反応時間に対して生成したグルコースの濃度をプロットしたグラフである。 トリコデルマ・リーセイ培養上清液とアスペルギルス・カワチ培養上清液の混合割合を変化させてバガスを糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。 トリコデルマ・リーセイ培養液とアスペルギルス・カワチ培養液の混合割合を変化させてセルロース粉末を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。 トリコデルマ・リーセイ培養上清液とアスペルギルス・カワチ培養上清液の混合割合を変化させてビール粕を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。 種々のアスペルギルス属糸状菌培養上清液をトリコデルマ・リーセイ培養上清液と組み合わせて用いてセルロース粉末を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。 ２種類のトリコデルマ属糸状菌由来セルラーゼ液をアスペルギルス・カワチ培養上清液と組み合わせて用いてセルロース粉末を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を比較したグラフである。 トリコデルマ・リーセイ培養上清液とアスペルギルス・カワチ固体培養濾過液を組み合わせてセルロース原料を糖化した場合に、生成したグルコースの濃度を示したグラフである。

Claims (9)

  1.   セルロース分解活性を示す、トリコデルマ（Trichoderma）属糸状菌培養液または上清液とアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）培養物との混合物、またはその乾燥物。
  2.   前記アスペルギルス・カワチ培養物が、培養液または上清液である請求項１記載の混合物、またはその乾燥物。
  3.   前記アスペルギルス・カワチ培養物が、固体培養物または抽出液である請求項１記載の混合物、またはその乾燥物。
  4.   前記トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液のセルラーゼ活性が５０Ｕ／ｍｌ以上であり、前記アスペルギルス・カワチ培養液、上清液または固体培養物抽出液のヘミセルラーゼ活性が５０Ｕ／ｍｌ以上である請求項１～３のいずれか記載の混合物、またはその乾燥物。
  5.   前記トリコデルマ属糸状菌培養液または上清液と前記アスペルギルス・カワチ培養液、上清液または固体培養物抽出液との混合割合が、体積比で１０：９０～９０：１０の範囲である請求項１～４のいずれか記載の混合物、またはその乾燥物。
  6.   前記トリコデルマ属糸状菌がトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）又はトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）である請求項１～５のいずれか記載の混合物、またはその乾燥物。
  7.   前記トリコデルマ属糸状菌がトリコデルマ・リーセイである請求項１～５のいずれか記載の混合物、またはその乾燥物。
  8.   請求項１～７のいずれか記載の混合物または乾燥物を用いてセルロース原料を糖化する工程を包含する、グルコースの製造方法。
  9.   前記糖化は３０～７０℃及びｐＨ３～７の条件で行われる請求項８記載の方法。
PCT/JP2009/053748 2008-03-28 2009-02-27 セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法 WO2009119252A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009801108561A CN101981178B (zh) 2008-03-28 2009-02-27 表现出纤维素水解活性的丝状真菌培养产物的混合物或其干品以及使用其生产葡萄糖的方法
EP09723651A EP2261318A4 (en) 2008-03-28 2009-02-27 MIXING OF FILAMENTOUS FUNGI CULTURES HAVING A DECOMPOSITION ACTIVITY OF THE CELLULOSE OR ITS DRIED PRODUCT, AND METHOD FOR PRODUCING GLUCOSE USING THE MIXTURE OR THE DRIED PRODUCT
JP2010505477A JPWO2009119252A1 (ja) 2008-03-28 2009-02-27 セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法
CA2719282A CA2719282A1 (en) 2008-03-28 2009-02-27 Mixture of culture products of filamentous fungi or dried product thereof, which exhibits cellulolytic activity, and method for producing glucose using the same
US12/934,924 US20110027839A1 (en) 2008-03-28 2009-02-27 Mixture of culture products of filamentous fungi or dried product thereof, which exhibits cellulolytic activity, and method for producing glucose using the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008086792 2008-03-28
JP2008-086792 2008-03-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009119252A1 true WO2009119252A1 (ja) 2009-10-01

Family

ID=41113458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/053748 WO2009119252A1 (ja) 2008-03-28 2009-02-27 セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20110027839A1 (ja)
EP (1) EP2261318A4 (ja)
JP (1) JPWO2009119252A1 (ja)
CN (1) CN101981178B (ja)
CA (1) CA2719282A1 (ja)
WO (1) WO2009119252A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011155933A (ja) * 2010-02-02 2011-08-18 Gekkeikan Sake Co Ltd バイオマスの糖化促進剤、糖化処理剤およびそれを用いた糖化処理方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006211966A (ja) * 2005-02-04 2006-08-17 Takara Shuzo Co Ltd 新規麹菌及びその用途
WO2007040008A1 (ja) * 2005-10-05 2007-04-12 Asahi Breweries, Ltd. 糸状菌培養物の製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006211966A (ja) * 2005-02-04 2006-08-17 Takara Shuzo Co Ltd 新規麹菌及びその用途
WO2007040008A1 (ja) * 2005-10-05 2007-04-12 Asahi Breweries, Ltd. 糸状菌培養物の製造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E.G. SIMMONS, ABST. 2ND INTERNATIONAL MYCOLOGICAL CONGRESS, August 1977 (1977-08-01), pages 618
HAKKOKOGAKU, vol. 60, 1982, pages 333 - 341
HIDEYA MURAKAMI: "Koji-gaku", 25 March 1987, pages: 78
J. FERMENT. TECHNOL., vol. 57, 1979, pages 151 - 159
See also references of EP2261318A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011155933A (ja) * 2010-02-02 2011-08-18 Gekkeikan Sake Co Ltd バイオマスの糖化促進剤、糖化処理剤およびそれを用いた糖化処理方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2719282A1 (en) 2009-10-01
CN101981178A (zh) 2011-02-23
EP2261318A4 (en) 2012-07-04
EP2261318A1 (en) 2010-12-15
US20110027839A1 (en) 2011-02-03
JPWO2009119252A1 (ja) 2011-07-21
CN101981178B (zh) 2012-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011024667A1 (ja) 廃菌体を用いたβ－グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
Ahmed et al. Bioprocessing of proximally analyzed wheat straw for enhanced cellulase production through process optimization with Trichoderma viride under SSF
CN111304183A (zh) 一种纤维素酶的发酵方法
JP4025848B2 (ja) セルロース原料の分解方法
CN112593437A (zh) 一种木质素的生物降解方法
WO2009119252A1 (ja) セルロース分解活性を示す糸状菌培養物混合物またはその乾燥物、及びそれらを用いるグルコースの製造方法
CN110894522A (zh) 一种玉米皮水解产物及其在发酵制备苏氨酸中的应用
Guerfali et al. Hydrolytic potential of Talaromyces thermophilus β-xylosidase and its use for continuous xylose production
JP4343266B1 (ja) β−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
WO2011021612A1 (ja) 小麦ふすまを用いたβ－グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
CN105803019A (zh) 一种自制酶液生产壳寡糖的方法
Sutaoney et al. Current perspective in research and industrial applications of microbial cellulases
JP5599991B2 (ja) 果実の絞り粕を用いたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
Bharathi et al. Efficacy of cellulose degrading bacteria from soil in production of cellulase from corn waste
JP5502388B2 (ja) 麦茶抽出粕を用いたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
JP6325214B2 (ja) セルラーゼの製造方法及び液体培地
ANJANA ISOLATION OF CELLULASE ENZYME BY ASPERGILLUS NIGER FROM SUGARCANE BAGASSE
JP2010081826A (ja) セルラーゼ生産菌用培地、セルラーゼ生産菌の培養方法、及びセルロースの糖化方法
WO2010116545A1 (ja) ビール粕を用いたβ－グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
JP6086280B2 (ja) バイオマスの処理方法
CN111500559A (zh) 一种纤维素酶发酵调控剂及应用
CN109837263A (zh) 用于产纤维素酶的混合菌剂的培养基及其制备方法
JPH10295372A (ja) β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途
JP2010142221A (ja) β−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地
Shiahmorteza et al. Cellulase production by Trichoderma reesei (CBS383. 73) and an isolated Botrytis strain using several agricultural wastes

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980110856.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09723651

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010505477

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009723651

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2719282

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12934924

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE