JP5502388B2 - 麦茶抽出粕を用いたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地 - Google Patents
麦茶抽出粕を用いたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法及び液体培地 Download PDFInfo
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Description
本発明の液体培地はセルロース分解酵素を生産する微生物、例えば、トリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニウム属、スポロトリクム属、ペニシリウム属、タラロマイセス属、フミコラ属、ネオカリマスチクス属、サーモマイセス属又はクロストリディウム属、ストレプトマイセス属に属する微生物が生育する栄養を含んでいる。
麦茶抽出粕:5g、(NH4)2SO4:0.14g、KH2PO4:1.5g、CaCl2・2H2O:0.03g、MgSO4・7H2O:0.03g、コーンスティープリカー:2mL、ツイーン80:0.1mL、微量元素液(H3BO4 6mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 26mg、FeCl3・6H2O 100mg、CuSO4・5H2O 40mg、MnCl2・4H2O 8mg、ZnSO4・7H2O 200mg液):0.1mL、水:100mLを含む(燐酸又は水酸化ナトリウムでpH4.8に調整)
本発明に使用するトリコデルマ属に属する微生物はセルロースの糖化に必要なセルラーゼを生産するものであれば特に限定されない。好ましいトリコデルマ属に属する微生物はトリコデルマ属糸状菌であり、具体的にはトリコデルマ・リーセイ又はトリコデルマ・ビリデである。特に好ましくは、トリコデルマ・リーセイである。
本発明の方法により得られたβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼは、セルロース資源を分解又は糖化するのに有用である。ここでいうセルロース資源は、合成セルロースもしくは天然セルロース資源のどちらでも良い。合成セルロースとは、セルロース粉末として、流通しているものを表す。天然セルロース資源とは、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕、木材などが挙げられる。本発明は、β−グルカナーゼおよびキシラナーゼを同時に高生産できるため、特に、バガス、稲わら、麦わら、ビール粕などの天然セルロース資源の糖化に優れている。
丸つぶ麦茶(アサヒビールモルト社製)及び沸騰させた湯を用いて、麦茶を煮出した。水溶液である麦茶を除去し、残された粕を水洗し乾燥させて、麦茶抽出粕を得た。
前記で得られた培養液について酵素活性を測定した。
β−グルカナーゼ活性は、メガザイム社製のβ‐グルカナーゼ測定キットを用い、色素標識したβ−グルカンを基質とした酵素分解によって生じた染色断片を吸光度測定した。具体的には、アゾ大麦グルカン基質溶液0.1mLに培養液0.1mLを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、停止液〔4%酢酸ナトリウム、0.4%酢酸亜鉛、80%メチルセルソルブを含む(pH5)〕0.6mLを加えて5分放置し、反応を停止した。続いて遠心分離した後、上澄液を590nmの吸光度測定した。1単位のβ−グルカナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕5%(5g/100mL)に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを塩化アンモニウムに置き換えてアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ20mM、40mM、50mM、60mM、80mM、100mMまたは120mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図2に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕5%(5g/100mL)に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを燐酸二アンモニウムに置き換えてアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ15mM、30mM、45mM、60mM、80mM、100mMまたは115mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図3に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕5%(5g/100mL)に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムをロイシンに置き換えてアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ8mM、15mM、23mM、31mM、38mM、46mMまたは53mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図4に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕5%(5g/100mL)に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムを尿素に置き換えてアミノ態窒素のモル濃度がそれぞれ17mM、33mM、50mM、67mM、83mMまたは100mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図5に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕に置き換えて濃度が1%、2%、3%、4%、5%、6%または7%になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が480mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図6に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースの濃度を1%とし、窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mMまたは115mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図7に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロース濃度が1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%または4%になるように添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度が160mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図8に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕2%(2g/100mL)に置き換えて添加して、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ15mM、35mM、50mM、65mM、80mM、100mMまたは115mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図9に示す。
マンデル培地の炭素源である結晶セルロースを実施例1と同様にして得た脱リグニン処理した麦茶抽出粕5%(5g/100mL)に置き換えて、また窒素源である硫酸アンモニウムのアンモニア態窒素のモル濃度がそれぞれ330mM、420mM、500mM、580mM、660mM、720mMまたは800mMになるように添加して実施例1と同様に液体培地を用意した。トリコデルマ・リーセイQM9414(NBRC 31329)をポテトデキストロース寒天培地上で28℃、7日間培養して胞子を充分形成させ、この1白金耳を液体培地に接種して、28℃、180rpm、7日間振とう培養した。7日目に培養液を遠心分離し、実施例1と同様にしてβ−グルカナーゼ活性およびキシラナーゼ活性を測定した。結果を図10に示す。
実施例1で得られた培養上清液(5%麦茶抽出粕、アンモニア態窒素が100mMの硫安)および参考例2で得られた培養上清液(1%アビセル培地、アンモニア態窒素が100mMの硫安)を用いて、セルロース原料の糖化試験を行った。糖化に供するセルロース原料は、以下の方法で脱リグニン処理を行った。稲わらおよびビール粕をそれぞれ微粉砕し、0.3NのNaOHに懸濁して、120℃、15分間処理し、水で充分に洗浄後、乾燥した。セルロース原料の糖化は、セルロース原料:0.3g、培養上清液:9.5mL、1M酢酸バッファー(pH4.8):0.2mLからなる液(セルロース原料3%液)を50℃、pH4.8、48時間、振とうさせて糖化し、生成したグルコースをグルコースCII−テストワコー(和光純薬工業)で測定した。結果を図11および図12に示す。
Claims (11)
- (a)炭素源として麦茶抽出粕、及び(b)窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地を用いて、トリコデルマ属に属する微生物を培養する工程を包含するβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 前記麦茶抽出粕の前記液体培地中における濃度が3%W/V以上である請求項1に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 前記麦茶抽出粕の前記液体培地中における濃度が4〜15%W/Vである請求項1又は2に記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 前記アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の前記液体培地中における濃度が30〜660mMである請求項1〜3のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 前記アンモニア態窒素又はアミノ態窒素の前記液体培地中における濃度が40〜580mMである請求項1〜4のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 前記トリコデルマ属に属する微生物が、トリコデルマ・リーセイである請求項1〜5のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 培養の過程において前記液体培地に対して麦茶抽出粕を追加する請求項1〜6のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- 前記麦茶抽出粕が、六条大麦、二条大麦又はこれらの混合物を含むものである請求項1〜7のいずれかに記載のβ−グルカナーゼ及びキシラナーゼの製造方法。
- (a)炭素源として麦茶抽出粕、及び(b)窒素源としてアンモニア態窒素又はアミノ態窒素を含む液体培地であって、トリコデルマ属に属する微生物を培養するために用いられる液体培地。
- 前記麦茶抽出粕を3%W/V以上含有する請求項9に記載の液体培地。
- アンモニア態窒素又はアミノ態窒素を30〜660mM含有する請求項9又は10に記載の液体培地。
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