WO2007040008A1 - 糸状菌培養物の製造方法 - Google Patents

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WO2007040008A1 PCT/JP2006/317506 JP2006317506W WO2007040008A1 WO 2007040008 A1 WO2007040008 A1 WO 2007040008A1 JP 2006317506 W JP2006317506 W JP 2006317506W WO 2007040008 A1 WO2007040008 A1 WO 2007040008A1
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enzyme
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filamentous fungus
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Toshikazu Sugimoto
Hiroshi Shoji
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Asahi Breweries, Ltd.
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    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a filamentous fungus culture using a liquid medium, in particular, by culturing filamentous fungi while controlling the release rate of nutrients in the culture raw material to the culture system.
  • the present invention relates to a method for producing a filamentous fungus culture for adjusting enzyme productivity of nutrients.
  • koji molds which are a type of filamentous fungi
  • the culture form is based on a solid culture method in which koji molds are grown on the cereal surface and is called the solid koji method.
  • Such a method using a solid koji is a traditional production method, but it is a method unsuitable for large-scale production because it is a special culture form called solid culture.
  • liquid koji which is a koji mold culture obtained by liquid culture of koji mold, is easy to control culture and is a culture method suitable for efficient production. It is well known that enzymes necessary for the production of products cannot be obtained sufficiently (see Non-Patent Documents 1 to 4), and there have been few examples used in actual production so far.
  • Non-Patent Document 1 Hata Y. et. A1 .: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)
  • Non-Patent Document 2 Hata Y. et. Al .: Gene., 207, 127-134 (1998)
  • Non-Patent Document 3 Ishida H. et.al .: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)
  • Non-Patent Document 4 Ishida H. et. Al: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)
  • Non-Patent Document 5 Bhargava S. et al: Biotechnol Bioeng., 82 (1), 111-7 (2003)
  • Non-Patent Document 6 Pedersen H. et al: Appl Microbiol Biotechnol, 53 (3): 272-7 ( 2000)
  • Patent Literature 1 Japanese Patent Publication No. 5-68237
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 6-53059
  • An object of the present invention is a liquid medium using at least one kind selected from cereals, beans, cocoons, amaranthus, and quinukaka as a culture raw material, and culturing nutrients in cereal as a culture raw material.
  • the present inventors have adjusted the whitening ratio when using a raw material with husk as the raw material of the liquid medium, thereby adjusting the nutrition ratio. of It has been found that the release rate of glucose, which is one glucose, can be controlled. In addition, as a result of culturing filamentous fungi using raw materials with different polishing ratios, it was found that enzyme productivity in filamentous fungal cultures can be controlled by polishing ratio.
  • the present inventors cultivated koji molds in a liquid medium containing a starch raw material or husk and a non-alphanized starch raw material, thereby producing Darco required for the production of fermented foods and drinks. It was found that a liquid koji containing a large amount of amylase and acid-resistant ⁇ - amylase can be produced. This is because even if the raw material is not encased in husk or husk, the release of sugars and amino acids to the culture system that is difficult to be decomposed unless it is pregelatinized, results in the necessary enzyme activity. This is expected.
  • the present inventors have completed the present invention based on these findings.
  • the present invention uses a liquid medium containing at least one kind selected from cereals, beans, potatoes, amaranthus, and quinuca as a culture raw material.
  • a method for producing a filamentous fungus culture characterized in that the enzyme productivity of the filamentous fungus culture is adjusted by culturing the filamentous fungus while controlling the release rate of the nutrient to the culture system.
  • the present invention according to claim 2 uses a cereal in which the whole or a part of the surface is covered with at least a husk as a culture raw material, and adjusts the milling rate of the cereal, thereby cultivating the nutrients in the cereal. 2.
  • the present invention controls the rate of release of nutrients in the culture raw material into the culture system by using the raw material from which the husk or hull has been removed and not pre-gelatinized as the culture raw material.
  • the present invention according to claim 4 uses a liquid medium that has undergone a sterilization process including a heat treatment step, and adjusts the inorganic salt concentration of the liquid medium during the heat treatment, thereby culturing nutrients in the culture raw material.
  • the present invention according to claim 5 is the filamentous shape according to claim 1, wherein the nutrient is a sugar derived from starch in the culture raw material and an amino acid derived from koji or protein in the culture raw material. This is a method for producing a fungus culture.
  • the present invention according to claim 6 is the method for producing a filamentous fungus culture according to claim 1, wherein the enzyme is at least one selected from starch degrading enzyme, plant fiber degrading enzyme, and protein degrading enzyme power. is there.
  • the present invention according to claim 7 is the method for producing a filamentous fungus culture according to claim 1, wherein the filamentous fungus is at least one selected from Neisseria gonorrhoeae, Trichoderma spp. And white rot fungi.
  • the present invention according to claim 8 is a filamentous fungus culture obtained by the method according to any one of claims 1 to 7.
  • the present invention according to claim 9 is a method for producing an enzyme agent using the filamentous fungus culture according to claim 8.
  • the present invention according to claim 10 is an enzyme agent obtained by the method according to claim 9.
  • the present invention according to claim 11 uses a liquid medium containing at least one selected from cereals, beans, potatoes, amaranthus, and quinuaka as a culture raw material, and supplies nutrients in the culture raw material to the culture system.
  • An enzyme production method comprising adjusting the enzyme productivity of a filamentous fungus culture by culturing the filamentous fungus while controlling a release rate.
  • the present invention according to claim 12 is an enzyme obtained by the method according to claim 11.
  • the present invention according to claim 13 is a method for producing a fermented food or drink product using the filamentous fungus culture according to claim 8.
  • the present invention according to claim 14 is a method for producing a fermented food or drink product using the enzyme agent according to claim 10.
  • the present invention according to claim 15 is a method for producing a fermented food or drink product using the enzyme according to claim 12.
  • the present invention according to claim 16 is a fermented food or drink obtained by the method according to any one of claims 13 to 15.
  • the concentration of nutrients such as sugars and amino acids in the culture system is kept low, and Fermentation The raw productivity can be adjusted.
  • roses containing darcoamylase and acid-resistant a- amylase necessary for the production of fermented foods and beverages such as baking are used using raw materials to which the husks and skins are not attached. Can be produced.
  • the same raw material can be used in the liquid koji manufacturing process and the fermentation process, and the manufacturing cost can be reduced.
  • wheat hulls and straw may have a negative effect on the quality of sake.
  • the raw material is used without heating, it also saves energy.
  • the strength of fermented foods and beverages can be easily increased by using filamentous fungus cultures produced by combining filamentous fungus cultures using various raw materials and filamentous strains.
  • the culture method of the present invention is considered to be a new culture mode that has not been reported so far.
  • liquid culture can be controlled more strictly than solid culture, according to the present invention, a filamentous fungus culture with stable quality can be produced at low cost.
  • FIG. 1 is a graph showing the change over time in the glucose concentration in a reaction solution when a barley substrate solution of each milling ratio and a koji mold supernatant were reacted.
  • FIG. 2 is a graph showing the rate of glucose release during the first hour when the barley substrate solution and the koji mold culture supernatant solution at each milling ratio are reacted.
  • FIG. 3 is a diagram showing the enzyme activity in a white koji mold culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • A shows the enzyme activity of darcoamylase (white bar) and oc-amylase (black bar), and
  • B shows the enzyme activity of acid-resistant ⁇ -amylase.
  • FIG. 4 is a diagram showing the enzyme activity in a white birch culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • ( ⁇ ) shows cellulase activity
  • ( ⁇ ) shows enzyme activity of / 3-Darcosidase.
  • FIG. 5 is a graph showing darcoamylase activity (GA) in a black koji mold culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • FIG. 6 is a graph showing oc-amylase activity ( ⁇ ) in a black koji mold culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • FIG. 7 is a diagram showing acid-resistant ⁇ -amylase activity (ASAA) in a black koji mold culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • ASAA acid-resistant ⁇ -amylase activity
  • FIG. 8 is a graph showing dalcamylase activity (GA) in a koji mold culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • FIG. 9 is a graph showing oc-amylase activity ( ⁇ ) in a koji mold culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • FIG. 10 is a graph showing cellulase activity (CEL) in Trichoderma viride culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • CEL cellulase activity
  • FIG. 11 is a graph showing cellulase activity (CEL) in a Trichoderma reesei culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • CEL cellulase activity
  • FIG. 12 Trichoderma reesei culture using barley of each milling ratio as a raw material It is a figure which shows xylanase activity (XYL).
  • FIG. 13 is a diagram showing ⁇ -darcosidase activity (BGL) in Trichoderma reesei culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • FIG. 14 is a graph showing cellulase activity (CEL) in Aspergillus achillaetus culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • CEL cellulase activity
  • FIG. 15 is a diagram showing ⁇ -darcosidase activity (BGL) in Aspergillus achillaetus culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • BGL ⁇ -darcosidase activity
  • FIG. 16 is a graph showing cellulase activity (CEL) in a white rot fungus culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • CEL cellulase activity
  • FIG. 17 is a graph showing xylanase activity (XYL) in a white rot fungus culture using barley of each milling ratio as a culture raw material.
  • FIG. 18 is a diagram showing the glucose concentration in a reaction solution when a barley substrate solution having a different salt concentration during sterilization and a koji mold culture supernatant are reacted.
  • FIG. 19 is a diagram showing dalcamylase activity (GA) in a white koji mold culture using liquid media with different salt concentrations during sterilization.
  • FIG. 20 is a view showing acid-resistant a-amylase activity (ASAA) in a white koji mold culture using liquid media having different salt concentrations during sterilization.
  • ASAA acid-resistant a-amylase activity
  • the present invention according to claim 1 relates to a method for producing a filamentous fungus culture, using a liquid medium containing at least one selected from cereals, beans, potatoes, amaranthus, and quinua force as a culture raw material.
  • the enzyme productivity of the filamentous fungus culture is adjusted by culturing the filamentous fungus while controlling the release rate of nutrients in the raw material to the culture system.
  • the concentration of nutrients such as sugars and amino acids in the culture system is kept low by controlling the release rate of nutrients contained in the culture raw material to the culture system. Enzyme activity in nutrients is enhanced.
  • cereal refinement can be used.
  • Method by adjusting white ratio, method of using beans, potatoes, amaranthus or quinua with attached hulls as culture raw material, method of using culture raw material from which husk or hull has been removed but not hatched, liquid Examples include methods by adjusting the concentration of inorganic salts when heat-treating the medium, and methods of artificially forming an edible film on the cereal surface to protect cereal starches and cereal proteins. It is not limited. It is also possible to control the nutrient release rate by suppressing physical disruption of the culture raw material in the culture solution. For example, by using a culture device with weak stirring shear force, the nutrient release rate can be reduced. Can be suppressed.
  • examples of enzymes produced by filamentous fungi include a group of enzymes whose productivity is catabolite-suppressed by the concentration of sugars such as glucose and proteolysates such as amino acids in the culture system. it can. Specifically, starch-degrading enzymes such as dalcoamylase, acid-resistant ⁇ -amylase, and a-amylase; plant fiber-degrading enzymes such as cellulase, xylanase, and 13-darcosidase; and protein degradation such as protease, peptidase, and daltaminase. Forces S, including enzymes, are not necessarily limited to these.
  • the culture raw materials include barley, rice, wheat, buckwheat, shrimp, millet, millet, corn, corn and other grains, soybeans, red beans and other beans, sweet potatoes such as sweet potato, amaranth, Mince grains such as quinoa can be used.
  • amaranthus is a general term for a plant belonging to the genus Huaceae, and in cereals, the content of lysine, which is one of the amino acids having a high protein content, is comparable to that of soybean. It is a highly nutritious grain that contains more calcium, iron and fiber than milled rice, and the country of origin is a specific region in Latin America, India, Himalayas, and Nepal.
  • Quinua is an annual plant of the Agasaceae family and is cultivated mainly in the highlands of southern Peru and the Andes Mountains of western Peru and is rich in minerals, vitamins, proteins and dietary fiber.
  • These culture raw materials can be used alone or in combination of two or more. Moreover, the shape of these raw materials is not specifically limited.
  • the culture raw material is mixed with water to prepare a liquid medium.
  • the mixing ratio of the culture raw material is determined by the target enzyme to be accumulated in the filamentous fungus culture. It is prepared so that it is selectively generated and accumulated.
  • a liquid medium containing 1-20% (wZvol) of brown barley with respect to water is used.
  • wZvol 1-20%
  • unpolished barley is used as brown wheat, it is more preferably prepared in a liquid medium supplemented with 8 to 10% (w / vol). More preferably, it is prepared in a liquid medium supplemented with 1 to 4% (w / vol).
  • the amount of rice is 1 to 20% (w / vol), preferably 5 to 13% (w / vol), more preferably 8 to 10 with respect to water. Prepared in a liquid medium supplemented with% (w / vol).
  • beans When beans are used as a culture raw material, beans are 1 to 10% (w / vol), preferably 8 to 10% (w / vol) for soybeans, 1 for beans. Prepared in liquid medium supplemented with ⁇ 2% (w / vol). In addition, when moss is used as a culture raw material, it is prepared in a liquid medium with moss 1 to 10% (w / vol) added to water.
  • amaranth when used as a culture raw material, it is 1.5 to 15% (wZ vol), preferably 2 to 10% (w / vol), more preferably 2 to 8% based on water. (w / vol) Prepared in a liquid medium.
  • wZ vol 1.5-7%
  • wZvol 1.5-7%
  • 2-6% w / vol
  • 2-4% w / vol
  • the optimum blending and usage amount varies depending on the target enzyme, the degree of whitening of the raw material used, the filamentous strain used, the type of raw material, etc., and may be arbitrarily selected.
  • white fungi such as Aspergillus kawachii as filamentous fungi, and Aspergillus awamori, Aspergillus awamori
  • Aspergillus niger Aspergillus niger
  • sodium nitrate, potassium nitrate or the like can be used as the nitrate, and potassium nitrate is particularly preferable.
  • potassium dihydrogen phosphate, ammonium phosphate or the like can be used, and potassium dihydrogen phosphate is particularly preferable.
  • magnesium sulfate heptahydrate, iron sulfate heptahydrate, ammonium sulfate and the like can be used, and magnesium sulfate heptahydrate and iron sulfate heptahydrate are particularly preferable.
  • These inorganic salts can be used in combination of multiple types.
  • the concentration of the inorganic salt in the liquid medium in the case of using the above-described white koji mold or black koji mold is such that darcoamylase and acid-resistant ⁇ -amylase are selectively produced and accumulated in the koji mold culture. Adjusted to things. Specifically, in the case of nitrate from 0.1 to 2.0%, good Mashiku ⁇ or 0.2 to 1.5 0/0, when the phosphate ⁇ or 0. 05-1. 0 0 / 0, preferably ⁇ or 0.1 to 0.5 0/0, when the sulfate 0.5 01-0. 5%, preferably 0.1 02-0. 1% (both w / vol).
  • nitrate, phosphate, and sulfate together in a liquid medium.
  • sodium nitrate, potassium nitrate, or the like can be used as the nitrate, and sodium nitrate is particularly preferable.
  • phosphate potassium dihydrogen phosphate, ammonium phosphate, and the like can be used, and potassium dihydrogen phosphate is particularly preferable.
  • magnesium sulfate heptahydrate, iron sulfate heptahydrate, ammonium sulfate and the like can be used, and magnesium sulfate heptahydrate and iron sulfate heptahydrate are particularly preferable.
  • These inorganic salts can also be used in combination of multiple types.
  • the concentration of the inorganic salt in the liquid medium in the case of using the yellow koji mold is adjusted so that darcoamylase and acid-resistant ⁇ -amylase are selectively generated and accumulated in the koji mold culture. Is done. Specifically, 0.1 to 2.0% in the case of nitrate, preferably 0.2 to 1.5%, 0.05 to 0% in the case of zincate, preferably 0.1 to 0.5%, in the case of sulfate, 0.01-0. 5%, preferably 0.02-0. 1%.
  • organic substances other than the above-mentioned inorganic salts, inorganic salts, and the like can be appropriately added as nutrient sources. These additives are commonly used for the cultivation of filamentous fungi. There are no particular limitations as long as the organic substances are used, but organic substances include rice bran, wheat straw, corn steep liquor, soybean meal, defatted soybeans, etc., and inorganic salts such as ammonium salt, potassium salt, strong sucrose salt, Water-soluble compounds such as magnesium salts can be mentioned, and two or more kinds of organic substances and Z or inorganic salts may be used at the same time.
  • the amount of these additives is not particularly limited as long as it promotes the growth of filamentous fungi, but is about 0.1 to 5% (w / vol) for organic substances and 0.1 to 1% (inorganic salts). It is preferable to add about w / vol).
  • additives such as antibiotics and preservatives can be used in the liquid medium as necessary.
  • the inorganic salt concentration of the liquid medium during the heat treatment is appropriately adjusted. This also makes it possible to control the release rate of nutrients in the culture raw material into the culture system.
  • the release of nutrients in the culture raw material into the culture system can be suppressed by increasing the inorganic salt concentration of the liquid medium during the heat treatment. This is considered to be because the physical collapse of the raw material is suppressed by heating the raw material in the presence of an inorganic salt.
  • the inorganic salt is not particularly limited. As described above, the power that can be used in the liquid medium for filamentous fungi can be used. Nitrate, phosphate, and sulfate are more preferable. In addition, the inorganic salt concentration in the liquid medium during the heat treatment can be about 1 to 10 times the suitable concentration in the liquid medium described above.
  • the inorganic salt concentration in the liquid medium during the heat treatment exceeds the concentration range suitable for the cultivation of filamentous fungi, dilute it after the heat treatment, adjust the inorganic salt concentration as appropriate, and then subject to culture. be able to.
  • the heat treatment conditions may be 80 to 130 ° C, preferably 100 to 121 ° C, 5 to 120 minutes, preferably 10 to 30 minutes. Especially by autoclave etc. It is preferable to use 110 to 121 ° C for 5 to 20 minutes, which are general liquid medium heat sterilization conditions, because the medium can be sterilized at the same time.
  • filamentous fungi are inoculated into the liquid medium.
  • a filamentous fungus that produces an enzyme that is catabolite-suppressed by the concentration of nutrients such as sugars and amino acids in the culture system can be widely used.
  • Aspergillus spp. For example, Aspergillus kawachii and the like, Aspergillus oryzae Aspergillus sojae and Aspergillus sojae Examples include Aspergillus awamori, Aspergillus niger and other Aspergillus, such as Aspergillus niger, and Aspergillus aculeatus.
  • Specific examples of the genus Trichoderma include cellulase-producing bacteria such as Trichoderma viride and Trichoderma reesei.
  • filamentous fungi can be used either by culturing with one kind of strain or by culturing with two or more kinds of the same or different kinds of strains. There is no problem whether these are used in the form of spores or mycelia obtained by preculture, but it is preferable to use mycelia because the time required for the logarithmic growth phase is shortened.
  • the amount of filamentous fungus inoculated into the liquid medium is not particularly limited, but about 1 X 10 4 to 1 X 10 6 spores per ml of liquid medium, or 0.1 to 10 It is preferable to inoculate about 10%.
  • the culture temperature of the filamentous fungus is not particularly limited as long as it does not affect the growth, but it is preferably 25 to 45 ° C, more preferably 30 to 40 ° C. When the culture temperature is low, the growth of filamentous fungi is slowed down, and contamination with various germs is likely to occur.
  • the culture time is preferably 24 to 120 hours.
  • the culture apparatus is only required to be able to perform liquid culture. However, since filamentous fungi need to be aerobically cultured, it is necessary to perform them under aerobic conditions in which oxygen and air can be supplied into the medium. is there. Further, during the culture, it is preferable to stir so that the raw materials, oxygen, and filamentous fungi in the medium are uniformly distributed in the apparatus. As long as the agitation conditions and the air flow rate are conditions that can keep the culture environment aerobic, However, it may be appropriately selected depending on the culture apparatus, the viscosity of the medium, and the like.
  • the present invention according to claim 2 is the above-described method for producing a filamentous fungus culture, wherein a cereal in which all or a part of the surface is covered with at least a husk is used as a culture raw material. By adjusting the rate, the release rate of nutrients in cereals into the culture system is controlled.
  • the shape of the cereal it is necessary that the whole or a part of the surface is covered with at least the husk, and the unmilled product, or at least the husk is left on the surface of the grain, More than a whitening ratio that has been polished to a certain extent can be used, and brown rice, brown wheat, etc. can also be used.
  • the unpolished milling rate is 100%, or the unmilled milling rate is 100%, and the unmilled milling rate (100%) is used to develop the barley grain ratio (general In other words, it is a ratio obtained by subtracting 7-8%), that is, a polishing rate of about 92-93%.
  • the present invention by adjusting the milling rate of cereals, the release rate of nutrients to the culture system is controlled, and the enzyme activity in the filamentous fungus culture is enhanced. Therefore, the one with the best milling ratio is selected according to the enzyme to be produced and the type of raw grain. For example, when producing dalcore amylase and acid-resistant ⁇ -amylase, and using barley as a raw material, the milling ratio is 90-100%, preferably 98%, so that both enzymes are balanced. High production can be achieved.
  • the milling ratio refers to the proportion of cereals that remain after cerealing, and for example, 90% milling ratio means that 10% of the skin of the surface layer of the cereal is scraped off.
  • the unpolished barley includes unmilled wheat to one that has been polished to such an extent that the husk is left on the surface of the grain, that is, one having a polishing ratio of 90% or more.
  • the husk is the outer part of the grain that covers the surface of the grain.
  • the starch contained in the cereals may be gelatinized before being cultured.
  • the starch gelatinization method is not particularly limited, and may be performed according to conventional methods such as a steaming method and a roasting method. In the sterilization process of the liquid medium, which will be described later, when the starch is heated to a temperature higher than the gelatinization temperature by high-temperature high-pressure sterilization or the like, the starch paste is simultaneously performed by this treatment.
  • the liquid medium of the present invention according to claim 2 is water, the above-described culture raw material, and other media. Prepared by mixing the ingredients. There is no particular limitation on the processing method in which the liquid medium may be sterilized as necessary. An example is the high-temperature, high-pressure sterilization method, which is performed at 121 for 15 minutes.
  • the present invention according to claim 3 is the above-described method for producing a filamentous fungus culture, by using a raw material from which the husk or hull has been removed and which has not been pregelatinized as a culture raw material.
  • the release rate of nutrients in the culture raw material to the culture system is controlled.
  • the culture raw material is removed from the husk or hull and is not pregelatinized.
  • barley milling ratio 65%
  • threshing, milling, peeling, washing, shredding, shredding, freezing, etc. can be performed.
  • the blending ratio of the culture raw material in the liquid medium is such that darcoamylase and acid-resistant hyaamylase are selectively generated and accumulated in the filamentous fungus culture. To the extent that it is done. Specifically, 1 to 10% (w / vol), preferably 2 to 6% (w / vol) of culture raw material may be added to the liquid medium.
  • the optimum blending ratio varies depending on the factors, etc., and may be appropriately selected in consideration of these.
  • the amount of culture material used exceeds the upper limit, when aerobic filamentous fungi are used, the viscosity of the culture solution becomes high, and the supply of oxygen and air necessary for aerobic cultivation of the filamentous fungi becomes insufficient. This is not preferable because the oxygen concentration in the product is lowered and the culture becomes difficult to proceed.
  • the amount of the raw material used is less than the lower limit value, darcoamylase and acid-resistant ⁇ -amylase are not produced at high yield.
  • the liquid medium of the present invention according to claim 3 is prepared by mixing water, the above-described culture raw material, and other medium components. At this time, if necessary, medium components other than the culture raw material are mixed with water and sterilized in advance. Can be added. Alternatively, after mixing a part of the culture raw material and other medium components with water and performing sterilization in advance, the remaining culture raw material that has not been pregelatinized is further added.
  • the sterilization method is not particularly limited.
  • An example is the high-temperature and high-pressure sterilization method, which can be performed at 121 ° C for 15 minutes.
  • the filamentous fungus culture includes, in addition to the culture itself, a culture solution obtained by centrifuging the culture, a concentrated product, a purified product, a dried product, and the like.
  • the method for producing an enzyme according to claim 11 is the same as the method for producing the filamentous fungus culture described above.
  • the filamentous fungus culture obtained by the present invention can be used for the production of sugars, amino acids and their derivatives as well as the production of fermented foods and drinks, as well as for enzyme agents and pharmaceutical antiseptics.
  • the culture can be used in place of solid cake.
  • the fermentation raw material (hanging raw material) used for manufacturing these fermented foods and drinks may or may not be pregelatinized.
  • a part of the obtained filamentous fungus culture can be used as a starter in the production of the next filamentous fungus culture.
  • the culture can be used as it is, or the filtrate, the supernatant of centrifugation, etc. can be used as a liquid enzyme agent. It can also be made into a powdery 'particulate enzyme agent by drying or fixing to a carrier. At this time, an appropriate excipient or the like may be added as necessary.
  • Barley (Australian Stirling varieties) with different milling ratios ranging from 65% to 98% were reacted with enzymes derived from Aspergillus oryzae cultures, and the glucose release rate of barley power was measured.
  • the cells were cultured for 42 hours at a temperature of 37 ° C., a stirring speed of 300 rpm, and an aeration rate of 0.5 wm, and filtered through a filter paper (Toyo Filter Paper No. 2) to obtain a “Koji mold culture supernatant”.
  • a filter paper Toyo Filter Paper No. 2
  • the barley substrate solution 50 ml and the koji mold culture supernatant 50 ml prepared as described above were each incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then the reaction was started by mixing them.
  • the glucose concentration in the reaction solution sampled lhr, 2hr, 3hr, and 4hr after the start of the reaction was measured using Dalcos C-II Test Sakai (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
  • the time course of the glucose concentration in the reaction solution is as shown in FIG. 1, and it was confirmed that the amount of released glucose was different depending on the milling rate of the barley used in the barley substrate solution.
  • the bark percentage of barley is usually around 10%, and the 65% white and 83% white barley used in this study have no skin on the surface.
  • 92% refined barley, 95% refined wheat and 98% refined wheat have grain skin on the surface.
  • the test plots using 65% and 83% polished wheat and 98% polished wheat with no husk on the surface showed high glucose concentrations, compared to 92% and 95%.
  • the lower the milling ratio the lower the glucose concentration. This indicates that the amount of glucose released is adjusted by the presence of husk.
  • FIG. 2 shows the calculated glucose release rate in the first hour of the reaction in this test. From this figure, it was confirmed that the lower the milling rate, the lower the glucose release rate.
  • birch fungus cultures were produced by the following method, and their enzyme activities were measured.
  • dalcoamylase activity (GA), amylase activity (AA), and acid-resistant a-amylase activity (ASAA), which are amylolytic enzymes, were measured.
  • Dalcoamylase activity (GA) is measured using a sugar squid fraction determination kit (manufactured by Kikkoman), and ⁇ -amylase activity (AA) is measured using an ⁇ -amylase measurement kit (manufactured by Kikkoman). I did it.
  • the acid-resistant a-amylase activity (ASAA) was measured using Sud 0 S. et al: J. Ferment. Bioeng., 7, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J.
  • an OC-amylase assay kit (manufactured by Kikkoman) was used. More specifically, 9 ml of lOOmM acetate buffer (pH 3) was added to 1 ml of the culture solution, and after acid treatment at 37 ° C for 1 hour, a amylase measurement kit (manufactured by Kikkoman) was used. It was measured.
  • CEL Cellulase activity
  • BGL 13-darcosidase activity
  • DFS dinitrosalicylic acid
  • CMC substrate solution Sigma low viscosity dissolved in lOOmM acetic acid buffer (pH5)
  • enzyme reaction DNS reagent including dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydrate 1.2%, sodium potassium tartrate 4hydrate 20.5%, lactose monohydrate 0.3%) 4 ml was added and mixed well to stop the reaction.
  • the reaction stop solution was accurately heated for 15 minutes in a boiling water bath. Subsequently, after cooling to room temperature, the amount of reducing sugar corresponding to glucose was quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of cellulase activity (CEL) is expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • the j8-darcosidase activity was measured by the following method. ImM p- -tro-phenol-j8-D -Dalcoviranoside (PNPG) was used as a substrate, and the enzyme reaction was carried out accurately at 37 ° C for 10 minutes in 50 mM acetate buffer (pH 5). The amount of p-nitrophenol produced by absorbance was quantified, and the enzyme activity was calculated. The reaction was stopped by adding 200 mM sodium carbonate solution twice the amount of the reaction solution. One unit of activity was defined as the activity of releasing 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • PNPG ImM p- -tro-phenol-j8-D -Dalcoviranoside
  • dalcoamylase activity (GA), amylase activity (AA), and acid-resistant a-amylase activity (ASAA), which are amylolytic enzymes, were measured.
  • Dalcoamylase activity (GA) is measured using a sugar squid fraction determination kit (manufactured by Kikkoman), and ⁇ -amylase activity (AA) is measured using an ⁇ -amylase measurement kit (manufactured by Kikkoman). I did it.
  • the acid-resistant a-amylase activity (ASAA) was measured using Sud 0 S. et al: J. Ferment. Bioeng., 7, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J.
  • an OC-amylase assay kit (manufactured by Kikkoman) was used. More specifically, 9 ml of lOOmM acetate buffer (pH 3) was added to 1 ml of the culture solution, and after acid treatment at 37 ° C for 1 hour, a amylase measurement kit (manufactured by Kikkoman) was used. It was measured.
  • the productivity of amylolytic enzymes increased as the milling ratio decreased.
  • the enzyme productivity was remarkably lowered.
  • the enzyme productivity of the black koji mold culture is shown in Experimental Example 1.
  • the tendency to inversely correlate with the rate of dulcose release was confirmed, and it was shown that the enzyme productivity of the black koji mold culture can be controlled by changing the barley milling ratio.
  • Dalcoamylase activity (GA) is measured using a sugar squid fraction determination kit (manufactured by Kikkoman), and ⁇ -amylase activity (AA) is measured using an ⁇ -amylase measurement kit (manufactured by Kikkoman). I did it.
  • the productivity of amylolytic enzymes increased as the milling rate decreased.
  • the activity of darcoamylase was significantly increased in 98% polished wheat.
  • the enzyme productivity was significantly reduced.
  • the enzyme productivity of the koji mold culture is greatly affected by the glucose release rate shown in Experimental Example 1, and the enzyme productivity of the koji mold culture can be controlled by changing the barley milling ratio. It has been shown.
  • Example 4 A culture of a filamentous fungus (Trichoderma piride) using barley having a different polishing ratio Manufacturing
  • filamentous fungi Trichoderma piride cultures capable of producing a cellulolytic enzyme were produced by the following method, and their enzyme activities were measured.
  • CEL cellulase activity
  • CMC carboxymethylcellulose
  • DAS dinitrosalicylic acid
  • DNS reagent (dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, potassium sodium tartrate tetrahydrate 25.5%, lactose monohydrate 0.3% 4 ml) was added and mixed well to stop the reaction.
  • the reaction stop solution was heated accurately in a boiling water bath for 15 minutes. Subsequently, after cooling to room temperature, the amount of reducing sugar corresponding to dulcose was quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of cellulase activity (CEL) was expressed as the amount of enzyme that produces a reducing sugar corresponding to: mol glucose per minute.
  • Figure 10 shows the measurement results.
  • Trichoderma bilide which is a filamentous fungus other than Neisseria gonorrhoeae
  • the highest enzyme productivity was obtained when 98% polished barley was used, but the enzyme activity of the pulverized product was significantly reduced, and the effect of inhibiting the release of nutrients by barley husk could contribute to the high production of cellulase. It was suggested.
  • filamentous fungi Trichoderma reesei cultures capable of producing a cellulose-degrading enzyme were produced by the following method, and their enzyme activities were measured.
  • the supernatant was collected by culture fluid centrifugation, and the activity of the plant fiber-degrading enzyme in the supernatant was measured.
  • CEL Cellulase activity
  • CMC substrate solution Sigma low vise osity dissolved in lOOmM acetate buffer (pH 5)
  • DNS reagent containing dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, sodium potassium tartrate tetrahydrate 25.5%, lactose monohydrate 0.3% 4 ml was added and mixed well to stop the reaction.
  • the reaction stop solution was heated accurately in a boiling water bath for 15 minutes. Subsequently, after cooling to room temperature, the amount of reducing sugar corresponding to dulcose was quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of cellulase activity (CEL) was expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to: mol of dalcose in 1 minute.
  • xylanase activity was quantified by increasing the absorbance at 540 nm by reacting reducing sugars produced by enzymatic hydrolysis with oat spelts-derived xylan as a substrate.
  • 1% xylan substrate solution [Sigma Xylan, from oat spelts dissolved in 200 mM acetic acid buffer (PH4.5)] Add 0.1 ml of culture solution to 1.9 ml and accurately at 40 ° C After 10 minutes of enzyme reaction, DNS reagent (dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, sodium potassium tartrate tetrahydrate 22.5%, lactose monohydrate 0.3 4ml was added and mixed well to stop the reaction. To quantify the amount of reducing sugar contained in the reaction stop solution The reaction stop solution was accurately heated in a boiling water bath for 15 minutes.
  • the amount of reducing sugar corresponding to xylose was quantified by measuring the absorbance at 540 ° C.
  • One unit of xylanase activity was expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to 1 / z mol of xylose per minute under the reaction conditions of 40 ° C for 10 minutes.
  • ⁇ -Darcosidase activity was measured by the following method. ImM ⁇ — -Molecular 13-D-Dalcobilanoside (PNPG) was used as a substrate, and the enzyme reaction was performed at 37 ° C for 10 minutes in 50 mM acetate buffer (pH 5). The amount of p-nitrophenol produced by the absorbance was determined, and the enzyme activity was calculated. The reaction was stopped by adding 200 mM sodium carbonate solution twice the amount of the reaction solution. One unit of activity was defined as the activity of releasing 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • PNPG ImM ⁇ — -Molecular 13-D-Dalcobilanoside
  • Example 6 Production of a filamentous fungus (Aspergillus aquilatorus) culture using barley having different milling ratios
  • filamentous fungi Aspergillus aquilaetus cultures capable of producing a cellulose-degrading enzyme were produced by the following method, and their enzyme activities were measured.
  • the supernatant was collected by culture fluid centrifugation, and the activity of the plant fiber-degrading enzyme in the supernatant was measured.
  • CEL Cellulase activity
  • CMC substrate solution Sigma low vise osity dissolved in lOOmM acetate buffer (pH 5)
  • DNS reagent containing dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, sodium potassium tartrate tetrahydrate 25.5%, lactose monohydrate 0.3% 4 ml was added and mixed well to stop the reaction.
  • the reaction stop solution was heated accurately in a boiling water bath for 15 minutes. Subsequently, after cooling to room temperature, the amount of reducing sugar corresponding to dulcose was quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of cellulase activity (CEL) was expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to: mol of dalcose in 1 minute.
  • ⁇ -Darcosidase activity was measured by the following method. ImM ⁇ — It was generated by the absorbance at 410 ° after the reaction was stopped for 10 minutes at 37 ° C in 50mM acetate buffer (pH5) using oral ferrule-13-D-darcobilanoside (PNPG) as a substrate. The amount of p-nitrophenol was quantified and the enzyme activity was calculated. The reaction was stopped by adding 200 mM sodium carbonate solution twice the amount of the reaction solution. One unit of activity was defined as the activity of releasing 1 ⁇ mol of glucose per minute.
  • the supernatant was collected by culture fluid centrifugation, and the activity of the plant fiber-degrading enzyme in the supernatant was measured.
  • CEL Cellulase activity
  • CMC substrate solution Sigma low vise osity dissolved in lOOmM acetic acid buffer (pH 5)
  • DNS reagent including dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, sodium potassium tartrate tetrahydrate 25.5%, lactose monohydrate 0.3%) 4 ml was added and mixed well to stop the reaction.
  • the reaction stop solution was heated accurately in a boiling water bath for 15 minutes. Subsequently, after cooling to room temperature, the amount of reducing sugar corresponding to dulcose was quantified by measuring the absorbance at 540 nm.
  • One unit of cellulase activity (CEL) was expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to: mol of dalcose in 1 minute.
  • xylanase activity was quantified by increasing the absorbance at 540 nm by reacting reducing sugars produced by enzymatic hydrolysis with oat spelts-derived xylan as a substrate.
  • 1% xylan substrate solution [Sigma Xylan, from oat spelts dissolved in 200 mM acetic acid buffer (PH4.5)] Add 0.1 ml of culture solution to 1.9 ml and accurately at 40 ° C After 10 minutes of enzyme reaction, DNS reagent (dinitrosalicylic acid 0.75%, sodium hydroxide 1.2%, sodium potassium tartrate tetrahydrate 22.5%, lactose monohydrate 0.3 4ml was added and mixed well to stop the reaction. In order to quantify the amount of reducing sugar contained in the reaction stop solution, the reaction stop solution was heated accurately in a boiling water bath for 15 minutes.
  • the amount of reducing sugar corresponding to xylose was quantified by measuring absorbance at 540 °.
  • One unit of xylanase activity was expressed as the amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to 1 / z mol of xylose per minute under the reaction conditions of 40 ° C for 10 minutes.
  • the flask was placed in a square flask and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes. After cooling, chloramphe Nicole (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a concentration of 50 ⁇ g / ml, followed by heat treatment to add 2 g of uncured barley.
  • the main culture medium was inoculated with 1 ml of the preculture and cultured at 37 ° C. for 72 hours with shaking at 1 OO rpm to obtain a koji mold culture.
  • a koji mold culture was produced using an ⁇ -cultured culture material. That is, 2 g of barley, 0.2 g of KNO, 0.3 g of KH PO and 100 ml of water are put into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask,
  • the activity of darcoamylase, acid-resistant ⁇ -amylase and ⁇ -amylase was measured for the koji mold culture obtained in each test section. That is, the measurement of darcoamylase activity was performed using a sugar squid fraction determination kit (manufactured by Kikkoman). Acid resistant amylase The measurement of activity is ⁇ Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo
  • the present invention can produce a koji mold culture that can be used for the production of fermented foods and drinks.
  • the flask was placed in an Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes.
  • 1 ml of the preculture was inoculated and cultured at 37 ° C for 24 hours with shaking at lOOrpm.
  • 1.5 g of unheated barley was added and further shake-cultured at 37 ° C. for 48 hours at lOO rpm to obtain a koji mold culture.
  • Yeast Kagoshima yeast was cultured with shaking in lml YPD medium at 100 rpm overnight, centrifuged, and washed twice with sterile water.
  • the preparation composition is shown in Table 2 below. As the wheat, the barley was washed, immersed in water for 60 minutes, drained for 30 minutes, and steamed for 40 minutes. Yeast was used in full amount as described above.
  • Fermentation conditions Fermentation was carried out at 25 ° C for 20 days. A secondary charge was made 3 days after the first charge.
  • Fermentation proceeded smoothly.
  • the alcohol content of the mash after the fermentation was 17.5%.
  • the sensory evaluation of the sample after distillation was conducted by 6 panelists specializing in alcoholic beverages.
  • Pre-culture method Barley (Australian Stirling) 8g and 100ml water 500 ⁇ buff The flask was placed in an Erlenmeyer flask with a flask and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes. To this preculture medium, 1 ⁇ 10 6 Zml of Aspergillus oryzae NRIB40 was inoculated and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours at lOOrpm to obtain a preculture solution.
  • the flask was placed in an Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C for 15 minutes. After cooling, chloramphenicol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to 50 ⁇ g / ml, and 2 g of barley was added. A 1 ml preculture solution was inoculated into this main culture medium, and cultured at 37 ° C for 72 hours with shaking at lOOrpm, thereby producing a koji mold culture.
  • a koji mold culture was produced by the method of the present invention described in claim 2. That is, 95% wheat (Australian Stirling) 2g, KNO 0.8g, K
  • the cells were cultured for 42 hours at a temperature of 37 ° C., a stirring speed of 300 rpm, and an aeration rate of 0.5 wm, and filtered through a filter paper (Toyo Filter Paper No. 2) to obtain a “Koji mold culture supernatant”.
  • a filter paper Toyo Filter Paper No. 2
  • Example 11 Manufacture of birch fungus culture using barley with different inorganic salt concentrations during sterilization Using various polished barley (Australian Stirling), birch fungus culture was produced by the following method. Their enzyme activities were measured.
  • the main culture medium prepared as described above was allowed to cool, and then 1 ml of the preculture was inoculated and cultured at 37 ° C for 48 hours with shaking at lOOrpm.
  • dalcoamylase activity (GA) and acid-resistant protease activity (ASAA), which are amylolytic enzymes, were measured.
  • the measurement of darcoamylase activity was carried out using a sugar squid fraction determination kit (manufactured by Kikkoman).
  • AZA acid-resistant ⁇ -amylase activity
  • Figure 19 shows the results of measurement of darcoamylase activity. The results are shown in 20.
  • the nutrient concentration in the culture system is controlled to be low, so that the fed batch culture in which nutrients are added little by little from the outside of the culture system is performed, and it is equivalent to the flow caloculture in a simple batch culture. Culture mode is possible.
  • the filamentous fungus culture used in a wide range of industries which is not limited to the filamentous fungus culture used for the production of fermented foods and beverages, and the enzymes and enzyme agents produced thereby are produced stably and inexpensively.
  • a method is provided.
  • the present invention is expected to be applied to heterogeneous protein production using a promoter region such as amylolytic enzyme gene.
  • the present invention can be used in a wide range of industries such as food manufacturing industry, fermentation industry, and pharmaceutical manufacturing industry.

Abstract

　本発明は、穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を培養原料とする液体培地で糸状菌を培養して得られる糸状菌培養物を製造するにあたり、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することにより、糸状菌培養物の酵素、特にデンプン分解酵素や植物繊維分解酵素、タンパク分解酵素の生産性を調整する方法を提供することを目的とする。 　本発明は、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌアから選ばれた少なくとも１種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法を提供する。

Description

明 細 書
糸状菌培養物の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、液体培地を用いた糸状菌培養物の製造方法、特に、培養原料中の栄 養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培 養物の酵素生産性を調整する糸状菌培養物の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 焼酎など発酵飲食品の製造には、糸状菌の一種である麹菌が用いられている。そ の培養形態は、穀類表面上に麹菌を生育させる固体培養法によるものであり、固体 麹法と呼ばれている。このような固体麹を用いる方法は、伝統的な製造法であるが、 固体培養という特殊な培養形態であるため、大規模製造に不向きな方法であるとい える。
[0003] 一方、麹菌を液体培養して得られる麹菌培養物である液体麹は、培養制御が容易 であり、効率的な生産に適した培養方法であるといえるが、焼酎醸造などの発酵飲食 品の製造に必要な酵素が充分に得られないことがよく知られており（非特許文献 1— 4参照）、これまで実製造で使用された例は少な力つた。
[0004] 麹菌を含む糸状菌の液体培養による酵素生産などにぉ 、ては、培養系内のダルコ ースなどの栄養分濃度を低く制御することで酵素生産性が向上することが知られてい る。従来では、培養系外力ゝら糖などの栄養分を少量ずつ添加する流加培養法などに よって糖などの栄養分濃度を抑えることが行われていたが、より簡便な手法の開発が 望まれて!/ヽた (非特許文献 5— 6参照)。
[0005] 我々は、穀皮ゃ外皮のつ!ヽた原料を用いた液体培地を用いて麹菌を培養すること により、ダルコアミラーゼや耐酸性 α—アミラーゼといった酵素を充分に含有する麹 菌培養物を製造する方法を開発し、既に特許出願を行った (特願 2004— 350661号 明細書、特願 2004— 352320号明細書、特願 2004— 352324号明細書、特願 2004— 3 78453号明細書、特願 2005— 290651号明細書、特願 2005— 290648号明細書参照） 。しかし、本製造法の酵素高生産機構や、それに基づく麹菌培養物の酵素生産性の 調整法、ならびに麹菌以外の糸状菌における酵素生産性の調整方法についてはい まだ知られていない。
[0006] 一方、特別高!ヽ無蒸煮デンプン糖ィ匕力を有するコルティシゥム属新菌株を、無蒸 煮原料とミネラル等を含む液体培地で培養して得られた酵素液を用いて無蒸煮デン プンを液化する方法 (特許文献 1参照）、並びに、該酵素液を無蒸煮原料に作用させ て清酒を製造する方法 (特許文献 2参照）が提案されている。しかし、担子菌類である コルティシゥム属菌は、発酵飲食品の製造に広く利用されている麹菌とは大きく異な つている。し力も、特許文献 1、 2では、黒麹菌（Aspergillus awamori)やリゾプス属に は十分な糖ィ匕力がない旨記載されている。さらに、上記酵素液が十分な耐酸性 α— アミラーゼ活性を有しているかは不明である。
[0007] 非特許文献 1 : Hata Y. et. A1.： J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537(1997)
非特許文献 2 : Hata Y. et. al. : Gene.， 207, 127-134(1998)
非特許文献 3 : Ishida H. et. al. :J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307(1998)
非特許文献 4 : Ishida H. et. al:Curr. Genet., 37, 373-379(2000)
非特許文献 5 : Bhargava S. et al: Biotechnol Bioeng., 82(1), 111-7(2003) 非特許文献 6 : Pedersen H. et al: Appl Microbiol Biotechnol, 53(3):272- 7(2000) 特許文献 1：特公平 5-68237号公報
特許文献 2：特公平 6-53059号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌァカゝら選ばれた少な くとも 1種を培養原料とする液体培地で、培養原料である穀類中の栄養分の培養系 への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素、特 にデンプン分解酵素や植物繊維分解酵素、タンパク分解酵素の生産性を調整する 方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、液体培地の原料と して穀皮のついた原料を用いる際に、その精白歩合を調整することにより、栄養分の ひとつであるグルコースの培地中への遊離速度が制御可能であることを見出した。ま た、精白歩合の異なる原料を用いて糸状菌を培養した結果、精白歩合によって糸状 菌培養物における酵素生産性を制御できることを見出した。
また、本発明者らは、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、 α化されていないデ ンプン原料を含む液体培地で麹菌を培養することによって、発酵飲食品の製造に必 要なダルコアミラーゼおよび耐酸性 α アミラーゼを多く含有する液体麹を製造でき ることを見出した。これは、穀皮又は外皮に包まれていない原料でも、 α化されてい なければ分解されにくぐ培養系への糖やアミノ酸等の放出が抑制され、結果的に必 要な酵素活性が得られるためと予想される。
本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至ったのである。
[0010] すなわち、請求項 1に係る本発明は、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサ ス、及び、キヌァカも選ばれた少なくとも 1種を含む液体培地を用いて、当該培養原 料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、 糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法 である。
請求項 2に係る本発明は、培養原料として表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に 覆われた穀類を用い、当該穀類の精白歩合を調整することにより、当該穀類中の栄 養分の培養系への放出速度を制御する、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方 法である。
請求項 3に係る本発明は、培養原料として、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ 、 α化されていないものを用いることにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出 速度を制御する、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法である。
請求項 4に係る本発明は、液体培地として加熱処理工程を含む滅菌処理を施した ものを用い、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を調整することにより、 培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項 1に記載の糸状菌 培養物の製造方法である。
[0011] 請求項 5に係る本発明は、栄養分が、培養原料中のデンプンに由来する糖および Ζまたは培養原料中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項 1に記載の糸状 菌培養物の製造方法である。
請求項 6に係る本発明は、酵素が、デンプン分解酵素、植物繊維分解酵素、タンパ ク質分解酵素力も選ばれた少なくとも 1種類である、請求項 1に記載の糸状菌培養物 の製造方法である。
請求項 7に係る本発明は、糸状菌が、麹菌、トリコデルマ属菌および白色腐朽菌か ら選ばれた少なくとも 1種である、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法である 請求項 8に係る本発明は、請求項 1〜7のいずれか 1項に記載の方法で得られた糸 状菌培養物である。
[0012] 請求項 9に係る本発明は、請求項 8に記載の糸状菌培養物を用いた酵素剤の製造 方法である。
請求項 10に係る本発明は、請求項 9に記載の方法で得られた酵素剤である。 請求項 11に係る本発明は、培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び 、キヌァカゝら選ばれた少なくとも 1種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分 の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物 の酵素生産性を調整することを特徴とする酵素の生産方法である。
請求項 12に係る本発明は、請求項 11に記載の方法で得られた酵素である。
[0013] 請求項 13に係る本発明は、請求項 8に記載の糸状菌培養物を用いた発酵飲食品 の製造方法である。
請求項 14に係る本発明は、請求項 10に記載の酵素剤を用いた発酵飲食品の製 造方法である。
請求項 15に係る本発明は、請求項 12に記載の酵素を用いた発酵飲食品の製造 方法である。
請求項 16に係る本発明は、請求項 13〜15のいずれか 1項に記載の方法で得られ た発酵飲食品である。
発明の効果
[0014] 本発明によれば、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することによ り、培養系内の糖やアミノ酸などの栄養分濃度が低く維持され、糸状菌培養物の酵 素生産性を調整することができる。
[0015] 請求項 2に係る本発明によれば、精白歩合を調整することにより、培養系における 培地中へのグルコースの遊離速度を制御することができた。精白歩合の異なる原料 を用いて麹菌液体培養物を製造した結果、精白歩合によって、デンプン分解酵素や 植物繊維分解酵素の酵素生産性を制御できることを見出した。また、麹菌以外の糸 状菌により生産される他の酵素についても、同様の方法により、その生産性を制御で きることを見出した。
[0016] 請求項 3に係る本発明によれば、穀皮ゃ外皮が付着していない原料を用いて、焼 射等の発酵飲食品の製造に必要なダルコアミラーゼと耐酸性 a—アミラーゼをバラ ンスよく含む糸状菌培養物を製造することができる。
したがって、例えば麦焼酎などの製造について言えば、液体麹製造工程と発酵ェ 程で同一の原料を使用することが可能になり、製造コストを抑えることができる。また、 麦の外皮や糠が酒質に良くない影響を与える場合もある。さらに、原料を加熱しない で用いるため、エネルギーの節約にもつながる。
し力も、種々の原料や糸状菌株を用いた糸状菌培養物を組み合わせて製造した糸 状菌培養物を使用することで、発酵飲食品のバラエティー化を図ることが容易となる
[0017] 本発明の方法により、グルコース以外にも、さまざまな糖やアミノ酸など、穀類中に 含まれる多くの栄養分の遊離速度も同様に制御されていると予想されるため、培養 系内の糖濃度やアミノ酸濃度によりカタボライト抑制を受けるような酵素生産は広く調 整されると予想される。
また、デンプン分解酵素遺伝子などのプロモーター領域を使用した異種タンパク質 生産にも適用の可能性が高い。
[0018] また、本発明によれば、流加培養よりも簡便な回分培養においても、培養系内に既 に添加されている原料からの栄養分の遊離速度を調整することで、培地中の糖など の栄養分濃度を低く抑えることが可能となるので、流加培養と同様の培養効果が達 成できる。したがって、本発明の培養法は、これまで報告のない新たな培養モードで あると考えられる。 [0019] さらに、液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能であるため、本 発明によれば、品質が安定した糸状菌培養物を安価に製造することができる。
図面の簡単な説明
[0020] [図 1]各精白歩合の大麦基質溶液と麹菌培養上清液とを反応させたときの、反応液 中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。
[図 2]各精白歩合の大麦基質溶液と麹菌培養上清液とを反応させたときの、初発 1時 間におけるグルコース遊離速度を示す図である。
[図 3]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白麹菌培養物における酵素活性を 示す図である。 (A)はダルコアミラーゼ（白棒)および oc -アミラーゼ（黒棒)の酵素活 性を、（B)は耐酸性 α—アミラーゼの酵素活性を示す。
[図 4]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白麹菌培養物における酵素活性を 示す図である。 (Α)はセルラーゼ活性を、 (Β)は /3 -ダルコシダーゼの酵素活性を示 す。
[図 5]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黒麹菌培養物におけるダルコアミラ ーゼ活性 (GA)を示す図である。
[図 6]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黒麹菌培養物における ocーァミラ ーゼ活性 (ΑΑ)を示す図である。
[図 7]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黒麹菌培養物における耐酸性 α— アミラーゼ活性 (ASAA)を示す図である。
[図 8]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黄麹菌培養物におけるダルコアミラ ーゼ活性 (GA)を示す図である。
[図 9]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた黄麹菌培養物における ocーァミラ ーゼ活性 (ΑΑ)を示す図である。
[図 10]各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ'ビリデ培養物におけ るセルラーゼ活性 (CEL)を示す図である。
[図 11]各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ'リーセィ培養物にお けるセルラーゼ活性 (CEL)を示す図である。
[図 12]各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ'リーセィ培養物にお けるキシラナーゼ活性 (XYL)を示す図である。
[図 13]各精白歩合の大麦を培養原料として用いたトリコデルマ'リーセィ培養物にお ける β—ダルコシダーゼ活性 (BGL)を示す図である。
[図 14]各精白歩合の大麦を培養原料として用 ヽたァスペルギルス ·アキユレ一タス培 養物におけるセルラーゼ活性 (CEL)を示す図である。
[図 15]各精白歩合の大麦を培養原料として用 ヽたァスペルギルス ·アキユレ一タス培 養物における β—ダルコシダーゼ活性 (BGL)を示す図である。
[図 16]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白色腐朽菌培養物におけるセル ラーゼ活性 (CEL)を示す図である。
[図 17]各精白歩合の大麦を培養原料として用いた白色腐朽菌培養物におけるキシラ ナーゼ活性 (XYL)を示す図である。
[図 18]滅菌時の塩濃度が異なる大麦基質溶液と麹菌培養上清液とを反応させたとき の、反応液中のグルコース濃度を示す図である。
[図 19]滅菌時の塩濃度が異なる液体培地を用いた白麹菌培養物におけるダルコアミ ラーゼ活性 (GA)を示す図である。
[図 20]滅菌時の塩濃度が異なる液体培地を用いた白麹菌培養物における耐酸性 a —アミラーゼ活性 (ASAA)を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0021] 以下、本発明について具体的に説明する。
請求項 1に係る本発明は、糸状菌培養物の製造方法に関し、培養原料として穀類 、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌァ力 選ばれた少なくとも 1種を含む液体培 地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を 培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とするもので ある。
[0022] 本発明にお ヽては、培養原料に含まれる栄養分の培養系への放出速度を制御す ることにより、培養系内の糖やアミノ酸などの栄養分濃度が低く維持され、糸状菌培 養物中の酵素活性が増強される。
培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する手段としては、穀類の精 白歩合の調整による方法、外皮の付着した豆類、芋類、アマランサス又はキヌァを培 養原料に用いる方法、穀皮又は外皮が除去されているがひ化されていない培養原 料を用いる方法、液体培地を加熱処理する際の無機塩濃度の調整による方法、穀 類表面上に食用可能な膜などを人工的に形成し、穀類デンプン質ゃ穀類タンパク質 を保護する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、培養 原料の培養液中での物理的な崩壊を抑えることで栄養分の放出速度を制御すること も可能であり、例えば、攪拌せん断力の弱い培養装置を用いることで、栄養分の放出 速度を抑制することができる。
[0023] ここで、糸状菌が生産する酵素としては、培養系内のグルコースなどの糖や、ァミノ 酸などのタンパク分解物の濃度により、その生産性がカタボライト抑制を受ける酵素 群を挙げることができる。具体的には、ダルコアミラーゼ、耐酸性 α—アミラーゼ、 a アミラーゼ等のデンプン分解酵素や、セルラーゼ、キシラナーゼ、 13—ダルコシダ ーゼ等の植物繊維分解酵素、プロテアーゼ、ぺプチダーゼ、ダルタミナーゼなどのタ ンパク分解酵素が挙げられる力 S、必ずしもこれらに限定されない。
[0024] 本発明において培養原料としては、大麦、米、小麦、そば、ヒェ、ァヮ、キビ、コゥリ ヤン、トウモロコシ等の穀類、大豆、小豆等の豆類、サツマィモ等の芋類、アマランサ ス、キヌァ等の雑穀類などを用いることができる。
ここで、アマランサスとは、ヒュ科ヒュ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量 が高ぐアミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べて もカルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国 、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。
また、キヌァは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアン デス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富 に含んでいる。
なお、これらの培養原料は、単独あるいは 2種以上を組み合わせて用いることがで きる。また、これらの原料の形状は特に限定されない。
[0025] 上記培養原料は、水と混合して液体培地を調製する。
この培養原料の配合割合は、糸状菌培養物中に蓄積させようとする目的の酵素が 選択的に生成、蓄積される程度のものに調製される。
例えば、ダルコアミラーゼ、及び耐酸性 α—アミラーゼをバランスよく高生産させる ためには、大麦を原料とした場合には、水に対して玄麦を l〜20% (wZvol)添カロし た液体培地に調製される。また、玄麦として無精白の大麦を用いた場合には、さらに 好ましくは 8〜10% (w/vol)添加した液体培地に調製され、玄麦として 95%精白し た大麦を原料とした場合には、さらに好ましくは 1〜4% (w/vol)添加した液体培地 に調製される。
玄麦の使用量が 20% (wZvol)より多くなると、培養液の粘性が高くなり、糸状菌を 好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃 度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。
[0026] 次に、米を培養原料とした場合には、水に対して米を 1〜20% (w/vol)、好ましく は 5〜13% (w/vol)、より好ましくは 8〜10% (w/vol)添カ卩した液体培地に調製さ れる。
[0027] 豆類を培養原料とした場合には、水に対して豆類を 1〜10% (w/vol)、好ましくは 大豆であれば 8〜10% (w/vol)、小豆であれば 1〜2% (w/vol)添加した液体培 地に調製される。また、芋類を培養原料とした場合には、水に対して芋類を 1〜10% (w/vol)添加した液体培地に調製される。
[0028] また、例えば、アマランサスを培養原料とした場合は、水に対して 1. 5〜15% (wZ vol)、好ましくは 2〜 10% (w/vol)、より好ましくは 2〜8% (w/vol)添カ卩した液体 培地に調製される。一方、キヌァの場合は、水に対して 1. 5〜7% (wZvol)、好まし くは 2〜6% (w/vol)、より好ましくは 2〜4% (w/vol)添加した液体培地に調製さ れる。
[0029] このように、目的とする酵素や、使用する原料の精白度、使用する糸状菌株、原料 の種類等によって、最適な配合使用量は異なるので、任意に選択すればよい。
[0030] 液体培地には、前述の原料の他に栄養源として有機物、無機塩等を添加するのが 好ましい。
たとえば、糸状菌としてァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kawachii)等の白麹菌、 および、ァスペルギルス'ァヮモリ（Aspergillus awamori)ゃァスペルギルス '二ガー（A spergillus niger)等の黒麹菌を用いる場合は、硝酸塩およびリン酸塩を併用すること が好ましぐさらに好ましくは、これらと共に硫酸塩を併用する。ここで、硝酸塩として は硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどを用いることができ、特に硝酸カリウムが好ましい 。リン酸塩としてはリン酸 2水素カリウム、リン酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、 特にリン酸 2水素カリウムが好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム 7水和物、硫 酸鉄 7水和物、硫酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム 7水 和物、硫酸鉄 7水和物が好ましい。これらの無機塩は、複数種を組み合わせて用い ることちでさる。
[0031] 上記の白麹菌や黒麹菌を用いる場合の液体培地における上記の無機塩の濃度は 、麹菌培養物中にダルコアミラーゼ及び耐酸性 α—アミラーゼが選択的に生成、蓄 積される程度のものに調整される。具体的には、硝酸塩の場合は 0. 1〜2. 0%、好 ましく ίま 0. 2〜1. 50/0、リン酸塩の場合 ίま 0. 05-1. 00/0、好ましく ίま 0. 1〜0. 50/0、 硫酸塩の場合は 0. 01-0. 5%、好ましくは 0. 02-0. 1% (いずれも w/vol)とする。
[0032] また、糸状菌としてァスペルギルス'オリーゼ（Aspergillus oryzae)ゃァスペルギルス •ソーャ (Aspergillus sojae)等の黄麹菌を用いる場合は、液体培地において硝酸塩、 リン酸塩および硫酸塩を併用することが好ましい。ここで、硝酸塩としては硝酸ナトリウ ム、硝酸カリウムなどを用いることができ、特に硝酸ナトリウムが好ましい。リン酸塩とし てはリン酸 2水素カリウム、リン酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、特にリン酸 2水 素カリウムが好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム 7水和物、硫酸鉄 7水和物、 硫酸アンモ-ゥムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム 7水和物、硫酸鉄 7 水和物が好ましい。これらの無機塩は、複数種を組み合わせて用いることもできる。
[0033] 上記の黄麹菌を用いる場合の液体培地における上記の無機塩の濃度は、麹菌培 養物中にダルコアミラーゼ及び耐酸性 α—アミラーゼが選択的に生成、蓄積される 程度のものに調整される。具体的には、硝酸塩の場合は 0. 1〜2. 0%、好ましくは 0 . 2〜1. 5%、ジン酸塩の場合は 0. 05-1. 0%、好ましくは 0. 1〜0. 5%、硫酸塩 の場合は 0. 01-0. 5%、好ましくは 0. 02-0. 1% 0ヽずれも w/vol)とする。
[0034] 本発明における液体培地には、前述の無機塩以外の有機物や無機塩等も、栄養 源として適宜添加することができる。これらの添加物は糸状菌の培養に一般に使用さ れているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンステ ィープリカ一、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモ-ゥム塩、カリウム塩、力 ルシゥム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、 2種類以上の 有機物及び Z又は無機塩を同時に使用してもよい。これらの添加量は糸状菌の増 殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては 0. l〜5% (w/vol) 程度、無機塩としては 0. l〜l% (w/vol)程度添加するのが好ましい。
上限値を超えてこれらの栄養源を添加した場合は、糸状菌の増殖を阻害するため 好ましくない。また、添加量が下限値未満である場合は、酵素が十分に生産されない ため、やはり好ましくない。
なお、これらの栄養源の他にも、抗生物質、防腐剤等の添加物を必要に応じて液 体培地に用いることができる。
[0035] 請求項 4に記載したように、本発明にお ヽて、液体培地として加熱処理を施したも のを用いる場合は、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を適宜調整す ることによつても、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御することができ る。
すなわち、加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を上げることによって、培養 原料中の栄養分の培養系への放出を抑制することができるのである。これは、培養 原料を無機塩存在下で加熱することにより、当該原料の物理的な崩壊が抑えられる ためと考えられる。
[0036] ここで、無機塩としては特に制限はなぐ上述のように糸状菌用の液体培地に通常 用いられるものを用いることができる力 硝酸塩やリン酸塩、硫酸塩がより好ましい。 また、加熱処理時における液体培地中の無機塩濃度としては、既述した液体培地 中の好適な濃度の 1〜 10倍程度とすることができる。
なお、加熱処理時における液体培地中の無機塩濃度が、糸状菌の培養に好適な 濃度範囲を超えて ヽる場合は、加熱処理後に希釈して無機塩濃度を適宜調整した 後、培養に供することができる。
[0037] 上記の加熱処理条件としては、 80〜130°C、好ましくは 100〜121°Cで、 5〜120 分間、好ましくは 10〜30分間とすることができる。特に、オートクレープなどによる一 般的な液体培地の加熱滅菌処理条件である 110〜121°C、 5〜20分間とすると、培 地の滅菌処理も同時に行うことができるので好ましい。
[0038] 次に、糸状菌を液体培地に接種する。本発明で用いる糸状菌としては、培養系内 の糖やアミノ酸などの栄養分の濃度によりカタボライト抑制を受ける酵素を生産する 糸状菌を広く用いることができ、ァスペルギルス属菌ゃトリコデルマ属菌、白色腐朽 菌ィルペックス.ラクテウス（Irpex lacteus)などを例示することができる。ァスペルギル ス属菌の具体例としては、たとえばァスペルギルス'カヮチ（Aspergillus kawachii)等 に代表される白麹菌、ァスペルギルス'オリーゼ（Aspergillus oryzae)ゃァスペルギル ス ·ソーャ（Aspergillus sojae)等に代表される黄麹菌、ァスペルギルス ·ァヮモリ（Aspe rgillus awamori)ゃァスペルギルス ·-ガー（Aspergillus niger)等に代表される黒麹菌 などの麹菌、および、ァスペルギルス'アキユレ一タス（Aspergillus aculeatus)などを 挙げることができる。トリコデルマ属菌の具体例としては、セルラーゼ生産菌であるトリ コテノレマ ·ビリテ、Trichoderma viride)やトリコテノレマ ·リーセづ (Trichoderma reesei) などを挙げることができる。
[0039] これらの糸状菌は一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上 の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは胞子又は前培養に より得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌糸を用いる方が 対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。糸状菌の液体培地への接種量 には特に制限はないが、液体培地 lml当り、胞子であれば 1 X 104〜1 X 106個程度 、菌糸であれば前培養液を 0. 1〜10%程度接種することが好ましい。
[0040] 糸状菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、 好ましくは 25〜45°C、より好ましくは 30〜40°Cで行なうのがよい。培養温度が低いと 糸状菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は 24〜12 0時間で培養するのが好ま ヽ。培養装置は液体培養を行なうことができるものであ ればよいが、糸状菌は好気培養を行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供 給できる好気的条件下で行なう必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及 び糸状菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通 気量につ 、ては、培養環境を好気的に保つことができる条件であれば 、かなる条件 でもよぐ培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。
[0041] 請求項 2に係る本発明は、上記の糸状菌培養物の製造方法において、培養原料と して表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に覆われた穀類を用い、当該穀類の精白 歩合を調整することにより、穀類中の栄養分の培養系への放出速度を制御するもの である。
本発明において、穀類の形状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆 われていることが必要であって、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残 されて 、る程度までに精白された精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、 玄麦なども使用できる。例えば、穀類が大麦の場合には、未精白の精白歩合 100% のもの、或いは未精白の精白歩合を 100%とし、この未精白の精白歩合（100%)か ら大麦の穀皮歩合 (一般的には 7〜8%)を差し引いた割合、すなわち、 92〜93%程 度の精白歩合以上のものである。
[0042] 請求項 2に係る本発明においては、穀類の精白歩合を調整することによって、栄養 分の培養系への放出速度を制御し、糸状菌培養物における酵素活性の増強を図る 。したがって、生産しょうとする酵素や、原料穀類の種類等に応じて最適の精白歩合 のものを選択する。たとえば、ダルコアミラーゼや耐酸性 α—アミラーゼを製造する場 合であって、大麦を原料とするときは、精白歩合を 90〜100%、好ましくは 98%とす ることにより、両酵素をバランスよく高生産することができる。
[0043] ここで、精白歩合とは穀類を精白して残った穀類の割合を言い、例えば精白歩合 9 0%とは、穀類の表層部の穀皮等を 10%削り取ることを意味する。また、本発明にお いて玄麦とは、未精白の麦から、穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白 されたものまで、すなわち精白歩合 90%以上のものを含む。また、穀皮とは穀類の 粒の表面を覆って 、る外側部位のことを言う。
[0044] 穀類に含まれるでん粉は、培養前にあら力じめ糊化してぉ 、てもよ 、。でん粉の糊 化方法については特に限定はなぐ蒸きよう法、焙炒法等常法に従って行なえばよい 。後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりでん粉の糊化温 度以上に加熱する場合は、この処理によりでん粉の糊ィ匕も同時に行なわれる。
[0045] 請求項 2に係る本発明の液体培地は、水、上記した培養原料、及びその他の培地 成分を混合して調製される。液体培地は必要に応じて滅菌処理を行なってもよぐ処 理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、 121 でで 15分間行なえばょ 、。
[0046] 請求項 3に係る本発明は、上記の糸状菌培養物の製造方法において、培養原料と して穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、 α化されていないものを用いることにより
、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御するものである。
[0047] 請求項 3に係る本発明にお ヽて、上記培養原料は、穀皮又は外皮が除去されて!ヽ て、かつ、 α化されていないことが必要である。
例えば、培養原料が大麦の場合は、未精白の精白歩合（100%)から穀皮歩合 (一 般的には 7〜8%)を差し引いた割合、すなわち、 92〜93%程度の精白歩合以下の ものを用いることができ、丸麦 (精白歩合 65%)も用いることができる。
上記培養原料にっ 、ては、加熱などデンプンを a化させるような処理は行わな！/ヽが
、必要に応じて脱穀、精白、皮むき、洗浄、細断、細砕、凍結などの処理を施すこと ができる。
[0048] 請求項 3に係る本発明にお ヽて、液体培地における上記の培養原料の配合割合 は、糸状菌培養物中にダルコアミラーゼ、及び耐酸性ひ—アミラーゼが選択的に生 成、蓄積される程度とする。具体的には、液体培地に対して培養原料を l〜10% (w /vol)、好ましくは 2〜6% (w/vol)添加すればよいが、使用する糸状菌株、培養原 料の種類等によって最適な配合割合は異なるので、これらを考慮して適宜に選択す ればよい。
培養原料の使用量が上限値より多くなると、好気性糸状菌を用いる場合、培養液の 粘性が高くなり糸状菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分と なり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。一方 、該原料の使用量が下限値に満たないと、ダルコアミラーゼや耐酸性 α—アミラーゼ が高生産されない。
[0049] 請求項 3に係る本発明の液体培地は、水、上記した培養原料、及びその他の培地 成分を混合して調製される。このとき、必要であれば培養原料以外の培地成分を水と 混合して、予め滅菌処理を行った後に、 α化されていないデンプン原料をさらに添 加することができる。あるいは、培養原料の一部およびその他の培地成分を水と混合 して、予め滅菌処理を行った後に、 α化されていない残りの培養原料をさらに添加す る方法を採ることちでさる。
なお、滅菌処理方法は特に限定されない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げるこ とができ、 121°Cで 15分間行なえばよい。
[0050] 上記の培養法で糸状菌を培養することにより、目的とする酵素が効率よく生成-蓄 積された糸状菌培養物が得られる。尚、本発明において糸状菌培養物とは、培養し たそのものの他に、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、それらの濃 縮物や精製物、乾燥物等を包含するものとする。
[0051] 上述の通り、上記の培養法によれば、培養系内のグルコースなどの糖や、アミノ酸 などのタンパク分解物の濃度により、その生産性がカタボライト抑制を受ける酵素群 を高生産することができる。
したがって、請求項 11に記載の酵素の生産方法は、上記した糸状菌培養物の製 造方法と同様である。
[0052] 本発明により得られた糸状菌培養物は、発酵飲食品の製造だけでなぐ糖、ァミノ 酸およびこれらの誘導体の製造や、酵素剤、医薬消ィ匕剤などに用いることができる。 例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製 造する場合には、もろみ仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込 みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、醸造酢を製 造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階にお いて、甘酒を製造する場合には、仕込みの段階において、麹菌培養物を固体麹の 代わりに用いることができる。なお、これら発酵飲食品の製造に用いる発酵原料 (掛 け原料）は、 α化されていても、されていなくても良い。
また、得られた糸状菌培養物の一部を次の糸状菌培養物製造におけるスターター として用いることもできる。このように糸状菌培養物を連続的に製造することにより、安 定的な生産が可能になると同時に、生産効率の向上も図ることができる。
[0053] 本発明における糸状菌培養物から酵素剤を製造する方法としては、培養物をその まま、もしくはその濾液ゃ遠心分離上清等を液状酵素剤とすることもできるし、常法に より乾燥あるいは担体に固定することにより粉末状'粒状酵素剤とすることもできる。ま た、このとき必要に応じて適当な賦形剤等を添加してもよい。
[0054] また、上記の糸状菌培養物を用いて酒類等の発酵飲食品を製造する場合には、全 工程を液相で行なうことができる。例えば、焼酎を製造する場合、トウモロコシ、麦、米 、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約 80°Cの高温で耐熱性酵素剤を 使用して溶かして液化した後、これに上記した麹菌培養物、及び酵母を添加すること でアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製 造することができる。
実施例
[0055] 以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。
[0056] <実験例 1 >精白歩合の異なる大麦におけるグルコース遊離速度の測定
65%から 98%の精白歩合が異なる大麦 (オーストラリア産スターリング種)を、麹菌培 養物由来の酵素と反応させ、大麦力 のグルコース遊離速度を測定した。
[0057] 具体的には、 65%精白麦、 83%精白麦、 92%精白麦、 95%精白麦、 98%精白麦、
98%精白麦粉砕品をそれぞれ 2gずつは力り取り、水 50mlとともに 200ml三角フラスコ に入れた。これをオートクレープで滅菌（121°C、 15分間）することで、「大麦基質溶液
」を調製した。
[0058] 続 、て、大麦 (オーストラリア産スターリング)を培養原料として用いて製造した麹菌 培養物を、ろ紙ろ過にて固液分離することで「麹菌培養上清液」を得た。
本試験で用いた麹菌培養物の具体的な製造方法は以下に示すとおりとした。
[0059] 1.前培養方法
65%精白麦 8gと水 100mlを 500π バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 1 5分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌 (Aspergillus kawa chii NBRC4308)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで 振盪培養し、前培養液とした。
[0060] 2.本培養方法
硝酸カリウム 0. 2% (wZvol)、リン酸 2水素カリウム 0. 3% (wZvol)を添カ卩した水 に、 98%精白麦が 2. 0% (wZvol)になるようにカ卩えた液体培地を調製した。調製し た液体培地 3000mlを容量 5000mlのジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ製） に張り込み、オートクレープ滅菌（121°C、 15分間）後、あら力じめ前記の方法にて液 体培地で前培養した白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308) 30mlを接種した。そ の後、温度 37°C、攪拌速度 300rpm、通気量 0. 5wmにて 42時間培養を行ない、 ろ紙 (東洋ろ紙 No. 2)でろ過することにより「麹菌培養上清液」を得た。
[0061] 3.測定方法
このように調製した大麦基質溶液 50mlと麹菌培養上清液 50mlをそれぞれ 37°Cで 5 分間保温した後、これらを混合することで反応を開始した。反応開始から lhr後、 2hr 後、 3hr後、および 4hr後にサンプリングした反応液中のグルコース濃度を、ダルコ一 ス C- IIテストヮコー（和光純薬製)を用いて測定した。
[0062] 4.結果
反応液中のグルコース濃度の経時変化は、図 1に示すとおりであり、大麦基質溶液 に用いた大麦の精白歩合によって、グルコース遊離量が異なることが確認された。大 麦の穀皮歩合は通常 10%程度であり、本試験で用いた 65%精白麦ならびに 83%精 白麦は、その表面に穀皮が存在しない。一方、 92%精白麦、 95%精白麦、 98%精白 麦は表面に穀皮が残った状態にある。
図 1を見ると、表面に穀皮がない 65%および 83%精白麦と 98%精白麦粉砕品を用 いた試験区では、いずれも高いグルコース濃度を示していたのに対し、 92%、 95%お よび 98%精白麦を用いた試験区では、精白歩合が低いほど、グルコース濃度が低い ことが分かる。このことから、穀皮の存在によりグルコース遊離量が調整されることが 示された。
[0063] 図 2は、本試験における反応の初発 1時間におけるグルコース遊離速度を計算した ものである。この図から、精白歩合が低いほど、グルコース遊離速度が低く制御され ることが確認できた。
一方、 98%精白麦粉砕品を用いた試験区では、グルコース遊離速度が 65%精白 麦と同等レベルまで上昇しており、穀皮が大麦デンプン質を物理的に覆っていること 力 グルコース遊離速度を調整して ヽる主要因であることが示唆された。 [0064] <実施例 1 >精白歩合の異なる大麦を用いた白麹菌培養物の製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で白麹菌培養 物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
[0065] 1.前培養方法
65%精白麦 8gと水 100mlを 500π バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 1 5分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌 (Aspergillus kawa chii NBRC4308)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで 振盪培養し、前培養液とした。
[0066] 2.本培養方法
65%精白麦、 83%精白麦、 92%精白麦、 95%精白麦、 98%精白麦のいずれか 2g と、硝酸カリウム 0. 2g、リン酸 2水素カリウム 0. 3g及び水 100mlを 500π バッフル付 三角フラスコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この本 培養培地へ前培養液 lmlを植菌し、 37°C、 48時間、 lOOrpmで振盪培養した。
[0067] 3.測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるダルコアミラーゼ活性 (GA)とひ—アミラーゼ 活性 (AA)、耐酸性 a—アミラーゼ活性 (ASAA)につ 、て測定した。
ダルコアミラーゼ活性 (GA)の測定は、糖ィ匕カ分別定量キット (キッコーマン製)を用 いて行い、 α—アミラーゼ活性 (AA)の測定は、 α—アミラーゼ測定キット（キッコーマ ン製)を用いて行なった。また、耐酸性 a—アミラーゼ活性 (ASAA)の測定は、く Sud 0 S. et al: J. Ferment. Bioeng., 7り, 105- 110(1993)、 Sudo S. et al: J. Ferme nt. Bioeng., 77, 483- 489(1994)、須藤茂俊ら： 日本醸造協会誌.， 89, 768- 774(199 4) >に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性 α アミラー ゼ活性を失活させた後、 OC—アミラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて行なつ た。より具体的には、培養液 lmlに 9mlの lOOmM 酢酸緩衝液 (pH3)を添カ卩し、 3 7°Cで 1時間酸処理を行なった後に、 a アミラーゼ測定キット（キッコーマン製)を用 いて測定した。
[0068] また、セルロース分解酵素であるセルラーゼ活性 (CEL)と 13 -ダルコシダーゼ活性 ( BGL)の測定も同時に行なった。セルラーゼ活性（CEL)は、カルボキシメチルセル口 ース (CMC)を基質として加水分解により生じた還元糖量を、ジニトロサリチル酸 (Dini trosalicylic acid; DNS)法により定量する方法により行なった。より具体的には、 1%C MC基質溶液（シグマ社製 low viscosityを lOOmM酢酸緩衝液（pH5)に溶解） 1mlに 培養液 lmlをカ卩えて、 40°Cにて正確に 10分間酵素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸ィ匕ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水 和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3%を含む) 4mlを加えてよく混合し、反応を停止した 。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で 1 5分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、 540nmの吸光度を測定するこ とでグルコースに相当する還元糖量として定量した。 1単位のセルラーゼ活性 (CEL) は、 1分間に 1 μ molのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0069] j8 -ダルコシダーゼ活性測定は以下の方法により行なった。 ImMの p— -トロフエ- ル - j8 - D -ダルコビラノシド（PNPG)を基質とし、 50mM酢酸緩衝液（pH5)中、 37°Cで 正確に 10分間酵素反応を行い、反応停止後、 410應の吸光度により生じた p—ニトロ フエノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液の 2倍量 の 200mM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性 1単位は、 1分間に 1 μ molのグルコースを遊離する活性とした。
測定結果を図 3ならびに図 4に示す。
[0070] 4.結果
図 3に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が 高くなつた。また、精白歩合の低い 98%精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が 著しく低くなつた。さらに、図 4に示すように、セルロース分解酵素の生産性も精白歩 合が低くなるに従って高くなる傾向が確認された。このように、白麹菌培養物の酵素 生産性は実験例 1にて示したグルコース遊離速度と逆相関する傾向が確認され、大 麦精白歩合を変えることで白麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された
[0071] <実施例 2>精白歩合の異なる大麦を用いた黒麹菌培養物の製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で黒麹菌培養 物を製造し、それらの酵素活性を測定した。 [0072] 1.前培養方法
65%精白麦 8gと水 100mlを 500π バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 1 5分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に黒麹菌 (Aspergillus awam ori NBRC4388)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで振 盪培養し、前培養液とした。
[0073] 2.本培養方法
65%精白麦、 83%精白麦、 92%精白麦、 95%精白麦、 98%精白麦のいずれか 2g と、硝酸カリウム 0. 2g、リン酸 2水素カリウム 0. 3g及び水 100mlを 500π バッフル付 三角フラスコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この本 培養培地へ前培養液 lmlを植菌し、 37°C、 48時間、 lOOrpmで振盪培養した。
[0074] 3.測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるダルコアミラーゼ活性 (GA)とひ—アミラーゼ 活性 (AA)、耐酸性 a—アミラーゼ活性 (ASAA)につ 、て測定した。
ダルコアミラーゼ活性 (GA)の測定は、糖ィ匕カ分別定量キット (キッコーマン製)を用 いて行い、 α—アミラーゼ活性 (AA)の測定は、 α—アミラーゼ測定キット（キッコーマ ン製)を用いて行なった。また、耐酸性 a—アミラーゼ活性 (ASAA)の測定は、く Sud 0 S. et al: J. Ferment. Bioeng., 7り, 105- 110(1993)、 Sudo S. et al: J. Ferme nt. Bioeng., 77, 483- 489(1994)、須藤茂俊ら： 日本醸造協会誌.， 89, 768- 774(199 4) >に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性 α アミラー ゼ活性を失活させた後、 OC—アミラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて行なつ た。より具体的には、培養液 lmlに 9mlの lOOmM 酢酸緩衝液 (pH3)を添カ卩し、 3 7°Cで 1時間酸処理を行なった後に、 a アミラーゼ測定キット（キッコーマン製)を用 いて測定した。
測定結果を図 5〜7に示す。
[0075] 4.結果
図 5〜7に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産 性が高くなつた。また、精白歩合の低い 98%精白麦であっても、粉砕すると酵素生産 性が著しく低くなつた。このように、黒麹菌培養物の酵素生産性は実験例 1にて示し たダルコース遊離速度と逆相関する傾向が確認され、大麦精白歩合を変えることで 黒麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。
[0076] <実施例 3 >精白歩合の異なる大麦を用いた黄麹菌培養物の製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で黄麹菌培養 物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
[0077] 1.培養方法
65%精白麦、 83%精白麦、 92%精白麦、 95%精白麦、 98%精白麦のいずれか 2g と、硝酸ナトリウム 1. 2% (wZvol)、塩ィ匕カリウム 0. 8% (wZvol)、リン酸 2水素カリ ゥム 0. 4% (w/vol)、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 2% (w/vol)、硫酸鉄 7水和物 0. 08% (wZvol)及び水を含む培地 100mlを 500mlバッフル付三角フラスコに張り 込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この培地へ黄麹菌 (Asperg illus oryzae RIB40)を 1 X 106個/ mlになるように植菌し、 30。C、 72時間、 lOOrpm で振盪培養した。
[0078] 2.測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるダルコアミラーゼ活性 (GA)とひ—アミラーゼ 活性 (AA)につ 、て測定した。
ダルコアミラーゼ活性 (GA)の測定は、糖ィ匕カ分別定量キット (キッコーマン製)を用 いて行い、 α—アミラーゼ活性 (AA)の測定は、 α—アミラーゼ測定キット（キッコーマ ン製)を用いて行なった。
測定結果を図 8, 9に示す。
[0079] 3.結果
図 8, 9に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性 が高くなつた。特にダルコアミラーゼは 98%精白麦で顕著に活性が上昇した。また、精 白歩合の低い 98%精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなつた。こ のように、黄麹菌培養物の酵素生産性は実験例 1にて示したグルコース遊離速度の 影響を大きく受けており、大麦精白歩合を変えることで黄麹菌培養物の酵素生産性 を制御できることが示された。
[0080] <実施例 4 >精白歩合の異なる大麦を用いた糸状菌（トリコデルマ ·ピリデ)培養物の 製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース 分解酵素生産能を有する糸状菌（トリコデルマ ·ピリデ)培養物を製造し、それらの酵 素活性を測定した。
[0081] 1.前培養方法
グルコース 2%、酵母エキス 0. 5%、硝酸カリウム 0. 1%、リン酸水素 1カリウム 0. 1 %、硫酸アンモ-ゥム 0. 07%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、塩化カルシウム 0. 02% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500π バッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地 にトリコデルマ.ビリデ（Trichoderma viride NBRC31137)を 1 X 106個/ mlになるよう に植菌し、 30°C、 24時間、 lOOrpmで振盪培養し、前培養液とした。
[0082] 2.本培養方法
精白大麦 2%、トリプトン 0. 08%、硫酸アンモ-ゥム 0. 25%、リン酸アンモ-ゥム 0 . 1%、塩化カルシウム 0. 03%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、硝酸カリウム 0 . 12% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500mlバッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、 65%精白麦、 83%精白麦、 92%精白麦、 95%精白 麦、 98%精白麦、又は 98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液 10mlを植菌し、 30°C、 90時間、 lOOrpmで 振盪培養した。
[0083] 3.測定方法
培養終了後、セルロース分解酵素であるセルラーゼ活性 (CEL)測定を行なった。 セルラーゼ活性 (CEL)はカルボキシメチルセルロース（CMC)を基質として加水分解 により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定量 する方法により行なった。より具体的には、 1%CMC基質溶液 (シグマ社製 low viscosi tyを lOOmM酢酸緩衝液 (pH5)に溶解） 1ml〖こ培養液 lmlをカ卩えて、 40°Cにて正確 に 10分間酵素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸ィ匕 ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3%を 含む) 4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を 定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、室 温まで冷却した後、 540nmの吸光度を測定することでダルコースに相当する還元糖 量として定量した。 1単位のセルラーゼ活性（CEL)は、 1分間に： molのグルコース に相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0084] 4.結果
測定結果を図 10に示す。麹菌以外の糸状菌であるトリコデルマ'ビリデにおいても 、精白歩合によってセルラーゼ生産性に差が生じることが確認された。 98%精白麦 を使用すると最も高い酵素生産性が得られたが、同粉砕品では酵素活性が著しく低 下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果がセルラーゼ高生産に寄与す ることが示唆された。
[0085] <実施例 5 >精白歩合の異なる大麦を用いた糸状菌（トリコデルマ ·リーセィ)培養物 の製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース 分解酵素生産能を有する糸状菌（トリコデルマ ·リーセィ)培養物を製造し、それらの 酵素活性を測定した。
[0086] 1.培養方法
(1)前培養方法
グルコース 2%、酵母エキス 0. 5%、硝酸カリウム 0. 1%、リン酸水素 1カリウム 0. 1 %、硫酸アンモ-ゥム 0. 07%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、塩化カルシウム 0. 02% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500π バッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地 にトリコデルマ.リーセィ（Trichoderma ressei NBRC31326)を 1 X 106個 Zmlになるよ うに植菌し、 30°C、 72時間、 lOOrpmで振盪培養し、前培養液とした。
[0087] (2)本培養方法
精白大麦 2%、トリプトン 0. 08%、硫酸アンモ-ゥム 0. 25%、リン酸アンモ-ゥム 0 . 1%、塩化カルシウム 0. 03%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、硝酸カリウム 0 . 12% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500mlバッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、 65%精白麦、 83%精白麦、 95%精白麦、 98%精白 麦、又は 98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液 10mlを植菌し、 30°C、 96時間、 lOOrpmで 振盪培養した。
[0088] 2.酵素活性測定方法
培養終了後、培養液力 遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵 素の活性を測定した。
[0089] (1)セルラーゼ活性測定法
セルラーゼ活性 (CEL)はカルボキシメチルセルロース（CMC)を基質として加水分 解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定 量する方法により行なった。より具体的には、 1%CMC基質溶液 (シグマ社製 low vise osityを lOOmM酢酸緩衝液 (pH5)に溶解） 1mlに培養液 lmlをカ卩えて、 40°C〖こて正 確に 10分間酵素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸 化ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3% を含む) 4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量 を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、 室温まで冷却した後、 540nmの吸光度を測定することでダルコースに相当する還元 糖量として定量した。 1単位のセルラーゼ活性（CEL)は、 1分間に: molのダルコ一 スに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0090] (2)キシラナーゼ活性測定法
次に、キシラナーゼ活性 (XYL)は、 oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水 分解により生成した還元糖を DNSと反応させ、 540nmの吸光度の増加で定量した。よ り具体的には 1%キシラン基質溶液 [シグマ社製 Xylan,from oat speltsを 200mM酢酸 緩衝液 (PH4.5)に溶解] 1.9mlに培養液 0.1mlを加えて、 40°Cにて正確に 10分間酵 素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸化ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3%を含む） 4mlを 加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するため に、反応停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した 後、 540應の吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した 。 1単位のキシラナーゼ活性は、 40°C、 10分間の反応条件下で、 1分間に 1 /z molのキ シロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0091] (3) β -ダルコシダーゼ活性測定法
β -ダルコシダーゼ活性 (BGL)測定は以下の方法により行なった。 ImMの ρ— -ト 口フエ-ル- 13 -D -ダルコビラノシド（PNPG)を基質とし、 50mM酢酸緩衝液 (pH5)中、 37°Cで正確に 10分間酵素反応を行い、反応停止後、 410應の吸光度により生じた p —ニトロフエノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液 の 2倍量の 200mM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性 1単位は、 1分間に 1 μ molのグルコースを遊離する活性とした。
[0092] 3.結果
測定結果を図 11〜13に示す。麹菌以外の糸状菌であるトリコデルマ'リーセィにお いても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。 95%もしくは 98%精白麦を使用すると高い酵素生産性が得られたが、 98%精白麦粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効 果が植物繊維分解酵素高生産に寄与することが示唆された。
[0093] <実施例 6 >精白歩合の異なる大麦を用いた糸状菌（ァスペルギルス ·アキユレータ ス)培養物の製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース 分解酵素生産能を有する糸状菌 (ァスペルギルス ·アキユレ一タス)培養物を製造し、 それらの酵素活性を測定した。
[0094] 1.培養方法
(1)前培養方法
グルコース 2%、酵母エキス 0. 5%、硝酸カリウム 0. 1%、リン酸水素 1カリウム 0. 1 %、硫酸アンモ-ゥム 0. 07%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、塩化カルシウム 0. 02% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500π バッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地 にァスペルギルス'アキユレ一タス（Aspergillus aculeatus NBRC3530)を 1 X 106個/ mlになるように植菌し、 30°C、 72時間、 lOOrpmで振盪培養し、前培養液とした。
[0095] (2)本培養方法
精白大麦 2%、トリプトン 0. 08%、硫酸アンモ-ゥム 0. 25%、リン酸アンモ-ゥム 0 . 1%、塩化カルシウム 0. 03%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、硝酸カリウム 0 . 12% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500mlバッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、 65%精白麦、 83%精白麦、 95%精白麦、 98%精白 麦、又は 98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液 10mlを植菌し、 30°C、 96時間、 lOOrpmで 振盪培養した。
[0096] 2.酵素活性測定方法
培養終了後、培養液力 遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵 素の活性を測定した。
[0097] (1)セルラーゼ活性測定法
セルラーゼ活性 (CEL)はカルボキシメチルセルロース（CMC)を基質として加水分 解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定 量する方法により行なった。より具体的には、 1%CMC基質溶液 (シグマ社製 low vise osityを lOOmM酢酸緩衝液 (pH5)に溶解） 1mlに培養液 lmlをカ卩えて、 40°C〖こて正 確に 10分間酵素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸 化ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3% を含む) 4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量 を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、 室温まで冷却した後、 540nmの吸光度を測定することでダルコースに相当する還元 糖量として定量した。 1単位のセルラーゼ活性（CEL)は、 1分間に: molのダルコ一 スに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0098] (2) β -ダルコシダーゼ活性測定法
β -ダルコシダーゼ活性 (BGL)測定は以下の方法により行なった。 ImMの ρ— -ト 口フエ-ル- 13 -D -ダルコビラノシド（PNPG)を基質とし、 50mM酢酸緩衝液 (pH5)中、 37°Cで正確に 10分間酵素反応を行い、反応停止後、 410應の吸光度により生じた p —ニトロフエノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液 の 2倍量の 200mM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性 1単位は、 1分間に 1 μ molのグルコースを遊離する活性とした。
[0099] 3.結果
測定結果を図 14、 15に示す。麹菌以外の糸状菌であるァスペルギルス ·アキユレ 一タスにおいても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが 確認された。 98%精白麦を使用すると高い酵素生産性が得られた。一方、同粉砕品 では CEL活性、 BGL活性が低下したことから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果 力 Sこれら酵素の高生産に寄与することが示唆された。
[0100] <実施例 7 >精白歩合の異なる大麦を用いた白色腐朽菌培養物の製造
各種精白麦 (オーストラリア産スターリング）を用い、以下のような方法でセルロース 分解酵素生産能を有する白色腐朽菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定し た。
[0101] 1.培養方法
( 1)前培養方法
グルコース 2%、酵母エキス 0. 5%、硝酸カリウム 0. 1 %、リン酸水素 1カリウム 0. 1 %、硫酸アンモ-ゥム 0. 07%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、塩化カルシウム 0. 02% (V、ずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500π バッフル付三角フラ スコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地 にィルペックス'ラタテウス（Irpex lacteus NBRC5367)の 5mm四方の菌糸マット 30個を 植菌し、 28°C、 96時間、 120rpmで振盪培養し、前培養液とした。
[0102] (2)本培養方法
精白大麦 2%、ポリペプトン 0. 1 %、硫酸アンモ -ゥム 0. 14%、リン酸二水素力リウ ム 0. 2%、尿素 0. 03%、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 03%、塩ィ匕カルシウム 0. 03 %、ツイーン 80 0. 1 % (いずれも wZvol)および水を含む培地 100mlを 500π バッ フル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 15分間オートクレープ滅菌した。 なお、上記精白大麦として、 65%精白麦、 83%精白麦、 98%精白麦、又は 98% 精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液 10mlを植菌し、 28°C、 96時間、 120rpmで 振盪培養した。
[0103] 2.酵素活性測定方法
培養終了後、培養液力 遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵 素の活性を測定した。
[0104] (1)セルラーゼ活性測定法
セルラーゼ活性 (CEL)はカルボキシメチルセルロース（CMC)を基質として加水分 解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸（Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定 量する方法により行なった。より具体的には、 1%CMC基質溶液 (シグマ社製 low vise osityを lOOmM酢酸緩衝液 (pH5)に溶解） 1mlに培養液 lmlをカ卩えて、 40°Cにて正 確に 10分間酵素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸 化ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3% を含む) 4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量 を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、 室温まで冷却した後、 540nmの吸光度を測定することでダルコースに相当する還元 糖量として定量した。 1単位のセルラーゼ活性（CEL)は、 1分間に: molのダルコ一 スに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0105] (2)キシラナーゼ活性測定法
次に、キシラナーゼ活性 (XYL)は、 oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水 分解により生成した還元糖を DNSと反応させ、 540nmの吸光度の増加で定量した。よ り具体的には 1%キシラン基質溶液 [シグマ社製 Xylan,from oat speltsを 200mM酢酸 緩衝液 (PH4.5)に溶解] 1.9mlに培養液 0.1mlを加えて、 40°Cにて正確に 10分間酵 素反応を行なわせた後、 DNS試薬 (ジニトロサリチル酸 0. 75%、水酸化ナトリウム 1. 2%、酒石酸ナトリウムカリウム 4水和物 22. 5%、乳糖 1水和物 0. 3%を含む） 4mlを 加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するため に、反応停止液を沸騰水浴中で 15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した 後、 540應の吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した 。 1単位のキシラナーゼ活性は、 40°C、 10分間の反応条件下で、 1分間に 1 /z molのキ シロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
[0106] 3.結果
測定結果を図 16、 17に示す。白色腐朽菌においても、精白歩合によって植物繊 維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。 98%精白麦を使用すると最も高 い酵素生産性が得られたが、同粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大 麦穀皮による栄養分放出抑制効果が植物繊維分解酵素高生産に寄与することが示 唆された。
[0107] <実施例 8 > α化されていない丸麦を用いた白麹菌培養物の製造
(1)前培養方法； 丸麦 (オーストラリア産スターリング種) 8gと水 100mlを 500πύバッフ ル付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌した。この前培養培 地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC 4308)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 3 7°C、 24時間、 lOOrpmで振とう培養することにより前培養液を得た。
[0108] (2)本培養方法； KNO 0.2g、 KH PO 0.3g、および水 100mlを 500mlバッフル付三
3 2 4
角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌した。冷却後、クロラムフエ 二コール (和光純薬工業株式会社)を 50 μ g/mlとなるように添加し、加熱処理して ヽ ない丸麦 2gを添カ卩した。この本培養培地へ前培養液 lmlを植菌し、 37°C、 72時間、 1 OOrpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。
対照として、 α化された培養原料を用いて麹菌培養物を製造した。すなわち、丸麦 2g、KNO 0.2g、KH PO 0.3g、水 100mlを 500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、
3 2 4
121°C、 15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフエ-コールを 50 g/mlと なるように添カ卩した。この本培養培地へ前培養液 lml植菌し、 37°C、 72時間、 1 OOrpm で振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。
[0109] (3)測定方法
各試験区で得られた麹菌培養物について、ダルコアミラーゼ、耐酸性 α—アミラー ゼおよび α—アミラーゼの活性を測定した。すなわち、ダルコアミラーゼ活性の測定 は、糖ィ匕カ分別定量キット（キッコーマン製)を用いて行った。耐酸性ひ一アミラーゼ 活性の測定は、 < Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105- 110(1993)、 Sudo
S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483- 489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協 会誌.， 89, 768-774(1994) >に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理すること で非耐酸性ひ一アミラーゼ活性を失活させた後、 —アミラーゼ測定キット (キッコー マン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液 lmlに 9mlの lOOmM 酢酸緩 衝液 (pH3)を添加し、 37°Cで 1時間酸処理を行なった後に、 α—アミラーゼ測定キ ット（キッコーマン製)を用いて行った。また、 α アミラーゼ活性の測定は、 α—アミ ラーゼ測定キット（キッコーマン製)を用いて行った。結果を以下の表 1に示す。
[0110] (4)結果
本発明の生丸麦麹菌培養物において、ダルコアミラーゼ、耐酸性ひ—アミラーゼ共 に良好に、かつ、ノランスよく生産された。一方、 a アミラーゼはやや低い生産量 であった。
対照において、耐酸性ひ—アミラーゼやひ アミラーゼが比較的多く生産されたの は、 α化された原料を用いている力 KNO や KH ΡΟの存在により栄養条件が好適
3 2 4
な範囲に維持されているためと考えられる。
よって、本発明により、発酵飲食品の製造に使用可能な麹菌培養物が製造できるこ とが明らかになった。
[0111] [表 1]
Figure imgf000031_0001
<実施例 9 > a化されて!/、な 、丸麦を用いた白麹菌培養物による麦焼酎の製造 (1)前培養方法； 丸麦 (オーストラリア産スターリング種) 8gと水 100mlを 500πύバッフ ル付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌した。この前培養培 地に白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC 4308)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 3 7°C、 24時間、 lOOrpmで振盪培養することにより、前培養液を得た。 (2)本培養方法； 丸麦 0.5g、KNO 0.2g、KH PO 0.3g、水 100mlを 500mlバッフル付
3 2 4
三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌した。この本培養培地へ 前培養液を lmlずつ植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで振とう培養した。その後、加熱 処理していない丸麦を 1.5g添カ卩し、 37°C、 48時間、 lOOrpmでさらに振盪培養すること により、麹菌培養物を得た。
(3)酵母;鹿児島酵母を lmlの YPD培地にて一晩 100 rpmで振盪培養し、遠心集菌 後、滅菌水で 2回洗浄した。
(4)仕込み； 仕込み配合を以下の表 2に示す。掛麦としては、丸麦を洗浄後、 60分 間水に浸漬し、 30分間水切り後、 40分間蒸したものを用いた。酵母は先に述べたも のを全量用いた。
[0113] [表 2]
Figure imgf000032_0001
[0114] (5)発酵条件； 25°Cで 20日発酵させた。 1次仕込みから 3日後に 2次仕込みを行つ た。
(6)蒸留；—650mmHgの減圧下で減圧蒸留した。
[0115] (7)結果
発酵は順調に進んだ。発酵終了後のもろみのアルコール度数は 17. 5%であった 蒸留後のサンプルの官能評価を酒類専門パネル 6名で行ったところ、きれ 、な酒 質であり、評価が高力つた。
この結果から、本発明の方法によって問題ない品質の麦焼酎が製造できることが明 らかとなつた。
[0116] <実施例 10 > α化されていない丸麦を用いた黄麹菌培養物の製造
(1)前培養方法； 丸麦 (オーストラリア産スターリング種) 8gと水 100mlを 500πύバッフ ル付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌した。この前培養培 地に黄麹菌（Aspergillus oryzae NRIB40)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで振盪培養して、前培養液を得た。
[0117] (2)本培養方法； KNO 0.8g、 KH PO 1.2g、 MgSO 0.2g、水 100mlを 500mlバッフル
3 2 4 4
付三角フラスコに張り込み、 121°C、 15分間オートクレープ滅菌した。冷却後、クロラム フエ二コール (和光純薬工業株式会社)を 50 μ g/mlとなるように添加し、丸麦 2gを添 加した。この本培養培地へ前培養液を lml植菌し、 37°C、 72時間、 lOOrpmで振盪培 養することにより、麹菌培養物を製造した。
ポジティブコントロールとして、請求項 2に記載の本発明の方法により、麹菌培養物 を製造した。すなわち、 95%精麦 (オーストラリア産スターリング種） 2g、 KNO 0.8g、 K
3
H PO 1.2g、 MgSO 0.2g、および水 100mlを 500mlバッフル付三角フラスコに張り込み
2 4 4
、 121°C、 15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフエ-コールを 50 g/ml となるよう〖こ添加した。この本培養培地へ前培養液を lml植菌し、 37°C、 72時間、 100r pmで振盪培養することにより、麹菌培養物を製造した。
[0118] (3)結果
各試験区で得られた麹菌培養物につ!、て、実施例 8と同様にしてダルコアミラーゼ および α—アミラーゼの活性を測定した。結果を以下の表 3に示す。
生丸麦麹菌培養物では、ダルコアミラーゼが良好に生産され、 (X アミラーゼ活性 はやや低力つた。両酵素とも、ポジティブコントロールに比べて活性は劣っているが、 ノ ランスよく生産されており、発酵飲食品の製造に使用可能な麹菌培養物が製造で きることが明らかになった。
[0119] [表 3]
Figure imgf000033_0001
[0120] <実験例 2>滅菌時の無機塩濃度が異なる大麦基質溶液におけるグルコース遊離 速度の測定 異なる塩濃度の大麦含有無機塩水溶液をオートクレープ滅菌して得た大麦基質溶 液を、麹菌培養物由来の酵素と反応させ、大麦力 のグルコース遊離速度を測定し た。
[0121] 1.大麦基質溶液調製方法
まず、 98%精白麦 (オーストラリア産スターリング)を 2gは力り取り、水 50mlとともに 50 0ml三角フラスコに入れた。これをオートクレーブで滅菌（121°C、 15分間）することで 、大麦基質溶液を調製し、これを「No.l対照区」とした。
また、「No.2塩類使用区」では、「No.l対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム O.lgとリン酸 2水素カリウム 0.15gを含む無機塩水溶液 50mlを用いてオートクレーブ滅 菌した。つまり、オークレーブ滅菌時の塩類濃度は硝酸カリウム 0.2%とリン酸 2水素力 リウム 0.3%である。
「No.3滅菌時高濃度塩類使用区」では、「No.l対照区」において、水のかわりに硝 酸カリウム O.lgとリン酸 2水素カリウム 0.15gを含む無機塩水溶液 10mlを用いてオート クレープ滅菌後、滅菌水を 40ml添加した。つまり、滅菌時の塩類濃度は No.2の 5倍量 である硝酸カリウム 1.0%とリン酸 2水素カリウム 1.5%である力 滅菌 ·加水後の塩類濃 度は No.2と同じ硝酸カリウム 0.2%とリン酸 2水素カリウム 0.3%になるように調製したもの である。
[0122] 2.麹菌培養上清液調製方法
続 、て、大麦 (オーストラリア産スターリング)を培養原料として用いて製造した麹菌 培養物を、ろ紙ろ過にて固液分離することで「麹菌培養上清液」を得た。
本試験で用いた麹菌培養物の具体的な製造方法は以下に示すとおりとした。
[0123] (1)前培養方法
65%精白麦 8gと水 100mlを 500π バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 1 5分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌 (Aspergillus kawa chii NBRC4308)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで 振盪培養し、前培養液とした。
[0124] (2)本培養方法
硝酸カリウム 0. 2% (wZvol)、リン酸 2水素カリウム 0. 3% (wZvol)を添カ卩した水 に、 98%精白麦が 2. 0% (wZvol)になるようにカ卩えた液体培地を調製した。調製し た液体培地 3000mlを容量 5000mlのジャーフアーメンター（丸菱バイオェンジ製） に張り込み、オートクレープ滅菌（121°C、 15分間）後、あら力じめ前記の方法にて液 体培地で前培養した白麹菌（Aspergillus kawachii NBRC4308) 30mlを接種した。そ の後、温度 37°C、攪拌速度 300rpm、通気量 0. 5wmにて 42時間培養を行ない、 ろ紙 (東洋ろ紙 No. 2)でろ過することにより「麹菌培養上清液」を得た。
[0125] 3.グルコース遊離速度の測定方法
大麦基質溶液 50mlと麹菌培養上清液 50mlをそれぞれ 37°Cで 5分間保温した後、こ れらを混合することで反応を開始した。反応開始から 3hr後にサンプリングした反応液 中のグルコース濃度をグルコース C- Πテストヮコー（和光純薬製）を用いて測定し、グ ルコース遊離速度を算出した。
[0126] 4.結果
反応液中のダルコース濃度測定結果力 算出されたダルコース遊離速度は、図 18 に示すとおりであり、大麦基質溶液調製時の塩類濃度によって、グルコース遊離速 度が異なることが確認された。上記実験例 1にて、大麦の精白歩合によってダルコ一 ス遊離速度の調整が可能なことを既に示したが、本試験によって オートクレーブ滅 菌等の加熱処理時における塩類の存在によっても、グルコース遊離速度が低くなる ことを確認した。これは、大麦の加熱処理時に塩類が存在することで、大麦の物理的 な崩壊が抑えられることに起因すると推察された。
[0127] く実施例 11 >滅菌時の無機塩濃度が異なる大麦を用いた白麹菌培養物の製造 各種精白麦 (オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で白麹菌培養 物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
[0128] 1.前培養方法
65%精白麦 8gと水 100mlを 500π バッフル付三角フラスコに張り込み、 121°Cで 1 5分間オートクレープ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌 (Aspergillus kawa chii NBRC4308)を 1 X 106個 Zmlになるように植菌し、 37°C、 24時間、 lOOrpmで 振盪培養し、前培養液とした。
[0129] 2.本培養方法 98%精白麦（オーストラリア産スターリング）を 2gは力り取り、水 100mlとともに 500ml 三角フラスコに入れ、これをオートクレーブで滅菌（121°C、 15分間）することで、本培 養培地を調製し、これを「No.l対照区」とした。
また、「No.2塩類使用区」では、「No.l対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム 0.2gとリン酸 2水素カリウム 0.3gを含む無機塩水溶液 100mlを用いてオートクレーブ滅 菌し 7こ。
「Νο.3滅菌時高濃度塩類使用区」では、「No.l対照区」において、水のかわりに硝 酸カリウム 0.2gとリン酸 2水素カリウム 0.3gを含む無機塩水溶液 20mlを用いてオートク レーブ滅菌後、滅菌水を 80ml添加した。つまり、滅菌時の塩類濃度は No.2の 5倍量 である硝酸カリウム 1.0%とリン酸 2水素カリウム 1.5%である力 滅菌 ·加水後の塩類濃 度は No.2と同じの硝酸カリウム 0.2%とリン酸 2水素カリウム 0.3%になるように調製したも のである。
上記のように調製した本培養培地を放冷後、前培養液 lmlを植菌し、 37°C、 48時 間、 lOOrpmで振盪培養した。
[0130] 3.測定方法
培養終了後、デンプン分解酵素であるダルコアミラーゼ活性 (GA)と耐酸性ひ—ァ ミラーゼ活性 (ASAA)について測定した。
ダルコアミラーゼ活性 (GA)の測定は、糖ィ匕カ分別定量キット (キッコーマン製)を用 いて行なった。
また、耐酸性 α—アミラーゼ活性 (ASAA)の測定は、 < Sudo S. et al: J. Ferme nt. Bioeng., 76, 105— 110(1993)、 Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng" 77, 483— 4 89(1994)、須藤茂俊ら： 日本醸造協会誌.， 89, 768-774(1994) >に記載の方法を若 干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性ひ—アミラーゼ活性を失活させた後、 a—アミラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて行なった。より具体的には、培養 液 lmlに 9mlの lOOmM 酢酸緩衝液 (pH3)を添カ卩し、 37°Cで 1時間酸処理を行な つた後に、 OC アミラーゼ測定キット (キッコーマン製)を用いて測定した。
[0131] 4.結果
ダルコアミラーゼ活性の測定結果を図 19に、耐酸性ひ—アミラーゼ活性の測定結 果を 20に示す。
図 19, 20に示すように、滅菌時の塩類濃度が高い No.3では、培養時の塩類濃度 が同様の No.2に比べて酵素生産性が向上した。実験例 2においては、加熱処理時 における大麦基質溶液の無機塩濃度が高 ヽほど、大麦原料からの糖遊離速度が低 くなることが確認された。したがってこれは、麹菌の増殖に対する塩類の効果以外に 、糖遊離速度が酵素生産性に影響を与えることを示唆している。塩類の含まれない N 0.1では、麹菌の増殖が抑えられるとともに、糖遊離速度が高いために酵素生産が著 しく抑制されたと考えられる。
これまで、培地調製時に添加する無機塩類は、培養する際の麹菌増殖にのみ関与 すると考えられていた。しかし、本実施例によって、大麦原料からの糖遊離抑制効果 によっても、麹菌の液体培養における酵素生産が促進される可能性が示唆された。 産業上の利用可能性
本発明の方法では、培養系内の栄養分濃度を低く制御することにより、培養系外か ら栄養分を少量ずつ添加する流加培養を行なわなくても、簡便な回分培養にて流カロ 培養と同等な培養モードが可能となる。
また、本発明によれば、発酵飲食品の製造に用いる糸状菌培養物だけでなぐ幅 広い産業において用いられる糸状菌培養物や、それにより生産される酵素ならびに 酵素剤を安定的かつ安価に製造する方法が提供される。
さらに、本発明は、デンプン分解酵素遺伝子などのプロモーター領域を使用した異 種タンパク質生産などにも応用が期待される。
したがって、本発明は、食品製造業、発酵工業、医薬品製造業など幅広い産業に 利用できる。

Claims

請求の範囲
[I] 培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌァカゝら選ばれた少なく とも 1種を含む液体培地を用いて、当該培養原料中の栄養分の培養系への放出速 度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整 することを特徴とする糸状菌培養物の製造方法。
[2] 培養原料として表面の全部又は一部が少なくとも穀皮に覆われた穀類を用い、当 該穀類の精白歩合を調整することにより、当該穀類中の栄養分の培養系への放出速 度を制御する、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法。
[3] 培養原料として、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、 α化されていないものを 用いることにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する、請求項
1に記載の糸状菌培養物の製造方法。
[4] 液体培地として加熱処理を施したものを用い、当該加熱処理時における液体培地 の無機塩濃度を調整することにより、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を 制御する、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法。
[5] 栄養分が、培養原料中のデンプンに由来する糖および Ζまたは培養原料中のタン パク質に由来するアミノ酸である、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法。
[6] 酵素が、デンプン分解酵素、植物繊維分解酵素、タンパク質分解酵素から選ばれ た少なくとも 1種類である、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法。
[7] 糸状菌が、麹菌、トリコデルマ属菌および白色腐朽菌力 選ばれた少なくとも 1種で ある、請求項 1に記載の糸状菌培養物の製造方法。
[8] 請求項 1〜7の!ヽずれか 1項に記載の方法で得られた糸状菌培養物。
[9] 請求項 8に記載の糸状菌培養物を用いた酵素剤の製造方法。
[10] 請求項 9に記載の方法で得られた酵素剤。
[II] 培養原料として穀類、豆類、芋類、アマランサス、及び、キヌァカゝら選ばれた少なく とも 1種を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を 制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整するこ とを特徴とする酵素の生産方法。
[12] 請求項 11に記載の方法で得られた酵素。
[13] 請求項 8に記載の糸状菌培養物を用いた発酵飲食品の製造方法。
[14] 請求項 10に記載の酵素剤を用いた発酵飲食品の製造方法。
[15] 請求項 12に記載の酵素を用いた発酵飲食品の製造方法。
[16] 請求項 13〜15のいずれか 1項に記載の方法で得られた発酵飲食品。
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