JP2009273472A - 糸状菌培養物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、表面の全部が穀皮で覆われた大麦又は小麦(但し、未精白物は除く)、及び無機塩として硝酸塩およびリン酸塩を含み、加熱処理を施した液体培地を用いること、及び、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を上げることにより、当該大麦又は小麦中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら白麹菌又は黒麹菌を培養することにより、麹菌培養物のグルコアミラーゼ及び/又は耐酸性α−アミラーゼ生産性を調整することを特徴とする麹菌培養物の製造方法を提供する。
【選択図】 なし
Description
また、本発明者らは、穀皮又は外皮が除去されていて、かつ、α化されていないデンプン原料を含む液体培地で麹菌を培養することによって、発酵飲食品の製造に必要なグルコアミラーゼおよび耐酸性α−アミラーゼを多く含有する液体麹を製造できることを見出した。これは、穀皮又は外皮に包まれていない原料でも、α化されていなければ分解されにくく、培養系への糖やアミノ酸等の放出が抑制され、結果的に必要な酵素活性が得られるためと予想される。
本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成するに至ったのである。
請求項2に係る本発明は、栄養分が、大麦又は小麦中のデンプンに由来する糖、および/あるいは、大麦又は小麦中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法である。
請求項3に係る本発明は、加熱処理が、80〜130℃で行われる、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法である。
請求項4に係る本発明は、加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を、麹菌の培養に好適な濃度の10倍以下に調整する、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法である。
請求項6に係る本発明は、加熱処理後に液体培地を希釈して無機塩濃度を調整した後、培養に供する、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法である。
請求項7に係る本発明は、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法で麹菌培養物を得て、該麹菌培養物を用いる、グルコアミラーゼ及び/又は耐酸性α−アミラーゼ剤の製造方法である。
請求項8に係る本発明は、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法で麹菌培養物を得て、該麹菌培養物を用いる、発酵飲食品の製造方法である。
請求項9に係る本発明は、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法で麹菌培養物を得て、該麹菌培養物を用いる、グルコアミラーゼ及び/又は耐酸性α−アミラーゼの製造方法である。
したがって、例えば麦焼酎などの製造について言えば、液体麹製造工程と発酵工程で同一の原料を使用することが可能になり、製造コストを抑えることができる。また、麦の外皮や糠が酒質に良くない影響を与える場合もある。さらに、原料を加熱しないで用いるため、エネルギーの節約にもつながる。
しかも、種々の原料や糸状菌株を用いた糸状菌培養物を組み合わせて製造した糸状菌培養物を使用することで、発酵飲食品のバラエティー化を図ることが容易となる。
また、デンプン分解酵素遺伝子などのプロモーター領域を使用した異種タンパク質生産にも適用の可能性が高い。
本発明は、糸状菌培養物の製造方法に関し、表面の全部が穀皮で覆われた穀類を含む液体培地を用いて、培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら糸状菌を培養することにより、糸状菌培養物の酵素生産性を調整することを特徴とするものである。
培養原料中の栄養分の培養系への放出速度を制御する手段としては、穀類の精白歩合の調整による方法、外皮の付着した豆類、芋類、アマランサス又はキヌアを培養原料に用いる方法、穀皮又は外皮が除去されているがα化されていない培養原料を用いる方法、液体培地を加熱処理する際の無機塩濃度の調整による方法、穀類表面上に食用可能な膜などを人工的に形成し、穀類デンプン質や穀類タンパク質を保護する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、培養原料の培養液中での物理的な崩壊を抑えることで栄養分の放出速度を制御することも可能であり、例えば、攪拌せん断力の弱い培養装置を用いることで、栄養分の放出速度を抑制することができる。
ここで、アマランサスとは、ヒユ科ヒユ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量が高く、アミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べてもカルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。
また、キヌアは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアンデス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富に含んでいる。
なお、これらの培養原料は、単独あるいは2種以上を組み合わせて用いることができる。また、これらの原料の形状は特に限定されない。
この培養原料の配合割合は、糸状菌培養物中に蓄積させようとする目的の酵素が選択的に生成、蓄積される程度のものに調製される。
例えば、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼをバランスよく高生産させるためには、大麦を原料とした場合には、水に対して玄麦を1〜20%(w/vol)添加した液体培地に調製される。また、玄麦として無精白の大麦を用いた場合には、さらに好ましくは8〜10%(w/vol)添加した液体培地に調製され、玄麦として95%精白した大麦を原料とした場合には、さらに好ましくは1〜4%(w/vol)添加した液体培地に調製される。
玄麦の使用量が20%(w/vol)より多くなると、培養液の粘性が高くなり、糸状菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。
たとえば、糸状菌としてアスペルギルス・カワチ(Aspergillus kawachii)等の白麹菌、および、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)やアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)等の黒麹菌を用いる場合は、硝酸塩およびリン酸塩を併用することが好ましく、さらに好ましくは、これらと共に硫酸塩を併用する。ここで、硝酸塩としては硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどを用いることができ、特に硝酸カリウムが好ましい。リン酸塩としてはリン酸2水素カリウム、リン酸アンモニウムなどを用いることができ、特にリン酸2水素カリウムが好ましい。硫酸塩としては硫酸マグネシウム7水和物、硫酸鉄7水和物、硫酸アンモニウムなどを用いることができ、特に硫酸マグネシウム7水和物、硫酸鉄7水和物が好ましい。これらの無機塩は、複数種を組み合わせて用いることもできる。
上限値を超えてこれらの栄養源を添加した場合は、糸状菌の増殖を阻害するため好ましくない。また、添加量が下限値未満である場合は、酵素が十分に生産されないため、やはり好ましくない。
なお、これらの栄養源の他にも、抗生物質、防腐剤等の添加物を必要に応じて液体培地に用いることができる。
すなわち、加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を上げることによって、培養原料中の栄養分の培養系への放出を抑制することができるのである。これは、培養原料を無機塩存在下で加熱することにより、当該原料の物理的な崩壊が抑えられるためと考えられる。
また、加熱処理時における液体培地中の無機塩濃度としては、既述した液体培地中の好適な濃度の1〜10倍程度とすることができる。
なお、加熱処理時における液体培地中の無機塩濃度が、糸状菌の培養に好適な濃度範囲を超えている場合は、加熱処理後に希釈して無機塩濃度を適宜調整した後、培養に供することができる。
本発明において、穀類の形状としては、表面の全部又は一部が少なくとも穀皮で覆われていることが必要であって、未精白物、または少なくとも穀皮が穀粒の表面に残されている程度までに精白された精白歩合以上のもの等を用いることができ、玄米、玄麦なども使用できる。例えば、穀類が大麦の場合には、未精白の精白歩合100%のもの、或いは未精白の精白歩合を100%とし、この未精白の精白歩合(100%)から大麦の穀皮歩合(一般的には7〜8%)を差し引いた割合、すなわち、92〜93%程度の精白歩合以上のものである。
例えば、培養原料が大麦の場合は、未精白の精白歩合(100%)から穀皮歩合(一般的には7〜8%)を差し引いた割合、すなわち、92〜93%程度の精白歩合以下のものを用いることができ、丸麦(精白歩合65%)も用いることができる。
上記培養原料については、加熱などデンプンをα化させるような処理は行わないが、必要に応じて脱穀、精白、皮むき、洗浄、細断、細砕、凍結などの処理を施すことができる。
培養原料の使用量が上限値より多くなると、好気性糸状菌を用いる場合、培養液の粘性が高くなり糸状菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので好ましくない。一方、該原料の使用量が下限値に満たないと、グルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼが高生産されない。
なお、滅菌処理方法は特に限定されない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、121℃で15分間行なえばよい。
したがって、請求項7に記載の酵素の生産方法は、上記した糸状菌培養物の製造方法と同様である。
また、得られた糸状菌培養物の一部を次の糸状菌培養物製造におけるスターターとして用いることもできる。このように糸状菌培養物を連続的に製造することにより、安定的な生産が可能になると同時に、生産効率の向上も図ることができる。
65%から98%の精白歩合が異なる大麦(オーストラリア産スターリング種)を、麹菌培養物由来の酵素と反応させ、大麦からのグルコース遊離速度を測定した。
本試験で用いた麹菌培養物の具体的な製造方法は以下に示すとおりとした。
65%精白麦8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
硝酸カリウム0.2%(w/vol)、リン酸2水素カリウム0.3%(w/vol)を添加した水に、98%精白麦が2.0%(w/vol)になるように加えた液体培地を調製した。調製した液体培地3000mlを容量5000mlのジャーファーメンター(丸菱バイオエンジ製)に張り込み、オートクレーブ滅菌(121℃、15分間)後、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養した白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)30mlを接種した。その後、温度37℃、攪拌速度300rpm、通気量0.5vvmにて42時間培養を行ない、ろ紙(東洋ろ紙No.2)でろ過することにより「麹菌培養上清液」を得た。
このように調製した大麦基質溶液50mlと麹菌培養上清液50mlをそれぞれ37℃で5分間保温した後、これらを混合することで反応を開始した。反応開始から1hr後、2hr後、3hr後、および4hr後にサンプリングした反応液中のグルコース濃度を、グルコースC-IIテストワコー(和光純薬製)を用いて測定した。
反応液中のグルコース濃度の経時変化は、図1に示すとおりであり、大麦基質溶液に用いた大麦の精白歩合によって、グルコース遊離量が異なることが確認された。大麦の穀皮歩合は通常10%程度であり、本試験で用いた65%精白麦ならびに83%精白麦は、その表面に穀皮が存在しない。一方、92%精白麦、95%精白麦、98%精白麦は表面に穀皮が残った状態にある。
図1を見ると、表面に穀皮がない65%および83%精白麦と98%精白麦粉砕品を用いた試験区では、いずれも高いグルコース濃度を示していたのに対し、92%、95%および98%精白麦を用いた試験区では、精白歩合が低いほど、グルコース濃度が低いことが分かる。このことから、穀皮の存在によりグルコース遊離量が調整されることが示された。
一方、98%精白麦粉砕品を用いた試験区では、グルコース遊離速度が65%精白麦と同等レベルまで上昇しており、穀皮が大麦デンプン質を物理的に覆っていることが、グルコース遊離速度を調整している主要因であることが示唆された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で白麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
65%精白麦8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
65%精白麦、83%精白麦、92%精白麦、95%精白麦、98%精白麦のいずれか2gと、硝酸カリウム0.2g、リン酸2水素カリウム0.3g及び水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この本培養培地へ前培養液1mlを植菌し、37℃、48時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性(GA)とα−アミラーゼ活性(AA)、耐酸性α−アミラーゼ活性(ASAA)について測定した。
グルコアミラーゼ活性(GA)の測定は、糖化力分別定量キット(キッコーマン製)を用いて行い、α−アミラーゼ活性(AA)の測定は、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。また、耐酸性α−アミラーゼ活性(ASAA)の測定は、<Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,77,483-489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協会誌.,89,768-774(1994)>に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。より具体的には、培養液1mlに9mlの100mM 酢酸緩衝液(pH3)を添加し、37℃で1時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて測定した。
測定結果を図3ならびに図4に示す。
図3に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が高くなった。また、精白歩合の低い98%精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなった。さらに、図4に示すように、セルロース分解酵素の生産性も精白歩合が低くなるに従って高くなる傾向が確認された。このように、白麹菌培養物の酵素生産性は実験例1にて示したグルコース遊離速度と逆相関する傾向が確認され、大麦精白歩合を変えることで白麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で黒麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
65%精白麦8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に黒麹菌(Aspergillus awamori NBRC4388)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
65%精白麦、83%精白麦、92%精白麦、95%精白麦、98%精白麦のいずれか2gと、硝酸カリウム0.2g、リン酸2水素カリウム0.3g及び水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この本培養培地へ前培養液1mlを植菌し、37℃、48時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性(GA)とα−アミラーゼ活性(AA)、耐酸性α−アミラーゼ活性(ASAA)について測定した。
グルコアミラーゼ活性(GA)の測定は、糖化力分別定量キット(キッコーマン製)を用いて行い、α−アミラーゼ活性(AA)の測定は、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。また、耐酸性α−アミラーゼ活性(ASAA)の測定は、<Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,77,483-489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協会誌.,89,768-774(1994)>に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。より具体的には、培養液1mlに9mlの100mM 酢酸緩衝液(pH3)を添加し、37℃で1時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて測定した。
測定結果を図5〜7に示す。
図5〜7に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が高くなった。また、精白歩合の低い98%精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなった。このように、黒麹菌培養物の酵素生産性は実験例1にて示したグルコース遊離速度と逆相関する傾向が確認され、大麦精白歩合を変えることで黒麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で黄麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
65%精白麦、83%精白麦、92%精白麦、95%精白麦、98%精白麦のいずれか2gと、硝酸ナトリウム1.2%(w/vol)、塩化カリウム0.8%(w/vol)、リン酸2水素カリウム0.4%(w/vol)、硫酸マグネシウム7水和物0.2%(w/vol)、硫酸鉄7水和物0.08%(w/vol)及び水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この培地へ黄麹菌(Aspergillus oryzae RIB40)を1×106個/mlになるように植菌し、30℃、72時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性(GA)とα−アミラーゼ活性(AA)について測定した。
グルコアミラーゼ活性(GA)の測定は、糖化力分別定量キット(キッコーマン製)を用いて行い、α−アミラーゼ活性(AA)の測定は、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。
測定結果を図8,9に示す。
図8,9に示すように、精白歩合が低くなるにしたがってデンプン分解酵素の生産性が高くなった。特にグルコアミラーゼは98%精白麦で顕著に活性が上昇した。また、精白歩合の低い98%精白麦であっても、粉砕すると酵素生産性が著しく低くなった。このように、黄麹菌培養物の酵素生産性は実験例1にて示したグルコース遊離速度の影響を大きく受けており、大麦精白歩合を変えることで黄麹菌培養物の酵素生産性を制御できることが示された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する糸状菌(トリコデルマ・ビリデ)培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
グルコース2%、酵母エキス0.5%、硝酸カリウム0.1%、リン酸水素1カリウム0.1%、硫酸アンモニウム0.07%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、塩化カルシウム0.02%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride NBRC31137)を1×106個/mlになるように植菌し、30℃、24時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
精白大麦2%、トリプトン0.08%、硫酸アンモニウム0.25%、リン酸アンモニウム0.1%、塩化カルシウム0.03%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、硝酸カリウム0.12%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、65%精白麦、83%精白麦、92%精白麦、95%精白麦、98%精白麦、又は98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液10mlを植菌し、30℃、90時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、セルロース分解酵素であるセルラーゼ活性(CEL)測定を行なった。セルラーゼ活性(CEL)はカルボキシメチルセルロース(CMC)を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸(Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定量する方法により行なった。より具体的には、1%CMC基質溶液(シグマ社製low viscosityを100mM酢酸緩衝液(pH5)に溶解)1mlに培養液1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬(ジニトロサリチル酸0.75%、水酸化ナトリウム1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム4水和物22.5%、乳糖1水和物0.3%を含む)4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。1単位のセルラーゼ活性(CEL)は、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
測定結果を図10に示す。麹菌以外の糸状菌であるトリコデルマ・ビリデにおいても、精白歩合によってセルラーゼ生産性に差が生じることが確認された。98%精白麦を使用すると最も高い酵素生産性が得られたが、同粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果がセルラーゼ高生産に寄与することが示唆された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する糸状菌(トリコデルマ・リーセイ)培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
(1)前培養方法
グルコース2%、酵母エキス0.5%、硝酸カリウム0.1%、リン酸水素1カリウム0.1%、硫酸アンモニウム0.07%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、塩化カルシウム0.02%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma ressei NBRC31326)を1×106個/mlになるように植菌し、30℃、72時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
精白大麦2%、トリプトン0.08%、硫酸アンモニウム0.25%、リン酸アンモニウム0.1%、塩化カルシウム0.03%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、硝酸カリウム0.12%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、65%精白麦、83%精白麦、95%精白麦、98%精白麦、又は98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液10mlを植菌し、30℃、96時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、培養液から遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵素の活性を測定した。
セルラーゼ活性(CEL)はカルボキシメチルセルロース(CMC)を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸(Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定量する方法により行なった。より具体的には、1%CMC基質溶液(シグマ社製low viscosityを100mM酢酸緩衝液(pH5)に溶解)1mlに培養液1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬(ジニトロサリチル酸0.75%、水酸化ナトリウム1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム4水和物22.5%、乳糖1水和物0.3%を含む)4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。1単位のセルラーゼ活性(CEL)は、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
次に、キシラナーゼ活性(XYL)は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量した。より具体的には1%キシラン基質溶液[シグマ社製Xylan,from oat speltsを200mM酢酸緩衝液(pH4.5)に溶解]1.9mlに培養液0.1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬(ジニトロサリチル酸0.75%、水酸化ナトリウム1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム4水和物22.5%、乳糖1水和物0.3%を含む)4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。1単位のキシラナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
β-グルコシダーゼ活性(BGL)測定は以下の方法により行なった。1mMのp−ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド(PNPG)を基質とし、50mM酢酸緩衝液(pH5)中、37℃で正確に10分間酵素反応を行い、反応停止後、410nmの吸光度により生じたp−ニトロフェノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液の2倍量の200mM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性1単位は、1分間に1μmolのグルコースを遊離する活性とした。
測定結果を図11〜13に示す。麹菌以外の糸状菌であるトリコデルマ・リーセイにおいても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。95%もしくは98%精白麦を使用すると高い酵素生産性が得られたが、98%精白麦・粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果が植物繊維分解酵素高生産に寄与することが示唆された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する糸状菌(アスペルギルス・アキュレータス)培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
(1)前培養方法
グルコース2%、酵母エキス0.5%、硝酸カリウム0.1%、リン酸水素1カリウム0.1%、硫酸アンモニウム0.07%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、塩化カルシウム0.02%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にアスペルギルス・アキュレータス(Aspergillus aculeatus NBRC3530)を1×106個/mlになるように植菌し、30℃、72時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
精白大麦2%、トリプトン0.08%、硫酸アンモニウム0.25%、リン酸アンモニウム0.1%、塩化カルシウム0.03%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、硝酸カリウム0.12%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、65%精白麦、83%精白麦、95%精白麦、98%精白麦、又は98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液10mlを植菌し、30℃、96時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、培養液から遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵素の活性を測定した。
セルラーゼ活性(CEL)はカルボキシメチルセルロース(CMC)を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸(Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定量する方法により行なった。より具体的には、1%CMC基質溶液(シグマ社製low viscosityを100mM酢酸緩衝液(pH5)に溶解)1mlに培養液1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬(ジニトロサリチル酸0.75%、水酸化ナトリウム1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム4水和物22.5%、乳糖1水和物0.3%を含む)4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。1単位のセルラーゼ活性(CEL)は、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
β-グルコシダーゼ活性(BGL)測定は以下の方法により行なった。1mMのp−ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド(PNPG)を基質とし、50mM酢酸緩衝液(pH5)中、37℃で正確に10分間酵素反応を行い、反応停止後、410nmの吸光度により生じたp−ニトロフェノールの量を定量し、酵素活性を算出した。なお、反応停止は、反応液の2倍量の200mM炭酸ナトリウム溶液を添加することにより行なった。活性1単位は、1分間に1μmolのグルコースを遊離する活性とした。
測定結果を図14、15に示す。麹菌以外の糸状菌であるアスペルギルス・アキュレータスにおいても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。98%精白麦を使用すると高い酵素生産性が得られた。一方、同粉砕品ではCEL活性、BGL活性が低下したことから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果がこれら酵素の高生産に寄与することが示唆された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法でセルロース分解酵素生産能を有する白色腐朽菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
(1)前培養方法
グルコース2%、酵母エキス0.5%、硝酸カリウム0.1%、リン酸水素1カリウム0.1%、硫酸アンモニウム0.07%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、塩化カルシウム0.02%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地にイルペックス・ラクテウス(Irpex lacteus NBRC5367)の5mm四方の菌糸マット30個を植菌し、28℃、96時間、120rpmで振盪培養し、前培養液とした。
精白大麦2%、ポリペプトン0.1%、硫酸アンモニウム0.14%、リン酸二水素カリウム0.2%、尿素0.03%、硫酸マグネシウム7水和物0.03%、塩化カルシウム0.03%、ツィーン80 0.1%(いずれもw/vol)および水を含む培地100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。
なお、上記精白大麦として、65%精白麦、83%精白麦、98%精白麦、又は98%精白麦を粉砕したものを用いた。
放冷後、この本培養培地へ前培養液10mlを植菌し、28℃、96時間、120rpmで振盪培養した。
培養終了後、培養液から遠心分離により上清を回収し、上清中の植物繊維分解酵素の活性を測定した。
セルラーゼ活性(CEL)はカルボキシメチルセルロース(CMC)を基質として加水分解により生じた還元糖量をジニトロサリチル酸(Dinitrosalicylic acid; DNS)法により定量する方法により行なった。より具体的には、1%CMC基質溶液(シグマ社製low viscosityを100mM酢酸緩衝液(pH5)に溶解)1mlに培養液1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬(ジニトロサリチル酸0.75%、水酸化ナトリウム1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム4水和物22.5%、乳糖1水和物0.3%を含む)4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでグルコースに相当する還元糖量として定量した。1単位のセルラーゼ活性(CEL)は、1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
次に、キシラナーゼ活性(XYL)は、oat spelts由来のキシランを基質とした酵素加水分解により生成した還元糖をDNSと反応させ、540nmの吸光度の増加で定量した。より具体的には1%キシラン基質溶液[シグマ社製Xylan,from oat speltsを200mM酢酸緩衝液(pH4.5)に溶解]1.9mlに培養液0.1mlを加えて、40℃にて正確に10分間酵素反応を行なわせた後、DNS試薬(ジニトロサリチル酸0.75%、水酸化ナトリウム1.2%、酒石酸ナトリウムカリウム4水和物22.5%、乳糖1水和物0.3%を含む)4mlを加えてよく混合し、反応を停止した。反応停止液に含まれる還元糖量を定量するために、反応停止液を沸騰水浴中で15分間正確に加熱した。続いて、室温まで冷却した後、540nmの吸光度を測定することでキシロースに相当する還元糖量として定量した。1単位のキシラナーゼ活性は、40℃、10分間の反応条件下で、1分間に1μmolのキシロースに相当する還元糖を生成する酵素量として表した。
測定結果を図16、17に示す。白色腐朽菌においても、精白歩合によって植物繊維分解酵素生産性に差が生じることが確認された。98%精白麦を使用すると最も高い酵素生産性が得られたが、同粉砕品では酵素活性が著しく低下することから、大麦穀皮による栄養分放出抑制効果が植物繊維分解酵素高生産に寄与することが示唆された。
(1)前培養方法; 丸麦(オーストラリア産スターリング種)8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地に白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC 4308)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養することにより前培養液を得た。
対照として、α化された培養原料を用いて麹菌培養物を製造した。すなわち、丸麦2g、KNO3 0.2g、KH2PO4 0.3g、水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコールを50μg/mlとなるように添加した。この本培養培地へ前培養液1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。
各試験区で得られた麹菌培養物について、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼおよびα−アミラーゼの活性を測定した。すなわち、グルコアミラーゼ活性の測定は、糖化力分別定量キット(キッコーマン製)を用いて行った。耐酸性α−アミラーゼ活性の測定は、<Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,77,483-489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協会誌.,89,768-774(1994)>に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。より具体的には、培養液1mlに9mlの100mM 酢酸緩衝液(pH3)を添加し、37℃で1時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行った。また、α−アミラーゼ活性の測定は、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行った。結果を以下の表1に示す。
本発明の生丸麦麹菌培養物において、グルコアミラーゼ、耐酸性α−アミラーゼ共に良好に、かつ、バランスよく生産された。一方、α−アミラーゼはやや低い生産量であった。
対照において、耐酸性α−アミラーゼやα−アミラーゼが比較的多く生産されたのは、α化された原料を用いているが、KNO3 やKH2PO4の存在により栄養条件が好適な範囲に維持されているためと考えられる。
よって、本発明により、発酵飲食品の製造に使用可能な麹菌培養物が製造できることが明らかになった。
(1)前培養方法; 丸麦(オーストラリア産スターリング種)8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地に白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC 4308)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養することにより、前培養液を得た。
(2)本培養方法; 丸麦0.5g、KNO3 0.2g、KH2PO4 0.3g、水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この本培養培地へ前培養液を1mlずつ植菌し、37℃、24時間、100rpmで振とう培養した。その後、加熱処理していない丸麦を1.5g添加し、37℃、48時間、100rpmでさらに振盪培養することにより、麹菌培養物を得た。
(3)酵母;鹿児島酵母を1mlのYPD培地にて一晩100 rpmで振盪培養し、遠心集菌後、滅菌水で2回洗浄した。
(4)仕込み; 仕込み配合を以下の表2に示す。掛麦としては、丸麦を洗浄後、60分間水に浸漬し、30分間水切り後、40分間蒸したものを用いた。酵母は先に述べたものを全量用いた。
(6)蒸留;−650mmHgの減圧下で減圧蒸留した。
発酵は順調に進んだ。発酵終了後のもろみのアルコール度数は17.5%であった。
蒸留後のサンプルの官能評価を酒類専門パネル6名で行ったところ、きれいな酒質であり、評価が高かった。
この結果から、本発明の方法によって問題ない品質の麦焼酎が製造できることが明らかとなった。
(1)前培養方法; 丸麦(オーストラリア産スターリング種)8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地に黄麹菌(Aspergillus oryzae NRIB40)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養して、前培養液を得た。
ポジティブコントロールとして、以下の方法により、麹菌培養物を製造した。すなわち、95%精麦(オーストラリア産スターリング種)2g、KNO3 0.8g、KH2PO4 1.2g、MgSO4 0.2g、および水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した。冷却後、クロラムフェニコールを50μg/mlとなるように添加した。この本培養培地へ前培養液を1ml植菌し、37℃、72時間、100rpmで振盪培養することにより、麹菌培養物を製造した。
各試験区で得られた麹菌培養物について、実施例8と同様にしてグルコアミラーゼおよびα−アミラーゼの活性を測定した。結果を以下の表3に示す。
生丸麦麹菌培養物では、グルコアミラーゼが良好に生産され、α−アミラーゼ活性はやや低かった。両酵素とも、ポジティブコントロールに比べて活性は劣っているが、バランスよく生産されており、発酵飲食品の製造に使用可能な麹菌培養物が製造できることが明らかになった。
異なる塩濃度の大麦含有無機塩水溶液をオートクレーブ滅菌して得た大麦基質溶液を、麹菌培養物由来の酵素と反応させ、大麦からのグルコース遊離速度を測定した。
まず、98%精白麦(オーストラリア産スターリング)を2gはかり取り、水50mlとともに500ml三角フラスコに入れた。これをオートクレーブで滅菌(121℃、15分間)することで、大麦基質溶液を調製し、これを「No.1対照区」とした。
また、「No.2塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.1gとリン酸2水素カリウム0.15gを含む無機塩水溶液50mlを用いてオートクレーブ滅菌した。つまり、オートクレーブ滅菌時の塩類濃度は硝酸カリウム0.2%とリン酸2水素カリウム0.3%である。
「No.3滅菌時高濃度塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.1gとリン酸2水素カリウム0.15gを含む無機塩水溶液10mlを用いてオートクレーブ滅菌後、滅菌水を40ml添加した。つまり、滅菌時の塩類濃度はNo.2の5倍量である硝酸カリウム1.0%とリン酸2水素カリウム1.5%であるが、滅菌・加水後の塩類濃度はNo.2と同じ硝酸カリウム0.2%とリン酸2水素カリウム0.3%になるように調製したものである。
続いて、大麦(オーストラリア産スターリング)を培養原料として用いて製造した麹菌培養物を、ろ紙ろ過にて固液分離することで「麹菌培養上清液」を得た。
本試験で用いた麹菌培養物の具体的な製造方法は以下に示すとおりとした。
65%精白麦8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
硝酸カリウム0.2%(w/vol)、リン酸2水素カリウム0.3%(w/vol)を添加した水に、98%精白麦が2.0%(w/vol)になるように加えた液体培地を調製した。調製した液体培地3000mlを容量5000mlのジャーファーメンター(丸菱バイオエンジ製)に張り込み、オートクレーブ滅菌(121℃、15分間)後、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養した白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)30mlを接種した。その後、温度37℃、攪拌速度300rpm、通気量0.5vvmにて42時間培養を行ない、ろ紙(東洋ろ紙No.2)でろ過することにより「麹菌培養上清液」を得た。
大麦基質溶液50mlと麹菌培養上清液50mlをそれぞれ37℃で5分間保温した後、これらを混合することで反応を開始した。反応開始から3hr後にサンプリングした反応液中のグルコース濃度をグルコースC-IIテストワコー(和光純薬製)を用いて測定し、グルコース遊離速度を算出した。
反応液中のグルコース濃度測定結果から算出されたグルコース遊離速度は、図18に示すとおりであり、大麦基質溶液調製時の塩類濃度によって、グルコース遊離速度が異なることが確認された。上記実験例1にて、大麦の精白歩合によってグルコース遊離速度の調整が可能なことを既に示したが、本試験によって、オートクレーブ滅菌等の加熱処理時における塩類の存在によっても、グルコース遊離速度が低くなることを確認した。これは、大麦の加熱処理時に塩類が存在することで、大麦の物理的な崩壊が抑えられることに起因すると推察された。
各種精白麦(オーストラリア産スターリング)を用い、以下のような方法で白麹菌培養物を製造し、それらの酵素活性を測定した。
65%精白麦8gと水100mlを500mlバッフル付三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌(Aspergillus kawachii NBRC4308)を1×106個/mlになるように植菌し、37℃、24時間、100rpmで振盪培養し、前培養液とした。
98%精白麦(オーストラリア産スターリング)を2gはかり取り、水100mlとともに500ml三角フラスコに入れ、これをオートクレーブで滅菌(121℃、15分間)することで、本培養培地を調製し、これを「No.1対照区」とした。
また、「No.2塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.2gとリン酸2水素カリウム0.3gを含む無機塩水溶液100mlを用いてオートクレーブ滅菌した。
「No.3滅菌時高濃度塩類使用区」では、「No.1対照区」において、水のかわりに硝酸カリウム0.2gとリン酸2水素カリウム0.3gを含む無機塩水溶液20mlを用いてオートクレーブ滅菌後、滅菌水を80ml添加した。つまり、滅菌時の塩類濃度はNo.2の5倍量である硝酸カリウム1.0%とリン酸2水素カリウム1.5%であるが、滅菌・加水後の塩類濃度はNo.2と同じの硝酸カリウム0.2%とリン酸2水素カリウム0.3%になるように調製したものである。
上記のように調製した本培養培地を放冷後、前培養液1mlを植菌し、37℃、48時間、100rpmで振盪培養した。
培養終了後、デンプン分解酵素であるグルコアミラーゼ活性(GA)と耐酸性α−アミラーゼ活性(ASAA)について測定した。
グルコアミラーゼ活性(GA)の測定は、糖化力分別定量キット(キッコーマン製)を用いて行なった。
また、耐酸性α−アミラーゼ活性(ASAA)の測定は、<Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.,77,483-489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協会誌.,89,768-774(1994)>に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐酸性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて行なった。より具体的には、培養液1mlに9mlの100mM 酢酸緩衝液(pH3)を添加し、37℃で1時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ測定キット(キッコーマン製)を用いて測定した。
グルコアミラーゼ活性の測定結果を図19に、耐酸性α−アミラーゼ活性の測定結果を20に示す。
図19,20に示すように、滅菌時の塩類濃度が高いNo.3では、培養時の塩類濃度が同様のNo.2に比べて酵素生産性が向上した。実験例2においては、加熱処理時における大麦基質溶液の無機塩濃度が高いほど、大麦原料からの糖遊離速度が低くなることが確認された。したがってこれは、麹菌の増殖に対する塩類の効果以外に、糖遊離速度が酵素生産性に影響を与えることを示唆している。塩類の含まれないNo.1では、麹菌の増殖が抑えられるとともに、糖遊離速度が高いために酵素生産が著しく抑制されたと考えられる。
これまで、培地調製時に添加する無機塩類は、培養する際の麹菌増殖にのみ関与すると考えられていた。しかし、本実施例によって、大麦原料からの糖遊離抑制効果によっても、麹菌の液体培養における酵素生産が促進される可能性が示唆された。
また、本発明によれば、発酵飲食品の製造に用いる糸状菌培養物だけでなく、幅広い産業において用いられる糸状菌培養物や、それにより生産される酵素ならびに酵素剤を安定的かつ安価に製造する方法が提供される。
さらに、本発明は、デンプン分解酵素遺伝子などのプロモーター領域を使用した異種タンパク質生産などにも応用が期待される。
したがって、本発明は、食品製造業、発酵工業、医薬品製造業など幅広い産業に利用できる。
Claims (9)
- 表面の全部が穀皮で覆われた大麦又は小麦(但し、未精白物は除く)、及び無機塩として硝酸塩およびリン酸塩を含み、加熱処理を施した液体培地を用いること、及び、当該加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を上げることにより、当該大麦又は小麦中の栄養分の培養系への放出速度を制御しながら白麹菌又は黒麹菌を培養することにより、麹菌培養物のグルコアミラーゼ及び/又は耐酸性α−アミラーゼ生産性を調整することを特徴とする麹菌培養物の製造方法。
- 栄養分が、大麦又は小麦中のデンプンに由来する糖、および/あるいは、大麦又は小麦中のタンパク質に由来するアミノ酸である、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法。
- 加熱処理が、80〜130℃で行われる、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法。
- 加熱処理時における液体培地の無機塩濃度を、麹菌の培養に好適な濃度の10倍以下に調整する、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法。
- 硝酸塩が硝酸ナトリウム又は硝酸カリウムであり、リン酸塩がリン酸2水素カリウム又はリン酸アンモニウムである、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法。
- 加熱処理後に液体培地を希釈して無機塩濃度を調整した後、培養に供する、請求項1に記載の麹菌培養物の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法で麹菌培養物を得て、該麹菌培養物を用いる、グルコアミラーゼ及び/又は耐酸性α−アミラーゼ剤の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法で麹菌培養物を得て、該麹菌培養物を用いる、発酵飲食品の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法で麹菌培養物を得て、該麹菌培養物を用いる、グルコアミラーゼ及び/又は耐酸性α−アミラーゼの製造方法。
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