JPS61293380A - 微生物の培養方法及び培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微生物の培養方法と培養装置に関するものであ
る。

〈従来の技術） 微生物の培養において、培養液中の主炭素源や培地成分
の濃度を連続的に測定し、代謝生成物や菌体の濃度を培
養の全経過にわたり常に最適条件で培養管理することは
、収率と品質の向上、培養時間の短縮及び省力化を図る
上で極めて重要である。従って、培養液から連続的に自
動的に且つ無菌的に試料をサンプリングしてこれを分析
測定できれば、微生物工業に寄与するところ極めて大で
ある。然し培養液中には微生物の菌体又は培地中の不溶
解物が懸濁物の状態となって存在し、培養液をそのまま
測定試料として分析系や検知器にかけることはできない
。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の方法は人力を費して培養液を抜き取り、遠心分離
又は濾過により試料液を得る方法であった。しかし、こ
のような方法では測定結果を得るまでに相当の時間がか
かる上に、測定中に成分が変化したりする慣れがあり、
好ましいものではなかった。従って、培養液中の主炭素
源濃度、培地成分濃度、代謝生成物濃度を直接かつ迅速
に測定して、その測定値又は測定値に基づく演算値を指
標とし、応答遅れなく制御する培養方法が強く要望され
ていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明は前述の問題点を解決することを目的とする。

本発明者は鋭意実験研究の結果、培養槽より培養液を無
菌的且つ自動的に抜き出し濾過し、培養濾液をサンプリ
ングし、分析、測定し、その測定値又はそれに基づく演
算値を利用して主炭素源及び培地成分の濃度を微生物の
消費速度に合わせて自動的に培養槽に添加しながら、そ
れらの濃度を夫々所定の値に維持し、その微生物の培養
目的に最適の条件で培養を行なうことができる方法及び
装置を発明した。

本発明は主炭素源を資化し、代謝生成物を生産する微生
物の培養方法において、培養槽内より培養液を連続的か
つ無菌的に抜き出し、濾過し培養槽に戻す細流を生成し
、濾過後の細流について連続的に又は間欠的に主炭素源
濃度、培地成分濃度及び代謝生成物濃度の何れか一者以
上を測定し、測定値又は測定値に基づく演算値を制御指
標として菌体濃度及び／又は代謝生成物濃度の培養管理
を行なうことを特徴とする微生物の培養方法である。

本発明は他の見地においては、主炭素源を資化し、代謝
生成物を生産する微生物の培養装置において、培養槽内
より細流の培養液を連続的かつ無菌的に抜き出し、培養
槽に戻すポンプと、抜き出した細流の培養液を濾過する
濾過膜を具える連続濾過装置と、濾過後の細流の培養液
を連続的に又は間欠的に測定する測定装置と、測定値に
基づいて培養槽中の菌体濃度及び／又は代謝生成物濃度
を制御する制御装置とを有することを特徴とする微生物
の培養装置である。

培養液中の主炭素源は、通常、アルコール類、有機酸類
、糖類、炭化水素からなる群から選択したものである。

測定対象とする培地成分は、通常、窒素、カリウム、燐
、フェノール類及び微量無機塩からなる群から選択した
ものである。

代謝生成物は、通常、アルコール類、有機酸類、蛋白質
、アミノ酸、ビタミン、脂質からなる群から選択したも
のである。

培養液中の主炭素源は、ガスクロマトグラフ法、高速液
体クロマトグラフ法、分光光度法、螢光分光光度法、糖
度屈折率測定法、導電率法、酵素電極法、微生物センサ
ー法からなる群から選択した分析計または検知器で測定
する。

培地成分は、原子吸光分光光度法、ポーラログラフ法、
イオン選択性電極法、ガスクロマトグラフ法、高速液体
クロマトグラフ法、分光光度法、屈折率測定法からなる
群から選択した分析計又は検知器で測定する。

代謝生成物は、高速液体クロマトグラフ法、ガスクロマ
トグラフ法、分光光度法、螢光光度法、酵素電極法、微
生物センサー法、電気泳動法からなる群から選択した分
析計又は検知器で測定する。

測定値やそれに基く演算値を利用して菌体濃度及び／又
は代謝生成物濃度の最適化制御を行うにあたっては、イ
ンターフェース及びマイクロコンピュータ−を内蔵する
中央演算処理装置を用いれば、好都合である。

本発明の対象とする微生物は、バクテリア、酵母、カビ
又は放射菌である。

濾過装置は濾過膜に限外濾過膜又は中空繊維膜素材を用
い、クロスフィルトレージョンで濾過することが好まし
い。クロスフィルトレージョンとは、濾過膜面に平行に
培養液を流すこにより濾過膜面に濾滓が堆積することを
防止し、培養液を培養液の流れ方向に対し略々直角方向
に濾過膜を横断通過させて濾液とすることである。

連続濾過装置はもし目詰りが甚しく、必要な場合には無
菌空気で空気逆洗を行ない、濾過能力を完全に回復する
ことができる。

以下、本発明を例につきさらに詳細に説明するが、本発
明はこれにのみ限定されるものではない。

（実施例） 例　　１ 第１図のように微生物を含有する培養液から培養濾液を
サンプリングするにあたって、培養槽１より培養液２を
導管７，７′を介して循環ポンプ５により抜き出し、濾
過装置４に導き、濾過装置４の底部より導管８を経て培
養槽１に戻し、培養液を循環させた。この導管７．７’
　、８及び濾過装置４はスチーム又は薬剤により予め殺
菌しておいた。濾過装置４により培養液を濾過し、濾液
から分析測定に充分な量のみをサンプリングポンプ６に
より連続的、無菌的に分取し、自動サンプリング装置１
３又は検知器１４に導き、分析計１５．１６により主炭
素源濃度、培地成分濃度、代謝生成物濃度等を測定した
。

第２ａ図に濾過装置４の構造の概略を示す。濾過装置４
の内部の濾膜２４は中空繊維膜素材又は限外濾過膜と呼
ばれているもので、これらの膜素材はポリビニルアルコ
ール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、
ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、ポリアクリ
ロニトリル、酢酸セルロース、ナイロン、芳香族ポリア
ミドが一般的であるが、その他テフロン、セラミックス
、焼結金属も使用できた。形状はホローファイバー形、
管状形が一般的であるが、螺旋形もある。一般的条件下
では０．１μｍの大きざの固形物を分離でき、通常の温
度、圧力、ｐＨで幅広く使用できた。必要に応じて分離
特性を向上したい場合は、さらに細かい目の濾膜を使用
することにより、精密な濾過を行なうことができた。

第２ａ図は中空管状繊維膜素材を使用した例であるが、
濾過装置４内を第１図からの培養液２はｉ１！膜２４の
壁面に対して垂直に上方から下方に管８との連結口部に
向って流した。従って、微生物菌体の増殖が進行して培
養後半に高菌体濃度に到達した状況になっても、クロス
フィルトレージョンの原理が働くので、濾膜２４の表面
に堆積した微生物菌体は流下する培養液２により洗い落
され、濾膜２４への付着を僅小に留めることができ、濾
膜２４の目詰りは生じなかった。然し、若し目詰り現象
が生じた場合でも、空気源３０と無菌フィルター１１よ
り得た無菌空気を濾過装置４に導入し、無菌空気逆洗を
行ない、濾膜表面の目詰りを゛解消し、初期の状況に復
帰せしめることができる。さらにここで付は加えたいこ
とは、循環ポンプ５は比較的小型ではあっても、脈動式
、例えばダイヤフラム形が目詰りの防止に効果があるこ
とが実験で証明されたことである。

培養液が８１膜２４の壁体を外方から内方へ略々半径方
向に横断的に通過して濾過されることによって生成した
培養濾液は、第２ｂ図に示すごとく、中空管状繊維膜２
４の上端２５から上部孔部を経て連結管９を通ってり゛
シブリングポンプ６に依り引出される。

次に第３図に自動サンプリング装置の１例を示す。濾過
装置４より得た無菌的な培養濾液を、サンプリングポン
プ６を有する自動サンプリング装置１３．１４により所
定ｍ採取して、バルブの切換を行ない、分析試料の流れ
（斜線部）の方向に向けて分析計１５．１６に共試し、
培養液中の主炭素源濃度、培地成分濃度、及び代謝生成
物濃度を測定し、又は検知器１４において分析計１６で
直接これらの測定を行なった。その測定値をインターフ
ェース及びマイクロコンピュータ内蔵の中央演算処理装
置１７で演算処理し、その信号を補給貯槽１９．２０の
ポンプ２１．２２へ夫々フィードバックし、主炭素源濃
度又は培地成分′ａ度を一定の値に維持した。

第４図にフローセル型イオン選択性電極の例を示す。こ
れは自動サンプリング装置は設けず、フローセル内に直
接培養濾液を流して、培地成分中の微量無機塩の測定を
行なった。図中、Ａはイオン選択性電極、Ｂは比較電極
、Ｆはフローセルを示す。これと同様な測定方法として
、屈折率測定法があり、配管内の培養濾液の流れを光の
屈折率により直接糖度を測定した。

第５図に主炭素源濃度制御のフローチャートの１例を示
す。

主炭素源の分析装置ではガスクロマトグラフ法、高速液
体クロマトグラフ法、分光光度法、螢光光度法、糖度屈
折率測定法、８Ｉ電率法、酵素電極法、微生物センサー
法等を採用して測定し、培地成分及びその中の微量無機
塩の分析は原子吸光分光光度法、ポーラログラフ法、イ
オン選択性電極法、ガスクロマトグラフ法、高速液体ク
ロマトグラフ法、分光光度法を採用して測定した。代謝
生成物も、高速液体クロマトグラフ法、ガスクロマトグ
ラフ法、分光光度法、螢光光度法、酵素電極法、微生物
センサー法、電気泳動法等で測定した。

第１図には自動サンプリング装置、分析計、ポンプ及び
補給貯槽を各々２系列で構成する例を示したが、例えば
第１系列は主炭素源、第２系列は窒素、燐、カリウム等
の培地成分、第３系列は微量無機塩、第４系列はその他
の栄養物とする等、補給系を増加できることは勿論であ
る。また、主炭素源は２種併用しても培養でき又は培養
途中で切替えること、例えばグルコースからエタノール
に切替えることもできる。

例　　２ 本例は補酵素Ｑ、。の製造の目的で行なった。

使用菌株はオーレオバシデイウム　プルランスｓｐ、１
４（微生物受託番号微工研菌寄第５９１２号）を使用し
て、モールドエキス３　ａ　／　１００ｍＡ　、ペプト
ンｏ、５ｇ　／　１００ｍｆｌ、酵母エキス０．Ｏ１ａ
／　１００ｍＡよりなる試験管培地にて、振とう培養を
３０℃で２日間行った。これは種母培養段階である。

次に板ロフラスコにエタノールを炭素源とし、燐酸−カ
リウム１．０％、硫酸マグネシウム０．１％、塩化第２
鉄０．００３％、ジベンゾイルチアミン塩酸塩０．２０
７１０％、尿素０．２８２％、バラヒドロキシ安息香酸
０，２２５％、その伯微量無機塩を含む培地を入れ、殺
菌優（尿素は無菌濾過してｍ製）、オーレオバシディウ
ム　プルランスｓｐ、　１４を種母培養より得た菌懸濁
液を２　ｒａｊ２／１００ｍぶ培地の割合で接種し、３
０℃で２日間振とう培養を行った。これは前培養である
。

第１図に示した如り３０℃０℃ジャーフッメンタ−１株
）丸菱バイオエンジ製ＭＳＪ−Ｕ−３０１型〕に濾過装
置４（（株）クラレ製ＫＬ−Ｆ型濾過膜３１”４０１）
をポンプ５とステンレス製バイブ７゜８（外径８　ｍｍ
、肉厚１ａ＋ｍ）を介して接続し、さらにサンプリング
ポンプ６、無菌濾過器１１、自動サンプリング装ｆｔ１
３をステンレスパイプ９．１０（外径６ｍｍ、肉厚１ｍ
ｒａ）及び無菌パルプ１２を介し接続した装置を製作し
ておき、全ての配管系と、ジャーフッメンタ−１をスチ
ーム殺菌処理し、濾過装置４を薬剤又はスチームにより
殺菌処理した。ジャーフッメンタ−１に前培養培地成分
の半分の濃度に調整して１０．８Ｊ２の容積とし、殺菌
処理を行なった。冷却後板ロフランスコにより前培養液
合計１．２Ｊ２を接種し、全容積を１２１とした。

培養は次のように行なった。

培養温度３０℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、培養液のｐｌ
−１は５．４〜５．６に保つように、３０％燐酸及び２
９％アンモニア水で自動制御した。通気量は１．０〜１
．５ｖｖｍとした。また、循環ポンプは４０β／時、圧
力０．５〜１．５ｋｇ／ｃ（ゲージ、サンプリングポン
プは４０１１４７時、圧力０〜０．２ｋｇ／ｃ４ゲージ
の条件とし、１４５時間の培養を行なった。培養濾液中
の炭素源であるエタノール及び培地成分中の微量無機塩
をエタノールセンサー、原子吸光分光光度法で各々測定
し、中央演算処理装置でデータ処理を行ない、消費速度
に合わせて培養液中の主炭素源と培地成分の濃度を一定
の値に維持する自動制御を行ない、データを記録計に記
録した。培養試験中の培養液のエタノール濃度の状況を
、第６図に示した。また、菌体濃度の変化の状況を第７
図に示した。第７図中で曲線Ｇは本発明による菌体濃度
の曲線であり、曲線Ｈは従来の方法による曲線である。

このデータから１４０時間後の菌体濃度を簡単に比較す
ると、従来の方法では国体の濃度は約１１０ｇ乾燥菌体
／！であり、本発明方法では約１８０ｇ乾燥菌体／（と
なり、従来の方法と比較して約１．６倍の菌体濃度を得
たことになるので、本発明による効果は極めて大である
と認められた。図中、■〜■は培地成分、微量無機塩の
補給時刻と補給通算回数を示す。

本発明は他の微生物の培養にも適用でき、菌体濃度は１
０〜３０（ｌ乾燥菌体／ぶの低濃度はもとより、１００
〜２００ｇ乾燥菌体／Ｊ２の高濃度でも適用できる。

九−１ 本例は酵母菌体の製造である。

主炭素源には甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜を使用した。

糖蜜を水で希釈し、高温で短時間処１ｊｌｊ　（１４４
℃。

３分）を行ない、沈澱物を遠心除去し、清澄化した。

種母培養としては、ＤＩＦＣＯ社のモールドエキス１０
％溶液をｐＨを４．２〜４．５に調節した液１００１１
Ａづつ板ロフラスコに分注し、殺菌後、パン酵母（サツ
カロミセス　セレビシェ−）を斜面培養から接種し、３
０℃で４８時間振とう培養した。

本培養の培地としては、上記糖蜜を糖１％となるように
水道水で希釈し、これに過燐酸石灰を熱水に溶かし不溶
物を濾過により除いた液を、燐の損として３ａ／Ｉ１．
培地の濃度になるように加えた液を用いた。ｐ）−１４
，２〜４．５に調節後、３０１のジャーファメンターに
この培地１０βを入れ殺菌した。

種母培養液を１１接種し、通気量１　ｖｖｍ　、攪拌速
度５００ｒｐｍで培養した。培養中第１図に示す装置に
取り付けた自動サンプリング装置１３又は１４により１
５分毎に培養濾液を採取し、糖度屈折率計１５と中央演
算処理装置１７により糖分を測定し、培養液中の糖分濃
度が常時１％に保たれるように、貯槽１９又は２０から
殺菌した糖蜜をジャーフ？メンタ−に流下させた。培養
中ｐＨが初期１）Ｈより低下すればアンモニア水により
自動的に中和し、窒素源を補給した。かくして４８〜７
２時間の培養により約２００ｇ乾燥菌体／ぶの酵母菌体
を生育せしめることができた。

例　　４ 本例は微生物によるグルコン酸ソーダの製造である。

種母培養として、５００＋＋＋Ｊ！の板ロフラスコにグ
ルコース２０％、コーンステイープリカー０．４４ｍぶ
／１００Ｊ！、、１ｉｉｌＷ１マグネシウムｏ、ｏｉｓ
％、燐酸−カリウム０．０２２％、尿素０．０１％、燐
酸ニアンモニウム０，０４７％及び炭酸カルシウム６．
５ｇを含む培地１００１１１Ｊ２を入れて培養した。こ
のうち尿素および炭酸カルシウム以外の成分はまず水道
水に溶かし、硫酸でｐＨ４，５に調節した液を予め板ロ
フラスコに入れ、１２０℃、１５分殺菌した。尿素は別
に１０％濃厚液を作り、除菌フィルターで常温下で無菌
液とした後、その計算膳即ち０．１　ａｌｌを無菌的に
、上記殺菌流みの培地に添加した。最後に別に乾燥殺菌
しておいた炭酸カルシウムをもこれに加えた。

その後、アスペルギルス　ニガー５８４の胞子懸濁液を
培地１００１１につき１〜２ｍｆ２の割合で接種し、３
０℃、４０〜４５時間振とう培養を行なった。このよう
に調整した種母を１０％量、即ち０．８βを、３０βジ
ャーフ？メンタ−に１．２１入れて殺菌した次の組成の
本培養培地にに接種した。

グルコース２．ＯＯｇ／　１、コーンステイープリカー
３．７１１１β／１、硫酸マグネシウム０．１７ｇ／Ｊ
２、燐酸−カリウム０．２！Ｉｔ　／Ｉｔ　、尿素０．
１ＣＩ／Ｊ２、燐酸ニアンモニウム０．４２Ｑ／１２．
　　ＤＨ４，５に硫酸で調節、仕込量合計８℃。

尿素の殺菌添加法は種母培養培地と同様に行なった。本
培養は次ように行なった。

培養温度３０℃、空気ｆｆｌ　１，５ｖｖｍ　、攪拌速
度４００ｒｐｍ、ｐＨは４０％カセイソーダの添加によ
り６．５に自動調節した。

ジャーファメンター内圧力は、１．０ｋｓ／ｃｉに保ち
、培養を行なった。

ジャーファメンターには予め殺菌を既に施しである連続
濾過装置の接続を行なっておき、培養開始後４０ｎ＋ｊ
！／時の流量でジャーファメンタ一槽内より除菌取得し
た培ｔ！ｉ濾液の連続的な流出を開始した。この培養濾
液より自動サンプリング装置により、１回２μ℃、１時
間に少くとも２回の頻度で採取した培養濾液中のグルコ
ース恐を、酵素電極法で測定した。この測定値又はその
演算値に基づき、殺菌濃厚グルコース液を自動的、無菌
的にジャーファメンター内に直接添加し、ジャーフ？メ
ンター内のグルコース濃度を８〜１１％に自動制御した
。この方法によりグルコースがグルコン酸ナトリウムに
転換消費され、５０〜５２時間後、発酵液中に４２％以
上の過飽和グルコン酸ソーダを生産せしめることができ
、培養を終了した。

（効　果） 本発明は無菌的、自動的に且つ迅速に、培養槽内の培養
液から試料液を得ることができる。

本発明は好気性発酵でも嫌気性発酵でも適用でき、回分
法、半回分法、連続培養法でも採用できる。

本発明は最適な条件下で代謝反応の制御を行なうことが
でき、培養物の収率及び品質の向上、培養時間の短縮、
省力化はもとより、微生物反応の解析、プロセス解析、
スケールアップの効率化に寄与するところが大きい。従
って、本発明は産業上稗益するところが極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の例を示す線図的工程系統図、 第２ａ図は本発明に係る濾過装置の線図的縦断面図、 第２ｂ図は本発明に係る中空管状繊維膜の断面を示す図
、 第３図は本発明に係る自動サンプリング装置の線図的説
明図、 第４図は本発明に係るフローセル型イオン選択性電極の
線図的説明図、 第５図は本発明に係る主炭素源濃度制御のフローチャー
ト、 第６図は培養時間に伴なう培養液中のエタノール濃度を
示す特性線図、 第７図は培養時間に伴なう培養液中の乾燥菌体濃度を示
す特性線図である。 １・・・培養槽　　　　　２・・・培養液３・・・攪拌
機　　　　　４・・・濾過装置５・・・循環ポンプ　　
　６・・・サンプリングポンプγ、γ’、８，９．１０
・・・導管 １１・・・無菌フィルター　１２・・・無菌バルブ１３
、１４・・・自動サンプリング装置１５、１６・・・分
析計　　　１７・・・中央演算処理装置１８・・・記録
計 １９、２０・・・培養液成分補給貯槽 ２１、２２・・・ポンプ　　　２３・・・コック付導管
２４・・・中空濾過材＜ｍ膜） ２５・・・中空濾過材の上端 ３０・・・空気源 特許出願人　　　株式会社　三ｒＪＩＪ製作所第２ｂ図
　　　第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、主炭素源を資化し、代謝生成物を生産する微生物の
   培養方法において、培養槽内より培養液を連続的かつ無
   菌的に抜き出し培養槽に戻す細流を生成し、その培養液
   を一部濾過し、濾過後の細流について連続的に又は間欠
   的に主炭素源濃度、培地成分濃度及び代謝生成物濃度の
   何れか一者以上を測定し、測定値又は測定値に基づく演
   算値を制御指標として菌体濃度及び／又は代謝生成物濃
   度の培養管理を行なうことを特徴とする微生物の培養方
   法。 ２、主炭素源を資化し、代謝生成物を生産する微生物の
   培養装置において、培養槽内より細流の培養液を連続的
   かつ無菌的に抜き出し、培養槽に戻すポンプと、抜き出
   した細流の培養液を濾過する濾過膜を具える連続濾過装
   置と、濾過後の細流の培養液を連続的に又は間欠的に測
   定する測定装置と、測定値に基づいて培養槽中の菌体濃
   度及び／又は代謝生成物濃度を制御する装置とを有する
   ことを特徴とする微生物の培養装置。