ES2236738T3 - Composicion para mejorar la digestibilidad y la utilizacion de nutrientes. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA COMPOSICION PARA MEJORAR LA DIGESTIBILIDAD Y UTILIZACION DE NUTRIENTES, QUE COMPRENDE UNA O MAS LIPASAS ESTABLES A ACIDO Y/O UNA O MAS AMILASAS ESTABLES A ACIDO. TANTO LA LIPASA COMO LA AMILASA PUEDEN TENER UN ORIGEN FUNGICO. LA LIPASA SE OBTIENE PREFERENTEMENTE DE RHIZOPUS ARRHIZUS O RHIZOPUS JAVANICUS Y LA AMILASA DE ASPERGILLUS NIGER. LA COMPOSICION ES POR EJEMPLO UNA COMPOSICION FARMACEUTICA PARA SER UTILIZADA EN EL TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA DEL PANCREAS EXOCRINO QUE PUEDE SER EL RESULTADO DE UN EFECTO SECUNDARIO DE PANCREATITIS ADQUIRIDA CRONICA, ALCOHOLISMO, FIBROSIS CISTICA O CARCINOMAS PANCREATICOS.

Description

Composición para mejorar la digestibilidad y utilización de nutrientes.

La presente invención se refiere a una composición para la mejora de la digestibilidad y utilización de los nutrientes. La invención se refiere también al uso de la amilasa fúngica estable a los ácidos y la lipasa fúngica estable a los ácidos para el tratamiento de enfermedades clínicas asociadas con una inadecuada capacidad digestiva tal como la insuficiencia pancreática exocrina y en la preparación de estas composiciones.

La eficiencia con la que se absorben (y por tanto, se utilizan) los nutrientes por el cuerpo humano y animal depende entre otras cosas de la eficiencia de la digestión. La digestión está mediada, entre otros, por diferentes enzimas que tienen funciones específicas en diferentes localizaciones del tracto digestivo. El deterioro de la actividad de estas enzimas tendrá influencia sobre la degradación de los constituyentes alimentarios y consecuentemente sobre la absorción de los nutrientes. El deterioro de la absorción producirá, entre otros, una reducción del crecimiento.

En el proceso global de la digestión, el páncreas tiene un importante papel. Segrega un jugo que tiene dos componentes principales, un fluido alcalino y enzimas, hacia el duodeno. Los dos componentes aparecen en proporciones variables dependiendo de los estímulos. El componente del fluido alcalino, que varía en volumen de 200-800 ml/día, tiene una alta concentración de bicarbonato, lo que neutraliza el contenido gástrico que entra en el duodeno y ayuda a regular el pH del tracto intestinal.

Las enzimas del jugo pancreático son sintetizadas y segregadas por las células acinares que también segregan un fluido similar en composición electrolítica a un ultrafiltrado del plasma. En los comedores intermitentes tales como el hombre, el perro y el gato, el volumen del fluido segregado por las células acinares es muy pequeño y tiene poco efecto sobre el volumen y composición del jugo pancreático que fluye en el principal ducto pancreático.

El jugo pancreático contiene cuatro grupos principales de enzimas: lipolíticas, proteolíticas, amilolíticas y enzimas que desdoblan el ácido nucleico. Estas enzimas pancreáticas, alguna de las cuales son segregadas en múltiples formas, tienen especificidades complementarias a las de las enzimas unidas a la membrana intestinal. El jugo pancreático fresco, no contaminado no tiene actividad proteolítica porque estas enzimas están en la forma de zimógenos inactivos. Una fracción importante del calcio del jugo pancreático acompaña a las enzimas, especialmente a la alfa-amilasa. El jugo pancreático humano es muy parecido al del cerdo con un alto contenido de lipasa y alfa-amilasa con respecto a otros mamíferos [1]. Por tanto, el extracto de páncreas de cerdo, llamado pancreatina, ha sido hasta ahora la fuente enzimática preferida para la sustitución terapéutica del páncreas exocrino.

Los principales grupos de pacientes que requieren provisión de enzimas digestivas son los que tienen pancreatitis crónica adquirida, principalmente secundaria a alcoholismo, niños y adultos con fibrosis quística, y pacientes con carcinomas pancreáticos. La insuficiencia pancreática exocrina aparece en la mayoría de los pacientes con fibrosis quística y lleva a una esteatorrea crónica y a una alta incidencia de un estado de desnutrición, que se relaciona con la gravedad de la enfermedad pulmonar y también con la morbimortalidad [2].

El objetivo final de la terapia de sustitución del páncreas exocrino es eliminar la malabsorción y mantener una nutrición adecuada. El tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina debería ser relativamente fácil, mediante la administración de un extracto de páncreas de mamífero, tal como páncreas porcino. Desafortunadamente, se ha comprobado que un tratamiento adecuado es difícil de controlar y se han registrado grandes variaciones en el grado de sustitución enzimática del páncreas a pesar de la disponibilidad de potentes extractos pancreáticos porcinos y a menudo de la administración de muy altas dosis. Hay que considerar los problemas inherentes a las propias preparaciones pancreáticas, así como las particularidades en el entorno en el que se espera que trabajen las enzimas [3].

La predigestión intragástrica por las lipasas gástricas [4] no está deteriorada en los pacientes con insuficiencia pancreática exocrina. Para completar la digestión en el duodeno, el contenido de ácido gástrico debe ser llevado, por medio del bicarbonato pancreático, a un valor de pH considerablemente más alto, porque el pH óptimo de la mayoría de las enzimas pancreáticas se sitúa en el intervalo entre 6 y 9 (figura 1). Esta subida del pH cambia también el comportamiento físico de los ácidos grasos. Estos se ionizan parcialmente, migran a la interfase de las partículas de lípidos emulsionadas y median junto con las sales biliares, fosfolípidos y colesterol, en la solubilización de los lípidos.

Sin embargo, en la insuficiencia pancreática exocrina, una reducción de la secreción del bicarbonato pancreático deteriora esta neutralización del pH. Como resultado, el pH duodenal posprandial puede permanecer por debajo de pH 5 tanto en la pancreatitis crónica como en la fibrosis cística (figura 2). Este bajo pH duodenal puede reducir la realización de la terapia de sustitución con pancreatina de diversas formas.

Cuando se administra pancreatina a pacientes en una u otra formulación galénica, dicha pancreatina se mezclará con la masa alimenticia y realizará algo de digestión en el estómago. Sin embargo, la lipasa y la amilasa pancreáticas se inactivan irreversiblemente a pH 4 y por tanto la mayor parte de las actividades enzimáticas se destruirán antes de llegar al duodeno en los pacientes en que el pH es demasiado bajo debido a un deterioro en la excreción de bicarbonato [5]. Sólo se pueden esperar resultados terapéuticos en pacientes en los que el pH posprandial permanece relativamente alto como consecuencia por ejemplo, de gastritis alcohólica o medicación concomitante con inhibidores de la secreción de ácido gástrico.

Además, la eficiencia de la lipolisis puede ser puesta en riesgo por la precipitación de las sales biliares. La precipitación de las sales biliares que son necesarias para la solubilización de los lípidos llevará por tanto a una digestión de lípidos más baja de lo normal.

También las enzimas de sustitución de la pancreatina están demasiado lejos de sus respectivos pH óptimos para una suficiente actividad catalítica.

El recubrimiento entérico es hasta ahora el modo más común para sortear la inactivación gástrica de las enzimas pancreáticas. Para proteger las enzimas durante su paso a través del estómago, se usa un recubrimiento que es insensible a los ácidos pero que se disuelve a un pH más neutro. Las preparaciones con recubrimiento entérico no deben desintegrarse ni liberar su contenido hasta un valor de pH definido, por ejemplo se considera 5,6 [6]. Para ser efectivo, el contenido gástrico no puede ser llevado, ni siquiera temporalmente, por encima de este valor por la masa alimentaria. Por otro lado, la disolución del recubrimiento en el duodeno requerirá un pH de 5,6 o más en dicho medio. Por tanto puede ser un problema que en los pacientes con insuficiencia pancreática exocrina, debida a la baja producción de bicarbonato, el periodo de tiempo durante el cual el pH del contenido duodenal alcanza un valor de más de 5 a 6 es muy corto o demasiado corto para permitir una disolución adecuada del recubrimiento. La absorción de los nutrientes principalmente tiene lugar en la primera parte del duodeno-yeyuno. Las preparaciones de pancreatina recubiertas entéricamente no se disolverán o se disolverán demasiado tarde en el intestino delgado para hacer que las enzimas están disponibles en el lugar en el que se supone que son activas.

Además, ha habido varios intentos para optimizar el pH intraduodenal mediante la disminución del ácido libre del estómago. Los bloqueantes del receptor H_{2} de histamina, metiamida [7], cimetidina [8-10] y ranitidina [11] así como el inhibidor de la H^{+}/K^{+}-ATPasa, omeprazol [12,13] y el análogo E1 de prostaglandina, misoprostol [14] han sido incorporados en estudios clínicos en combinación con las preparaciones de pancreatina. Parece que se favorecen algunos resultados pero también se han observado graves efectos secundarios y se tiene que buscar un equilibrio entre los efectos positivos sobre el aumento de las actividades de las enzimas intraduodenales y la demanda fisiológica de acidez en el estómago. Se tienen que tener en cuenta los efectos secundarios inherentes a algunos de estos fármacos en función de un tratamiento concomitante durante toda la vida. También, la reducción de la actividad gástrica elimina una barrera física protectora natural y puede provocar con el uso continuo, un crecimiento microbiano excesivo [15] y las infecciones gastroentéricas [16], un riesgo suplementario en los pacientes de fibrosis quística, quienes a causa de la naturaleza de su enfermedad son más susceptibles a las infecciones intestinales.

Las combinaciones de pancreatina con antiácidos tales como bicarbonato, no parece que produzcan un efecto suplementario [17-19]. Las razones presumibles pueden ser la estimulación refleja de la secreción de ácido, la unión de ácidos biliares con calcio, y la formación de mezclas de calcio y magnesio con los ácidos grasos liberados.

También se debe considerar el uso de las lipasas gástricas, siempre que se pueda ampliar a costes alcanzables. Sin embargo, su especificidad isomérica, restringida principalmente a la posición sn-3 de los triglicéridos, pone a dicho método fuera de lugar.

Queda claro según lo expuesto, que es muy deseable un nuevo tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina. Es por tanto un objetivo específico de la invención proporcionar dicho tratamiento. Más en general, es el objetivo de la invención mejorar la digestibilidad y la utilización de los nutrientes en los seres humanos y en los animales.

La invención propone por tanto un nuevo método para mejorar la digestibilidad y utilización de los nutrientes en función de enfermedades tales como insuficiencia pancreática exocrina. Consta de una composición que comprende una o más amilasas estables a los ácidos, opcionalmente con una o más lipasas estables a los ácidos.

Preferiblemente la lipasa estable a los ácidos es de origen fúngico y se origina a partir de Rhizopus arrhizus o Rhizopus javanicus. También la amilasa estable a los ácidos preferida es una de origen fúngico, que se origina, por ejemplo, a partir de Aspergillus niger. Sin embargo, la composición de la invención se puede preparar también con lipasas y amilasas recombinantes estables a los ácidos.

La lipasa estable a los ácidos aislada de Rhizopus javanicus tiene actividad en una amplia zona de pH que varía desde pH 2,8 a 9 (Figura 4), mientras que la lipasa del páncreas humano es solamente estable a valores de pH superiores a 5 (Confr. Figura 1).

La preincubación de la grasa de la dieta en el contenido del estómago con ambas lipasas, la lipasa gástrica natural y la lipasa estable a los ácidos de la invención, la lipasa fúngica, liberará ácidos grasos de cadena corta y media que pueden ser absorbidos ya a través de la mucosa gástrica y llegar a estar disponibles como fuente de energía para el organismo. Por otro lado, los ácidos grasos de cadena larga liberados se ionizarán parcialmente en el duodeno y contribuirán a la formación de micelas de sales de los lípidos biliares. Los ácidos grasos producidos en el estómago contribuyen al mismo tiempo por sus propiedades antibacterianas y antivirales a la prevención de las infecciones gastrointestinales [23,24].

En contraste con la lipasa del páncreas humano no es necesaria la colipasa y no hay ninguna influencia negativa de un contenido duodenal ácido sobre su actividad. Tanto la lipasa humana como la lipasa fúngica estable a los ácidos comparten la misma especificidad isomérica y una similar especificidad de los ácidos grasos con respecto a sus substratos.

No se ha podido demostrar ninguna mutagenicidad, toxicidad oral aguda o subaguda detectables. La estructura de la lipasa estable a los ácidos preferida ha sido resuelta a su nivel molecular como se describe en los ejemplos.

Para un confort más completo del paciente se debe corregir al máximo no solamente la lipolisis sino también la amilolisis con el fin de mejorar el equilibrio energético, para mantener la flora bacteriana normal antagonizando el desarrollo y dispersión de los gérmenes patógenos y para evitar la extensión de la permanencia de los azúcares osmóticamente activos en el lumen intestinal y la absorción defectuosa de agua y iones asociada con ello. Por tanto, la composición de la invención comprende además preferiblemente una o más amilasas estables a los ácidos.

El complejo de amilasa fúngica a ser usado en la invención comparte con la lipasa fúngica seleccionada una extensión de la estabilidad en función de las variaciones del pH. Su estabilidad y actividad a valores bajos de pH evita la necesidad de recubrimiento entérico, la toma de antiácidos o inhibidores de la secreción de ácido gástrico. De esta manera se obvian los inconvenientes descritos antes. El pH ácido óptimo para la actividad enzimática favorece la amilolisis especialmente en enfermedades clínicas asociadas con la baja liberación de bicarbonato pancreático tal como ocurre en la mayoría de los pacientes con fibrosis quística y pancreatitis crónica. Estas propiedades no se consiguen con la amilasa pancreática que se inactiva a valores de pH por debajo de 4 y tiene un óptimo enzimático alrededor de un pH neutro.

El complejo de amilasa estable a los ácidos que se usa preferiblemente en la composición de la invención ha sido evaluado como seguro (status GRAS ("generalmente reconocido como seguro")) y ha sido declarado adecuado como una enzima de grado alimentario. Su toxicidad oral ha sido ensayada en ratas (13 semanas). La LD50 está por encima de 2000 mg/kg de peso corporal, lo que le clasifica como no tóxico.

La invención no solamente incluye composiciones que comprenden una combinación de una lipasa estable a los ácidos y una amilasa estable a los ácidos, sino que se refiere también a una composición que comprende únicamente una amilasa estable a los ácidos como ingrediente activo, opcionalmente junto con excipientes adecuados.

Se puede usar la composición como tal sin tratamiento adicional con otros medicamentos. Sin embargo, la composición de la invención puede comprender también enzimas proteolíticas y/o enzimas que escinden el ácido nucleico y/o los fosfolípidos y/o otros lípidos para mantener adicionalmente la actividad de degradación de la composición. Como una alternativa, se puede usar la pancreatina para suplementar todas las otras enzimas pancreáticas (excepto lipasa y/o amilasa).

Las formulaciones galénicas de la composición de la invención comprenden como componentes activos, amilasa estable a los ácidos (gastrorresistente), lipasa posiblemente gastrorresistente y/o extracto pancreático (recubierto o no recubierto), opcionalmente en presencia de excipientes adecuados.

La cantidad de amilasa y/o lipasa administrada diariamente a los seres humanos o a los animales depende del resultado específico a ser alcanzado. El médico experto debe ser capaz de prescribir la dosis requerida basándose en su diagnóstico de la enfermedad a ser tratada.

Por ejemplo, en el caso de tratamiento de la insuficiencia exocrina en humanos una forma farmacéutica comprende preferiblemente al menos 30.000 unidades FIP (Federación Internacional Farmacéutica) de lipasa y al menos 30 unidades AG de amilasa. Las unidades FIP son unidades reconocidas internacionalmente [1]. Las unidades AG son unidades de amiloglucosidasa y se definen como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto a 25ºC, pH 4,3 (tampón de acetato). Usualmente un paciente recibirá al menos 4 formas farmacéuticas por día, preferiblemente tomadas o administradas durante o después de una comida.

La composición puede tener cualquier forma farmacéutica concebible pero preferiblemente está en una forma farmacéutica oral, tal como cápsulas, comprimidos, pelets, polvo, microesferas, jarabe reconstituible.

Las realizaciones más preferidas comprenden cápsulas de gelatina dura, que comprenden microesferas de lipasa fúngica estable a los ácidos con una actividad lipolítica de al menos 150.000 unidades FIP/g, y microesferas de un complejo de amilasa fúngica estable a los ácidos con una actividad de degradación de la maltosa y el almidón de al menos 300 unidades de amiloglucosidasa/g (unidades AG/g). Las microesferas tienen por ejemplo un diámetro entre 0,5 y 2,0, preferiblemente entre 0,8 y 1,6 mm. Las unidades FIP/g y las unidades AG/g indican la actividad específica de la amilasa y la lipasa.

Especialmente adecuada para administración a niños es una composición que comprende una preparación liofilizada de la lipasa y la amilasa, opcionalmente junto con colorantes y aromatizantes, cuya preparación forma un jarabe tras la adición de agua.

La invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina. Opcionalmente se puede administrar la composición junto con pancreatina. La insuficiencia pancreática exocrina puede ser el resultado de la pancreatitis crónica adquirida, alcoholismo, fibrosis quística o carcinomas pancreáticos o un efecto secundario de los mismos. La invención no se limita sin embargo a estas causas específicas de la insuficiencia.

Otro uso de la amilasa estable a los ácidos es la reposición de la flora intestinal de un individuo, por ejemplo después de tratamiento con antibióticos.

La invención en otro aspecto, proporciona el uso de una lipasa estable a los ácidos obtenible de Rhizopus javanicus para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina. Y también el uso de una amilasa estable a los ácidos obtenible de Aspergillus niger para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina.

Además, la invención se refiere al uso de una amilasa estable a los ácidos obtenible de Aspergillus niger para la preparación de un ayudante de la digestión o de una composición para reponer la flora intestinal de un individuo, por ejemplo después de tratamiento con antibióticos.

Aunque el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina se usa como un ejemplo específico de la invención, se debe entender que también están dentro del alcance de la invención otras situaciones diferentes en las que se precisa o se desea una mejora de la digestibilidad y utilización de los nutrientes.

La invención es también adecuada, por ejemplo, para mejorar el aumento de peso en los animales destinados al consumo. La lipasa y amilasa de la invención ya sean solas o en combinación una con otra y/o con otras enzimas pueden mejorar la digestibilidad y por tanto la utilización de los nutrientes y pueden por tanto aumentar la eficiencia de la utilización de los alimentos. Las enzimas se pueden administrar separadamente o se pueden añadir a los ali-
mentos.

"Amilasa" como se usa en esta memoria descriptiva pretende englobar una enzima o complejo de enzimas que tienen la capacidad de degradar el almidón y/o el azúcar. En la práctica se prefiere un complejo de amilasa que combina tres tipos de actividad de degradación de azúcar, principalmente la actividad de maltasa que escinde la maltosa en dos moléculas de glucosa, la actividad de glucoamilasa que escinde secuencialmente las moléculas de glucosa de una molécula de almidón, y la actividad de dextrinización que rompe una molécula de almidón en fragmentos de almidón. Los expertos entenderán fácilmente que según la invención, se puede usar cualquier combinación de estas y otras actividades de degradación de azúcar.

La presente invención se aclarará de forma adicional en los siguientes ejemplos, que se dan únicamente con fines de ilustración.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento y caracterización de un complejo de amilasa gastrorresistente 1. Introducción

Las enzimas amilolíticas están ampliamente extendidas en los microorganismos. La multiplicidad de amilasas dentro de varias especies de Aspergillus y bacilos destaca la importancia de estas enzimas para su crecimiento y supervivencia. La mayoría de ellas son enzimas extracelulares y tienen pH óptimos cerca de la neutralidad o entre pH 4 y 7. En la investigación que llevó a la invención se identificó una fuente de amilasa de Aspergillus niger que es capaz de resistir un tratamiento ácido a pH 2,5 a 37ºC durante 30 min. Se seleccionó esta amilasa para posterior caracterización.

2. Materiales y métodos 2.1. Purificación de un complejo de amilasa gastrorresistente de Aspergillus niger

Las recolecciones crudas de fermentaciones controladas de Aspergillus niger se sometieron a un procedimiento de purificación usando un sistema de cromatografía de líquidos Millipore 600 E (Milford, USA) o un sistema Bio-Pilot de Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden). Las columnas de Sepharose fast flow, Streamline DEAE-Sepharose, XK 16/20 y XK 50/30 se obtuvieron también de Pharmacia Biotech. El procedimiento de purificación se llevó a cabo con Streamline DEAE-Sepharose debido a su excelente comportamiento con caudales altos y en el caso del escalado. En términos de capacidad este adsorbente se compara bien con la Sepharose fast flow. Después de cargar la columna con una muestra apropiada, se lavó la columna y se eluyó con un gradiente lineal de acetato de amonio entre 0,1 y 1 M, a pH 4,5.

También fue posible hacer una elución en etapas de los dos componentes con acetato de amonio 325 mM y 775 mM. Sin embargo, la elución por gradiente separó de forma más eficiente el pigmento pardo-amarillento del material de partida.

El procedimiento de purificación se pudo aumentar de forma lineal usando 300 ml de adsorbente en una columna de 5 cm de diámetro. Se cargó la muestra a 20 ml/min. Se lavó la columna con 2,6 litros de acetato de amonio 100 mM pH 4,5 y se eluyó con 3 litros en gradiente lineal de acetato de amonio de 0,1 a 1 M pH 4,5, todo a 20 ml/min. Se recogieron picos entre 240 y 400 mM y entre 450 y 630 mM en 530 y 600 ml respectivamente. Las fracciones de todas las columnas que mostraron picos se reunieron antes de la concentración. Se concentró una muestra de 30 ml de la fracción baja en sal que mostraba un pico, usando un concentrador Centriprep (Amicon, Beverly, USA), se cambió a acetato de amonio 10 mM y se secó por centrifugación en vacío en un Savant SpeedVac SC100 (New York, USA). La muestra era blanca y contenía predominantemente proteína como se calculó por peso. Se usó este material para electroforesis usando un protocolo estándar [20] y el estudio de actividad en relación con el pH.

2.2. Ensayos de actividad

La amilasa usada en la invención es un complejo de moléculas con diferentes tipos de actividades, que dependen del sustrato que usan.

2.2.1. Ensayo de la maltasa

El ensayo de la maltasa usa la propiedad de la glucoamilasa del Aspergillus niger para escindir la maltosa en dos moléculas de glucosa. Típicamente, se diluyeron 20 \mul de muestra en 500 \mul de maltosa (Difco) a 5 g/l en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4,3. Se incubó la mezcla de reacción a 37ºC. Después de 30 min exactos, se paró la reacción pipeteando 52 \mul de la mezcla de reacción a 75 \mul de TRIS.HCl 1,66 M pH 7,6 contenidos en un vial apropiado para análisis automático de glucosa con el instrumento Cobas-Bio (Roche Analytical Instruments, Inc., Nutley, New Jersey). El reactivo de glucosa contenía 0,5 mg/ml de 2,2'-azino-di-[3-etil-benzotiazolin-sulfonato] (ABTS, Boehringer Mannheim, Germany) 1,5 unidades/ml de peroxidasa de rábano y 9,5 unidades/ml de glucosa-oxidasa (ambas enzimas de Boehringer Mannheim). En el ensayo automático, se diluyeron 6 \mul de muestra en 200 \mul de reactivo de glucosa y se leyó la absorbancia a 420 nm cuando no se observó ningún incremento adicional, usualmente después de 15 min. Se calibró el ensayo con estándares de glucosa de 65 y 130 mg/l. Usualmente se incluyeron un blanco del tampón y un blanco de la enzima (se añadió TRIS.HCl 1,66 M pH 7,6 antes de la incubación). Una unidad es la cantidad de enzima que escinde 1 \mumol de maltosa por min.

2.2.2. Ensayo de la glucoamilasa

La actividad de glucoamilasa del complejo de amilasa escinde moléculas de glucosa a partir del almidón. Se aplicó un ensayo similar al descrito en 2.2.1. usando almidón soluble (Merck) (0,5%) como sustrato en lugar de maltosa. En este caso se acortó la incubación hasta 10 min a 37ºC. La actividad se expresa como \mumoles de enlaces glucosídicos rotos por min.

2.2.3. Ensayo de la actividad de dextrinización de la alfa-amilasa

La capacidad para producir fragmentos de almidón se llama actividad de dextrinización, la conversión de almidón en glucosa se llama actividad de sacarificación. Para evaluar rápidamente la actividad de dextrinización de la amilasa, se incubó la muestra con una solución de almidón soluble y después de 10 min, se determinó la cantidad restante de almidón con yodo.

Se añadieron a una cubeta de 3 ml: 25 \mul de tampón de acetato de sodio (100 mM pH 4,3), 25 \mul de almidón soluble (Merck, 1% en agua) y 25 \mul de muestra. Después de agitar en vórtex, se incubó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 10 min. Se paró la reacción con la adición de 25 \mul de KI_{3} (0,01 M en HCl 1 M) y dilución con agua. Se leyó la absorción a 660 nm. El ensayo es lineal entre 1 y 0,1 unidades de absorbancia.

3. Resultados

El Aspergillus niger segrega dos principales fracciones proteínicas que degradan el almidón, que se pudieron resolver por cromatografía de cambio aniónico (figura 3). Ambos picos contienen una alta actividad de glucoamilasa/maltasa pero solamente las fracciones que eluyen en el extremo bajo en sal del gradiente se asociaron con una alta actividad de amilasa (dextrinización). El perfil de la actividad en relación con el pH del material recogido en el primer pico se muestra en la figura 4 en comparación con la alfa-amilasa pancreática. La actividad de amilasa y glucoamilasa (medida con almidón soluble) de la preparación de Aspergillus niger tiene un amplio pH óptimo entre pH 3 y 5,5. La amilasa pancreática no degrada el almidón soluble a glucosa a lo largo de toda la región de pH estudiada. La Tabla 2 lista las actividades específicas de la enzima del Aspergillus niger en comparación con un estándar F.I.P. para la amilasa pancreática.

TABLA 2 Actividades amilolíticas del complejo de amilasa ácida de Aspergillus niger y amilasas pancreáticas

1

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Caracterización de una lipasa gastrorresistente 1. Introducción

Las lipasas han sido aisladas de distintas fuentes, mamíferos, microbios y plantas [22]. Algunos hongos producen lipasas que se excretan a través de la membrana externa hasta el medio de cultivo y por tanto son relativamente fáciles de aislar. Además, son bastante estables. Esto les hace particularmente atractivas para uso médico, porque pueden ser sometidas a escalado sin necesidad de desarrollar un procedimiento recombinante de producción.

La selección de una fuente apropiada de lipasa no se enfocó únicamente en la actividad y estabilidad en función del pH, sino también en la ausencia de efectos inhibidores de las sales biliares, el grado de resistencia frente a la actividad de la pepsina y las especificidades del sustrato. Se ha encontrado que la lipasa de Rhizopus arrhizus y Rhizopus javanicus restringen su actividad lipolítica a los enlaces estéricos primarios (análogamente a la lipasa del páncreas humano) y que son estables en una zona amplia de pH. Puesto que se encontró que el extracto de Rhizopus arrhizus era 50% más bajo en actividad de lipasa en comparación con el Rhizopus javanicus, se seleccionó el primero para purificación y caracterización.

Además se encontró que la lipasa de Rhizopus javanicus era notablemente resistente frente al ataque de las enzimas proteolíticas tipo pepsina-proteasa y pancreatina-proteasa, probablemente debido a su glucosilación sustancial. Hay también una falta de efectos negativos de las concentraciones fisiológicas de las sales biliares. A diferencia de la lipasa del páncreas humano, la lipasa de Rhizopus javanicus no es dependiente del activador de la proteína-colipasa. La lipasa, lo mismo que la amilasa, es segregada en su forma activa. Por tanto no se requiere ninguna proforma para sustitución de la enzima.

2. Materiales y métodos 2.1. Purificación, secuenciación, caracterización de la lipasa de Rhizopus javanicus

Se realizó la purificación por medio de varias etapas cromatográficas de la cosecha cruda de la fermentación de la lipasa de Rhizopus javanicus según los procedimientos descritos en [20]. Los métodos usados para ensayo, electroforesis, escisión por bromuro de cianógeno, hidrólisis ácida parcial, escisión proteolítica, secuenciación de aminoácidos y evaluación de la estabilidad frente a pH se detallan también en [20,21].

2.2. Análisis de secuencias y construcción del modelo

Se extrajeron las secuencias de la base de datos EMBL/Swissprot y se alinearon usando la información combinada de diferentes métodos. Se realizaron los alineamientos de secuencias usando el programa PIRPSQ. El modelo atómico de la lipasa de Rhizopus javanicus estable a los ácidos, se construyó usando la estructura de la lipasa de Rhizomucor miehei siguiendo el protocolo de Eijsink y usando el módulo de modelado por homología del programa WHATIF. Los coordinados atómicos de los átomos de \alpha-carbono de la lipasa de Rhizomucor se obtuvieron del banco de datos de proteínas PDB. La minimización de la energía y la dinámica molecular se realizaron con GROMOS
[20, 21].

3. Resultados

La purificación de la lipasa de Rhizopus javanicus por medio de etapas cromatográficas consecutivas da como resultado una proteína homogénea de una única banda con un peso molecular de 36 kDa y que posee una actividad enzimática específica de aproximadamente 9,10^{6} unidades FIP. El análisis de secuencias de aminoácidos revela una proteína con un terminal amino no bloqueado y estabilizada por tres puentes.

Se puede deducir una glucosilación sustancial de las diferencias entre el peso molecular calculado de la enzima (32163 kDa) y el valor de 36000 Da determinado experimentalmente.

El análisis comparativo de las secuencias de aminoácidos tanto de la lipasa de Rhizopus javanicus como de la lipasa de Rhizomucor miehei demuestra una homología global del 54%, creando la oportunidad de construir con gran confianza un modelo tridimensional [20].

La cromatografía de afinidad de la concanavalina indica la presencia de una glucofracción rica en manosa para la lipasa de Rhizopus javanicus, lo que probablemente contribuye a la notable estabilidad frente a los ácidos de la enzima. La inspección de la secuencia designa el Asn^{197} como la posición más probable de la glucosilación.

El residuo Pro adyacente a Asn^{210} evita su glucosilación y el tercer Asn^{124} está situado cerca de la zona de contacto de la enzima con la interfase lípido/agua. Hay que destacar que los sitios de N-glucosilación están ausentes en la lipasa de Rhizomucor miehei menos estable a los ácidos.

Ejemplo 3 Estudio clínico 1. Introducción

Se ensayó la composición de la invención in vivo en pacientes con fibrosis quística.

2. Materiales y pacientes 2.1. Forma farmacéutica para el ensayo clínico

Los pacientes del estudio recibieron cápsulas de gelatina dura Nº 1 (0,48 ml) que contenían amilasa (Aspergillus niger) \geq 300 AG/\mug, lipasa (Rhizopus javanicus) \geq 120.000 U FIP/g, en forma de microesferas con diámetro entre 0,8 y 1,6 mm en la proporción de 25% de amilasa y 75% de lipasa.

Las medicaciones se mantuvieron secas a temperatura ambiente.

2.2. Pacientes implicados en el estudio

Los pacientes implicados en este estudio tienen fibrosis quística determinada por evidencia clínica y un test del sudor positivo. También tienen un alto grado de grave insuficiencia pancreática exocrina, que implica un deterioro del estatus nutricional y/o del crecimiento (dependiendo de la edad). Las mujeres dan una prueba negativa de embarazo y están tomando un anticonceptivo eficaz.

Se hizo seguimiento de los pacientes en su situación de la vida real (sin estandarización sistemática de la dieta). Se asignó cada paciente al estudio durante un mínimo de 5 semanas. Dos o tres semanas funcionaron como periodo de referencia. Durante este periodo los pacientes permanecieron con su dieta normal sin ningún cambio en el tratamiento en curso con cápsulas de pancreatina. Las siguientes semanas constituyeron el periodo de ensayo durante el cual el tratamiento con pancreatina fue suplementado con las cápsulas de la invención. Al comienzo y al final del estudio se realizó un examen físico. Se monitorizó el estudio por medio de un informe diario del paciente, evaluación del peso corporal, frecuencia de las heces, consistencia de las heces, hinchazón, síntomas abdominales y registro de efectos secundarios inusuales y medicación concomitante. Los niveles de vitamina E en plasma se midieron al comienzo y al final del estudio como un índice para la corrección de la malabsorción de la grasa. La evaluación de la seguridad se hizo por pruebas rutinarias en el laboratorio de análisis clínicos. Cuando fue posible se organizó un análisis fecal en el periodo de referencia y al final del periodo de ensayo.

3. Resultados

Se observaron las siguientes diferencias al final del periodo de ensayo en comparación con el periodo de referencia:

1.

desaparición de los síntomas de dolores abdominales crónicos

2.

desaparición de la hinchazón

3.

mejora de la consistencia de las heces y disminución de la frecuencia de las heces

4.

recuperación del apetito

5.

aumento consistente y significativo del peso corporal.

Después de volver a la toma de la dosis usual de pancreatina al final del periodo de ensayo, los dolores y los síntomas indicados en 1 a 4 reaparecieron. El aumento del peso corporal obtenido durante el periodo de ensayo se siguió manteniendo.

Un ejemplo típico de los datos registrados en un paciente se indica en la Figura 5.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Intervalos de actividades (barras en blanco de la parte superior) y estabilidad (barras sombreadas de la parte inferior) en función del pH de las principales enzimas digestivas presentes en el tracto gastrointestinal humano y las enzimas gastrorresistentes desarrolladas. Por una línea cortada se representan las zonas no bien documentadas. Los intervalos indicados son sólo aproximados ya que pueden ser influidos por muchos factores y condiciones de reacción, por ejemplo, el intervalo de actividad de la lipasa gástrica se mueve desde pH 4-6 (triglicéridos de cadena larga) a pH 4-7 (triglicéridos de cadena corta).

Figura 2. Valores del pH duodenal en los sujetos testigos durante el periodo basal, y periodo de comida y bebida (izquierda); valores del pH duodenal basal en pacientes con fibrosis quística (derecha). La inactivación irreversible de la lipasa y amilasa pancreáticas tiene lugar a pH 4 mientras que sus actividades catalíticas requieren un valor de pH por encima de 5.

Los intervalos se indican por una línea cortada y la desviación estándar por una línea sólida; n es el número de sujetos estudiados.

Figura 3. Purificación de las enzimas de Aspergillus niger que degradan el almidón sobre Streamline DEAE-Sepharose. Se muestran los siguientes parámetros: concentración de proteínas (círculos vacíos), actividades de dextrinización (círculos compactos), actividad de maltasa (cuadrados compactos), gradiente de acetato de amonio 0,1-1 M (línea de puntos).

Figura 4. Perfil pH-actividad de la amilasa de Aspergillus niger (símbolos compactos) y amilasa pancreática (símbolos vacíos). La actividad de dextrinización (\boxempty, \bullet) y de glucoamilasa (\Box, \boxempty) se midió con almidón soluble como se describe en la sección experimental excepto que se usaron tampones 50 mM de citrato (pH 2,5-6) y de fosfato (pH 6-7,7).

Figura 5. Ejemplo de datos registrados en un paciente (edad: 8 años) antes (periodo de referencia) y durante la suplementación con amilasa y lipasa estables a los ácidos (gastrorresistentes) (periodo de ensayo).

De forma importante, la ganancia en peso corporal continuó después de la finalización del ensayo.

Referencias

1. G. Peschke, Active components and galenic aspects of enzyme preparations, Pancreatic Enzymes in Health and Disease (P.G. Lankisch, ed.), Springer, Berlin, pp. 55-64 (1991).

2. R. Kraemer, A. Rüdeberg, B. Hodorn and E. Rossi, Relative underweight in cystic fibrosis and its prognostic value, Acta Paediatr. Scand., 67: 33-37.

3. E. DiMagno, J. Malagelada, V. Go, and C. Moertel, Fate of orally ingested enzymes in pancreatic insufficiency, N. Engl. J. Med., 296: 1318-1322 (1977).

4. Y. Gargouri, H. Moreau, and R. Verqer, Gastric lipases: biochemical and physiological studies, Biochim. Biophys. Acta, 1006: 255-271 (1989).

5. I. Ihse, P. Lilja, and I. Lundquist, Intestinal concentrations of pancreatic enzymes following pancreatic therapy, Scand. J. Gastroent., 15: 137-144 (1980).

6. A. Whitehead, study to compare the enzyme activity, acid resistance and dissolution characteristics of currently available pancreatic enzyme preparations, Pharm. Weekbl. [Sci.], 10: 12-16 (1988).

7. J. Saunders, S. Drummond, and K. Wormsley, Inhibition of gastric secretion in treatment of pancreatic
insufficiency, Br. Med. J., 1: 418-419 (1977).

8. V. Hubbard, G. Dunn, and L. Lester, Effectiveness of cimetidine as an adjunct to supplemental pancreatic enzymes in patients with cystic fibrosis, Am. J. Clin. Nutr., 33: 2281-2286 (1980).

9. D. Graham, Pancreatic enzyme replacement. The effect of antacid or cimetidine, Dig. Dis. Sci., 27: 485-490 (1982).

10. M. Shoni, R. Kraemer, A. Ruedeberg, M. Lentze, R. Mordasini, W. Riesen, M. Kläy, and E. Rcssi, Long-term cimetidine in children with cystic fibrosis: a randomized double-blind study, Pediatr. Res., 18: 66-70 (1984).

11. H. Heijerman, C. Lamers, J. Dijkman, and W. Bakker, Ranitidine compared with the dimethylprostaglandin E2-analogue enprostil as adjunct to pancreatic enzyme replacement in adult cystic fibrosis, Scand. J. Gastroenterol., 25 (suppl 178): 26-31 (1990).

12. C. Lamers and J. Jansen, Omeprazole as adjunct to enzyme replacement treatment in severe pancreatic
insufficiency, Br. Med. J., 293: 99 (1986).

13. H. Heijerman, New modalities in the treatment of exocrine pancreatic insufficiency in cystic fibrosis,
Netherlands Journal of Medicine 41: 105-109 (1992).

14. G. Cleghorn, R. Shepherd, and T. Holt, The use of a synthetic prostaglandin E_{1} analogue (Misoprostol) as an adjunct to pancreatic enzyme replacement in cystic fibrosis, Scand. J. Gastroenterol., 20 (suppl 143): 142-147 (1988).

15. R. Stockbruegger, Bacterial overgrowth as a consequence of reduced gastric acidity, Scand. J. Gastroenterol., 20 (suppl): 7-15 (1985).

16. C. Howden and R. Hunt, Relationship between gastric secretion and infection, Gut 25: 96-107 (1987).

17. P. Regan, J. Malagelada, E. DiMagno, S. Glanzman, and V. Go, Comparative effects of antacids, cimetidine and enteric coating on the therapeutic response to oral enzymes in severe pancreatic insufficiency, N. Eng. J. Med., 297: 854-85S (1977).

18. D. Graham and J. Sackman, Mechanism of increase in steatorrhea with calcium and magnesium in exocrine pancreatic insufficiency: an animal model, Gastroenteroloqy 83: 638-644 (1982).

19. E. Nassif, M. Younoszai, M. Weinberqer, and C. Nassif, Comparative effects of antacids, enteric coating, and bile salts on the efficacy of oral pancreatic enzyme therapy in cystic fibrosis, J. Pediatr., 98: 320-323 (1981).

20. W. Uyttenbroeck, D. Hendriks, G. Vriend, I. De Baere, L. Moens and S. Scharpé, Molecular characterization of an extracellular acid-resistant lipase produced by Rhizopus javanicus, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 245-254 (1993).

21. F. Goossens, I. De Meester, G. Vanhoof, D. Hendriks, G. Vriend, and S. Scharpé, The purification, characterization and analysis of primary and secondary-structure of prolyl oligopeptidase from human lymphocytes. Evidence that the enzyme belongs to the \alpha/\beta hydrolase fold family, Eur. J. Biochem., 233, 432-441 (1995).

22. M.R. Aires-Barros, M.A. Taipa and J.M.S. Cabral, Isolation and purification of lipases, in: Lipases, eds. P. Woolley and S.B. Petersen, Cambridge University Press, p. 243-270 (1994).

23. A. Canas-Rodriguez and H. Smith, The identification of the antimicrobial factors of the stomach contents of sucking rabbits, Biochem. J., 100: 79-82 (1966).

24. H. Thormar, C. Isaacs, H. Brown, M. Barshatzky, and T. Pessolano, Inactivation of enveloped viruses and killing of cells by fatty acids and monoglycerides, Antimicrob. Agents Chemother., 31: 27-31 (1987).

Claims (21)

1. Una composición para mejorar la digestibilidad y la utilización de los nutrientes, que comprende una enzima o complejo de enzimas que tienen actividad de maltasa, actividad de glucoamilasa, actividad de dextrinización y la estabilidad a los ácidos del complejo de amilasa de Aspergillus niger.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que la enzima o complejo de enzimas es de origen fúngico.

3. La composición según la reivindicación 2, en la que la enzima o complejo de enzimas se origina de Aspergillus niger.

4. La composición según la reivindicación 1, en la que la enzima o complejo de enzimas es una enzima recombinante o un complejo de enzimas recombinantes.

5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además una o más lipasas estables a los ácidos.

6. La composición según la reivindicación 5, en la que la lipasa es de origen fúngico.

7. La composición según la reivindicación 6, en la que la lipasa se origina de Rhizopus arrhizus o Rhizopus javanicus.

8. La composición según la reivindicación 6, en la que la lipasa es una lipasa recombinante.

9. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que comprende además enzimas proteolíticas y/o enzimas que escinden el ácido nucleico y/o los fosfolípidos y/o otros lípidos.

10. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la composición está en la forma de cápsulas, comprimidos, pelets, polvo, microesferas, jarabe reconstituible.

11. La composición según la reivindicación 9, en la que la composición está en la forma de cápsulas de gelatina dura, que comprenden microesferas de lipasa fúngica estable a los ácidos con una actividad lipolítica de al menos 150.000 unidades FIP/g, y microesferas de un complejo de amilasa fúngica estable a los ácidos con una actividad de degradación de la maltosa y el almidón de al menos 300 unidades de amiloglucosidasa/g.

12. La composición según la reivindicación 11, en la que las microesferas tienen un diámetro entre 0,5 y 2,0, preferiblemente entre 0,8 y 1,6 mm, y las cápsulas comprenden aproximadamente 25-75%, más preferiblemente aproximadamente 50-75%, y lo más preferiblemente aproximadamente 75% de la lipasa estable a los ácidos, y aproximadamente 25-75%, más preferiblemente aproximadamente 25-50%, y lo más preferiblemente aproximadamente 25% de la amilasa estable a los ácidos.

13. La composición según la reivindicación 10, en la que la composición comprende una preparación liofilizada de la lipasa y la amilasa, opcionalmente junto con colorantes y aromatizantes, cuya preparación forma un jarabe o un líquido tras la adición de agua.

14. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, cuya composición es una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina.

15. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, cuya composición es una composición farmacéutica para uso junto con la pancreatina en el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina.

16. La composición farmacéutica según las reivindicaciones 14 o 15, en la que la insuficiencia pancreática exocrina es el resultado de la pancreatitis crónica adquirida, alcoholismo, fibrosis quística o carcinomas pancreáticos o un efecto secundario de los mismos.

17. El uso de una enzima o complejo de enzimas que tienen actividad de maltasa, actividad de glucoamilasa, actividad de dextrinización y la estabilidad a los ácidos del complejo de amilasa de Aspergillus niger para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la insuficiencia pancreática exocrina.

18. El uso de una enzima o complejo de enzimas que tienen actividad de maltasa, actividad de glucoamilasa, actividad de dextrinización y la estabilidad a los ácidos del complejo de amilasa de Aspergillus niger para la preparación de un ayudante de la digestión o de una composición para reponer la flora intestinal de un individuo, por ejemplo después de tratamiento con antibióticos.

19. El uso según las reivindicaciones 17 y 18, en el que la composición comprende además una lipasa estable a los ácidos.

20. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que la enzima o complejo de enzimas es el complejo de amilasa de Aspergillus niger.

21. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en el que la enzima o complejo de enzimas es una enzima o un complejo de enzimas recombinantes.