CZ299055B6 - Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genupro lipázu, prostredek mající fosfolipázovou úcinnost, farmaceutický prostredek, izolovaný imunizacní peptid a nukleová kyselina, biologicky aktivní prostredek, vektor, rekombinantní bunka, prostredek - Google Patents

Abstract

Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genupro lipázu (LLG), kde uvedený polypeptid (a) se váže na heparin, (b) má homologii s lidskou lipoproteinovou lipázou a jaterních lipáz, a (c) obsahuje39 kD katalytickou doménu triacylglycerol-lipázové rodiny, kde 39 kD katalytická doména triacylglycerol-lipázové rodiny má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10. Prostredek majícího fosfolipázovou úcinnost obsahující tento polypeptid, a farmaceutický prostredek. Izolovaný imunizacní peptid a izolovaná nukleová kyselina kódující izolovaný polypeptid kódovaný LLG. Biologicky aktivní prostredek a farmaceutický prostredek obsahující tuto izolovanou nukleovou kyselinu. Vektor obsahující tuto izolovanou nukleovou kyselinu a rekombinantní bunky obsahující tento vektor. Prostredek využitelný k transfekaci cílové bunky. Farmaceutický prostredek obsahující tento vektor. Zpusob výroby polypeptidu a polypeptid takto pripravený. Protilátka schopná specifické vazby na výše specifikovaný izolovaný polypeptid a hybridomní bunka produkující tuto protilátku. Prostredek poskytující navázání izolovaného polypeptidu na protilátku. Farmaceutický prostredek obsahující tuto protilátku. Zpusob screeningu LLG agonistu nebo antagonistu. Zpusob in vitro enzymatické hydrolýzy fosfatidylcholinesteru. Použití farmaceutického prostredku obsahujícího izolovaný polypeptid nebo nukleovou kyselinu pro výrobu léciva pro zlepšení sérového lipidového profilu. Transgenní myš exprimující izolovaný polypeptid.

Description

Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genu pro lipázu, prostředek mající fosfolipázovou účinnost, farmaceutický prostředek, izolovaný imunizační peptid a nukleová kyselina, biologicky aktivní prostředek, vektor, rekombinantní buňka, prostředek využitelný k transfekaci cílové buňky, způsob výroby polypeptidu a polypeptid takto vyrobený, protilátka, hybridomní buňka, způsob screeningu, způsob in vitro enzymatické hydrolýzy, použití farmaceutického prostředku a transgenní myš

Oblast techniky

Vynález se týká izolovaného polypeptidu kódovaného genem podobným genu pro lipázu, prostředku majícího fosfolipázovou účinnost, který obsahuje tento polypeptid, a farmaceutického prostředku obsahujícího tento polypeptid. Dále je vynález zaměřen na izolovaný imunizační peptid a izolovanou nukleovou kyselinu kódující izolovaný polypeptid kódovaný genem podobíš ným genu pro lipázu. Dále se vynález týká biologicky aktivního prostředku a farmaceutického prostředku obsahujícího tuto izolovanou nukleovou kyselinu. Dále se vynález týká vektoru obsahujícího tuto izolovanou nukleovou kyselinu a rekombinantní buňky obsahující tento vektor.

Dále se vynález týká prostředku využitelného k transfekaci cílové buňky. Dále se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího výše specifikovaný vektor. Dále se vynález týká způso20 bu výroby polypeptidu a polypeptidu takto připraveného. Kromě toho se vynález týká protilátky schopné specifické vazby na výše specifikovaný izolovaný polypeptid a hybridomní buňky produkující tuto protilátku. Dále se vynález týká prostředku poskytujícího navázání izolovaného polypeptidu podle vynálezu na protilátku. Dále se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího výše specifikovanou protilátku. Dále se vynález týká způsobu screeningu LLG (gen podobný genu pro lipázu) agonistů nebo antagonistů. Dále se vynález týká způsobu in vitro enzymatické hydrolýzy fosfatidylcholinesteru. Dále se vynález týká použití farmaceutického prostředku obsahujícího izolovaný polypeptid nebo nukleovou kyselinu podle vynálezu pro výrobu léčiva pro zlepšení sérového lipidového profilu. A konečně se vynález týká transgenní myši exprimující izolovaný polypeptid podle vynálezu.

Konkrétně je možno uvést, že se vynález týká polypeptidů rodiny triacylglycerol-lipázy, nukleových kyselin kódujících uvedené polypeptidy, antisense sekvencí odvozených od uvedených nukleových kyselin a protilátek proti uvedeným polypeptidům. Rovněž do rozsahu vynálezu náleží příprava uvedených polypeptidů za použití pro vyhledávání agonistů a antagonistů uvede35 ných polypeptidů. Vynález se také týká způsobů pro terapeutické použití takových polypeptidů a nukleových kyselin kódujících tyto polypeptidy ve farmaceutických prostředcích, včetně prostředků pro genovou terapii, pro léčbu onemocnění lipidového a lipoproteinového metabolismu.

Dosavadní stav techniky (A) Lipidy

Lipidy jsou ve vodě nerozpustné organické biomolekuly, které jsou základními složkami podílejí45 cích se na různých biologických funkcích, včetně uchovávání, transportu a metabolismu energie, a struktury a tekutosti membrán. Lipidy jsou v případě lidí a jiných živočichů získávány ze dvou zdrojů: některé lipidy jsou přijímány potravou jako potravinové tuky a oleje a jiné lipidy jsou biologickými pochody syntetizovány člověkem nebo živočichem. U savců tvoří lipidy alespoň 10 % tělesné hmotnosti, z nichž většina je ve formě triacylglycerolů.

Triacylglyceroly, též známé jako triglyceridy a triacylglyceridy, jsou tvořeny třemi mastnými kyselinami esterifikovanými na glycerol. Potravinové triacylglyceroly jsou skladovány v tukové tkáni jako zdroj energie, nebo jsou hydrolyzovány v trávicím traktu triacylglycerollipasami, z nichž nejvýhodnější je pankreatická lipasa. Triacylglyceroly jsou transportovány mezi tkáněmi ve formě lipoproteinů.

-1 CZ 299055 B6

Lipoproteiny jsou micelovitá seskupení, která se nacházejí v plasmě a obsahují různé poměry různých typů lipidů a proteinů (nazývaných apoproteiny). Existuje pět hlavních tříd plasmatických lipoproteinů, jejichž hlavní funkcí je transport lipidů. Tyto třídy jsou, podle zvyšující se hustoty, chylomikrony, lipoproteiny s velmi nízkou hustotou (VLDL), lipoproteiny se střední hustotou (IDL), lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL) a lipoproteiny s vysokou hustotou (HDL). Ačkoliv se v rámci každé třídy lipoproteinů vyskytují různé typy lipidů, transportuje každá třída především jeden typ lipidů: triacylglyceroly popsané výše jsou transportovány v chylomikronech, VLDL a IDL, zatímco fosfolipidy a estery cholesterolu jsou transportovány v HDL a LDL, v příslušném pořadí.

Fosfolipidy jsou diestery mastných kyselin s glycerolfosfatem, které také obsahují polární skupinu navázanou na fosfát. Fosfolipidy jsou významnou strukturální složkou buněčných membrán. Fosfolipidy jsou hydrolyzovány enzymy zvanými fosfolipasy. Fosfatidylcholin, jako příklad fos15 folipidu, je hlavní složkou membrán většinou eukaryotických buněk.

Cholesterol je metabolickým prekurzorem steroidních hormonů a žlučových kyselin, stejně jako je základní složkou buněčných membrán. U lidí a u jiných živočichů je cholesterol přijímán potravou a též je syntetizován v játrech a vjiných tkáních. Cholesterol je transportován mezi tkáně20 mi ve formě cholesterylesterů v LDL a jiných lipoproteinech.

Membrány obklopují každou živou buňku a slouží jako bariera mezi intracelulámími a extracelulámími kompartmenty. Membrány také obklopují jádro eukaryotických buněk, tvoří endoplasmatické retikulum a slouží ve specializovaných funkcích jako jsou například myelinové pochvy obklopující axony. Typická membrána obsahuje přibližně 40 % lipidů a 60 % proteinů, ale v tomto poměru existují významné odchylky. Hlavními lipidovými složkami jsou fosfolipidy, zejména fosfatidylcholin a fosfatidylethanolamin a cholesterol. Fyzikálně-chemické vlastnosti membrán, jako tekutost, mohou být změněny modifikací profilu fosfolipidů mastných kyselin nebo obsahu cholesterolu. Modulování složení a organizace membránových lipidů také ovlivňuje buněčné funkce závislé na membráně, jako je aktivita receptorů, endocytosa a tok cholesterolu.

(B) Enzymy

Triacylglycerol-lipasy jsou skupinou enzymů, která má mnoho zásadních funkcí v metabolismu lipidů v těle. Byly popsány tři členy skupiny lidských triacylglycerol-lipas: pankreatická lipasa, lipoproteinová lipasa a jatemí lipasa (Goldberg, I.J. Le, N.A., Ginsberg, H.N., Krauss, R.M., aLindgren, F.T., (1988) J. Clin. Invest. 81: 561-568; Goldberg, I.J., Le, N, Paterniti, J.R., Ginsberg, H.N., Lindgren, F.T. a Brown, W.V. (1982) J. Clin. Invest. 70: 1184 - 1192; Hide, W.A., Chán, L., a Li, W.-H., (1992) J. Lipid Res. 33: 167-178). Pankreatická lipasa je primárně odpovědná za hydrolýzu potravinových lipidů. Popsány byly různé varianty pankreatické lipasy, ale jejich fyziologická funkce nebyla určena (Giler, T, Buchwald, P., Blum-Kaelin, D. aHunziker, W., (1992) J. Biol. Chem. 267: 16 509- 16 516). Lipoproteinová lipasa je hlavním enzymem odpovědným za distribuci a využití triacylglyceridů v těle. Lipoproteinová lipasa hydrolyzuje triglyceridy jak v chylomikronech, tak ve VLDL. Jatemí lipasa též působí jako fosfolipasa a hydro45 lyžuje fosfolipidy v HDL.

Fosfolipasy mají významnou úlohu vkatabolismu a remodelování fosfolipidových složek lipoproteinů a fosfolipidů v membránách. Fosfolipasy mají také funkci v uvolňování kyseliny arachidonové a v následné tvorbě prostaglandinů, leukotrienů a jiných lipidů, které se účastní různých zánětlivých procesů.

Lipasové polypeptidy kódované těmito lipasovými geny mají délku přibližně 450 aminokyselin s vedoucími signálními peptidy pro usnadnění sekrece. Lipasové proteiny se skládají ze dvou hlavních domén (Winkler, K, DArcy, A., a Hunziker, W., (1990), Nátuře 343: 771 - 774).

Amino-koncová doména obsahuje katalytické místo, zatímco o karboxy-koncové doméně se

-2CZ 299055 B6 předpokládá, že je odpovědná za vazbu substrátu, asociaci s kofaktorem a za interakci s buněčnými receptory (Wong, H, Davis, R.C., Nikazy, J., Seebart, K.E. a Schotz, M.C. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 11 290 - 11 294; van Tilbeurgh, H. Roussel, A. Lalouel, J.M., a Cambillau, C. (1994), J. Biol. Chem. 269: 4626 - 4633; Wong, H, Davis, R.C., Thuren, T, Goers, J.W.,

Nikazy, J. Waite, M., a Schotz, M.C. (1994) J. Biol. Chem. 269: 10 319 - 10 323; Chappel, D.A., Inoue, L, Fry, G.L., Pladet, M.W., Bowen S.L., Iverius, P.-H., Lalouet, J.M., aStrickland, D.K. (1994), J. Biol. Chem. 269: 18 001 - 18 006). Celková úroveň aminokyselinové homologie mezi členy rodiny je 22 až 65 %, s lokálními regiony vysoké homologie odpovídajícím strukturálním homologiím, které jsou spojeny s enzymatickou funkcí.

V přírodě se vyskytující protein lipoproteinové lipasy je glykosylovaný, přičemž tyto glykosylace je nutná pro enzymatickou aktivitu LPL (Semenkovich, C.F., Luo, C.-C., Nakanishi, M.K, Chen, S.-H., Smith, L.C., a Chán, L. (1990) J. Biol. Chem. 265: 5429 - 5433). Existují tři místa pro Nvázanou glykosylaci na jatemí a lipoproteinové lipase a jedno místo na pankreatické lipase. Dále, čtyři uspořádání cysteinů tvoří disulfidové můstky, které jsou nutné pro zachování strukturální integrity nutné pro enzymatickou aktivitu (Lo, J.-Y., Smith, L.C. a Chán, L. (1995) Biochem., Biophys. Res. Commun. 206: 266 - 271; Brady, J, Brzozowski, A.M., Dereweda. Z.S., Dodson, E., Dodson G., Totiey, S., Turkenburg, J.P., Christiansen, L., Huge-Jensen, B., Norskov, L., Thim, L., aMenge, U., (1990) Nátuře 343: 767 - 770).

Členové skupiny triacylglycerol-lipas mají společné mnohé strukturální charakteristiky. Jedním rysem je „GXSXG“ motiv, ve kterém je centrální serinový zbytek jedním ze tří zbytků obsahujících „katalytickou triádu“ (Winkler, K, DArcy,A ., a Hunziker, W., (1990), Nátuře 343: 771 774; Faustinella, F, Smith, L.C., a Chán, L., (1992) Biochemistry 31: 7219 - 7223). Konzer25 vované asparagové a histidinové zbytky vytvářejí rovnováhu katalytické trias. Krátký úsek o 19 až 23 aminokyselinách („lid region“) tvoří amfipatickou šroubovici a pokrývá katalytickou „kapsu“ enzymu (Winkler, K, DArcy, A., a Hunziker, W., (1990), Nátuře 343: 771- 774). Tento region odlišuje členy skupiny, přičemž nedávno bylo zjištěno, že určuje substrátovou specificitu enzymu (Dugi, K.A., Dichek, H.L., a Santamarina-Fojo, S., (1995) J. Biol. Chem. 270: 25 96 30 2 5 401). Srovnání mezi jatemí a lipoproteinovou lipasou prokázalo, že rozdíly v triacylglycerollipasové a fosfolipasové aktivitě enzymů jsou částečně způsobeny tímto „lid“ regionem (Dugi, K.A., Dichek. H.L. a Santamarina-Fojo, S., (1995), J. Biol. Chem. 270: 25 396-25 401).

Triacylglycerol-lipasy mají různý stupeň vazebné aktivity pro heparin. Lipoproteinová lipasa má nejvyšší afinitu pro heparin a tato vazebná aktivita byla lokalizována na protažení pozitivně nabitých zbytků a amino-doméně (Μ, Y., Henderson, H.E., Liu, M.S., Zhyng, H, Forsyte, I.J., Clarke-Lewis, L, Hayden, M.R., a Brunzell, J.D., J. Lipid Res., 35: 2049 - 2059). Lokalizace lipoproteinové lipasy na povrch endotelu (Cheng, C.F., Oosta, G.M., Bensadoun, A., a Rosenberg, R.D. (1981) J. Biol. Chem. 256: 12893 - 12896) je primárně zprostředkovaná vazbou na povrchové proteoglykany (Shimada, K, GUI, P.J., Silbert, J.E., Douglas, W.H.J., a Fanburg, B.L., (1981), J. Clin. Invest. 68: 995 - 1002; Saxena, U., Klein, M.G., a Gotdberg, I.J., (1991)

J. Biol. Chem. 266: 17 516- 17 521; Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. a Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90: 2013 - 2021). Tato vazebná aktivita umožňuje enzymu akcelerovat vychytávání LDL tím, že působí jako můstek mezi LDL a povrchem buněk (Mulder, M.,

Lombardi, P., Jansen, H, vanBerkel, T.J., Frants, R.R. a Havekes, L.M. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185: 582 - 587; Rutledge, J.C. a Goldberg, I.J. (1994), J. Lipid Res. 35: 1152 - 1160; Tsuchia, S., Yamabe, M., Yamaguchi, T, Kobayashi, Y, Konno, T., a Tada,

K. (1980) Int. J. Cancer 26: 171 - 176).

O lipoproteinové lipase a jatemí lipase je v případě obou známo, že působí spolu s ko-aktivačními proteiny:

apolipoproteinem Cil pro lipoproteinovou lipasu a ko-lipasou pro pankreatickou lipasu.

-3CZ 299055 B6

V publikacích podle dosavadního stavu techniky byly popsány tyto genové sekvence kódující lidskou pankreatickou lipasu, jatemí lipasu a lipoproteinovou lipasu (Genbank accession No. M93285, J03540, resp. M15856). Messenger RNA lidské jatemí lipasy a pankreatické lipasy mají délky přibližně 1,7, resp, 1.8 kilobází. Dva mRNA transkripty o 3,6 a 3,2 kB jsou produkovány z lidského genu pro lipoproteinovou lipasu. Tyto dva transkripty využívají alternativní polyadenylační signály a liší se ve své translační účinnosti (Rangenathan, G., Ong, J.M., Yukht, A., Saghizadeh, M., Simsolo, R.B., Bauer, A., aKern, P.A. (1995) J. Biol. Chem. 270: 7149 - 7155).

(C) Fyziologické procesy

Metabolismus lipidů zahrnuje interakce lipidů, apoproteinů, lipoproteinů a enzymů.

Jatemí lipasa a lipoproteinová lipasa jsou multifunkční proteiny, které zprostředkují vazbu, vychytávání, katabolismus a remodelování lipoproteinů a fosfolipidů. Lipoproteinová lipasa a ja15 temí lipasa jsou funkční při navázání na luminální povrch endotelových buněk v periferní tkáni a v játrech, v příslušném pořadí. Oba enzymy se účastní na reverzním transportu cholesterolu, což je přesun cholesterolu z periferních tkání do jater, buď z důvodu exkrece z těla, nebo recyklace. Genetické defekty v jatemí lipase a lipoproteinové lipase jsou známé a jsou příčinou dědičných onemocnění lipoproteinového metabolismu. Defekty v metabolismu lipoproteinů vedou k závažným metabolickým onemocněním, včetně hypercholesterolemie, hyperlipidemie a atherosklerosy.

Atherosklerosa je komplexní, polygenní onemocnění, které je histologicky definováno depozity (lipidovými nebo fibrolipidovými plaky) lipidů a jiných krevních derivátů ve stěně cév, zejména velkých arterií (aortě, koronárních arteriích, karotidách). Tyto plaky, které jsou více ěi méně kalcifikovány, podle stupně progrese atherosklerotického procesu, mohou být spojeny s lézemi a jsou asociovány s akumulací tukových depozit v cévách, kde se tato depozita skládají hlavně z esterů cholesterolu. Tyto plaky jsou doprovázeny zesílením stěny cév, hypertrofií hladkého svalu, výskytem pěnitých buněk (buňky obsahující lipidy vzniklé z makrofágů nekontrolovatelně vychytávajících cholesterol) a akumulací vazivové tkáně. Atheromový plak značně vyčnívá ze stěny, vytváří stenosu, která je odpovědná za oklusy cévy atheromem, trombem nebo embolem, k čemuž dochází u nejvíce postižených pacientů. Takové léze mohou vést ke vzniku závažných kardiovaskulárních patologických stavů, jako je infarkt, náhlá smrt, srdeční insuficience a mrtvice.

Funkce triacylglycerol-lipas u vaskulámích patologických stavů jako je atherosklerosa byla intenzivně zkoumána (přehled je uveden v Olivecrona, G. a Olivecrona, T. (1995) Curr. Opin. Lipid. 6: 291 -305). Obecně se soudí, že účinek triacylglycerol-lipas je antiatherogenní, protože tyto enzymy snižují hladiny sérových triacylglycerolů a podporují tvorbu HDL. Transgenní zvířa40 ta exprimující lidskou lipoproteinovou lipasu a jatemí lipasu mají snížené koncentrace plasmatických triglyceridů a zvýšené hladiny lipoproteinů s vysokou hustotou (HDL), (Shimada, M., Shimano, H., Gotoda, T, Yamamoto, K, Kawamura, M., Inaba, T, Yazaki, T. a Yamada, N. (1993) J. Biol. chem. 268: 17 924 -17 929; Liu, M.-S., Jirik, F.R., LeBoeuf, PC., Henderson, H, Castellani, L.W., Lusis, A.J., Ma, Y, Forsythe, I.J., Zhang, H, Kirk, E., Brunzell, J.D aHyaden, M.R. (1994) J. Biol. Chem., 269: 11 417-11 424). Bylo zjištěno, že lidé s genetickými defekty vedoucími k snížené aktivitě lipoproteinové lipasy mají hypertriglyceridemii, ale nemají vyšší riziko koronárních onemocnění. Je popsáno, že tato skutečnost je způsobena tím, že chybí produkce středně velikých, atherogenních lipoproteinů, které se mohou akumulovat v subendotelovém prostoru (Zilversmit, D.B. (1973) Circ. Res. 33: 633 - 638).

V lokalizované oblasti atherosklerotické léze se nicméně předpokládá, že zvýšená lipasová aktivita akceleruje atherogenní proces (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41: 153 - 158; Zatnbon, A., Torres,A ., Bijvoet, S., Gagne, C. Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden, M.R. a Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341: 1119 - 1121). Toto může být způsobeno vyšší vazbou a vychytáváním lipo55 proteinů cévní tkání, které je způsobeno lipasami (Eisenberg, S., Sehayek. E., Olivecrona, T.

-4CZ 299055 B6 a Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90: 2013 - 2021; Tabas, I, Li, 1, Brocia, R.W., Xu, S.W., Swenson, T.L., Williams, K.J. (1993), J. Biol. Chem. 268: 20 419 - 20 432; Nordestgaard, B.G. aNielsen, A.C. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5: 252 - 257; Williams, K.J. a Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vasc. Bio. 15: 551 - 561). Dále, vysoká lokální hladina Upasové aktivity může vést k cytotoxickým koncentracím mastných kyselin a lysofosfatidylcholinu v prekurzorových atherosklerotických lézích.

Přes znalosti funkce Upasové aktivity v homeostase lipidů nebyly v oboru identifikovány další geny kódující proteiny, které regulují metabolismus lipidů.

Podstata vynálezu

Podstatou řešení podle předmětného vynálezu je izolovaný polypeptid kódovaný genem podobíš ným genu pro lipasu (LLG), kde uvedený polypeptid:

(a) se váže na heparin, (b) má homologii s lidskou lipoproteinovou lipasou a jatemí lipasou, a (c) obsahuje 39 kD katalytickou doménu triacylglycerollipasové rodiny, kde 39 kD katalytická doména triacylglycerollipasové rodiny má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.

Ve výhodném provedení má tento izolovaný polypeptid aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 25 8 a molekulovou hmotnost přibližně 55 kD na 10 % SDS-PAGE gelu.

Podle dalšího výhodného provedení má tento izolovaný polypeptid aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8 a molekulovou hmotnost přibližně 68 kD na 10 % SDS-PAGE gelu.

Výhodně má tento izolovaný polypeptid aktivitu fosfolipasy A.

Podle dalšího výhodného provedení má tento izolovaný polypeptid aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6 a molekulovou hmotnost přibližně 40 kD na 10 % SDS-PAGE gelu.

Výhodně je tento izolovaný polypeptid podle vynálezu lidského původu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží prostředek mající fosfolipázovou účinnost, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje některý z výše specifikovaných polypeptidů a biologicky kompatibilní roztok.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje některý z výše specifikovaných polypeptidů a farmaceuticky přijatelný nosič.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží izolovaný imunizační peptid, který obsahuje SEQ ID NO: 16.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží izolovaná nukleová kyselina kódující některý z výše specifikovaných polypeptidů.

Ve výhodném provedení je touto izolovanou nukleovou kyselinou cDNA. Výhodně je její nukleotidová sekvence vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 5, 7 a 9. Výhodně obsahuje nukleotidy 252 až 1754 SEQ ID NO: 7.

-5CZ 299055 B6

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží izolovaná nukleová kyselina, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek na nukleovou kyselinu mající sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3, 5 a 7. Výhodně tato izolovaná nukleová kyselina obsahuje 20 nukleotidů. Výhodně je touto izolovanou nukleovou kyselinou antisense nukleová kyselina. Výhodně je sekvence této antisense nukleové kyseliny operativně navázána na regulační region pro genovou expresi.

Podle dalšího výhodného provedení je touto izolovanou nukleovou kyselinou kyselina, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek na cílovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnulo jící nukleotidy 44 až 79 SEQ ID NO: 3 a nukleotidy 1036 až 1065 SEQ ID NO: 5.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží biologicky aktivní prostředek, který obsahuje výše specifikovanou nukleovou kyselinu a biologicky kompatibilní roztok.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše specifikovanou nukleovou kyselinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor obsahující výše specifikovanou izolovanou nukleovou kyselinu operativně navázanou na regulační region.

Ve výhodném provedení je v případě tohoto vektoru regulační region z heterologního zdroje. Rovněž je výhodné, jestliže je tímto vektorem podle vynálezu virový vektor. Nejvýhodněji je tímto vektorem adenovirový vektor.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rekombinantní buňka obsahující výše specifikovaný vektor.

Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu je touto rekombinantní buňkou eukaryotická buňka, ještě výhodněji je touto buňkou COS-7 buňka.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží prostředek využitelný k transfekaci cílové buňky, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše specifikovaný vektor a biologicky kompatibilní roztok.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše specifikovaný vektor a farmaceuticky přijatelný nosič.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob výroby polypeptidu, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kultivaci výše specifikovaných rekombinantních buněk za podmínek umožňujících expresi polypeptidu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží polypeptid připravený tímto způsobem podle vynálezu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží protilátka schopná specifické vazby na polypeptid podle vynálezu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží protilátka schopná specifické vazby na polypeptid podle vynálezu a neutralizující fosfolipasovou aktivitu polypeptidu.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je touto protilátkou monoklonální protilátka. Podle dalšího výhodného provedení je touto protilátkou polyklonální protilátka.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží hybridomní buňka, která produkuje protilátku 55 podle předmětného vynálezu.

-6CZ 299055 B6

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží prostředek poskytující navázání izolovaného polypeptidu podle předmětného vynálezu na protilátku, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše specifikovanou protilátku podle vynálezu a biologicky kompatibilní roztok.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje výše specifikovanou protilátku podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob screeningu aktivity LLG (gen podobný genu pro lipázu) agonistů nebo antagonistů, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:

(a) kontaktování potenciálních agonistů nebo antagonistů a LLG a substrátem LLG, a (b) měření schopnosti potenciálních agonistů nebo antagonistů potencovat nebo inhibovat LLG aktivitu, kde LLG je polypeptid podle vynálezu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob in vitro enzymatické hydrolýzy fosfatidylcholinesteru, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kontaktování uvedeného fosfatidyl20 cholinesteru s výše specifikovaným polypeptidem podle vynálezu.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití farmaceutického prostředku podle předmětného vynálezu, obsahujícího polypeptid podle vynálezu nebo nukleovou kyselinu podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, pro výrobu léčiva pro zlepšení sérového lipidového profilu u lidí a jiných živočichů majících nežádoucí lipidový profil.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití farmaceutického prostředku podle předmětného vynálezu, obsahujícího protilátku podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, pro výrobu léčiva pro zlepšení sérového lipidového profilu u lidí a jiných živočichů majících nežá30 doučí lipidový profil.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží transgenní myš exprimující izolovaný polypeptid podle předmětného vynálezu.

Předmětný vynález se týká objemu genu podobného genu pro lipasu (LLG), jeho exprimovaného polypeptidového produktu a prostředků a způsobů pro jeho použití. LLG polypeptid se váže na heparin, má homologii s lidskou lipoproteinovou lipasou a jatemí lipasou a obsahuje 39 kD katalytickou doménu náležící do skupiny triacylglycerol-lipas. V dalším provedení má polypeptid aktivitu fosfolipasy A.

Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z přiložených obrázků a z následujícího podrobného popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna sekvence (SEQ ID NO: 17-31) primerů použitých v příkladných PCR amplifikacích.

Na obr. 2 je znázorněna sekvence nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 1) a vydedukované aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 2) RT-PCR produkty diferenciálního zobrazení obsahujícího LLG cDNA. Sekvence odpovídající dvěma příměrům použitým při amplifikaci jsou podtrženy. Terminační kodon s polyadenylační signál jsou rámečkovány. GAATTC motivy a sousedící sekvence jsou z pCRII vektoru, do kterého byl produkt klonován.

-7CZ 299055 B6

Na obr. 3 je znázorněna sekvence nukleové kyseliny (SEQ ID NO: 3) a vydedukované aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 4) R'RACE extenze LLG cDNA. Sekvence odpovídající dvěma příměrům použitým v amplifikaci jsou podtrženy. GAATTC motivy a sousedící sekvence jsou z pCRII vektoru, do kterého byl produkt klonován.

Na obr. 4 je znázorněna sekvence (SEQ ID NO: 7) cDNA obsahující kompletní otevřený „reading frame“ genu podobného genu pro lipasu, LLGXL. Startovací kodon (ATG) a terminační kodon (TGA) jsou orámečkovány. Dral místo (TTTAAA) a Srfl místo (GCCCGGGC) použité při konstrukci expresních vektorů jsou podtrženy.

Na obr. 5 je znázorněna vydedukovaná aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 8) LLGXL proteinu. Předpokládaná signální sekvence je podtržena.

Na obr. 6 je znázorněno přiřazení proteinové sekvence členů triancylglycerol-lipasové genové skupiny (SEQ ID NO: 13 - 15). Zbytky v rámečku jsou identické s LLGXL proteinem (SEQ ID NO: 8). Mezery byly vloženy do sekvencí pro maximalizaci přiřazení za použití CLUSTAL programu.

Na obr. 7 je znázorněna Northern analýza LLG mRNA v THP-1 buňkách. Buňky byly stimu20 lovány buď PMA, nebo PMA a oxidovaným LDL (PMA + oxLDL). Čísla vlevo ukazují pozice RNA standardů (v kilobázích).

Na obr. 8 je znázorněna Northern analýza mRNA z více lidských tkání, která byla sondována LLG, lipoproteinovou lipasou (LPL) a lidským beta-aktinem. Pozice 4,4 kb RNA standardu je uvedena vlevo na LLG a LPL panelech.

Na obr. 9 je znázorněna Northern analýza LLG a LPL exprese v kultivovaných lidských endotelových buňkách a v THP-1 buňkách. Buňky byly buď nestimulované (nevystavené PMA), nebo stimulované PMA.

Na obr. 10 je ilustrována sekvence imunizujícího peptidu (SEQ ID NO: 16) a její vztah k sekvenci LLGXL proteinu. Peptid je uveden v rámečku. Terminální cystein byl vložen pro usnadnění vazby peptidu na proteinový nosič.

Na obr. 11 je ilustrována Western analýza proteinů navázaných na heparin-Sepharosu kondicionovaného média kultivovaných endotelových buněk. Skvrna byla sondována anti-LLG antisérem. Čísla nalevo ukazují pozici proteinových standardů v kilodaltonech.

Na obr. 12 je ilustrována Western analýza proteinů navázaných na heparin-Sepharosu v kondi40 cionovaném médiu COS-7 buněk dočasně transfektovaných expresním vektorem obsahujícím cDNA pro LLGN nebo LLGXL nebo neobsahujícím DNA (Mock). Proteiny z endotelových buněk stimulovaných PMA (HCAEC + PMA) byly použity pro kontrolu velikosti. Čísla nalevo uvádějí zřetelné molekulové hmotnosti hlavních imunoreaktivních proteinů, jak byly určeny srovnáním s proteinovými standarty.

Na obr. 13 je ilustrována sekvence králičího LLG PCR produktu (RELLG.SEQ, SEQ ID NO: 12) a přiřazení sekvence mezi králičím LLG PCR produktem a odpovídající sekvencí v lidské cDNA (LLG7742A). Identické nukleotidy jsou v rámečku.

Na obr. 14 je ilustrována aktivita fosfolipasy A u lidského LPL, LLGN a LLGXL, za použití fosfatidylcholinového substrátu.

Na obr. 15 je ilustrována aktivita triacylglycerid-lipasy u lidského LPL, LLGN a LLGXL, za použití trioleinového substrátu.

-8CZ 299055 B6

Na obr. 16 je ilustrována hybridizace LLG a LPL sond na genomové DNA z různých druhů.

Předkládaný vynález se týká objemu genu podobného genu pro lipasu (LLG) ajeho exprimovaných polypeptidových produktů. Tyto polypeptidové produkty, patřící do skupiny triacyklglyce5 rol-lipas, obsahují 39 kD katalytickou doménu náležící do skupiny triacylglycerol-lipas, která má například sekvenci SEQ ID NO: 10. Podle jednoho z provedení podle předkládaného vynálezu je LLGN polypeptid, který obsahuje 354 aminokyselin. Podle dalšího provedení podle předkládaného vynálezu je LLGXL polypeptid, který obsahuje 500 aminokyselin a vykazuje 43% podobnost s lidskou lipoproteinovou lipasou a 37% podobnost s lidskou jatemí lipasou. LLGXL io polypeptid má aktivitu fosfolipasy A.

Podle předmětného vynálezu byla izolována parciální cDNA z mRNA THP-1 buněk, které byly vystaveny forbolesteru a oxidovány LDL. Po 5'RACE extenzi této parciální cDNA byla izolována menší alternativně sestřižená cDNA. Druhá, větší cDNA byla izolována z lidské placentami cDNA knihovny.

Norther analýzy prokázaly, že LLG gen je exprimován v endotelových buňkách. Antisérum proti peptidů předpokládané odvozenému z otevřeného reading frame cDNA detekovalo proteiny předpokládané velikosti pro LLGN a LLGXL v kondicionovaném médiu z kultivovaných endotelo20 vých buněk. Zpracování endotelových buněk forbolesterem vedlo ke zvýšené produkci LLG jak na úrovni mRNA, tak na úrovni proteinů. Jedná se o prvního člena triacylglycerollipasové skupiny, jehož exprese byla zjištěna v endotelových buňkách.

(A) Definice

Následující definované termíny jsou použity v předkládaném popisu, přičemž by měly napomoci pochopení rozsahu a provádění předkládaného vynálezu.

„Polypeptid“ je polymemí sloučenina skládající se z kovalentně vázaných aminokyselinových zbytků. Aminokyseliny mají následující obecnou strukturu:

H l

R-C-COOH

Aminokyseliny jsou klasifikovány do sedmi skupin podle bočního řetězce R: (1) s alifatickým bočním řetězcem, (2) s bočním řetězcem obsahujícím hydroxylovou (OH) skupinu (3) s bočním řetězcem obsahujícím atomy síry, (4) s bočním řetězcem obsahujícím kyselou nebo amidovou skupinu, (5) s bočním řetězcem obsahujícím bazickou skupinu, (6) s bočním řetězcem obsahujícím aromatický kruh, a (7) prolin, aminokyselinu, ve které je boční řetězec kondenzován na amino-skupinu.

„Protein“ je polypeptid, který má strukturální nebo funkční úlohu v živých buňkách.

Polypeptidy a proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být glykosylované nebo neglykosylované.

„Homologie“ znamená podobnost sekvence, která je důsledkem společného evolučního původu.

O polypeptidech a proteinech se uvádí že mají homologii, nebo podobnost, pokud je významná část jejich aminokyselin buď (1) identická, nebo (2) mají chemicky podobný boční řetězec R.

-9CZ 299055 B6

O nukleových kyselinách platí, že mají homologii, pokud je významné množství jejich nukleotidů identické.

„Izolovaný polypeptid“ nebo „izolovaný protein“ je polypeptid nebo protein, který v podstatě neobsahuje ty sloučeniny, které obvykle obsahuje v přirozeném stavu (například další proteiny nebo polypeptidy, nukleové kyseliny, sacharidy, lipidy). Termín „izolovaný“ nevylučuje umělé nebo syntetizované směsi s jinými sloučeninami, nebo nevylučuje přítomnost nečistot, které neovlivňují nepříznivým způsobem biologickou aktivitu a které mohou být přítomny, například, v důsledku neúplného přečištění, přidání stabilizačních činidel, nebo zpracování do formy farma10 ceuticky přijatelného prostředku.

Molekula je „antigenní“, pokud je schopna specifické interakce s molekulovou rozpoznávající antigen v imunitním systému, jako je imunoglobulin (protilátka) nebo antigenní receptor T buněk. Antigenní polypeptid obsahuje nejméně 5, lépe alespoň 10, aminokyselin. Antigenní část molekuly může být ta část, kteráje imunodominantní pro rozpoznání protilátkou nebo receptorem T buněk, nebo to může být část použitá pro vytvoření protilátky k molekule pomocí konjugace antigenní části na molekulu nosiče pro imunizaci. Molekula, která je antigenní, nemusí být sama o sobě imunogenní, tj. schopná vyvolání imunitní odpovědi bez nosiče.

„LLGN polypeptid“ a „LLGN protein“ je polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 6, kde uvedený polypeptid může být glykosylovaný nebo neglykosylovaný.

„LLGXL polypeptid“ a „LLGXL protein“ je polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 8, kde uvedený polypeptid může být glykosylovaný nebo neglykosylovaný.

„LLG polypeptid“ obecně označuje LLGN polypeptid a LLGXL polypeptid.

LLG polypeptid nebo protein podle předkládaného vynálezu zahrnuje jakýkoliv analog, fragment, derivát nebo mutant odvozený od LLG polypeptidu, který si uchovává alespoň jednu biolo30 gickou vlastnost LLG polypeptidu. V přírodě existují různé varianty LLG polypeptidu. Tyto varianty mohou být alelické varianty charakterizované rozdíly v nukleotidových sekvencích strukturálního genu kódujícího protein, nebo mohou obsahovat odlišný sestřih nebo postranslační modifikace. Odborníci v oboru mohou vyrobit varianty mající jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí, adicí nebo náhradou. Tyto varianty mohou zahrnovat, mimo jiné: (a) varianty, ve kterých je jeden nebo více aminokyselinových zbytků substituován konzervativní nebo nekonzervativní aminokyselinou, (b) varianty, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin adována na LLG polypeptid, (c) varianty, ve kterých jedna nebo více aminokyselin obsahuje substituent, a (d) varianty, ve kterých je LLG polypeptid kondenzován s jiným polypeptidem, jako je sérový albumin. Mezi další LLG polypeptidy podle předkládaného vynálezu patří varianty, ve kterých jsou aminokyselinové zbytky od jednoho druhu substituovány odpovídajícím zbytkem jiného druhu, buď v zachované, nebo v nezachované pozici. V jiném provedení jsou aminokyselinové zbytky v nezachovaných pozicích substituovány konzervativními nebo nekonzervativními zbytky. Technické metody získání těchto variant, včetně genetických (suprese, delece, mutace atd.), chemických a enzymatických technik, jsou odborníkům pracujícím v daném oboru běžně známé.

Pokud takové alelické varianty, analogy, fragmenty, deriváty, mutanty a modifikace, včetně forem vzniklých alternativním sestřihem mRNA a forem vzniklých alternativní post-translační modifikací, vedou ke vzniku derivátů LLG polypeptidu, který si zachovává biologické vlastnosti

LLG polypeptidu, pak spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

„Nukleová kyselina“ je polymemí sloučenina složená z kovalentně navázaných podjednotek, které se nazývají nukleotidy. Mezi nukleové kyseliny patří polyribonukleová kyselina (RNA) a polydeoxyribonukleová kyselina (DNA), které mohou být obě jednořetězcové nebo dvouřetěz-10CZ 299055 B6 cové. Mezi DNA patří cDNA, genomová DNA, syntetická DNA a semi-syntetická DNA. Sekvence nukleotidů, která kóduje protein, se nazývá kódující sekvence.

„Antisense nukleová kyselina“ je sekvence nukleotidů, která je komplementární ke kódující sekvenci. Antisense nukleové kyseliny mohou být použity pro snížení nebo blokádu exprese polypeptidu kódovaného kódujícím řetězcem.

„Izolovaná nukleová kyselina“ je nukleová kyselina, která v podstatě neobsahuje ty sloučeniny, které obvykle obsahuje v přirozeném stavu. Termín „izolovaná“ nevylučuje umělé nebo synteti10 zované směsi s jinými sloučeninami, nebo nevylučuje přítomnost nečistot, které neovlivňují nepříznivým způsobem biologickou aktivitu a které mohou být přítomny, například, v důsledku neúplného přečištění, přidání stabilizačních činidel, nebo zpracování do formy farmaceuticky přijatelného prostředku.

Termín „nukleová kyselina, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek“ (při vysoce náročných podmínkách) znamená, že hybridizované nukleové kyseliny odolávají promývání při podmínkách vysoké stringentnosti. Příkladem vysoce stringentních promývacích podmínek pro DNA-DNA hybridy je O,1X SSC, 0,5 % SDS při 68 °C. Jiné vysoce stringentní promývací jednotky jsou odborníkům pracujícím v daném oboru známé.

„Regulační region“ označuje sekvenci nukleové kyseliny, která reguluje expresi nukleové kyseliny. Regulační region může obsahovat sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi určité nukleové kyseliny (homologní region) nebo může obsahovat sekvence jiného původu (odpovědné za expresi jiných proteinů nebo i syntetických proteinů). Konkrétně mohou být těmito sekvence25 mi sekvence eukaryotických nebo virových genů nebo odvozené sekvence, které stimulují nebo potlačují transkripci genu specifickým nebo nespecifickým způsobem a indukovatelným nebo neindukovatelným způsobem. Regulační regiony zahrnují elementy rozpoznávající počátek replikace, místa pro sestřih RNA, zesilovače transkripce, transkripční terminační sekvence, signální sekvence, které směrují polypeptid do sekreční dráhy cílové buňky a promotory.

Regulační region z „heterologního zdroje“ je regulační region, který není přirozeně asociován s exprimovanou nukleovou kyselinou. Mezi tyto heterologní regulační regiony patří regulační regiony z jiných druhů, regulační regiony z jiných genů, hybridní regulační sekvence a regulační sekvence, které se přirozeně nevyskytují, ale které jsou navrženy odborníky zkušenými v daném oboru.

„Vektor“ je jakýkoliv prostředek pro přenos nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu do hostitelské buňky. Termín „vektor“ zahrnuje jak virové, tak nevirové prostředky pro vložení nukleové kyseliny do prokaryotických nebo eukaryotických buněk in vivo, ex vivo nebo in vitro.

Nevirové vektory zahrnují plasmidy, liposomy, elektricky nabité lipidy (cytofektiny), komplexy DNA-protein a biopolymery. Mezi virové vektory patří retrovirus, adeno-asociovaný virus, pox-virus, bakulovirus, virus vakcinie, herpes simplex virus, virus Epstein-Barrové a adenovirus. Kromě nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může vektor také obsahovat jeden nebo více regulačních regionů a/nebo selektovatelných markérů použitelných při selekci, měření a monitorování výsledků přenosu nukleové kyseliny (přenosu do určitých tkání, trvání exprese a podobně).

„Rekombinantní buňka“ je buňka, která obsahuje nukleovou kyselinu, která se přirozeně nevyskytuje v buňce. Termín „rekombinantní buňka“ zahrnuje vyšší eukaryotické buňky, jako je savčí buňka, nižší eukaryotické buňky, jako je kvasinka, prokaryotické buňky a archaebakteriální buňky.

Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ označuje ředidla a plnidla, která jsou farmaceuticky přijatelná pro způsob podávání a která jsou sterilní, přičemž těmito nosičovými látkami mohou být vodné nebo olejové suspenze vyrobené za použití vhodných dispergačních nebo smáčecích

-11 CZ 299055 B6 činidel a suspendačních činidel. Konkrétní farmaceuticky přijatelný nosič a poměr aktivní sloučeniny k nosičové látce se určí podle rozpustnosti a chemických vlastností těchto látek, podle stanoveného způsobu podávání a podle znalostí ze standardní farmaceutické praxe.

„Lipasa“ je protein, který enzymaticky štěpí lipidový substrát.

„Fosfolipasa“ je protein, který enzymaticky štěpí fosfolipidový substrát.

„Triacylglycerol-lipasa“ je protein, který enzymaticky štěpí triacylglycidový substrát.

„Fosfatidylcholin“ je glycerolfosfolipid mající následující strukturu:

R-—C—O—CH₂ i

R*—C—O-CH θ

-) H₂Íí---O----p-~O---CH₂---CH₂—N(CH₃)₃

O“ kde R a R¹ jsou uhlovodíkové boční řetězce mastných kyselin. Fosfatidylcholin je také známý jako lecitin.

Termín „lipidový profil“ označuje sadu koncentrací cholesterolu, triglyceridů, lipoproteinového cholesterolu a jiných lipidů v lidském těle nebo v těle jiného živočicha.

„Nežádoucí lipidový profil“ je stav, při kterém jsou koncentrace cholesterolu, triglyceridů nebo lipoproteinového cholesterolu mimo referenční meze pro věk a pohlaví. Obecně jsou koncentrace celkového cholesterolu > 200 mg/dl, plasmatických triacylglyceridů > 200 mg/dl, LDL cholesterolu > 130 mg/dl, HDL cholesterolu < 39 mg/ml nebo poměr celkového cholesterolu kHDL cholesterolu > 4,0 považovány za nežádoucí lipidový profil. Nežádoucí lipidový profil je spojován s mnoha patologickými stavy, včetně hyperlipidemie, diabetické hypercholesterolemie, athe25 rosklerosy a jiných forem onemocnění koronárních arterií.

(B) Polypeptidy

Předkládaný vynález poskytuje polypeptidy, které tvoří do triacylglycerollipasové skupiny a kte30 ré obsahují 39 kD katalytickou doménu triacylglycerollipasové skupiny, například mající sekvenci SEQ ID NO: 10. Podle jednoho z provedení podle předmětného vynálezu je tímto polypeptidem izolovaný LLG polypeptid obsahující SEQ ID NO: 6 a mající zdánlivou relativní molekulovou hmotnost přibližně 40 kDa na 10 % SDS-PAGE gelu. Podle dalšího provedení podle předmětného vynálezu je tímto polypeptidem izolovaný LLG polypeptid obsahující SEQ ID NO: 8 a mající zdánlivou relativní molekulovou hmotnost přibližně 55 kDa nebo 68 kDa na 10 % SDSPAGE gelu.

Polypeptidy a proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být rekombinantní polypeptidy, v přírodě se vyskytující polypeptidy nebo syntetické polypeptidy ajejich zdrojem mohou být lidé, králíci nebo jiní živočichové. Polypeptidy jsou charakterizovány reprodukovatelnou jednou molekulovou hmotností a/nebo sadou více molekulových hmotností, chromatografickou odezvou a elučními profily, aminokyselinovým složením a sekvencí a biologickou aktivitou.

- 12CZ 299055 B6

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány z přirozených zdrojů, jako jsou extrakty z placenty, lidská plasma nebo z kondicionované médium kultivovaných buněk, jako jsou makrofágy nebo endotelové buňky, za použití technik přečištění, kteréjsou odborníkům pracujícím v daném oboru známé.

Alternativně mohou být polypeptidy podle předkládaného vynálezu připraveny pomocí rekombinantní DNA technologie, která zahrnuje zkombinování nukleové kyseliny kódující její polypeptid se vhodným vektorem, inserci výsledného vektoru do vhodné hostitelské buňky, získání polypeptidu produkovaného výslednou hostitelskou buňkou a přečištění získaného polypeptidu.

(C) Nukleové kyseliny

Předkládaný vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny, které kódují LLG polypeptid.

Předkládaný vynález rovněž poskytuje antisense nukleové kyseliny, které mohou být použity pro snížení nebo blokování exprese LLG polypeptidu in vitro, in vivo nebo ex vivo.

Techniky rekombinantní DNA technologie jsou v tomto oboru známé. Obecné metody pro klonování a expresi rekombinantních molekul jsou popsány v Maniatis (Molecular Cloning, Cold

Spring Harbor Laboratories, 1982) a v Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987), kteréjsou zde uvedeny jako odkazové materiály.

Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být navázány najeden nebo více regulačních regionů. Výběr vhodného regulačního regionu nebo regionů je pro odborníky v oboru snadný. Regulační regiony zahrnují promotory a mohou zahrnovat zesilovače transkripce, supresory a podobně.

Mezi promotory, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, patří jak konstitutivní promotory, tak regulovatelné (indukovatelné) promotory. Promotory mohou být eukaryotické nebo prokaryotické, podle hostitele. Mezi prokaryotické (včetně bakteriofágových) promotory použitelné v předkládaném vynálezu patří lacl, lacZ, T3, T7, lambda P_r, Pi a trp promotory. Mezi eukaryotické (včetně virových) promotory použitelné při praktickém uplatnění předkládaného vynálezu patří ubikvitní promotory (například pro HPRT, vimentin, aktin, tubulin), intermediální vláknité promotory (například desmin, neurofilamenty, keratin, GFAP), terapeutické genové promotory (například MDR typ, CFTR, faktor VIII), tkáňově-specifické promotory (například aktiniový promotor v buňkách hladkého svalu, nebo Fit a Flk promotory aktivní v endoteliových buňkách), promotory, které jsou přednostně aktivovány v dělicích se buňkách, promotory, které reagují na stimuly (například receptor steroidního hormonu, receptor kyseliny retinové), tetracyklinem regulované transkripční modulátory, cytomegalovirový bezprostřední časný promotor, retrovirový LTR promotor, metallothioneinový promotor, SV—40 promotor, Ela promotor a MPL promotor. Tetracyklinem regulované transkripční modulátory a CMV promotory jsou popsány v mezinárodní publikované patentové přihlášce WO 96/01313, patentech Spojených států amerických US 5 168 062 a US 5 385 839, které jsou zde svým obsahem uvedeny jako odkazové materiály.

Výhodně jsou virové vektory použité v genové terapii replikačně-defektní, to znamená, že nejsou schopné autonomní replikace v cílových buňkách. Obecně, genom replikačně-defektních virových vektorů, které jsou použité v rozsahu předkládaného vynálezu, postrádá alespoň jeden region, který je nutný pro replikaci viru v infikované buňce. Tyto regiony mohou být buď elimi50 novány (zcela nebo částečně), nebo změněny na nefunkční technikami, které jsou v tomto oboru známé. Mezi tyto techniky patří úplné odstranění, substituce (jinou sekvencí, zejména insertovanou nukleovou kyselinou), částečná delece nebo adice jedné nebo několika bází k základnímu (pro replikaci) regionu. Takové techniky mohou být provedeny in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, za použití technik genetické manipulace nebo zpracováním mutagenními činidly.

-13CZ 299055 B6

Výhodně jsou v replikačně-defektním viru zachovány genomové sekvence, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.

Retroviry jsou integrující viry, které infikují dělící se buňky. Genom retroviru obsahuje dva LTR, sekvenci pro enkapsidaci a tři kódující regiony (gag, pol a env). Konstrukce rekombinantních retrovirových vektorů byla popsána například v EP 453242, EP 178220, Bernstein a kol., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick BioTechnology 3 (1985) 689, atd. V rekombinantních virových vektorech jsou gag, pol a env geny obvykle deletovány, zcela nebo částečně, a jsou nahrazeny požadovanou heterologní sekvencí nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být vyrobeny z růzío ných typů retroviru, jako je například MoMuLV („Moloneyův virus myší leukemie“). MSV („Moloneyův virus myšího sarkomu“), HaSV („virus Harveyho sarkomu“), SNV („virus nekrosy sleziny“), RSV („virus Rousova sarkomu“) a Friend virus.

Obecně je pro konstrukci rekombinantních retrovirů obsahujících sekvenci kódující LLG podle předkládaného vynálezu konstruován plasmid, který obsahuje LTR, enkapsidační sekvenci a kódující sekvenci. Tento konstrukt je použit pro transfekci bloku buněčné linie, kteráje schopná dodat „in trans“ retrovirové funkce, které jsou deficitní v plasmidu. Obecně jsou takto bloky buněčných linií schopné exprimovat gag, pol a env geny. Tyto bloky buněčných linií byly popsány v publikacích podle dosavadního stavu techniky, například buněčná linie PA317 (patent

Spojených států amerických US 4 861 719); PsiCRIP buněčná linie (WO 90/02806) aGP+envAm-12 buněčná linie (WO 89/07150). Kromě toho mohou rekombinantní retrovirové vektory obsahovat modifikace v LTR pro potlačení transkripční aktivity, stejně jako extenzivní enkapsidační sekvence, které mohou obsahovat část gag genu (Bender a kol., J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinantní retrovirové vektory se čistí standardními technikami běžně známými v tomto oboru.

Adeno-asociované viry (AAV) jsou DNA viry relativně malé velikosti, které se mohou integrovat, stabilním a místně specifickým způsobem, do genomu buněk, které infikují. Tyto viry jsou schopny infikovat široké spektrum buněk bez způsobení jakýchkoliv efektů na buněčný růst, morfologii nebo diferenciaci, a proto se nezdá, že by vyvolávaly u lidí patologické stavy. Genom AAV byl klonován, sekvenován a charakterizován. Obsahuje přibližně 4700 bází a obsahuje invertovaný terminální opakující se (ITR) region o přibližně 145 bázích na každém konci, který slouží jako zdroj replikace pro virus. Zbytek genomu je rozdělen do dvou základních regionů, které mají enkapsidační funkci: levá část genomu obsahuje rep gen, který se účastní virové repli35 kace a exprese virových genů; a pravá část genomu obsahuje cap gen kódující kapsidové proteiny viru.

Použití vektorů odvozených od AAV pro přenos genů in vivo a in vivo bylo popsáno publikacích podle dosavadního stavu techniky (viz WO 91/18088; patenty Spojených států amerických

US 4 797 368; US 5 139 941; a EP 448 528). Tyto publikace popisují různé konstrukty odvozené od AAV, ve kterých jsou rep a/nebo cap geny deletovány a nahrazeny požadovaným genem, a dále popisují použití těchto konstruktů pro přenos požadovaného genu in vivo (do kultivovaných buněk) nebo in vivo (přímo do organismu). Replikaěně-defektní rekombinantní AAV podle předkládaného vynálezu může být připraven současnou transfekci plasmidu obsahujícího požado45 vanou sekvenci nukleové kyseliny obklopenou dvěma invertovanými terminálními repetitivními (ITR) regiony, a plasmidem obsahujícím enkapsidační geny AAV (rep a cap geny), do buněčné linie, kteráje infikována lidským pomocným virem (například adenovirem). Produkované AAV rekombinanty se potom čistí standardními technikami. Vynález se také proto týká rekombinantního viru odvozeného od AAV, jehož genom obsahuje sekvenci kódující LLG polypeptid obklope50 nou ITR AAV. Vynález se rovněž týká plasmidu obsahujícího sekvenci kódující LLG polypeptid obklopenou dvěma ITR z AAV. Takový plasmid může být použit pro přenos LLG sekvence, kdy plasmid je v případě potřeby inkorporován do liposomálního vektoru (pseudo-virus).

Ve výhodném provedení je tímto vektorem adenovirový vektor.

- 14CZ 299055 B6

Adenoviry jsou eukaryotické viry, které mohou být modifikovány k účinnému dodání nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu do různých typů buněk.

Existují různé sérotypy adenovirů. Z těchto sérotypů jsou v předkládaném vynálezu přednostně použity typ 2 nebo typ 5 lidského adenovirů (Ad 2 nebo Ad 5), nebo adenovirus zvířecího původu (viz WO 94/26914). Mezi tyto adenoviry zvířecího původu, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, patří psí, hovězí, myší (například Mávl, Beard a kol., Virology 75 (1990), 81), ovčí, prasečí, ptačí a opičí (například SAV) adenoviry. Výhodně je zvířecím adenovirem psí adenovirus, nejméně CAV2 adenovirus (například Manhattan nebo kmen A26/61 (ATCC VR10 800).

Výhodně obsahují replikačně-defektní adenovirové vektory podle předkládaného vynálezu ITR, enkapsidační sekvenci a požadovanou nukleovou kyselinu. Ještě lépe je alespoň jeden El region adenovirového vektoru nefunkční. Delece se v El regionu výhodně rozprostírá v rozsahu od nukleotidu 455 do nukleotidu 3329 v sekvenci adenovirů Ad5. Další regiony mohou být také modifikovány, konkrétně E3 region (WO 95/02697), E2 region (WO 94/28938), E4 region (WO 94/28152 a WO 94/12649) nebo jakýkoliv z pozdních genů L1-L5. Defektní retrovirové vektory jsou popsány v WO 95/02697.

Ve výhodném provedení má adenovirový vektor delece v El a E4 regionech. Podle jiného výhodného provedení má adenovirový vektor delecí v El regionu, do kterého je insertován E4 region a sekvence kódující LLG (viz FR94 13355).

Replikačně-defektní rekombinantní adenoviry podle předkládaného vynálezu mohou být připra25 vény jakoukoliv běžně známou technikou v tomto oboru (Levrero a kol, Gene 101 (1991) 195; EP 18 5573; Graham, EMBO J. 3 (1984), 2917). Konkrétně mohou být připraveny homologní rekombinací mezi adenovirem a plasmidem, který obsahuje, kromě jiného, požadovanou DNA sekvenci. Homologní rekombinace je provedena po současné transfekci uvedeného adenovirů a plasmidu do vhodné buněčné linie. Použitá buněčná linie by měla být (i) transformovatelná uvedenými elementy, a (ii) měla by obsahovat sekvence, které jsou schopné doplnit část genomu replikačně-defektního adenovirů, výhodně v integrované formě, aby se předešlo riziku rekombinace. Jako příklady buněčných linií, které mohou být použity, je možno uvést buněčná linie lidských embryonálních ledvin 293 (Graham a kol., J. Genet. Virol. 36 (1977) 59)), která obsahuje levostrannou část genomu Ad5 adenovirů (12%) integrovanou do svého genomu, a buněčné linie, které jsou schopné doplnit funkce Ela E4, a které jsou popsány v publikovaných mezinárodních patentových přihláškách WO 94/26914 a WO 95/02679. Rekombinantní adenoviry jsou získány a přečištěny za použití standardních technik molekulární biologie, které jsou v tomto oboru dobře známé.

Snížení genové exprese za použití antisense nukleových kyselin může být provedeno na translační nebo na transkripční úrovni, Antisense nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně fragmenty nukleové kyseliny, které jsou schopné specifické hybridizace s celou nebo s částí nukleové kyseliny kódující LLG nebo s odpovídající messenger RNA. Tyto antisense nukleové kyseliny mohou být syntetické oligonukleotidy, případně modifikované za účelem zlepšení jejich stability a selektivity. Mohou jimi být rovněž DNA sekvence, jejichž exprese v buňkách vede k produkci RNA, která je komplementární k celé nebo k části mRNA pro LLG. Antisense nukleové kyseliny mohou být připraveny expresí celé nebo části sekvence vybrané ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 11, v opačné orientaci, jakje to popsáno v EP 140308. Pro praktické použití v předmětném vynálezu je vhodná jakákoliv délka antisense sekvence, pokud je schopná snížení nebo blokování exprese LLG. Výhodně má antisense sekvence délku alespoň 20 nukleotidů. Příprava a použití antisense nukleových kyselin, DNA kódující antisense RNA a použití oligo a genetických antisense sekvencí je popsáno ve WO 92/15680, přičemž obsahy těchto publikací zde slouží jako odkazové materiály.

-15CZ 299055 B6 (D) Protilátky

Předkládaný vynález poskytuje protilátky proti LLG polypeptidu. Tyto protilátky mohou být monoklonální protilátky nebo polyklonální protilátky. Předkládaný vynález obsahuje chimérické, jednořetězcové a humanizované protilátky, stejně jako Fab fragmenty a produkty Fab expresní knihovny.

Polyklonální protilátky mohou být připraveny proti antigennímu fragmentu LLG polypeptidu, jak je popsáno v příkladu 4A. Protilátky mohou být také vyrobeny proti intaktnímu LLG proteinu nebo polypeptidu, nebo proti fragmentu, derivátu nebo epitopu proteinu nebo polypeptidu. Protilátky mohou být získány po podání proteinu, polypeptidu, fragmentu, derivátu nebo epitopu zvířeti, za použití technik a postupů běžně známých v tomto oboru.

Monoklonální protilátky mohou být připraveny za použití metody popsané v publikaci Mishell,

B.B. a kol., Selected Methods in Cellulary Immunology (W.H. Freeman, ed.), San Francisco (1980). Stručně, polypeptid podle předkládaného vynálezu se použije pro imunizaci buněk sleziny Balb/c myší. Imunizované buňky sleziny se fúzují s myelomovými buňkami. Fúzované buňky obsahující charakteristiky slezinných a myelomových buněk se izolují růstem na HAT médiu, což je médium, které hubí oba původní typy buněk, ale umožňuje přežití a růst fúzovaných buněk.

Monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být „humanizované“, aby se zabránilo vyvolání imunitní odpovědi hostitele vůči protilátkám. „Humanizovaná protilátka“ je taková protilátka, ve které jsou komplementaritu určující regiony (CDR) a/nebo jiné části pracov25 ního rámce variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce odvozeny od jiného než lidského imunoglobulinu, ale zbývající část molekuly jsou odvozeny od jednoho nebo více lidských imunoglobulinů. Mezi humanizované protilátky také patří protilátky charakterizované humanizovaným těžkým řetězcem spojeným s donorovým nebo akceptorovým nemodifikovaným lehkým řetězcem nebo chimérickým lehkým řetězcem, nebo naopak. Humanizace protilátek může být provedena technikami běžně známými v tomto oboru (viz například G.E. Mark a E.A. Padlan, „Chapter 4, Humanization of Monoclonal Antibodies“, The Handbook ofExperimental Pharmacology, svazek 113, Springer Verlag, New York, 1994). Pro expresi humanizovaných protilátek mohou být použita transgenní zvířata.

Techniky běžně známé v tomto oboru používané pro získání jednořetězcových protilátek mohou být upraveny pro získání jednořetězcových protilátek k imunogenním polypeptidům a proteinům podle předkládaného vynálezu.

Anti-LLG protilátky jsou užitečné v testech pro detekci nebo kvantifikaci hladin LLG. Podle jed40 noho z provedení tyto testy umožňují klinickou diagnostiku a hodnocení LLG u různých patologických stavů a umožňují testování účinnosti léčby.

(E) Způsoby screeningu agonistů a antagonistů

Předkládaný vynález poskytuje způsoby screeningu knihoven malých molekul nebo v přírodě se vyskytujících sloučenin na agonistickou aktivitu (zesilovací nebo ko-aktivační aktivitu včetně proteinových ko-aktivátorů) nebo antagonistou aktivitu (inhibiční) vzhledem k LLGXL. Potenciální agonista nebo antagonista je kontaktován s LLGXL proteinem a substrátem LLGXL a měří se schopnost potenciálního agonisty nebo antagonisty zesilovat nebo inhibovat aktivitu LLGXL.

LLGXL protein použitý v této technice může být produkován rekombinantně v různých hostitelských buňkách, včetně savčích buněk (jak je patrné z příkladu 7), bakulovirem infikovaných hmyzích buněk, kvasinek a bakterií. LLG exprese ve stabilně transfektovaných CHO buňkách může být optimalizována methotrexatovou amplifikací buněk. LLGXL protein může být také

-16CZ 299055 B6 přečištěn z přirozených zdrojů, jako je lidská plasma, extrakty z placenty, nebo z kondicionovaného média kultivovaných endotelových buněk, THP-1 buněk nebo makrofágů.

Optimalizaci parametrů testu, včetně pH, koncentrací iontů, teploty, koncentrací substrátu a emulgačních podmínek, určí odborník pracující v daném oboru.

Substituenty mastných kyselin substrátů se mohou lišit v délce řetězce, stejně jako v množství a pozici nenasycených vazeb. Substráty mohou být radioaktivně značené v několika pozicích. Fosfolipidové substráty, jako je například fosfatidylcholin, mohou být radioaktivně značené, například v pozici Sn-1 nebo Sn-2 mastné kyseliny, nebo na glycerolu, fosfátu nebo polární hlavní skupině (cholinu v případě fosfatidylcholinu).

Jak alternativa k radioaktivně značeným substrátům mohou být při screeningových metodách použity také jiné třídy značených substrátů, jako jsou fluorescenční substráty nebo substráty obsahující thio-skupinu.

Fluorescenční substráty jsou zejména vhodné při provádění screeningových testů, protože enzymatická katalýza může být měřena kontinuálně měřením intenzity fluorescence, bez fyzikální separace (extrakce) produktů od substrátu. Příkladem fluorescenčního fosfatidylcholinového substrátu je C₆NBD-BC{l-acyl-2-[6-(nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]kaproylfosfatidylcholin.

Substráty obsahující thio-skupinu zahrnují l,2-bis-(hexanoylthio)-l,2-dideoxy-sn-glycero-3fosforylcholin (L.J. Reynolds, W.N. Washburn, R.A.. Deems, a E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 3-23; L. Yu a E.A. Dennis, 1991, Methods in Enzymology 197: 65 - 75; L.A. Wittenauer, K. Shirai, R.L. Jackson, aJ.D. Johnson, 1984, Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 894-901).

(F) Hydrolýza fosfatidylcholinových esterů

Předkládaný vynález poskytuje způsob enzymatické hydrolýzy fosfatidylcholinových esterů, například pro průmyslové použití nebo pro potravinářské zpracování, nebo pro použití v pracích prostředcích. Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro hydrolýzu fosfatidylcholinových esterů v roztoku, nebo mohou být enzymy navázány na pevný nosič, který je potom uveden do kontaktu se substrátem. Tento způsob může být použit pro výrobu lysofosfolipidů a volných mastných kyselin.

(G) Prostředky

Předkládaný vynález poskytuje prostředky v biologicky kompatibilním (biokompatibilním) roztoku, které obsahují polypeptidy, nukleové kyseliny, vektory a protilátky podle předkládaného vynálezu. Biologicky kompatibilní roztok je roztok, ve kterém je polypeptid, nukleová kyselina, vektor nebo protilátka podle předkládaného vynálezu udržován v aktivní formě, například ve formě zachovávající biologickou aktivitu. Například, polypeptid podle předkládaného vynálezu bude mít fosfolipasovou aktivitu, nukleová kyselina bude schopná replikace, translace informace, nebo bude schopná hybridizace na komplementární nukleovou kyselinu; vektor bude schopen transfekovat cílové buňky; protilátka se bude vázat na polypeptid podle předkládaného vynálezu. Obecně bude takový biologicky kompatibilní roztok vodný roztok pufru, například Tris, fosfátového nebo HEPES pufru, obsahující ionty solí. Obvykle bude koncentrace iontů solí podobná fyziologickým koncentracím. Podle jednoho ze specifických provedení je biokompatibilní roztok farmaceuticky přijatelný přípravek. Biologicky kompatibilní roztoky mohou obsahovat stabilizační a konzervační činidla.

Takové prostředky mohou být připraveny pro lokální, orální, parenterální, intranasální, podkožní a intraokulámí způsob podání. Parenterální podání zahrnuje intravenosní injekci, intramuskulámí

- 17CZ 299055 B6 injekci, intraarteriální injekci nebo infusi. Prostředek může být podán parenterálně v jednotkové dávce obsahující standardní, dobře známé netoxické fyziologicky přijatelné nosiče, adjuvans a vehikula.

Výhodným sterilním prostředkem pro injekční podání může být roztok nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle nebo ředidle. Příklady farmaceuticky přijatelných nosičů jsou fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, izotonický fyziologický roztok (například dihydrogen- nebo hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo horečnatý, nebo směsi takových solí), Ringerův roztok dextrosa, voda, sterilní voda, glycerol, ethanol, a jejich kombinace, jako rozpouštědla nebo suspendační činidla jsou výhodně použity 1,3-butandiol a sterilní netěkavé oleje. Může být použit jakýkoliv nedráždivý netěkavý olej, včetně syntetických mono- nebo di-glyceridů. Mastné kyseliny jako je kyselina olejová se mohou také použít při přípravě injekčních roztoků.

Média použitých pro tento prostředek může být také hydrogel, který se připraví z jakéhokoliv biokompatibilního nebo netoxického (homo- nebo hetero-) polymeru, jako je hydrofilní polymer polyakrylové kyseliny, který může sloužit jako houbovitá substance absorbující léčivo. Takové polymery byly popsány, například, v mezinárodní publikované patentové přihlášce WO 93/08845, jejíž celý obsah je zde uveden jako odkazový materiál. Některé z těchto hydroge20 lů, zejména ty, které jsou získány z ethylenoxidu a/nebo propylenoxidu, jsou běžně komerčně dostupné. Hydrogel může být umístěn přímo na povrchu léčené tkáně, například v průběhu chirurgického zákroku.

Jiným výhodným provedením předkládaného vynálezu je farmaceutický prostředek obsahující replikačně-defektní rekombinantní virus a poloxamer. Přesněji se vynález týká prostředku obsahujícího replikačně-defektní rekombinantní viru obsahující nukleovou kyselinu kódující LLG polypeptid a poloxamer. Výhodným poloxamerem je Poloxamer 407, který je běžně komerčně dostupný (BASF, Parsippany, NJ), přičemž se jedná o netoxický, biokompatibilní polyol. Poloxamer impregnovaný rekombinantními viry může být umístěn přímo na povrchu léčené tkáně, například v průběhu chirurgického zákroku. Poloxamery mají v podstatě stejné výhody jako hydrogely, přičemž mají menší viskozitu.

(H) Způsoby léčby

Předkládaný vynález je využitelný pro léčebné postupy, při kterých se podává účinné množství prostředku podle předkládaného vynálezu lidem nebo jiným živočichům.

Účinné množství se může lišit, podle věku, typu a závažnosti léčeného stavu, tělesné hmotnosti, požadovaného trvání léčby, způsobu podání a jiných parametrů. Účinné množství je určeno léka40 řem nebo jiným kvalifikovaným zdravotníkem.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou obecně podávány v dávce od přibližně 0,01 mg/kg do přibližně 100 mg/kg, výhodně od přibližně 0,1 mg/kg do přibližně 50 mg/kg a nejlépe od přibližně 1 mg/kg do přibližně 10 mg/kg tělesné hmotnosti a den.

Rekombinantní viry podle předkládaného vynálezu jsou obvykle připraveny a podávány ve formě dávek od přibližně 10⁴ pfu do přibližně 10¹⁴ pfu. V případě AAV a adenovirů jsou výhodně použity dávky od přibližně 10⁶ pfu a přibližně 10¹¹ pfu. Termín pfu („plaky tvořící jednotky“) odpovídá infekčnímu potenciálu suspenze virionů a je určen infikováním vhodné buněčné kultury a měřením počtu vytvořených plaků. Techniky pro určení pfu titru virového roztoku jsou v tomto oboru dobře známé.

Předkládaný vynález je použitelný pro léčbu atherosklerosy, kde uvedená atherosklerosa vzniká v důsledku nadměrné, abnormální nebo neadekvátní expres aktivity LLG polypeptidu.

- 18CZ 299055 B6

Předkládaný vynálezu je dále použitelný pro léčbu lidí nebo zvířat majících nežádoucí lipidový profil, kde uvedený nežádoucí lipidový profil vzniká v důsledku abnormálně vysoké nebo neadekvátní exprese aktivity LLG polypeptidů.

Předkládaný vynález je dále použitelný pro léčbu diabetes mellitus, hyperlipidemie, intrahepatální cholestasy nebo jiných metabolických onemocnění, kde uvedený diabetes mellitus, hyperlipidemi, intrahepatální cholestasa nebo jiná metabolická onemocnění vzniká v důsledku abnormálně vysoké nebo neadekvátní exprese aktivity LLG polypeptidů.

(1) Léčba nežádoucích lipidových profilů spojených se zvýšenou expresí LLG polypeptidů

Způsoby snížení exprese LLG polypeptidů pro léčbu stavů, při kterých aktivita LLG polypeptidů způsobuje onemocnění nebo po ruchu spojenou s nežádoucím lipidovým profilem zahrnují, bez jakéhokoliv omezování, podání prostředku obsahujícího antisense nukleovou kyselinu, podání prostředku obsahujícího intracelulámí vazebný protein, jako je protilátka, podání prostředku obsahujícího LLGN polypeptid nebo jiný fragment LLG a podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje LLGN polypeptid nebo jiný fragment LLG.

Podle jednoho z provedení je prostředek obsahující antisense nukleovou kyselinu použit pro snížení nebo blokování exprese LLG. Podle jednoho z výhodných provedení kóduje nukleová kyselina molekuly antisense RNA. V tomto provedení je nukleová kyselina operativně navázaná na signální sekvence umožňující expresi sekvence nukleové kyseliny a je zavedena do buněk, výhodně za použití rekombinantních vektorů, které exprimují antisense nukleovou kyselinu po zavedení vektoru do buňky. Jako příklady vhodných vektorů je možno uvést plasmidy, adeno25 viry, adenoasociované viry, retroviry a herpes viry. Výhodně je vektorem adenovirus. Nejvýhodněji je vektorem replikačně-defektní adenovirus obsahující deleci v El a/nebo E3 regionech viru.

Podle jiného provedení je exprese LLG snížena nebo blokována expresí sekvence nukleové kyseliny kódující intracelulámí vazebný protein, který je schopný selektivní interakce sLLG.

V publikovaných mezinárodních patentových přihláškách WO 94/29446 a WO 94/02610, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy, je popisována transfekce buněk genu, které kódují intracelulámí vazebné proteiny. Mezi intracelulámí vazebné proteiny patří jakýkoliv protein schopný selektivní interakce, nebo vazby, s LLG v buňkách, ve kterých je exprimován a který je schopen neutralizovat funkci navázaného LLG. Výhodně je intracelulámím vazebným proteinem protilát35 ka nebo fragment protilátky. Nej výhodněji je intracelulámím vazebným proteinem jednořetězcová protilátka.

V publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 94/02610 se popisuje příprava protilátek a identifikace nukleové kyseliny kódující určitou protilátku. Za použití LLG nebo jeho fragmentu je specifická monoklonální protilátka připravena technikami, které jsou v tomto oboru známé. Potom se pro použití v postupu podle předkládaného vynálezu připraví vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující intracelulámí vazebný protein, nebo jeho část, který je schopen exprese v hostitelské buňce.

Alternativně může být aktivita LLG blokována podáním neutralizační protilátky do oběhu. Taková neutralizační protilátka může být podána přímo jako protein, nebo může být exprimována z vektoru (se sekrečním signálem).

Podle dalšího provedení může být aktivita LLGXL inhibována podáním prostředku obsahujícího

LLGN polypeptid nebo jiný fragment LLG. Takový prostředek může být podán vhodným způsobem, jako je orální, lokální, intravenosní, intraperitoneální, intramuskulámí, subkutánní, intranasální nebo intradermální způsob podání. Prostředek může být podán přímo, nebo může být enkapsulován (například v lipidovém systému, aminokyselinových mikrosférách, nebo v globulámích dendrimerech). Polypeptid může být, v některých případech, navázán na jiný polymer, jako je sérový albumin nebo polyvinylpyrrolidon.

-19CZ 299055 B6

Podle dalšího provedení může být aktivita LLGXL inhibována pomocí sloučenin o malé molekulové hmotnosti, které interferují sjeho enzymatickými vlastnostmi nebo které brání jeho rozpoznání vhodnými buněčnými vazebnými místy.

Podle dalšího provedení může být aktivita LLGXL inhibována pomocí gelové terapie, to znamená pomocí podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje a řídí expresi LLGN polypeptidů, nebo jiného fragmentu LLG.

Podle jednoho ze specifických provedení má LLG gen podle předkládaného vynálezu také afinitu na heparin. Vazba LLG polypeptidů na extracelulámí heparin v lumenu cév umožňuje vazbu LLG na LDL a akceleraci vychytávání LDL tím, že působí jako můstek mezi LDL a extracelulámím heparinem. Předpokládá se, že v lokalizované oblasti atherosklerotické léze akceleruje zvýšená lipasová aktivita atherogenní proces (Zilversmit, D.B., (1995) Clin. Chem. 41: 153-158;

Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C, Moojani, S., Lupien, P.J., Hayden, M.R. a Brunzell, J.D. (1993) Lancet 341: 1119-1121). Toto může být způsobeno vyšší vazbou a vychytáváním lipoproteinů cévní tkání, které je způsobeno lipasami (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. a Vlodavsky, I. (1992), J. Clin. Invest. 90: 2013-2021; Tabas, I, Li, L, Brocia, R.W., Xu, S.W., Swenson, T.L., Williams, K.J. (1993) J. Biol. Chem. 268: 20 419-20 432; Nordestgaard,

B.G. aNielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5: 252-257; Williams, K.J. a Tabas, I. (1995) Art. Throtnb. and Vasc. Biol. 15: 551-561). Dále, vysoká lokální hladina lipasové aktivity může vést k cytotoxickým koncentracím mastných kyselin a lysofosfatidylcholinu v prekurzorových atherosklerotických lézích. Tato jednotlivá aktivita LLG může způsobovat vývoj nebo progresi atherosklerosy, zejména v souvislosti s vysokými hladinami lipidů u subjektu, které jsou způsobeny dietními nebo genetickými faktory. Tímto způsobem předkládaný vynález umožňuje inhibici akumulace lipoproteinů tím, že inhibuje expresi LLG polypeptidů nebo jeho vazbu na lipoprotein (například na LDL).

(2) Léčba nežádoucích lipidových profilů spojených s nedostatečnou aktivitou LLG polypeptidů

Mezi metody zvýšení exprese LLG pro léčbu těch stavů, při kterých aktivita LLG polypeptidů způsobuje onemocnění nebo poruchu spojenou s nežádoucím lipidovým profilem, patří bez jakéhokoliv omezování, podávání prostředku obsahujícího LLGXL polypeptid a podávání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje LLGXL polypeptid.

Podle jednoho z provedení se aktivita LLGXL zvýší podáním prostředku obsahujícího LLGXL polypeptid. Takový prostředek může být podán libovolným vhodným způsobem, jako je orální, lokální, intravenosní, intraperitoneální, intramuskulámí, subkutánní, intranasální nebo intradermální způsob podání. Prostředek může být podán přímo, nebo může být enkapsulován (například v lipidovém systému, aminokyselinových mikrosférách, nebo v globulámích dendrimerech). Polypeptid může být v některých případech navázán na jiný polymer, jako je sérový albumin nebo polyvinylpyrrolidon.

Podle jiného provedení se aktivita LLGXL zvýší pomocí sloučenin o malé molekulové hmot45 nosti, které zvyšují expresi LLGXL na úroveň transkripce, translace nebo na post-translační úroveň.

Podle jiného provedené se aktivita LLGXL zvýší pomocí genové terapie, to znamená pomocí podání prostředku obsahujícího nukleovou kyselinu, která kóduje a řídí expresi LLGXL poly50 peptidu.

Intrahepatická cholestasa může být charakterizována zvýšenou hladinou sérového cholesterolu a fosfolipidů. Nově popsaný krysí model intrahepatické cholestasy indukované faloidinem demonstruje signifikantní zvýšení sérových hladin cholesterolu a fosfolipidů (Ishizaki, K., Kinba55 ra, S., Miyazawa, N, Takeuchi, Y, Hirabayashi, N, Kasai, H. aAraki, T. (1997) Toxicol. Letters

-20CZ 299055 B6

90: 29-34). Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu intrahepatické cholestasy u pacientů, kteří mají zvýšený sérový cholesterol a/nebo fosfolipidy. Kromě toho, tento model také vykazuje závažné snížení exkreční rychlosti cholesterolu žlučí. LLG polypeptidy a nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro léčbu pacientů s poruchou biliámího vylučovacího systému.

Intrahepatická cholestasa je také charakterizována jako porušený odtok žluči z jater. Nově byla místa progresivní familiární intrahepatické cholestasy (PFIC nebo Bylerova nemoc) a benigní recidivující intrahepatické cholestasy (BRIC) mapovány na 18q21-q22 (Carlton, V.E.H., Knisely, ío A.S., a Freimer, N.B. (1995) Hum. Mol. Genet. 4: 1049 - 1053; resp. Houwen, RH., Baharloo,

S., Blankenship, K., Raeymaekers, P., Juyn, 1, Sandkuijl, L.A. a Freimer, N.B., (1994) Nátuře

Genet. 8: 380-386). Protože je LLG gen lokalizován v tomto chromosomálním regionu v 18q21, může být LLG gen nebo prostředek podle předkládaného vynálezu použit pro léčbu pacientů s intrahepatickou cholestasou, kteráje způsobena mutací nebo defektní expresí PFIC/BRIC genu.

Podle dalšího provedení může být LLG gen nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu použit pro léčbu pacientů s intrahepatickou cholestasou, která není způsobena defektem v PFIC/BRIC genech v 18q21-q22. Nedávné studie naznačily, že jiné místo, lokalizované mimo 18q21— q22 region, může také produkovat PFIC fenotyp (Strautnieks, S.S., Kagalwalla, A.F., Tanner,

M.S., Gardiner, RM. a Thompson, R.J. (1996) J. Med. Genet. 33: 833 - 836). Nicméně, podání

LLG polypeptidu, buď přímé, nebo v genové terapii, může zmírnit tuto formu onemocnění.

V genové terapii je jedna nebo více nukleových kyselin kódujících polypeptid, stejně jako regulačních regionů kontrolujících jejich expresi, přenesena do cílových buněk člověka nebo zvířete.

Tento přenos je proveden buď ex vivo postupem, při kterém jsou nukleové kyseliny přeneseny do buněk v laboratoři a modifikované buňky jsou potom podány lidem nebo jiným živočichům, nebo in vivo postupem, při kterém jsou nukleové kyseliny přeneseny přímo do buněk člověka nebo jiného živočicha. Přenos nukleových kyselin může být proveden za použití virových nebo nevirových vektorů popsaných výše.

Nevirové vektory mohou být přeneseny do buněk za použití metod běžně známých v tomto oboru, včetně koprecipitace fosforečnanem vápenatým, lipofekce (za použití syntetických aniontových nebo kationtových liposomů), receptory zprostředkovaného genového přenosu, injekce pouhé DNA, elektroporace a biobalistiky nebo urychlení částic.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují vynález. Tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklad 1: Identifikace diferenciálně exprivované cDNA

A) Příprava RNA

Lidské monocyty THP-1 (Smith, P.K. Krohn, R.I. Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., a Klenk, D.C. (1985) Anal. Biochem., 150: 76 - 85) se kultivují v RPMI-1640 médium (G1BCO) s 25 mM HEPES, 10% fetál50 ním hovězím sérem, 100 jednotkami/ml penicilinu G, sodné soli a 100 jednotkami/ml streptomycinsulfatu. Buňky se umístí na 15 cm tkáňové kultivační disky v koncentraci 1,0 x 10⁷ buněk/disk a zpracují se 40 ng/ml forbol-12-myristat-13-acetatem (Sigma) po dobu 48 hodin pro indukci diferenciace buněk. Lidské lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) se zakoupí od Calbiochem a dialyzují se do vyčerpání proti PBS při 4 °C. LDL se potom ředí na 500 pg/ml a dialyzují se proti

5 μΜ CuSO₄ v PBS při 37 °C po dobu 16 hodin. Pro ukončení oxidace se LDL důkladně dialyzu-21 CZ 299055 B6 je proti 150 mM NaCl, 0,3 mM EDTA a potom se sterilizují filtrací. Koncentrace proteinu se určí BCA metodou (Schuhm J., Fairclough, G.F., a Haschemeyer, R.H. (1978) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3173 - 3177) (Pierce). Stupeň oxidace se určí TBARS metodou (Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15: 532-537) a je mezi 25 - 30 nmol MDA ekvivalentů/mg proteinu. Dife5 rencované THP-1 buňky se vystaví na 24 hodin buď 50 pg/ml oxidovaného LDL, nebo NaClEDTA pufru vRPMI médiu s 10% lipoprotein-deficientním fetálním hovězím sérem (Sigma). Pro získání RNA se plotny promyjí 10 ml PBS a potom se do každé plotny přidá 14 ml TRIZOL (Liang, P. a Pardee, A.B. (1992)) Science 257: 967 - 971). Roztok se několikrát pipetuje pro smísení, potom se stejné vzorky shromáždí do centrifugačních zkumavek a přidají se 3 ml chlorofor10 mu na plotnu a provede se míšení. Zkumavky se centrifugují při 12 000 x g po dobu 15 minut. Po centrifugací se horní vrstva přenese do nové zkumavky a přidá se 7,5 ml isopropanolu na plotnu a provede se míšení. Zkumavky se centrifugují při 12 000 x g o dobu 20 minut. Peleta se promyje ledově chladným 70% ethanolem a suší se při pokojové teplotě. Pelety se resuspendují v 500 μΐ TE (Tris-EDTA) a zpracují se 200 jednotkami DNAsy I prosté RNAsy a 200 jed15 notkami RNasinového placentámího inhibitoru RNAsy (Promega) po dobu 30 minut při 37 °C. RNA se přečistí postupnými extrakcemi fenolem, fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1) a chloroform/isoamylalkoholem (24:1) a potom se provede srážení ethanolem.

B) Syntéza DNA

Syntéza cDNA a PCR amplifikace se provede podle protokolu uvedeném v Differential Display Kitu, verzi 1.0 (Display Systém Biotechnology, Inc.). Tento systém je založen na technice, kterou původně popsali Liang a Pardee (Mead, D.A., Pey, N.K., Hermstadt, C., Marcil, R.A., a Smith, L.M. (1991) Bio/Technology 9: 657 - 633). Páry primerů, které vedly k zisku fragmentu cDNA obsahujícímu první informaci o lipase podobnému genu byly „downstream“ primer 7 a „upstream“ primer 15. cDNA pro amplifikaci byla syntetizována následujícím způsobem, za použití RNA získané z THP-1 buněk ošetřených PMA vystavených buď pufru, nebo oxidovanému LDL:

μΐ 25 μΜ „downstream“ primeru 7 a 7,5 μΐ vody zpracované diethylpyrouhličitanem (DEPC) se přidá k 300 ng (3,0 μΐ) THP z každého vzorku THP-1 RNA. Tato směs se zahřeje na 70 °C na dobu 10 minut a potom se ochladí na ledu. Do této zkumavky se přidají 3 μΐ 5x PCR pufru (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KC1) (GIBCO), 3 μΐ 25 mM MgCl₂, 3 μΐ 0,1 M DTT, 1,2 μΐ 500 μΜ dNTP, 0,7 μΐ RNasinu a 5,6 μΐ vody zpracované DEPC. Zkumavky se inkubují po dobu 2 minut při pokojové teplotě a potom se přidá 1,5 μΐ (300 jednotek) Superscript I RNAsa H reversní transkriptasy (GIBCO). Zkumavky se inkubují postupně při pokojové teplotě po dobu

2 minut, při 37 °C po dobu 60 minut a při 95 °C po dobu 5 minut a potom se ochladí na ledu.

PCR amplifikace se provede za použití „master“ směsi obsahující 117 μΐ lOx PCR pufru (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂ a 0,01 % (hmotn./obj.) želatiny), 70,2 μΐ 25 mM MgCl₂, 5,9 μΐ α-³³Ρ dATP (10 mCi/ml, DuPont NEN), 4,7 μΐ 500 μΜ směsi dNTP, 11 μΐ Ampli-Taq DNA polymerasy (5 jednotek/μΐ, Perkin-Elmer) a 493,3 μΐ vody zpra40 cované DEPC. Do každé reakční směsi se přidá 12 μΐ master směsi do 2 μΐ „downstream“ primeru 7, 1 μΐ cDNA a 5 μΐ „upstream“ primeru 15. Reakční směsi se zahřejí na 94 °C na dobu 1 minutu, potom se provede 40 teplotních cyklů s denaturačním krokem 94 °C po dobu 15 sekund, krokem tepelného zpracování při 40 °C po dobu 1 minuty a krokem extenze při 72 °C po dobu 30 sekund. Po 40 cyklech se reakční směsi inkubují při 72 °C po dobu 5 minut a usklad45 ní se při 10 °C. PCR reakce se provede na Perkin-Elmer GeneAmp Systém 960 přístroji pro teplotní cykly.

μΐ amplifikační reakční směsi se smísí se stejným objemem zaváděcího pufru (0,2% bromfenolová modř, 0,2% Xylen cyanol, lOmM EDTA, pH 8,0 a 20 glycerol). 4 μΐ této směsi se nechají projít 6% nedenaturačním sekvenačním gelem během 3 hodin při 1200 V (konstantní napětí). Gel se suší při 80 °C po dobu 1,5 hodiny a exponuje se na Kodak XAR filmu. Produkt amplifikace nalezený pouze v reakční směsí obsahující cDNA z THP-1 buněk vystavených oxidovanému LDL se identifikuje a exciduje se z gelu. 100 μΐ vody zpracované DEPC se přidá do

-22CZ 299055 B6 mikrocentrifugové zkumavky obsahující excidovaný gelový fragment a inkubuje se po dobu 30 minut při pokojové teplotě a potom při 95 °C při teplotě 15 °C.

Pro reamplifikaci PCR produktu se 26,5 μΐ eluované DNA použije v amplifikační reakční směsi, která také obsahuje 5 μΐ lOx PCR pufru, 3 μΐ 25 mM MgCl₂, 5 μΐ 500 μΜ dNTP, 5 μΐ 2 μΜ „downstream“ primeru 7, 7,5 μΐ „upstream“ primeru 15 a 0,5 μΐ Amplitaq polymerasy. Parametry cyklů pro PCR a přístroje jsou stejné, jak bylo popsáno výše. Po aplikaci se 20 μΐ reamplifikovaného produktu analyzuje na agarosovém gelu v 4 μΐ se použijí pro subklonování PCR produktů ve vektoru pCRII za použití TA klonovacího systému (Frohman, M.A., Dush, M.K. a Martin,

G.R. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8998 - 9002) (Invitrogen). Po ligaci přes noc při 14 °C se produkty ligace použijí pro transformaci E. coli. Vzniklé transformanty se odeberou a 3 ml kultur kultivovaných přes nos se použijí v plasmidových minipřípravcích. Velikosti insertů se určí pomocí trávení plasmidů EcoRI a klony obsahující inserty přibližně velikosti původního PCR produktu se sekvencují za použití fluorescenčních barviv-terminačních činidel (Prism,

Applied Biosystems) a Applied Biosystems 373 DNA sekvenačního přístroje. Sekvence produktu PCR je uvedena obr. 2. Sekvence amplifikačních primerů jsou podtrženy.

C) 5' RACE reakce

Extenze cDNA identifikované pomocí RT-PCR se provede pomocí 5'RACE systému (Loh, E.Y., Eliot, J.F., Cwirla, S., Lanier, L.L. a Davis, M.M. (1989) Science 243: 217 - 219; Simms, D„ Guan, N„ a Sitaraman, K„ (1991) Focus 13: 99) (GIBCO). 1 pg THP-1 RNA (ošetřené oxidovaným LDL) se použitá nejprve v diferenciálních zobrazovacích reakcích se použije v 5'RACE postupu:

μΐ (1 pg) RNA se smísí s 3 μΐ (3 pmol) primeru 2a a 11 μΐ vody zpracované DEPC a zahřeje se na 70 °C na dobu 10 minut, a potom se chladí po dobu 1 minuty na ledu. Přidá se 2,5 μΐ lOx reakčního pufru (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KC1), 3 μΐ 25 mM MgCl₂, 5 μΐ 500 μΜ směsí dNTP, a 2,5 μΐ 0,1 M DTT. Směs se inkubuje při 42 °C po dobu 2 minut a potom se přidá 1 μΐ Superscript II reversní transkriptasy. Reakční směs se inkubuje po dobu dalších 30 minut při 42 °C. 15 minut při 70 °C a na ledu podobu 1 minuty. Přidá se 1 μΐ RNAsy H (2 jednotky) a směs se inkubuje při 55 °C po dobu 10 minut. cDNA se přečistí za použití GlassMax kolon (Sambrook, J„ Fritsch, E.F., a Maniatis, T. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) obsažených v kitu.

cDNA se eluuje z kolony v 50 μΐ dH₂O, lyofilizuje se a resuspenduje se ve 21 μΐ dH₂O. Připojení koncového úseku cDNA se provede následující reakcí: 7,5 μΐ dH₂O, 2,5 μΐ reakčního pufru (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KC1), 1,5 μΐ 25 mM MgCl₂, 2,5 μΐ 2 mM dCTP a 10 μΐ cDNA se inkubuje při 94 °C po dobu 3 minut, potom 1 minuta na ledu. Přidá se 1 μΐ (10 jednotek) terminální deoxynukleotidyltransferasy a směs se inkubuje po dobu 10 minut při 37 °C.

Enzym se tepelně inaktivuje inkubací při 70 °C po dobu 10 minut a směs se umístí na led. PCR amplifikace cDNA se provede v následujících krocích: 5 μΐ cDNA s koncovým úsekem se přidá do reakční směsi, která také obsahuje 5 μΐ lOx PCR pufru (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl₂ a 0,01 % (hmotn./obj.) želatiny), 1 μΐ 10 mM směsi dNTP, 2 μΐ (10 pmol) kotvícího primeru a 35 μΐ dH₂O. Tato reakční směs se zahřeje na 95 °C na dobu 1 minuty a potom se přidá 0,9 μΐ (4,5 jednotek) Amplitaq polymerasy. Provede se 40 reakčních cyklů za následujících podmínek: 94 °C po dobu 5 sekund, 50 °C po dobu 20 sekund, a 72 °C po dobu 30 sekund. 1 μΐ této reakční směsi se použije v skupinové reamplifikaci pro zvýšení hladin specifických produktů pro následnou izolaci. Reamplifikace obsahuje: 1 μΐ produktu primární amplifikace, 5 μΐ lOx PCR pufru, 1 μΐ 10 mM směsi dNTP, 2 μΐ (20 pmol) universálního amplifikačního primeru, 2 μΐ (20 pmol) primeru 4a a 38 μΐ dH₂O. Reakční směs se zahřeje na 95 °C na dobu 1 minuty a potom se přidá 0,7 μΐ (3,5 jednotek) Amplitaq polymerasy. Provede se 40 reakčních cyklů za následujících podmínek: 94 °C po dobu 5 sekund, 50 °C po dobu 20 sekund, 72 °C po dobu 30 sekund. Produkty amplifikace se analyzují pomocí elektroforesy na 0,8% agarosovém

-23CZ 299055 B6 gelu. Detekuje se převládající produkt velikosti přibližně 1,2 kB. 2 μΐ reakčního produktu se klonují do pCRII vektoru z TA klonovacího kitu (Invitrogen) a provede se inkubace při 14 °C přes noc. Produkty ligace se použijí pro transformaci E. coli. Velikosti insertů výsledných transformantů se určí pomocí trávení plasmidů EcoRI. Klony obsahující inserty přibližné velikosti původního PCR produktu se sekvencují za použití fluorescenčních barviv-terminačních činidel (Prism, Applied Biosystems) a Applied Biosystems 373 DNA sekvenačního přístroje. Sekvence RACE produktu včetně EcoRI míst z TA vektoru jsou uvedeny na obr. 3. Sekvence amplimerů (universální amplifikační primer a komplement k 5'RACE primeru 4a) jsou podtrženy.

Příklad 2: Klonování a chromosomální lokalizace LLGXL genu

A) Vyšetřování cDNA knihovny

Lidská placentámí cDNA knihovny (Oligo dT a náhodně „primed“, katalogové č. 5014b, Lot č. 52033) se získá od Clontech (Palo Alto, CA). Radioaktivně značená sonda se vytvoří excisí insertu plasmidů obsahujícího reakční produkt 5'RACE PCR popsaný výše. Sonda se radioaktivně značí pomocí techniky náhodné vazby: DNA fragment (50 až 100 ng) se inkubuje s 1 gg náhodných hexamerů (Gibco) při 95 °C po dobu 10 minut a potom na ledu po dobu 1 minuty.

Při pokojové teplotě se přidá: 3 gl lOx Klenow pufru (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl₂, 57 mM dithiotreitolu; New England Biolabs), 3 gl 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP), 100 gCi a³²PdCTP (3000 Ci/mmol, New England Nuclear) a 1 gl Klenow fragmentu DNA polymerasy I (5 jednotek, Gibco). Reakční směs se inkubuje po dobu 2 až 3 hodin při pokojové teplotě a reakce se potom ukončí zvýšením objemu na 100 gl pomocí TE, pH, 8,0 a přidáním EDTA do koneč25 né koncentrace 1 mM. Neinkorporované nukleotidy se odstraní zvýšením reakčního objemu na 100 gl a zpracováním na G-50 odstředivé koloně (Boehringer Mannheim). Výsledné sondy mají specifickou aktivitu vyšší než 5 χ 10⁸ cpm/gg DNA.

Knihovna se sonduje pomocí běžných technik (Walter, P., Gilmore, R. a Blobel, G. (1984) Cell

38: 5-8). Stručně, filtry se hybridizují po dobu 24 hodin při 65 °C v 4,8x SSPE (20X SSPE =

3,6 M NaCl, 0,2 M NaH₂PO₄, 0,02 M EDTA, pH 7,7), 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, IX Denhartově roztoku (100X = 2% Ficoll 400, 2% polyvinylpyrrolidon, 2% BSA), 10% dextransíranu, 0,1% SDS, 10 gg/ml lososí spermatické DNA a 1 χ 10⁶ cpm/ml radioaktivně značené sondy. Filtry se potom promyjí 3x po dobu 15 minut při pokojové teplotě v 2X SSC (IX SSC = 150 mM

NaCl, 15 mM citrát sodný, pH 7,0), 0,1% dodecylsíranu sodného (SDS) se potom následují tři promytí pokaždé po dobu 15 minut při 65 °C v 0,5X SSC, 0,01% SDS. Fág, který hybridizuje na sondu, se izoluje a amplifikuje. DNA se přečistí z amplifikovaného fágu za použití LambdaSorb činidla (Promega) podle návodu výrobce. Inserty se excidují zfágové DNA trávením EcoRI. Inserty se subklonují do EcoRI místa plasmidového vektoru (Bluescript II SK, Stratagene).

Sekvence otevřeného čtecího rámce v 2,6 kB EcoRI fragmentu cDNA se určí automatizovaným sekvencováním, jak je popsáno výše. Sekvence je uvedena na obr. 4. Aminokyselinová sekvence předpokládaného proteinu kódovaného otevřeným čtecím rámcem je uvedena na obr. 5 a byla určena LLGXL. Předpokládá se, že první methionin je kódován páry nukleotidů 252 - 254. Předpokládaný protein má délku 500 aminokyselin. Prvních 18 aminokyselin tvoří sekvenci pro sekreční signální peptid (Higgins, D.G. a Sharp, P.M. (1988) Gene 73: 237 - 244). Předpokládá se, že propeptid má molekulovou hmotnost 56 800 Daltonů. Za předpokladu štěpení signálního peptidu v pozici 18 má nemodifikovaný zralý protein molekulovou hmotnost 54724 Daltonů.

Celková podobnost mezi tímto proteinem a dalšími známými členy triacylglycerol-lipasové rodi50 ny je uvedena na obr. 6 a v tabulce 1. V uspořádání uvedeném na obr. 6 je LLG polypeptid (SEQ ID NO: 6) kódovaný cDNA (SEQ ID NO: 5) popsanou v příkladu 1 a je zde označen jako LLGN. Tento protein je identický s LLGXL proteinem v amino-terminálních 345 zbytcích. 9 jedinečných zbytků je následováno terminačním kodonem, za vzniku propolypeptidu o 39,3 kD a zralé-24CZ 299055 B6 ho proteinu o 37,3 kD. Sekvence, které jsou společně LLGN a LLGXL jsou sekvence nukleové kyseliny SEQ ID NO: 9 a aminokyselinová sekvence SEQ ID NO: 10.

Zajímavé je, že pozice, ve které se LLGN a LLGXL proteiny liší, je v regionu, o kterém je známo ze struktury jiných lipas, že je mezi amino- a karboxy-koncovými doménami proteinů. Proto se zdá, že LLGN protein obsahuje pouze jednu ze dvou domén triacylglycerol-lipas. Tato sekvence obsahuje charakteristický „GXSXG“ Upasový motiv a pozici 167 - 171, stejně jako konzervaci zbytků katalytické triady v Ser 169, Asp 193 a His 274. Konzervace cysteinových zbytků (pozice 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463 a 483), které se účastní na disulfidových vazbách ío v jiných lipasách naznačuje, že LLGXL protein má strukturální podobnosti s jinými enzymy. Existuje zde pět předpokládaných míst pro N-glykosylaci: v aminokyselinových pozicích 80, 136, 393, 469 a 491. Proteinové sekvence použité pro srovnání jsou lidská lipoproteinová lipasa (LPL; Genbank přírůstkové č. Ml 5856, SEQ ID NO: 13), lidská jatemí lipasa (HL; Genbank přírůstkové č. J03540, SEQ ID NO: 14), lidská pankreatická lipasa (PL; Genbank přírůstkové

č. M93285, SEQ ID NO: 15), lidský protein 1 příbuzný s pankreatickou lipasou (PLRP-1; Genbank přírůstkové č. M93283) a lidský protein 2 příbuzný s pankreatickou lipasou (PLRP-2; Genbank přírůstkové č. M93284).

Tabulka 1: Podobnost genů rodiny triacylgkycerol-lipas

	LLGXL	LPL	HL	PL	PLRP-1	PLRP-2
LLGXL	-	42,7	36,5	24,5	22,5	22,6
LPL	42,7	-	40,0	22,8	22,7	20,9
HL	36,5	40,0	-	22,8	24,0	22,0
PL	24,5	22,8	22,8	-	65,2	62,2
PLRP-1	22,5	22,7	24,0	65,2	-	61,7
PLRP-2	22,6	20,9	22,0	62,2	61,7	-

Procentuální podobnost se určí na základě párového přirazení za použití Clustal algoritmu (Camps, L., Reina, M., Llobera, M., Vilaro, S., a Olivercrona, T., (1990) Am. J. Physiol. 258: C673 - C681) v Megalign programu Lasergene Biocomputing Software Suitě (Dnastar).

B) Chromosomální lokalizace

DNA zPl klonu (Stemberg, N., Ruether, J. a De Riel, K. New Biologist 2: 151 - 62, 1990) obsahující genomovou LLG DNA se značí digoxigenin-UTP pomocí značkovací translace.

Značená sonda se smísí s nastříhanou lidskou DNA a hybridizuje na PHA stimulované lymfocyty periferní krve od mužského dárce v roztoku obsahujícím 50% formamid, 10% dextransíran a 2X SSC. Specifické hybridizační signály se detekují pomocí inkubace hybridizovaných buněk s fluoresceinovanými protilátkami proti digoxigeninu, po které následuje kontrastní barvení DAPI. Tento první pokus vede ke specifickému označení chromosomu skupiny E, o kterém se součí podle barvení DAPI, že jde o chromosom 18.

Provede se druhý pokus, ve kterém biotinem značená sonda specifická pro centromeru chromosomu 18 hybridizuje současně sLLG sondou. Tento pokus vede ke specifickému červenému značení centromery chromosomu 18 a zelenému značení dlouhého raménka chromosomu 18.

Měření 11 specificky značených hybridizovaných chromosomů 18 ukázalo, že LLG má Flter 0,67 (Frankovo měření 0,38), což odpovídá proužku 18q21. Předpokládá se, že několik genetic-25CZ 299055 B6 kých onemocnění, včetně intrahepatální cholestasy, dystrofie tyčinek sítnice a familiární expansivní osteolýzy, obsahuje defekty v tomto chromosomálním regionu.

Příklad 3: Analýza LLG RNA

A) Exprese LLG RNA v THP-1 buňkách

Analýzy mRNA, ze které byla odvozena cDNA, byla provedena pomocí Northern analýzy ío THP-1 RNA. RNA z těchto buněk byla připravena způsobem popsaným výše. mRNA byla přečištěna z celkové RNA za použití systému poly-dT-magnetických korálků (Polyattract systém,

Promega). 3 pg mRNA obsahující poly(A) se podrobí elektroforese na 1% agarosovém-formaldehydovém gelu. Gel se promývá po dobu 30 minut v dH₂O. RNA se ve vakuu přenese na nylonové membrány za použití alkalického přenosového pufru (3M NaCl, 8 mM NaOH, 2 mM sarkosyl). Po přenosu se skvrny neutralizují inkubací po dobu 5 minut v 200mM fosfátovém pufru, pH 6,8. RNA se naváže na membrány za použití přístroje pro navázání využívajícího ultrafialové záření (Stratagene).

Sonda se vyrobí excisí insertu plasmidu obsahujícího reakční produkt 5'RACE PCR, jak je uvedeno výše. Sonda se radioaktivně značí za použití techniky náhodného značení jakje uvedena v příkladu 2.

Filtry se prehybridizují v QuickHyb roztoku pro rychlou hybridizaci (Stratagene) po dobu 30 minut při 65 °C. Radioaktivně značená sonda (1-2 x 10⁶ cpm/ml) a sonikovaná lososí spermatická

DNA (konečná koncentrace 100 pg/ml) se denaturují zahřátím na 95 °C na dobu 10 minut a rychle se ochladí na ledu před přidáním k filtru v QuickHyb. Hybridizace se provede při 65 °C po dobu 3 hodin. Nehybridizovaná sonda se odstraní promytím filtru dvakrát po dobu 15 minut v 2X SSC, 0,1% dodecylsíranem sodným při pokojové teplotě a potom dvakrát po dobu 15 minut v 0,lX SSC, 0,1% SDS při 62 °C. Po promytí se filtry krátce suší a potom se exponují na Kodak

XAR-2 filmu s intenzifikovaným snímáním při -80 °C. Výsledky jsou uvedeny na obr. 7, který ukazuje hlavní typ mRNA o přibližně 4,5 kB. Minoritní typy o 4,3 kB a 1,6 kB jsou také přítomné. Očekávaná velikost LLGN cDNA je 1,6 kB. LLGXL sekvence je pravděpodobně kódována hlavním detekovaným typem mRNA.

B) Exprese LLG RNA v různých lidských tkáních.

Komerčně připravený filtr obsahující 3 pg každé mRNA z lidských tkání (srdce, mozku, placenty, plic, jater, kosterního svalu, ledvin a slinivky břišní) se získají od Clontech (katalogové č. 7760-1). Tento filtr se sonduje a zpracuje způsobem popsaným výše. Po sondování radioaktivně značeným LLG fragmentem a autoradiografii se sonda odstraní promytím v horkém 0,lX SSC, 0,1% SDS po dobu 2x15 minut v inkubátoru při 65 °C. Membrány se potom sondují 1,4 kB DNA fragmentem kódujícím lidskou lipoproteinovou lipasu. Tento fragment se získá RT-PCR RNA z THP-1 (ošetřených PMA a oxLDL) za použití 5'LPL a 3'LKPL primerů uvedených na obr. 1 a RT-PCR podmínek popsaných výše. Po autoradiografii se membrány znovu očistí a son45 dují se znovu radioaktivně značeným fragmentem cDNA lidského β-aktinu po normalizaci obsahu RNA. Výsledky těchto analýz jsou uvedeny na obr. 8. Nejvyšší hladiny informace pro LLG se detekují v placentámí RNA a nejnižší hladiny se detekují v RNA z plic, jater a ledvin. V souladu s dříve uvedenými studiemi (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H., (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211: 121 - 124) se informace pro liporoteinovou lipasu nachází v mnoha tkáních, s nej vyššími koncentracemi v srdeční tkáni a kosterním svalu. Výsledky této analýzy naznačují, že tkáňová distribuce exprese LLG je velmi odlišná od distribuce LPL. Charakter exprese LLG je také odlišný od charakteru exprese jak jatemí lipasy, tak pankreatické lipasy, jakje popsán v jiných studiích (Wang, C.-S., a Harstuck, J.A. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1166: 1-19; Semenkovich,

-26CZ 299055 B6

C.F., Chen, S.-W., Wims, M., Luo, C.-C., Li, W.-H., a Chán, L., (1989), J. Lipid. Res. 30: 423431; Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fields, C., a Venter, C. (1993) Nátuře Genet. 4: 256- 265).

Pro určení charakteru exprese v dalších lidských tkáních se jiná komerčně dostupná membrána sonduje LLGXL cDNA. Tento „dot blot“ (Human RNA Master Blot, Clontech katalogové č. 7770-1) obsahuje 100 až 500 ng mRNA z 50 různých tkání a je normalizován pro ekvivalentní přirozenou genovou expresi (Chen, L., a Morin, R. (1971) Biochim. Biophys. Acta 231: 194 - 197). 1,6 kB Dral-Srfl fragment LLGXL cDNA se značí ³²PdCTP se použití systému náhodných oligonukleotidů (Prime It II, Stratagene) podle návodu výrobce. Po 30 minutách pre10 hybridizace při 65 °C se sonda přidá do QuickHyb hybridizačního roztoku při 1,3 x 10⁶ cpm/ml. Hybridizace se provede při 65 °C po dobu 2 hodin. Nehybridizovaná sonda se odstraní promytím filtrů dvakrát po dobu 15 minut v 2x SSC, 0,1% dodecylsíranem sodným při pokojové teplotě a potom dvakrát po dobu 15 minut v 0,lX SSC, 0,1% SDS při 62 °C. Po promytí se filtry krátce suší a potom se exponují na Kodak XAR-2 filtru s intersifikovaným snímáním při -80 °C, po různou dobu. Vzniklý záznam se kvantifikuje densitometrií. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2. Relativní hladiny exprese ve tkáních zjištěné v northem analýza více tkání a „dot blot“ analýzy více tkání jsou podobné, s nejvyššími hladinami v placentě a nejnižšími hladinami v plících, játrech a ledvinách. Ve fetálních játrech, ledvinách a plících je exprese zhruba stejná jako ve tkáních od dospělých jedinců. Překvapivě byly hladiny exprese ve tkáních štítné žlázy nejvyšší ze všech testovaných tkání, s expresí rovnou 122% exprese ve placentámí tkáni. Zatímco se předpokládala exprese lipasy v placentě (Rothwell, J.E., Elphick, M.C. (1982), J. Dev. Physiol. 4: 153 - 159; Verhoeven, A.J.M. Carling, D., a Jansen, H. (1994) J. Lipid Res. 35: 966 - 975; Burton, B.K. Mueller, H.W. (1980) Biochim, Biophys. Acta 618: 449 - 460), nebylo doposud známo, že by byla ve štítné žláze exprimována jakákoliv lipasa. Tyto výsledky naznačují, že LLG exprese se může účastnit funkce placenty, kde může LLG sloužit k uvolnění volných mastných kyselin ze substrátů jako jsou fosfolipidy, které jsou potom zdrojem energie. LLG exprivovaný ve štítné žláze může vytvářet prekurzory pro syntézu bioaktivních molekul štítnou žlázou.

-27CZ 299055 B6

Tabulka 2: Exprese LLG mRNA v různých lidských tkáních

Celý mozek	N.D.	Substantia nigra	N.D.
Amygdala	N.D.	Temporální lalok	N.D.
Nucleus caudatus	N.D.	Thalamus	N.D.
Cerebellum	4	Subtalamické jádro	N.D.
Mozková kůra	N.D.	Mícha	N.D.
Frontální lalok	N.D.	Srdce	N.D.
Hippocampus	N.D.	Aorta	N.D.
Medulla oblongata	N.D.	Kosterní sval	N.D.
Okcipitalní lalok	N.D.	Tlusté střevo	S
Putamen	N.D.	Močový měchýř	N.D.
Děloha	N.D.	Varlata	9
Prostata	5	Vaj ečníky	N.D.
Žaludek	N.D.	Slinivka břišní	N.D.
Hypofýza	N.D.	Kostní dřeň	N.D.
Nadledviny	N.D.	Apendix	7
Štítná žláza	122	Plíce	29
Slinné žlázy	N.D.	Průdušnice	12
Mléčná žláza	N.D.	Placenta	100
Ledviny	44	Fetální mozek	5
Játra	61	Fetální srdce	N.D.
Tenké střevo	6	Fetální ledvina	56
Slezina	N.D.	Fetální játra	14
Thymus	N.D.	Fetální slezina	N.D.
Periferní leukocyt	N.D.	Fetální thymus	N.D.
Lymfatická uzlina	N.D.	Fetální plíce	S

Uvedené hodnoty jsou procenta exprese vůči expresi v placentě, která byla stanovena na 100 %. Hodnoty jsou průměry densitometrických měření ze dvou autoradiografických měření.

N.D. = nedetekovatelná hladina.

C) Exprese LLG RNA v kultivovaných endotelových buňkách

Lidské endotelové buňky pupečníkové žíly (HUVEC) a lidské endotelové buňky koronární arterie (HCAEC) se získají od Clonetics. HUVEC se propagují v komerčně získaném kultivačním médiu pro endotelové buňky (EGM, Clonetics) doplněném 3 mg/ml extraktu z hovězího mozku (Maciag, T., Cerunolo, J. Ilsley, S., Kelley, P.R., a Forand, R., (1979) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 5674 - 5678), Clonetics), zatímco HCAEC se propagují v EGM doplněném 3 mg/ml extraktu z hovězího mozku a 3% fetálním hovězím sérem (5% konečná koncentrace). Buňky se kultivují

-28CZ 299055 B6 do konfluence a potom se médiu zamění za EGM bez extraktu z hovězího mozku. Kultury se stimulují přidáním 100 ng/ml forbolmyristatu (Sigma). Po 24 hodinové inkubaci se RNA extrahuje z buněk za použití Trizolové metody popsané výše. 20 pg celkové RNA se podrobí elektroforese a přenese se na membrány pro analýzu. Membrány se sondují LLG a LPL sondami, jak je popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. Na 20 pg celkové RNA z THP-1 buněk stimulovaných PMA se provede analýza na skvrně pro srovnání. RNA hybridizující na LLG sondu se detekuje v nestimulovaných a PMA stimulovaných HUVEC buňkách. Naopak, detekovatelné hladiny LLG mRNA byly v kulturách HCAEC buněk zjištěny pouze po stimulaci PMA. V souladu s předchozími studiemi nebyla v jakýchkoliv RNA endotelových buněk detekována mRNA ío pro lipoproteinovou lipasu (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H., (1994) Biochem. Biophys. Acta

1211: 121-124).

Příklad 4: Analýzy LLG proteinu

A) Příprava protilátky

Připraví se antisérum kpeptidům se sekvencí odpovídající regionu předpokládaného proteinu kódovaného LLG cDNA otevřeným čtecím rámcem. Tento peptid se vybere vzhledem kjeho předpokládanému vysokému indexu antigenicity (Jameson, B.A., a Wolf, H. (1988) Comput. Applic. in the Biosciences 4: 181 - 186). Sekvence imunizačního peptidu nebyla nalezena v žádném proteinu nebo translatované DNA sekvenci v Genbank databázy. Jeho odpovídající pozice v LLG proteinu je uvedena na obr. 10. Karboxy-koncový cystein peptidu neodpovídá zbytku v domnělém LLG proteinu, ale je vložen pro usnadnění navázání na proteinový nosič. Peptid se syntetizuje na Applied Biosystems Model 433A peptidového syntezátoru. 2 mg peptidu se nachází na 2 mg přílipkového hemokyaninu aktivovaného meleimimidem podle postupu popsaného v Imject Activated Immunogen Conjugation Kitu (Pierce Chemical). Po odsolení se jedna polovina konjugátu emulsifikuje se stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Pierce). Tato emulse se podá injekčně králíkům druhu New Zaeland White. 4 týdny po první imunizaci se podá dosycovací dávka emulze vyrobené stejným způsobem s tou výjimkou, že se použije Freundovo nekompletní adjuvans (Pierce). Dva týdny po dosycovací dávce se odebere krev a titry specifických protilátek se určí ELISA za použití imobilizovaného peptidu. Další dosycovací dávka se provede 1 měsíc po první dosycovací dávce.

B) Western analýza média z kultur endotelových buněk

HUVEC a HCAEC buňky se kultivují a stimulují PMA stejným způsobem jak je popsán v příkladu 3c s tou výjimkou, že buňky se stimulují PMA po dobu 48 hodin. Vzorky kondicionovaného média (9 ml) se inkubují s 500 pl 50% kaše heparin-Sepharosa CL-B ve fosfátem pufrova40 ném salinickém roztoku (PBS, 150 mM chlorid sodný, lOOmM fosforečnan sodný, pH 7,2). Heparin-Sepharosa se vybere pro částečné přečištění a koncentrování LLG proteinů vzhledem ke konzervaci zbytků v LLGXL sekvenci, které byly identifikovány jako zásadní pro vazebnou aktivitu LPL pro heparin (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.S. Zhyng, H., Forsyte, I.J., ClarkeLewis, I., Hayden, M.R., a Brunzell, J.D., J. Lipid Res. 35: 2049-2059; a obr. 6). Po rotaci při

4 °C po dobu 1 hodiny se vzorky centrifugují po dobu 5 minut při 150 x g. Médium se aspiruje a Sepharosa se promyje 14 ml PBS. Po centrifugací a aspiraci se peleta hepari-Sepharosy suspenduje v 200 pl 2x SDS zaváděcího pufru (4% SDS, 20% glycerol, 2% β-merkaptoethanol, 0,002% bromfenolová modř a 120 mM Tris, pH 6,8). Vzorky se zahřívají při 95 °C po dobu 5 minut a 40 pl se zavede do 10% Tris-Glycin SDS gelu. Po elektroforese při 140 V po dobu přibližně 90 minut se proteiny přenesou na nitrocelulosové membrány za použití Novex elektroblotovacího přístroje (210 V, 1 hodina). Membrány se blokují po dobu 30 minut v blokovacím pufru (5% odtučněné sušené mléko, 0,1% Tween 20, 150mM chlorid sodný, 25 mM Tris pH 7,2). Antisérum proti peptidu a normální králičí sérum se ředí 1:5000 v blokovacím pufru a inkubují se s membránami přes noc při 4 °C s jemným míšením, membrány se potom promyjí

4 x 15 minut TBTS (0,1% Tween 20, 150 mM chlorid sodný, 25 mM Tris pH 7,2). Kozí antisé-29CZ 299055 B6 rum proti králičím protilátkám konjugované s peroxidasou (Boehringer Mannheim) se ředí 1:5000 v blokovacím pufru a inkubuje se s membránami po dobu 1 hodiny za jemného třepání. Membrány se promyjí způsobem uvedeným výše, reagují s Renaissance chemiluminiscenčním činidlem (DuPont Nen) a exponují se na Kodak XAR-2 filmu. Výsledky jsou uvedeny na obr.

11. Ve vzorcích z nestimulovaných HUVEC a HCAEC buněk jsou přítomny dva druhy imunoreaktivních proteinů. Koncentrace imunoreaktivních proteinů v nestimulovaných HCAEC vzorků jsou o mnoho nižší, než koncentrace v odpovídajících HUVEC vzorcích. Při stimulaci PMA jsou kulturami endotelových buněk secemovány tři imunoreaktivní proteiny. Expozice PMA značně zvyšuje hladiny LLG proteinů produkovaných HCAEC kulturami. Indukce LLG proteinů PMA io v HUVEC kulturách není tak výrazná.

Příklad 5: Rekombinantní produkce LLG proteinu

A) LLG expresní konstrukty cDNA kódující LLGN a LLGXL proteiny se klonují do savčího expresního vektoru pCDNA3 (Invitrogen). Tento vektor umožňuje expresi cizorodých genů v mnoha savčích buňkách za použití cytomegalovirového hlavního pozdního promotoru. LLGN 5'RACE produkt se klonuje do EcoRl místa pCDNA3. LLGXL cDNA se tráví Dral a Srfl za zisku 1,55 kB cDNA (viz obr. 4). Vektor se tráví restrikčním enzymem EcoRV a vektor a insert se ligují za použití T4 DNA ligasy a činidel z Rapid Ligation Kitu (Boehringer Mannheim) podle návodu výrobce. Produkty ligace se použijí pro transformace kompetentních E. coli. Výsledné kolonie se vyšetřují restrikční analýzou a sekvencováním na přítomnost a orientaci insertu v expresním vektoru.

B) Přechodná transfekce LLG v COS-7 buňkách

LLG expresní vektory se vloží do COS-7 buněk za použití Lipofectaminového kationtového lipidového činidla (GIBCO). 24 hodin při transfekci se COS-7 buňky umístí na 60 mm tkáňové kultivační disky v hustotě 2 χ 10⁵ buněk/disk. Buňky se propagují v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM, GIBCO) doplněném 10% fetálním telím sérem, 100 U/ml penicilinu, 100pg/ml streptomycinu. 1 pg plasmidové DNA se přidá do 300 μΐ Optimem I bezsérového média (GIBCO). 10 μΐ Lipofectaminového činidla se ředí 300 μΐ Optimem I média a tato směs se přidá k roztoku DNA a provede se reakce při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Médium se odstraní za ploten a buňky se propláchnou 2 ml Optimem Média. Roztok DNA-Lipofectamin se přidá k plotnám spolu s 2,7 ml Optimem média a plotny se inkubují po dobu 5 hodin při 37 °C. Po inkubaci se bezsérové médium odstraní a nahradí se DMEM doplněným 2% FBS a antibiotiky. 12 hodin po transfekci se některé kultury ošetří buď 0,25 mM Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), inhibitorem proteas, nebo 10 U/ml heparinu. 30 minut před odběrem se vzorky ošetřené heparinem ošetří dalšími 40 U/ml heparinu. Médium se odstraní z buněk 60 hodin po transfekci. Heparin-Sepharosa CL-4B (200 μΐ 50% kaše v PBS, pH 7,2) se přidá k 1 ml média a mísí se při 4 °C po dobu 1 hodiny. Sepharosa se peletuje centrifugací při nízké rychlosti a promyje se třikrát 1 ml chladného PBS. Sepharosa se peletuje a suspenduje ve 100 μΐ 2x zaváděcího pufru. Vzorky se zahřejí na 95 °C na dobu 5 minut. 40 μΐ každého vzorku se zavede na 10%

SDS-PAGE gel. Elektroforesa a western analýza se provedou za použití anti-LG antiséra způsobem popsaným výše. Výsledky jsou uvedeny na obr. 12. Proteiny z HCAEC kondicionovaného média byly použity pro kontrolu velikosti. LLGN migruje při přibližně 40 kD, což odpovídá nejmenšímu proužku v HCAE. Médium z COS-7 buněk transfektovaných LLGXL cDNA obsahuje proužky jak 68 kD, tak 40 kD. Když byly tyto buňky ošetřeny heparinem, tak se výrazně zvýšilo množství jak 68 kD, tak 40 kD proteinů získaných z média, což ukazuje buď na uvolnění proteinu navázaného na proteoglykany z povrchu buněk, nebo na stabilizaci proteinů heparinem. Když byly buňky ošetřeny inhibitorem proteas Pefabloc, tak se množství 68 kD proteinu zvýšilo vůči 40 kD proteinu. Toto naznačuje, že protein s nižší molekulovou hmotností produkovaný těmito buňkami je produkt proteolýzy větší 68 kD formy. Úloha mRNA identifikované v diferen-30CZ 299055 B6 ciálním zobrazení, která kóduje kratší, 40 kD protein, není známá. Existují nicméně práce popisující alternativně sestřiženou formu jatemí lipasy, která je exprivována tkáňově specifickým způsobem a může se tvořit zkrácený protein.

Příklad 6: LLG ve zvířecích druzích

A) Klonování králičího homologů LLG ío Komerčně dostupná lambda cDNA knihovna odvozená z králičí plicní tkáně (Clontech, katalogové č. TLI01 Ob) se použije k izolaci fragmentu králičího homologů LLG genu. 5 μΐ zásobního roztoku knihovny se přidá k 45 μΐ vody a směs se zahřeje na 95 °C na dobu 10 minut. Potom se přidá v konečném objemu 100 μΐ: 200 μΜ dNTP, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 100 μΜ každého primerů DLIP774 a LLGgen2a a 2,5 U Taq polymerásy (GIBCO). Provede se 35 teplotních cyklů s parametry: 15 sekund při 94 °C, 20 sekund při 72 °C. 10 μΐ reakční směsi se analyzuje za použití elektroforesy na agarosovém gelu. Detekuje se produkt o přibližně 300 párech bází. Část (4 μΐ) reakční směsi se použije pro klonování produktu za použití TA klonovacího systému. Insert výsledného klonu se sekvencuje (SEQ ID NO: 11). Seřazení odvozené králičí aminokyselinové sekvence (SEQ ID NO: 12) a odpovídající sekvence lidské cDNA je také uvedeno na obr. 14. V nukleotidech, které nepatří do amplifikačních primerů, je 85,8% identita mezi sekvencí králičího a lidského LLG. Předpokládaný protein kódovaný touto králičí cDNA má 94,6% identitu s lidským proteinem, s tím, že většina nukleotidových substitucí je v třetí nebo „vratké“ pozici kodonů. Významné je, že tento region zahrnuje „víčkovou“ sekvenci předpokládaných LLG proteinů a je variabilní doménou v rodině lipasového genu. Toto je důkaz vysokého stupně konzervace tohoto genu mezi druhy.

B) LLG v jiných druzích

Pro důkaz přítomnosti LLG genu v jiných druzích je genomová DNA z různých druhů restrikčně trávena EcoRI, separována elektroforesou na agarosových gelech a blotována na nitrocelulosové membrány.

Membrány se hybridizují přes noc při 65 °C s 2,5 χ 10⁶ cpm/ml náhodných ³²P-LLG nebo ³²PLPL (lipoproteinová lipasa) sond v hybridizačním roztoku obsahujícím 6X SSC, 10%dextran35 síran, 5X Denhartův roztok, 1% SDS a 5 pg/ml lososí spermatické DNA. Membrány se promyjí 0,lX SSC, 0,5% SDS po dobu 10 minut při pokojové teplotě a potom postupně po dobu 10 minut při 40 °C, 50 °C a 55 °C. Autoradiogramy blotů jsou uvedeny na obr. 16.

Obr. 16 ukazuje přítomnosti LLG a LPL genů u všech vyšetřovaných druhů s tou výjimkou, že žádná hybridizace nebyla pozorována pro LLG sondu proti krysí DNA. Data pro krysí DNA mohou být artefaktem způsobeným tvorbou abnormálně velikých restrikčních fragmentů obsahujících LLG sekvence. Takové fragmenty mohou být mimo frakcionační rozsah agarosového gelu nebo mohou být neúčinně blotovány. Různé proužky detekované dvěma sondami naznačují, že LPL a LLG jsou separované, evolučně konzervované geny.

Příklad 7: Enzymatická aktivita LLGXL

A) Fosfolipasová aktivita

Kondicionovaná média z COS-7 buněk přechodně exprivuj ících lidskou lipoproteinovou lipasu (LPL), LLGN, nebo LLGXL se testují na fosfolipasovou aktivitu. MEM obsahující 10% FBS (MEM) se použije jako prázdný vzorek a kondicionované médium z COS-7 buněk transfektovaných protismyslným LLGXL plasmidem (AS) se použije jako negativní kontrola.

-31 CZ 299055 B6

Fosfatidylcholinová (PC) emulse se vyrábí za použití 10 μΐ fosfatidylcholinu (10 mM), 40 μΐ ¹⁴C-fosfatidylcholin, dipalmitoylu (2 pCi), značeného v sn 1 a sn 2 pozici a 100 μΐ Tris-TCNB (100 mM Tris, 1% Triton, 5 mM CaCl₂, 200 mM NaCl, 0,1% BSA). Emulse se odpaří během

10 minut, potom se upraví na konečný objem 1 ml přidáním Tris-TCNB.

Reakce se provede dvojmo a obsahuje 20 μΐ PC emulse a 950 μΐ média. Vzorky se inkubují v třepací vodní lázni po dobu 2 až 4 hodin při 37 °C. Reakce se ukončí přidáním 1 ml IN HCl, potom se provede extrakce 4 ml 2-propanol: hexanu (1:1). Vrchní 1,8 ml hexanová vrstva se zavede do io silikagelové kolony a uvolněný ¹⁴C-bez mastných kyselin obsažený v protékající frakci se kvantifikuje v scintilačním přístroji. Výsledky testu jsou uvedeny na obr. 14.

B) Triacylglycerol-lipasová aktivita

Kondicionovaná média z COS-7 buněk přechodně exprivujících lidskou lipoproteinovou lipasu (LPL), LLGN, nebo LLGXL se testují na triacylglycerol-lipasovou aktivitu. MEM obsahující

10% FBS (MEM) se použije jako prázdný vzorek a kondicionované médium z COS-7 buněk transfektovaných protismyslným LLGXL plasmidem (AS) se použije jako negativní kontrola.

Koncentrovaný substrát se připraví jako bezvodá emulse značené trioleinu (9,10-³H(N)) a neznačeného trioleinu (konečné množství celkového trioleinu = 150 mg s 6,25 χ 10⁸ cpm), která se stabilizuje přidáním 9 mg lecitinu v 100% glycerolu. 0,56 ³H-trioleinu (0,28 mCi) se smísí s 0,17 ml neznačeného trioleinu a 90 μΐ lecitinu (9 mg). Směs se odpaří proudem dusíku. Sušená lipidová směs se emulsifikuje v 2,5 ml 100% glycerolu sonikací (30 sekundové pulsy, intenzita 2,

2 sekundové cykly, 5 minut).

Substrát pro test se připraví ředěním 1 objemu koncentrovaného substrátu 4 objemy 0,2 M TrisHCl pufru (pH 8,0) obsahujícími 3% hmotn./obj. hovězího sérového albuminu bez mastných kyselin. Ředěný substrát se důkladně míchá po dobu 5 sekund.

Reakce se provedou dvojmo v celkovém objemu 0,2 ml obsahujícím 0,1 ml substrátu pro test a 0,1 ml uvedeného kondicionovaného média. Reakční směsi se inkubují po dobu 90 minut při 37 °C. Reakce se ukončí přidáním 3,25 ml methanol-chloroform-heptanu 1,41:1.25:1 (obj./obj./obj.) a potom 1,05 ml 0,lM uhličitan vápenatý-boritanového pufru (pH 10,5). Po důkladném míšení po dobu 15 sekund se vzorky centrifugují po dobu 5 minut při 1000 rpm. 1,0 alikvota vrchní vodné fáze se odečítá v scintilačním přístroji. Výsledky testu jsou vedeny na obr. 15.

Příklad 8: Použití LLG polypeptidů pro vyšetřování agonistů a antagonistů

Rekombinantní LLG se produkuje v bakulovirem infikovaných hmyzích buňkách. Rekombinantní LLG se přečistí z kondicionovaného média obsahujícího nebo neobsahujícího sérum chromatografií na heparin-Sehparose a potom chromatografii na kationtové iontoměničové pryskyřici. Pokud je to nutné, použije se k přečištění LLG třetí chromatografický krok, jako je zpracování na molekulovém sítu. Během přečištění se protilátky proti peptidů použijí pro monitorování LLG proteinu a fosfolipasový test se použije pro určení aktivity LLG.

Ve fluorescenčním testu jsou konečné podmínky přibližně 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM KC1, 2 mM CaCl₂, 5 μΜ C₆NBD-PC{l-acyl-2-[6-(nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]50 kaproylfosfatidylcholin a LLG protein (přibližně 1 až 100 ng). Reakční směs se podrobí fluorescenční excitaci při 470 nm a průběžně se sleduje aktivita enzymu, jak je měřena emisí fluorescence při 540 nm. Sloučeniny a/nebo substance, které jsou testovány na stimulační a/nebo inhibiční aktivitu pro LLG, se přidají jako 10 až 200mM roztoku v dimethylsulfoxidu. Sloučeniny, které stimulují nebo inhibují aktivitu LLG se identifikují podle toho, zda způsobují zvýšení nebo sníže55 ní emise fluorescence při 540 nm.

-32CZ 299055 B6

Ve thio-testu jsou konečné podmínky přibližně 25 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM KC1, 10 mM CaCl₂, 4,24 mM triton X-100, 0,5 mM l,2-bis(hexanoylthio)-l,2-dideoxy-sn-glycero-3-fosforylcholinu, 5 mM 4,4'-dithiobispyridinu (z 50 mM zásobního roztoku v ethanolu) a 1 až 100 ng rekombinantního LLG. Fosfolipasová aktivita se měří zvýšením absorpce při 342 nm. Sloučeniny a/nebo substance, které jsou testovány na stimulační a/nebo inhibiční aktivitu pro LLG, se přidají jako 10 až 200mM roztoky v dimethylsulfoxidu. Sloučeniny, které stimulují nebo inhibují aktivitu LLG se identifikují podle toho, zda způsobují zvýšení nebo snížení absorpce při 342 nm.

Příklad 9: Transgenní myši exprivující lidský LLG

Pro další výzkum fyziologické úkoly LLG byly vytvořeny transgenní myší exprivující lidský LLG.

1,53 kb Dral/Srfl restrikční fragment kódující LLGXL (viz obr. 4) se klonuje do plasmidového vektoru (pHMG) „downstream“ od promotoru pro ubikvitně exprivovaný gen pro 3-hydroxy-3methylglutaryl koenzym A (HMG CoA) reduktasu. Transgenní myši exprivující různé hladiny lidského LLGXL se generují za použití běžných technik (viz například G.L. Tromp et al., Gene

1565 : 199 - 205, 1995). Transgenní myši se použijí pro určení vlivu nadměrné exprese LLGXL na lipidový profil, vaskulámí patologické stavy, rychlost vývoje a závažnost atherosklerosy a jiné fyziologické parametry.

Příklad 10: Exprese LGL v atherosklerotické tkáni

Exprese LLGXL v atherosklerotické tkáni se vyšetřuje pomocí reversní transkriptasové - polymerasové řetězové reakce (RT-PCR) za použití mRNA izolované z vaskulámích biopsií od čtyř pacientů s atherosklerosou. Vzorky tkáně jsou ze stěny aorty (jeden vzorec), arteria iliaca (dva vzorky) a karotidy (jeden vzorek).

Biopsie z atherosklerotické tkáně se získají od Gluocestershire Royal Hospital, England, a póly A+ mRNA se připraví a resuspenduje se ve vodě zpracované diethylpyrouhličitanem (DEPC) v koncentraci 0,5 pg/ml mRNA. Reakce s reversní transkriptasou se provedou podle GibcoBRL protokolu pro Superscript Preamplification Systém for First Strand cDNA Synthesis. Stručně, cDNA se syntetizuje následujícím způsobem: 2 μΐ každé mRNA se přidají k 1 μΐ oligo(dT)i₂ is primeru a 9 μΐ DEC vody. Zkumavky se inkubují při 70 °C po dobu 10 minut a potom se umístí na led na dobu 1 minuty. Do každé zkumavky se přidají následující složky: 2 μΐ 10X PCR pufru, 2 μΐ 25 mM MgCl₂, 1 μΐ 10 mM směsi dNTP a 2 μΐ 10X PCR pufru, 2 μΐ 25 mM MgCl₂, 1 μΐ

10 mM směsi dNTP a 2 μΐ 0,1 M DTT. Po 5 minutách při 42 °C se přidá 1 μΐ (200 jednotek)

SuperScript II reversní transkriptasy. Reakční směsi se jemně mísí a potom se inkubuje při 42 °C po dobu 50 minut. Reakce se ukončí inkubací při 70 °C po dobu 15 minut a potom umístěním na led. Zbývající mRNA se značí přidáním 1 μΐ RNAsy H do každé zkumavky a inkubací po dobu 20 minut při 37 °C.

PCR amplifikace se provedou za použití 2 μΐ cDNA reakčních směsí. Do každé zkumavky se přidá: 5 μΐ 10X PCR pufru, 5 μΐ 2 mM dNTP, 1 μΐ hllg-gspl primeru (20 pmol/ml, viz bor. 1), 1 μΐ hllg-gsp2a primeru (20 pmol/ml, viz obr. 1), 1,5 μΐ 50 mM MgCl₂, 0,5 μΐ Taq polymerasy (5 U/ml) a 34 μΐ vody. Po 2 hodinách při 95 °C se provede následující 30 cyklů PCR reakce:

15 sekund při 94 °C, 20 sekund při 52 °C a 30 sekund při 72 °C. Výsledná reakční směs se nechá po dobu 10 minut při 72 °C před elektroforetickou analýzou a agarosovém gelu. hllg-gsp primery jsou specifické pro LLG a vedou k zisku očekávaného produktu o 300 bp. V paralelní PCR pro průkaz toho, že reakce syntézy cDNA byly úspěšné, se použijí primery specifické pro provozní gen, G3DPH (lidská glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenasa) (1 μΐ v koncentraci 20 pmol/ml).

-33 CZ 299055 B6

G3PDH primery (viz obr. 1) vedou k zisku očekávaného produktu o 983 bp ve všech bioptických vzorcích z cév. LLG se detekuje ve třech ze čtyřech vzorků, kdy žádná exprese není detekována ve vzorku z arterie carotis.

Všechny uvedené citace jsou zde obsaženy jako odkaz.

Odborníků v oboru bude jasné, že předkládaný vynález je vhodný pro provádění předmětů vynálezu a získání uvedených výsledků a výhod, stejně jako těch, které jsou od nich odvozené. Peptiio dy, polynukleotidy, způsoby, postupy a techniky, které jsou zde uvedené, jsou příklady výhodných provedení a neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Do rozsahu předkládaného vynálezu a připojených patentových nároků spadají jejich varianty a jiná použití, která budou odborníkům v oboru zřejmá.

Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: Jaye, Michael C.

Doan, Kim-Anh T. Krawiec, John A. Lynch, Kevin J. Amin, Dilip V. South, Victoria J.

(ii) Název vynálezu: LLG polypeptidy triacylglycerol-lipasové rodiny a prostředky a způsoby pro jejich použití v enzymatické hydrolýze a proteinové a genové terapii (iii) Počet sekvencí: 31 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: Rhone-Poulenc Rorer lne.

(B) Ulice: 500 Arcola Rd. 3C43 (C) Město: Collegeville (D) Země: PA (E) Stát: USA (F)ZIP: 19426 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Médium: Floppy Disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1.0, verze # 1.30 (vi) Data současné přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: US (B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

-34CZ 299055 B6 (viii) Zástupce/agent - informace:

(A) Jméno: Fehlner Ph. D., Paul F.

(B) Registrační číslo: 35135 (C) Referenční/číslo rejstříku: A2582-WO (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: (610)454-3839 ίο (B) Telefax: (610)454-3808 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 367 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 22... 180 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

GAATTCGGCT TGATCAATCG C TTC Phe	AAA AAG	GGG ATC TGT CTG AGC TGC CGC	51
Lys	Lys	Gly	Ile 5	Cys	Leu	Ser	Cys Arg 10
	1
AAG	AAC CGT TGT AAT AGC ATT	GGC	TAC	AAT	GCC	AAG	AAA	ATG	AGG AAC	99
Lys	Asn Arg Cys Asn Ser Ile	Gly	Tyr	Asn	Ala	Lys	Lys	Met	Arg Asn
	15			20					25
AAG	AGG AAC AGC AAA ATG TAC	CTA	AAA	ACC	CGG	GCA	GGC	ATG	CCT TTC	147
Lys	Arg Asn Ser Lys Met Tyr	Leu	Lys	Thr	Arg	Ala	Gly	Met	Pro Phe
	30		35					40
AGA	GGT AAC CTT CAG TCC CTG	GAG	TGT	CCC	TGA	GGAAGGCCCT TAATACCTCC	200
Arg	Gly Asn Leu Gin Ser Leu	Glu	Cys	Pro	★
	45	50

TTCTTAATAC	CATGCTGCAG	AGCAGGGCAC	ATCCTAGCCC	AGGAGAAGTG	GCCAGCACAA	260
TCCAATCAAA	TCGTTGCAAA	TCAGATTACA	CTGTGCATGT	CCTAGGAAAG	GGAATCTTTA	320
CAAAATAAAC	AGTGTGGACC	CCTCAAAAAA	AAAAAAAAGC	CGAATTC		367

-35CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 53 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Phe 1	Lys	Lys	Gly	Ile 5	Cys	Leu	Ser
Ile	Gly	Tyr	Asn 20	Ala	Lys	Lys	Met
Tyr	Leu	Lys 35	Thr	Arg	Ala	Gly	Met 40
Leu	Glu	Cys	Pro	*

Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser
10	15
Arg Asn Lys Arg Asn	Ser Lys Met
25	30
Pro Phe Arg Gly Asn	Leu Gin Ser
45

(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1328 párů bází 20 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 312...1370

-36CZ 299055 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

GAATTCGGCT TCTACTACTA CTAGGCCACG CGTCGCCTAG TACGGGGGGG GGGGGGGGGG 60

TCAGCGAGTC CTTGCCTCCC GGCGGCTCAG GACGAGGGCA GATCTCGTTC TGGGGCAAGC 120

CGTTGACACT CGCTCCCTGC CACCGCCCGG GCTCCGTGCC GCCAAGTTTT CATTTTCCAC 180

CTTCTCTGCC TCCAGTCCCC CAGCCCCTGG CCGAGAGAAG GGTCTTACCG GCCGGGATTG 240

CTGGAAACAC CAAGAGGTGG TTTTTGTTTT TTAAAACTTC TGTTTCTTGG GAGGGGGTGT 300

GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC 350

Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu

60 65

TGC TAT TGC TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA 398

Cys Tyr Cys Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly

75 80

CGG CTG GAA GAT AAG CTC CAC AAA CCC AAA GCT ACA CAG ACT GAG GTC 446

Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gin Thr Glu Val

90 95

AAA CCA TCT GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC TCC AAG GAC CCA GAG CAT 494

Lys Pro Ser Val Arg Phe Asn. Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His

100 105 110

GAA GGA TGC TAC CTC TCC GTC GGC CAC AGC CAG CCC TTA GAA GAC TGC 542

-37CZ 299055 B6

Glu 115

Gly

Cys

Tyr

Leu

Ser 120

Val

Gly

His

Ser

Gin 125

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys 130

AGT

TTC

AAC

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

590

Ser

Phe

Asn

Met

Thr 135

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe 140

Ile

Ile

His

Gly

Trp 145

Thr

ATG

AGC

GGT

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

638

Met

Ser

Gly

Ile 150

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu 155

His

Lys

Leu

Val

Ser 160

Ala

Leu

CAC

ACA

AGA

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

686

His

Thr

Arg 165

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn 170

Val

Val

Val

Val

Asp 175

Trp

Leu

Pro

CTG

GCC

CAC

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

734

Leu

Ala 180

His

Gin

Leu

Tyr

Thr 185

Asp

Ala

Val

Asn

Asn 190

Thr

Arg

Val

Val

GGA

CAC

AGC

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

782

Gly 195

His

Ser

Ile

Ala

Arg 200

Met

Leu

Asp

Trp

Leu 205

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp 210

TTT

TCT

CTC

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

830

Phe

Ser

Leu

Gly

Asn 215

Val

His

Leu

Ile

Gly 220

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala 225

His

GTG

GCC

GGG

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

878

Val

Ala

Gly Tyr 230

Ala

Gly

Asn

Phe

Val. 235

Lys

Gly

Thr

Val

Gly 240

Arg

Ile

ACA

GGT

TTG

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

926

Thr

Gly

Leu 245

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro 250

Met

Phe

Glu

Gly

Ala 255

Asp

Ile

His

AAG

AGG

CTC

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

974

Lys

Arg 260

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp 265

Ala

Asp

Phe

Val

Asp 270

Val

Leu

His

Thr

TAC

ACG

CGT

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

1022

Tyr 275

Thr

Arg

Ser

Phe

Gly 280

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile 285

Gin

Met

Pro

Val

Gly 290

CAC

ATT

GAC

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

1070

His

Ile

Asp

Ile

Tyr 295

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp 300

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys 305

Gly

CTC

AAC

GAT

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

1118

Leu

Asn

Asp

Val 310

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala 315

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr 320

Glu

Val

GTA

AAA

TGT

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

ttt

GTT

GAC

TCT

CTG

1166

38CZ 299055 B6

Val

Lys

Cys 325

Glu

His

Glu

Arg

Ala 330

Val

His

Leu

Phe

Val 335

Asp

Ser

Leu

GTG

AAT

CAG

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

1214

Val

Asn 340

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser 345

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys 350

Thr

Asp

Ser

Asn

CGC

TTC

AAA

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

1262

Arg 355

Phe

Lys

Lys

Gly

lle 360

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg 365

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn 370

AGC

ATT

GGC

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

1310

Ser

lle

Gly

Tyr

Asn 375

Ala

Lys

Lys

Met

Arg 380

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser 385

Lys

ATG

TAC

CTA

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GGT

AAC

CTT

CAG

1358

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

390 395 400

TCC CTG GAG TGT CAAGCCGAAT TC 1382

Ser Leu Glu Cys

405.

(2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 353 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

39CZ 299055 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

Met 1

Ser

Asn

Ser

Val 5

Pro

Leu

Leu

Cys

Phe 10

Trp

Ser

Leu

Cys

Tyr 15

Phe

Ala

Ala

Gly 20

Ser

Pro

Val

Pro

Phe 25

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg 30

Leu

Asp

Lys

Leu 35

His

Lys

Pro

Lys

Ala 40

Thr

Gin

Thr

Glu

Val 45

Lys

Pro

Val

Arg 50

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr 55

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu 60

His

Glu

Gly

Tyr 65

Leu

Ser

Val

Gly

His 70

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu 75

Asp

Cys

Ser

Phe

Met

Thr

Ala

Lys

Thr 85

Phe

Phe

Ile

Ile

His 90

Gly Trp

Thr

Met

Ser 95

Ile

Phe

Glu

Asn 100

Trp

Leu

His

Lys

Leu 105

Val

Ser

Ala

Leu

His 110

Thr

Glu

Lys

Asp 115

Ala

Asn

Val

Val

Val 120

Val

Asp

Trp

Leu

Pro 125

Leu

Ala

Gin

Leu 130

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val 135

Asn

Asn

Thr

Arg

Val 140

Val

Gly

His

Ile 145

Ala

Arg

Met

Leu

Asp 150

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys 155

Asp

Asp

Phe

Ser

Gly

Asn

Val

His

Leu 165

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu 170

Gly

Ala

His

Val

Ala 175

Tyr

Ala

Gly

Asn 180

Phe

Val

Lys

Gly

Thr 185

Val

Gly

Arg

Ile

Thr 190

Gly

Asp

Pro

Ala 195

Gly

Pro

Met

Phe

Glu 200

Gly

Ala

Asp

Ile

His 205

Lys

Arg

Ser

Pro 210

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe 215

Val

Asp

Val

Leu

His 220

Thr

Tyr

Thr

Ser 225

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile 230

Gly

Ile

Gin

Met

Pro 235

Val

Gly

His

Ile

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn

245 250 255

Cys

Glu

Ser

Cys

Asn

Gly

Arg

His

Ser

Leu

160

Gly

Leu

Leu

Arg

Asp

240

Asp

-40CZ 299055 B6

Val

Leu

Gly

Ser 260

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr 265

Ile

Thr

Glu

Val

Val 270

Lys

Cys

Glu

His

Glu 275

Arg

Ala

Val

His

Leu 280

Phe

Val

Asp

Ser

Leu 285

Val

Asn

Gin

Asp

Lys 290

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe 295

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser 300

Asn

Arg

Phe

Lys

Lys 305

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser 310

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg 315

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly 320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys 325

Met

Arg

Asn

Lys

Arg 330

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr 335

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

340 345 350

Cys (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1065 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina ío (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1... 1065 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

ATG AGC AAC TCC

GTT Val

CCT Pro

CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC TGC TAT TGC

48

Mat

Ser Asn 355

Ser

Leu Leu 360

Cys

Phe

Trp Ser Leu 365

cys

Tyr Cys

TTT

GCT

GCG

GGG

AGC

CCC

GTA

CCT

TTT

GGT

CCA

GAG

GGA

CGG

CTG

GAA

96

Phe

Ala

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Pro

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

370

375

360

385

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

AAA

CCA

TCT

144

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

Lys

Pro

Ser

390 395 400

-41 CZ 299055 B6

GTG AGG TTT AAC CTC CGC ACC

TCC Ser

AAG GAC CCA GAG CAT

GAA GGA TGC

192

Val Arg Phe Asn

Leu Arg

Thr

Lys Asp 410

Pro Glu

His

Glu 415

Gly Cys

405

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

AGT

TTC

AAC

240

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly

His

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu

Asp

Cys

Ser

Phe

Asn

420

425

430

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

ATG

AGC

GGT

288

Met

Thr

Ala

Lys

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile

His

Gly

Trp

Thr

Met

Ser

Gly

435

440

445

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

CAC

ACA

AGA

336

Ile

Phe

Glu

Asn

Trp

Leu

His

Lys

Leu

Val

Ser

Ala

Leu

His

Thr

Arg

450

455

460

465

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

CTG

GCC

CAC

384

Glu

Lys

Asp

Ala

Asn

Val

Val

Val

Val

Asp

Trp

Leu

Pro

Leu

Ala

His

470

475

480

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

GGA

CAC

AGC

432

Gin

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val

Asn

Asn

Thr

Arg

Val

Val

Gly

His

Ser

485

490

495

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

TTT

TCT

CTC

480

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu

500

505

510

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

GTG

GCC

GGG

528

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Val

Ala

Gly

515

520

525

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

ACA

GGT

TTG

576

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

530

535

540

545

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

AAG

AGG

CTC

624

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

Lys

Arg

Leu

550

555

560

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

TAC

ACG

CGT

672

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

565

570

575

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

CAC

ATT

GAC

720

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

His

Ile

Asp

580

585

590

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

CTC

AAC

GAT

768

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

cys

Gly

Leu

Asn

Asp

595

600

605

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA

ATC

ACA

GAG

GTG

GTA

AAA

TGT

816

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Val

Lys

Cys

610

615

620

625

-42CZ 299055 B6

864

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

GTG

AAT

CAG

Glu

His

Glu

Arg

Ala 630

Val

His

Leu

Phe

Val 635

Asp

Ser

Leu

Val

Asn 640

Gin

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

CGC

TTC

AAA

Asp

Lys

Pro

Ser 645

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys 650

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg 655

Phe

Lys

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

AGC

ATT

GGC

Lys

Gly

Ile 660

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg 665

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn 670

Ser

Ile

Gly

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

ATG

TAC

CTA

Tyr

Asn 675

Ala

Lys

Lys

Met

Arg 680

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser 685

Lys

Met

Tyr

Leu

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GGT

AAC

CTT

CAG

TCC

CTG

GAG

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg Gly

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

912

960

1008

1056

690	695	700	705
TGT CCC TGA
Cys Pro *

1065 (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 355 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu Cys Tyr Cys 15 10 15

Phe Ala Ala Gly Ser Pro Val Pro Phe Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu 20 25 30

Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr Gin Thr Glu Val Lys Pro Ser 35 40 45

Val Arg Phe Asn Leu Arg Thr Ser Lys Asp Pro Glu His Glu Gly Cys 50 55 60

Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gin Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn

70 75 80

Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly

90 95

Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg 100 105 HO

Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His 115 120 125

Gin Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser 130 135 140

Ile Ala Arg Met Leu Asp Trp Leu Gin Glu Lys Asp Asp Phe Ser Leu

145 150 155 160

Gly Asn Val His Leu Ile Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Val Ala Gly

165 170 175

Tyr Ala Gly Asn Phe Val Lys Gly Thr Val Gly Arg Ile Thr Gly Leu

180 185 190

Asp Pro Ala Gly Pro Met Phe Glu Gly Ala Asp Ile His Lys Arg Leu 195 200 205

Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Tyr Thr Arg 210 215 220

Ser Phe Gly Leu Ser Ile Gly Ile Gin Met Pro Val Gly His Ile Asp

225 230 235 240

Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Asp Phe Gin Pro Gly Cys Gly Leu Asn Asp

245 250 255

Val Leu Gly Ser Ile Ala Tyr Gly Thr Ile Thr Glu Val Val Lys Cys 260 265 270

Glu His Glu Arg Ala Val His Leu Phe Val Asp Ser Leu Val Asn Gin 275 280 285

Asp Lys Pro Ser Phe Ala Phe Gin Cys Thr Asp Ser Asn Arg Phe Lys 290 295 300

-44CZ 299055 B6

Lys Gly Ile Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Ser Ile Gly

305

310

315

320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys 325

Met

Arg

Asn

Lys

Arg 330

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr 335

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Gly

Asn

Leu

Gin

Ser

Leu

Glu

340 345 350

Cys Pro * 355 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 2565 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý io (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 252...1754 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

GAATTCGCGG CCGCGTCGAC GGCGGCTCAG GACGAGGGCA GATCTCGTTC TGGGGCAAGC	60
CGTTGACACT CGCTCCCTGC CACCGCCCGG GCTCCGTGCC GCCAAGTTTT CATTTTCCAC	120
CTTCTCTGCC TCCAGTCCCC CAGCCCCTGG CCGAGAGAAG GGTCTTACCG GCCGGGATTG	180
CTGGAAACAC CAAGAGGTGG TTTTTGTTTT TTAAAACTTC TGTTTCTTGG GAGGGGGTGT	240
GGCGGGGCAG G ATG AGC AAC TCC GTT CCT CTG CTC TGT TTC TGG AGC CTC Met Ser Asn Ser Val Pro Leu Leu Cys Phe Trp Ser Leu 360 365	290

TGC TAT TGC TTT GCT GCG GGG AGC CCC GTA CCT TTT GGT CCA GAG GGA

338

Cys

Tyr Cys 370

Phe Ala Ala Gly 375

Ser

Pro

Val

Pro Phe Gly 380

Pro

Glu

Gly

CGG

CTG

GAA

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

386

Arg

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val

385

390

395

400

AAA

CCA

TCT

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

434

Lys

Pro

Ser

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

HiS

405

410

415

-45CZ 299055 B6

482

GAA

GGA

TGC

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC TTA

GAA

GAC

TGC

Glu

Gly

Cys

Tyr 420

Leu

Ser

Val

Gly

His 425

Ser

Gin

Pro Leu

Glu 430

Asp

Cys

AGT

TTC

AAC

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT CAC

GGA

TGG

ACG

Ser

Phe

Asn 435

Met

Thr

Ala

Lys

Thr 440

Phe

Phe

Ile

Ile His 445

Gly

Trp

Thr

ATG

AGC

GGT

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC GTG

TCA

GCC

CTG

Met

Ser 450

Gly

Ile

Phe

Glu

Asn 455

Trp

Leu

His

Lys

Leu Val 460

Ser

Ala

Leu

CAC

ACA

AGA

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT GAC

TGG

CTC

CCC

His 465

Thr

Arg

Glu

Lys

Asp 470

Ala

Asn

Val

Val

Val 475

Val Asp

Trp

Leu

Pro 480

CTG

GCC

CAC

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT ACC

AGG

GTG

GTG

Leu

Ala

His

Gin

Leu 485

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val 490

Asn

Asn Thr

Arg

Val 495

Val

GGA

CAC

AGC

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG GAG

AAG

GAC

GAT

Gly

His

Ser

Ile 500

Ala

Arg

Met

Leu

Asp 505

Trp

Leu

Gin Glu

Lys 510

Asp

Asp

TTT

TCT

CTC

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC CTC

GGA

GCG

CAC

Phe

Ser

Leu 515

Gly

Asn

Val

His

Leu 520

Ile

Gly

Tyr

Ser Leu 525

Gly

Ala

His

GTG

GCC

GGG

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG GTG

GGC

CGA

ATC

Val

Ala 530

Gly

Tyr

Ala

Gly

Asn 535

Phe

Val

Lys

Gly

Thr Val 540

Gly

Arg

Ile

ACA

GGT

TTG

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG GCC

GAC

ATC

CAC

Thr 545

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala 550

Gly

Pro

Met

Phe

Glu 555

Gly Ala

Asp

Ile

His 560

AAG

AGG

CTC

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT GTC

CTC

CAC

ACC

Lys

Arg

Leu

Ser

Pro 565

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe 570

Val

Asp Val

Leu

His 575

Thr

TAC

ACG

CGT

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG ATG

CCT

GTG

GGC

Tyr

Thr

Arg

Ser 580

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile 585

Gly

Ile

Gin Met

Pro 590

Val

Gly

CAC

ATT

GAC

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG CCA

GGC

TGT

GGA

His

Ile

Asp 595

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly 600

Gly

Asp

Phe

Gin Pro 605

Gly

Cys

Gly

CTC

AAC

GAT

GTC

TTG

GGA

TCA

ATT

GCA

TAT

GGA

ACA ATC

ACA

GAG

GTG

Leu

Asn 610

Asp

Val

Leu

Gly

Ser 615

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr Ile 620

Thr

Glu

Val

GTA

AAA

TGT

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT GTT

GAC

TCT

CTG

Val 625

Lys

Cys

Glu

His

Glu 630

Arg

Ala

Val

His

Leu 635

Phe Val

Asp

Ser

Leu 640

GTG

AAT

CAG

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC ACT

GAC

TCC

AAT

Val

Asn

Gin

Asp

Lys 645

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe 650

Gin

Cys Thr

Asp

Ser 655

Asn

530

578

626

674

722

770

818

866

914

962

1010

1058

1106

1154

-46CZ 299055 B6

CGC Arg

TTC AAA AAG

GGG Gly

ATC TGT CTG Ile Cys Leu

AGC TGC CGC AAG AAC CGT TGT AAT

1202

Phe Lys

Lys 660

Ser 665

Cys

Arg

Lys Asn

Arg Cys Asn 670

AGC

ATT

GGC

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

1250

Ser

ile

Gly

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

675

680

685

ATG

TAC

CTA

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

GTT

TAC

CAT

TAT

1298

Met

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

Val

Tyr

His

Tyr

690

695

700

CAG

ATG

AAA

ATC

CAT

GTC

TTC

AGT

TAC

AAG

AAC

ATG

GGA

GAA

ATT

GAG

1346

Gin

Met

Lys

Ile

His

Val

Phe

Ser

Tyr

Lys

Asn

Met

Gly

Glu

Ile

Glu

705

710

715

720

CCC

ACC

TTT

TAC

GTC

ACC

CTT

TAT

GGC

ACT

AAT

GCA

GAT

TCC

CAG

ACT

1394

Pro

Thr

Phe

Tyr

Val

Thr

Leu

Tyr

Gly

Thr

Asn

Ala

Asp

Ser

Gin

Thr

725

730

735

CTG CCA

CTG GAA ATA GTG GAG

CGG ATC GAG CAG AAT GCC ACC AAC ACC

1442

Leu

Pro

Leu

Glu 740

Ile

Val

Glu

Arg Ile 745

Glu

Gin

Asn

Ala

Thr Asn Thr 750

TTC

CTG

GTC

TAC

ACC

GAG

GAG

GAC TTG

GGA

GAC

CTC

TTG

AAG ATC CAG

1490

Phe

Leu

Val 755

Tyr

Thr

Glu

Glu

Asp Leu 760

Gly Asp

Leu

Leu 765

Lys Ile Gin

CTC

ACC

TGG

GAG

GGG

GCC

TCT

CAG TCT

TGG

TAC

AAC

CTG

TGG AAG GAG

1538

Leu

Thr 770

Trp

Glu

Gly

Ala

Ser 775

Gin Ser

Trp

Tyr

Asn 780

Leu

Trp Lys Glu

TTT

CGC

AGC

TAC

CTG

TCT

CAA

CCC CGC

AAC

CCC

GGA

CGG

GAG CTG AAT

1586

Phe 785

Arg

Ser

Tyr

Leu

Ser 790

Gin

Pro Arg

Asn

Pro 795

Gly

Arg

Glu Leu Asn 800

ATC

AGG

CGC

ATC

CGG

GTG

AAG

TCT GGG

GAA

ACC

CAG

CGG

AAA CTG ACA

1634

Ile

Arg

Arg

Ile

Arg 805

Val

Lys

Ser Gly

Glu 810

Thr

Gin

Arg

Lys Leu Thr 815

TTT

TGT

ACA

GAA

GAC

CCT

GAG

AAC ACC

AGC

ATA

TCC

CCA

GGC CGG GAG

1682

Phe

Cys

Thr Glu 820

Asp

Pro

Glu

Asn Thr 825

Ser

Ile

Ser

Pro

Gly Arg Glu 830

CTC

TGG

TTT

CGC

AAG

TGT

CGG

GAT GGC

TGG

AGG

ATG

AAA

AAC GAA ACC

1730

Leu

Trp

Phe 835

Arg

Lys

Cys

Arg

Asp Gly 840

Trp

Arg

Met

Lys 845

Asn Glu Thr

AGT Ser

CCC Pro 850

ACT Thr

GTG Val

GAG Glu

CTT Leu

CCC Pro 855

TGA GGGTGCCCGG GCAAGTCTTG CCAGCAAGGC ★

1784

-47CZ 299055 B6

AGCAAGACTT CCTGCTATCC AAGCCCATGG AGGAAAGTTA CTGCTGAGGA CCCACCCAAT 1844

GGAAGGATTC TTCTCAGCCT TGACCCTGGA GCACTGGGAA CAACTGGTCT CCTGTGATGG 1904

CTGGGACTCC TCGCGGGAGG GGACTGCGCT GCTATAGCTC TTGCTGCCTC TCTTGAATAG 1964

CTCTAACTCC AAACCTCTGT CCACACCTCC AGAGCACCAA GTCCAGATTT GTGTGTAAGC 2024

AGCTGGGTGC CTGGGGCCTC TCGTGCACAC TGGATTGGTT TCTCAGTTGC TGGGCGAGCC 2084

TGTACTCTGC CTGACGAGGA ACGCTGGCTC CGAAGAGGCC CTGTGTAGAA GGCTGTCAGC 2144

TGCTCAGCCT GCTTTGAGCC TCAGTGAGAA GTCCTTCCGA CAGGAGCTGA CTCATGTCAG 2204

GATGGCAGGC CTGGTATCTT GCTCGGGCCC TGGCTGTTGG GGTTCTCATG GGTTGCACTG 2264

ACCATACTGC TTACGTCTTA GCCATTCCGT CCTGCTCCCC AGCTCACTCT CTGAAGCACA 2324

CATCATTGGC TTTCCTATTT TTCTGTTCAT TTTTTAATTG AGCAAATGTC TATTGAACAC 2384

TTAAAATTAA TTAGAATGTG GTAATGGACA TATTACTGAG CCTCTCCATT TGGAACCCAG 2444

TGGAGTTGGG ATTTCTAGAC CCTCTTTCTG TTTGGATGGT GTATGTGTAT ATGCATGGGG 2504

AAAGGCACCT GGGGCCTGGG GGAGGCTATA GGATATAAGC AGTCGACGCG GCCGCGAATT 2564

C 2565 (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 501 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

Met 1

Ser Asn

Ser Val 5

Pro Leu Leu

Cys

Phe 10

Trp Ser Leu Cys Tyr 15

Cys

Phe

Ala

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Pro

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly Arg

Leu

Glu

20

25

30

Asp

Lys

Leu

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu

Val Lys

Pro

Ser

40 45

-48CZ 299055 B6

Val

Arg 50

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr 55

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu 60

His

Glu

Gly

Cys

Tyr 65

Leu

Ser

Val

Gly

His 70

Ser

Gin

Pro

Leu

Glu 75

Asp

Cys

Ser

Phe

Asn 80

Met

Thr

Ala

Lys

Thr 85

Phe

Phe

Ile

Ile

His 90

Gly

Trp

Thr

Met

Ser 95

Gly

Ile

Phe

Glu

Asn 100

Trp

Leu

His

Lys

Leu 105

Val

Ser

Ala

Leu

His 110

Thr

Arg

Glu

Lys

Asp 115

Ala

Asn

Val

Val

Val 120

Val

ASp

Trp

Leu

Pro 125

Leu

Ala

His

Gin

Leu 130

Tyr

Thr

Asp

Ala

Val 135

Asn

Asn

Thr

Arg

Val 140

Val

Gly

His

Ser

Ile 145

Ala

Arg

Met

Leu

Asp 150

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys 155

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu 160

Gly

Asn

Val

His

Leu 165

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu 170

Gly

Ala

His

Val

Ala 175

Gly

Tyr

Ala

Gly

Asn 180

Phe

Val

Lys

Gly

Thr 185

Val

Gly Arg

Ile

Thr 190

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala 195

Gly

Pro

Met

Phe

Glu 200

Gly

Ala

Asp

Ile

His 205

Lys

Arg

Leu

Ser

Pro 210

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe 215

Val

Asp

Val

Leu

His 220

Thr

Tyr

Thr

Arg

Ser 225

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile 230

Gly

ile

Gin

Met

Pro 235

Val

Gly

His

Ile

Asp 240

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly 245

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro 250

Gly

Cys

Gly

Leu

Asn 255

Asp

Val

Leu

Gly

Ser 260

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr 265

Ile

Thr

Glu

Val

Val 270

Lys

Cys

Glu

His

Glu 275

Arg

Ala

Val

His

Leu 280

Phe

Val

Asp

Ser

Leu 285

Val

Asn

Gin

Asp

Lys 290

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe 295

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser 300

Asn

Arg

Phe

Lys

Lys 305

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser 310

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg 315

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly 320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys 325

Met

Arg

Asn

Lys

Arg 330

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr 335

Leu

Lys

Thr

Arg

Ala 340

Gly

Met

Pro

Phe

Arg 345

Val

Tyr

His

Tyr

Gin 350

Met

Lys

-49CZ 299055 B6

Ile

His

Val 355

Phe

Ser

Tyr

Lys

Asn 360

Met

Gly

Glu

Ile

Glu 365

Pro

Thr

Phe

Tyr

Val 370

Thr

Leu

Tyr

Gly

Thr 375

Asn

Ala

Asp

Ser

Gin 380

Thr

Leu

Pro

Leu

Glu 385

Ile

Val

Glu

Arg

Ile 390

Glu

Gin

Asn

Ala

Thr 395

Asn

Thr

Phe

Leu

Val 400

Tyr

Thr

Glu

Glu

Asp 405

Leu

Gly

Asp

Leu

Leu 410

Lys

Ile

Gin

Leu

Thr 415

Trp

Glu

cly

Ala

Ser 420

Gin

Ser

Trp

Tyr

Asn 425

Leu

Trp

Lys

Glu

Phe 430

Arg

Ser

Tyr

Leu

Ser 435

Gin

Pro

Arg

Asn

Pro 440

Gly

Arg

Glu

Leu

Asn 445

Ile

Arg

Arg

Ile

Arg 450

Val

Lys

Ser

Gly

Glu 455

Thr

Gin

Arg

Lys

Leu 460

Thr

Phe

Cys

Thr

Glu 465

Asp

Pro

Glu

Asn

Thr 470

Ser

Ile

Ser

Pro

Gly 475

Arg

Glu

Leu

Trp

Phe 480

Arg

Lys

Cys

Arg

Asp 485

Gly

Trp

Arg

Met

Lys 490

Asn

Glu

Thr

Ser

Pro 495

Thr

Val Glu Leu Pro *

500 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1035 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 1...1035

-50CZ 299055 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

ATG

AGC

AAC

TCC

GTT

CCT

CTG

CTC

TGT

TTC

TGG

AGC

CTC

TGC

TAT

TGC

48

Met

Ser

Asn

Ser 505

Val

Pro

Leu

Leu

Cys 510

Phe

Trp

Ser

Leu

cys 515

Tyr

Cys

TTT

GCT

GCG

GGG

AGC

CCC

GTA

CCT

TTT

GGT

CCA

GAG

GGA

CGG

CTG

GAA

96

Phe

Ala

Ala 520

Gly

Ser

Pro

Val

Pro 525

Phe

Gly

Pro

Glu

Gly 530

Arg

Leu

Glu

GAT

AAG

CTC

CAC

AAA

CCC

AAA

GCT

ACA

CAG

ACT

GAG

GTC

AAA

CCA

TCT

144

Asp

Lys 535

Leu

His

Lys

Pro

Lys 540

Ala

Thr

Gin

Thr

Glu 545

Val

Lys

Pro

Ser

GTG

AGG

TTT

AAC

CTC

CGC

ACC

TCC

AAG

GAC

CCA

GAG

CAT

GAA

GGA

TGC

192

Val 550

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg 555

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro 560

Glu

His

Glu

Gly

Cys 565

TAC

CTC

TCC

GTC

GGC

CAC

AGC

CAG

CCC

TTA

GAA

GAC

TGC

AGT

TTC

AAC

240

Tyr

Leu

Ser

Val

Gly 570

His

Ser

Gin

Pro

Leu 575

Glu

Asp

Cys

Ser

Phe 580

Asn

ATG

ACA

GCT

AAA

ACC

TTT

TTC

ATC

ATT

CAC

GGA

TGG

ACG

ATG

AGC

GGT

288

Met

Thr

Ala

Lys 585

Thr

Phe

Phe

Ile

Ile 590

His

Gly

Trp

Thr

Met 595

Ser

Gly

ATC

TTT

GAA

AAC

TGG

CTG

CAC

AAA

CTC

GTG

TCA

GCC

CTG

CAC

ACA

AGA

336

Ile

Phe

Glu 600

Asn

Trp

Leu

His

Lys 605

Leu

Val

Ser

Ala

Leu 610

His

Thr

Arg

GAG

AAA

GAC

GCC

AAT

GTA

GTT

GTG

GTT

GAC

TGG

CTC

CCC

CTG

GCC

CAC

384

Glu

Lys 615

Asp

Ala

Asn

Val

Val 620

Val

Val

Asp

Trp

Leu 625

Pro

Leu

Ala

His

CAG

CTT

TAC

ACG

GAT

GCG

GTC

AAT

AAT

ACC

AGG

GTG

GTG

GGA

CAC

AGC

432

Gin 630

Leu

Tyr

Thr

Asp

Ala 635

Val

Asn

Asn

Thr

Arg 640

Val

Val

Gly

His

Ser 645

ATT

GCC

AGG

ATG

CTC

GAC

TGG

CTG

CAG

GAG

AAG

GAC

GAT

TTT

TCT

CTC

480

I-le

Ala

Arg

Met

Leu 650

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu 655

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser 660

Leu

GGG

AAT

GTC

CAC

TTG

ATC

GGC

TAC

AGC

CTC

GGA

GCG

CAC

GTG

GCC

GGG

528

Gly

Asn

Val

His 665

Leu

Ile

Gly Tyr

Ser 670

Leu

Gly

Ala

His

Val 675

Ala

Gly

TAT

GCA

GGC

AAC

TTC

GTG

AAA

GGA

ACG

GTG

GGC

CGA

ATC

ACA

GGT

TTG

576

Tyr

Ala

Gly 680

Asn

Phe

Val

Lys

Gly 685

Thr

Val

Gly

Arg

Ile 690

Thr

Gly

Leu

GAT

CCT

GCC

GGG

CCC

ATG

TTT

GAA

GGG

GCC

GAC

ATC

CAC

AAG

AGG

CTC

624

Asp

Pro 695

Ala

Gly

Pro

Met

Phe 700

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile 705

His

Lys

Arg

Leu

TCT

CCG

GAC

GAT

GCA

GAT

TTT

GTG

GAT

GTC

CTC

CAC

ACC

TAC

ACG

CGT

672

Ser 710

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp 715

Phe

Val

Asp

Val

Leu 720

His

Thr

Tyr

Thr

Arg 725

TCC

TTC

GGC

TTG

AGC

ATT

GGT

ATT

CAG

ATG

CCT

GTG

GGC

CAC

ATT

GAC

720

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser 730

Ile

Gly

Ile

Gin

Met 735

Pro

Val

Gly

His

Ile 740

Asp

ATC

TAC

CCC

AAT

GGG

GGT

GAC

TTC

CAG

CCA

GGC

TGT

GGA

CTC

AAC

GAT

768

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly

Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Qiy

Leu

Asn

Asp

745 750 755

-51 CZ 299055 B6

GTC TTG GGA TCA

ATT GCA lle Ala

TAT GGA

ACA ATC ACA GAG GTG GTA AAA TGT

816

Val

Leu

Gly Ser 760

Tyr

Gly 765

Thr

Xle Thr

Glu

Val Val 770

Lys Cys

GAG

CAT

GAG

CGA

GCC

GTC

CAC

CTC

TTT

GTT

GAC

TCT

CTG

GTG

AAT

CAG

864

GlU

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

775

780

785

GAC

AAG

CCG

AGT

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACT

GAC

TCC

AAT

CGC

TTC

AAA

912

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

790

795

800

805

AAG

GGG

ATC

TGT

CTG

AGC

TGC

CGC

AAG

AAC

CGT

TGT

AAT

AGC

ATT

GGC

960

Lys

Gly

lle

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

lle

Gly

810

815

820

TAC

AAT

GCC

AAG

AAA

ATG

AGG

AAC

AAG

AGG

AAC

AGC

AAA

ATG

TAC

CTA

1008

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

825

830

835

AAA

ACC

CGG

GCA

GGC

ATG

CCT

TTC

AGA

1035

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

840 845 (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 345 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina ío (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Met 1

Ser

Asn.

Ser

Val 5

Pro

Leu

Leu

Cys

Phe 10

Trp

Ser

Leu

Cys

Tyr 15

Cys

Phe

Ala

Ala

Gly 20

Ser

Pro

Val

Pro

Phe 25

Gly

Pro

Glu

Gly

Arg 30

Leu

Glu

Asp

Lys

Leu 35

His

Lys

Pro

Lys

Ala 40

Thr

Gin

Thr

Glu

Val 45

Lys

Pro

Ser

Val

Arg

Phe

Asn

Leu

Arg

Thr

Ser

Lys

Asp

Pro

Glu

His

Glu

Gly

Cys

55 60

-52CZ 299055 B6

Tyr Leu Ser Val Gly His Ser Gin Pro Leu Glu Asp Cys Ser Phe Asn 65 70 75 80

Met Thr Ala Lys Thr Phe Phe Ile Ile His Gly Trp Thr Met Ser Gly 85 90 95

Ile Phe Glu Asn Trp Leu His Lys Leu Val Ser Ala Leu His Thr Arg 100 105 110

Glu Lys Asp Ala Asn Val Val Val Val Asp Trp Leu Pro Leu Ala His 115 120 125

Gin Leu Tyr Thr Asp Ala Val Asn Asn Thr Arg Val Val Gly His Ser

130

135

140

Ile

Ala

Arg

Met

Leu

Asp

Trp

Leu

Gin

Glu

Lys

Asp

Asp

Phe

Ser

Leu

145

150

155

160

Gly

Asn

Val

His

Leu

Ile

Gly

Tyr

Ser

Leu

Gly

Ala

His

Val

Ala

Gly

165

170

175

Tyr

Ala

Gly

Asn

Phe

Val

Lys

Gly

Thr

Val

Gly

Arg

Ile

Thr

Gly

Leu

180

185

190

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Met

Phe

Glu

Gly

Ala

Asp

Ile

His

Lys

Arg

Leu

195

200

205

Ser

Pro

Asp

Asp

Ala

Asp

Phe

Val

Asp

Val

Leu

His

Thr

Tyr

Thr

Arg

210

215

220

Ser

Phe

Gly

Leu

Ser

Ile

Gly

Ile

Gin

Met

Pro

Val

Gly

His

Ile

Asp

225

230

235

240

Ile

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly Asp

Phe

Gin

Pro

Gly

Cys

Gly

Leu

ASn

Asp

245

250

255

Val

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Tyr

Gly

Thr

Ile

Thr

Glu

Val

Val

Lys

Cys

260

265

270

Glu

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

275

280

285

Asp

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

290

295

300

Lys

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Ser

Ile

Gly

305

310

315

320

Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Met

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Ser

Lys

Met

Tyr

Leu

325

330

335

Lys

Thr

Arg

Ala

Gly

Met

Pro

Phe

Arg

340 345

-53CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 225 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS 15 (B) Umístění: 1...225 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

CTG GGA TCC ATC

GCC TAT GGC ACG ATC GCG GAG GTG GTG AAG

TGC GAG Cys Glu 360

Leu Gly Ser

Ile

Ala Tyr Gly Thr Ile 350

Ala 355

Glu

Val

Val Lys

CAT

GAG

CGG

GCC

GTG

CAT

CTC

TTT

GTG

GAC

TCC

CTG

GTG

AAC

CAG

GAC

His

Glu

Arg

Ala

Val

His

Leu

Phe

Val

Asp

Ser

Leu

Val

Asn

Gin

Asp

365

370

375

AAG

CCG

AGC

TTT

GCC

TTC

CAG

TGC

ACA

GAC

TCC

AAC

CGC

TTC

AAA

AAA

Lys

Pro

Ser

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg

Phe

Lys

Lys

380

385

390

GGG

ATC

TGT

CTC

AGC

TGC

CGG

AAG

AAC

CGC

TGT

AAC

GGC

ATC

GGC

TAC

Gly

Ile

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn

Gly

Ile

Gly

Tyr

395

400

405

AAT

GCT

AAG

AAG

ACG

AGG

AAT

AAG

AGG

AAC

ACC

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

410

415

420

144

192

225 (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 75 aminokyselin 25 (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

54CZ 299055 B6

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

Leu 1

Gly

Ser

Ile

Ala 5

Tyr

Gly

Thr

Ile

Ala 10

Glu

Val

Val

Lys

Cys 15

Glu

His

Glu

Arg

Ala 20

Val

His

Leu

Phe

Val 25

Asp

Ser

Leu

Val

Asn 30

Gin

Asp

Lys

Pro

Ser 35

Phe

Ala

Phe

Gin

Cys 40

Thr

Asp

Ser

Asn

Arg 45

Phe

Lys

Lys

Gly

Ile 50

Cys

Leu

Ser

Cys

Arg 55

Lys

Asn

Arg

Cys

Asn 60

Gly

Ile

Gly Tyr

Asn

Ala

Lys

Lys

Thr

Arg

Asn

Lys

Arg

Asn

Thr

65

70

75

(2) Informace pro SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 472 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

Met 1

Glu

Ser

Lys

Ala 5

Leu

Leu

Val

Leu

Thr 10

Leu

Ala

Val

Trp

Leu 15

Gin

Ser

Leu

Thr

Ala 20

Ser

Arg

Gly

Gly

Val 25

Ala

Ala

Ala

Asp

Gin 30

Arg

Arg

Asp

Phe

Ile 35

Asp

Ile

Glu

Ser

Lys 40

Phe

Ala

Leu

Arg

Thr 45

Pro

Glu

Asp

Thr

Ala 50

Glu

Asp

Thr

Cys

His 55

Leu

Ile

Pro

Gly

Val 60

Ala

Glu

Ser

Val

Ala 65

Thr

Cys

His

Phe

Asn 70

His

Ser

Ser

Lys

Thr 75

Phe

Met

Val

Ile

His 80

Gly

Trp

Thr

Val

Thr 85

Gly

Met

Tyr

Glu

Ser 90

Trp

Val

Pro

Lys

Leu 95

Val

Ala

Ala

Leu

Tyr 100

Lys

Arg

Glu

Pro

Asp 105

Ser

Asn

Val

Ile

Val 110

Val

Asp

Trp

Leu

Ser 115

Arg

Ala

Gin

Glu

His 120

Tyr

Pro

Val

Ser

Ala 125

Gly

Tyr

Thr

Lys

Val 130

Gly

Gin

Asp

Val

Ala 135

Arg

Phe

Ile

Asn

Trp 140

Met

Glu

Glu

Glu

-55 CZ 299055 B6

Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu Gly

145

150

155

160

Ala

His

Ala

Ala

Gly 155

Ile

Ala

Gly

Ser

Leu 170

Thr

Asn

Lys

Lys

Val 175

Asn

Arg

ile

Thr

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala

Gly

Pro

Asn

Phe

Glu

Tyr

Ala

Glu

180 185 190

Ala

Pro

Arg 195

Leu

Ser

Pro

Asp

Asp 200

Ala

Asp

Phe

Val

Asp 205

Val

Leu

His

Thr

Phe 210

Thr

Arg

Gly

Ser

Pro 215

Gly

Arg

Ser

Ile

Gly 220

Ile

Gin

Lys

Pro

Val 225

Gly

His

Val

Asp

Ile 230

Tyr

Pro

Asn

Gly

Gly 235

Thr

Phe

Gin

Pro

Qiy 240

Cys

Asn

Ile

Gly

Glu 245

Ala

Ile

Arg

Val

Ile 250

Ala

Glu

Arg

Gly

Leu 255

Gly

Asp

Val

Asp

Gin 260

Leu

Lys

Cys

Ser

His 265

Glu

Arg

Ser

Ile

His 270

Leu

Phe

Ile

Asp

Ser 275

Leu

Leu

Asn

Glu

Glu 280

Asn

Pro

Ser

Lys

Ala 285

Tyr

Arg

Cys

Ser

Ser 290

Lys

Glu

Ala

Phe

Glu 295

Lys

Gly

Leu

Cys

Leu 300

Ser

Cys

Arg

Lys

Asn 305

Arg

Cys

Asn

Asn

Leu 310

Gly

Tyr

Glu

Ile

Asn 315

Lys

Val

Arg

Ala

Lys 320

Arg

Ser

Ser

Lys

Met 325

Tyr

Leu

Lys

Thr

Arg 330

Ser

Gin

Met

Pro

Tyr 335

Lys

Val

Phe

His

Tyr 340

Gin

Val

Lys

Ile

His 345

Phe

Ser

Gly

Thr

Glu 350

Ser

Glu

Thr

His

Thr 355

Asn

Gin

Ala

Phe

Glu 360

Ile

Ser

Leu

Tyr

Gly 365

Thr

Val

Ala

Glu

Ser 370

Glu

Asn

Ile

Pro

Phe 375

Thr

Leu

Pro

Glu

Val 380

Ser

Thr

Asn

Lys

Thr 385

Tyr

Ser

Phe

Leu

Ile 390

Tyr

Thr

Glu

Val

Asp 395

Ile

Gly

Glu

Leu

Leu 400

Met

Leu

Lys

Leu

Lys

Trp

Lys

Ser

Asp

Ser

Tyr

Phe

Ser

Trp

Ser

Asp

405 410 415

-56CZ 299055 B6

Trp

Trp

Ser

Ser 420

Pro

Gly

Phe

Ala

Ile 425

Gin

Lys

Ile

Arg

Val 430

Lys

Ala

Gly

Glu

Thr 435

Gin

Lys

Lys

Val

Ile 440

Phe

Cys

Ser

Arg

Glu 445

Lys

Val

Ser

His

Leu 450

Gin

Lys

Gly

Lys

Ala 455

Pro

Ala

Val

Phe

Val 460

Lys

Cys

His

Asp

Lys

Ser

Leu

Asn

Lys

Lys

Ser

Gly

465 470 (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:

(i)	Charakteristiky sekvence:
	(A) Délka: 499 aminokyselin
	(B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: protein
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Met	Asp Thr Ser Pro Leu	Cys	Phe	Ser	Ile	Leu	Leu	Val	Leu	Cys	Ile
1	5				10					15
Phe	Ile Gin Ser Ser Ala	Leu	Gly	Gin	Ser	Leu	Lys	Pro	Glu	Pro	Phe
	20			25					30
Gly	Arg Arg Ala Gin Ala	Val	Glu	Thr	Asn	Lys	Thr	Leu	His	Glu	Met
	35		40					45
Lys	Thr Arg Phe Leu Leu	Phe	Gly	Glu	Thr	Asn	Gin	Gly	Cys	Gin	Ile
	50	55					60
Arg	Ile Asn His Pro Asp	Thr	Leu	Gin	Glu	Cys	Gly	Phe	Asn	Ser	Ser
65	70					75					80
Leu	Pro Leu Val Met Ile	Ile	His	Gly	Trp	Ser	Val	Asp	Gly	Val	Leu
	85				90					95
Glu	Asn Trp Ile Trp Gin	Met	Val	Ala	Ala	Leu	Lys	Ser	Gin	Pro	Ala
	100			105					110
Gin	Pro Val Asn Val Gly	Leu	Val	Asp	Trp	Ile	Thr	Leu	Ala	His	Asp
	115		120					125

-57CZ 299055 B6

His

Tyr 130

Thr

Ile

Ala

Val

Arg 135

Asn

Thr

Arg

Leu

Val 140

Gly

Lys

Glu

Val

Ala 145

Ala

Leu

Leu

Arg

Trp 150

Leu

Glu

Glu

Ser

Val 155

Gin

Leu

Ser

Arg

Ser 160

His

Val

His

Leu

Ile 165

Gly

Tyr

Ser

Leu

θίγ 170

Ala

His

Val

Ser

Gly 175

Phe

Ala

Gly

Ser

Ser 180

Ile

Gly

Gly

Thr

His 185

Lys

Ile

Gly

Arg

Ile 190

Thr

Gly

Leu

Asp

Ala 195

Ala

Gly

Pro

Leu

Phe 200

Glu

Gly

Ser

Ala

Pro 205

Ser

Asn

Arg

Leu

Ser 210

Pro

Asp

Asp

Ala

Asn 215

Phe

Val

Asp

Ala

Ile 220

His

Thr

Phe

Thr

Arg 225

Glu

His

Met

Gly

Leu 230

Ser

Val

Giy

Ile

Lys 235

Gin

Pro

Ile

Gly

His 240

Tyr

Asp

Phe

Tyr

Pro 245

Asn

Gly

Gly

Ser

Phe 250

Gin

Pro

Gly

Cys

His 255

Phe

Leu

Glu

Leu

Tyr 250

Arg

His

Ile

Ala

Gin 265

His

Gly

Phe

Asn

Ala 270

Ile

Thr

Gin

Thr

Ile 275

Lys

Cys

Ser

His

Glu 280

Arg

Ser

Val

His

Leu 285

Phe

Ile

Asp

Ser

Leu 290

Leu

His

Ala

Gly

Thr 295

Gin

Ser

Met

Ala

Tyr 300

Pro

Cys

Gly Asp

Met 305

Asn

Ser

Phe

Ser

Gin 310

Gly

Leu

Cys

Leu

Ser 315

Cys

Lys

Lys

Gly

Arg 320

Cys

Asn

Thr

Leu

Gly 325

Tyr

His

Val

Arg

Gin 330

Glu

Pro

Arg

Ser

Lys 335

Ser

Lys

Arg

Leu

Phe 340

Leu

Val

Thr

Arg

Ala 345

Gin

Ser

Pro

Phe

Lys 350

Val

Tyr

His

Tyr

Gin 355

Leu

Lys

Ile

Gin

Phe 360·

Ile

Asn

Gin

Thr

Glu 365

Thr

Pro

Ile

Gin

Thr 370

Thr

Phe

Thr

Met

Ser 375

Leu

Leu

Gly

Thr

Lys 380

Glu

Lys

Met

Gin

Lys 385

Ile

Pro

Ile

Thr

Leu 390

Gly

Lys

Gly

Ile

Ala 395

Ser

Asn

Lys

Thr

Tyr 400

-58CZ 299055 B6

Ser

Phe

Leu

Ile

Thr 405

Leu

Asp

Val

Asp

Ile 410

Gly

Glu

Leu

Ile

Met 415

Ile

Lys

Phe

Lys

Trp 420

Glu

Asn

Ser

Ala

Val 425

Trp

Ala

Asn

Val

Trp 430

Asp

Thr

Val

Gin

Thr 435

Ile

Ile

Pro

Trp

Ser 440

Thr

Gly

Pro

Arg

His 445

Ser

Gly

Leu

Val

Leu 450

Lys

Thr

Ile

Arg

Val 455

Lys

Ala

Gly

Glu

Thr 460

Gin

Gin

Arg

Met

Thr 465

Phe

Cys

Ser

Glu

Asn 470

Thr

Asp

Asp

Leu

Leu 475

Leu

A.rg

Pro

Thr

Gin 480

Glu

Lys

Ile

Phe

Val

Lys

Cys

Glu

Ile

Lys

Ser

Lys

Thr

Ser

Lys

Arg

⁴θ5 490 495

Lys ile Arg (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 465 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární o

(ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Met 1

Leu

Pro

Leu

Trp 5

Thr

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Leu

Gly

Ala

Val

Ala 15

Gly

Lys

Glu

Val

Cys 20

Tyr

Glu

Arg

Leu

Gly 25

Cys

Phe

Ser

Asp

Asp 30

Ser

Pro

Trp

Ser

Gly 35

Ile

Thr

Glu

Arg

Pro 40

Leu

His

Ile

Leu

Pro 45

Trp

Ser

Pro

Lys

Asp 50

Val

Asn

Thr

Arg

Phe 55

Leu

Leu

Tyr

Thr

Asn 60

Glu

Asn

Pro

Asn

Asn 65

Phe

Gin

Glu

Val

Ala 70

Ala

Asp

Ser

Ser

Ser 75

Ile

Ser

Gly

Ser

Asn 80

Phe

Lys

Thr

Asn

Arg 85

Lys

Thr

Arg

Phe

Ile 90

Ile

His

Gly

Phe

Ile 95

Asp

Lys

Gly

Glu

Glu 100

Asn

Trp

Leu

Ala

Asn 105

Val

Cys

Lys

Asn

Leu 110

Phe

Lys

Val

Glu

Ser 115

Val

Asn

Cys

Ile

Cys 120

Val

Asp

Trp

Lys

Gly 125

Gly

Ser

Arg

Thr

Gly

Tyr

Thr

Gin

Ala

Ser

Gin

Asn

Ile

Arg

Ile

Val

Gly

Ala

Glu

130 135 140

-59CZ 299055 B6

Val 145

Ala

Tyr

Phe

Val

Glu 150

Phe

Leu

Gin

Ser

Ala 155

Phe

Gly

Tyr

Ser

Pro 160

Ser

Asn

Val

His

Val 165

Ile

Gly

His

Ser

Leu 170

Gly

Ala

His

Ala

Ala 175

Gly

Glu

Ala

Gly

Arg 180

Arg

Thr

Asn

Gly

Thr 185

Ile

Gly

Arg

Ile

Thr 190

Gly

Leu

Asp

Pro

Ala 195

Glu

Pro

Cys

Phe

Gin 200

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu 205

Val

Arg

Leu

Asp

Pro 210

Ser

Asp

Ala

Lys

Phe 215

Val

Asp

Val

Ile

His 220

Thr

Asp

Gly

Ala

Pro 225

Ile

Val

Pro

Asn

Leu 230

Gly

Phe

Gly

Met

Ser 235

Gin

Val

Val

Gly

His 240

Leu

Asp

Phe

Phe

Pro 245

Asn

Gly

Gly

Val

Glu 250

Met

Pro

Gly

Cys

Lys 255

Lys

Asn

Ile

Leu

Ser 260

Gin

Ile

Val

Asp

Ile 265

Asp

Gly

Ile

Trp

Glu 270

Gly

Thr

Arg

Asp

Phe 275

Ala

Ala

Cys

Asn

His 280

Leu

Arg

Ser

Tyr

Lys 285

Tyr

Tyr

Thr

Asp

Ser 290

Ile

Val

Asn

Pro

Asp 295

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe 300

Pro

Cys

Ala

Ser

Tyr 305

Asn

Val

Phe

Thr

Ala 310

Asn

Lys

Cys

Phe

Pro 315

Cys

Pro

Ser

Gly

Gly 320

Cys

Pro

Gin

Met

Gly 325

His

Tyr

Ala

Asp Arg 330

Tyr

Pro

Gly

Lys

Thr 335

Asn

Asp

Val

Gly

Gin 340

Lys

Phe

Tyr

Leu

Asp 345

Thr

Gly

Asp

Ala

Ser 350

Asn

Phe

Ala

Arg

Trp 355

Arg

Tyr

Lys

Val

Ser 360

Val

Thr

Leu

Ser

Gly 365

Lys

Lys

Val

Thr

Gly 370

His

Ile

Leu

Val

Ser 375

Leu

Phe

Gly

Asn

Lys 380

Gly

Asn

Ser

Lys

Gin 385

Tyr

Glu

Ile

Phe

Lys 390

Gly

Thr

Leu

Lys

Pro 395

Asp

Ser

Thr

His

Ser 400

Asn

Glu

Phe

Asp

Ser 405

Asp

Val

Asp

Val

Gly 410

Asp

Leu

Gin

Met

Val 415

Lys

Phe

Ile

Trp

Tyr

Asn

Asn

Val

Ile

Asn

Pro

Thr

Leu

Pro

Arg

Val

Gly

420 425 430

Ala

Ser

Lys 435

lle

lle

Val

Glu

Thr 440

Asn

Val

Gly

Lys

Gin 445

Phe

Asn

Phe

Cys

Ser 450

Pro

Glu

Thr

Val

Arg 455

Glu

Glu

Val

Leu

Leu 460

Thr

Leu

Thr

Pro

Cys

465 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 17 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Gly Pro Glu Gly Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr 15 10 15

Cys (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 13 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

TTTTTTTTTT TGA

-61 CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 10 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

GATCAATCGC 10 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

TAGGACATGC ACAGTGTAAT CTG 23 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ 45 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

GATTGTGCTG GCCACTTCTC

-62CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 19 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

GACACTCCAG GGACTGAAG 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná báze (B) Umístění: 36 (D) Jiné informace /modbaze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná báze (B) Umístění: 37 (D) Jiné informace /mod baze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná báze (B) Umístění: 41 (D) Jiné informace /mod baze = i (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná báze (B) Umístění: 42 (D) Jiné informace /mod baze = i

-63CZ 299055 B6 (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: modifikovaná báze (B) Umístění: 46 (D) Jiné informace /modbaze = i (ix) Vlastnosti:

io (A) Jméno/klíč: modifikovaná báze (B) Umístění: 47 (D) Jiné informace /mod baze = i (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

CUACVACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG (2) Informace pro SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 25 (ii) Typ molekuly: j iná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

CACACACAGG CCACGCGTCG ACTAGTAC 28 (2) Informace pro SEQ ID NO: 24 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

ACCACCATGG AGAGCAAAGC CCTG ²⁴

-64CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

CCAGTTTCAG CCTGACTTCT TATTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární 25 (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

GGCTGTGGAC TCAACGATGT C (2) Informace pro SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ 45 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

CCGGGTGGGT AGGTACATTT TG

-65CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární io (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

GGGGGTGACT TCCAGCCAGG CTGTG ²⁵ (2) Informace pro SEQ ID NO: 29:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ 30 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 29:

AACTCTGAAA GGCATGCCTG CCCGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 30:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:

TGAAGGTCGG AGTCAACGGA TTTGGT 26

-66CZ 299055 B6 (2) Informace pro SEQ ID NO: 31:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = „Oligonukleotid“ (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polypeptid kódovaný genem podobným genu pro lipasu, kde uvedený polypeptid:

   25 (a) se váže na heparin, (b) má homologii s lidskou lipoproteinovou lipasou a jatemí lipasou, a (c) obsahuje 39 kD katalytickou doménu triacylglycerollipasové rodiny, kde 39 kD katalytická

   30 doména triacylglycerollipasové rodiny má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.
2. 2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 8 a molekulovou hmotnost přibližně 55 kD na 10% SDS-PAGE gelu.

   35
3. 3. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ

   ID NO: 8 a molekulovou hmotnost přibližně 68 kD na 10% SDS-PAGE gelu.
4. 4. Izolovaný polypeptid podle nároků 1 až 3, kde polypeptid má aktivitu fosfolipasy A.

   40 5. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ

   ID NO: 6 a molekulovou hmotnost přibližně 40 kD na 10% SDS-PAGE gelu.

   6. Izolovaný polypeptid podle nároků 1 až 5, kde polypeptid je lidského původu.

   45 7. Prostředek mající fosfolipázovou účinnost, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároků 1 až 6 a biologicky kompatibilní roztok.

   8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároků 1 až 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   9. Izolovaný imunizační peptid, který obsahuje SEQ ID NO: 16.

   -67CZ 299055 B6

   10. Izolovaná nukleová kyselina kódující polypeptid podle nároků 1 až 6.

   11. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 10, kterou je cDNA.
5. 5 12. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 11, jejíž nukleotidová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 5, 7 a 9.

   13. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 12 obsahující nukleotidy 252 až 1754 SEQ ID NO: 7.

   14. Izolovaná nukleová kyselina, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek na nukleovou kyselinu mající sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 3, 5 a 7.

   15. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 14, která obsahuje 20 nukleotidů.

   16. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 14, kterou je antisense nukleová kyselina.

   17. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 16, kde sekvence antisense nukleové kyseliny je operativně navázána na regulační region pro genovou expresi.

   18. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 14, která hybridizuje za vysoce stringentních podmínek na cílovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující nukleotidy 44 až 79 SEQ ID NO: 3 a nukleotidy 1036 až 1065 SEQ ID NO: 5.

   25 19. Biologicky aktivní prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 16 a biologicky kompatibilní roztok.

   20. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 16 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   21. Vektor obsahující izolovanou nukleovou kyselinu podle nároků 10 až 13 operativně navázanou na regulační region.

   22. Vektor podle nároku 21, kde regulační region je z heterologního zdroje.

   23. Vektor podle nároku 21 nebo 22, kterým je virový vektor.

   24. Vektor podle nároku 23, kterým je adenovirový vektor.

   40 25. Rekombinantní buňka obsahuje vektor podle nároku 21 až 24.

   26. Rekombinantní buňka podle nároku 25, kde buňka je eukaryotická buňka.

   27. Rekombinantní buňka podle nároku 26, kde touto buňkou je COS-7 buňka.

   28. Prostředek využitelný k transfekaci cílové buňky, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle nároků 21 až 24 a biologicky kompatibilní roztok.

   29. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle náro50 ků 21 až 24 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   30. Způsob výroby polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci rekombinantních buněk podle nároků 25 až 27 za podmínek umožňujících expresi polypeptidu.

   55 31. Polypeptid připravený způsobem podle nároku 30.

   -68CZ 299055 B6

   32. Protilátka schopná specifické vazby na polypeptid podle nároků 1 až 6 nebo 31.

   33. Protilátka schopná specifické vazby na polypeptid podle nároku 4 a neutralizující fosfolipa5 sovou aktivitu polypeptidu.

   34. Protilátka podle nároku 32 nebo 33, kterou je monoklonální protilátka.

   35. Protilátka podle nároku 32 nebo 33, kterou je polyklonální protilátka.

   36. Hybridomní buňka, která produkuje protilátku podle nároku 34.

   37. Prostředek poskytující navázání polypeptidu podle nároku 1 na protilátku, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároků 32 až 35 a biologicky kompatibilní roztok.

   38. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároků 32 až 35 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   39. Způsob screeningu aktivity LLG agonistů nebo antagonistů, vyznačující se tím, 20 že zahrnuje:

   (a) kontaktování potenciálních agonistů nebo antagonistů s LLG a substrátem LLG, a (b) měření schopnosti potenciálních agonistů nebo antagonistů potencovat nebo inhibovat LLG 25 aktivitu, kde LLG je polypeptid podle nároku 1.

   40. Způsob in vitro enzymatické hydrolýzy fosfotidylcholinesteru, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování uvedeného fosfatidylcholinesteru s polypeptidem podle nároků 1 až 4.

   41. Použití farmaceutického prostředku podle nároku 8 nebo 20 pro výrobu léčiva pro zlepšení sérového lipidového profilu u lidí a jiných živočichů majících nežádoucí lipidový profil.

   42. Použití farmaceutického prostředku podle nároku 38 pro výrobu léčiva pro zlepšení sérové35 ho lipidového profilu u lidí a jiných živočichů majících nežádoucí lipidový profil.

   43. Transgenní myš exprimující polypeptid podle nároků 1 až 4.