EA003293B1

EA003293B1 - Полипептиды, кодируемые геном, подобным гену липазы человека, содержащие их композиции и способы использования композиций

Info

Publication number: EA003293B1
Application number: EA199900522A
Authority: EA
Inventors: Майкл К. Джей; Ким-Анх Тхи Доан; Джон А. Кравик; Кевин Дж. Линч; Дилип В. Амин; Виктория Дж. Саут
Original assignee: Авентис Фармасьютикалз Продактс Инк.
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2003-04-24
Also published as: SK287687B6; PL191624B1; IL129986A0; HK1068636A1; CZ299055B6; EA199900522A1; DE948609T1; AP9901548A0; AU750891B2; NO326140B1; DE69732789T2; US6395530B1; US20030108538A1; BG103472A; WO1998024888A2; CN1167793C; EP0948609B1; ATE291080T1; US20120114660A1; IL129986A

Abstract

Описываются полипептиды, подобные липопротеин-липазе, нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды, антисмысловые последовательности и антитела против указанных полипептидов. Описываются также способы получения указанных полипептидов в рекомбинантной системе и способы использования указанных полипептидов для выявления агонистов или антагонистов этих полипептидов. Кроме того, описываются способы и композиции для лечения нарушений липидного метаболизма.

Description

Настоящее изобретение относится к полипептидам семейства триацилглицерол-липаз, к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные полипептиды, к антисмысловым последовательностям, производным указанных нуклеиновых кислот, и к антителам против указанных полипептидов. Настоящее изобретение также относится к получению указанных полипептидов с использованием рекомбинантной технологии, и к использованию указанных полипептидов для скрининга в целях выявления агонистов или антагонистов указанных полипептидов. Настоящее изобретение также относится к способам терапевтического использования таких полипептидов и последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих указанные полипептиды, в фармацевтических композициях, включая композиции для генной терапии и композиции для лечения нарушений метаболизма липидов и липопротеинов.

Предпосылки изобретения

А. Липиды

Липиды представляют собой нерастворимые в воде органические биологические молекулы, которые являются непременными участниками различных биологических функций, включая накопление, транспорт и метаболизм энергии, а также играют важную роль для структуры и текучести мембраны. Липиды, содержащиеся в организме человека и других животных, образуются из двух источников: некоторые липиды поступают с пищевыми жирами и маслами, а другие липиды биологически синтезируются организмом человека или животного. У млекопитающих, по крайней мере, 10% от их массы тела составляют липиды, большинство из которых присутствует в форме триацилглицеринов.

Триацилглицерины, известные также как триглицериды или триацилглицериды, состоят из трех жирных кислот, этерифицированных глицерином. Пищевые триацилглицериды накапливаются в жировой ткани как источник энергии или гидролизуются в пищеварительном тракте триацилглицерол-липазами, из которых наиболее важной является панкреатическая липаза. Триацилглицерины транспортируются между тканями в форме липопротеинов.

Липопротеины представляют собой мицеллоподобные структуры, обнаруживаемые в плазме и содержащие варьирующиеся соотношения различных типов липидов и белков (называемых апопротеинами). Имеется пять основных классов липопротеинов плазмы, главной функцией которых является транспорт липидов. Такими классами являются, в порядке возрастания плотности: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛИП), липопротеины низкой плотности (ЛНП) и липопротеины высокой плотности (ЛВП). Хотя каждый класс липопротеинов включает в себя много типов липидов, однако, каждый класс транспортирует преимущественно один тип липидов: триацилглицерины, описанные выше, транспортируются в составе хиломикронов, ЛОНП и ЛПП; тогда как фосфолипиды и сложные эфиры холестерина транспортируются в составе ЛВП и ЛНП, соответственно.

Фосфолипиды представляют собой сложные эфиры двухосновной жирной кислоты и глицеринфосфата, также содержащие полярную группу, связанную с фосфатом. Фосфолипиды являются важными структурными компонентами клеточных мембран. Фосфолипиды гидролизуются ферментами, называемыми фосфолипазами. Фосфатидилхолин, типичный фосфолипид, является главным компонентом мембран большинства эукариотических клеток.

Холестерин представляет собой метаболический предшественник стероидных гормонов и желчных кислот и является также основным компонентом клеточных мембран. У человека и других животных холестерин поступает с пищей, а также синтезируется печенью и другими тканями. Холестерин транспортируется между тканями в форме сложных эфиров холестерина, входящих в состав ЛНП и других липопротеинов.

Каждая живая клетка окружена мембранами, которые служат барьером между внутриклеточными и внеклеточными компартментами. Мембраны также окружают ядро эукариотической клетки, входят в состав эндоплазматического ретикулума и осуществляют специальные функции, такие как функции в миелиновой оболочке, которая окружает аксоны. Типичная мембрана содержит около 40% липида и 60% белка, но имеются и существенные вариации. Главными липидными компонентами являются фосфолипиды, в частности фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, и холестерин. Физикохимические свойства мембран, такие как текучесть, могут быть изменены путем модификации либо профилей жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов, либо содержания холестерина. Модуляция состава и структуры мембранных липидов также приводит к модуляции мембрано-ассоциированных клеточных функций, таких как рецепторная активность, эндоцитоз и поступление холестерина.

В. Ферменты

Триацилглицерол-липазы представляют семейство ферментов, которые играют несколько ключевых ролей в метаболизме липидов в организме. Были описаны три члена семейства триацилглицерол-липаз: панкреатическая липаза, липопротеин-липаза и липаза печени (6о1бЬетд, Т.Е, Ье, Ν.-Α., СткЬетд, Η.Ν., Кгаикк, К.М., & Ьшбдтеп Е.Т. (1988) 1. С1ш. Ιηνβκΐ., 81, 561568; Со1бЬегд, Ι.Ε, Ье, Ν., Ра1егш11 ЕК.., СшкЬетд, Η.Ν., Ьтбдтеп, Е.Т. & Вготеп, А.У. (1982) 1. С1ш. Гптекк, 70, 1184-1192; Н1бе, А.А., Скап, Ь., & Ы, А.-Н. (1992) 1. Ыр1б. Кек. 33, 167-178). Панкреатическая липаза ответственна, главным образом, за гидролиз пищевых липидов. Были описаны варианты панкреатической липазы, но их физиологическая роль не была определена (СШет, Т., Висктеа1б, Р., В1ит-Кае1ш, Ό., & Нип/1кет, А. (1992) 1. В1о1. Скет., 267, 1650916516). Липопротеин-липаза является главным ферментом, ответственным за распределение и утилизацию триглицеридов в организме. Липопротеин-липаза гидролизует триглицериды как в составе хиломикронов, так и в виде ЛОНП. Липаза печени гидролизует триглицериды с образованием ЛПП и ЛВП и ответственна за ремоделирование липопротеинов. Липаза печени также действует как фосфолипаза и гидролизует фосфолипиды с образованием ЛВП.

Фосфолипазы играют важную роль в катаболизме и ремоделировании фосфолипидного компонента липопротеинов и фосфолипидов мембран. Фосфолипазы также играют определенную роль в высвобождении арахидоновой кислоты с последующем образованием простагландинов, лейкотриенов и других липидов, которые участвуют в ряде воспалительных процессов.

Полипептиды липазы, кодируемые генами липазы, имеют последовательность длиной приблизительно в 450 аминокислот с пептидами лидерной сигнальной последовательности для облегчения секреции. Белки липазы состоят из двух главных доменов (Ашк1ет, К., Э'Атсу, А., & Нип71кет, А. (1990) Νοίυιβ, 343, 771-774). Амино-концевой домен содержит каталитический центр, а карбоксиконцевой домен, очевидно, ответственен за связывание с субстратом, присоединение кофактора и взаимодействие с клеточными рецепторами (Аопд, Н., Оатк, К.С, Мка/у, 1., 8ееЬай, К.Е., & 8ско1х, М.С. (1991) Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 88, 11290-11294; тап ТйЬеитдк, Н., Коикке1, А., Ьа1оие1, Ι-М., & СатЫ11аи, С. (1994) 1. Вю1. Скет. 269, 4626-4633; Аопд, Н., Эатк, К.С., Ткигеп, Т., Соегк, ЕА., Мка/у, 1., Ааке, М., & 8ско1х, М.С. (1994) 1. Вю1. Скет. 269, 10319-10323; Скарре11, Э.А., 1поие, I., Егу, С.Ь., Р1абе1, М.А., Вотееп, 8.Ь., Гтепик, Р.-Н., Ьа1оие1, Е-М. & 81пск1апб, Ό.Κ. (1994) 1. Вю1. Скет. 269, 18001-18006). Общий уровень аминокислотной гомологии между членами этого семейства составляет 22-65%, при этом имеются локальные области высокой гомологии, соответствующие структурной гомологии, которая связана с ферментативной функцией.

Природная липопротеин-липаза (БРЬ) гликозилирована, и это гликозилирование необходимо для ЕРЬ-ферментативной активности (8етепкоткк, С.Е., Ьио, С.-С., какапккЕ М.К.,

Скеп, 8.-Н., 8ткк, Ь.С., & Скап, Ь. (1990) 1. Вю1. Скет., 265, 5429-5433). В липазе печени и липопротеин-липазе присутствуют два сайта Νгликозилирования, а в панкреатической липазе присутствует один сайт Ν-гликозилирования. Кроме того, четыре группы цистеинов образуют дисульфидные мостики, которые имеют важное значение в сохранении структурной целостности для обеспечения ферментативной активности (Ьо, Е-Υ., 8ткк, Ь.С., & Скеп, Ь. (1995) Вюскет. Вюркук. Кек. Соттип. 206, 266-271; Вгабу, Ь., Вг/охотекк!, А.М., Эегетеепба, Ζ.8., Эобкоп, Е., Эобкоп, С., То11еу, 8., ТигкепЬигд, ЕР., Сктккапкеп, Ь., НидеЛепкеп В., Хогккот, Ь., ТЫт, Ь., & Мепде, и. (1990) УПиге 343, 767770).

Члены семейства триацилглицерол-липаз имеют ряд общих консервативных структурных особенностей. Одной из таких особенностей является мотив СХ8ХС, в котором центральный сериновый остаток является одним из трех остатков, составляющих каталитическую триаду (А1пк1ег, К., Э'Атсу, А., & Нипх1кег, А. (1990) №1иге, 343, 771-774; Еаик1ше11а, Е., 8ткк, Ь.С., & Скап, Ь. (1992) Вюскеткку 31, 72197223). Остальные остатки каталитической триады составляют консервативные аспартатные и гистидиновые остатки. Короткий участок из 1923 аминокислот (область крышки) образуют амфипатическую спиральную структуру и покрывают каталитический карман фермента (Ашк1ет, К., Э'Атсу, А., & Нипх1кег, А. (1990) №1иге, 343, 771-774). Эта область отличается у разных членов этого семейства, а недавно было установлено, что эта область сообщает ферменту субстратную специфичность (Оид1, К. А., Όίскек Н.Ь., & 8ап1атаппа-Ео.)о, 8. (1995) 1. Вю1. Скет., 270, 25396-25401). Сравнение липазы печени и липопротеин-липазы показало, что различия в активностях триацилглицероллипазы и фосфолипазы опосредовано отчасти данной областью крышки (Эидт К.А., Эккек Н.Ь., & 8ап1ататта-Ео.)о, 8. (1995) 1. Вю1. Скет., 270, 25396-25401).

Триацилглицерол-липазы обладают различными степенями гепарин-связывающей активности. Липопротеин-липаза имеет наиболее высокое сродство к гепарину, и в соответствии с проведенным картированием эта область связывающей активности простирается до положительно заряженных остатков в амино-концевом домене (Ма, Υ., Непбегкоп, Н.Е., Ыи, М.-8., ΖΗ^ι^, Н., Еогку1ке, Ι.Ε, С1атке-Ьетек, I., Наубеп, М.К., & ВгипгеЦ, ΕΌ., 1. Ыр1б Кек. 35, 20492059). Локализация липопротеин-липазы на поверхности эндотелиальной клетки (Скепд, С.Е., Оок1а, С.М., Вепкабоип, А., & КокепЬегд, К.Э. (1981) 1. Вю1. Скет., 256, 12893-12896) опосредуется, главным образом, через связывание с поверхностными протеогликанами (8к1таба, К., 0111, Р.Е, 8йЬет1, ЕЕ., Эоид1ак, А.Н.Е, & ЕапЬигд, В.Ь. (1981) 1. С1ш ГптекЕ 68, 995-1002;

8ахепа, и., ΚΙβίη, М.С., & Со1йЬегд, 1.1. (1991) 1. Вю1. СЬет. 266, 17516-17521; Е18епЬег§, 8., 8еЬауек, Е., ОНуесгопа, Т., & У1ойаукку, I. (1992) 1. Сйп. 1пуек1., 90, 2013-2021) . Именно эта связывающая активность позволяет ферменту ускорять поглощение ЛНП, действуя в качестве мостика между ЛНП и клеточной поверхностью (МиИет, М., ЬотЬатШ, Р., 1апкеп, Н., уапВетке1 Т.Е, Ртап1к К..К.., & Науекек, Ь.М. (1992) ВюсЬет. ВюрЬук. Кек. Сотт. 185, 582-587; К.и11ейде, ЕС., & Со1йЬегд, 1.1. (1994) 1. Барк Кек. 35. 1152-1160; ТкисЫуа, 8., УатаЬе, М., УатадисНг Т., КоЬауакЫ, Υ., Коппо, Т., & Тайа, Κ. (1980) 1п1. 1. Сапсег 26, 171-176).

Известно, что как липопротеин-липаза, так и липаза печени функционируют в сочетании с белками коактиваторами: аполипо-протеином СИ для липопротеин-липазы, и колипазой для панкреатической липазы.

Генетические последовательности, кодирующие панкреатическую липазу, липазу печени и липопротеин-липазу человека, описаны в литературе (СепЬапк, регистрационные номера М93285, 103540 и М15856 соответственно). Информационные РНК липазы печени и панкреатической липазы человека имеют длину приблизительно 1,7 и 1,8 тысяч пар оснований соответственно. Два мРНК-транскрипта длиной 3,6 и 3,2 тысяч пар оснований транскрибируется с гена липопротеин-липазы человека. Эти два транскрипта используют альтернативные сигналы полиаденилирования и отличаются по эффективности своей трансляции (КапдапаИап, С., Опд, ЕМ , ΥιιΡΙιΙ. А., 8ад1ихайе11. М., 81тко1о, К.В., Раиег, А., & Кет, Р.А. (1995) 1. Вю1. СЬет., 270, 7149-7155).

С. Физиологические процессы

Метаболизм липидов осуществляется посредством взаимодействия липидов, апопротеинов, липопротеинов и ферментов.

Липаза печени и липопротеин-липаза представляют собой многофункциональные белки, которые опосредуют связывание, утилизацию, катаболизм и ремоделирование липопротеинов и фосфолипидов. Липопротеин-липаза и липаза печени функционируют посредством связывания с люминальной поверхностью эндотелиальной клетки в периферических тканях и в печени соответственно. Оба эти фермента участвуют в обратном транспорте холестерина, который заключается в переносе холестерина из периферических тканей в печень либо для экскреции из организма, либо для повторного метаболического цикла. Известно, что генетические дефекты как липазы печени, так и липопротеин-липазы вызывают наследственные нарушения метаболизма липопротеина. Дефекты в метаболизме липопротеинов приводят к серьезным метаболическим расстройствам, включая гиперхолестеринемию, гиперлипидемию и атеросклероз.

Атеросклероз представляет собой комплексное полигенное заболевание, которое с гистологической точки зрения определяется как отложение (липидные или фибролипидные бляшки) липидов и других производных крови на стенках кровеносных сосудов, особенно крупных артерий (в аорте, коронарной артерии, сонной артерии) . Эти бляшки, которые являются более или менее кальцифицированными в соответствии со стадией атеросклеротического процесса, могут быть связаны с поражениями и ассоциироваться с аккумуляцией в кровеносных сосудах жировых отложений, состоящих в основном из сложных эфиров холестерина. Эти бляшки сопровождаются утолщением стенки кровеносного сосуда, гипертрофией гладкой мускулатуры, появлением пенистых клеток (нагруженных липидом клеток, образующихся в результате нерегулируемого поглощения холестерина рекрутированными макрофагами) и аккумуляцией фиброзной ткани. Атероматозные бляшки заметно выступают на стенке сосуда, что сообщает им стенозирующие свойства, ответственные за окклюзию сосудов вследствие атеромы, тромбоза или эмболии, развивающихся у тех пациентов, которые наиболее восприимчивы к этим поражениям. Указанные поражения могут приводить к серьезным сердечнососудистым патологиям, таким как инфаркт, внезапная смерть, сердечная недостаточность и инсульт.

Роль триацилглицерол-липаз в сосудистых патологиях, таких как атеросклероз, является объектом интенсивного исследования (см., обзор С., & Ойуестопа, С., & Ойуестопа, Т. (1995) Сшт. Орш. Ыр1й 6, 291-305). В основном, действие триацилглицерол-липаз является, очевидно, антиатерогенным, поскольку эти ферменты снижают уровень триацилглицерина в сыворотке и стимулируют образование ЛВП. Трансгенные животные, экспрессирующие липопротеин-липазу или липазу печени человека, обнаруживали пониженный уровень триглицеридов в плазме и повышенный уровень липопротеинов высокой плотности (ЛВП) (8Ытайа, М. 8Ытапо, Н., Со1ойа, Т., Υататοΐο, К., Катеатига, М., 1паЬа, Т., Υаζак^. Т., & Υатайа. N. (1993) 1. Вю1. СЬет. 268, 17924-17929; Ыи, М.-

8., йпк, Р.К., ЬеВоеик, К.С., Непйегкоп, Н., Сак1е11ап1, Ь.^., Ьик1к, АЛ., Ма, Υ., РогкуНе, ЕЕ, 2Ьапд, Н., Кйк, Е., ВгипхеИ, Ι.Ό., & Науйеп, М.К. (1994) 1. Вю1. СЬет. 269, 11417-11424). Было установлено, что люди с генетическими дефектами, приводящими к снижению уровней липопротеин-липазной активности, подвержены гипертриглицеридемии, но без повышенного риска возникновения ишемической болезни сердца. Сообщалось, что это обусловлено отсутствием продуцирования атерогенных липопротеинов промежуточных размеров, которые могут аккумулироваться в субэндотелиальном пространстве (2буегктй, Ό.Β. (1973) Сне. Век. 33, 633-638).

Однако было высказано предположение, что в локализованной области атеросклеротического поражения повышенный уровень липазной активности ускоряет атерогенный процесс (2йуегктй, Ό.Β. (1995) С1ш Сйет. 41, 153-158; 2атЬои, А., Тоггек, А., Вууое1, 8., Оадие, С., Моо)апг 8., Ьцр1еп, Р.1., Наубеп М.В. & Виш/еВ Ι.Ό. (1993) Гансе! 341, 1119-1121). Это может быть обусловлено увеличением связывания и поглощения липопротеинов сосудистой тканью, опосредованным липазами (ЕщепЬегд, 8., 8ейауек, Е., Ойуеегопа, Т. У1обаукку, I. (1992) 1. Сйп. 1пуек1. 90, 2013-2021; ТаЬак, I., Ь1, I., Вгоаа

В.XV.. Хи, 8.XV.. 8\\сп8оп. Т.Ь., Χνί11ίηιη8. К.1. (1993) 1. Вю1. Сйет. 268, 20419-20432; Хогбек!даагб, В.О., & №е1кеп, А.О. (1994) Сигг. Орт. Ыр1б. 5, 252-257; №1Шатк, К.1. & ТаЬак, I. (1995) Ай. ТйготЬ. апб Уаке. Вю1. 15, 551-561). Кроме того, высокий локальный уровень липазной активности может приводить к цитотоксическим уровням жирных кислот и лизофосфатидилхолина, продуцируемого в предшественниках атеросклеротических повреждений.

Несмотря на появление все возрастающих сведений относительно роли, которую играет липазная активность в липидном гомеостазе, тем не менее, необходимость в идентификации дополнительных генов, кодирующих белки, регулирующие липидный метаболизм, остаются актуальной.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к обнаружению гена, подобного гену липазы (ЕЬО), к полипептидным продуктам экспрессии этого гена, а также к композициям и к способам их использования. ЕЬО-полипептид связывается с гепарином, обладает гомологией с липопротеинлипазой и липазой печени человека и включает каталитический 39 кДа-домен семейства триацилглицерол-липаз. В другом варианте осуществления изобретения этот полипептид обладает активностью фосфолипазы А.

Настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему последовательность 8ЕО ГО Ыо: 10.

Кроме того, настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, содержащему последовательность 8ЕО ГО Ыо: 8 и имеющему кажущуюся молекулярную массу около 55 кДа или 68 кДа на 10% ДСН-ПААГ -геле.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полипептиду, содержащему последовательность 8ЕО ГО Ыо: 6 и имеющему кажущуюся молекулярную массу около 40 кДа на 10% ДСН-ПААГ-геле.

Кроме того, настоящее изобретение относится к антигенному фрагменту ЕЬО-полипептида.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой ки слоте, кодирующей полипептид, имеющий вышеуказанную последовательность.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему вышеуказанную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид и правильно присоединенную к регуляторной области, такой как промотор.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке, включающей вышеуказанный вектор.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения полипептида, предусматривающему культивирование рекомбинантных клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный полипептид, в условиях, благоприятствующих экспрессии указанного полипептида.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антителу, способному специфически связываться с полипептидами настоящего изобретения и/или нейтрализовать биологическую активность этих полипептидов. Действительно, дополнительное свойство полипептида настоящего изобретения заключается в том, что он специфически связывается с антителом настоящего изобретения, то есть с антителом, являющимся специфичным по отношению к ЕЬО-полипептиду.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей полипептид, нуклеиновую кислоту, вектор, антисмысловую нуклеиновую кислоту или антитело настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга в целях выявления агонистов или антагонистов ферментативной активности, которой обладают полипептиды настоящего изобретения, где указанный способ предусматривает контактирование потенциальных агонистов или антагонистов с указанными полипептидами и их субстратом и измерение способности потенциальных агонистов или антагонистов усиливать или ингибировать эту активность.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу ферментативного гидролиза сложного эфира фосфатидилхолина, предусматривающему контактирование указанного сложного эфира фосфатидилхолина с полипептидом настоящего изобретения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения человека или животного в целях улучшения профиля содержания липидов в сыворотке данного человека или животного, имеющего нежелательный липидный профиль, где указанный способ предусматривает введение эффективного количества композиции настоящего изобретения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или преду9 преждения атеросклероза у человека или животного, предусматривающему введение данному человеку или животному эффективного количества композиции настоящего изобретения.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения, кроме того, проиллюстрированы на рисунках и в подробном описании предпочтительных вариантов его осуществления.

Краткое описание рисунков

На фиг. 1 показаны последовательности (8ЕЦ ΙΌ Νο: 17-31) праймеров, использованные для экспериментальных РСЯ-амплификаций.

На фиг. 2 показана нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο: 1) и выведенная аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο: 2) продукта ЯТ-РСЯ-реакции (проводимой методом дифференциального отображения), содержащего кДНК ген, подобный гену липазы. Последовательности, соответствующие двум праймерам, используемым при амплификации, подчеркнуты. Стоп-кодон и сигнал полиаденилирования выделены рамкой. Мотивы СЛЛТТС и фланкирующая последовательность являются производными вектора рСК11, в который был клонирован этот продукт.

На фиг. 3 показана нуклеотидная последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο: 3) и выведенная аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο: 4) 5'ЯАСЕ-удлинения кДНК для ЬЬС. Последовательности, соответствующие двум праймерам, используемым при амплификации, подчеркнуты. Мотивы СЛЛТТС и фланкирующая последовательность происходят от вектора рСКП, в который был клонирован этот продукт.

На фиг. 4 показана последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο: 7) кДНК, содержащая полную открытую рамку считывания гена, подобного гену липазы ЬЬСХЬ. Старт-кодон (АТС) и стопкодон (ТАС) выделены рамкой. Э га Ι-сайт (ТТТААА) и 8гП-сайт (СССССССС), использованные при конструировании экспрессирующих векторов, подчеркнуты.

На фиг. 5 показана выведенная аминокислотная последовательность (8ЕЦ ΙΌ Νο: 8) белка ЬЬСХЕ. Предполагаемая сигнальная последовательность подчеркнута.

На фиг. 6 показано сравнение первичных последовательностей членов семейства генов триацилглицерол-липаз (8ЕЦ ΙΌ Νο: 13-15). Заштрихованные остатки идентичны белку ЬЬСХЬ (8ЕЦ ΙΌ Νο: 8). Бреши были введены в последовательности для максимизации сравнения первичных последовательностей с использованием программы СЬи8ТАЬ.

На фиг. 7 показан Нозерн-анализ мРНК ЬЬС в клетках ТНР-1. Клетки были стимулированы либо РМА, либо РМА и окисленным ЬЭЬ (РМА + окис. ЬЭЬ). Цифры слева указывают на положения РНК-стандартов (тысяч пар оснований).

На фиг. 8 показан Нозерн-анализ мРНК из множества тканей человека, зондированных с использованием кДНК ЬЬС, липопротеинлипазы (ЬРЬ) и бета-актина человека. Положение 4,4 т.п.о. РНК-стандарт указано слева от панелей ЬЬС и ЬРЬ.

На фиг. 9 показан Нозерн-анализ экспрессии ЬЬС и ЬРЬ в культивированных эндотелиальных клетках и в клетках ТНР-1 человека. Эти клетки либо не стимулировали (не обрабатывали РМА), либо стимулировали РМА.

На фиг. 10 показана последовательность иммунизирующего пептида (8ЕЦ ΙΌ Νο: 16) и его родство с последовательностью белка ЬЬСХЕ. Этот пептид показан в заштрихованной рамке. Терминальный цистеин был введен путем присоединения пептида к белку-носителю.

На фиг. 11 показан Вестерн-анализ белков, концентрированных на гепарин-сефарозе, из кондиционированной среды от культивированных эндотелиальных клеток. Блот зондировали с использованием антисыворотки против ЬЬС. Цифры слева указывают на положение белковстандартов в килодальтонах.

На фиг. 12 показан Вестерн-анализ на белки, связанные с гепарин-сефарозой из кондиционированной среды от клеток СО8-7, кратковременно трансфицированных экспрессирующим вектором, содержащим кДНК для ЬЬСХ или ЬЬСХЬ или не содержащим ДНК (контроль). Белки от РМА-стимулированных эндотелиальных клеток (НСАЕС + РМА) были включены для сравнения размеров. Цифры слева обозначают кажущуюся молекулярную массу основных иммунореактивных белков, определенную путем сравнения с белкамистандартами.

На фиг. 13 показана последовательность РСЯ-продукта кроличьего ЬЬС (ЯЬЬС, 8ЕЦ ΙΌ Νο: 12) и сравнение первичных последовательностей РСЯ-продукта кроличьего ЬЬС и соответствующей последовательности кДНК человека (ЬЬС7742А). Идентичные нуклеотиды заштрихованы.

На фиг. 14 проиллюстрирована фосфолипазная (А) активность ЬРЬ, ΕΤΟΝ и ЬЬСХЬ с использованием фосфатидилхолинового субстрата.

На фиг. 15 проиллюстрирована фосфолипазная (А) активность ЬРЬ, ΕΤΟΝ и ЬЬСХЬ с использованием триолеинового субстрата.

На фиг. 16 показана гибридизация ЬЬС- и ЬРЬ-зондов для геномных ДНК, происходящих от различных видов.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к обнаружению гена, подобного гену липазы (ЬЬС), и к полипептидным продуктам его экспрессии.

Эти полипептидные продукты, члены семейства триацилглицерол-липаз, содержат каталитический домен приблизительно 39 кДа, характерный для семейства триацилглицерол-липаз, на11 пример, имеющий последовательность 8Е0 ΙΌ Νο: 10. В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к полипептиду ΒΕ6Ν, имеющему 354 аминокислот. В своем втором варианте настоящее изобретение относится к полипептиду ББСХБ, содержащему 500 аминокислот и имеющему 43%-ное сходство с липопротеин-липазой человека и 37%-ное сходство с липазой печени человека. Полипептид ББСХБ обладает фосфолипазной (А) активностью.

Авторами настоящего изобретения была выделена неполная кДНК из мРНК клеток ТНР1, которые были обработаны форболовым сложным эфиром и окисленными ЛНП. После 5'ЯАСЕ-удлинения этой неполной кДНК, была выделена более мелкая альтернативно сплайсированная кДНК. Вторая более крупная кДНК была выделена из кДНК-библиотеки плаценты человека.

Нозерн-анализ показал, что ген ББС экспрессируется в эндотелиальных клетках. Антисыворотка, продуцированная против пептида, предсказанного исходя из открытой рамки считывания кДНК, позволила обнаружить белки ожидаемых размеров для ΕΕ6Ν и ББСХБ в кондиционированной среде от культивированных эндотелиальных клеток. Обработка эндотелиальных клеток форболовыми сложными эфирами приводит к повышенному продуцированию ЕБС как на уровне мРНК, так и на уровне белков. Этот белок является первым членом семейства триацилглицерол-липаз, который, как было обнаружено, экспрессируется эндотелиальными клетками.

А. Определения

Ниже приводится определение терминов, используемых в описании настоящего изобретения, которое может быть полезным для понимания существа и применения настоящего изобретения.

Полипептид представляет собой полимерное соединение, состоящее из ковалентно связанных аминокислотных остатков. Аминокислоты имеют следующую общую структуру: н I

Н — С — СООН

I ΝΗ;

Аминокислоты были подразделены на семь групп в соответствии со своими боковыми цепями Я: (1) алифатические боковые цепи, (2) боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (ОН), (3) боковые цепи, содержащие атомы серы, (4) боковые цепи, содержащие кислотные или амидные группы, (5) боковые цепи, содержащие основные группы, (6) боковые цепи, содержащие ароматическое кольцо, и (7) пролин, аминокислота, в которой боковая цепь связана с аминогруппой.

Белок представляет собой полипептид, который играет определенную структурную или функциональную роль в живой клетке.

Полипептиды и белки настоящего изобретения могут быть гликозилированными или негликозилированными.

Термин гомология означает сходство последовательностей, отражающее их общее эволюционное происхождение. Считается, что полипептиды или белки имеют гомологию или сходство, если значительное число их аминокислот является либо (1) идентичными, либо (2) имеют химически подобную боковую цепь Я. Считается, что нуклеиновые кислоты имеют гомологию, если значительное число их нуклеотидов являются идентичными.

Выделенный полипептид или выделенный белок представляет собой полипептид или белок, который, в основном, не содержит тех соединений, которые обычно ассоциируются с ними в природных условиях (например, другие белки или полипептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды). Термин выделенный не означает, что он исключает искусственные или синтетические смеси с другими соединениями или присутствия примесей, которые не влияют на биологическую активность и которые могут присутствовать, например, из-за неполной очистки, добавления стабилизаторов или изготовления фармацевтически приемлемых препаратов.

Молекула является антигенной, если она способна специфически взаимодействовать с ангигенраспознающей молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор для Т-клеточного антигена. Антигенный полипептид содержит, по крайней мере, около 5, а предпочтительно, по крайней мере, около 10 аминокислот. Антигенный участок молекулы может быть тем участком, который является иммунодоминантным для антитела или для распознавания Т-клеточного рецептора, либо он может быть участком, используемым для продуцирования антитела к данной молекуле путем конъюгирования антигенного участка с молекулой-носителем для иммунизации. Молекула, которая является антигенной, необязательно должна быть сама иммуногенной, то есть, способной индуцировать иммунный ответ в отсутствии носителя.

Полипептид ББС№' и белок ББС№' означают полипептид, включающий последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 6, где указанный полипептид является гликозилированным или негликозилированным.

Полипептид ББСХБ и белок ББСХБ означают полипептид, включающий последовательность 8ЕО ΙΌ Νο: 8, где указанный полипептид является гликозилированным или негликозилированным.

ББС-полипептид, в основном, относится как к полипептиду ΕΕΟΝ. так и к полипептиду

ББСХБ.

ББС-полипептидом или белком настоящего изобретения является любой аналог, фраг13 мент, производное или мутант, который происходит от ЬЬС-полипептида и который сохраняет, по крайней мере, одно биологическое свойство ЬЬС-полипептида. В природе существуют различные варианты ЬЬС-полипептида. Эти варианты могут быть аллельными вариантами, характеризующимися различиями нуклеотидных последовательностей структурного гена, кодирующего данный белок, либо они могут отличаться по сплайсингу или по посттрансляционной модификации. Каждый специалист может самостоятельно получить варианты, имеющие одно или множество аминокислотных замен, делеций, добавлений или перестановок. Такими вариантами могут быть, 1п(сг аНа, (а) варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотами, (Ь) варианты, в которых одна или несколько аминокислот добавлены к ЬЬС-полипептиду, (с) варианты, в которых одна или несколько аминокислот включают замещающую группу, и (б) варианты, в которых ЬЬС-полипептид соединен с другим полипептидом, таким как сывороточный альбумин. Другими ЬЬС-полипептидами настоящего изобретения являются варианты, в которых аминокислотные остатки, происходящие от одного вида, заменены на соответствующие аминокислотные остатки от другого вида либо в консервативных, либо в неконсервативных положениях. В другом варианте осуществления изобретения аминокислотные остатки в неконсервативных положениях заменены консервативными или неконсервативными остатками. Способы получения этих вариантов, включая генетические (суппрессии, делеции, мутации, и т.п.), химические и ферментативные способы, известны каждому среднему специалисту.

Если такие аллельные варианты, аналоги, фрагменты, производные, мутанты и модификации, включая альтернативные формы мРНКсплайсинга и альтернативные формы посттрансляционной модификации, приводят к продуцированию производных ЬЬС-полипептида, которые сохраняют любые из биологических свойств этого ЬЬС-полипептида, то все они входят в объем настоящего изобретения.

Нуклеиновая кислота представляет собой полимерное соединение, состоящее из ковалентно связанных субъединиц, называемых нуклеотидами. Нуклеиновыми кислотами является полирибонуклеиновая кислота (РНК) и полидезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), обе из которых могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. ДНК может представлять собой кДНК, геномную ДНК, синтетическую ДНК и полусинтетическую ДНК. Последовательность нуклеотидов, которая кодирует белок, называется смысловой последовательностью.

Антисмысловая нуклеиновая кислота представляет собой последовательность нуклео тидов, которая комплементарна смысловой последовательности. Антисмысловая последовательность может быть использована для ингибирования или блокирования экспрессии полипептида, кодированного смысловой цепью.

Термин выделенная нуклеиновая кислота означает нуклеиновую кислоту, которая, в основном, не содержит соединений, обычно ассоциирующихся с ней в природных условиях. Термин выделенный не означает, что он исключает искусственные или синтетические смеси с другими соединениями или присутствия примесей, которые не влияют на биологическую активность и которые могут присутствовать, например, из-за неполной очистки, добавления стабилизаторов или изготовления фармацевтически приемлемых препаратов.

Фраза нуклеиновая кислота, которая гибридизируется в условиях высокой жесткости означает, что гибридизированные нуклеиновые кислоты способны выдерживать промывку в условиях высокой жесткости. Примером промывки в условиях высокой жесткости для гибридов ДНК-ДНК является промывка 0,1 х ЗЗС, 0,5% ДСН при 68°С. Специалистам известны и другие промывки в условиях высокой жесткости.

Термин регуляторная область означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию нуклеиновой кислоты. Регуляторная область может включать последовательности, которые по своей природе ответственны за экспрессию конкретной аминокислоты (гомологичная область), или она может включать последовательности различного происхождения (ответственные за экспрессию различных белков или даже синтетических белков). В частности, такими последовательностями могут быть последовательности эукариотических генов или вирусных генов или производные от них последовательности, стимулирующие или подавляющие транскрипцию гена специфическим или неспецифическим способом и индуцируемым или не индуцируемым способом. Регуляторные области включают участки инициации репликации, сайты сплайсинга РНК, энхансеры, последовательности терминации транскрипции, сигнальные последовательности, которые направляют полипептид по секреторному пути в клетки-мишени, и промоторы.

Регуляторная область из гетерологичного источника представляет собой регуляторную область, которая в природных условиях не ассоциируется с экспрессируемой нуклеиновой кислотой. К гетерологичным регуляторным областям относятся регуляторные области особей другого вида, регуляторные области другого гена, гибридные регуляторные последовательности и регуляторные последовательности, которые не встречаются в природе, но которые были сконструированы искусственно.

Термин вектор означает любую последовательность, предназначенную для переноса нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетку-хозяина. Термин вектор включает векторы вирусного и невирусного происхождения, используемые для введения нуклеиновой кислоты в прокариотическую или эукариотическую клетку ίη νίίτο, ех νΐνο или ίη νΐνο. Векторами невирусного происхождения являются плазмиды, липосомы, липиды с электрическим зарядом (цитофектины), комплексы ДНК-белок и биологические полимеры. Вирусными векторами являются ретровирусы, аденоассоциированные вирусы, векторы на основе поксвирусов, бакуловирусов, вирусов коровьей оспы, вирусов простого герпеса, вирусов Эпштейна-Барра и аденовирусов. Помимо нуклеиновой кислоты настоящего изобретения вектор может также содержать одну или несколько регуляторных областей и/или селективные маркеры, используемые для отбора, измерения и мониторинга результатов переноса нуклеиновой кислоты (переноса в ткани, продолжительности экспрессии и т. п.).

Рекомбинантная клетка представляет собой клетку, содержащую нуклеиновую кислоту, которая в природных условиях не присутствует в данной клетке. Термин рекомбинантная клетка включает высшие эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, низшие эукариотические клетки, такие как дрожжевые клетки, прокариотические клетки, и архебактериальные клетки.

Фармацевтически приемлемый носитель включает разбавители и наполнители, которые являются фармацевтически приемлемыми для данного способа введения и стерильными и могут представлять собой водные или масляные суспензии, изготовленные с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Выбор конкретного фармацевтически приемлемого носителя и отношения содержания активного соединения к содержанию этого носителя определяется растворимостью и химическими свойствами композиции, конкретным способом введения и стандартной фармацевтической практикой.

Липаза представляет собой белок, который может ферментативно расщеплять липидный субстрат.

Фосфолипаза представляет собой белок, который может ферментативно расщеплять фосфолипидный субстрат.

Триацилглицерол-липаза представляет собой белок, который может ферментативно расщеплять триацилглицеридный субстрат.

Фосфатидилхолин представляет собой глицеринсодержащий фосфолипид, имеющий следующую структуру:

о

А—с—о-сн, , I

0~° ?^Н ί? ₊

О Н₂с—О—р—О—СНг—СН, 1Ч(СН₃)₃

О где Я и Я' представляют углеводородные боковые цепи жирных кислот. Фосфатидилхолин также известен как лецитин.

Термин липидный профиль означает серию концентраций холестерина, триглицерида, липопротеинового холестерина и других липидов в организме человека или животного.

Нежелательный липидный профиль представляет собой состояние, при котором концентрации холестерина, триглицерида, или липопротеинового холестерина находятся вне стандартных пределов, определенных для данного возраста и пола. Обычно, нежелательным липидным профилем считаются концентрации общего холестерина > 200 мг/дл, триглицеридов плазмы > 200 мг/дл, холестерина ЛНП > 130 мг/дл, холестерина ЛВП < 39 мг/дл или отношения общего холестерина к холестерину ЛВП > 4,0. Нежелательный липидный профиль ассоциирован с рядом патологических состояний, включая гиперлипидемию, диабетическую гиперхолестеринемию, атеросклероз и другие формы ишемической болезни сердца.

В. Полипептиды

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые являются членами семейства триацилглицерол-липаз и которые включают каталитический 39 кДа-домен семейства триацилглицерол-липаз, например домен, имеющий последовательность 8Е0 ГО Νο: 10. Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является выделенный БЕС-полипептид. содержащий последовательность 8Е0 ГО Νο: 6 и имеющий кажущуюся молекулярную массу около 40 кДа на 10% ПААГ-ДСН-геле. Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является выделенный ЬЕО-полипептид, содержащий последовательность 8Е0 ГО Νο: 8 и имеющий кажущуюся молекулярную массу около 55 кДа или 68 кДа на 10% ПААГ-ДСНгеле.

Полипептиды и белки настоящего изобретения могут быть рекомбинантными полипептидами, природными полипептидами или синтетическими полипептидами и могут происходить от человека, кролика или от других животных. Эти полипептиды характеризуются репродуцируемыми одной молекулярной массой и/или множеством молекулярных масс хроматографическими реакциями и профилями элюции, аминокислотным составом и аминокислотной последовательностью, а также биологической активностью.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть выделены из природных источников, таких как экстракты плаценты, плазма человека или кондиционированные среды от культивированных клеток, таких как макрофаги или эндотелиальные клетки, с использованием процедур очистки, хорошо известных специалистам.

Альтернативно, полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием метода рекомбинантных ДНК, который предусматривает встраивание нуклеиновой кислоты, кодирующей данный полипептид, в подходящий вектор, введение полученного вектора в подходящую клетку-хозяин, выделение полипептида, продуцированного полученной клеткой-хозяином, и очистку этого выделенного полипептида.

С. Нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, которые кодируют ЬЬб-полипептиды.

Настоящее изобретение также относится к антисмысловым нуклеиновым кислотам, которые могут быть использованы для супрессии или блокирования экспрессии ЬЬС-полипептидов ίη νίίτο, ех νίνο или ίη νίνο.

Техника рекомбинантных ДНК известна каждому специалисту в этой области. Общие методы клонирования и экспрессии рекомбинантных молекул описаны в руководстве Маηίαΐίδ (Мо1еси1аг Οοηίη§. Со1б 8ртшд НатЬот ЬаЬотаШпек, 1982) и Аи8иЬе1 (СштеЫ РюЮ^Е ίη ΜοΕ^^ ВюЕду, ГС Псу ηηά δοηκ, 1987), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения могут быть соединены с одной или несколькими регуляторными областями. Выбор соответствующей регуляторной области или регуляторных областей представляет собой рутинный метод, доступный каждому среднему специалисту. Регуляторные области включают промоторы и могут включать энхансеры, супрессоры и т.п.

Промоторами, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются конститутивные промоторы и регулируемые (индуцибельные) промоторы. Эти промоторы могут быть прокариотическими или эукариотическими в зависимости от хозяина. Прокариотическими промоторами (включая бактериофаговые промоторы), которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения, являются 1ас1, 1ас2, Т3, Т7, лямбда Р_г, Р₁, и ίτρпромоторы. Эукариотическими промоторами (включая вирусные промоторы), которые могут быть использованы в целях настоящего изобретения, являются конститутивные промоторы (например, промоторы НРК.Т, виментина, актина, тубулина); промоторы промежуточных филаментов (например, промоторы десмина, нейрофиламентов, кератина, СЕАР); промоторы терапевтических генов (например, типа МЭР, СРТК, фактора VIII); тканеспецифические промоторы (например, промотор актина в клетках гладких мышц или промоторы Е11 и Р1к, активные в эндотелиальных клетках); промоторы, которые преимущественно активируются в делящихся клетках; промоторы, которые восприимчивы к стимуляторам (например, рецептор стероидного гормона, рецептор ретиноевой кислоты); регулируемые тетрациклином модуляторы транскрипции; предранние промоторы цитомегаловируса; длинные концевые повторы (ЬТВ) ретровирусов; промоторы металлотионеина; промоторы 8ν40; промоторы Е1а; и промоторы МЬР. Регулируемые тетрациклином модуляторы транскрипции и промоторы СΜV описаны в ГСО 96/01313, в патентах США 5168062 и 5385839, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предпочтительно, чтобы вирусные векторы, используемые в генной терапии, были дефектными по репликации, то есть предпочтительно, чтобы они были неспособны автономно реплицироваться в клетках-мишенях. В основном в геноме дефектных по репликации вирусных векторов, которые используются в настоящем изобретении, отсутствует, по крайней мере, одна область, необходимая для репликации вируса в инфицированных клетках. Эти области могут быть либо элиминированы (полностью или частично), либо сделаны не функциональными известными способами. Эти способы предусматривают полное удаление, замену (другими последовательностями, в частности инсертированной нуклеиновой кислотой), частичную делецию или добавление одного или нескольких оснований к главной (для репликации) области. Эти способы могут быть осуществлены ίη νίίτο (на выделенной ДНК) или ίη δίΐιι с использованием техники модификации генов или путем обработки мутагенными агентами.

При этом предпочтительно, чтобы дефектный по репликации вирус сохранял последовательности своего генома, необходимые для образования капсида вирусных частиц.

Ретровирусы представляют собой интегрирующиеся вирусы, которые инфицируют делящиеся клетки. Геном ретровируса включает два ЬТВ (длинных концевых повтора), последовательность, ответственную за образование капсида, и три кодирующих области (дад, ρο1 и ему). Было описано конструирование рекомбинантных ретровирусных векторов: см., в частности, ЕР 453242, ЕР 178220, Ветйсш е1 а1., Сенек Епд. 7 (1985) 235; Мс^тЦк, ВюТесйгюкду 3 (1985) 689 и т.п. В рекомсинантных ретровирусных векторах гены дад, ρο1 и спу обычно делетированы полностью или частично и заменены нужной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Эти векторы могут быть сконструированы из ретровирусов различных типов, таких как ΜοΜи^V (мышиный вирус лейкоза Молони), М!^ (мышиный вирус саркомы Молони), Η;·ι8ν (вирус сарко мы Харвея); 8Νν (вирус некроза селезенки); К8У (вирус саркомы Рауса) и вируса Фрейнда.

В основном, для конструирования рекомбинантных ретровирусов, содержащих последовательность, кодирующую ЬЬС-полипептид настоящего изобретения, была сконструирована плазмида, которая содержит ЬТК, последовательность, ответственную за образование капсида, и кодирующую последовательность. Эту конструкцию использовали для трансфекции упаковывающей клеточной линии, которая способна обеспечивать в транс-положении ретровирусные функции, отсутствующие в плазмиде. Таким образом, упаковывающие клеточные линии в основном способны экспрессировать гены дад, ро1 и епу. Такие упаковывающие клеточные линии были описаны ранее, а в частности клеточная линия РАЗ 17 (И84861719), клеточная линия Ρδίί,’ΚΙΡ (ГСО 90/02806) и клеточная линия 6Р+епу Ат-12 (ГСО 89/07150). Кроме того, рекомбинантные ретровирусные векторы могут содержать модификации в ЬТК для ингибирования транскрипционной активности, а также удлиненные последовательности, ответственные за образование капсида, которые могут включать часть гена дад (Вепйет е1 а1., 1. νίτοί, 61 (1987) 16З9). Рекомбинантные ретровирусные векторы очищают с помощью стандартных методик, хорошо известных специалисту.

Аденоассоциированными вирусами (ААВ) являются ДНК-содержащие вирусы относительно небольшого размера, которые могут интегрироваться стабильным и сайт-специфическим способом в геном клеток, которые они инфицируют. Эти вирусы способны инфицировать широкий спектр клеток без индуцирования какоголибо воздействия на рост, морфологию или дифференцировку клеток, и они, очевидно, не вызывают каких-либо патологий у человека. Геном ААВ был клонирован, секвенирован и охарактеризован. Он содержит приблизительно 4700 оснований и содержит область инвертированных концевых повторов (ГТК) приблизительно в 145 оснований на каждом конце, которая является областью инициации репликации вируса. Остальная часть генома делится на две основные области, несущие функции образования капсида: левостороннюю часть генома, которая содержит ген гер, участвующий в репликации вируса и экспрессии вирусных генов; и правостороннюю часть генома, которая содержит ген сар, кодирующий капсидные белки вируса.

Использование векторов, происходящих от ААВ, для переноса генов ίη νίίτο и ίη νίνο описано в работах (см. ГСО 91/18088, ГСО 93/09239; патенты США 4797368; 5139941, ЕР 488528). В этих публикациях описаны различные происходящие от ААВ конструкции, в которых гены гер и/или сар были делегированы и заменены нужным геном, а также использование этих конструкций для переноса указанного нужного гена ίη νίίτο (в культивированные клетки) или ίη νίνο (непосредственно в организм). Дефектные по репликации рекомбинантные ААВ настоящего изобретения могут быть получены путем котрансфекции плазмиды, содержащей нужную последовательность нуклеиновой кислоты, фланкированную двумя областями инвертированных концевых повторов (ГТК) ААВ, и плазмиды, несущей гены, ответственные за образование капсида ААВ (гены гер и сар), в клеточную линию, инфицированную человеческим вирусом-помощником (например аденовирусом). Затем продуцированные рекомбинанты ААВ очищают стандартными методами. Следовательно настоящее изобретение относится к производному от ААВ рекомбинантному вирусу, геном которого охватывает последовательность, кодирующую ЕЬС-полипептид, фланкированный ААВ-ГТК. Настоящее изобретение также относится к плазмиде, включающей последовательность, кодирующую ЬЬС-полипептид, фланкированный двумя ГТК от ААВ. Такая плазмида также может быть использована для переноса последовательности ЬЬС, причем эта плазмида, если это необходимо, может быть введена в липосомный вектор (псевдовирус).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения таким вектором является аденовирусный вектор.

Аденовирусы представляют собой эукариотические ДНК-вирусы, которые могут быть модифицированы для доставки нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в клетки различных типов.

Существуют различные серотипы аденовирусов. Из этих серотипов, с точки зрения настоящего изобретения, предпочтительно использовать аденовирусы человека типа 2 или 5 (Ай2 или Ай5) или аденовирусы, происходящие от животных (см. ГСО 94/26914). Такими аденовирусами животного происхождения, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, являются аденовирусы собак, коров, мышей (например, Мау1, Веатй е1 а1., νίΐΌΐοβν 75 (1990) 81), овец, свиней, птиц и обезьян (например, 8АУ). Предпочтительными аденовирусами, происходящими от животных, являются аденовирусы собак, более предпочтительно аденовирус САУ2 (например, штамм Манхэттен) или штамм А26/61 (например, АТСС УК-800).

Предпочтительные дефектные по репликации аденовирусные векторы настоящего изобретения содержат ГТК, последовательность образования капсида и нужную нуклеиновую кислоту. Еще более предпочтительно чтобы, по крайней мере, область Е1 аденовирусного вектора была нефункциональной. При этом предпочтительно, чтобы делеция в области Е1 охватывала область от нуклеотида 455 до нуклеотида 3329 в последовательности аденовируса Ай5. Могут быть также модифицированы другие области, в частности область Е3 (ГСО 95/02697), область Е2 (№0 94/28938), область Е4 (№0 94/28152, №0 94/12649 и №0 95/02697) или область в любом из поздних генов Е1-Ь5. Дефектные ретровирусные векторы описаны в №0 95/02697.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения аденовирусный вектор имеет делецию в областях Е1 и Е4. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения аденовирусный вектор имеет делецию в области Е1, в которую были встроены область Е4 и последовательность, кодирующая ЬЬС (см. ЕВ 9413355).

Дефектные по репликации рекомбинантные аденовирусы настоящего изобретения могут быть получены любым способом, известным специалистам (Ьеутего с1 а1., Сепе 101 (1991) 195, ЕР 185573; Сгайат, ЕМВ0 1., 3 (1984) 2917). В частности, они могут быть получены путем гомологичной рекомбинации между аденовирусом и плазмидой, которая содержит ш1ет айа нужную ДНК-последовательность. Эта гомологичная рекомбинация осуществляется после котрансфекции указанного аденовируса и плазмиды в соответствующую клеточную линию. Используемая клеточная линия должна быть предпочтительно (1) трансформируемой указанными элементами и (ίί) содержать последовательности, комплементарные части генома, дефектного по репликации аденовируса, предпочтительно в интегрированной форме для устранения риска рекомбинации. Примерами клеточных линий, которые могут быть использованы, являются почечная клеточная линия эмбриона человека 293 (Сгайат е1 а1., 1. Сеп. νίτοί. 36 (1977) 59), которая содержит левостороннюю часть генома аденовируса Аб5 (12%), интегрированную в ее геном, и клеточные линии, способные к комплементации функций Е1 и Е4, как описано в заявках №0 94/26914 и №0 95/02697. Рекомбинантные аденовирусы выделяли и очищали с использованием стандартных методов молекулярной биологии, хорошо известных каждому специалисту.

Ингибирование экспрессии гена с использованием антисмысловых нуклеиновых кислот может быть достигнуто на трансляционном или транскрипционном уровне. Антисмысловые нуклеиновые кислоты настоящего изобретения предпочтительно представляют собой фрагменты нуклеиновых кислот, способных специфически гибридизироваться со всей или с частью нуклеиновой кислоты, кодирующей ЬЬС или соответствующую информационную РНК. Эти антисмысловые нуклеиновые кислоты могут представлять собой синтетические олигонуклеотиды, необязательно модифицированные для повышения их стабильности и селективности. Они могут также представлять собой ДНКпоследовательности, экспрессия которых в клетке приводит к продуцированию РНК, комплементарной всей или части мРНК ЬЬС. Анти смысловые нуклеиновые кислоты могут быть получены путем экспрессии всей или части последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ Νο: 2, 8Е0 ΙΌ Νο: 3, 8Е0 ΙΌ Νο: 7 или 8Е0 ΙΌ Νο: 11, и находящейся в противоположной ориентации, как описано в ЕР 140308. Для осуществления настоящего изобретения подходящей является антисмысловая последовательность любой длины при условии, что она способна ингибировать или блокировать экспрессию ЬЬС. Предпочтительно, чтобы длина антисмысловой последовательности составляла, по крайней мере, 20 нуклеотидов. Получение и использование антисмысловых нуклеиновых кислот, ДНК, кодирующих антисмысловые РНК, и использование олиго- и генных антисмысловых последовательностей описано в заявке №0 92/15680, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Ό. Антитела

Настоящее изобретение относится к антителам против ЕЬС-полипептида. Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными антителами. Настоящее изобретение включает химерные, одноцепочечные, гуманизированные антитела, а также Еай-фрагменты и продукты библиотеки экспрессируемых Еайфрагментов.

Могут быть получены поликлональные антитела против антигенного фрагмента ЬЬСполипептида, как описано в примере 4А. Могут быть также продуцированы антитела против интактного ЬЬС-белка или полипептида, либо против фрагмента, производного или эпитопа этого белка или полипептида. Антитела могут быть продуцированы после введения белка, полипептида, фрагмента, производного или эпитопа животному с использованием техники и процедур, известных специалистам.

Моноклональные антитела могут быть получены методом М|кйе11. В.В., е1 а1., 8е1ес1еб Мебюбк ίη Се11и1аг Iттиηο1οду (№.Н. Егеетап, еб.) 8ап Етали^ (1980). Для этого, полипептид настоящего изобретения используют для иммунизации клеток селезенки мышей ВАЕВ/с. Иммунизированные клетки селезенки подвергают слиянию с миеломными клетками. Слитые клетки, обладающие свойствами клетки селезенки и миеломной клетки, выделяют путем культивирования в среде НАТ, то есть в среде, на которой обе родительские клетки погибают, но продукты слитых клеток выживают и растут.

Моноклональные антитела настоящего изобретения могут быть гуманизированы для предотвращения вырабатывания у хозяина иммунного ответа на эти антитела. Гуманизированное антитело представляет собой антитело, в котором гипервариабельные области (определяющие комплементарность области - СИВ) и/или другие области каркасных вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепи являются производными иммуноглобулина, отличного от человеческого, а остальные участки молекулы происходят от одного или нескольких иммуноглобулинов человека. Гуманизированными антителами также являются антитела, характеризующиеся тем, что у них гуманизированная тяжелая цепь ассоциирована с донорной или акцепторной немодифицированной легкой цепью или с химерной легкой цепью, или наоборот. Гуманизирование антител может быть осуществлено методами, известными специалистам (см., например, С.Е. Магк & Е.А. Раб1ап, СЬар1ет 4. ΗιιιηαηίζαΙίοη о£ Мопос1опа1 АпйЬоб1ек, Тйс НапбЬоок о£ Ехрептеп1а1 РЬагтасо1оду Уо1. 113, 8ргшдег-Уег1ад, №\ν Уотк, 1994). Для продуцирования гуманизированных антител могут быть использованы трансгенные животные.

Для продуцирования одноцепочечных антител против иммуногенных полипептидов и белков настоящего изобретения могут быть приспособлены методики, известные специалистам и используемые для продуцирования одноцепочечных антител.

Антитела против ЕЬС могут быть использованы в анализах для обнаружения или для количественной оценки уровней ЕЬС. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, эти анализы позволят проводить клиническую диагностику и оценку уровней ЬЬС на различных стадиях заболевания и осуществлять мониторинг эффективности лечения.

Е. Методы скрининга для выявления агонистов или антагонистов

Настоящее изобретение относится к способам скрининга библиотек небольших молекул или источников природных продуктов для выявления агонистов (энхансеров или коактиваторов, включая белковые коактиваторы) или антагонистов (ингибиторов) ЕЬСХЕ-активности. Предполагаемый агонист или антагонист подвергают контакту с белком ЬЬСХЕ и субстратом ЬЬСХЕ и оценивают способность предполагаемого агониста или антагониста усиливать или ингибировать активность ЬЬСХЕ.

Белок ЬЬСХЬ, используемый в данном способе, может быть продуцирован рекомбинантным методом в ряде клеток-хозяев, включая клетки млекопитающих (как показано в примере 7), клетки, инфицированные бакуловирусом, дрожжи и бактерии. Экспрессия ЬЬС в стабильно трансфицированных клетках СНО может быть оптимизирована путем метотрексатамплификации этих клеток. Белок ЬЬСХЬ может быть также выделен из природных источников, таких как плазма человека, плацентарные экстракты или кондиционированная среда от культивированных эндотелиальных клеток, клеток ТНР-1 или макрофагов.

Оптимизация аналитических параметров, включая рН, концентрацию ионов, температуру, концентрацию субстрата и условия эмульгиро вания может быть проведена эмпирически любым специалистом.

Жирнокислотные заместители субстратов могут варьироваться по длине цепи, а также по степени и положению ненасыщенности. Субстраты могут быть помечены радиоактивной меткой в любом из нескольких положений. Фосфолипидные субстраты, такие как фосфатидилхолин, могут быть подвергнуты радиоактивному мечению, например в положении жирных кислот 8п-1 или 8п-2, или в глицериновой, фосфатной или полярной головной группе (холин в случае фосфатидилхолина) .

В качестве альтернативы радиоактивным субстратам в методах скрининга могут быть также использованы и другие классы меченых субстратов, такие как флуоресцентные субстраты или тиосодержащие субстраты.

Флуоресцентные субстраты являются особенно подходящими для использования в анализах скрининга, поскольку в этом случае ферментативный катализ может оцениваться непрерывно путем измерения интенсивности флуоресценции, не прибегая к физическому отделению (экстракции) продуктов от субстратов. Примером флуоресцентного фосфатидилхолинового субстрата является СЦВЭ-РС-1-ацил-2[6-(нитро-2,1,3-бензоксадиазол-4-ил)амино]капроилфосфатидилхолин.

Тиосодержащими субстратами являются 1,2-бис(гексаноилтио)-1,2-дидезокси-кп-глицеро-3-фосфорилхолин (ЬЭ. Веупо1бк, ЭД.К ЭДакЬЬигп, В.А. Эеетк, & Е.А. Эепшк, 1991, Мебюбк ш Еηζуто1оду 197: 3-23; Ь. Уи & Е.А. Эепшк, 1991, Мебюбк ш Еηζуто1оду 197:65-75; Ь.А. ЭДШепаиег, К. 8Ыта1, КЬ. 1асккоп & Ю. 1оЬпкоп, 1984, ВюсЬет. ВюрЬук. Век. Соттип. 118: 894-901).

Б. Гидролиз сложных эфиров фофсфатидилхолина

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного гидролиза сложных эфиров фофсфатидилхолина, например, для промышленной или пищевой обработки или для получения моющих средств для стирки белья. Полипептиды настоящего изобретения могут быть использованы для гидролиза сложных эфиров фофсфатидилхолина в растворе либо эти ферменты могут быть связаны с твердым носителем, который может быть затем подвергнут контакту с субстратом. Этот метод может быть использован для продуцирования лизофосфолипидов и свободных жирных кислот.

С. Композиции

Настоящее изобретение относится к композициям в биологически совместимом растворе, включающем полипептиды, нуклеиновые кислоты, векторы и антитела настоящего изобретения. Биологически совместимый раствор представляет собой раствор, в котором полипептид, нуклеиновая кислота, вектор или антитело настоящего изобретения поддерживаются в активной форме, например в форме, благоприятствующей для осуществления биологической активности. Так, например, полипептид настоящего изобретения должен обладать фосфолипазной активностью, нуклеиновая кислота должна быть способной к репликации и к трансляции транскрипта, или гибридизироваться с комплементарной нуклеиновой кислотой; вектор должен быть способен трансфицировать клетку-мишень; а антитело должно связываться с полипептидом настоящего изобретения. В основном таким биологически совместимым раствором является водный буфер, например Трис, фосфат или буфер НЕРЕ8, содержащий ионы соли. Обычно, концентрация ионов соли аналогична физиологическим уровням. В конкретном варианте осуществления изобретения биологически совместимый раствор представляет собой фармацевтически приемлемую композицию. Биологически совместимые растворы могут включать стабилизирующие агенты и консерванты.

Такие композиции могут быть изготовлены для местного перорального, парентерального, интраназального, подкожного и внутриглазного введения. Под парентеральным введением подразумевается внутривенная инъекция, внутримышечная инъекция, внутриартериальная инъекция или инфузия. Данная композиция может быть введена парентерально в виде готовых лекарственных форм, содержащих стандартные, хорошо известные нетоксичные физиологически приемлемые носители, адъюванты и наполнители, если это необходимо.

Предпочтительными стерильными инъецируемыми препаратами могут быть раствор или суспензия в нетоксичном парентерально приемлемом растворителе или разбавителе. Примерами фармацевтически приемлемых носителей являются физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, изотонический физиологический раствор (например, однозамещенный фосфат натрия, двузамещенный фосфат натрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния или смеси этих солей), раствор Рингера, декстроза, вода, стерильная вода, глицерин, этанол и их комбинации. Обычно в качестве растворителей или суспендирующих сред используют 1,3-бутандиол и стерильные жирные масла. Для этой цели может быть использовано любое мягкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. В препаратах для инъекций могут быть также использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Средой для композиций может быть также гидрогель, который получают из любого биологически совместимого или нетоксичного (гомоили гетеро-) полимера, такого как гидрофильный полимер полиакриловой кислоты, который может действовать как губка, абсорбирующая лекарственное средство. Такие полимеры были описаны, например, в заявке \¥О 93/08845, содержание которой вводится в настоящее описание посредством ссылки. Некоторые из них, в частности такие как полимеры, получаемые из этилена и/или окиси пропилена, являются коммерчески доступными. Гидрогель может быть осажден непосредственно на поверхность обрабатываемой ткани, например, во время хирургического вмешательства.

В другом предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающий дефектный по репликации рекомбинантный вирус и полоксамер. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей дефектный по репликации рекомбинантный вирус, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ЬЕС-полипептид, и полоксамер. Предпочтительным полоксамером является полоксамер 407, который имеется в продаже (ВА8Б, Рагарраиу, N1), а наиболее предпочтительным является нетоксичный биологически совместимый многоатомный спирт. Полоксамер, пропитанный рекомбинантным вирусом, может быть осажден непосредственно на поверхности обрабатываемой ткани, например, во время хирургического вмешательства. Полоксамер обладает в основном теми же преимуществами, что и гидрогель, но при этом он имеет более низкую вязкость.

Н. Способы лечения

Настоящее изобретение относится к способам лечения, предусматривающим введение человеку или другому животному эффективного количества композиции настоящего изобретения.

Эффективные количества композиции могут варьироваться в зависимости от возраста, типа и тяжести состояния пациента, подвергаемого лечению, а также от массы тела, необходимой продолжительности лечения, способа введения и других параметров.

Эффективные количества определяются лечащим врачом и другим квалифицированным медицинским персоналом.

Полипептиды настоящего изобретения вводят в основном в дозах, составляющих от около 0,01 до около 100 мг/кг, предпочтительно от около 0,1 до около 50 мг/кг, а наиболее предпочтительно от около 1 до около 10 мг/кг массы тела в день.

Рекомбинантные вирусы настоящего изобретения обычно продуцируют и вводят в дозах от около 10⁴ до около 10¹⁴ б.о.е. В случае ААВ и аденовирусов предпочтительно использовать дозы от около 10⁶ до около 10¹¹ б.о.е. Термин б.о.е (бляшкообразующая единица) соответствует инфекционной способности суспензии вирионов, которая определяется инфекцией соответствующей клеточной культуры, и измеряется числом образованных бляшек. Способы опреде27 ления титра б.о.е вирусного раствора хорошо описаны в литературе.

Настоящее изобретение относится к способам лечения атеросклероза, где указанный атеросклероз является результатом избыточной, аномальной или неадекватной экспрессии ЬЬСполипептидной активности.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения человека или другого животного, имеющего нежелательный липидный профиль, где указанный нежелательный липидный профиль является результатом высокой или неадекватной экспрессии ЬЬСполипептидной активности.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения сахарного диабета, гиперлипидемии, внутрипеченочного холестаза или других метаболических нарушений, где указанные сахарный диабет, гиперлипидемия, внутрипеченочный холестаз или другие метаболические нарушения являются результатом высокой или неадекватной экспрессии ЬЬС-полипептидной активности.

1. Коррекция нежелательных липидных профилей, ассоциированных с повышенной экспрессией ЬЬб-полипептида

Способы снижения экспрессии ЬЬСполипептида для коррекции указанных состояний, где эти состояния или нарушения, ассоциированные с нежелательным липидным профилем, обусловлены ЬЬС-полипептидной активностью, предусматривают, но не ограничиваются, ведение композиции, содержащей антисмысловую нуклеиновую кислоту; введение композиции, содержащей внутриклеточный связывающий белок, такой как антитело; введение композиции, содержащей ЬЬСМ-полипептид или другие фрагменты ЬЬС; и введение композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует ЬЬСМ-полипептид или другой фрагмент ЬЬС.

В одном из вариантов осуществления изобретения композицию, содержащую антисмысловую нуклеиновую кислоту, используют для подавления или блокирования экспрессии ЬЬС. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная нуклеиновая кислота кодирует антисмысловые РНК-молекулы. В этом варианте настоящего изобретения нуклеиновую кислоту правильно соединяют с сигнальными последовательностями, обеспечивающими экспрессию нуклеотидной последовательности, и встраивают в клетку, используя предпочтительно рекомбинантные векторные конструкции, которые способны экспрессировать антисмысловую нуклеиновую кислоту после введения этого вектора в клетку. Примерами подходящих векторов являются плазмиды, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и вирусы герпеса. Предпочтительным вектором является аденовирус. Наиболее предпочтительным вектором является дефектный по реплика ции аденовирус, имеющий делецию в областях вируса Е1 и/или Е3.

В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения экспрессия ЕЬС ингибируется или блокируется посредством экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей внутриклеточный связывающий белок, способный избирательно взаимодействовать с ЕЬС. В заявках ГСО 94/29446 и ГСО 94/02610, содержание которых вводится в настоящее описание посредством ссылки, описана трансфекция клеток генами, кодирующими внутриклеточный связывающий белок. Внутриклеточным связывающим белком является любой белок, способный избирательно взаимодействовать или связываться с ЬЬС в клетке, в которой он экспрессируется, и нейтрализовать функцию связанного ЬЬС. Предпочтительным внутриклеточным связывающим белком является антитело или фрагмент антитела. Более предпочтительным внутриклеточным связывающим белком является одноцепочечное антитело.

В ГСО 94/02610 описаны получение антител и идентификация нуклеиновой кислоты, кодирующей конкретное антитело. С использованием ЬЬС или его фрагмента, специфическое моноклональное антитело может быть получено способами, известными специалистам. Для использования в способе настоящего изобретения может быть затем получен вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую внутриклеточный связывающий белок или его фрагмент, и способный экспрессироваться в клетке-хозяине.

Альтернативно, ЕЬС-активность может быть блокирована путем введения нейтрализующего антитела в кровоток. Это нейтрализующее антитело может быть введено непосредственно в виде белка либо оно может быть экспрессировано из вектора (содержащего секреторный сигнал).

В другом варианте настоящего изобретения ЬЕСХЕ-активность ингибируют путем введения композиции, содержащей полипептид ΚΕ6Ν или другой фрагмент ЬЬС. Эта композиция может быть введена стандартным способом, таким как пероральное, местное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, интраназальное или чрескожное введение. Эта композиция может быть введена непосредственно либо она может быть инкапсулирована (например, в липидной системе, в аминокислотных микросферах или в глобулярных дендримерах). В некоторых случаях этот полипептид может быть присоединен к другому полимеру, такому как сывороточный альбумин или поливинилпирролидон.

В другом варианте настоящего изобретения ЬЕСХЕ-активность ингибируют посредством использования низкомолекулярных соединений, которые подавляют его ферментативные свойства или предотвращают его распознавание клеточными сайтами связывания.

В другом варианте настоящего изобретения ЬЬбХЬ-активность ингибируют путем использования генной терапии, то есть путем введения соединения, содержащего нуклеиновую кислоту, которая кодирует и направляет экспрессию полипептида ΕΕ6Ν или другого фрагмента БЕС.

В конкретном варианте осуществления изобретения ген БЕС настоящего изобретения также обладает сродством к гепарину. ЕБСполипептид, связывающийся с внеклеточным гепарином в полости кровеносных сосудов, позволяет ББС связываться и ускорять поглощение ЛНП, действуя в качестве мостиковой связи между ЛНП и внеклеточным гепарином. Предполагается, что в области локализации атеросклеротических поражений повышенный уровень липазной активности ускоряет атерогенный процесс (2йуегктй, Ό.Β. (1995) С1ш. Сйет. 41, 153-158; 2атЬои, А., Тоггек, А., Вууое!, 8., Садие, С., Моо_)аи1, 8., Еир1еи, Р.Е, Наубеи М.К, & ВгиигеЦ, 6.Ό. (1993) Еапсе! 341, 1119-1121). Это может быть обусловлено повышением уровня связывания и поглощения липопротеинов сосудистой тканью, опосредованным липазами (ЕкеиЬегд, 8., 8ейауек, Е., Ойуесгоиа, Т., У1обаукку, I. (1992) I. Сйи. Шуей., 90, 20132021; ТаЬак, I., Ы, I., Вгоаа В.ЭД., Хи, 8.ЭД., 8^еикои, Т.Б., ЭДййатк, К.1. (1993) I. Вю1. Сйет., 268, 20419-20432; №гбек1даагб, В.,С., & №екеи, А.,С. (1994) Сигг. Орт. Ыр1б. 5, 252257; ЭДййатк, К. б., & ТаЬак, I. (1995) Ай. ТйготЬ. аиб Уакс. Вю1. 15, 551-561). Кроме того, высокий локальный уровень липазной активности может приводить к цитотоксическим уровням жирных кислот и лизофосфатидилхолина, продуцируемого в предшественниках атеросклеротических поражений. Эта конкретная активность БЕС может способствовать развитию или прогрессированию атеросклероза, особенно на фоне избыточных уровней липидов, обусловленных питанием или генетическими факторами. Таким образом, настоящее изобретение позволяет ингибировать аккумуляцию липопротеинов путем ингибирования экспрессии ЕБСполипептида или связывания с липопротеином (например, ЛНП).

2. Коррекция нежелательных липидных профилей, ассоциированных с недостаточной активностью ЕБС-полипептида

Способы повышения экспрессии ББС для коррекции тех состояний, в которых активность ЕБС-полипептида способствует развитию заболеваний или нарушений, ассоциированных с нежелательным липидным профилем, предусматривают, но не ограничиваются, введение композиции, содержащей полипептид ЕЕСХЕ, и введение композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид ЕБСХЕ.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ЕЕСХЕ-активность по вышают путем введения композиции, содержащей полипептид ЕЕСХЕ. Эта композиция может быть введена стандартным способом, таким как пероральное, местное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, интраназальное или чрескожное введение. Эта композиция может быть введена непосредственно либо она может быть инкапсулирована (например, в липидной системе, в аминокислотных микросферах или в глобулярных дендримерах). В некоторых случаях этот полипептид может быть присоединен к другому полимеру, такому как сывороточный альбумин или поливинилпирролидон.

В другом варианте настоящего изобретения ЕЕСХЕ-активность повышают путем использования низкомолекулярных соединений, которые могут усиливать экспрессию ЕЕСХБ на уровне транскрипции, трансляции или после трансляции.

В другом варианте настоящего изобретения уровень ЕЕСХБ повышают путем введения композиции, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует и направляет экспрессию ЕЕСХБ-полипептида.

Внутрипеченочный холестаз может быть охарактеризован как увеличение уровней холестерина и фосфолипида в сыворотке. Недавно сообщалось, что модель внутрипеченочного холестаза у крыс, индуцированного лекарственным средством фаллоидином, продемонстрировала значительное увеличение уровней холестерина и фосфолипида в сыворотке (кЫ/аку К., КтЬага, 8., М1уа7а^а, Ν., ТакеисЫ, Υ., НйаЬауакЫ, Ν., Кака1, Н., & Агакр Т. (1997) Тох1со1. Бейегк 90, 29-34). Продукты настоящего изобретения могут быть использованы для лечения внутрипеченочного холестаза у пациентов с повышенными уровнями холестерина и/или фосфолипида в сыворотке. Кроме того, эта модель с использованием крыс также показала значительное снижение скоростей выведения холестерина с желчью. ЕБС-полипептид и продукты нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для лечения пациентов с нарушениями системы желчевыделения.

Внутрипеченочный холестаз характеризуется как нарушение выделения желчи из печени. Недавно проведенное картирование показало, что локусы для прогрессирующего наследственного внутрипеченочного холестаза (ПНВХ или болезнь Байлера) и доброкачественный рецидивирующий внутрипеченочный холестаз (ДРВХ) находятся на 18с|21-с|22 (Сагйои, У.Е.Н., Кике1у, А.8., & Егешег, КВ. (1995) Нит. Мо1. Сеие! 4, 1049-1053 & Нои^еи, В.Н., Вайаг1оо,

8., В1аикеикЫр, К., Ваеутаекегк, Р., биуи, б., 8аибкиу1, Б.А., & Еге1тег, КВ. (1994) №1Шге Сеие! 8, 380-386, соответственно). Поскольку ген ББС был картирован на этой хромосоме в области 18д21, то ген ББС или продукты на стоящего изобретения могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих внутрипеченочным холестазом, вызванным мутацией или дефектной экспрессией гена (генов), ответственного за заболевание ПНВХ/ДРВХ.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ген ЬЬС или полипептидные продукты этого изобретения могут быть использованы для лечения пациентов, страдающих внутрипеченочным холестазом, не вызываемым дефектом гена, ответственного за заболевание ПНВХ/ДРВХ, в области 18с.|21-с.|22. Недавно проведенные исследования позволили предположить, что другой локус, расположенный за пределами области 18ς21-ς22. может также продуцировать ПНВХ-фенотип (ЗбаШшекк,

8.8., Када1^а11а, А.Р., Таппег, М.З., Сагбтег, К.М. & Тботркоп, В.Е (1996) 1. Меб. СепеР 33, 833-836). Тем не менее, введение ЬЬСполипептида либо непосредственно, либо посредством генной терапии может облегчить состояние, вызываемое этой формой заболевания.

В генной терапии одна или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, а также регуляторные области, контролирующие ее экспрессию, переносят в клетки-мишени человека или другого животного. Этот перенос осуществляют либо ех νίνο способом, в котором нуклеиновую кислоту переносят в клетки в лаборатории, а затем модифицированные клетки вводят человеку или другому животному, либо 1п νίνο способом, в котором нуклеиновую кислоту вводят непосредственно в клетки человека или другого животного. Перенос нуклеиновых кислот может быть осуществлен с использованием либо вирусных, либо невирусных векторов, описанных выше.

Невирусные векторы могут быть перенесены в клетки любыми методами, известными специалистам, включая копреципитацию фосфатом кальция, липофекцию (с использованием синтетических анионных и катионных липосом), опосредованную рецептором доставку гена, инъекцию голой ДНК, электропорацию и доставку методами биобаллистики или ускорения частиц.

Примеры

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами. Эти примеры приводятся только в иллюстративных целях и не ограничивают объем притязаний.

Пример 1. Идентификация дифференциально экспрессированной кДНК

А) Получение РНК

Моноцитарные клетки ТНР-1 человека (Зтбб Р.К., Кгобп, Β..Ι., Негтапкоп, С.Т., МаШа,

А.К., Сайпе г, Р.Н., Ргоуеп/апо, М.И., Рнрто1о, Е.К., Соеке, КМ., Окоп, В.к, апб К1епк, И.С. (1985) Апа1. Вюсбет. 150, 76-85) культивировали в среде ВРМ1-1640 (С1ВСО), содержащей 25 мМ НЕРЕ8, 10% фетальную бычью сыворотку, 100 единиц/мл натрийсодержащего пеницилли на С и 100 единиц/мл сульфата стрептомицина. Клетки высевали в 15 см-чашки для культивирования ткани при концентрации 1,5 х 10⁷ клеток/чашку и обрабатывали 40 нг/мл 12миристат-13-ацетатом форбола (З1дта) в течение 48 ч для индуцирования дифференцировки клеток. Человеческие липопротеины низкой плотности (ЛНП), поставляемые фирмой Са1Ьюсбет, подвергали исчерпывающему диализу против РВ8 при 4°С. Затем ЛНП разводили до 500 мкг/мл и диализовали против 5 мкМ Си8О₄в РВ8 при 37°С в течение 16 ч. Для прекращения окисления ЛНП подвергали исчерпывающему диализу против 150 мМ ИаС1, 0,3 мМ ЕИТА, а затем фильтр стерилизовали. Концентрацию белка определяли методом ВСА (8сбиб,

I., Рабс1оидб, С.Р., апб Наксбетеуег, В.Н.(1978) Ргос. Иаб. Асаб. Зск ИЗА 75, 3173-3177)(Р1егсе). Степень окисления была определена методом ТВАВЗ (Сботс/упккк Р. (1993) Вю1есбпк|ие8 15, 532-537) и составляла 25-30 нмоль эквивалентов МОА/мг белка. Дифференцированные клетки ТНР-1 обрабатывали в течение 24 ч либо 50 мкг/мл окисленного ЛНП, либо №1С4-ЕОТАбуфером в среде ВРМ1, содержащей 10%-ную фетальную бычью сыворотку с дефицитом липопротеина (З1дта). Для сбора РНК чашки промывали 10 мл РВ8, а затем в каждую чашку добавляли 14 мл ТВКОБ Ланд, Р. & Рагбее, А.В. (1992) Заепсе 257, 967-971) (С1ВСО). Раствор несколько раз пипетировали для получения смеси, а затем одинаковые образцы объединяли в центрифужные пробирки, добавляли 3 мл хлороформа на чашку и смешивали. Пробирки центрифугировали в течение 15 мин при 12000 х д. После центрифугирования верхний слой переносили в новую пробирку, а затем добавляли 7,5 мл изопропанола на чашку и смешивали. Пробирки центрифугировали при 12000 х д в течение 20 мин. Осадок после центрифугирования промывали охлажденным на льду 70%-ным этанолом и сушили при комнатной температуре. Осадки суспендировали в 500 мкл ТЕ (ТрисЕИТА) и обрабатывали 200 единицами ДНКазы Ι, не содержащей РНКазы, и 200 единицами РНКазина, плацентарного ингибитора РНКазы, (Рготеда) в течение 30 мин при 37°С. РНК очищали путем последовательной экстракции фенолом, фенолом/хлороформом/изоамиловым спиртом (25:24:1) и хлороформом/изоамиловым спиртом (24:1), а затем осаждали этанолом.

В) Синтез кДНК

Синтез кДНК и РСВ-амплификацию осуществляли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для осуществления метода дифференциального отображения (Об[сгепйа1 Окр1ау Кб, версия 1,0, 01кр1ау Зук1ет8 Вю1есбпо1оду, 1пс.). Эта система основана на методе, впервые описанном Е1апд и Рагбее (Меаб, И.А., Реу, КК., Неггпкйбр С., Магсб, В.А., & Зтбб, б.М. (1991) Вю/Тесбпо1оду 9657-663). Пары праймеров, которые давали кДНК-фрагмент, содержащий первую информацию о гене липазоподобного полипептида, представляли собой прямой праймер 7 и обратный праймер 15. кДНК для амплификации синтезировали как описано ниже, с использованием РНК, происходящей от клеток ТНР-1, обработанных РМА и экспонированных либо буфером, либо окисленным ЛНП: 3 мкл 25 мкМ прямого праймера 7 и

7.5 мкл воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (ПЕРС), добавляли к 300 нг (3,0 мкл) РНК от любого образца РНК ТНР-1. Эту смесь нагревали до 70°С в течение 10 мин, а затем охлаждали на льду. В эту пробирку добавляли 3 мкл 5х РСЯ-буфера (250 мМ Трис-НС1, рН 8,3, 375 мМ КС1) (С1ВСО), 3 мкл 25 мМ МдС1₂, 3 мкл 0,1М ДТТ, 1,2 мкл 500 мкМ 6ΝΤΡ, 0,7 мкл РНКазина, и 5,6 мкл ОЕРС-обработанной воды. Пробирки инкубировали в течение 2 мин при комнатной температуре, после чего добавляли

1.5 мкл (300 единиц) Зирегкспр! II РНКазы Нобратной транскриптазы (С1ВСО). Пробирки инкубировали последовательно при комнатной температуре в течение 2 мин, 60 мин при 37°С и 5 мин при 95°С, а затем охлаждали на льду. РСЯ-амплификацию осуществляли с использованием набора МаЛсг Μίχ, содержащего 117 мкл 10х РСЯ-буфера (500 мМ КС1, 100 мМ Трис-НС1 рН 8,3, 15 мМ МдС1₂, и 0,01% (мас./об.) желатина), 70,2 мкл 25 мМ МдС1₂, 5,9 мкл альфа-³³Р-бАТР (10м Ки/мл. БиРоп! ΝΕΝ), 4,7 мкл 500 мкМ смеси бЭТР, 11 мкл ДНКполимеразы Атр1|-Тас.| (5 единиц/мкл, РегкшЕ1тег) и 493,3 мкл ОЕРС-обработанной воды. Для каждой реакции 12 мкл набора МаЛег Μίχ добавляли к 2 мкл прямого праймера #7, 1 мкл кДНК и 5 мкл обратного праймера #15. Реакционные смеси нагревали до 94°С в течение 1 мин, а затем подвергали 40 термоциклам со стадией денатурации при 94°С в течение 15 с; стадией отжига при 40°С в течение 1 мин и со стадией удлинения при 72°С в течение 30 с. После проведения 40 циклов реакционные смеси инкубировали при 72°С в течение 5 мин и хранили при 10°С. РСЯ-реакции осуществляли в термоячейке СепеАтр 8ук1ет 9600 Регкт-Е1тег.

Четыре микролитра реакционной смеси для амплификации смешивали с равным объемом буфера для загрузки (0,2% бромфенолового синего, 0,2% ксилолцианола, 10 мМ ЕБТА рН 8,0, и 20% глицерина). Четыре микролитра этой смеси подвергали электрофорезу в 6%-ном неденатурирующем акриламидном секвенирующем геле в течение 3 ч при 1200 В (постоянное напряжение). Этот гель сушили при 80°С в течение 1,5 ч и экспонировали с пленкой Кобак ХАЯ. Был идентифицирован амплифицированный продукт, обнаруженный только в реакционной смеси, содержащей кДНК от клеток ТНР-1, обработанных окисленным ЛНП, а затем этот продукт вырезали из геля. В микроцентрифужную пробирку, содержащую вырезанный гелевый фрагмент, добавляли 100 мкл ПЕРС обработанной воды, а затем инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем еще в течение 15 мин при 95°С.

Для проведения повторной амплификации РСЯ-продукта, 26,5 мкл элюированной ДНК использовали в реакции амплификации, которая также включала 5 мкл 10х РСЯ-буфера, 3 мкл 25 мМ МдС1₂, 5 мкл 500 мкМ бЭТР, 5 мкл 2 мкМ прямого праймера 7, 7,5 мкл обратного праймера 15 и 0,5 мкл полимеразы Атр1йас.|. Параметры РСЯ-циклов и оборудование были описаны выше. После амплификации 20 мкл повторно амплифицированной реакционной смеси анализировали на агарозном геле и 4 мкл использовали для субклонирования РСЯ-продуктов в вектор рСЯ11 с использованием системы клонирования ТА (Ргойтап, М.А., Пикй, М.К. & Майш,

С.Я. (1988) Ргос. №11. Асаб. 8οΐ. И8А 85, 89989002) (1пуйгодеи). После лигирования в течение ночи при 14°С лигированные продукты использовали для трансформации Е. сой. Полученные трансформанты собирали и 3 мл ночных культур использовали для приготовления плазмидных минипрепаратов. Размеры вставок определяли с использованием ЕсоЯ1-гидролиза плазмид, и клоны, содержащие вставки, приблизительно размера исходного РСЯ-продукта, секвенировали с использованием реагентовтерминаторов и флуоресцентного красителя (Рпкт, Аррйеб В|о5У51е1П5), и с использованием ДНК-секвенатора Аррйеб ВюкуЫетк 373. Последовательность РСЯ-продукта показана на фиг. 2. Последовательность амплифицированных праймеров подчеркнута.

С) Реакция 5'ЯАСЕ

Удлинение кДНК, идентифицированной посредством ЯТ-РСЯ, осуществляли с использованием системы 5' ЯАСЕ (Бой, Е.У., Ейо1, 6.Р., С\уй1а, 8., Башег, Б.Б., & Πηνίκ, М.М. (1989) 8с1епсе 243, 217-219; 81ттк, Ό., Сиап, Ν., & 8йагатап, К., (1991) Росик 1399 (С1ВСО)). Один микрограмм РНК ТНР-1 (обработанных окисленным ЛНП), использованных первоначально в реакциях дифференциального отображения, использовали в реакции 5'ЯАСЕ:

мкл (1 мкг) РНК объединяли с 3 мкл (3 пмоль) праймера 2а и 11 мкл ОЕРСобработанной воды и нагревали до 70°С в течение 10 мин, а затем выдерживали в течение 1 мин на льду. Затем добавляли 2,5 мкл 10х буфера для реакции (200 мМ Трис-НС1, рН 8,4, 500 мМ КС1), 3 мкл 25 мМ МдС1₂, 1 мкл 10 мМ смеси б№ТР и 2,5 мкл 0,1 М ДТТ. Эту смесь инкубировали в течение 2 мин при 42°С, а затем добавляли 1 мкл обратной транскриптазы 8ирегкспр! II. Реакционную смесь инкубировали еще 30 мин при 42°С, 15 мин при 70°С и 1 мин на льду. Затем добавляли один микролитр РНКазы Н (2 единицы) и смесь инкубировали при 55°С в течение 10 мин. кДНК очищали с использованием колонок С1аккМах (8атйгоок, б. Ргйксй, Е.Р & Машайк Т. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А Байо га!огу Мапиа1, кесопй еййюп, Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогакгу Ргекк, Р1ашу1ее, ΝΥ), включенных в набор. Эту кДНК элюировали из колонки в 50 мкл ЙН₂О, лиофилизовали и ресуспендировали в 21 мкл ЙН₂О. Наращивание цепи кДНК осуществляли в следующей реакции: 7,5 мкл ЙН₂О, 2,5 мкл буфера для реакции (200 мМ Трис-НС1, рН 8,4, 500 мМ КС1), 1,5 мкл 25 мМ МдС1₂, 2,5 мкл 2 мМ ЙСТР и 10 мкл кДНК инкубировали при 94°С в течение 3 мин, а затем на льду в течение 1 мин. Затем добавляли 1 мкл (10 единиц) концевой дезоксинуклеотидил-трансферазы и смесь инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Фермент подвергали тепловой инактивации путем инкубирования при 70°С в течение 10 мин, а затем смесь помещали на лед. РСК-амплификацию кДНК осуществляли в следующих стадиях: 5 мкл кДНК с наращенным концом было включено в реакционную смесь, которая также содержала 5 мкл 10х РСК-буфера (500 мМ КС1, 100 мМ Трис-НС1, рН 8,3, 15 мМ МдС1₂ и 0,01% (мас./об.) желатина), 1 мкл 10 мМ смеси й№ТР, 2 мкл (10 пмоль) якорного праймера, 1 мкл (20 пмоль) праймера 3 а и 35 мкл ЙН₂О. Реакционную смесь нагревали до 95°С в течение 1 мин, а затем добавляли 0,9 мкл (4,5 единиц) полимеразы Атр1йас.|. Реакцию проводили в 40 циклов при следующих условиях: 94°С - 5 с, 50°С - 20 с и 72°С - 30 с. Один микролитр этой реакционной смеси использовали для гнездовой повторной амплификации в целях повышения уровней специфического продукта для последующего выделения. Для повторной амплификации использовали: 1 мкл смеси для первичной амплификации, 5 мкл 10х РСК-буфера, 1 мкл 10 мМ смеси άΝΤΈ, 2 мкл (20 пмоль) универсального праймера для амплификации, 2 мкл (20 пмоль) праймера 4а и 38 мкл ЙН₂О. Реакционную смесь нагревали до 95°С в течение 1 мин, а затем добавляли 0,7 мкл (3,5 единиц) полимеразы Атр1йас.|. Реакцию проводили в 40 циклов при следующих условиях: 94°С - 5 с, 50°С - 20 с и 72°С - 30 с. Амплифицированные продукты анализировали путем электрофореза в 0,8% агарозном геле. Был обнаружен преобладающий продукт, содержащий примерно 1,2 т.п.о. Два микролитра продуктов реакции клонировали в вектор рСКИ из набора для клонирования ТА (1пуйгодеп) и инкубировали в течение ночи при 14°С. Эти продукты лигирования использовали для трансформации Е. сой. Размеры вставок полученных трансформантов определяли путем ЕсоК1-гидролиза. Клоны, содержащие вставки приблизительно размера РСК-продукта, секвенировали с использованием реагентов-терминаторов - флуоресцентного красителя (Рпкт, Аррйей Вю-кук1етк), и с использованием ДНК-секвентатора Аррйей В1окук1етк 373. Последовательность КАСЕпродукта, включая ЕсоК1-сайты от вектора ТА, представлена на фиг. 3. Последовательности амплимеров (универсальный амплифицирован ный праймер и праймер, комплементарный 5'КАСЕ-праймеру 4а) подчеркнуты.

Пример 2. Клонирование и локализация гена ЕЬбХЬ на хромосоме.

А) Скрининг библиотеки кДНК

Плацентарную библиотеку кДНК человека (олиго άΤ и рандомизированно праймированную, кат. № 5014Ь, серия #52033) получали от С.’1оп1ес11 (Ра1о Айо, СА). Радиоактивно меченный зонд создавали путем вырезания вставки плазмиды, содержащей вышеописанный РСКпродукт 5'-КАСЕ-реакции. Зонд радиоактивно метили с использованием техники рандомизированного праймирования: ДНК-фрагмент (50100 нг) инкубировали с 1 мкг рандомизированных гексамеров (61Ьсо) при 95°С в течение 10 мин, а затем на льду в течение 1 мин. Затем при комнатной температуре были добавлены 3 мкл 10х буфера Кленова (100 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 50 мМ МдС1₂, 57 мМ дитиотрейтол; №\ν Епд1апй В1о1аЬк), 3 мкл (0,5 мМ ЙАТР, Й6ТР, ЙТТР), 100 мкКи а-³²РйСТР (3000 Ки/ммоль, №\ν Епд1апй М1с1еаг) и 1 мкл фрагмента Кленова ДНКполимеразы I (5 единиц, 61Ьсо). Реакционную смесь инкубировали в течение 2-3 ч при комнатной температуре, а затем реакцию прекращали путем повышения объема до 100 мкл с использованием ТЕ, рН 8,0 и путем добавления ЕЭТА до конечной концентрации 1 мМ. Не включенные нуклеотиды удаляли путем повышения объема реакционной смеси до 100 мкл и ее пропускания через центрифужную колонку 6-50 (Воейппдег Маппйет). Полученные зонды имели специфическую активность, превышающую 5 х 10⁸ имп/мин/мкг ДНК.

Библиотеку зондировали стандартными методами (^айег, Р., бйтоге, К., & В1оЬе1, 6. (1984) Се11 38, 5-8). Для этого фильтры гибридизовали в течение 24 ч при 65°С в 4,8Х 88РЕ (20Х 88РЕ = 3,6 М №С1, 0,2 М NаН₂РО₄, 0,02 М ЕОТА, рН 7,7), 20 мМ Трис-НС1 рН 7,6, 1х растворе Денхардта (100Х = 2% фиколл 400, 2% поливинилпирролидон, 2% В8А), 10% сульфате декстрана, 0,1% ДСН, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося и 1 х 10⁶ имп/мин/мл радиоактивно меченного зонда. Затем фильтры промывали три раза в течение 15 мин при комнатной температуре в 2 х 88С (1 х 88С = 150 мМ №С1, 15 мМ цитрат натрия, рН 7,0), 0,1% додецилсульфате натрия (ДСН), а затем промывали три раза в течение 15 мин при 65°С каждым из 0,5 х 88С и 0,1% ДСН. Фаг, который гибридизовался с зондом, выделяли и амплифицировали. ДНК очищали из амплифицированного фага с использованием реактива ЬатЬйа8огЬ (Рготеда) в соответствии с инструкциями производителей. Вставки вырезали из фаговой ДНК путем гидролиза ферментом ЕсоК1. Эти вставки субклонировали в ЕсоК1-сайт плазмидного вектора (В1иексг1р1 II 8К, 81га1адепе). Путем вышеописанного автоматического секвенирования была определена последовательность открытой рамки считывания, находящаяся внутри 2,6 т.п.о.ЕсоВГфрагмента кДНК. Эта последовательность показана на фиг. 4. Аминокислотная последовательность предсказанного белка, кодированного открытой рамкой считывания, показана на фиг. 5 и обозначена ЬЬСХЬ. Было предположено, что первый метионин кодируется парами нуклеотидов 252-254. Предсказанный белок имеет длину в 500 аминокислот. Первые 18 аминокислот образуют последовательность, характерную для секреторного сигнального пептида (Шддтк, Ό.6. & 8йагр, Р.М. (1988) Оепе 73, 237-244). Предсказанный пропептид имеет молекулярную массу 56800 Дальтон. Если предположить, что расщепление сигнального пептида происходит в положении 18, то молекулярная масса не модифицированного зрелого белка составляет 54724 Дальтон.

Полное сходство между этим белком и другими известными членами семейства триацилглицерол-липазы проиллюстрировано на фиг. 6 и в табл. 1. В сравнении первичных последовательностей, показанном на фиг. 6, ББС представляет собой полипептид (8ЕО ГО Ыо: 6), кодированный кДНК (8ЕО ГО Ыо: 5), описанной в примере 1, и далее обозначается ЬЬ6Ы. По своим аминоконцевым 345 остаткам этот белок идентичен белку ЬЬСХЕ. 9 уникальных остатков следуют за стоп-кодоном и продуцируют полипептид 39,3 кДа и зрелый белок 37,3 кДа. Последовательности, которые являются общими для ЬЬСЫ и ЬЬСХЕ, представляют собой последовательность нуклеиновой кислоты 8ЕО ГО Ыо: 9 и аминокислотную последовательность 8ЕО ГО Ыо: 10.

Интересно отметить, что положение, в котором белки ЬЬ6Ы и ЬЕОХЬ различаются, представляет собой область, которая, как известно из структуры другой липазы, находится между амино- и карбоксидоменами этих белков. Поэтому белок ЬЬСЫ, очевидно, состоит только из одного из двух доменов триацилглицероллипаз. Эта последовательность содержит характерный мотив СХ8ХС липазы в положениях 167-171, а также консервативные остатки каталитической триады в 8ег 169, Акр 193 и Н1к 274. Консервативность цистеиновых остатков (положения 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463 и 483), которые участвуют в дисульфидных связях в других липазах, дает основание предположить, что белок ЬЬСХЕ имеет структурное сходство с другими ферментами. Имеются пять предполагаемых сайтов Ы-гликозилирования в положениях аминокислот 80, 136, 393, 469 и 491. Последовательностями белка, используемыми для сравнения, являются липопротеинлипаза человека (ЬРЬ; ОепЬапк, номер доступа #М15856, 8ЕО ГО Ыо: 13), липаза печени человека (НЬ, ОепЬапк, номер доступа #103540, 8ЕО ГО Ыо: 14), панкреатическая липаза человека (РЬ, ОепЬапк, номер доступа #М93285, 8ЕО ГО Ыо: 15), белок-1, родственный панкреатической липазе человека (РЬВР-1; ОепЬапк, номер доступа #М93283), белок-2, родственный панкреатической липазе человека (РЬВР-2; ОепЬапк, номер доступа #М93284).

Таблица 1. Сходство семейства генов триацилглицерол-липаз

	ЬЬОХЬ	ЬРЬ	НЬ	РЬ	РЬВР1	РЬВР2
ЬЬОХЬ	-	42,7	36,5	24,5	22,5	22,6
ЬРЬ	42,7	-	40,0	22,8	22,7	20,9
НЬ	36,5	40,0	-	22,8	24,0	22,0
РЬ	24,5	22,8	22,8	-	65,2	62,2
РЬВР1	22,5	22,7	24,0	65,2	-	61,7
РЬВР2	22,6	20,9	22,0	62,2	61,7	-

Процент сходства оценивали исходя из сравнения пар оснований первичных структур с использованием алгоритма С1ик!а1 (Сатрк, Ь, Вета, М., Ь1оЬега, М., Уйаго, 8., & ОБуесгоиа, Т. (1990) Ат. 1. Рйукю1. 258, С673-С681) программы МедаНдп в наборе программ Бакегдепе Вюсотрийпд 8оП\гаге 8ш1е ГОпак1аг).

В) Локализация на хромосоме

ДНК от клона РI (81етЬегд, Ы., Вие1йег, 1. & ИеВ1е1, К. Тйе Хем Вю1о§й1 2: 151-62, 1990), содержащего геномную ДНК БЬС, метили ИТР (уридинтрифосфатом) дигоксигенина путем ник-трансляции. Меченный зонд объединяли с фрагментированной ДНК человека и гибридизовали с РНА, стимулированной лимфоцитами периферической крови, взятыми от донора мужчины, в растворе, содержащем 50% формамида, 10% сульфата декстрана и 2 х 88С. Специфические сигналы гибридизации детектировали путем инкубирования гибридизованных клеток с флуоресцентно помеченными антителами против дигоксигенина с последующим контрастным окрашиванием ОАРЕ Этот предварительный эксперимент приводил к специфическому мечению хромосомы группы Е, которая, исходя из ИАРЕокрашивания, является, очевидно, хромосомой 18.

Затем проводили второй эксперимент, в котором меченный биотином зонд, специфичный для центромеры хромосомы 18, совместно гибридизовали БЬС-зондом. Этот эксперимент приводил к специфическому окрашиванию центромеры хромосомы 18 красным и длинного плеча хромосомы 18 зеленым. Измерения 11 специфически меченных гибридизованных хромосом 18 продемонстрировали, что БЕС имеет БИег 0,67 (измерения по Франку 0,38), что соответствует полосе 18η21. Некоторые наследственные заболевания, включая внутрипеченочный холестаз, колбочко-палочковую дистрофию (сетчатки) и наследственный остеолиз, очевидно, обусловлены дефектами в этой области хромосомы.

Пример 3. Анализ РНК БЕС.

А) Экспрессия РНК БЕС в клетках ТНР-1

Анализ мРНК, из которой получают кДНК, осуществляли путем Нозерн-анализа РНК ТНР1. РНК от этих клеток получали как описано выше. Эту мРНК выделяли из полной РНК с использованием системы ро1у-бТ-магнитных сфер (Ро1уа(1гас( хух1ет, Рготеда). Три микрограмма ро1у(А)-содержащей мРНК подвергали электрофорезу на 1% агарозном формальдегидном геле. Этот гель промывали в течение 30 мин в бН₂О. РНК переносили в условиях вакуума на найлоновую мембрану с использованием щелочного буфера для переноса (3М №С1, 8 мМ №1ОН, 2 мМ саркозил). После переноса блот нейтрализовали путем инкубирования в течение 5 мин в 200 мМ фосфатном буфере, рН 6,8. РНК перекрестно сшивали с мембраной с использованием прибора для УФ-сшивания (81га1адепе).

Зонд получали путем вырезания вставки плазмиды, содержащей 5'КАСЕ-продукт РСКреакции, описанный выше. Этот зонд подвергали радиоактивному мечению с использованием техники рандомизированного праймирования, описанной в примере 2.

Фильтры предварительно гибридизовали в растворе для быстрой гибридизации ОшкНуЬ (81га!адепе) в течение 30 мин при 65°С. Радиоактивно меченный зонд (1-2 х 10⁶ имп/мин/мл) и обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (конечная концентрация 100 мкг/мл) денатурировали путем нагревания в течение 10 мин до 95°С и быстро охлаждали льдом, после чего переносили на фильтр в раствор ОшкНуЬ. Гибридизацию проводили 3 ч при 65°С. Негибридизированный зонд удаляли путем двукратной 15минутной промывки фильтров 2 х 88С, 0,1% додецилсульфатом натрия при комнатной температуре с последующей двукратной 15минутной промывкой фильтров 0,1 х 88С, 0,1% ДСН при 62°С. После промывки фильтры быстро осушали, а затем экспонировали с пленкой Кобак ХАК-2 с усиливающими экранами при -80°С. Результаты проиллюстрированы на фиг. 7, где показаны крупные мРНК-молекулы, составляющие приблизительно 4,5 тысяч пар оснований. Присутствовали также и более мелкие молекулы длиной 4,3 и 1,6 тысяч пар оснований. Ожидаемый размер кДНК ΡΤ6Ν составлял 1,6 т.п.о. Последовательность ЕЬСХЕ, очевидно, кодируется крупными молекулами детектированной мРНК.

В) Экспрессия РНК ЬЬС в различных тканях человека

Коммерчески доступный готовый фильтр, содержащий 3 мкг каждой из мРНК от различных тканей человека (сердца, головного мозга, плаценты, легких, печени, скелетной мышцы, почек и поджелудочной железы), получали от фирмы С1опе1еск (Са1а1од #7760-1). Этот фильтр зондировали и обрабатывали, как описано выше. После зондирования радиоактивно меченным фрагментом ЬЬС и радиоавтографии, зонд очищали путем промывки в кипящем 0,1 х 88С, 0,1% ДСН в инкубаторе при 65°С в течение 2 х 15 мин. Затем мембраны зондировали с использованием ДНК-фрагмента в 1,4 т.п.о., кодирующего липопротеин-липазу человека. Этот фрагмент получали посредством полимеразной цеп ной реакции с обратной транскриптазой (КТРСК) РНК от клеток ТНР-1 (обработанных РМА и окис. ЛНП) с использованием 5'ЬРЬ- и 3'БРБпраймеров, показанных на фиг. 1, и условий КТРСК, описанных выше. После авторадиографии, мембраны снова очищали и снова зондировали радиоактивно меченным фрагментом кДНК бета-актина человека для нормализации содержания РНК. Результаты этих анализов проиллюстрированы на фиг. 8. Наиболее высокие уровни транскрипта ЬЬС обнаруживались в РНК плаценты, а более низкие уровни обнаруживались в РНК, происходящих от тканей легких, печени и почек. В соответствии с предыдущими исследованиями других авторов (Уегкоеуеп, Λ.Ι.Μ., 1апхеп, Н. (1994) Вюскет. Вюркух. Ас!а 1211, 121124) транскрипт липопротеин-липазы обнаруживался во многих тканях, при этом наибольшие уровни обнаруживались в тканях сердца и скелетной мышцы. Результаты этих анализов показали, что распределение экспрессии ЕЬС в тканях очень отличается от распределения БРБ. Характер экспрессии ББС также отличается от характера экспрессии липазы печени или панкреатической липазы, как сообщалось другими исследователями (ГСапд, С.-8., & Найхиск, ЕЛ. (1993) Вюскет. Вюркуз. Ас!а 1166, 1-19; 8етепкоукк, С.Е., Скеп 8.-ГС., ГС1тх, М., Био С.С., Б1, ГС.-Н., & Скал, Б. (1989) 1. Б1р1б Кех. 30, 423-431; Абатх, Μ.Ό, Кебауаде, А.К., Пе1бх, С., & УеШег, С. (1993) Уинге Селе!. 4, 256-265).

Для определения характера экспрессии в других тканях человека, другая коммерчески доступная мембрана была зондирована с использованием кДНК ББСХБ. Этот дот-блот (РНК человека Мах1ег В1о1, С1оп1еск СаР # 77701) содержал 100-500 нг мРНК из 50 различных тканей и был нормализован на эквивалентную экспрессию генов домашнего хозяйства (Скап, Б., & Могт, К. (1971) Вюскет. Вюркух. Ас1а 231, 194-197). 1,6 т.п.о. Ога1-8гП-фрагмент кДНК ББСХБ метили ³²РбСТР с использованием рандомизированной системы олигонуклеотидного праймирования (Рпте к II, 81га1адепе) с соответствии с инструкциями производителей. После 30-минутной предгибридизации при 65°С зонд добавляли к гибридизационному раствору ОшкНук при 1,3 х 10⁶ имп/мин/мл. Гибридизацию проводили в течение 2 ч при 65°С. Негибридизованный зонд удаляли путем двукратной промывки фильтров 2 х 88С в течение 15 мин, а затем 0,1% додецилсульфатом натрия при комнатной температуре с последующей двукратной промывкой в течение 15 мин в 0,1 х 88С, 0,1% ДСН при 62°С. После промывки фильтры подвергали быстрой сушке, а затем экспонировали с пленкой Кобак ХАК-2 с использованием усиливающих экранов при -80°С в различные периоды времени. Полученные изображения количественно оценивали путем денситометрии. Результаты представлены в табл. 2. Относительные уровни экспрессии в тканях, опреде ленные с помощью Нозерн-анализа множества тканей и с помощью дот-блотов, полученных от множества тканей, были аналогичны, при этом наиболее высокие уровни наблюдались в плаценте, а более низкие уровни наблюдались в легких, печени и почках. В фетальной печени, почках и легком также экспрессировались почти те же самые уровни, что и в тканях взрослых индивидуумов. Неожиданно было обнаружено, что из всех представленных тканей, ткани щитовидной железы экспрессировали наиболее высокие уровни, которые составляли 122% от уровня, экспрессируемого в тканях плаценты. Хотя экспрессия липазы в плаценте наблюдалась ранее (ΚοΐΚ^11, ТЕ., Е1рЫск, М.С. (1982) 1.

Эеу. РЬукю1. 4, 153-159; Уе^мете!!, АЭ.М., Саг11пд Ό., & 1апкеп Н. (1994) 1. ЫрИ Кек. 35, 966975; ВигШи В.К., Мие11ег, Н.ГС. (1980) Вюскет. В юрку к. Ас1а 618, 449-460), однако, экспрессия какой-либо липазы в щитовидной железе ранее не наблюдалась. Эти результаты дают основание предположить, что экспрессия ЬЕС может способствовать сохранению плаценты, где ЬЕС может служить для высвобождения свободных жирных кислот из субстратов, таких как фосфолипиды, как источников энергии. ЬЕС, экспрессированный в щитовидной железе, может служить предшественником для синтеза биологически активных молекул этой железой.

Таблица 2. Экспрессия мРНК ЬЕС в различных тканях человека

Весь головной мозг	н.о	черное вещество	н.о	матка	н.о	молочная желе- за	н.о	легкие	29
Миндалина	н.о.	височная доля	н.о	предстательная железа	5	почки	44	трахея	12
Хвост ядра	н.о.	таламус	н.о.	желудок	н.о.	печень	61	плацента	100
Мозжечок	4	подбугорное ядро	н.о.	яички	9	тонкая кишка	б	головной мозг плода	5
Кора головного мозга	н.о.	спинной мозг	н.о.	яичник	н.о.	селезенка	н.о.	сердце плода	н.о.
Лобная доля	н.о.	сердце	н.о.	поджелудочная железа	н.о.	тимус	н.о.	почка плода	56
Гиппокамп	н.о.	аорта	н.о.	гипофиз	н.о.	периферический лейкоцит	н.о.	печень пло- да	14
Продолговатый мозг	н.о.	скелетная мышца	н.о.	надпочечник	н.о.	лимфоузел	н.о.	селезенка плода	н.о.
Затылочная доля	н.о.	толстая кишка	8	щитовидная железа	122	костный мозг	н.о.	тимус плода	н.о.
Скорлупа	н.о.	мочевой пузырь	н.о.	слюнная же- леза	н.о.	аппендикс	7	легкое пло- да	8

Данные величины представляют собой проценты экспрессии; при этом уровни в тканях плаценты были произвольно приняты за 100%.

Эти величины представляют собой средние значения из денситометрических измерений, полученных из двух авторадиографических экспонирований, н. о. - не обнаруживали.

С) Экспрессия РНК ЬЕС в культивированных эндотелиальных клетках

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НИУЕС) и эндотелиальные клетки коронарной артерии человека (НСАЕС) получали от СЦпейск. НИУЕС были размножены в коммерчески доступной среде для роста эндотелиальных клеток (ЕСМ, С^пеИск), в которую было добавлено 3 мг/мл экстракта бычьего головного мозга (Мас1ад, Т., ί.0Γΐιπάο1ο. 1.. Г1к1еу,

8., Ке11еу, Р.К., & Εοι-апа, К. (1979) Ргос. Асай. 8ск, И8А, 76, 5674-5678, С^пеИск), а НСАЕС были размножены в среде ЕСМ, в которую было добавлено 3 мг/мл экстракта бычьего головного мозга и 3% фетальной бычьей сыворотки (в конечной концентрации 5%). Клетки культивировали до достижения конфлюентности, после чего эту среду заменяли на среду ЕСМ, не содержащую экстракта бычьего головного мозга. Культуры стимулировали путем добавления 100 нг/мл миристата форбола (81дта). После 24-часового инкубирования, РНК экстрагировали из клеток методом с использованием тризола, описанным выше. 20 мкг полной РНК подвергали электрофорезу и переносили на мембрану для анализа. Мембраны зондировали ЬЕС- и ЕРЬ-зондами, как описано выше. Результаты проиллюстрированы на фиг. 9. 20 мкг полной РНК из клеток ТНР-1, стимулированных РМА, подвергали блот-анализу для сравнения. РНК, гибридизирующуюся с ЕЬСзондом, обнаруживали в нестимулированных и РМА-стимулированных клетках НИУЕС. В противоположность этому, детектируемые уровни мРНК ЬЕС обнаруживались только в культурах НСАЕС после стимуляции РМА. В соответствии с предшествующими исследованиями дру гих авторов какого-либо детектируемого уровня мРНК липопротеин-липазы не было обнаружено ни в одной из эндотелиальных РНК ^ейюеуеп,

А.1.М., 1апкеп, Н. (1994) Вюсйет. Вюрйук. Ас1а 1211, 121-124).

Пример 4. Анализ на белок ЬЬС.

A) Получение антител

Продуцировали антисыворотку против пептидов, имеющих последовательность, соответствующую области, которая, предположительно, кодируется открытой рамкой считывания кДНК ЬЬС. Был выбран именно этот пептид, поскольку он имеет высокий предсказанный индекс антигенности (^атекοη В.А. & №ο1£, Н. (1988) ^триЕ АррНс. ш 1йе Вюкаепсек 4, 181-186). Последовательность иммунизирующего пептида не была обнаружена ни в одном белке или в транслированной ДНК-последовательности, имеющихся в базе данных СепЬапк. Соответствующее положению этой последовательности в белке ЬЬС показано на фиг. 10. Карбоксиконцевой цистеин этого пептида не соответствует остатку в предполагаемом белке ЬЬС, но он был введен для облегчения связывания с белком-носителем.

Этот пептид синтезировали на синтезаторе пептидов Аррйеб Вю-кук1етк Мοбе1 433А. Два миллиграмма пептида объединяли с двумя миллиграммами активированного малеимидом гемоцианина лимфы улитки в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору 1т]ес1 Ас1|уа1еб ^тишдеп Сοη^идаΐ^οη Κίΐ (Легсе Сйет1са1). После обессоливания половину этого конъюгата эмульгировали с использованием равного объема полного адъюванта Фрейнда (Легсе). Эту эмульгированную смесь вводили новозеландским белым кроликам. Через четыре недели после первоначальной инокуляции была сделана бустер-инокуляция, при этом эмульгирование проводили точно также как было описано выше, за исключением того, что использовали неполный адъювант Фрейнда (Легсе). Через две недели после бустер-инокуляции брали пробу крови и титры специфических антител определяли посредством анализа ЕБ18А с использованием иммобилизованного пептида. Следующую бустер-инокуляцию проводили через месяц после первой бустер-инокуляции.

B) Вестерн-анализ среды от эндотелиальных клеточных культур

Клетки НυVЕС и НСЕАС культивировали и стимулировали РМА, как описано в примере 3 С, за исключением того, что клетки стимулировали РМА в течение 48 ч. Образцы кондиционированной среды (9 мл) инкубировали с 500 мкл 50%-ной суспензии гепарина-сефарозы СЬ6В в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8, 150 мМ хлорид натрия, 100 мМ фосфат натрия, рН 7,2). Для частичной очистки и концентрирования белков ЬЬС была выбрана именно гепарин-сефароза, поскольку консервативность остатков в последовательности

ЬЬСХЬ была идентифицирована как критическая для гепарин-связывающей активности ЬРЬ (Ма, Υ., Не^етто^ Н.Е., Ли, М.8., 2йапд, Н., Εογ^^, Ι.Τ, С1агке-Ьете1к, I., Наубеп, М.В., & Виш/еИ, ΤΌ., 1. Ь1р1б Век. 35, 2049-2059; и на фиг. 6). После вихревого перемешивания при 4°С в течение 1 ч образцы центрифугировали в течение 5 мин при 150 х д. Затем среду отсасывали и сефарозу промывали 14 мл РВ8. После центрифугирования и отсасывания осажденную гепарин-сефарозу суспендировали в 200 мкл 2 х ДСН-буфера для загрузки (4% ДСН, 20% глицерин, 2% β-меркаптоэтанол, 0,002% бромфеноловый синий и 120 мМ Трис, рН 6,8). Образцы нагревали до 95°С в течение 5 мин и 40 мкл образцов наносили на 10%-ный Трис-глициновый гель с ДСН. После электрофореза при 140 В приблизительно в течение 90 мин белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны с помощью аппарата для электроблоттинга №уех (210 В, 1 ч). Мембраны блокировали в течение 30 мин в блокирующем буфере (5% обезжиренное сухое молоко, 0,1% Твин-20, 150 мМ хлорид натрия, 25 мМ Трис, рН 7,2). Антипептидные антисыворотки и нормальную кроличью сыворотку разводили 1:5000 в блокирующем буфере и инкубировали с мембранами в течение ночи при 4°С при мягком помешивании. Затем мембраны 4 раза в течение 15 мин промывали ТВ8Т (0,1% Твин-20, 150 мМ хлорид натрия, 25 мМ Трис, рН 7,2). Козьи антикроличьи антисыворотки, конъюгированные с пероксидазой, (Вοейппдег Маппйепп) разводили 1:5000 в блокирующем буфере и инкубировали, перемешивая, с мембраной в течение 1 ч. Эти мембраны промывали как описано выше, а затем подвергали реакции с хемилюминесцентным реагентом Вепа1ккапсе (ΌπΡοηΐ ΝΕΝ) и экспонировали с пленкой №бак ХАВ-2. Результаты представлены на фиг. 11. В образцах от нестимулированных клеток НυVЕС и НСАЕС присутствовали два вида иммунореактивных белков. Уровни иммунореактивного белка в нестимулированных образцах НСАЕС были гораздо ниже, чем уровни, соответствующие образцу НυVЕС. После стимуляции РМА три иммунореактивных белка были секретированы эндотелиальными клеточными культурами. Обработка РМА значительно повышала уровень белков ЬЬС, продуцированных культурами НСАЕС. РМАиндуцирование белков ЬЬС в культурах НИνΕΟ не играло существенной роли.

Пример 5. Продуцирование рекомбинантного белка ЬЬС.

А) ЬЬС-экспрессирующие конструкции кДНК, кодирующие белки ΕΤΌΝ и ТЬСХЬ, клонировали в экспрессирующий вектор рСЭХА3 млекопитающего (Луйгодеп). Этот вектор позволяет экспрессировать чужеродные гены во многих клетках млекопитающих благодаря использованию главного позднего промотора цитомегаловируса. Этот 5'ВАСЕ-продукт

ΕΤΟΝ клонировали в ΕοοΕΙ^-ιίΑ ρί.ΌΝΛ3. кДНК БОСХЕ гидролизовали ферментами ΩηΙ и 8гН с получением кДНК размером 1,55 т.п.о. (см. фиг. 4). Полученный вектор гидролизовали рестриктирующим ферментом ΕοοΒν. а затем вектор и вставку лигировали с использованием ДНК-лигазы Т4 и реагентов из набора для быстрого лигирования Βαριά ΕίβαΙίοη Кб (Βοο1ιππ§ογ МаппЕснп) в соответствии с инструкциями производителей. Эти лигированные продукты были использованы для трансформации компетентной Е. οοΐί. Полученные колонии скринировали путем рестрикционного анализа и секвенировали на присутствие и ориентацию вставки в экспрессирующем векторе.

В) Кратковременная трансфекция ЬЬС в клетках СО8-7

ЬЬС-экспрессирующие векторы вводили в клетки СО8-7 с использованием катионного липидного реагента липофектамина (СШСО). За 24 ч до трансфекции клетки СО8-7 высевали на 60 мм-чашки для культивирования ткани при плотности 2 х 10⁵ клеток/чашку. Эти клетки размножали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ; СШСО), в которую были добавлены 10% фетальная сыворотка теленка, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. К 300 мкл бессывороточной среды ОрРтет Ι (СЛто) добавляли один микрограмм плазмидной ДНК. Десять микролитров липофектаминового реагента разводили в 300 мкл среды ОрРтст Ι и этот раствор объединяли с раствором ДНК и оставляли для перемешивания при комнатной температуре на 30 мин. Затем, среду удаляли из чашек и клетки промывали 2 мл среды ОрРтст Ι. Раствор ДНК и липофектамина добавляли в чашки вместе с 2,7 мл среды ОрРтст и эти чашки инкубировали в течение 5 ч при 37°С. После инкубирования бессывороточную среду удаляли и заменяли средой ΌΜΕΜ, в которую были добавлены 2% ЕВ8 и антибиотики. Через 12 ч после трансфекции определенную часть культур обрабатывали либо 0,25 мМ РеЕаЬкс 8С (Βοο1ιππ§ογ Маппбет), либо ингибитором протеазы, либо 10 ед/мл гепарина. За 30 мин до сбора, обработанные гепарином образцы обрабатывали еще 40 ед/мл гепарина. Среду удаляли из клеток через 60 ч после трансфекции. К 1 мл среды добавляли гепаринсефарозу СЬ-4В (200 мкл 50% суспензии в РВ8, рН 7,2) и размешивали при 4°С в течение 1 ч. Затем сефарозу осаждали путем центрифугирования при низкой скорости и три раза промывали 1 мл холодного РВ8. Эту сефарозу осаждали и суспендировали в 100 мкл 2х буфера для загрузки. Образцы нагревали до 95°С в течение 5 мин. 40 мкл каждого образца наносили на 10% ДСН-ПААГ-гель. Электрофорез и вестерн-анализ осуществляли с использованием антисыворотки против ЬЬС как описано выше. Результаты представлены на фиг. 12. Белки из кондиционированной среды от НСАЕС были включены для сравнения размеров. ΕΤΟΝ мигрирует приблизительно при 40 кДа, что соответствует самой нижней полосе в НСАЕС. Среда от клеток СО8, трансфицированных кДНК ТЬСХТ, содержит типы белка 68 кДа и 40 кДа. При обработке этих клеток гепарином количество белков 68 кДа и 40 кДа, выделенных из среды, резко увеличивалось, что указывало либо на высвобождение из клеточной поверхности белка, связанного с протеогликаном, либо на стабилизацию этих белков гепарином. При обработке клеток ингибитором протеазы Ре£аЬкс количество белка 68 кДа увеличивалось по сравнению с белком типа 40 кДа. Это дает основание предположить, что белок с более низкой молекулярной массой, продуцированный этими клетками, представляет собой продукт протеолиза более крупной 68 кДа-формы. Роль мРНК, идентифицированной посредством дифференциального отображения, которая кодирует более короткие виды белка 40 кДа, до сих пор не известна. Однако сообщалось, что была получена альтернативно сплайсированной, форма липазы печени, которая, очевидно, экспрессируется тканеспецифическим образом и должна продуцировать усеченный белок.

Пример 6. ЬЬС у животных различных видов.

А) Клонирование кроличьего гомолога ТЬС

Коммерчески доступную библиотеку кДНК лямбда, происходящую от легочной ткани кролика (СкШесй, кат. # ТЬ1010Ь), использовали для выделения фрагмента кроличьего гомолога гена ЕЕС. Пять микролитров исходной библиотеки добавляли к 45 мкл воды и нагревали до 95°С в течение 10 мин. Были добавлены следующие материалы в конечном объеме 100 мкл: 200 мкМ бХТР, 20 мМ Трис-НС1, рН 8,4, 50 мМ КС1, 1,5 мМ МдС1₂, 100 мкМ каждого из праймеров ОЫР774 и ТЬСдеп2а и 2,5 единиц полимеразы Тад (СШСО). Реакцию проводили в 35 термоциклов при следующих условиях: 15 с - 94°С, 20 с - 50°С и 30 с -72°С. 10 микролитров этой реакционной смеси анализировали путем электрофореза в агарозном геле. Был обнаружен продукт приблизительно в 300 пар оснований. Часть (4 мкл) этой реакционной смеси использовали для клонирования продукта с помощью системы клонирования ТА. Вставку полученного клона секвенировали (8ЕЦ ΙΌ Νο: 11). Сравнение первичных выведенной кроличьей аминокислотной последовательности (8ЕЦ ΙΌ Νο: 12) и соответствующей последовательности кДНК человека также показано на фиг. 14. Для нуклеотидов, которые не являются частью любого праймера для амплификации, наблюдалось 85,8%-ное сходство между кроличьей последовательностью и последовательностью ТЬС человека. Предсказанный белок, кодированный этой кроличьей кДНК, имеет 94,6%-ную идентичность с белком человека, при этом, большинство нуклеотидных замен находится в третьем положении или в положениях нестрогого соответствия (качелей) кодонов. Следует особо отметить, что эта область охватывает последовательность крышки предсказанных белков ЬЬС и представляет собой вариабельный домен в семействе генов липазы. Очевидно, это обеспечивает высокую степень консервативности этого гена для различных видов.

В) ЬЬС в других видах

Для демонстрации присутствия генов ЬЬС в других видах геномные ДНК от различных видов гидролизовали рестриктирующим ферментом ΕοοΚΙ, выделяли путем электрофореза в агарозных гелях и блотировали на нитроцеллюлозных мембранах.

Мембраны гибридизовали в течение ночи при 65°С с 2,5 х 10⁶ имп/мин/мл рандомизированно праймированного зонда ³²Р-ЬЬС или ³²РЬРЬ (липопротеинлипаза) в растворе для гибридизации: 6 х 88С, 10% сульфат декстрана, 5 X раствор Денхардта, 1% ДСН и 5 мкг/мл ДНК спермы лосося. Эти мембраны промывали 0,1 х 88С, 0,5% ДСН в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем последовательно в течение 10 мин при температуре 40, 50 и 55°С. Авторадиограммы блотов показаны на фиг. 16.

На фиг. 16 проиллюстрировано присутствие генов ЬЬС и ЬРЬ во всех оцениваемых видах, за исключением того, что гибридизации с зондом ЬЬС против ДНК крысы не наблюдалось. Исключительные данные, полученные для крысы, могут представлять артефакт, вызванный генерированием рестрикционных фрагментов аномального размера, содержащих последовательности ЬЬС. Такие фрагменты могут находиться вне пределов фракционирования агарозного геля или могут быть следствием неэффективного блотирования. Различные полосы, обнаруженные посредством двух зондов, указывают на то, что ЬРЬ и ЬЬС представляют собой отдельные эволюционно консервативные гены.

Пример 7. Ферментативная активность ЬЬбХЬ.

А) Фосфолипазная активность

Кондиционированные среды от клеток СО8-7, кратковременно экспрессирующие липопротеин-липазу человека (ЬРЬ), ΒΕΟΝ или ЬЬСХЬ, анализировали на фосфолипазную активность. Минимальную поддерживающую среду (МЕМ), содержащую 10% РВ8 (МЕМ), использовали в качестве слепого контроля, а кондиционированную среду от клеток СО8-7, трансфецированных антисмысловой ЬЬСХЬплазмидой (Л8), использовали в качестве негативного контроля.

Фосфатидилхолиновую (РС) эмульсию готовили с использованием 10 мкл фосфатидилхолина (10 мМ), 40 мкл ¹⁴С-фосфатидилхолина, дипальмитоила (2 мкКи), меченного в 1 и 2 положениях, и 100 мкл Трис-ТСХВ (100 мМ Трис, 1% Тритон, 5 мМ СаС1₂, 200 мМ №С1, 0,1%

В8Л). Полученную эмульсию упаривали в течение 10 мин, а затем доводили до конечного объема 1 мл в Трис-ТСХВ.

Реакции проводили в дубликате, и они содержали 50 мкл эмульсии РС и 950 мкл среды. Образцы инкубировали в водяной бане со встряхиванием в течение 2-4 ч при 37°С. Реакции завершали путем добавления 1 мл 1 н. НС1, а затем экстрагировали 4 мл 2пропанола:гексана (1:1). Верхний 1,8 мл гексановый слой пропускали через колонку с силикагелем и выделенные не содержащие С жирные кислоты, находящиеся в проточной фракции, количественно оценивали в сцинтилляционном счетчике. Результаты этих анализов показаны на фиг. 14.

В) Триацилглицерол-липазная активность

Кондиционированную среду от клеток СО8-7, кратковременно экспрессирующую липопротеин-липазу человека (ЬРЬ), ЬЬСХ или ЬЬСХЬ, анализировали на триглицероллипазную активность. МЕМ, содержащую 10% РВ8, использовали в качестве слепого контроля, а кондиционированную среду из клеток СО8-7, трансфицированную антисмысловой ЬЬСХЬплазмидой (Л8), использовали в качестве негативного контроля.

Концентрированный субстрат получали в виде безводной эмульсии меченного триолеина [9,10-³Η(Ν)] и немеченого триолеина (конечное содержание полного триолеина = 150 мг при 6,25 х 10⁸ имп/мин), которую стабилизировали путем добавления 9 мг лецитина в 100% глицерина. 0,56 мл ³Н-триолеина (0,28 мКи) смешивали с 0,17 мл немеченного триолеина и 90 мкл лецитина (9 мг) . Полученную смесь упаривали в потоке азота. Осушенную липидную смесь эмульгировали в 2,5 мл 100% глицерина путем обработки ультразвуком (30-секундные импульсы на уровне 2 с последующими двухсекундными циклами охлаждении в течение 5 мин).

Субстрат для анализа был получен путем разведения 1 объема концентрированного субстрата четырьмя объемами 0,2М Трис-НС1буфера (рН 8,0), содержащего 3% мас./об. альбумина бычьей сыворотки, в котором отсутствовала жирная кислота. Разведенный субстрат интенсивно перемешивали в течение 5 с.

Реакции проводили в дубликате в полном объеме 0,2 мл, содержащем 0,1 мл субстрата для анализа и 0,1 мл указанной кондиционированной среды. Реакционные смеси инкубировали в течение 90 мин при 37°С. Реакции прекращали путем добавления 3,25 мл метанолахлороформа-гептана (1,41:1,25:1)(об./об./об.), а затем, 1,05 мл 0,1М калийкарбонатного/боратного буфера (рН 10,5). После интенсивного размешивания в течение 15 с, образцы центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин. 1,0 мл-аликвоту верхней водной фазы оценивали в сцинтилляционном счетчике. Результаты этих анализов показаны на фиг. 15.

Пример 8. Использование ЬЬС-полипептида для скрининга в целях выявления агонистов или антагонистов.

Рекомбинантный ЬЬС продуцировали в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом. Рекомбинантный ЬЬС очищали из содержащей или не содержащей сыворотку кондиционированной среды с помощью хроматографии на гепаринсефарозе, а затем, с помощью хроматографии на катионообменной смоле. Если это было необходимо, то при очистке ЬЬС использовали третью хроматографическую стадию, такую как гель-фильтрация. Во время очистки антитела против пептидов использовали для мониторинга белка ЕЬС, а фосфолипазный анализ использовали для определения ЬЬСактивности.

Во флуоресцентном анализе конечные условия анализа предусматривали использование приблизительно 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 100 мМ КС1, 2 мМ СаС1₂, 5 мкМ С₆ЫВП-РС{1-ацил2-[6-(нитро-2,1,3-бензоксадиазол-4-ил)]амино} капроилфосфатидилхолин и белок ЬЬС (прибл. 1-100 нг) . Реакционную смесь подвергали флуоресцентному возбуждению при 470 нм и осуществляли мониторинг ферментной активности, измеренной по флуоресцентному излучению при 540 нм. Затем соединения и/или вещества, тестируемые на стимуляцию и/или ингибирование ЕЬС-активности, добавляли в виде 10-200 мМ растворов в диметилсульфоксиде. Соединения, которые стимулируют или ингибируют ЕЬС-активность, идентифицировали как соединения, вызывающие повышение или снижение флуоресцентного излучения при 540 нм.

В этом тио-анализе конечные условия анализа предусматривали использование приблизительно 25 мМ Трис-НС1 (рН 8,5), 100 мМ КС1, 10 мМ СаС1₂, 4,24 мМ Тритон Х-100, 0,5 мМ 1,2-бис(гексаноилтио)-1,2-дидезокси-кп-глицеро-3-фосфорилхолин, 5 мМ 4,4'-дитиобиспиридин (из 50 мМ исходного раствора в этаноле) и 1-100 нг рекомбинантного ЬЬС. Фосфолипазную активность определяли путем измерения увеличения поглощения при 342 нм. Соединения и/или вещества, тестируемые на стимуляцию и/или ингибирование ЕЬС-активности, добавляли в виде 10-200 мМ растворов в диметилсульфоксиде. Соединения, которые стимулируют или ингибируют ЬЬС-активность, идентифицировали как соединения, вызывающие увеличение или снижение поглощения при 342 нм.

Пример 9. Трансгенные мыши, экспрессирующие ЬЬС человека.

Для дальнейшего исследования физиологической роли ЬЬС были продуцированы трансгенные мыши, экспрессирующие ЬЬС человека.

Рестрикционный 1,53 т.п.о.-Эга1/8гП-фрагмент, кодирующий ЬЬСХЬ (см. фиг. 4), клонировали в плазмидный вектор (рНМС) ниже промотора для конститутивно экспрессируемого гена редуктазы 3-гидрокси-3-метилглутарил кофермента А (НМС СоА). Трансгенных мышей, у которых экспрессировались различные уровни ЬЬСХЬ человека, получали стандартными методами (см., например, С.Ь. Тготр е1 а1., Сепе 1565: 199-205, 1995). Этих трансгенных мышей использовали для определения влияния сверхэкспрессии ЬЬСХЬ на липидный профиль, сосудистую патологию, скорость развития и тяжесть атеросклероза и других физиологических параметров.

Пример 10. Экспрессия ЬЬС в атеросклеротических тканях.

Экспрессию ЬЬСХЬ при атеросклерозе оценивали путем проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (КТРСК) с использованием мРНК, выделенной путем сосудистой биопсии от четырех пациентов с атеросклерозом. Образцы тканей брали из стенки аорты (один образец), подвздошной артерии (два образца) и сонной артерии (один образец).

Биопсию из атеросклеротических сосудов получали из клиники (С1оисек1егЫге Коуа1 Нокрйа1, Епд1апй), после чего получали ро1у(А)+мРНК и ресуспендировали в обработанной диэтилпирокарбонатом (ПЕРС) воде при концентрации 0,5 мкг/мкл мРНК. Реакции с обратной транскриптазой осуществляли в соответствии с протоколом С1Ьсо ВКЬ, прилагаемым к системе предварительной амплификации (8ирегксг1р( РгеатрППсайоп 8ук1ет) для синтеза первой цепи кДНК. Вкратце, кДНК синтезировали следующим образом: 2 мкл каждой мРНК добавляли к 1 мкл ойдо (йТ)_12-18-праймера и 9 мкл ПЕРС-воды. Пробирки инкубировали в течение 10 мин при 70°С и помещали на 1 мин на лед. К каждой пробирке добавляли следующие компоненты: 2 мкл 10 х РСК-буфера, 2 мкл 25 мМ МдС1₂, 1 мкл 10 мМ й№ГР-смеси и 2 мкл 0,1 М ДТТ. После 5-минутного выдерживания при 42°С добавляли 1 мкл (200 единиц) обратной транскриптазы 8ирег 8сг1р1 II. Реакционную смесь слегка размешивали, а затем инкубировали 50 мин при 42°С. Реакции завершали путем инкубирования в течение 15 мин при 70°С, а затем реакционные смеси помещали на лед. Оставшуюся мРНК разрушали путем добавления в каждую пробирку 1 мкл РНКазы Н и инкубировали в течение 20 мин при 37°С.

РСК-амплификацию осуществляли с использованием 2 мкл кДНК-реакционной смеси. В каждую пробирку добавляли следующие компоненты: 5 мкл 10 х РСК-буфера, 5 мкл 2 мМ й№ГР-смеси, 1 мкл Ь11д-дкр1-праймера (20 пмоль/мл, см. фиг. 1), 1 мкл Ь11д-дкр2а-праймера (20 пмоль/мл, см. фиг. 1), 1,5 мкл 50 мМ МдС12, 0,5 мкл полимеразы Тад (5 ед/мл) и 34 мкл воды. После выдерживания реакционных смесей в течение 2 мин при 95°С проводили 30 циклов РСК при следующих условиях: 15 с при 94°С, 20 с при 52°С и 30 с при 72°С. Заключительные реакции проводили в течение 10 мин при 72°С, а затем осуществляли анализ путем электрофо51 реза в агарозном геле, Ы1д-д8р-праймеры являются специфичными к ЬЬС и дают ожидаемый продукт в 300 п.о. В параллельной РСК было показано, что реакции синтеза кДНК были успешными, при этом использовали праймеры, специфичные к гену домашнего хозяйства и к 63РИН (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы) (1 мкл каждого при концентрации 20 пмоль/мл).

С3РЭН-праймеры (см. фиг. 1) давали ожидаемый продукт в 983 п.о. для всех четырех образцов сосудистой биопсии. Экспрессия ЬЬС обнаруживалась в трех из четырех образцов, а в образце, взятом из сонной артерии, этой экспрессии не наблюдалось.

Все обсуждаемые работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Для каждого специалиста очевидно, что настоящее изобретение может быть легко адаптировано для осуществления целей изобретения и достижения нужных результатов и вышеупомянутых преимуществ настоящего изобретения. Пептиды, полинуклеотиды, способы, процедуры и техника, описанные в данной заявке, представлены как предпочтительные варианты осуществления изобретения и приводятся в иллюстративных целях, а поэтому они не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения. В настоящее изобретение могут быть внесены изменения и другие варианты его использования, однако, не должны выходить за рамки существа и объема изобретения, сформулированные в прилагаемой формуле изобретения.

Список последовательностей (1) Общая информация:

(ί) Заявитель: 1ауе, Мюйае1 С.

ΌοΗη, Κίιη-Ληπ Т. Кгач1ес, ίοΐιη А. Ьупсй, Κανίη 1. Аш1п, Όίΐίρ V. 8οιι11ι, νίαοπη 1.

(ίί) Название изобретения: Полипептиды ЬЬ6 семейства триацилглицерол-липаз, композиции и способы их использования в ферментативном гидролизе, и терапия с использованием белков и генов (ΐϊϊ) Число последовательностей: 31 (ίν) Почтовый адрес:

(A) Адрес: ΚΗο^-ΡοπΕμ Κοιόγ 1пс.

(B) Улица: 500 ΛιόοΙη Кб. 3С43 (C) Город: СсПс^суШс (Ό) Штат: РА (Е) Страна: США (Е) Почтовый индекс: 19426 (ν) Форма компьютерного считывания:

(A) Тип носителя: гибкий диск (B) Компьютер: РС совместимая с 1ВМ (C) Операционная система: РС-ЭО8/М8ΌΟ8 (Ό) Программное обеспечение: РаΐеηίIη Ке1еа§е # 1.0, Vе^8^οη #1.30 (νί) Данные настоящей заявки:

(A) Номер заявки: И8 (B) Дата подачи:

(С) Классификация:

(νίίί) Данные о поверенном/агенте:

(A) Имя, фамилия: ЕсЫпст РН.Э., Раи1 Е.

(B) Регистрационный номер: 35135 (C) Номер документа/досье: А2582-ГСО (ίχ) Телекоммуникационные данные:

(A) Телефон: (610) 454-3839 (B) Телефакс: (610) 454-3808 (2) Данные последовательности 8ЕО ГО Νο: 1:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 367 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: двуцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Отличительный признак:

(A) Имя/ключ: СГО8 (B) Локализация: 22..180 (χί) Описание последовательности 8ЕО ГО Νο: I:

ОААТТССОСТ ТОАТСААТСС С ТТС ААА ААС ОСС АТС ТОТ СТС АСС ТСС ССС51

РЬе Ьув Ьув С1у Не Сув ьеи Зег Суя Агд 1510

ААС ААС ССТ ТОТ ААТ АСС АТТ ССС ТАС ААТ ССС ААС ААА АТС АСС ААС99

Ьув Авп Агд Сув Азп Зег 11е С1у Туг Авп А1а Ьув Ьуз Мес Агд Азп

2025

ААС АСС ААС АСС ААА АТС ТАС СТА ААА АСС ССС ССА ОСС АТС ССТ ТТС147

Ьув Агд Азп 2ег Ьуз мес Туг Ьеи Ьуз ТЬг Агд А1а С1у МеС Рго РЬе

3540

АСА СОТ ААС СТТ САС ТСС СТО ОАО ТОТ ССС ТСА ОСААМСССТ ТААТАССТСС 200 Агд С1у Азп Ьеи О1п Зег Ьеи О1и Суз Рго *

4550

ТТСТТААТАС САТОСТОСАО АОСАОСССАС АТССТАОССС А60А0ААСТ6 ОССАОСАСАА 260

ТССААТСААА ТСОТТССААА ТСАОАТТАСА СТСТОСАТСТ ССТАООАААС СЗДАТСТТТА320

СААААТАААС АСПЗТОСАСС ССТСАААААА ААААААААОС СОААТТС367 (2) Данные последовательности 8ЕО ГО Νο: 2:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 53 аминокислоты (B) Тип: аминокислотная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности 8ЕО ГО Νο: 2:

РЬе Ьуз Ьуя С1у II· Сув Ьеи 2ег Суя Агд Ьув Авп Агд Сув Авп 5ег 15 Ю15

Не СХу Туг Авп АХа Ьув Ьув Мее Агд Азп Ьув Агд Азп Зег ьуз Мее

2530

Туг Ьеи Ьуз ТЬг Агд А1а С1у МвС Рго РНе Агд С1у Азп Ьеи С1п Зег 35 4045

Ьеи С1и Суз Рго *· (2) Данные последовательности 8ЕО ГО Νο: 3:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 1382 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: двуцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Отличительный признак:

(A) Имя/ключ: СГО8 (B) Локализация: 312..1370 (χί) Описание последовательности 8ЕО ГО

Νο: 3:

ОААТТССССТ ТСТАСТАСТА СТАССССАСС ССТССССТЛС ТАСООООСОО СССЗСССССС60

ТСАОСОАОТС СТТСССТССС ООСООСТСАС ОАСОАОООСА САТСТССТТС ТОСОЭСААвС120

ССТТСАСАСТ СССТСССТОС САССССССОС 6СТССОТССС СССААСТТТТ САТТТТССАС180

СТТСТСТССС ТССАСТСССС САСССССТОС ССОАОАСААС ССТСТТАССС СССССвАТГС240

СТОСАААСАС СААСАОСТОС ТТТТТСТТТТ ТТААААСТТС ТСТТТСТТОС САОООССТСТ300

ССССССССАС С АТС АСС ААС ТСС ОТТ ССТ СТС СТС ТСТ ТТС ТСС АСС СТС350

Нее бег Авп бег V»! Рго Ьеи Ьеи Сув РЬе Тгр бег Ьеи

6065

ТСС ТАТ ТСС ТТТ ССТ ССС 006 АСС ССС СТА ССТ ТТТ ССТ ССА ОАО СОА398

Сув Тут Сув РЬе АХа АХа СХу баг Рго УаХ Рго РЬе СХу Рго СХи СХу 70 7580

ССС СТС ОАА САТ ААС СТС САС ААА ССС ААЛ ССТ АСА САС АСТ САО СТС446

Агд Ьеи С1и Авр Ьув Ьеи Ηίβ Ьув Рго Ьув А1а ТЬг СХп ТЬг С1иУа1

9095

ААА ССА ТСТ СТО ЛОЗ ТТТ ААС СТС ССС АСС ТСС ААС САС ССА САС САТ494

Ьув Рго бег УаХ Агд РЬе Авп Ьеи Агд ТЬг бех Ьув Авр Рго СХиΗίβ

100 105110

САА ССА ТСС ТЛС СТС ТСС СТС <Э6С САС АСС САС ССС ТТА ОАА САС ТСС542

СХи СХу Суз Туг Ьеи Зег Уа1 С1у Ηίβ Зег СХп Рго Ьеи С1и Авр Сув

115 120 125130

АСТ ТТС ААС АТС АСА ССТ ААА АСС ТТТ ТТС АТС АТТ САС ССА ТСС АСС590

Зег РЬе Авп Нее ТЬг АХа Ьув ТЬх РЬе РЬе Не Не Ηίβ С1у ТгрТЬг

135 140145

АТС АСС СОТ АТС ТТТ ОАА ААС ТСС СТО САС ААА СТС СТС ТСА ССС СТС638

Мес. Зег С1у Не РЬе СХи Авп Тгр Ьеи Ηίβ Ьув Ьеи Уа1 Зег АХаЬеи

Х50 155160

САС АСА АСА САС ААА САС ССС ААТ СТА СТТ СТС ОТТ САС ТОО СТС ССС686

Ηίβ ТЬг Агд СХи Ьув Азр АХа Авп УаХ УаХ УаХ УаХ Авр Тгр ЬеиРхо

165 170175

СТС ССС САС САС СТТ ТАС АСС САТ ССС СТС ААТ ААТ АСС АСС СТС ОТО734

Ьеи АХа Ηίβ С1п Ьеи Тут ТЬг Авр А1а УаХ Авп Азп ТЬг Агд Уа1УаХ

180 185190

ССА САС АСС АТТ ССС ЛОО АТС СТС САС ТСС СТС САС САС ЛАС САС САТ782

СХу Ηίβ Зег Не А1а Агд Мес Ьеи Азр Тгр Ьеи С1п С1и ьув Азр Авр

195 200 205210

ТТТ ТСТ СТС ССС ААТ СТС САС ТТС АТС ОСС ТАС АСС СТС ССА ССС САС830

РЬе Зег Ьеи С1у Авп Уа1 Ηίβ Ьеи Не С1у Туг Зег Ьеи С1у АХа Ηίβ

215 220225 (ЗТО ССС ССС ТАТ ССА ССС ААС ТТС СТС ЛАЛ СОА АСС СТС ССС ССА АТС678

УаХ АХа СХу Туг АХа СХу Авп РЬе УаХ Ьув СХу ТЬх Уа1 С1у Агд Не

230 . 235240

АСА ССТ ТТС САТ ССТ ССС ООО ССС АТС ТТТ САА ОСО ССС САС АТС САС926

ТЬг СХу Ьеи Азр Рго А1а СХу Рго Мес РЬе С1и СХу А1а Азр Не Ηίβ

245 250255

ААС АСС СТС ТСТ ССС САС САТ ОСА САТ ТТТ СТС САТ СТС СТС САС АСС974

Ьув Агд Ьеи Зег Рго Авр Авр АХа Авр РЬе Уа1 Азр УаХ Ьеи Ηίβ ТЬг

260 265270

ТАС АСС СОТ ТСС ТТС ООО ТТС ЛВС АТТ ОСТ АТТ САО АТС ССТ ОТО ССС1022

Туг ТЬг Ахд Зег РЬе СХу Ьеи бег Не СХу Не СХп Нес Рго УаХ СХу

275 280 285290

САС АТТ САС АТС ТАС ССС ААТ ООО СОТ ОАС ТТС САС ССА ССС ТОТ ООА1070

Ηίβ Не Авр Не Туг Рго Авп С1у С1у Авр РЬе СХп РГО СХу Сув СХу

295 300305

СТС ЛАС САТ ОТС ТГО СОА ТСА АТТ ОСА ТАТ ООА АСА АТС АСА ОАО ОТО1118

Ьеи Авп Авр УаХ Ьеи С1у Зег 11е АХа Туг С1у ТЬг Не ТЬг С1и УаХ

310 315320

СТА ААА ТОТ ОАО САТ САО ССА ССС СТС САС СТС ТТТ СТТ САС ТСТ СТС1166

Уа1 Ьув Сув СХи Ηίβ С1и Агд АХа УаХ Н1з Ьеи РЬе УаХ Азр Зег Ьеи

325 330335

СТС ААТ САС САС ААС ССС АСТ ТТТ ССС ТТС САС ТСС АСТ САС ТСС ААТ1214

УаХ Азп С1п Азр Ьуз Рго Зег РЬе А1а РЬе СХп Суз ТЬг Азр Зег Азп

340 345350

ССС ТТС ААА ААС ССС АТС ТОТ СТО АСС ТСС ССС ААС ААС ССТ ТОТ ААТ1262

Агд РЬе Ьуз Ьуз СХу Не Суз Ьеи Зег Суз Агд Ьуз Азп Агд Суз Азп

355 360 365370

АСС АТТ ОСС ТАС ААТ ССС ААС ААА АТС ДОС ААС ААС ЛОВ ААС ДОС ААА1310

Зег Не СХу Туг Азп АХа Ьуз Ьуз ИеС Агд Азп Ьуз Агд Авп ЗегЬув

375 380385

АТС ТАС СТА ААА АСС ССС ОСА ССС АТС ССТ ТТС АСА ОСТ ААС СТТ САС1358

Нес. Туг Ьеи Ьув ТЬх Ахд А1а СХу Мес Рго РЬе Агд СХу Азп ЬеиСХп

390 395400

ТСС СТС ОАС ТСТ СААВСССААТ ТС1382

Зег Ьеи СХи Суз

405 (2) Данные последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ыо: 4:

(ί) Характеристики последовательности: (Α) Длина: 353 аминокислоты (В) Тип: аминокислотная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ыо: 4:

мее 1

Зег

Авп

Зег

Уа1 5

Рго

Ьеи

Суя

РЬе 10

Тгр

Зег

Ьеи

Сув

Туг 15

Сув

РЬе

А1а

С1у 20

Зег

Рго

Уа1

Рго

РЬе 25

<31у

Рго

О1и

О1у

Агд 30

Ьеи

С1и

Аяр

Ьув

Ьеи 35

ΗΪ8

Ьуз

Рго

Ьуз

А1а 40

ТЬг

С1п

ТЬг

С1и

Уа1 45

Ьув

Рго

Зег

у®1

Агд 50

РЬе

Азп

Ьеи

Агд

ТЬг 55

Зег

Ьуз

Авр

Рго

<31и 60

Ηίβ

61и

С1у Сув

Туг 65

Ьеи

Зег

νβΐ

С1у

Ηίβ 70

Зег

С1П

Рго

Ьеи

<31и 75

Авр

Суз

Зег

РЬе

Авп 80

Мее

ТЫ

А1а

Ьув

ТЫ 85

РЬе

11е

Ηίβ 90

С1у

Тгр

ТЬг

Мее

Зег 95

С1у

Не

РЬе

С1и

Авп 100

Тгр

Ьеи

Н18

Ьуз

Ьеи 105

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

Ηίβ 110

ТЬг

Агд

С1и

ьуз

Аар 115

А1а

Авп

Уа1

Уа1 120

νβΐ

Азр

Тгр

Ьеи

Рго 125

Ьеи

А1а

Нхз

С1п

Ьеи 130

Туг

ТЬг

Аар

А1а

Уа1 135

Авп

Азп

ТЬг

Агд

Уа1 140

νβΐ

С1у

Ηίβ

Зег

Не

А1а

Агд

Мее

Ьеи

Аар

Тгр

Ьеи

61П

61и

Ьуз

Азр

РЬе

5ег

Ьеи

145 150 155 160

С1у

Азп

νβΐ

Ηίβ

Ьеи 165

Не

С1у

Туг

Зег

Ьеи 170

О1у

А1а

Ηίβ

Уа1

АХа Х75

С1у

Туг

А1а

С1у

Азп 180

РЬе

Уа1

Ьув

С1у

ТЬг 185

Уа1

О1у

Агд

Не

ТЫ 190

СХу

Ьеи

АВР

РГО

А1а 195

<Э1у

Рго

Мее

РЬе

С1и 200

С1у

А1а

Авр

Не

Ηίβ 205

Ьуз

Агд

Ьеи

Зег

РГО 210

Авр

Азр

А1а

Азр

РЬе 215

Уа1

Азр

νβΐ

Ьеи

Ηίβ 220

ТЬг

Туг

ТЫ-

Агд

Зег 225

РЬе

<31у

Ьеи

Зег

Не 230

О1у

Не

С1п

Мес

Рго 235

Уа1

С1у

Ηίβ

Ие

Азр 240

Не

Туг

РГО

Азп

О1у 245

С1у

Авр

РЬе

61п

Рго 250

С1у

Суз

С1у

Ьеи

Авп 255

Аар

Уа1

Ьеи

С1у

Зег 260

Не

А1а

Туг

С1у

ТЬг 265

Не

ТЬг

<31и

Уа1

Уа1 270

Ьув

Сув

С1и

Нхз

□1и 275

Агд

А1а

Уа1

Ηίβ

Ьеи 280

РЬе

Уа1

Авр

Зег

Ьеи 285

Уа1

Авп

СХп

Аар

Ьув 290

Рго

Зег

РЬе

А1а

РЬе 295

61п

Сув

ТЬг

Аар

Зег 300

Ави

Агд

РЬе

ьув

Ьув 305

С1у

Не

Сув

Ьеи

Зег 310

Суз

Агд

Ьув

Авп

Агд 315

Сув

Авп

Зег

11е

СХу 320

Туг

Авп

А1а

Ьуз

ьув 325

Мес

Агд

Авп

Ьув

Агд 330

Авп

Зег

Ьув

МеС

Туг 335

Ьеи

Ьув

ТЬг

Агд

А1а 340

<31у

МеС

Рго

РЬе

Агд 345

С1У

Азп

Ьеи

О1п

Зег 350

Ьеи

СХи

Су· (2) Данные последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ыо: 5:

(ί) Характеристики последовательности:

(Α) Длина: 1065 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: двуцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Отличительный признак:

(A) Имя/ключ: СЭ8 (B) Локализация: 1..1065 (χί) Описание последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ыо: 5:

(2) Данные последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νο: 6:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 355 аминокислот (B) Тип: аминокислотная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности 8ЕЦ ГО Νο: 6:

Мее

5ег

Азп

Зег

Уа1

Рго

Ъеи

Ьей

Суз

РЬе

Тгр

Зег

Ьей

Суз

Туг

Суз

1

5

10

15

РЬе

А1а

С1у

Зег

РГО

Уа1

Рго

РЬе

ОХу

Рго

С1и

СХу

Агд

Ьей

6Хи

20

25

30

Азр

Ьуз

Ьей

ΗΪ8

Ьуз

РГО

Ьуз

АХа

ТПг

ехп

ТЬг

СХи

ν»ι

Ьуз

Рго

Зег

35

40

45

Уа1

Агд 50

РЬе

Лап

Ьей

Агд

ТЬг 55

Зег

Ъуз

Аар

Рго

СХи 60

Ηίβ

СХи

СХу

Суз

Туг 65

Ьей

Зег

Уа1

<31у

Ηίβ 70

Зег

СХп

Рго

Ъеи

С1и 75

Аар

Суз

Зег

РЬе

Аап 80

Мее

ТЫ

АХа

Ьуа

ТЬг 85

РЬе

Не

1Хе

Ηίβ 90

С1у

Тгр

ТЫ

Мее

Зег 95

СХу

Не

РЬе

С1и

Аап 100

Тгр

Ьей

Ηίβ

Ьуз

Ъеи 105

УаХ

Зег

АХа

Ьей

Ηίβ но

ТЫ

Агд

С1и

Ъуз

Аар 115

АХа

Азп

УаХ

Уа1 120

УаХ

Азр

Тгр

Ъеи

Рго 125

Ъеи

АХа

Ηίβ

С1п

Ъеи 130

Туг

ТЬг

Азр

АХа

УаХ 135

Азп

Аап

ТЫ

Агд

УаХ 140

Уа1

С1у

Ηίβ

Зег

Не 145

АХа

Агд

Мее

Ьей

Азр 150

Тгр

Ьей

СХп

С1и

Ъуз 155

Азр

Аар

РЬе

Зег

Ьей 160

С1у

Авп

УаХ

ΗΪ8

Ьей 165

Не

С1у

Туг

Зег

Ъеи 170

СХу

АХа

Ηίβ

УаХ

АХа 175

С1у

Туг

АХа

С1у

Авп 180

РЬе

УаХ

Ьув

СХу

ТЬг 185

УаХ

С1у

Агд

11а

ТЫ 190

С1у

Ьей

Авр

Рго

А1а 195

СХу

Рго

Мее

РЬе

СХи 200

С1у

А1а

Аар

Не

Н1з 205

Ьуа

Агд

Ьей

Зег

Рго 210

Аар

А1а

Азр

РЬе 215

УаХ

Азр

УаХ

Ьей

Ηίβ 220

ТЬг

Туг

ТЫ

Агд

Зег 225

РЬе

С1у

Ьей

Зег

Не 230

СХу

Пе

СХп

Мее

Рго 235

УаХ

С1у

Ηίβ

Не

Аар 240

1Хе

Туг

Рго

Азп

СХу 245

С1у

Азр

РЬе

СХп

Рго 250

СХу

Суд

О1у

Ъеи

Аап 255

Аар

ν«ι

Ьей

С1у

Зег 260

11е

А1а

Туг

СХу

ТЫ 265

ХХе

ТЫ

СХи

УаХ

УаХ 270

Ъуз

Суз

<31и

Ηίβ

С1и 275

Агд

А1а

Уа1

Ηίβ

Ьей 280

РЬе

УаХ

Аар

Зег

Ъеи 285

УаХ

Аап

С1п

Аар

Ъуз 290

Рго

Зег

РЬе

АХа

РЬе 295

СХп

Суа

ТЫ

Аар

Зег 300

Авп

Агд

РЬе

Ьуз

Ьув 305

С1у

Не

Суз

Ьей

Зег 310

Суз

Агд

Ъуз

Азп

Агд 315

Суа

Авп

Зег

11е

СХу 320

Туг

Лап

АХа

Ьуа

Ьуа 325

нее

Агд

Азп

Ъуз

Агд 330

Аап

Зег

Ъуз

мее

Туг 335

Ъеи

ьуз

ТЬг

Агд

АХа

СХу

мее

Рго

РЬе

Агд

СХу

Азп

Ьей

С1П

Зег

Ьей

С1и

340 345 350

Суа Рго ·

355 (2) Данные последовательности 8ЕЦ ГО Νο: 7:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 2565 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: двуцепочечная (О) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: СГО8 (B) Локализация: 252..1754 (χί) Описание последовательности 8ЕЦ ГО Νο: 7:

СААТТССССС СССССТССЛС СОССССТСАС ОАССАССОСА САТСТССТТС ТСССССААСС60

СОТТСАСАСТ СССТСССТСС САСССССССС ССТСССТОСС СССААОТТТТ САТГТТССАС120

СТТСТСТССС ТССАСТСССС САСССССТСС СССАСАСААС ССТСТТАССС СССООСАТТС180

СТССАААСАС СААОАООТОС ТТТТТСТТТТ ТТАААЛСТТС ТОТТТСТТСС САСОСВСТСТ 240 ссссссссас а ато АСС аас тсс стт сст ста стс тот ттс тсс лее стс290

Мес Зег Азп Зег УаХ Рго Ъеи Ьей Суз РЬе Тгр Зег Ъеи

360

365

ТСС

ТАТ

ТСС

ТТТ

ССТ

ССС

АСС

ССС

СТА

ССТ

ТТТ

сст

ССА

САС

ССА

338

Сув

Туг

Сув

РЬе

АХа

С1у

Зег

Рго

УаХ

Рго

РЬе

СХу

Рго

СХи

СХу

370

375

380

ССС

СТС

САА

САТ

ААС

СТС

САС

ААА

ССС

ААА

сст

АСА

САС

АСТ

САС

СТС

386

Агд

Ъеи

С1и

Авр

Ьуа

Ъеи

Ηίβ

Ьув

Рго

Ъуз

А1а

ТЬг

С1п

ТЬг

С1и

УаХ

385

390

395

400

ААА

ССА

ТСТ

ста

АСС

ТТТ

ААС

СТС

ССС

АСС

ТСС

ААС

САС

ССА

САС

САТ

434

Ъуз

Рго

Зег

Уа1

Агд

РЬе

Аап

Ъеи

Агд

ТЫ

Зег

Ьув

Азр

Рго

С1и

Ηίβ

405

410

415

САА

ССА

ТСС

ТАС

СТС

ТСС

СТС

ССС

САС

АСС

САС

ССС

ΤΤΑ

САА

САС

ТСС

4Θ2

СХи

С1у

Сув

Туг

Ъеи

8ег

уах

СХу

Н18

Зег

СХп

Рго

Ъеи

СХи

Авр

Суз

420

425

430

АСТ

ТТС

ААС

АТС

АСА

ССТ

ААА

АСС

ТТТ

ТТС

АТС

АТТ

САС

ССА

ТСС

АСС

530

Зег

РЬе

Авп

Мее

ТЫ

А1а

Ъув

ТЫ

РЬе

ХХе

Х1е

ΗΪ8

СХу

Тгр

ТЬг

435

440

445

АТО

АСС

ССТ

АТС

ТТТ

САА

ААС

ТСС

ста

САС

ААА

СТС

стс

ТСА

ССС

СТС

578

МеС

Зег

СХу

Х1е

РЬе

СХи

Авп

Тгр

Ъеи

Ηίβ

Ьув

Ъеи

УаХ

Зег

АХа

Ъеи

450

455

460

САС

АСА

АСА*

ВАС

ААЛ

САС

ССС

ААТ

ОТА

ОТТ

СТО

СТТ

САС

ТСС

СТС

ССС

626

Ηίβ

ТЬг

Агд

СХи

Ъуз

Авр

АХа

Авп

Уа1

УаХ

Уа1

Авр

Тгр

Ъеи

Рго

465

470

475

480

(ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности 8ЕО ГО №: 8:

Мее 1

Зег

Азп

Зег

Уа1 5

Рго

Ьеи

Суз

РЬе 10

Тгр

Зег

Ьеи

Суз

туг 15

Суз

РЬе

А1а

С1у 20

Зег

Рго

Уа1

Рго

РЬе 25

(31у

Рго

С1и

С1у

Агд 30

Ьеи

<51и

Авр

Ьуз

Ьеи 35

Нхз

Ьуз

Рго

Ьуз

Л1а 40

ТЬг

О1п

ТЬг

С1и

Уа1 45

Ьув

Рго

Зег

νβΐ

Агд 50

РЬе

Азп

Ьеи

Агд

ТЬг 55

Зег

Ьуз

Азр

Рго

О1и 60

Нхз

С1и

О1у

Суз

Туг 65

Ьеи

Зег

Уа1

С1у

Нхз 70

Зег

О1п

Рго

Ьеи

61и 75

Азр

Суз

Зег

РЬе

Азп 80

Мее

ТЫ

А1а

Ьуз

ТЬг 85

РЬе

Не

На

Н1з 90

б1у

тгр

ТЬг

Мае

Зег 95

О1у

Не

РЬе

С1и

Лзп 100

Тгр

Ьеи

НХВ

Ьуз

Ьеи 105

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

Нхз 110

ТЬг

Агд

С1и

Ьуз

Азр 115

А1а

АЗП

Уа1

Уа1 120

Уа1

Азр

Тгр

Ьеи

Рго 125

Ьеи

А1а

Нхв

С1п

Ьеи 130

Туг

ТЬг

Азр

А1а

Уа1 135

Азп

ТЬг

Агд

Уа1 140

Уа1

С1у

Н1з

Зег

Не 145

А1а

Агд

Мае

Ьеи

Азр 150

Тгр

Ьеи

С1п

(31и

Ьуз 155

Лар

Авр

РЬе

Зег

Ьеи 160

О1у

АЗП

ν«ι

ΗΪ3

Ьеи

Не

С1у

Туг

Зег

Ьеи

С1у

А1а

Нхз

Уа1

А1а

а1у

165

170

175

Туг

А1а

С1у

Азп 180

РЬе

Уа1

Ьуз

<31у

ТЬг 185

Уа1

С1у

Агд

Не

ТЬг 190

С1у

Ьеи

Азр

Рго

А1а 195

61у

Рго

Мее

РЬе

С1и 200

С1у

А1а

Азр

11е

Нхз 205

Ьуз

Агд

Ьеи

2504

Зег

Рго 210

АЗР

Азр

А1а

Азр

РЬе 215

Уа1

Авр

Уа1

Ьеи

НХВ 220

ТЫ

Туг

ТЫ

Агд

Зег 225

РЬе

С1у

Ьеи

Зег

Не 230

<31у

Не

С1п

МеГ

Рго 235

Уа1

С1у

Нхв

Не

Авр 240

11е

Туг

Рго

АЗП

С1у 245

<31у

Авр

РЬе

С1п

Рго 250

С1у

Суд

С1у

Ьеи

Авп 255

Авр

Уа1

Ьеи

С1у

Зег 260

Не

А1а

Туг

С1у

ТЫ 265

Не

ТЫ

<31и

Уа1

Уа1 270

Ьуз

Суз

61и

Нхз

С1и 275

Агд

А1а

Уа1

Нхз

Ьеи 280

РЬе

νβΐ

Азр

Зег

Ьеи 285

Уа1

Авп

С1п

Азр

ЬУ» 290

Рго

Зег

РЬе

А1а

РЬе 295

<31п

Суз

ТЬг

Азр

Зег 300

Авп

Агд

РЬе

Ьуз

Ьуз 305

С1у

Не

Суз

Ьеи

Зег 310

Суз

Агд

Ьув

Авп

Агд 315

Сув

Авп

Зег

Не

С1у 320

Туг

Азп

А1а

Ьув

Ьув 325

Мег

Агд

Авп

ьуз

Агд 330

Авп

Зег

Ьув

Мег

Туг 335

Ьеи

Ьуз

ТЬг

Агд

А1а 340

31у

Мег

Рго

РЬе

Агд 345

Уа1

Туг

Нхв

туг

С1п 350

МеГ

Ьув

Не

Н18

Уа1 355

РЬе

Зег

Туг

Ьув

Азп 360

Мег

С1у

О1и

Не

С1и 365

Рго

ТЬг

РЬе

Тут

Уа1 370

ТЬг

Ьеи

Туг

О1у

ТЬг 375

Авп

А1а

Азр

Зег

С1п 380

ты

Ьеи

Рго

Ьеи

С1и 385

Не

Уа1

<31и

Агд

11е 390

<31и

<31п

Авп

А1а

ТЬг 395

Авп

ты

РЬе

Ьеи

Уа1 400

Туг

ТЬг

С1и

Авр 405

Ьеи

С1у Азр

Ьеи

Ьеи 410

Ьув

Не

О1п

Ьеи

ТЬг 415

Тгр

С1и

<31у

А1а

Зег 420

О1п

Зег

Тгр

туг

А8П 425

Ьеи

Тгр

Ьув

С1и

РЬе 430

Агд

Зег

Туг

Ьеи

Зег 435

С1п

Рго

Агд

Авп

Рго 440

О1у

Агд

С1и

Ьеи

Авп 445

Не

Агд

11е

Агд 450

Уа1

Ьуз

Зег

О1у

С1и 455

ТЬг

С1п

Агд

Ьув

Ьеи 460

ТЬг

РЬе

Сув

ТЬг

С1и 465

Авр

Рго

С1и

Лзп

ТЫ 470

Зег

Не

Зег

Рго

С1у 475

Агд

С1и

Ьеи

Тгр

РЬе 480

Агд

Ьуз

Суз

Агд

Азр

С1у

Тгр

Агд

МеГ

ьув

Авп

<31и

ТЫ

Зег

Рго

ТЬг

485 490 495

ТСОАСТТОСС АТТГСТАОАС ССТСТТТСТС ТГТООАТОСТ СТАТОТСТАТ АТОСАТОООС

АААбССАССТ СОССССТС6С 60АСССТАТА ССАТАТААСС АОТСОАСОСС СССССОААТТ

2564

2565 (2) Данные последовательности 8ЕО ГО №: 8:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 501 аминокислота (B) Тип: аминокислотная (Ό) Топология: линейная νβΐ С1и Ьеи Рго *

500 (2) Данные последовательности 8Е0 ГО №: 9:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 1035 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: двуцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Отличительный признак:

(A) Имя/ключ: СЭ8 (B) Локализация: 1..1035 (χί) Описание последовательности 8Е0 ΙΌ Νο: 9:

АТС АОС ААС ТСС ОТТ ССТ СТС СТС ТСТ ТТС ТСО АСС СТС ТСС ТАТ ТСС48

Мее бег Азп Зег Уа1 Рго Ьеи Ьеи Суз рЬе Тгр Зег Ьеи Суб ТугСув

505 510515

ТТТ ССТ ССС ССС АСС ССС ОТА ССТ ТТТ СОТ ССА САС ССА ССС СТО САА96

РЬе АХа АХа ОХу бег Рго Уа1 Рго РЬе С1у Рго СХи С1у Агд ЬеиС1и

520 525530

САТ ААО СТС САС ААА ССС ААА ССТ АСА САС АСТ САС СТС ААА ССА ТСТ'144

Ажр Ьуз Ьеи Ηίβ Ьуз Рго Ьуз А1а ТЫ СХп ТЫ С1и Уа1 Ьуз Рго Зег

535 540545

ОТС АСС ТТТ ААС СТС ССС АСС ТСС ААС САС ССА САС САТ САА ССА ТСС192

Уа1 Агд РЬе Азп Ьеи Агд ТЫ Зег Ьуз Азр Рго О1и Ηίβ СХи СХу Суз

550 555 560565

ТАС СТС ТСС СТС ССС САС АСС САС ССС ТТА САА САС ТСС АСТ ТТС ААС240

Туг Ьеи Зег УаХ С1у Ηίβ Зег СХп Рго Ьеи С1и Азр Суз Зег РЬе Азп

570 575580

АТС АСА ССТ ААА АСС ТТТ ТТС АТС АТТ САС СОА ТСС АСС АТС АСС ООТ288

МеЕ ТЫ А1а Ьуз ТНг РЬе РЬе Не 1Хе ΗΪ3 С1у Тгр ТЫ Нес Зег <Э1у

585 590595

АТС ТТТ САА ААС ТСС СТС САС ААА СТС СТС ТСА ССС СТС САС АСА АСА336

11е РЬе С1и Азп Тгр Ьеи Ηίβ Ьуз Ьеи УаХ Зег АХа Ьеи Ηίβ ТНгАгд

600 605610

САС ААА САС ССС ААТ СТА СТТ СТС СТТ САС ТСС СТС ССС СТС ССС САС384

ОХи Ьуа Авр АХа Азп Уа1 Уа1 УаХ Уа1 Авр Тгр Ьеи Рго Ьеи АХаΗίβ

615 620625

САС СТТ ТАС АСС САТ ОСС СТС ААТ ААТ АСС АОС СТС СТС ОСА САС АСС432

О1п Ьеи Туг ТЬх Авр А1а УаХ Авп Азп ТЫ Агд Уа1 Уа1 С1у ΗίβЗег

630 635 640645

АТТ ССС АОО АТС СТС САС ТСС СТС САС ОДО ААС САС САТ ТТТ ТСТ СТС480

Х1е АХа Агд ИеЕ Ьеи Авр Тгр Ьеи С1п С1и Ьуз Азр Авр РНе ЗегЬеи

650 655660

ООО ААТ СТС САС ТТС АТС ССС ТАС АОС СТС ССА ОСС САС СТС ССС ОСО528

С1у Авп УаХ Ηίβ Ьеи 1Хе С1у Туг Зег Ьеи С1у А1а Ηίβ УаХ А1а С1у

665 670675

ТАТ ОСА СОС ААС ТТС СТС ААА ССА АСС СТС ССС ССА АТС АСА ССТ ТТС576

Туг АХа СХу Азп РЬе Уа1 Ьуз СХу ТЫ УаХ СХу Агд 11е ТЬг СХу Ьеи

680 685690

ОАТ ССТ ССС ООО ССС АТС ТТТ САА СОС ССС САС АТС САС ААС АСС СТС624

Авр Рго АХа С1у Рго МеЕ РНе СХи СХу АХа Азр 1Хе Ηίβ Ьуз Агд Ьеи

695 700705

ТСТ ССС САС САТ ССА САТ ТТТ ОТС САТ ОТС СТС САС АСС ТАС АСС СОТ672

Зег Рго Авр Авр А1а Азр РЬе УаХ Азр Уа1 Ьеи Ηίβ ТЫ Тут ТЫ Агд

7X0 715 720725

ТСС ТТС ССС ТТС АОС АТТ ООТ АТТ САС АТС ССТ СТС СОС САС АТТ САС720

Зег РЬе С1у Ьеи бег 1Хе СХу 11а СХп МеЕ Рго УаХ СХу Ηίβ Не Авр

730 735740

АТС ТАС ССС ААТ ССС СОТ ОАС ТТС САС ССА ССС ТСТ СОА СТС ААС ОАТ768

Не Тух Рго Авп СХу СХу Авр РЬе СХп Рго С1у Сув СХу Ьеи Азп Азр

745 750755

ОТС ТТС ССА ТСА АТТ ОСА ТАТ ОСА АСА АТС АСА ОАО СТС ОТА ААА ТСТ816

УаХ Ьеи СХу бег Не А1а Туг С1у ТЬг Не ТЫ С1и Уа1 УаХ Ьуа Сув

760 765770

САС САТ ОАО ССА ССС ОТС САС СТС ТТТ ОТТ САС ТСТ СТС ОТС ААТ САС864

СХи Ηίβ СХи Агд А1а УаХ Ηίβ Ьеи РЬе УаХ Азр бег Ьеи УаХ Азп СХп

775 780785

САС ААС ССС АСТ ТТТ ОСС ТТС САС ТСС АСТ ОАС ТСС ААТ ССС ТТС ААА912

Азр Ьуз Рго бег РЬе А1а РНе С1п Суз ТЫ Авр Зег Авп Агд РЬе Ьув

790 795 800805

ААС ССС АТС ТСТ СТС АОС ТСС ССС ААС ААС СОТ ТСТ ААТ АСС АТТ ССС960

Ьув О1у Не Суз Ьеи бег Сув Агд Ьуз Азп Агд Суз Авп Зег 11е С1у

810 815820

ТАС ААТ ССС ААС ААА АТС АСО ААС ААС АСС ААС АСС ААА АТС ТАС СТА1008

Туг Авп А1а Ьуз Ьуз МеЕ Агд Азп Ьуз Агд Азп бег Ьув МеЕ Туг Ьеи

825 830835

ААА АСС СОС ССА ССС АТС ССТ ТТС АСА1035

Ьув ТЬг Агд А1а С1у НвЕ Рго РЬе Агд

840845 (2) Данные последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νο: 10:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 345 аминокислот (B) Тип: аминокислотная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νο: 10:

1

Зег

АвП

Зег

Уа1 Рго Ьеи Ьеи Суз РНе Тгр Зег Ьеи Сув Тут Сув

5

10

15

РЬе

АХа

А1а

О1у 20

Зег

Рго

УаХ

Рго

РНе 25

СХу

Рго

С1и

СХу

Агд 30

Ьеи

СХи

Аяр

Ьув

Ьеи 35

Ηίβ

Ьув

Рго

Ьуз

А1а 40

ТНг

СХп

ТНг

С1и

УаХ 45

Ьув

Рго

вег

ναΐ

Агд 50

РЬ·

Авп

Ьеи

Агд

ТНг 55

вег

Ьув

Азр

Рго

С1и 60

Ηίβ

СХи

СХу

Суя

Туг 65

Ьеи

Зег

Уа1

С1у

Ηίβ 70

5ег

61п

Рго

Ьеи

О1и 75

Аяр

Сув

Зег

РНе

Авп 80

Мее

ТНг

А1а

Ьув

ТНг 85

РНе

Не

не

Ηίβ 90

О1у

Тгр

ТНг

нее

вег 95

ОХу

Не

РНе

С1и

Авп 100

Тгр

Ьеи

Ηίβ

Ьув

Ьеи 105

УаХ

Зег

А1а

Ьеи

Ηίβ но

ТНг

Агд

О1и

Ьув

Авр 115

А1а

Авп

УаХ

УаХ 120

УаХ

Авр

Тгр

Ьеи

Рго 125

Ьеи

А1а

Ηίβ

О1п

Ьеи

Туг

ТНг

Авр

А1а

Уа1

Авп

ТНг

Агд

Уа1

УаХ

СХу

Ηίβ

вег

130 135 140

11е Αία Агд Нее Ьеи Авр Тгр Ьеи С1п С1и Ьув Азр Азр РЬе Зег Ьеи

145

150

155

160

СХу

Азп

УаХ

Ηίβ

Ьеи 165

11е

СХу

Туг

Зег

Ьеи 170

61у

А1а

Ηίβ

УаХ

А1а 175

С1у

Туг

А1а

СХу

Азп 180

РНе

УаХ

Ьув

С1у

ТЬг 185

УаХ

СХу

Агд

Пе

ТНг 190

СХу

Ьеи

Азр

Рго

А1а 195

СХу

Рго

мее

РЬе

<31 и 200

СХу

А1а

Авр

11е

Ηίβ 205

Ьув

Агд

Ьеи

вег

Рго 210

Авр

АХа

Азр

РЬе 215

УаХ

Аяр

УаХ

Ьеи

Ηίβ 220

ТЬг

Туг

ТНг

Агд

вег 225

РЬе

С1у

Ьеи

Зег

1Хе 230

С1у

11е

СХп

Мее

Рго 235

УаХ

СХу

Ηίβ

11е

Авр 240

1Хе

туг

Рго

Авп

СХу 245

С1у

Азр

РЬе

С1п

Рго 250

СХу

Сув

СХу

Ьеи

Азп 255

Авр

УаХ

Ьеи

СХу

вех 260

11е

АХа

Туг

С1у

ТНг 265

11е

ТЬг

СХи

Уа1

УаХ 270

ьув

сув

СХи

Ηίβ

С1и

Агд

АХа

УаХ

Ηίβ

Ьеи

РЬе

УаХ

Авр

вег

Ьеи

уах

Авп

С1п

275 Авр Ьув Рго

вег

280

285

Ьуз

РЬе

АХа

РЬе 295

СХп

Суз

ТЫ

Авр

вег 300

Авп

Агд РЬе

290

Ьуз

СХу

1Хе

Суз

Ьеи

Зег

Суз

Агд

Ьуз

Азп

Агд

Суя

Авп

Зег

Не

СХу

305

310

315

320

туг

Азп

А1а

Ьуз

Мее

Агд

Авп

Ьув

Агд

Авп

вег

Ьуз

Мее

Туг

Ьеи

325

330

335

Ьув

ТЬг

Агд

АХа

СХу

Мее

Рго

РЬе

Агд

340

345

(2) Данные последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νο: 11:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 225 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: двуцепочечная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: кДНК (ίχ) Отличительный признак:

(A) Имя/ключ: ί.Ό8 (B) Локализация: 1..225 (χί) Описание последовательности 8ЕЦ ΙΌ Νο: 11:

сто

ССА ТСС АТС ОСС ТАТ

ССС АСС АТС ССС ОАО ОТС СТО ААО ТСС ОАО

48

ОХу

бег

11е

А1а 350

Туг

О1у

ТЬг

Не

А1а 355

О1и

Уа1

Ьув Суз О1и 360

САТ

САС

ССС

СТО

САТ

СТС

ТТТ

СТО

САС

ТСС

СТС

ААС

САС

ОАС

96

Ηίβ

С1и

Агд

А1а

Уа1

Ηίβ

Ьеи

РЬе

Уа1

Азр

бег

Ьеи

νβΐ

Авп

С1п

Авр

365

370

375

ААС

ССС

АОС

ТТТ

ОСС

ТТС

САС

ТСС

АСА

САС

ТСС

ААС

сос

ТТС

ААА

144

Ьув

Рго

бег

РЬе

АХа

РЬе

С1п

Сув

ТЫ

Аяр

бег

Азп

Агд

РЬе

Ьув

380

385

390

ССС

АТС

ТОТ

СТС

АОС

ТСС

ССС

ААС

СОС

ТСТ

ААС

ОСС

АТС

ОСС

ТАС

192

СХу

Не

Суз

Ьеи

бег

Сув

Агд

Ьув

Авп

Агд

Сув

Авп

О1у

11е

О1у

Тут

395

400

405

ААТ

ССТ

ААС

ААО

АСС

ААТ

ААС

АОС

ААС

АСС

225

Авп

АХа

Ьув

ТЫ

Агд

Авп

Ьуз

Агд

Азп

ТЫ

410

415

420

(2) Данные последовательности 8ЕЦ ΙΌ

Νο:12:

(ί) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 75 аминокислот (В) Тип: аминокислотная (Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ыо: 12:

Ьеи

С1у

Зег

11е

А1а

Туг

С1у

ТЬг

11е

А1а

С1и

Уа1

νβΐ

Ьув

суш

С1и

1

5

10

15

Н1е

С1и

Агд

А1а

Уа1

Нхз

Ьеи

РЬе

Уа1

Азр

Зег

Ьеи

Уа1

Азп

С1п

Азр

20

25

30

Ьуз

Рго

Зег

РЬе

А1а

РЬе

61п

Суз

ТЬг

Азр

Зег

Азп

Агд

РЬе

Ьуш

Ьуз

35

40

45

С1у

Не

Суз

Ьеи

Вех

Суш

Агд

ьув

Азп

Агд

Суш

Азп

С1у

Не

С1у

Туг

50

55

60

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

Агд

Азп

Ьув

Агд

Азп

ТЬг

65

70

75

(2) Данные последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ыо:

13:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 472 аминокислоты (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочечность:

(Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности ЗЕЦ ΙΌ

Ыо: 13:

Зег	Зег	Ьуз	О1и	А1а	РЬе	С1и	Ьуз	С1у	ьеи
	290					295
Лап	Агд	Суз	Азп	АЗП	Ьеи	(31у	Туг	С1и	Не
305					310
Агд	Зег	Зег	Ьув	Мес	Туг	Ьеи	Ьуз	ТЬг	Агд
				325					330
ν<ι	РЬе	ΗΪ8	туг	С1п	Уа1	Ьув	11е	ΗΪ8	РЬе

(2) Данные последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ыо:14:

(ί) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 499 аминокислот (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочечность:

(Ό) Топология: линейная (ίί) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ыо: 14:

Мес 1

Азр

ТЬг

Зег

Рго 5

Ьеи

Суш

РЬе

Зег

11е 10

Ъеи

Ьеи

Уа1

Ьеи

Суз 15

Не

РЬе

Не

С1п

Зег 20

Вех

А1а

Ьеи

С1у

61п 25

Зег

Ьеи

Ьуз

Рго

С1и 30

Рго

РЬе

С1у

Агд

Агд 35

А1а

αΐη

Л1а

νβΐ

С1и 40

ТЬг

Авп

Ьув

ТЬг

Ьеи 45

НХЗ

С1и

Мес

Ьуз

ТЬг 50

Агд

РЬе

Ьеи

РЬе 55

С1у

С1и

ТЬг

Авп

С1п 60

С1у

Суш

С1п

Не

Агд 65

Не

Азп

Нхз

Рго

Азр 70

ТЬг

Ьеи

С1п

<31и

Сув 75

С1у

РЬе

Азп

Зег

Зег 80

Ьеи

Рго

Ьеи

Уа1

Мес 85

Не

Н1з

С1у

Тгр 90

Зег

Уа1

Авр

<31у

νβΐ 95

Ьеи

С1и

Азп

Тгр

Не 100

Тгр

С1п

Мес

Уа1

АХа 105

А1а

Ьеи

Ьуш

Зег

С1п 110

Рго

А1а

О1п

РГО

Уа1 115

Азп

ναΐ

С1у

Ьеи

νβΐ 120

АВР

Тгр

Не

ТЬг

Ьеи 125

А1а

ΗΪ3

Азр

Нхз

Туг 130

ТЬг

Не

А1а

νβΐ

Агд 135

АШП

ТЬг

Агд

Ьеи

νβΐ 140

<31у

Ьуш

С1и

Уа1

А1а 145

А1а

Ьеи

Агд

Тгр 150

Ьеи

СХи

С1и

Зег

Уа1 155

<31п

Ьеи

Зег

Агд

Зег 160

НА в

Уа1

Н18

Ьеи

Не 165

С1у

Туг

Зег

Ьеи

С1у 170

А1а

НХ8

νβΐ

Зег

С1у 175

РЬе

А1а С1у Вег Зег

11е С1у С1у ТЬг Нхв Ьуш Не С1у Агд Не ТЬг С1у

180

185

190

Ьеи

Азр

А1а 195

А1а

С1у

Рго

Ьеи

РЬе 200

С1и

СХу

Зег

А1а

Рго 205

Зег

Азп

Агд

Ьеи

Зег 210

рго

Азр

А1а

Азп 215

РНе

Уа1

Азр

А1а

11е 220

Нхз

ТЬг

РЬе

ТЬг

Агд 225

С1и

ΗΪ5

МеС

СХу

Ьеи 230

Зег

νβΐ

С1у

Не

Ьув 235

С1п

Рго

11е

С1у

Нхз 240

Туг

Азр

РЬе

Туг

Рго 245

Азп

С1у

Зег

РЬе 250

С1п

Рто

С1у

Сув

Нхз 255

РЬе

Ьеи

СХи

Ьеи

Туг 260

Агд

Нхз

Не

А1а

С1п 265

Нхз

С1у

РЬе

Азп

А1а 270

Не

ТЬг

С1п

ТЬг

11е 275

Ьуз

Сув

Зег

НХ8

С1и 260

Агд

Зег

νβΐ

Ηΐβ

Ьеи 285

РЬе

Не

АШр

Зег

Ьеи 290

Ьеи

нА в

А1а

С1у

ТЬг 295

С1п

Зег

МеС

А1а

Туг 300

Рго

Суз

С1у

Азр

Мес 305

Азп

Зег

РЬе

Зег

С1п 310

С1у

Ьеи

Сув

Ьеи

Зег 315

Сув

Ьуз

Ьув

С1у

Агд 320

Сув

Азп

ТЬг

Ьеи

С1У 325

Туг

Н18

Уа1

Агд

С1п 330

С1и

Рго

Агд

Зег

Ьуз 335

Зег

Ьув

Агд

Ьеи

РЬе 340

Ьеи

νβΐ

ТЬг

Агд

А1а 345

С1п

Зег

Рго

РЬе

Ьуз 350

νβΐ

Туг

Н1з

Туг

С1п 355

Ьеи

Ьув

Не

С1п

РЬе 360

11е

Азп

С1п

ТЬг

СХи 365

ТЬг

Рго

Х1е

С1П

ТЬг 370

ТЬг

РЬе

ТЬг

МеС

Зег 375

Ьеи

С1у

ТЬг

Ьув 380

С1и

Ьув

Мес

С1п

Ьуз 385

Не

Рго

Не

ТЬг

Ьеи 390

С1у

Ьуш

С1у

11е

А1а 395

Зег

Азп

Ьув

ТЬг

туг 400

Зег

РЬе

Ьеи

11е

ТЬг 405

Ьеи

Авр

Уа1

Азр

11е 410

С1у

С1и

Ьеи

11е

Мес 415

Не

Ьув

РЬе

Ьув

Тгр 420

С1и

АЗП

Зег

А1а

ναΐ 425

Тгр

А1а

Азп

Уа1

Тгр 430

Авр

ТЬг

νβΐ

С1П

ТЬг 435

11е

Рго

Тгр

Зег 440

ТЬг

О1у

Рго

Агд

Нхз 445

Зег

С1у

Ьеи

νβΐ

Ьеи

Ьуз

ТНг

11 е

Агд

Уа1

Ьуш

А1а

С1у

С1и

ТНг

С1п

Агд

МеС

450 455 450

ТЬг РЬе Суз Зег С1и Азп ТЬг Азр Азр Ьеи Ьеи Ьеи Агд Рго ТЬг С1п

465 470 475 480

последовательности 8 ЕС) ΙΌ (2) Данные

15:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 465 аминокислот (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочечность:

(Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: белок (χί) Описание последовательности 8 ЕС) ΙΌ 15:

мес

Ьеи

Рго

Ьеи

Тгр

ТЬг

Ьеи

бег

Ьеи

С1у

А 1а

ν»ι

А1а

С1у

1

5

10

15

ьув

С1и

νβΐ

Сув

Туг

С1и

Агд

Ьеи

С1у

Сув

РНе

Зег

Авр

Зег

Рго

20

25

30

Тгр

Бег

С1у

Не

ТЬг

С1и

Агд

Рго

Ьеи

Ηίβ

Не

Ьеи

Рго

Тгр

Зег

Рго

А1а

Зег

Ьуз

Не

Уа1

δίи

ТЬг Азп

Уа1

С1у

ьув

О1П

РЬе

Авп

РЬе

435

440

445

Сув

Зег

Рго

С1и

ТЬг

νβΐ

Агд

С1и С1и

Уа1

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Рго

450

455

460

Сув

465

ТНг

С1у 130

Туг

ТЬг

С1п

Л1а

Зег 135

С1п

Азп

11е

Агд

Не 140

Уа1

О1у

А1а

С1и

νβΐ 145

А1а

Туг

РНе

νβΐ

С1и 150

РЬе

Ьеи

С1п

Зег

А1а 155

РЬе

С1у Туг

Бег

Рго 160

Зег

Азп

νβΐ

Ηίβ

νβΐ 165

Не

С1у

Ηίβ

Зег

Ьеи 170

С1у

А1а

Ηίβ

А1а

А1а 175

С1у

(31и

А1а

С1у

Агд 180

Агд

ТЬг

Авп

С1у

ТЬг 185

Не

С1у

Агд

Не

ТЬг С1у 190

Ьеи

Авр

Рго

А1а 195

С1и

Рго

Суз

РЬе

С1П 200

С1у

ТЬг

Рго

С1и

Ьеи 205

νβΐ

Агд

Ьеи

Авр

Рго 210

Зег

Авр

А1в

Ьув

РЬе 215

Уа1

Авр

Уа1

Не

Ηίβ 220

ТЬг

Авр

С1у

А1а

РГО 225

Не

Уа1

Рго

Азп

Ьеи 230

<31у

РЬе

С1у

Мес

Зег 235

С1п

Уа1

νβΐ

С1у

Ηίβ 240

Ьеи

Авр

РЬе

Рго 245

Азп

С1у

νβΐ

С1и 250

МеС

Рго

С1у

Сув

Ьуз 255

Ьуз

Авп

Не

Ьеи

Зег 260

ΰΐη

Не

νσΐ Авр

Не 265

Авр

Й1у

11е

Тгр

<31и 270

С1у

ТЬг

Агд

Авр

РЬе 275

А1а

Л1а

Сув

Лап

Ηίβ 280

Ьеи

Агд

Бег

Туг

Ьув 285

Туг

ТЬг

Авр

Зег 290

Не

ν«ι

АвП

рго

Авр 295

<31у

РЬе

А1а

С1у

РЬе 300

Рго

Суз

А1а

Зет

Туг

Азп

Уа1

РЬе

ТЬг

Л1а

Авп

ьув

Суз

РЬе

Рго

Сув

Рго

Бег

С1у С1у

305					310					315
Суз	Рго	<31п	Мес	С1у 325	Ηίβ	Туг	А1а	Азр	Агд 330	Туг	Рго
Авр	Уа1	С1у	О1п 340	Ьув	РЬе	Туг	Ьеи	Авр 345	ТЬг	С1у Авр
А1а	Агд	Тгр	Агд	Туг	Ьув	Уа1	Бег	Уа1	ТЬг	Ьеи	Бег

(2) Данные последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 16:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 17 аминокислот (B) Тип: аминокислотная (C) Цепочечность:

(Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: пептид (ν) Тип фрагмента: внутренний (χί) Описание последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 16:

е1у Рго С1и О1у Лтд Ьеи <31и Аар Ьуа Ьеи И1в Ьув Рго Ьув А1а ТЬг 15 10 15

Суа (2) Данные последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 17:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 13 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис. = олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 17:

ТТТТТТТТТТ Т6А 13 (2) Данные последовательности 8ЕС) ΙΌ ΝΘ: 18: (ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 10 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис. = олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 18:

ОАТСААТСОС Ю (2) Данные последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 19:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 23 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание :/опис.= олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 19:

ТА6САСАТ6С АСАСТСТААТ СТС 23 (2) Данные последовательности 8 ЕС) ΙΌ ^: 20:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 20 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание:/опис.= ”олигонуклеотид” (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО Νο: 20:

6АТТ6Т6СТ6 6ССАСТТСТС 20 (2) Данные последовательности 8Е() ГО Νο:21:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 19 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (и) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис. = ”олигонуклеотид” (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО Νο:21:

ОАСАСТССАС бОАСТСААе 19 (2) Данные последовательности 8Е() ГО Νο: 22:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 48 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (и) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание:/опис.= ”олигонуклеотид” (ΐχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: модифицированное основание (B) Локализация: 36 (Ό) Другая информация: /мод.основание=1 (ΐχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: модифицированное основание (B) Локализация: 37 (Ό) Другая информация: /мод.основание=1 (ΐχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: модифицированное основание (B) Локализация: 41 (Ό) Другая информация: /мод.основание=1 (ΐχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: модифицированное основание (B) Локализация: 42 (Ό) Другая информация: /мод.основание=1 (ΐχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: модифицированное основание (B) Локализация: 46 (Ό) Другая информация: /мод.основание=1 (ΐχ) Отличительная особенность:

(A) Имя/ключ: модифицированное основание (B) Локализация: 47 (Ό) Другая информация: /мод.основание=1 (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО Νο: 22:

СиАСиАСЦАС ЦАСОССАСОС СТССАСТАСТ АСБСОШССС ΝΝ666ΝΝ6 48 (2) Данные последовательности 8Е() ГО

Νο: 23:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 28 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (и) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис. = ”олигонуклеотид” (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО

Νο: 23:

САСАСАСАСО ССАСбСОТСб АСТАОТАС 28 (2) Данные последовательности 8Е() ГО Νο:

24:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 24 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (и) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание:/опис.= ”олигонуклеотид” (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО

Νο: 24:

АССАССАТСС АСАССАААСС ССТС 24 (2) Данные последовательности 8Е() ГО

Νο: 25:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 25 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (и) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание:/опис.= ''олигонуклеотид” (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО

Νο: 25:

ССАСТТТСАС сстелсттст ТАТТС 25 (2) Данные последовательности 8Е() ГО

Νο: 26:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 21 пара оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (и) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис. = олигонуклеотид” (χΐ) Описание последовательности 8Е() ГО

Νο: 26:

66СТСТ6ОАС ТСААСОАТОТ С 21 (2) Данные последовательности 8Е() ГО

Νο: 27:

(ΐ) Характеристики последовательности:

(А) Длина: 22 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис.= олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8ЕР ΙΌ Νο: 27:

ССБ6БТБ66Т АББТАСАТТТ ТБ 22 (2) Данные последовательности 8ЕР ΙΌ Νο: 28:

(1) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 25 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис.= олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8ЕР ΙΌ Νο: 28:

СБСССТБАСТ ТССАБССАСС СТ6Т6 25 (2) Данные последовательности 8ЕР ΙΌ Νο: 29:

(1) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 25 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис.= олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8ЕР ΙΌ Νο: 29:

ААСТСТБААА БОСАТБССТС ССС66 25 (2) Данные последовательности 8Ер ГО Νο: 30:

(ι) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 26 пар оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ϋ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис.= олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8Ер ГО Νο: 30:

ТбААББТСББ А6ТСААС6БА ТТТ6БТ 26 (2) Данные последовательности 8Ер ГО Νο: 31: (ι) Характеристики последовательности:

(A) Длина: 24 пары оснований (B) Тип: нуклеиновая кислота (C) Цепочечность: одноцепочечная (Ό) Топология: линейная (ΐΐ) Тип молекулы: другая нуклеиновая кислота (А) Описание: /опис.= олигонуклеотид (χί) Описание последовательности 8Ер ГО Νο: 31:

САТСТСЮССС АТОАбаТССА ССАС 24

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенный полипептид, кодируемый геном, подобным гену липазы, где указанный полипептид (a) связывается с гепарином;

(b) имеет гомологию с липопротеидлипазой и липазой печени человека и (c) включает каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Ер ГО NО: 6 и 8Ер ГО №: 8.
2. Выделенный полипептид по п.1, где указанный каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз имеет аминокислотную последовательность 8ЕР ГО NО: 10.
3. Выделенный полипептид по п.1, где указанный выделенный полипептид имеет аминокислотную последовательность 8ЕР ГО NО: 8 и расчетную молекулярную массу около 55 кДа.
4. Выделенный полипептид по п.1, где указанный выделенный полипептид имеет аминокислотную последовательность 8Ер ГО NО: 8 и кажущуюся молекулярную массу около 68 кДа по результатам электрофореза в 10% ДСНПААГ.
5. Композиция, содержащая полипептид, охарактеризованный в п.1, и биологически совместимый раствор.
6. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, охарактеризованный в п.1, и фармацевтически приемлемый носитель.
7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, охарактеризованный в п.1, где указанная выделенная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕР ГО №: 5, 8Ер ГО КО: 7, 8Ер ГО КО: 9 и нуклеотиды 252-1754 8Ер ГО №: 7.
8. Выделенная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с нуклеиновой кислотой, имеющей последовательность 8Ер ГО NО: 5 или 7, и где указанные условия высокой жесткости представляют собой 0,1 χ 88С, 0,5% ДСН при 68°С.
9. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, которая включает 20 нуклеотидов.
10. Выделенная нуклеиновая кислота по п.8, которая является антисмысловой нуклеиновой кислотой.
11. Выделенная нуклеиновая кислота по п.10, где указанная антисмысловая последовательность нуклеиновой кислоты оперативно соединена с областью, регулирующей экспрессию гена.
12. Выделенная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в условиях высокой жест кости с мишенью, состоящей из нуклеотидов 1036-1065 81Е) ГО ЫО: 5.
13. Композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.10, и биологически совместимый раствор.
14. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.10, и фармацевтически приемлемый носитель.
15. Вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в пп.7 и 8, оперативно соединенную с регуляторной областью.
16. Вектор по п.15, где указанная регуляторная область получена из гетерологичного источника.
17. Вектор по п.15 или 16, который является вирусным вектором.
18. Вектор по п.17, который является аденовирусным вектором.
19. Штамм эукариотических клеток, содержащих вектор по пп.15-18, где указанные клетки выбраны из группы, состоящей из клетки клеточной линии РыСКРР, клетки клеточной линии СР+епуА-12, клетки СНО, клетки ТНР-1, клетки НИУЕС, клетки НСЕАС и клетки СО8-7.
20. Штамм клеток по п.20, где указанные клетки являются клетками СО8-7.
21. Композиция, содержащая вектор, охарастеризованный в пп.15-18, и биологически совместимый раствор.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор, охарактеризованный в пп.15-18, и фармацевтически приемлемый носитель.
23. Способ получения полипептида по п.1, предусматривающий культивирование рекомбинантных клеток, охарактеризованных в пп. 19-21, в условиях, благоприятствующих экспрессии указанного полипептида, с последующим выделением полипептида из рекомбинантных клеток.
24. Способ скрининга для выявления агонистов или антагонистов БЕС-активности, предусматривающий (а) контактирование потенциальных агонистов или антагонистов с полипептидом ББС по п.1 и (Ь) измерение способности потенциальных агонистов или антагонистов усиливать или ингибировать ББС-активность.
25. Способ ферментативного гидролиза сложного эфира фосфатидилхолина, предусматривающий контактирование указанного сложного эфира фосфатидилхолина с полипептидом, охарактеризованным в п.1.
26. Способ улучшения липидного профиля сыворотки человека или иного животного, имеющего нежелательный липидный профиль, где указанный способ предусматривает введение эффективного количества фармацевтической композиции, охарактеризованной в п.6 или 14.
27. Выделенный полипептид, кодируемый геном, подобным гену липазы, где указанный полипептид (a) связывается с гепарином, (b) имеет гомологию с липопротеидлипазой и липазой печени человека, (c) включает каталитический домен массой 39 кДа семейства триацилглицероллипаз и (б) происходит от кролика, где указанный выделенный полипептид содержит аминокислотную последовательность 81Е) ГО ЫО: 12.
28. Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует полипептид, охарактеризованный в п.27.
29. Выделенная нуклеиновая кислота по п.28, содержащая нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО ЫО: 11.
30. Поликлональное антитело, способное специфично связываться с выделенным полипептидом, охарактеризованным в п.1.
31. Поликлональное антитело по п.30, нейтрализующее фосфолипазную активность полипептида, охарактеризованного в п.1.
32. Композиция, содержащая поликлональное антитело, охарактеризованное в пп.30 и 31, и биологически совместимый раствор.
33. Фармацевтическая композиция, содержащая поликлональное антитело, охарактеризованное в пп.30 и 31, и фармацевтически приемлемый носитель.