ES2239367T3 - Polipeptidos llg de la familia de las triacilglicerol lipasas, y composiciones y metodos para su uso en la hidrolisis enzimatica y terapias proteicas y genicas. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A POLIPEPTIDOS DEL TIPO LIPOPROTEINA LIPASA, ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHOS POLIPEPTIDOS, UNAS SECUENCIAS DE ANTIDETECCION ASI COMO ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNOS PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE DICHOS POLIPEPTIDOS, EN UN SISTEMA DE RECOMBINACION, ASI COMO SU USO PARA EL CRIBADO DE LOS AGONISTAS Y/O ANTAGONISTAS DE ESTOS POLIPEPTIDOS. ESTA INVENCION SE REFIERE FINALMENTE A UNOS PROCEDIMIENTOS Y A UNAS COMPOSICIONES DE TRATAMIENTO DE LOS TRASTORNOS DEL METABOLISMO LIPIDICO.

Description

Polipéptidos LLG de la familia de las triacilglicerol lipasas, y composiciones y métodos para su uso en la hidrólisis enzimática y terapias proteicas y génicas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los polipéptidos de la familia de las triaciglicerol lipasas, a los ácidos nucleicos que codifican a dichos polipéptidos, a las secuencias antisentido derivadas de los ácidos nucleicos mencionados y a los anticuerpos contra dichos polipéptidos. Esta invención también se refiere a la preparación de los polipéptidos mencionados utilizando la tecnología recombinante y al uso de dichos polipéptidos para seleccionar los agonistas o los antagonistas de dichos polipéptidos. Esta invención de igual modo se refiere a los métodos que se establecen para el uso de tales polipéptidos y de las secuencias de ácido nucleico que codifican a los mismos en los compuestos farmacéuticos, que incluyen los compuestos genéticos terapéuticos para el tratamiento de los trastornos del metabolismo de los lípidos y de las lipoproteínas.

Antecedentes de la invención A) Lípidos

Los lípidos son biomoléculas orgánicas insolubles en agua, las cuales son componentes esenciales de funciones biológicas diversas, que incluyen el almacenamiento, el transporte y el metabolismo de la energía y la estructura de la membrana y la fluidez. Los lípidos son derivados de dos fuentes en el hombre y en otros animales: algunos lípidos se ingieren como grasas y aceites alimenticios y otros lípidos son biosintetizados por el hombre o el animal. En los mamíferos, por lo menos el 10% del peso corporal es lípido, la mayor cantidad del cual se encuentra en forma de triacilgliceroles.

Los triacilgliceroles, también conocidos como triglicéridos y triacilglicéridos, están constituidos por tres ácidos grasos esterificados hasta el glicerol. Los triacilgliceroles alimenticios se depositan en los tejidos adiposos como una fuente de energía, o bien son hidrolizados en el tracto digestivo por medio de las triacilglicerol lipasas, de las cuales la más importante es la lipasa pancreática. Los triacilgliceroles se transportan a través de los tejidos en forma de lipoproteínas.

Las lipoproteínas son ensambles similares a las micelas que se encuentran en el plasma, las cuales contienen proporciones variables de diferentes tipos de lípidos y proteínas (que se denominan apoproteínas). Existen cinco clases principales de lipoproteínas plasmáticas, cuya función principal es el transporte de los lípidos. Estas clases son, en orden de incremento de la densidad, los quilomicrones, las lipotroteínas de muy baja densidad (VLDL), las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), las lipoproteínas de baja densidad (LDL), y las lipoproteínas de alta densidad (HDL). Si bien muchos tipos de lípidos se encuentran asociados con cada clase de lipoproteína, cada clase transporta en forma predominante un tipo de lípido; los triacilgliceroles que se han descripto con anterioridad son transportados en quilomicrones, VLDL e IDL, mientras que los fosfolípidos y los ésteres del colesterol son transportados en las HDL y en las LDL respectivamente.

Los fosfolípidos son ésteres de ácido di-graso de glicerol fosfato, que también contienen un grupo polar acoplado al fosfato. Los fosfolípidos son componentes estructurales importantes o membranas celulares. Los fosfolípidos son hidrolizados por las enzimas denominadas fosfolipasas. La fosfatidilcolina, un fosfolípido que se ofrece a modo de ejemplo es el componente principal de la mayoría de las membranas de la célula eucariótica.

El colesterol es el precursor metabólico de las hormonas esteroides y de los ácidos biliares al igual que un componente esencial de las membranas celulares. En el hombre y en otros animales, el colesterol se ingiere en la dieta y también es sintetizado por el hígado y otros tejidos. El colesterol es transportado a través de los tejidos en la forma de ésteres de colesteril en las LDL y en otras lipoproteínas.

Las membranas rodean cada una de las células vivas y sirven como una barrera entre los compartimientos intracelulares y extracelulares. Las membranas también incluyen al núcleo eucariótico, forman el retículo endoplásmático y sirven para las funciones especializadas tales como en la vaina de mielina que rodea a los axones. Una membrana típica contiene alrededor del 40% de lípido y alrededor del 60% de proteínas pero existe una variación considerable. Los componentes lipídicos principales son los fosfolípidos, específicamente la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina y el colesterol. Las propiedades fisicoquímicas de las membranas, tales como la fluidez, se pueden cambiar por medio de la modificación de los perfiles del ácido graso de los fosfolípidos o bien del contenido del colesterol. La modulación de la composición y la organización de los lípidos de la membrana también modula las funciones celulares que dependen de la membrana tales como la actividad del receptor, la endocitosis y el flujo del colesterol.

B) Enzimas

Las triacilglicerol lipasas son una familia de enzimas que desempeñan varias funciones pivotales en el metabolismo de los lípidos en el cuerpo. Se han descripto tres miembros de la familia de triacilglicerol lipasa: la lipasa pancreática, la lipasa de las lipoproteínas y la lipasa hepática (Goldberg. I.J., Le, N.-A., Ginsberg, H.N., Krauss, R.M., y Lindgren, F.T. (1988) J. Clin. Invest. 81,561-568; Goldberg, I.J., Le. N., Paterniti J.R., Ginsberg, H.N., Lindgren. F.T., y Brown, W.V. (1982) J. Clin. Invest. 70, 1184-1192; Hide, W.A., Chan. L., y Li, W.-H. (1992) J. Lipid. Res. 33, 167-178). La lipasa pancreática es principalmente responsable de la hidrólisis de los lípidos alimenticios. Se han descripto las variantes de la lipasa pancreática pero no se ha determinado su función fisiológica. (Gilier, T., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D., y Hunziker, W. (1992) J. Biol. Cherm. 267,16509-16516). La lipoproteína lipasa es la principal enzima responsable de la distribución y de la utilización de los triglicéridos en el cuerpo. La lipoproteína lipasa hidroliza los triglicéridos tanto en los quilomicrones como en la VLDL. La lipasa hepática hidroliza los triglicéridos en la IDL y en la HDL y es responsable de la remodelación de la lipoproteína. La lipasa hepática también funciona como una fosfolipasa e hidroliza los fosfolípidos en la HDL.

Las fosfolipasas desempeñan papeles importantes en el catabolismo y la remodelación del componente fosfolipídico de las lipoproteínas y los fosfolípidos de las membranas. Las fosfolipasas también desempeñan un papel en la liberación de ácido araquidónico y la formación subsiguiente de las prostaglandinas, los leucotrienos y otros lípidos que están involucrados en una variedad de procesos inflamatorios.

Los polipéptidos de la lipasa codificados por estos genes de la lipasa son aproximadamente 450 aminoácidos de longitud con péptidos señal líderes para facilitar la secreción. Las proteínas de la lipasa están comprendidas por dos dominios principales (Winkler, K., D' Arcy, A., y Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-774). El dominio amino terminal contiene el sitio catalítico mientras que se cree que el dominio carboxilo es responsable de la unión con el substrato, la asociación con el cofactor y la interacción con los receptores celulares (Wong, H., Davis, R.C., Nikazy, J., Seebart, K.B., y Scholz, M.C. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 11290-11294; van Tilbeurgh, H., Roussel, A., Lalouel, J.-M., y Cambillau, C. (1994) J. Biol. Chem. 269, 4626-4633; Wong, H., Davis, R.C., Thuren, T., Goers, J.W., Nikazy, J., Waite, M., y Schotz, M.C. (1994) J. Biol. Chem. 269,10319-10323; Chappell, D.A., Inoue, I., Fry, G.L., Pladet, M.W., Bowen. S.L., lverius, P.-H., Lalouel, J.-M., y Strickland, D.K. (1994) J. Biol. Chem. 269,18001-18006). El nivel general de homología de los aminoácidos entre los miembros de la familia es de 22-65%, con regiones locales de alta homología que corresponden a las homologías estructurales las cuales están vinculadas con la función enzimática.

La proteína lipoproteína lipasa que se produce en forma natural es glicosilada y la glicosilación es necesaria para la actividad enzimática de LPL (Semenkovich, C.F., Luo, C.-C., Nakanishi. M.K., Chen, S.H., Smith, L C., y Chao L. (1990) J. Biol. Chem. 265, 5429-5433). Existen dos sitios para la glicosilación unida a N en la lipasa hepática y en la lipoproteína lipasa y uno en la lipasa pancreática. De manera adicional, cuatro conjuntos de cisteínas forman puentes de disulfuro que son esenciales para mantener la integridad estructural de la actividad enzimática (Lo, J.-Y., Smith. L.C., y Chan. L. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 206, 266-271; Brady, L., Brzozowski, A.M., Derewenda, Z.S., Dodson, E., Dodson G., Tolley, S., Turkenburg, J.P., Christiansen, L., Huge-Jensen B., Norskov, L., Thim, L., y Menge, U (1990) Nature 343, 767-770).

Los miembros de la familia de las triacilglicerol lipasas comparten una cantidad de características estructurales conservadas. Una de tales características es el motivo "GXSXG", en el cual el residuo central de serina es uno de los tres residuos que comprenden la "tríada catalítica" (Winkler, K., D'Arcy, A., y Hunziker. W. (1990) Nature 343, 771-774; Faustinella, F., Smith, L.C., y Chan, L. (1992) Biochemistry 31, 7219-7223). Los residuos conservados de aspartato e histidina constituyen el balance de la tríada catalítica. Un pequeño abanico de 19-23 aminoácidos (la "región de la tapa") forma una estructura helicoidal anfipática y cubre el bolsillo catalítico de la enzima (Winkler, K., D' Alcy, A., y Hunziker, W. (1990) Nature 343, 771-774). Esta región discrepa entre los miembros de la familia y recientemente se ha determinado que el abanico confiere la especificidad del substrato a las enzimas (Dugi, K.A., Dichek H.L., y Santamarina-Fojo, S. (1995) 1. Biol. Chem. 270, 25396-25401). Las comparaciones entre la lipasa hepática y la lipoproteína lipasa han demostrado que las diferencias en las actividades de la triacilglicerol lipasa y de la fosfolipasa de las enzimas son en parte mediadas por esta región de tapa (Dugi, K.A., Dichek H.L., y Santamarina-Fojo, S. (1995) J. Biol. Chem. 270, 25396-25401).

Las triacilglicerol lipasas poseen grados variables de actividad de unión a la heparina. La lipoproteína lipasa tiene la mayor afinidad por la heparina y se ha hecho un mapa de su actividad de unión hasta los trechos de residuos cargados en forma positiva en el dominio amino terminal (Ma, Y., Henderson, H.E., Liu, M.-S., Zhang, H., Forsythe, I.J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M.R., y Brunzell, J.D. J. Lipid Res. 35, 2049-2059). La localización de la lipoproteína lipasa en la superficie del endotelio (Cheng, C.P., Oosta, G.M., Bensadoun, A., y Rosenberg, R.D. (1981) J. Biol. Chem. 256, 12893-12896) está principalmente mediada a través de la unión a los proteoglicanos de la superficie (Shimada K., Gill, P.J., Silbert, J.E., Douglas, W.H.J., y Fanburg, B.L. (1981) J. Clin. Invest. 68, 995-1002; Saxena, U., Klein, M.G., y Goldberg, I.J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 17516-17521; Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., y Vlodavsky, I. (1992) J. Clin Invest. 90, 2013-2021). Esta actividad de unión es la que permite a la enzima acelerar la recaptación de LDL al actuar como un puente entre LDL y la superficie celular (Mulder, M., Lombardi, P., Jansen, H., van Berkel T.J., Frants R.R., y Havekes, L.M. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185, 582-587; Rutledge, J.C., y Goldberg, I.J., (1994) J. Lipid Res. 35. 1152-1160; Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, T., Kobayashi, Y., Konno, T., y Tada, K. (1980) Int. J. Cancer 26, 171-176).

Se sabe que tanto la lipoproteína lipasa y la lipasa hepática funcionan en conjunto con las proteínas del co-activador: la apolipoproteína CII para la lipoproteína lipasa y la colipasa para la lipasa pancreática.

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Se han informado las secuencias genéticas que codifican la lipasa pancreática humana, la lipasa hepática y la lipoproteína lipasa (Acceso Genbank #M93285, #J03540, y #M15856 respectivamente). Los ARN mensajeros de la lipasa hepática humana y de la lipasa pancreática son de aproximadamente 1,7 y 1,8 kilobases de longitud respectivamente. Dos ARNm transcripciones de 3,6 y 3,2 kilobases se producen a partir del gen de la lipoproteína lipasa humana. Estas dos transcripciones utilizan señales de poliadenilación alternativas y difieren en su eficiencia para la traducción (Ranganathan, G., Ong, J.M., Yukht, A.. Saghizadeh, M., Simsolo, R.B., Pauer, A., y Kern, P.A. (1995) J. Biol. Chem. 270, 7149-7155).

C) Procesos fisiológicos

El metabolismo de los lípidos involucra la interacción de los lípidos, las apoproteínas, las lipoproteínas y las enzimas.

La lipasa hepática y la lipoproteína hepática son proteínas multifuncionales que median la unión, la recaptación, el catabolismo y la remodelación de las lipoproteínas y los fosfolípidos. La lipoproteína lipasa y la lipasa hepática funcionan mientras se unen a la superficie luminal de las células endoteliales en los tejidos periféricos y el hígado respectivamente. Ambas enzimas participan en el transporte inverso del colesterol, el cual constituye el movimiento del colesterol desde los tejidos periféricos hasta el hígado ya sea para la excreción desde el cuerpo o para el reciclado. Se sabe que los defectos genéticos tanto en la lipasa hepática como en la lipoproteína lipasa constituyen la causa de los trastornos familiares del metabolismo de la lipoproteína. Los defectos del metabolismo de las lipoproteínas dan como resultado trastornos metabólicos severos, que incluyen la hipercolesterolemia, la hiperlipidemia y la aterosclerosis.

La aterosclerosis es una enfermedad poligénica compleja que se define en términos histológicos por depósitos (placas de lípidos o fibrolípidos) de lípidos y de otros derivados de la sangre en las paredes de los vasos sanguíneos, especialmente las grandes arterias (aorta, arterias coronarias, carótida). Estas placas, que están más o menos calcificadas de acuerdo con el grado de progresión del proceso aterosclerótico, se pueden acoplar con lesiones y se asocian con la acumulación en los vasos de los depósitos de grasa que consisten esencialmente en ésteres de colesterol. Estas placas son acompañadas por el engrosamiento de la pared vascular, la hipertrofia de los músculos lisos, el aspecto de las células espumosas (células cargadas con lípidos que son generadas por la recaptación descontrolada del colesterol por medio de los macrófagos reclutados) y la acumulación del tejido fibroso. La placa ateromatosa sobresale de manera acentuada de la pared, dotándola con una tendencia a provocar estenosis responsable de las oclusiones vasculares por el ateroma, la trombolia o la embolia, las cuales se producen en aquellos pacientes que resultan más afectados. Estas lesiones pueden conducir a patologías cardiovasculares severas tales como el infarto, la muerte súbita, la insuficiencia cardiaca y el accidente cerebrovascular.

El papel que desempeñan las triacilglicerol lipasas en las patologías vasculares tales como la aterosclerosis ha sido un área de estudio intenso (revisada en Olivecrona, G., y Olivecrona, T. (1995) Curr. Opin. Lipid. 6,291-305). Por lo general, se cree que la acción de las triacilglicerol lipasas es antiaterogénica porque estas enzimas reducen los niveles de triacilglicerol en suero y promueven la formación de HDL. Los animales transgénicos que expresan la lipoproteína lipasa humana o la lipasa hepática tienen niveles reducidos de triglicéridos en plasma y un mayor nivel de lipoproteínas de alta densidad (HDL) (Shimada, M., Shimano, H. Gotoda, T., Yamamoto, K., Kawamura, M., Inaba, T., Yazaki, t., y Yamada, N. (1993) J. Biol. Chem. 268, 17924-17929; Liu, M.-S., Jirik, F. R., LeBoeuf. R. C., Henderson, H., Castellani, L.W.. Lusis, A. J., ma, Y., Forsythe, I.J., Zhang, H., Kirk, E., Brunzell, J.D., y Hayden, M.R. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11417-11424). Se halló que los humanos con defectos genéticos que tienen como resultado niveles reducidos de la actividad de la lipoproteína lipasa presentan hipertrigliceridemia pero no un aumento en el riesgo de contraer la enfermedad cardiaca coronaria. Se informa que esto se debe a la falta de producción de lipoproteínas aterogénicas de tamaño intermedio que se podrían acumular dentro del espacio subendotelial (Zilversmit. D.B. (1973) Circ. Res. 33, 633-638).

Sin embargo, se plantea la hipótesis según la cual en el área localizada de una lesión aterosclerótica, el nivel más alto de la actividad de la lipasa acelera el proceso aterogénico (Zilversmit, D.B. (1995) Clin. Chem. 41, 153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani. S., Lupien, P.J., Hayden M.R., y Brunzell. J.D. (1993) Lancet 34, 1119-1121). Esto se puede deber a un aumento en la unión y la recaptación de las lipoproteínas por el tejido vascular mediada por las lipasas (Eisenberg,S., Sehayek, E., Olivecrona, T. Vlodavsky, I. (1992) J. Clin. Invest. 90,2013-2021; Tabas, I., Li, I., Brocia R.W., Xu, S.W., Swenson T.L., Williams. KJ. (1993) J. Biol. Chem. 268, 20419-20432; Nordestgaard, B.G., y Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5,252-257; Williams, KJ., y Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15, 551-561). De manera adicional, un nivel local alto de la actividad de la lipasa puede dar como resultado niveles citotóxicos de los ácidos grasos y la lisofosfatifilcolina que se produce en los precursores de las lesiones ateroscleróticas.

Aún cuando se comprende aquello que ha evolucionado con respecto al papel de la actividad de la lipasa en la homeostasis, existe la necesidad de identificar dentro de la especialidad los genes adicionales que codifican las proteínas que regulan el metabolismo de los lípidos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de un gen similar a la lipasa (LLG), sus productos expresados en el polipéptido y las composiciones y los métodos para su uso. El polipéptido del LLG se une a la heparina, tiene homología con la lipoproteína lipasa humana y con la lipasa hepática y comprende un dominio catalítico de 39 kD de la familia de la triacilglicerol lipasa. En una realización adicional, el polipéptido tiene la actividad de la fosfolipasa A.

Esta invención suministra un polipéptido aislado que comprende la secuencia SEQ ID NO: 10.

Esta invención además suministra un polipéptido aislado que comprende la secuencia SEQ ID NO: 8 y que tiene un peso molecular aparente de alrededor de 55 kD o 68 kD sobre un gel 10% 50S-PAGE.

Esta invención también suministra un polipéptido aislado que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6 y que tiene un peso molecular aparente de alrededor de 40 kD sobre un gel de 10% 50S-PAGE.

La invención suministra además un fragmento antigénico del polipéptido de LLG.

Otro aspecto de esta invención es un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido que tiene la secuencia que se mencionó con anterioridad.

Otro aspecto de la invención es un vector que comprende el ácido nucleico que se mencionó con anterioridad que codifica a dicho polipéptido que está enlazado en forma operativa con una región regulatoria como por ejemplo un promotor.

Otro aspecto de esta invención es una célula recombinante que comprende el vector que se ha descripto con anterioridad.

Otro aspecto de esta invención es un método de preparación de un polipéptido que comprende el cultivo de las células recombinantes que contienen al polipéptido mencionado que codifica al ácido nucleico bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido mencionado.

Otro aspecto de esta invención es un anticuerpo que es capaz de unirse de manera específica a y/o neutralizar la actividad biológica de los polipéptidos de acuerdo con la invención. En realidad, una característica adicional de un polipéptido de la invención es que el mismo se une de manera específica a un anticuerpo de la invención, es decir, un anticuerpo específico para un polipéptido de LLG.

Otro aspecto de la presente invención es una composición que comprende un polipéptido, un ácido nucleico, un vector, un ácido nucleico antisentido, o un anticuerpo de acuerdo con la presente invención y un portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

Otro aspecto de esta invención es un método para seleccionar los agonistas o los antagonistas de la actividad enzimática exhibida por los polipéptidos de la presente invención que comprenden el hecho de poner en contacto a los agonistas potenciales o los antagonistas con los mencionados polipéptidos y un substrato de los mismos y la medición de la capacidad de los agonistas o los antagonistas potenciales para realzar o inhibir la actividad.

Otro aspecto de la presente invención es un método para la hidrólisis enzimática de un éster de fosfatidilcolina que comprende el hecho de poner en contacto al éster de fosfatidilcolina que se ha mencionado con un polipéptido de acuerdo con la presente invención.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen más adelante en los dibujos y en la descripción detallada de las realizaciones preferidas de los mismos que figura a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las secuencias (SEQ ID Nos: 17-31) de los cebadores utilizados en las amplificaciones de PCR que se ofrecen a modo de ejemplo.

La Figura 2 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: I) y la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 2) del producto RT-PCR de la representación diferencial que contiene el ADNc del gen similar a la lipasa. Las secuencias correspondientes a los dos cebadores utilizados en la amplificación están subrayadas. El codón de terminación y la señal de poliadenilación están recuadrados. Los motivos GAATTC y la secuencia flanqueante son del vector de pCRII dentro del cual fue clonado el producto.

La Figura 3 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 4) de la extensión de 5'RACE del LLG eDNA. Las secuencias correspondientes a los dos cebadores utilizados en la amplificación están subrayadas. Los motivos GAATTC y la secuencia flanqueante proveniente del vector pCRII en él dentro del cual fue clonado el producto.

La Figura 4 muestra la secuencia (SEQ ID NO: 7) del ADNc que contiene el marco completo de lectura abierta del gen similar a la lipasa, LLGXL. El codón de inicio (ATG) y el codón de terminación (TGA) están recuadradas. El sitio DraI (TTTAAA) y Srfl (GCCCGGGC) utilizados en la construcción de los vectores de expresión están subrayados.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 8) de la proteína LLGXL. La secuencia de la señal predecida está subrayada.

La Figura 6 muestra una alineación de la secuencia de la proteína de los miembros de la familia genética de la triacilglicerol lipasa (SBQ ID Nos: 13-IS). Los residuos sombreados son idénticos a la proteína LLGXL (SEQ ID NO: 8). Se introdujeron espacios en las secuencias para maximizar los valores de alineación utilizando el programa CLUSTAL.

La Figura 7 muestra un análisis Northern de LLG ARNm en las células THP-1. Las células fueron estimuladas ya sea con PMA o bien con PMA LDL oxidado (PMA + oxLDL). Los números que aparecen a la izquierda indican las posiciones de los standards ARN (en kilobases).

La Figura 8 muestra un análisis Northern de los ARNm de los múltiples tejidos humanos investigados con LLG, lipoproteína lipasa (LPL) y los ADNc de la actina beta humana. La posición estándar de un ARN 4,4 kilobase R se indica a la izquierda de los paneles de LLG y LPL.

La Figura 9 muestra el análisis Northern de la expresión LLG y LPL en la célula del cultivada del endotelio humano y la célula THP-I. Las células fueron ya sea no estimulada (no expuestas a PMA) o bien estimuladas con PMA.

La Figura 10 muestra la secuencia del péptido inmunizante (SEQ ID NO: 16) y su relación con la secuencia de la proteína LLGXL. El péptido se muestra en el recuadro sombreado. La cisteína terminal fue introducida para contribuir al acople del péptido con la proteína del portador.

La Figura 11 muestra un análisis Western de las proteínas concentradas heparina-Sefarosa de los medios condicionados de las células endoteliales cultivadas. Se investigó la mancha con antisuero anti-LLG. Los números que figuran a la izquierda indican las posiciones de los estándares de las proteínas en kilodaltons.

La Figura 12 muestra un análisis Western de las proteínas unidas heparina-Sefarosa en el medio acondicionado de las células COS-7 transfectadas de manera transitoria con un vector de expresión que contiene un ADNc para LLGN o LLGXL o ningún ADN (Mock). Las proteínas provenientes de las células endoteliales estimuladas por PMA (HCAEC + PMA) se incluyeron para tener una referencia del tamaño. Los números que figuran a la izquierda indican el peso molecular aparente de las proteínas inmunorreactivas principales según lo que se determinó por medio de la comparación con los estándares de proteínas.

La Figura 13 muestra la secuencia del producto LLG PCR del conejo (RLLG.SEQ, SEQ ID NO: 11) y la alineación de la secuencia entre el producto LLG PCR del conejo y la secuencia correspondiente en el ADNc humano (LLG7742A). Los nucleótidos idénticos están sombreados.

La Figura 14 muestra la actividad de la fosfolipasa A de LPL, LLGN, y LLGXL humanas, utilizando un substrato de fosfatidilcolina.

La Figura 15 muestra la actividad de la triacilglicérido lipasa de LPL, LLGN, y LLGXL humanas, utilizando un substrato de trioleína.

La Figura 16 muestra la hibridización de las investigaciones de LLG y LPL para los ADN genómicos de diferentes especies.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de un gen similar a la lipasa (LLG) y sus productos expresados en el polipéptido. Los productos polipeptídicos, miembros de la familia de la triacilglicerol lipasa, comprenden un dominio catalítico de aproximadamente 39,kD de la familia de la triacilglicerol lipasa, por ejemplo, que tienen la secuencia SEQ ID NO: 10. Una realización de la presente invención es el polipéptido LLGN, el cual tiene 354 aminoácidos: Una segunda realización de la presente invención es el polipéptido LLGXL, el cual tiene 500 aminoácidos y exhibe una similitud del 43% con la lipoproteína lipasa humana y una similitud del 37% con la lipasa hepática humana. El polipéptido LLGXL tiene la actividad de la fosfolipasa A.

Los inventores aislaron un ADNc parcial del ARNm de las células THP-I que han sido expuestas al éster de forbol y a los LDL oxidados. Siguiendo una extensión de 5'RACE de este ADNc parcial, se aisló el ADNc más pequeño con empalmes alternativos. Un segundo ADNc, más grande, se aisló a partir de una librería del ADNc de la placenta humana.

Los análisis Northern han demostrado que el gen LLG está expresado en las células endoteliales. Los antisueros que surgen para un péptido predecido a partir del marco de lectura abierto de las proteínas detectadas del ADNc de los tamaños predecidos para LLGN y LLGXL en un medio acondicionado proveniente de las células endoteliales cultivadas. El tratamiento de las células endoteliales con los ésteres de forbol dieron como resultado un aumento en la producción de LLG tanto en el nivel del ARNm como en el nivel de la proteína. Este es el primer miembro de la familia de la triacilglicerol lipasa que se descubrió que es expresado por las células endoteliales.

A) Definiciones

Los siguientes términos definidos se utilizan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva y deben ser útiles para la comprensión del alcance y la práctica de la presente invención.

Un "polipéptido" es un compuesto polimérico que comprende residuos de aminoácidos unidos por enlace covalente. Los aminoácidos tienen la estructura general siguiente:

R ---

\melm{\delm{\para}{NH _{2} }}{C}{\uelm{\para}{H}}

--- COOH

Los aminoácidos se clasifican en siete grupos sobre la base de la cadena lateral R: (1) cadenas alifáticas laterales (2) cadenas laterales que contienen un grupo hidroxílico (OR) (3) cadenas laterales que contienen átomos de azufre (4) cadenas laterales que contienen un grupo acídico o amida (5) cadenas laterales que contienen un grupo básico (6) cadenas laterales que contienen un anillo aromático y (7) prolina, un aminoácido en el cual la cadena lateral se fusiona con el grupo amino.

Una "proteína" es un polipéptido que desempeña un papel o una función estructural en una célula viva.

Los polipéptidos y las proteínas de la invención pueden ser glicosilados o no glisosilados.

"Homología" significa una similitud de la secuencia que refleje un origen de evolución común.

Se dice que los polipéptidos o las proteínas tienen homología o similitud, si una cantidad substancial de sus aminoácidos son ya sea (I) idénticos, o bien (2) tiene una cadena lateral R químicamente similar. Se dice que los ácidos nucleicos tienen homología si una cantidad sustancial de sus nucleótidos es idéntica.

"Péptido aislado" o "Proteína aislada" es un polipéptido o una proteína que está substancialmente libre de aquellos compuestos que normalmente están asociados con el mismo en su estado natural (por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos). "Aislado" no significa excluir las mezclas sintéticas o artificiales con otros compuestos o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a la purificación incompleta, la adición de estabilizadores o la formación de un compuesto en una preparación aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

Una molécula es "antigénica" cuando es capaz de interactuar de manera específica con un antígeno, molécula de reconocimiento del sistema inmune tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor del antígeno de la célula T. Un polipéptido antigénico contiene por lo menos alrededor de 5 y con preferencia por lo menos alrededor de 10 aminoácidos. Una porción antigénica de una molécula puede ser aquella porción que es inmunodominante para el anticuerpo o el reconocimiento del receptor de la célula T o puede ser una porción utilizada para generar un anticuerpo para la molécula por medio de la conjugación de la porción antigénica con una molécula portadora para la inmunización. Una molécula que es antigénica no necesita ser inmunogénica ella misma, es decir, capaz de elicitar una respuesta inmune sin un portador.

"Polipéptido LLGN" y "proteína LLGN" significan un polipéptido que incluye la secuencia SEQ ID NO: 6, siendo dicho polipéptido glicosilado o no glicosilado.

"Polipéptido LLGXL" y "proteína LLGXL" significan un polipéptido que incluya la secuencia SEQ ID NO: 8, siendo dicho polipéptido glicosilado o no glicosilado.

"Polipéptido LLG" describe en forma genérica tanto al polipéptido LLGN como al polipéptido LLGXL.

El polipéptido LLG o la proteína de la presente invención incluyen cualquier derivado del fragmento análogo o mutante que deriva de un polipéptido LLG y que conserva por lo menos una propiedad biológica del polipéptido LLG. En la naturaleza existen diferentes variantes del polipéptido LLG. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por las diferencias existentes en las secuencias del nucleótido del gen estructural que codifica la proteína o bien pueden implicar un empalme diferencial o una modificación posterior a la traducción. La persona idónea en la especialidad puede producir variantes que tengan sustituciones de aminoácidos únicas o variables, supresiones, agregados o reemplazos. Estas variantes pueden incluir: entre otras: (a) variantes en las cuales uno o más residuos de aminoácidos son sustituidos por aminoácidos conservadores o no conservadores, (b) variantes en las cuales uno o más aminoácidos se agregan al polipéptido LLG, (c) variantes en las cuales uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente y (d) variantes en las cuales el polipéptido LLG se fusiona con otro polipéptido tal como la albúmina sérica. Otros polipéptidos LLG de la invención incluyen las variantes en las cuales los residuos de aminoácidos de una de las especies son sustituidos por el residuo correspondiente en otras especies, ya sea en las posiciones conservadas o bien en las posiciones no conservadas. En otra realización, los residuos de aminoácidos de las posiciones no conservadas son sustituidos con residuos conservadores o no conservadores. Las técnicas adecuadas para obtener estas variantes, que incluyen las técnicas genéticas (supresiones, eliminaciones, mutaciones, etc.), químicas, y enzimáticas, son conocidas por las personas idóneas en la especialidad.

En caso de que las variaciones alélicas, los análogos, los fragmentos, los derivados, los mutantes y las modificaciones, que incluyen las formas de ARNm con empalmes y las formas alternativas de modificación posteriores a la traducción den como resultado derivados del polipéptido LLG que conservan cualquiera de las propiedades biológicas del polipéptido LLG, las mismas se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

Un "ácido nucleico" es un compuesto que comprende las subunidades unidas mediante enlace covalente denominadas nucleótidos. El ácido nucleico incluye el ácido polirribonucleico (ARN) y el ácido polideoxirribonucleico (ADN), ambos de los cuales pueden ser de hebra única o de doble hebra. El ADN incluye el ADNc, el ADN genómico, el ADN sintético y el ADN semi-sintético. La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína se denomina secuencia sentido.

Un "ácido nucleico antisentido" es una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia sentido. Los ácidos nucleicos antisentido se pueden utilizar para regular por disminución o para bloquear la expresión del polipéptido codificado por la hebra sentido.

"Ácido nucleico aislado" significa un ácido nucleico que está substancialmente libre de aquellos compuestos que normalmente están asociados con el mismo en su estado natural. "Aislado" no significa excluir las mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad biológica y que pueden estar presentes por ejemplo, debido a la purificación incompleta, el agregado de estabilizantes o la composición en una preparación farmacéuticamente aceptable.

La frase "un ácido nucleico que se hibridiza con mucho rigor" significa que los ácidos nucleicos hibridizados son capaces de resistir un lavado bajo condiciones muy rigurosas. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas para los híbridos ADN-ADN es 0.1X SSC, 0.5% SDS a 68ºC. Otras condiciones muy rigurosas para el lavado son conocidas para las personas idóneas en la especialidad.

"Región regulatoria" significa una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de un ácido nucleico. Una región regulatoria puede incluir las secuencias que naturalmente son responsables de expresar un ácido nucleico particular (una región homóloga) o puede incluir secuencias de origen diferente (responsables de expresar proteínas diferentes o inclusive proteínas sintéticas). En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes eucarióticos o virales o secuencias derivadas que estimulan o reprimen la transcripción de un gen de una manera específica o no específica y de una manera inducible o no inducible. Las regiones regulatorias incluyen los orígenes de la replicación, los sitios de empalme del ARN, los realzadores, las secuencias de transcripción de terminación, las secuencias de la señal que dirigen al polipéptido dentro de las vías de secreción de la célula blanco y los promotores.

Una región regulatoria de una "fuente heteróloga" es una región regulatoria que naturalmente no está asociada con el ácido nucleico expresado. Están incluidas entre las regiones heterólogas de regulación las regiones provenientes de una especie distinta, las regiones regulatorias de un gen diferente, las secuencias regulatorias híbridas y las secuencias regulatorias que no se producen en la naturaleza, pero que son diseñadas por las personas idóneas en la especialidad.

Un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped. El término "vector" incluye tanto a los medios virales como no virales para introducir el ácido nucleico en una célula procariótica o eucariótica in vitro, ex vivo o in vivo. Los vectores no virales incluyen los plásmidos, los liposomas, los lípidos cargados eléctricamente (citofectinas), los complejos de proteína - ADN y los biopolímeros. Los vectores virales incluyen los retrovirus, los virus adeno-asociados, viruela, baculovirus, vaccinia, herpes simplex, Epstein-Barr y los vectores del adenovirus. Además del "ácido nucleico" de acuerdo con la presente invención, un vector también puede contener una o más regiones regulatorias y/o marcadores que se pueden seleccionar, marcadores útiles para seleccionar, medir y monitorear los resultados de la transferencia de ácido nucleico (a qué tejidos se transfiere, la duración de la expresión, etc.).

Una "célula recombinante" es una célula que contiene un ácido nucleico que naturalmente no está presente en la célula. La "célula recombinante" incluye las células eucarióticas superiores tales como las células de mamíferos, las células eucarióticas inferiores tales como las células de los fermentos, las células procarióticas y las células arqueobacterianas.

El "portador aceptable desde el punto de vista farmacéutico" incluye los diluyentes y los rellenos que son aceptables desde el punto de vista farmacéutico para el método de administración, son estériles y pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas formuladas mediante la utilización de agentes adecuados de dispersión o humectación y de agentes de suspensión. El portador particular aceptable desde el punto de vista farmacéutico y la proporción del compuesto activo con el portador son determinadas por la solubilidad y las propiedades químicas de la composición, el modo particular de administración y la práctica farmacéutica estándar.

Una "lipasa" es una proteína que puede dividir enzimáticamente un substrato lipídico.

Una "fosfolipasa" es una proteína que puede dividir enzimáticamente un substrato fosfolipídico.

Una "triacilglicerol lipasa" es una proteína que puede dividir enzimáticamente un substrato de triacilglicérido.

"Fosfatidilcolina" es un fosfolípido del glicerol que tiene la estructura siguiente:

1

R y R' son las cadenas laterales de hidrocarburo de los ácidos grasos. La fosfatidilcolina también es conocida como lecitina.

"Perfil de lípidos" significa el conjunto de las concentraciones del colesterol, los triglicéridos, colesterol lipoproteico y otros lípidos en el cuerpo de un humano u otro animal.

Un "perfil indeseable de lípidos" es la condición en la cual las concentraciones de colesterol, triglicéridos o colesterol lipoproteico están fuera de los rangos de referencia ajustados por la edad y el sexo. Por lo general, una concentración de colesterol total > 200 mg/dl, de triglicéridos en plasma > 200 mg/dl, de colesterol LDL > 130 mg/dl, de colesterol HDL < 39 mg/dl, o una proporción de colesterol total con colesterol HDL > 4.0 se considera que es un perfil de lípidos indeseable. Un perfil de lípidos indeseable se asocia con una variedad de condiciones patológicas, que incluyen las hiperlipidemias, la diabetes, la hipercolesterolemia, la aterosclerosis y otras formas de enfermedad de la arteria coronaria.

B) Polipéptidos

La presente invención provee polipéptidos que son miembros de la familia de triacilglicerol lipasa y que comprenden un dominio catalítico de 39 kD de la familia de triacilglicerol lipasa, por ejemplo, que tienen la secuencia SEQ ID NO: 10. Una realización de la presente invención es un polipéptido LLG aislado que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6 y que tiene un peso molecular aparente de alrededor de 40 kD sobre un gel 10% SDS.PAGE. Otra realización de la presente invención es un polipéptido LLO aislado que comprende la secuencia SEQ ID NO: 8 y tiene un peso molecular de alrededor de 5S kD o 68 kD en un gel 10% SDS-PAGE.

Los polipéptidos y las proteínas de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos y pueden ser de origen humano, de conejos o de otros animales. Los polipéptidos se caracterizan por un peso molecular único que se puede reproducir y/o un conjunto múltiple de pesos moleculares, la respuesta cromatográfica y los perfiles de elución, la composición y la secuencia de aminoácidos y la actividad biológica.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser aislados de las fuentes naturales tales como los extractos de placenta, el plasma humano o los medios acondicionados de células cultivadas tales como los macrófagos o las células endoteliales, utilizando los procedimientos de purificación conocidos para las personas idóneas en la especialidad.

De manera alternativa, los polipéptidos de la presente invención se pueden preparar utilizando la tecnología del ADN recombinante, la cual comprende el hecho de combinar un ácido nucleico que codifique al polipéptido del mismo en un vector adecuado, insertar el vector resultante en una célula huésped adecuada, recuperar el polipéptido producido por la célula huésped resultante y purificar el polipéptido recuperado.

C) Ácidos nucleicos

La presente invención suministra ácidos nucleicos aislados que codifican los polipéptidos LLG.

La presente invención también suministra ácidos nucleicos que se pueden utilizar para regular por disminución o bloquear la expresión de los polipéptidos LLG in vitro, ex vivo o in vivo.

Las técnicas de la tecnología del ADN recombinante son conocidas por las personas idóneas en la especialidad. Los métodos generales para la clonación y la expresión de las moléculas recombinantes se describen en Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982), y en Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology: Wiley and Sons, 1987), que se incorporan a título de referencia.

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden unir con una o más regiones regulatorias. La selección de la o las regiones regulatorias adecuadas es una cuestión de rutina, dentro del nivel de idoneidad común dentro de la especialidad. Las regiones regulatorias incluyen los promotores y pueden incluir los realzadores, los supresores, etc.

Los promotores que se pueden utilizar en la presente invención incluyen tanto los promotores constitutivos como los promotores regulados (inducibles). Los promotores pueden ser procarióticos o eucarióticos dependiendo del huésped. Entre los promotores procarióticos (que incluyen los bacteriófagos) útiles para la práctica de esta invención están los promotores lacI, lacZ. T7, lambda P, P, y trp. Entre los promotores eucarióticos (que incluyen a los virales) los promotores útiles para la práctica de esta invención son los promotores ubicuos (por ejemplo, HPRT; vimentina, actina, tubulina), los promotores de filamentos intermedios (por ejemplo, desmina, neurofilamentos, queratina. GFAP), los promotores terapéuticos genéticos (por ejemplo, el tipo MDR, CFTR, el factor VIII), los promotores tisulares específicos (por ejemplo, el promotor de actina en las células del músculo liso, o los promotores Flt y Flk activos en las células endoteliales), los promotores que preferentemente se activan en las células divisoras, los promotores que responden a un estímulo (por ejemplo, el receptor de la hormona esteroide, el receptor del ácido retinoico), los moduladores de la transcripción regulados por la tetraciclina, el citomegalovirus inmediato-temprano, el LTR retroviral, la metalotioneína, el SV-40, los promotores Ela y MLP. Los moduladores de transcripción regulados por la tetraciclina y los promotores de CMV se describen en WO 96/01313. US 5.168.062 y 5.385.839, cuyos contenidos se incorporan a la presente a título de referencia.

Preferentemente, los vectores virales utilizados en la terapia genética son de replicación defectiva, es decir, son incapaces de replicarse de manera autónoma en la célula blanco. En general, el genoma de los vectores virales de replicación defectiva que se utilizan dentro del alcance de la presente invención carecen por lo menos de una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden ser eliminadas (ya sea en su totalidad o bien en parte), volverse no funcionales por medio de cualquier técnica conocida para las personas idóneas en la especialidad. Estas técnicas incluyen la eliminación total, la substitución (por otra, las secuencias, en particular por el ácido nucleico que se insertó), la eliminación o el agregado parcial de una o más bases a una región esencial (para la replicación). Tales técnicas se pueden realizar in vitro (en el ADN aislado) o in situ, utilizando las técnicas de genética, manipulación o por medio del tratamiento con agentes mutagénicos.

Preferentemente, el virus de replicación defectiva retiene las secuencias de su genoma, que son necesarias para encapsidar las partículas virales.

Los retrovirus son virus integradores que infectan las células divisoras. El genoma del retrovirus incluye dos LTR, una secuencia de encapsidación y tres regiones codificadoras (gag, pol y env). Se ha descripto la construcción de los vectores retrovirales recombinantes: ver, en particular, EP 453242, EPI78220, Bernstein et al. Genet. Eng.7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En los vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env por lo general son eliminados, en su totalidad o en parte, y son reemplazados con una secuencia de ácido nucleico heterólogo de interés. Estos vectores se pueden construir a partir de los diferentes tipos de retrovirus, tales como, MoMuL V ("murine Moloney leukaemia virus" MSV ("murine Moloney sarcoma virus"), HaSV ("Harvey sarcoma virus"); SNV ("spleen necrosis virus"); RSV ("Rous sarcoma virus") y Friend virus.

En general, a fin de construir los retrovirus recombinantes que contienen una secuencia que codifica LLG de acuerdo con la invención, se construyó un plásmido que contiene los LTR, la secuencia de encapsidación y la secuencia de codificación. Esta construcción se utiliza para transfectar una línea celular de empaque, cuya línea celular está en condiciones para suministrar en trans las funciones retrovirales que son deficientes en el plásmido. Por lo general, las líneas celulares de empaque están por consiguiente en condiciones de expresar los genes gag pol y env. Las líneas celulares de empaque han sido descriptas en la especialidad con anterioridad, en particular la línea celular PA317 (US4,86I,719); la línea celular PsiCRIP (W090/02806) y la línea celular GP+envAm-12 (W089/07150). Además, los vectores retrovirales recombinantes pueden contener modificaciones dentro de los LTR para suprimir la actividad de transcripción al igual que las secuencias de encapsidación extensiva que pueden incluir una parte del gen gag (Bender et al., 1. Virol. 61 (1987) 1639). Los vectores retrovirales recombinantes son purificados por medio de técnicas estándar conocidas por las personas idóneas en la especialidad.

Los virus adeno-asociados (AA V) son los virus del ADN de un tamaño relativamente pequeño que se pueden integrar de una manera estable y específica para el sitio, en el genoma de las células que infectan. Los mismos están en condiciones de infectar un amplio espectro de células sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento celular, la morfología o la diferenciación y no parecen estar involucrados en patologías humanas.

El genoma AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Abarca aproximadamente 4700 bases y contiene una región de repetición terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, el cual sirve como un origen de replicación para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que llevan a cabo las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep involucrado en la replicación viral y en la expresión de los genes virales; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las proteínas capsídicas del virus.

Se ha descripto el uso de los vectores derivados de AAVs para transferir los genes in vitro e in vivo (ver WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368. US 5,139,941, EP 488528). Estas publicaciones describen varios constructos derivados de AAV en los cuales los genes rep y/o cap son eliminados y reemplazados por un gen de interés y el uso de estos constructos para transferir al gen de interés mencionado in vitro (en las células cultivadas) o in vivo, (directamente dentro de un organismo). La replicación defectiva recombinante AAVs de acuerdo con la invención se puede preparar al cotransfectar un plásmido que contenga la secuencia de ácido nucleico de interés rodeada por dos regiones de repetición terminal invertidas AA V (ITR) y un plásmido que porta los genes de encapsidación AA V (genes rep y cap), en una línea celular que es infectada con un virus helper humano (por ejemplo un adenovirus). Los AA V recombinantes que se producen luego son purificados por medio de las técnicas estándar. La invención también se refiere, por lo tanto, a un virus recombinante derivado de AA V cuyo genoma comprende una secuencia que codifica un polipéptido LLG rodeado por AA V ITRs. La invención también se refiere a un plásmido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido LLG rodeado pro dos ITRs provenientes de un AA V. Un plásmido de esa naturaleza se puede utilizar como tal para transferir la secuencia de LLG, con el plásmido, cuando corresponda, incorporado en un vector de liposoma (pseudo-virus). En una realización preferida, el vector es un vector de adenovirus.

Los adenovirus son virus de ADN eucariótico que se pueden modificar para liberar de manera eficiente un ácido nucleico de la invención hasta una variedad de tipos de células.

Existen varios serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se otorga preferencia, dentro del alcance de la presente invención; a utilizar los adenovirus de tipo 2 o de tipo 5 humano (Ad 2 o Ad 5) o a los adenovirus de origen animal (ver W094126914). Estos adenovirus de origen animal que se pueden utilizar dentro del alcance de la presente invención incluyen los adenovirus de canino, bovino, murino (ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, de ave y de simio (ejemplo: SAV) origen. Preferentemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, con mayor preferencia un CAV2 adenovirus (por ejemplo Manhattan o variedad A26/61 (A TCC VR-800), por ejemplo).

Preferentemente, los vectores de adenovirus de replicación defectiva de la invención comprenden los ITR, una secuencia de encapsidación y el ácido nucleico de interés. De manera aún más preferida, por lo menos la región E1 del vector del adenovirus es no funcional. La eliminación en la región E1 se extiende con preferencia desde los nucleótidos 455 hasta 3329 en la secuencia de los adenovirus Ad5. De igual modo se pueden modificar otras regiones, en particular la región E3 (W095/02697), la región E2 (W094/28938), la región E4 (W094/28152, W094/12649 y W095/02697), o en cualquiera de los últimos genes L1-L5. Los vectores retrovirales defectivos se revelan en W095/02697.

En una realización preferida, el vector adenoviral tiene una supresión en las regiones E1 y E4. En otra realización preferida, el vector adenoviral tiene una supresión en la región E1 en la cual están insertas la región E4 y la secuencia que codifica a LLG (ver FR94 13355).

Los adenovirus recombinantes de replicación defectiva de acuerdo con la presente invención pueden ser preparados por medio de cualquier técnica conocida por las personas idóneas en la especialidad (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden ser preparados por medio de la recombinación de homólogos entre un adenovirus y un plásmido que porta, entre ellos, la secuencia de ADN de interés. La recombinación de homólogos se efectúa después de la cotransfección del adenovirus y del plásmido mencionados en una línea celular adecuada. La línea celular que se emplea, con preferencia debería (i) ser transformable por parte de los elementos mencionados y (ii) contener las secuencias que están en condiciones de complementar la parte del genoma del adenovirus de replicación defectiva, con preferencia en forma integrada a fin de evitar los riesgos de la recombinación. Son ejemplos de las líneas celulares que se pueden utilizar la línea celular 293 de riñón embriónico humano (Graham et al., 1. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) integrada en su genoma y las líneas celulares que están en condiciones de complementar las funciones E1 y E4, tal como se describen en las solicitudes W094/269l4 y W095/02697. Los adenovirus recombinantes se recuperan y se purifican utilizando las técnicas biológicas moleculares estándar que son de conocimiento de conocidas por las personas idóneas en la especialidad.

La regulación por disminución de la expresión genética utilizando ácidos nucleicos antisentido se puede lograr en el nivel de traducción o de transcripción. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención son con preferencia fragmentos de ácidos nucleicos capaces de hibridizarse de manera específica con todos o parte de un ácido nucleico que codifica LLG o el ARN mensajero correspondiente. Estos ácidos nucleicos antisentido pueden ser oligonucleótidos sintéticos, opcionalmente modificados para mejorar su estabilidad y su selectividad. También pueden ser secuencias de ADN cuya expresión en la célula produce ARN complementario para todo o parte del ARNm de LLG. Los ácidos nucleicos antisentido pueden ser preparados por medio de la expresión de toda o parte de una secuencia seleccionada a partir de un grupo que consiste en la SEQ ID No. 2, la SEQ ID No. 3, la SEQ ID No. 7, o la SEQ ID No. 11, en la orientación opuesta, tal como se describe en EP 140308. Cualquier longitud de la secuencia antisentido es adecuada para la práctica de la invención con tal que sea capaz de regular por disminución o de bloquear la expresión de LLG. Preferentemente, la secuencia antisentido es por lo menos de 20 nucleótidos de longitud. La preparación y el uso de los ácidos nucleicos antisentido, Los ARN antisentido que codifican el ADN y el uso de antisentidos oligo y genético se revelan en W092115680, cuyos contenidos se incorporan a la presente a título de referencia.

D) Anticuerpos

La presente invención suministra anticuerpos contra el polipéptido LLG. Estos anticuerpos pueden ser los anticuerpos monoclonales o los anticuerpos policlonales. La presente invención incluye los anticuerpos quiméricos, de cadena única y los anticuerpos humanizados, al igual que los fragmentos Fab y los productos de una librería con la expresión Fab.

Se pueden preparar anticuerpos policlonales contra un fragmento antigénico de un polipéptido LLG, tal como se describe en el Ejemplo 4A. De igual modo es posible generar los anticuerpos contra la proteína o el polipéptido LLG intactos o contra un fragmento, derivado o epitope de la proteína o el polipéptido. Los anticuerpos se pueden obtener después de la administración de la proteína, el polipéptido, el fragmento, el derivado o el epitope a un animal, utilizando las técnicas y los procedimientos que se conocen en la especialidad.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando el método de Mishell, B. B., et al., Selected Methods In Cellular Immunology, (W.H. Freeman, ed.) San Francisco (1980). En síntesis, un polipéptido de la presente invención se utiliza para inmunizar las células del bazo de ratón Balb/C. Las células del bazo inmunizadas se fusionan con las células del mieloma. Las células fusionadas que contienen las características celulares del bazo y el mieloma son aisladas por medio del crecimiento en el medio HAT, un medio que extermina a las células madre, pero que permite que los productos fusionados sobrevivan y crezcan.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención se pueden "humanizar" para evitar que el huésped arme una respuesta inmune a los anticuerpos. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo en el cual las regiones que determinan la complementariedad (CDR) y/u otras porciones del marco del dominio variable liviano o pesado derivan de una inmunoglobulina no humana, pero las porciones restantes de la molécula derivan de una o más inmunoglobulinas humanas. Los anticuerpos humanizados también incluyen los anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena liviana sin modificar donante o aceptora o una cadena liviana quimérica o viceversa. La humanización de los anticuerpos se puede llevar a cabo por medio de los métodos conocidos en la especialidad (ver, por ejemplo G.E. Made y E.A. Padlan" Capítulo 4. Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113, Springer-Verlag, New York, 1994). Los animales transgénicos se pueden utilizar para expresar los anticuerpos humanizados.

Las técnicas conocidas en la especialidad para la producción de anticuerpos de cadena única se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena única para los polipéptidos inmunogénicos y las proteínas de la presente invención.

Los anticuerpos anti-LLG son útiles en los ensayos para detectar o cuantificar los niveles de LLG. En una realización, estos ensayos proveen un diagnóstico clínico y una valoración de LLG en varios estados de enfermedad y un método para monitorear la eficacia del tratamiento.

E) Métodos de Selección para Agonistas o Antagonistas

La presente invención provee métodos de selección de las librerías pequeñas o las fuentes de productos naturales para los agonistas (realzadores o co-activadores que incluyen a los co-activadores proteináceos) o los antagonistas (inhibidores) de la actividad de LLGXL. Un agonista o un antagonista potencial se contacta con la proteína LLGXL y un substrato de LLGXL y se mide la capacidad del agonista o del antagonista potencial para realzar o inhibir la actividad de LLGXL.

La proteína LLGXL utilizada en el método se puede producir de manera recombinante en una variedad de células huésped que incluyen las células de mamífero (tal como se muestra en el Ejemplo 7), las células de insectos infectadas con baculovirus, levadura y bacterias. La expresión LLG en las células CHO transfectadas de manera estable se pueden optimizar por medio de la amplificación del metotrexato de las células. La proteína LLGXL también puede ser purificada a partir de las fuentes naturales tales como el plasma humano, los extractos de placenta o los medios acondicionados de células endoteliales cultivadas, las células THP-I o los macrófagos.

La optimización de los parámetros de ensayo que incluyen el pH, las concentraciones iónicas, la temperatura, la concentración del substrato y las condiciones de emulsión están determinadas en forma empírica por las personas idóneas en la especialidad.

Los sustituyentes del ácido graso de los substratos pueden variar en la longitud de la cadena al igual que en el grado y la posición de la insaturación. Los substratos pueden estar radiomarcados en cualquiera de las diversas posiciones. Los substratos de los fosfolípidos tales como la fosfatidilcolina pueden estar radiomarcados, por ejemplo, en la posición del ácido graso Sn-1 o Sn-2 o en el glicerol, el fosfato o el grupo polar cabecera (colina en el caso de la fosfatidilcolina).

Como una alternativa para los substratos radiomarcados, se pueden utilizar en los métodos de selección otras clases de substratos marcados tales como los substratos fluorescentes o los substratos que contengan tio.

Los substratos fluorescentes son particularmente útiles para los ensayos de selección porque la catálisis enzimática se puede medir en forma continua al medir la intensidad de la fluorescencia sin la separación física (extracción) de los productos provenientes de los substratos. Un ejemplo de un substrato fluorescente de fosfatidilcolina es C_{6}NBD-PC (1-acil-2-[6-(nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il)amino]caproilfosfatidilcolina.

Los substratos que contienen tio incluyen 1,2-bis(hexanoiltio)-1.2-dideoxi-sn-glicero-3-fosforilcolina (L.I.
Reynolds. W.N. Washburn, R.A. Deems. y E.A. Dennis. 1991. Methods in Enzymology 197: 3-23; L. Yu y E.A. Dennis. 1991. Methods in Enzymology 197: 65-75; L.A. Wittenauer. K. Shirai. R.L. Jackson, y J.D. Johnson. 1984. Biochem. Biophys. Res. Commun. 118: 894-901).

F) Hidrólisis de los Esteres de Fosfatidilcolina

La presente invención suministra un método para la hidrólisis enzimática de los ésteres de fosfatidilcolina, por ejemplo, para el procesamiento industrial o alimenticio o en los detergentes para lavandería. Los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar para hidrolizar los ésteres de fosfatidilcolina en solución o las enzimas se pueden unir a un soporte sólido que luego se pone en contacto con el substrato. Este método se puede utilizar para producir lisofosfolípidos y ácidos libres de grasa.

G) Composiciones

La presente invención suministra composiciones en una solución biológicamente compatible (biocompatible) que comprende los polipéptidos, los ácidos nucleicos, los vectores y los anticuerpos de la presente invención. Una solución biológicamente compatible es una solución en la cual el polipéptido, el ácido nucleico, el vector, o el anticuerpo de la invención se mantiene en una forma activa, por ejemplo, en una forma capaz de efectuar una actividad biológica: Por ejemplo, un polipéptido de la invención tendría una actividad de la fosfolipasa, un ácido nucleico estaría en condiciones de replicar, traducir un mensaje o hibridizarse hasta un ácido nucleico complementario; un vector sería capaz de transfectar una célula blanco; un anticuerpo se uniría a un polipéptido de la invención. Por lo general, una solución de este tipo biológicamente compatible será una solución buffer acuosa, por ejemplo, Tris, fosfato o solución buffer HEPES, que contengan iones de sal. Por lo general, la concentración de iones de sal será similar a los niveles fisiológicos. En una realización específica, la solución biocompatible es una composición aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Las soluciones biológicamente compatibles pueden incluir agentes estabilizantes y conservantes.

Tales composiciones se pueden formular para la administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, subcutánea e intraocular. La administración parenteral significa incluir las técnicas de inyección endovenosa, inyección intramuscular, inyección intraarterial o de infusión. La composición se puede administrar por vía parenteral en formulaciones de dosificación por unidad que contengan portadores, adyuvantes o vehículos estándar no tóxicos conocidos fisiológicamente aceptados según se desee.

Las preparaciones estériles preferidas pueden ser una solución o una suspensión en un solvente o diluyente no tóxico aceptable para la vía parenteral. Los ejemplos de los portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico son la solución salina, la solución salina amortiguada, la solución salina isotónica (por ejemplo, el fosfato monosódico o disódico, el sodio, el potasio, el calcio o el cloruro de magnesio o las mezclas de tales sales), la solución de Ringer, la dextrosa, el agua, el agua estéril, el glicerol, el etanol y las combinaciones de los mismos. El 1,3-butanodiol y los aceites estériles fijos son empleados de manera conveniente como solventes o medios de suspensión. Se puede emplear cualquier aceite insípido fijo que incluye los mono o los di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grasos tales como el ácido oleico también encuentran su uso en la preparación de inyectables.

El medio de composición también puede ser un hidrogel que se prepara a partir de cualquier polímero biocompatible o no citotóxico (homo o hetero) tal como un polímeroácido hidrofílico poliacrílico que puede actuar como una esponja que absorba la droga. Dichos polímeros han sido descriptos, por ejemplo, en la solicitud W093/08845, cuyo contenido completo se incorpora a la presente a título de referencia. Algunos de los mismos como por ejemplo, en particular, los que se han obtenido a partir del óxido de etileno y/o propileno están comercialmente disponibles. Se puede depositar un hidrogel directamente sobre la superficie del tejido que se debe tratar, por ejemplo durante la intervención quirúrgica.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un virus recombinante de replicación defectiva y poloxámero. De un modo más específico, la invención se refiere a una composición que comprende un virus recombinante de replicación defectiva que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido LLG y. Un poloxámero preferido es el Poloxamer 407, que está comercialmente disponible (BASF, Parsipanny, NJ) y es un poliol no tóxico, biocompatible y es el que goza de mayor preferencia. Un poloxámero impregnado con virus recombinantes se puede depositar directamente sobre la superficie del tejido que se debe tratar, por ejemplo durante una intervención quirúrgica. El poloxámero posee esencialmente las mismas ventajas que el hidrogel mientras que tiene una viscosidad inferior.

H) Métodos de Tratamiento

La presente invención es útil en los métodos de tratamiento que comprenden la administración a un humano o a otros animales de una cantidad efectiva de una composición de la presente invención.

La cantidad efectiva puede variar en función de la edad, el tipo y la severidad de la condición que debe ser tratada, el peso corporal, la duración deseada para el tratamiento, el método de administración y otros parámetros. Las cantidades efectivas son determinadas por un médico u otro profesional médico calificado.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención por lo general son administrados en dosis de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg, con preferencia de alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg y con mayor preferencia de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg de peso corporal por día.

Los virus recombinantes de acuerdo con la presente invención por lo general se formulan y se administran en la forma de dosis de entre alrededor de 10^{4} y alrededor de 10^{14} pfu. En el caso de AAVs y de los adenovirus, con preferencia se usan las dosis de desde alrededor de 10^{6} a hasta alrededor de 10'' pfu. El término pfu ("unidad formadora de placa") corresponde al poder de infección de una suspensión de viriones y se determina por la infección de un cultivo celular adecuado y la medición de la cantidad de placas formadas. Las técnicas para determinar el título de pfu de una solución viral están bien documentadas en la especialidad con anterioridad.

La presente invención es útil en los métodos para tratar la aterosclerosis cuando dicha aterosclerosis es el resultado del exceso, la expresión anormal o inadecuada de la actividad del polipéptido LLG.

La presente invención es útil en los métodos para tratar a un humano u otro animal que tiene un perfil de lípidos no deseado, donde dicho perfil de líquidos no deseado es el resultado de la expresión anormalmente alta o inadecuada de la actividad del polipéptido LLG.

La presente invención además es útil en los métodos de tratamiento par ala diabetes, la hiperlipidemia, la colestasis intrahepática u otros trastornos metabólicos en los cuales la diabetes, la hiperlipidemia, la colestasis intrahepática u otros trastornos metabólicos es el resultado de la expresión anormalmente alta o inadecuada de la actividad del polipéptido LLG.

1) Tratamiento de los Perfiles de Lípidos No Deseados Asociados Con el Aumento de la Expresión del Polipéptido LLG

Los métodos para reducir la expresión del polipéptido LLG para corregir las condiciones mencionadas en las cuales la actividad del polipéptido LLG contribuye a una enfermedad o a un trastorno asociado con un perfil de lípidos no deseado incluyen pero no se limitan a la administración de una composición que comprende un ácido nucleico antisentido, la administración de una composición que comprende una proteína de unión intracelular tal como un anticuerpo, la administración de una composición que comprende el polipéptido LLGN u otro fragmento de LLG y la administración de una composición que comprende un ácido nucleico que codifica al polipéptido LLGN u otro fragmento de LLG.

En una realización, una composición que comprende un ácido nucleico antisentido se utiliza para regular por disminución o bloquear la expresión de LLG. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica las moléculas ARN antisentido. En esta realización, el ácido nucleico de manera operativa se une a las señales que permiten la expresión de la secuencia del ácido nucleico y se introduce en una célula utilizando con preferencia los constructos del vector recombinante que expresarán el ácido nucleico antisentido una vez que el vector se haya introducido dentro de la célula. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen los plásmidos, los adenovirus, los virus adeno-asociados, los retrovirus y los herpes virus. Con preferencia, el vector es un adenovirus. Con mayor preferencia, el vector es un adenovirus con replicación defectiva que comprende una eliminación en las regiones E1 y/o E3 del virus.

En otra realización, la expresión de LLG es regulada por disminución o bloqueada por medio de la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica a una proteína de unión intracelular que es capaz de interactuar de manera selectiva con LLG. WO 94/29446 y WO 94/02610, cuyos contenidos se incorporan a la presente a título de referencia, revelan la transfixión celular con los genes que codifican una proteína de unión intracelular. Una proteína de unión intracelular incluye cualquier proteína capaz de interactuar de manera selectiva con LLG en la célula en la cual se expresa y capaz de neutralizar la función de unión de LLG. Con preferencia, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo. Con mayor preferencia la proteína de unión intracelular es un anticuerpo de cadena única.

WO 94/02610 revela la preparación de los anticuerpos y la identificación del ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular. Alutilizar LLG o un fragmento del mismo, se prepara un anticuerpo monoclonal específico por medio de las técnicas conocidas por las personas idóneas en la especialidad. Un vector que comprende el ácido nucleico que codifica una proteína de unión intracelular o una porción de la misma y es capaz de la expresión en una célula huésped se prepara de manera subsiguiente para utilizar en el método de esta invención.

De manera alternativa, la actividad de LLG puede ser bloqueada por medio de la administración de un anticuerpo neutralizante en la circulación. Un anticuerpo neutralizante de esa naturaleza se puede adminsitrar directamente como una proteína o bien se puede expresar a partir de un vector (con una señal secretoria).

En otra realización, la actividad de LLGXL se inhibe por medio de la administración de una composición que comprende el polipéptido LLGN u otro fragmento de LLG. Esta composición puede ser administrada de una manera conveniente, tal como por vía oral, tópica, endovenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. La composición se puede administrar directamente o puede ser encapsulada (por ejemplo, en un sistema de lípidos, en microesferas de aminoácido o en dendrímeros globulares). En algunos casos, el polipéptido puede estar unido a otro polímero tal como la albúmina sérica o la polivinil pirrolidona.

En otra realización, la actividad de LLGXL es inhibida por medio del uso de compuestos de bajo peso molecular que interfieren con sus propiedades enzimáticas o impiden su reconocimiento adecuado por parte de los sitios de unión celular.

En otra realización, la actividad de LLGXL es inhibida por medio del uso de la terapia genética, es decir, a través de la administración de una composición que comprende un ácido nucleico que codifica y direcciona la expresión del polipéptido LLGN u otro fragmento de LLG.

En una realización específica, el gen LLG de la presente invención también tiene una afinidad por la heparina. El polipéptido LLG que se une a la heparina extracelular en el lumen de los vasos sanguíneos permitiría a LLG y unirse a y acelerar la recaptación de LDL al actuar como un puente entre LDL y la heparina extracelular. En el área localizada de una lesión aterosclerótica, se plantea la hipótesis según la cual un mayor nivel de actividad de la lipasa acelera el proceso aterogénico (Zilversmit. D.B. (1995) Clin. Chem. 41.153-158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C. Moojani, S. Lupien, P.J., Hayden M.R., y Brunzell, J.D., (1993) Lancet 341. 1119-1121). Esto se puede deber a un aumento producido en la unión y la recaptación de las lipoproteínas por medio del tejido vascular mediado por las lipasas (Eisenberg, S., Sehayek. E., Olivecrona, T. Vlodavsky, I. (l992) I. Clin. Invest. 90,2013-2021; Tabas, I., Li, I., Brocia R.W., Xu, S.W., Swenson T.L. Williams, KJ. (1993) J. Biol. Chem. 268.20419-20432; Nordestgaard. B.G., y Nielsen, A.G. (1994) Curr. Opin. Lipid. 5.252-257; Williams. K.J., y Tabas, I. (1995) Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15,551-561). De manera adicional, un alto nivel local de la actividad de la lipasa puede dar como resultado niveles citotóxicos de los ácidos grasos y producir lisofosfatidilcolina en los precursores de las lesiones ateroscleróticas. Esta actividad particular de LLG puede contribuir al desarrollo o la progresión de la aterosclerosis, particularmente dentro del contexto de los niveles excesivos de lípidos en un paciente debido a factores relacionados con la dieta o a factores genéticos. Por lo tanto, la presente invención permite la inhibición de la acumulación de lipoproteína por medio de la inhibición de la expresión del polipéptido LLG o de la unión a la lipoproteína (por ejemplo, LDL).

2) Tratamiento de los Perfiles de Lípidos No Deseados Asociados con LLG Insuficiente Actividad del Polipéptido

Los métodos para aumentar la expresión de LLG para corregir aquellas condiciones en las cuales la actividad del polipéptido contribuye a una enfermedad o a un trastorno asociado con un perfil de lípidos no deseado, incluyen pero no se limitan a la administración de un a composición que comprende el polipéptido LLGXL y la administración de una composición que comprende un ácido nucleico que codifica al polipéptido LLGXL.

En una realización, el nivel de actividad de LLGXL aumenta a través de la administración de una composición que comprende el polipéptido LLGXL. Esta composición se puede administrar de una manera conveniente tal como por medio de la vía oral, tópica, endovenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, o intradérmica. La composición se puede adminsitrar directamente o puede ser encapsulada (por ejemplo, en un sistema de lípidos, en microesferas de aminoácidos o en dendrímeros globulares). En algunos casos, el polipéptido puede estar unido a otro polímero tal como la albúmina sérica o la polivinil pirrolidona.

En otra realización, el nivel de LLGXL se incrementa a través del uso de compuestos de bajo peso molecular que pueden regular hacia arriba la expresión de LLGXL en el nivel de la post-traducción.

En otra realización, el nivel de LLGXL se incrementa a través del uso de la terapia genética, es decir, a través de la administración de la composición que comprende un ácido nucleico que codifica y direcciona la expresión del polipéptido LLGXL.

La colestasis intrahepática se puede caracterizar por medio del aumento de los niveles del colesterol sérico y de los fosfolípidos. Un modelo descripto recientemente de colestasis intrahepática inducida por la droga phalloidin en ratas demostró aumentos significativos en los niveles séricos del colesterol y los fosfolípidos (Ishizaki. K., Kinbara. S., Miyazawa, N., Takeuchi. Y., Hirabayashi, N., Kasai, H., y Araki, T. (1997) Toxicol. Letters 90, 29-34). Los productos de la presente invención se pueden utilizar para tratar la colestasis intrahepática en pacientes que han aumentado el colesterol sérico y/o los fosfolípidos. Además, este modelo realizado en ratas también exhibió una reducción severa en las velocidades de excreción biliar del colesterol. El polipéptido LLG y los productos de ácido nucleico de esta invención se pueden utilizar para tratar pacientes con una disfunción en el sistema de excreción biliar.

La colestasis intrahepática también se caracteriza por un trastorno del caudal biliar desde el hígado.

Recientemente, se hizo el mapeo de las ubicaciones para la colestasis intrahepática familiar progresiva (PFIC o enfermedad de Byler) y la colestasis intrahepática benigna recurrente (BRIC) hasta 18q21-q22 (Carlton, V.E.H., Knisely. A.S., y Freimer, N.B. (1995) Hum. Mol. Genet. 4, 1049-1053 y Houwen; R.H., Baharloo. S., Blankenship, K., Raeymaekers. P., Juyn, J., Sandkuijl, L.A.. y Freimer, N.B. (1994) Nature Genet. 8, 380-386. respectivamente). En la medida que el gen LLG hace el mapa dentro de esta región cromosómica en 18q21, el gen LLG o los productos de esta invención pueden ser utilizados para tratar pacientes con colestasis intrahepática que es provocada por una mutación o una expresión defectuosa del gen o de los genes de la enfermedad PFIC/BRIC.

En otra realización, el gen LLG o los productos del polipéptido de esta invención se pueden utilizar para tratar pacientes con colestasis intrahepática que no se deba a un defecto en el o los genes de la enfermedad PFIC/BRIC en 18q21-q22. Un estudio reciente sugirió que otro locus ubicado fuera de la región 18q21-q22 también puede producir el fenotipo PFIC (Strautnieks, S.S., Kagalwalla, A.F. Tanner. M.S., Gardiner, R.M., y Thompson, R.I. (1996) J. Med. Genet. 33, 833-836).

No obstante ello, la administración del polipéptido LLG, ya sea directamente o por medio de la terapia genética, puede aliviar esta forma de la condición.

En la terapia genética, uno o más ácidos nucleicos que codifican a un polipéptido, al igual que las regiones regulatorias que controlan su expresión se transfieren a las células blanco de un humano u otro animal. Esta transferencia se lleva a cabo ya sea ex vivo en un procedimiento en el cual el ácido nucleico se transfiere a las células en el laboratorio y las células modificadas luego son administradas al humano o a otro animal o in vivo en un procedimiento en el cual el ácido nucleico se transfiere directamente a las células dentro del humano o de otro animal. La transferencia de los ácidos nucleicos se puede lograr utilizando ya sea los vectores virales como los no virales que han sido descriptos con anterioridad.

Los vectores no virales se pueden transferir a las células utilizando cualquiera de los métodos conocidos en la especialidad, que incluyen la co-precipitación de calcio fosfato, la lipofección (liposomas sintéticos aniónicos y catiónicos), la liberación de genes mediada por el receptor, la inyección de ADN descubierto, la electroporación y la aceleración biobalística o particulada.

Ejemplos

Los ejemplos que figuran a continuación ilustran la invención. Estos ejemplos son solamente ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Identificación de un ADNc Expresado en forma Diferencial A) Preparación del ARN

Las células monocíticas humanas THP-1 (Smith. P.K., Krohn. R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H. Provenzano. M.D., Fujimoto, E.K., Goeke. N.M., Olson, BJ., y Klenk. D.C. (1985) Anal. Biochem. 150,76-85) fueron cultivadas en el medio RPMI-I640 (GIBCO) con 25 nM HEPES, suero fetal bovino al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 unidades/ml de sulfato de estreptomicina. Las células fueron colocadas sobre placas de cultivo celular de 15 cm 1,5 x 10^{7} células/placa, y fueron tratadas con 40 ng/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (Sigma) durante 48 horas para inducir la diferenciación de las células. Se adquirieron lipoproteínas de baja densidad (LDL) a Calbiochem y las mismas fueron dializadas en forma exhaustiva contra PBS a 4ºC. Luego, se diluyó la LDL hasta 500 \mug/ml y se dializó contra 5 \muM CuSO_{4} en PBS a 37ºC durante 16 horas. Para detener la oxidación, la LDL fue dializada en forma exhaustiva contra150 nM NaC, 0.3 nM EDTA y luego se esterilizó el filtro. Se determinó la concentración de proteínas por medio del método BCA (Schuh, J. Fairclough, G.F., y Haschemeyer. R.H., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15. 3113-3117) (Pierce). Se determinó el grado de oxidación por medio de TBARS (Chomczynski, P. (1993) Biotechniques 15,532-537), y estuvo entre 25-30 nmol MDA equivalentes/mg proteína. Las células diferenciadas THP-I fueron expuestas durante 24 horas ya sea a 50 \mug/ml de LDL oxidada o bien a NaCl-EDTA buffer en medio RPMI con suero fetal bovino deficiente de lipoproteínas al 10% (Sigma). Para recolectar el ARN, las placas se enjuagaron con 10 ml de PBS y luego se agregaron a cada placa 14 ml de TRIZOL (Liang, P. y Pardee, A.B. (1992) Science 257,967-971) (GIBCO). Se revolvió la solución con una pipeta varias veces para mezclarla, luego las muestras similares fueron agrupadas en tubos centrífugos y se agregaron 3 ml de cloroformo por placa y se mezclaron. Se centrifugaron los tubos durante 15 minutos a 12000 x g. Después del centrifugado, la capa superior fue transferida a un tubo nuevo y de agregaron 7.5 ml de isopropanol por placa y se mezclaron. Los tubos se centrifugaron a 12000 x g durante 20 minutos. El pellet se enjuagó con etanol al 70% enfriado en hielo y secado a temperatura ambiente. Los pellets fueron suspendidos en 500 \mul TE (Tris-EDTA) y tratados con 200 unidades de ADNse I libre de ARNse y 200 unidades de inhibidor de RNase de placenta RNasin (Promega) durante 30 minutos a 37ºC. Se purificó en ARN por medio de extracciones secuenciales con fenol, fenol / cloroformo / isoamil alcohol (25:24: 1), y clorofornilsoamil alcohol (24:1) seguido de precipitación con etanol.

B) Síntesis de ADNc

Se llevaron a cabo la síntesis del ADNc y la amplificación del PCR utilizando protocolos de la versión 1.0 del Differential Display Kit (Kit de display diferencial) (Display Systems Biotechnology, Inc.) Este sistema se basa sobre la técnica que fue descripta originalmente por Liang y Pardee (Mead, D.A., Pey, N.K., Hermstadt, C., Marcil, R.A., y Smith, L.M., (1991) Bio/Technology 9,657-663). Los pares de cebadores que produjeron el fragmento de ADNc que contenía la primera información del gen similar a la lipasa fueron el cebador 7 corriente abajo y el cebador 15 corriente arriba. El ADNc para la amplificación fue sintetizado de la manera siguiente, utilizando ARN derivado de las células THP-I tratadas con PMA expuestas ya sea a solución buffer o bien a LDL oxidada: 3 \mul de 25 \muM del cebador 7 corriente abajo y 7.5 \mul de dietilpirocarbonato agua tratada con (DEPC) se agregaron a 300 ng (3.0 \mul) ARN de cada muestra de ARN de THP-1 RNA. Esto se calentó a 70ºC durante 10 minutos y luego se enfrió sobre hielo. A este tubo se agregaron 3 \mul de 5 x PCR solución buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3. 375 mM KCl) (GIBCO), 3 \mul 25 mM MgCl_{2}, 3 \mul 0.1M DTT, 1.2 \mul 500 \muM dNTPs, 0.7 \mul RNasin, y 5.6 \mul de agua tratada con DEPC. Los tubos fueron incubados durante 2 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se agregaron 1.5 ml (300 unidades) Superscript II RNase H- transcriptasa inversa (GmCO). Los tubos fueron incubados en forma secuencial a temperatura ambiente durante 2 minutos, 60 minutos a 37ºC, y 5 minutos a 95ºC, y seguidamente se enfrió sobre hielo. Se llevó a cabo la amplificación PCR utilizando una mezcla maestra que contenía 117 \mul 10x solución buffer PCR (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 8.3, 15 mM MgCl_{2}, y 0.01% (w/v) gelatina), 70,2 \mul 25 \muM MgCl_{2}, 5,9 alfa ^{33}PdATP (10M Ci/ml, DuPont NEN). 4,7 \mul 500 \muM dNTP mezcla, 11 \mul AmpliTaq ADN polimerasa (5 unidades/ml, Perkin-Elmer), y 493,3 \mul de agua tratada con DEPC. Para cada reacción, se agregaron 12 ml de la mezcla maestra a 2 ml del primer #7 corriente abajo, 1 ml de ADNc y 5 ml del cebador #15 corriente arriba. Las mezclas de la reacción se calentaron a 94ºC durante 1 minuto, luego fueron termocicladas 40 veces con un paso de desnaturalización de 94ºC durante 15 segundos, un paso de recocción de 40ºC durante 1 minuto y un paso de extensión de 72ºC durante 30 segundos. Después de los 40 ciclos, las reacciones fueron incubadas a 72ºC durante 5 minutos y se almacenaron a 10ºC. Las reacciones PCR se llevaron a cabo en un termociclador Perkin-Elmer GeneAmp System 9600.

Se mezclaron cuatro microlitros de la reacción de amplificación con un volumen igual de buffer de carga (azul bromofenol al 0.2%, Xileno cianol al 0.2%, 10 mM de EDTA con un pH de 8.0, y glicerol al 20%). Cuatro microlitros de esta mezcla fue extendida sobre un gel con formato de secuencias de acrilamida no desnaturalizada al 6% durante 3 horas a 1200 voltios (voltaje constante). El gel se secó a 80ºC durante 1,5 horas y se expuso a la película Kodak XAR. Se identificó y se separó del gel un producto de amplificación hallado solamente en la reacción que contenía ADNc proveniente de las células THP-I expuestas a LDL oxidada. Se agregaron 100 ml de agua tratada con DEPC a un tubo microcentrífugo que contenía el fragmento de gel separado y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido por 15 minutos a 95ºC.

Para volver a amplificar el producto PCR, 26.5 microlitros del ADN eluído se utilizaron en una reacción de amplificación que también incluyó 5 \mul 10x PCR buffer, 3 \mul 25 mM MgCl_{2}, 5 \mul 500 mM dNTPs, 5 \mul 2\muM del cebador 7 corriente abajo, 7.5 \mul del cebador 15 corriente arriba y 0.5 \mul Amplitaq polimerasa. Los parámetros de ciclado de PCR y el instrumento fueron los que se describieron con anterioridad. Después de la amplificación, 20 \mul de la reamplificación fueron analizados sobre un gel de agarosa y se utilizaron 4 \mul para subclonar los productos PCR en el vector pCRII utilizando el sistema de clonación T A (Forman, M.A., Dush, M.K., y Martin, G.R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,8998-90 (2) (Invitrogen). Después de la ligación durante toda la noche a 14ºC, los productos de ligación se utilizaron para transformar E. coli. Se recolectaron las transformaciones resultantes y 3 ml de los cultivos de toda la noche se utilizaron en minipreparaciones de plásmidos. Los tamaños de inserción se determinaron utilizando las digestiones de EcoRI de los plásmidos y los clones que contenían inserciones del tamaño aproximado del producto original de PCR fueron sometidos a secuencias utilizando reactivos fluorescentes pigmento-terminador (Prism. Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373. La secuencia del producto de PCR se muestra en la Figura 2. La secuencia de los cebadores de la amplificación está subrayada.

C) Reacción 5'RACE

La extensión del ADNc identificada a través de RT-PCR se realizó utilizando el sistema 5'RACE (Loh, E.Y., Eliot, J.F., Cwirla. S., Lanier. L.L., y Davis. M.M. (1989) Science 243, 217219; Simms, D., Guan, N., y Sitaraman, K., (1991) Focus 13,99) (GIBCO). Un microgramo del ARN de THP-1 (LDL oxidado tratado) utilizado en forma inicial en las reacciones de representación diferencial se utilizó en el procedimiento 5'RACE:

1 \mul (1 \mul ) de ARN se combinó con 3 \mul (3 pmol) del cebador 2a y 11 \mul de agua tratada con DEPC y calentado a 70ºC durante 10 minutos seguido de 1 minuto sobre hielo. Se agregaron 2.5 \mul solución buffer de reacción 10 x (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 3 \mul 25 mM MgCl_{2}, 1 \mul de mezcla 10 mM dNTP y 2.5 \mul 0.1 M DTT. La mezcla se incubó a 42ºC durante 2 minutos, luego se agregó 1 \mul de Superscipt II transcriptasa inversa. La reacción se incubó durante un período adicional de 30 minutos a 42ºC, 15 minutos a 70ºC, y sobre hielo durante 1 minuto. Se agregó 1 microlitro de RNase H (2 unidades) y la mezcla se incubó a 55ºC durante 10 minutos. El ADNc se purificó utilizando las columnas GlassMax (Sambrook, J. Fritsch, E.F., y Maniatis, T. (1989) . Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) que se incluye en el kit. El ADNc fue sometido a elución desde la columna en 50 \mul dH_{2}O, liofilizado y resuspendido en 21 \mul dH_{2}O. El acortamiento del ADNc se llevó a cabo en la reacción siguiente: 7.5 \mul de H_{2}O, 2.5 \mul de solución buffer de reacción (200 mM de Tris-HCl a un pH de 8.4, 500 mM de KCl), 1.5 \mul de 25 mM MgCl_{2}, 2.5 \mul de 2 mM dCTP, y 10 \mul del ADNc se incubaron a 94ºC durante 3 minutos y luego se colocaron 1 minuto sorbe hielo. Se agregó 1 \mul (10 unidades) de deoxinucleotidil transferasa terminal y la mezcla se incubó durante 10 minutos a 37ºC. La enzima se inactivó con calor por medio de incubación a 70ºC durante 10 minutos y la mezcla se colocó sobre hielo. La amplificación PCR del ADNc se llevó a cabo conforme a los pasos siguientes: 5 \mul del ADNc acortado se incluyeron en la reacción que también contenía 5 \mul de solución buffer 10x PCR (500 mM de KCl, 100 mM de Tris HCl a un pH de 8.3, 15 mM de MgCl_{2}, y 0.01% (p/v) gelatina), 1 \mul de mezcla 10 mM de dNTP, 2 \mul (10 pmol) del cebador de anclaje, 1 \mul (20 pmol) del cebador 3ª y 35 \mul de dH_{2}O. La reacción se calentó a 95ºC durante 1 minuto, luego se agregaron 0.9 \mul (4.5 unidades) de polimerasa Amplitaq. La reacción fue ciclada 40 veces bajo las condiciones siguientes: 94ºC durante 5 segundos, 50ºC durante 20 segundos, y 72ºC durante 30 segundos. Se utilizó un microlitro de esta reacción en una reamplificación anidada para incrementar los niveles del producto específico para el aislamiento subsiguiente. La reamplificación incluyó: 1 \mul de amplificación primaria, 5 \mul de solución buffer 10x PCR, 1 \mul de la mezcla de 10 mM dNTP, 2 \mul (20 pmol) del cebador de amplificación universal, 2 \mul (20 pmol) del cebador 4a y 38 \mul de dH_{2}O. La reacción se calentó hasta 95ºC durante 1 minuto, luego 0.7 \mul (3.5 unidades) Se agregó polimerasa Amplitaq. La reacción se cicló 40 veces bajo las condiciones mencionadas: 94ºC durante 5 segundos, 50ºC durante 20 segundos, y 72ºC durante 30 segundos. Los productos de la amplificación fueron analizados por medio de la electroforesis por gel de agarosa al 0.8%. Se detectó un producto predominante de aproximadamente 1.2 pares de kilobase. Se clonaron dos microlitros de los productos de la reacción en el vector pCRII del kit de clonación TA (Invitrogen) y se incubó a 14ºC durante toda la noche. Los productos de ligación se utilizaron para tansformar E. coli. Los tamaños de inserción de los transformantes resultantes se determinaron a continuación de la digestión de EcoRI. Se estableció la secuencia de los clones que contenían inserciones del tamaño aproximado del producto PCR utilizando reactivos fluorescentes del pigmento-terminador (Prism, Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373. La secuencia del producto RACE que incluye a los sitios EcoRI del vector TA se muestra en la Figura 3. Las secuencias de los amplímeros (cebador de amplificación universal y el complemento para el cebador 4 a 5'RACE) están subrayadas.

Ejemplo 2 Clonación y Ubicación de los Cromosomas del Gen LLGXL A) Selección de la librería del ADNc

Una librería del ADNc de la placenta humana (Oligo dT y cebado mediante randomización. Cat. #5014b, Lote #52033) se obtuvo a partir de Clontech (Palo Alto, CA). Se creó una sonda radiomarcada al suprimir la inserción de un plásmido que contenía el producto PCR de la reacción 5'RACE que se describió con anterioridad. La sonda fue radiomarcada utilizando la técnica de cebado por randomización: el fragmento de ADN (50-100 ng) se incubó con 1 \mug de hexámeros randomizados (Gibco) a 95ºC durante 10 minutos seguido de 1 minuto sobre hielo. Se agregó lo que figura a continuación a temperatura ambiente: 3 \mul de solución buffer 10x Klenow (100 mM de Tris-HCl a un pH de 7.5, 50 mM de MgCL_{2}, 57 mM de ditiotreitol; New England Biolabs), 3 \mul de 0.5 mM dATP, dGTP, dTTP), 100 \muCi de \alpha ^{32}PdCTP (3000 Ci/mmol, New England Nuclear), y 1\mul del fragmento Klenow del ADN polimerasa I (5 unidades, Gibco). La reacción se incubó durante 2-3 horas a temperatura ambiente y luego se interrumpió la reacción aumentando el volumen hasta 100 ml con TE pH 8.0 y agregando EDTA hasta lograr una concentración final de 1 mM. Los nucleótidos no incorporados fueron eliminados aumentando el volumen de la reacción hasta 100 \mul y pasando por encima de una columna giratoria G-50 (Boehringer Mannheim). Las investigaciones resultantes tuvieron una actividad específica superior a 5x10^{8} cpm/\mug ADN.

La librería se investigó utilizando los métodos establecidos (Walter, P.. Gilmore, R., y Blobel. G. (1984) Cell 38,5-8). En síntesis, los filtros fueron hibridizados durante 24 horas a 65ºC en 4.8X SSPE (20X SSPE = 3.6 M de NaCl, 0.2 M de NaH_{2}PO., 0.02 M de EDTA, a un pH de 7.7), 20 mM de Tris HCl a un pH de 7.6, IX solución Denhardt's (100X= 2% de Ficoll 400, 2% de polivinilpirrolidona, 2% del BSA), 10% de dextran sulfato, 0.1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón y 1x10^{8} cpm/ml de sonda radiomarcada. Los filtros luego se lavaron tres veces durante 15 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC (IX SSC = 150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de sodio a un pH de 7.0), 0.1% de dodecil sulfato sódico (SDS) seguido de tres lavados durante 15 minutos cada uno a 65ºC en 0.5X SSC, 0.1% de SDS. Los fagos que se hibridizaron a la sonda fueron aislados y amplificados. El ADN se purificó a partir del fago amplificado utilizando el reactivo LambdaSorb (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las inserciones fueron eliminadas del ADN del fago por digestión con EcoRI. Las inserciones fueron subclonadas en el sitio de EcoRI de un vector del plásmido (Bluescript II SK. Stratagene). La secuencia del marco de lectura abierta contenida dentro del fragmento 2.6 kb EcoRI del ADNc fue determinada por medio de la secuencia automática que se estableció tal como se describió con anterioridad. La secuencia se muestra en la Figura 4. La secuencia de aminoácidos de la proteína predecida codificada por un marco de lectura abierta se muestra en la Figura 5 y ha sido denominada LLGXL. Se predice que la primera metionina es codificada por los pares de nucleótidos 252-254. La proteína predecida es de 500 aminoácidos de longitud. Los primeros 18 aminoácidos de una secuencia característica de un péptido de señal secretoria (Higgins, D.G., y Sharp, P.M: (1988) Gene 73, 237-244). Se predice que el propéptido tiene un peso molecular de 56,800 Daltons. Suponiendo una división del péptido señal en la posición 18, la proteína madura inmodificada tiene un peso molecular de 54.724 Daltons.

Las similitudes generales entre esta proteína y los demás miembros conocidos de la familia de la triacilglicerol lipasa se ilustran en la Figura 6 y en la Tabla 1. En la alineación que se muestra en la Figura 6. LLG es el polipéptido (SEQ ID NO: 6) codificado por el ADNc (SEQ ID NO: 5) que se ha descripto en el Ejemplo 1, y que de aquí en adelante se denomina LLGN. Esta proteína es idéntica a la proteína LLGXL de los residuos amino terminales 345. Nueve residuos únicos son seguidos por un codón de terminación que produce un polipéptido de 39.3 kD y una proteína madura de 37.3 kD. Las secuencias que son comunes a LLGN y LLGXL son la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

Es interesante mencionar que la posición en la cual las proteínas LLGN y LLGXL divergen es en una región conocida a partir de la estructura de la otra lipasa hasta estar entre los dominios amino y carboxi de las proteínas. Por lo tanto, parece que la proteína LLGN consiste en sólo uno de los dos dominios de las triacilglicerol lipasas. Esta secuencia contiene la característica "GXSXG", motivo de la lipasa en las posiciones 167-171 al igual que la conservación de los residuos de la tríada catalítica en Ser 169, Asp 193, y His 274. La conservación de los residuos de cisteína (posiciones 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463, y 483) que han estado involucradas en la unión de disulfuro en las demás lipasas sugiere que la proteína LLGXL tiene similitudes estructurales con las demás enzimas. Existen 5 sitios previstos para la glicosilación unida a N; en las posiciones de los aminoácidos 80, 136, 393, 469, y 491. Las secuencias de la proteína utilizadas en las comparaciones son las lipoproteínas lipasa humanas (LPL; acceso a Genbank #M15856, SEQ ID NO: 13), la lipasa hepática humana (HL; acceso a Genbank #J03540, SEQ ID NO: 14), la lipasa pancreática humana (PL; acceso a Genbank # M93285, SEQ ID NO: 15), la proteína 1 asociada con la lipasa pancreática humana (PLRP-1; acceso a Genbank # M93283), y la proteína 2 asociada a la lipasa pancreática humana (PLRP-2; acceso a Genbank # M93284).

TABLA 1 Similitud de la familia del gen de la triagilglicerol lipasa

2

La similitud del porcentaje se basó en una alineación en forma de pares utilizando el algoritmo de Clustal (Camps, L., Reina, M., Llobera, M., Vilaro, S., y Olivecrona, T. (1990) Am. J. Physiol. 258,C673-C681) en el programa Megalign de la Lasergene Biocomputing Software Suite (Dnastar).

B) Ubicación de los Cromosomas

El ADN de un clon Pl (Sternberg, N., Ruether, J. y DeRiel, K. The New Biologist 2:151-62, 1990) que contiene el ADN del LLG genómico fue marcado con digoxigenina UTP por medio de la traducción del sobrenombre. La sonda marcada fue combinada con el ADN humano recortado y se hibridizó hasta los linfocitos de sangre periférica estimulada por PHA de un donante masculino en una solución que contenía formamida al 50%, dextran sulfato al 10% y 2X de SSC. Se detectaron señales específicas de hibridización al incubar las células hibridizadas en los anticuerpos de antidigoxigenina sometida a fluoresceinado seguido por contracoloración con DAPI. Este experimento inicial dio como resultado una rotulación específica de un cromosoma del grupo E, que se creyó que era el cromosoma 18 sobre la base del manchado DAPI.

Se realizó un segundo experimento en el cual una sonda rotulada con biotina específica para el centrómero del cromosoma 18 fue cohibridizada con la sonda de LLG. Este experimento dio como resultado la marcación específica del centrómero del cromosoma 18 en rojo y el brazo largo del cromosoma 18 en verde. Las mediciones de los 11 cromosomas 18 hibridizados específicamente rotulados demostraron que tiene un Filtro de 0.67 (medición Franke de 0.38), la cual corresponde a la banda 18q21. Se cree que las enfermedades genéticas severas, que incluyen la colestasis intrahepática, distrofia de los bastones de conos y bastones y la osteolisis expandible familiar, implican defectos en esta región de los cromosomas.

Ejemplo 3 Análisis del ARN del LLG A) Expresión del ARN del LLG en las células THP-1

El análisis del ARNm del cual fue derivado el ADNc fue realizado por el análisis Northern del ARN de THP-I. El ARN de estas células fue preparado de la manera que se ha descripto con anterioridad. El ARNm se purificó a partir del ARN total por medio del uso de un sistema de perla magnética de poliy-dT (Sistema Polyattract, Promega). Se sometieron a electroforesis 3 microgramos de poli ARNm con contenido de (A) sobre un gel de agarosa-formaldehído al 1%. El gel se lavó durante 30 minutos en dH_{2}O. Los ARN fueron transferidos en vacío a una membrana de nylon utilizando un buffer alcalino de transferencia (3M de NaCl, 8 mM de NaOH, 2 mM de sarcosil). Después de la transferencia, la mancha fue neutralizada por medio de incubación durante 5 minutos en 200 mM de solución buffer de fosfato a un pH 6.8. El ARN fue entrecruzado a la membrana utilizando un aparato de entrecruzamiento ultravioleta (Stratagene).

Se realizó una investigación eliminando la inserción de un plásmido que contenía el producto PCR de la reacción de 5'RACE que se ha descripto con anterioridad. La sonda fue radiomarcada utilizando la técnica de cebado randomizado que se ha descripto en el Ejemplo 2.

Se prehibridizaron los filtros en una solución rápida de hibridización QuikHyb (Stratagene) durante 30 minutos a 65ºC. La sonda radiomarcada (1-2 x 10^{6} cpm/ml) y el ADN de esperma de salmón sonicado (concentración final 100 \mug/ml) fueron desnaturalizados calentándolos a 95ºC durante 10 minutos y se sometieron a enfriado rápido sobre hielo antes de agregar al filtro en QuikHyb. La hibridización se realizó durante 3 horas a 65ºC. La sonda sin hibridizar se eliminó por medio del lavado de los filtros dos veces durante 15 minutos en sulfato dodecil sódico 2X SSC, 0.1% a temperatura ambiente seguido de dos veces durante 15 minutos en 0.1 X de SSC, 0.1% de SDS a 62ºC. A continuación de los lavados, se dejó que los filtros se secaran durante un tiempo corto y luego se expusieron a una película Kodak XAR-2 con pantallas intensificadoras a -80ºC. Los resultados se muestran en la Figura 7, la cual muestra una especie importante de ARNm de aproximadamente 4,5 kilobases. Las especies menores de 4,3 y 1,6 kilobases también están presentes. El tamaño esperado del ADNc del LLGN es de 1,6 kb. Es probable que la secuencia de LLGXL sea codificada por la especie principal del ARNm detectada.

B) Expresión del ARN del LLG en varios tejidos humanos.

Se obtuvo un filtro preparado comercialmente que contenía 3 \mug de los ARNm provenientes de tejidos humanos (corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas) de Clontech (Catálogo #7760-1). Este filtro se investigó y se describió con anterioridad. Después de investigar con el fragmento de LLG radiomarcado y con la autoradiografía, la sonda se retiró por medio de lavado en 0.1X SSC hirviendo, 0.1% SDS durante 2 x 15 minutos en un incubador a 65ºC. Luego las membranas fueron investigadas con un fragmento de ADN par de 1.4 kilobases que codifica a la lipoproteína lipasa humana. El fragmento se obtuvo por RT-PCR del ARN de THP-1 (tratado con PMA y oxLDL) utilizando los cebadores 5' LPL y 3'LPL que se han descripto en la figura 1 y las condiciones RT-PCR que se han descripto con anterioridad. Después de la auto-radiografía, las membranas fueron eliminadas nuevamente y se volvieron a investigar con un fragmento radiomarcado del ADNc de la actina beta humana hasta normalizar el contenido del ARN. Los resultados de estos análisis se muestran en la figura 8. Los niveles más altos del mensaje de LLG fueron detectados en el ARN de la placenta, y los niveles inferiores se detectaron en los ARN derivados de los tejidos del pulmón, del hígado y del riñón. De acuerdo con los estudios previos realizados por otros (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta .1211,121-124), el mensaje de la lipoproteína lipasa fue hallado en muchos tejidos, los niveles más altos se hallaron en el tejido del corazón y del músculo esquelético. Los resultados de este análisis indican que la distribución del tejido de la expresión de LLG es muy diferente a la de LPL. El modelo de la expresión de LLG también es diferente del de la lipasa hepática o bien la lipasa pancreática, tal como fue informado por otros (Wang, C.S.. y Hartsuck, J.A. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1166,1-19; Semenkovich, C.F., Chen. S.W., Wims, M., Luo C.C., Li, W.H., y Chan, L. (1989) J. Lipid Res. 30,423-431; Adams, M.D., Kerlavage, A.R., Fields, C., y Venter, C. (1993) Nature Genet. 4,256-265) .

Para determinar el modelo de expresión en los tejidos humanos adicionales, se investigó otra membrana preparada comercialmente con ADNc de LLGXL. Esta mancha (Human RNA Master Blot. Clontech Cat. # 7770-1) contiene 100-500 ng de ARNm proveniente de 50 tejidos diferentes y es normalizado para conservar la expresión genética equivalente (Chen, L., y Morin, R. (1971) Biochim. Biophys. Acta 231,194-197). Un fragmento Dral-Srfl de 1.6 kb del ADNc de LLGXL se rotuló con ^{32}PdCTP utilizando un sistema de cebado de oligonucleótidos randomizado (Prime It II, Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de una prehibridización de 30 minutos a 65ºC, la investigación se agregó a una solución de hibridización QuikHyb a 1.3 x 10^{6}. cpm/ml. La hibridización se realizó durante 2 horas a 65ºC. La sonda sin hibridizar fue eliminada mediante el lavado de los filtros dos veces durante 15 minutos con 2X SSC, sulfato dodecil sódico al 1% a temperatura ambiente seguido de dos veces durante 15 minutos en 0.1 X de SSC, 0.1% de SDS a 62ºC. A continuación de los lavados, los filtros se dejaron secar en forma breve y luego se expusieron a una película Kodak XAR-2 con pantallas intensificadoras a -80ºC, durante períodos de tiempo variantes. Las imágenes resultantes fueron cuantificadas por medio de densitometría. Los resultados se muestran en la tabla 2. Los niveles de expresión relativa de los tejidos representados tanto en la mancha del tejido múltiple Northern como en la mancha del tejido múltiple fueron similares, con los niveles más altos registrados en la placenta y los niveles más bajos registrados en el pulmón, el hígado y en el riñón. El hígado, el riñón y el pulmón fetal también expresan aproximadamente los mismos niveles que los tejidos de adultos. Es sorprendente que los niveles de expresión tisular de la tiroide fueron los más altos de todos los tejidos representados con la expresión del 122% en el tejido de la placenta. Aún cuando existe prioridad para la expresión de la lipasa por la placenta (Rothwel, J.E., Elphick. M.C. (1982) J. Dev. Physiol. 4,153-159; Verhoeven, A.J.M., Carling D., y Jansen H. (1994) J. Lipid Res. 35,966-975;. Burton, B.K., Mueller, H.W. (1980) Biochim. Biophys. Acta 618.449-460), con anterioridad no se sabía que la tiroide expresara ninguna lipasa. Estos resultados sugieren que la expresión de LLG puede estar involucrada en el mantenimiento de la placenta, donde LLG puede servir para liberar los ácidos grasos libres de los substratos tales como los fosfolípidos como una fuente de energía. El LLG expresado en la tiroide puede suministrar precursores para la síntesis de las moléculas bioactivas por parte de esa glándula.

TABLA 2 Expresión del ARNm del LLG en varios tejidos humanos

3

Valores dados como porcentajes de expresión con los niveles del tejido de placenta establecidos de manera arbitraria en 100%.

Los valores son el promedio de las mediciones densitométricas provenientes de dos exposiciones auto-radiográficas. N.D. = no detectable.

C) Expresión del ARN de LLG en las células de endotelio cultivadas.

Las células de endotelio de vena umbilical humana (HUVEC) y las células de endotelio de la arteria coronaria humana (HCAEC) se obtuvieron de Clonetics. Las HUVEC fueron propagadas en un medio de crecimiento de células endoteliales preparadas desde el punto de vista comercial (EGM, Clonetics) suplementadas con 3 mg/ml de extracto de cerebro bovino (Maciag, T., Cerundolo, J.. Ilsley, S., Kelley. P.R., y Forand, R. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5674-5678), Clonetics), mientras que las HCAEC fueron propagadas en EGM suplementado con 3 mg/ml de extracto de cerebro bovinoy 3% de suero bovino fetal (concentración final del 5%). Las células crecieron hasta la confluencia, luego el medio se cambió a EGM sin extracto de cerebro bovino. Los cultivos fueron estimulados por medio del agregado de 100 ng/ml de miristato de forbol (Sigma). Después de 24 horas de incubación, se extrajeron los ARN de las células por medio del método Trizol que ha sido descripto con anterioridad. Se sometieron a electroforesis veinte microgramos de ARN total y se transfirieron a la membrana para su análisis. Las membranas fueron sondeadas con las sondas LLG y LPL tal como se describió con anterioridad. Los resultados se muestran en la Figura 9. Se extendieron veinte microgramos del ARN total de las células THP-1 estimuladas con PMA sobre la mancha para su comparación. Se detectó el ARN que hibridiza a la sonda de LLG en las células HUVEC sin estimular y estimuladas con PMA. Por el contrario, los niveles detectables del ARNm de LLG sólo se encontraron en los cultivos de HCAEC después de la estimulación con PMA. De acuerdo con los estudios previos de otros, no se detectó ningún ARNm de la lipoproteína lipasa detectable en ninguno de los ARN del endotelio (Verhoeven, A.J.M., Jansen, H. (1994) Biochem. Biophys. Acta 1211,121-124).

Ejemplo 4 Análisis de la Proteína LLG A) Preparación del anticuerpo

Se generaron antisueros para los péptidos con secuencias correspondientes a una región de la proteína predecida codificada por el marco de lectura abierta del ADNc de LLG. Este péptido fue elegido en función de su alto índice de antigenicidad predecido (Jameson B.A., y Wolf, H. (1988) Comput. Applic. in the Biosciences 4,181-186). La secuencia del péptido de inmunización no se halló en ninguna proteína o secuencia de ADN traducida en la base de datos Genbank. Su posición correspondiente en la proteína LLG se muestra en la Figura 10. La cisteína carboxi terminal del péptido no corresponde al residuo de la proteína LLG putativa, sino que fue introducida para facilitar el acople con la proteína portadora. El péptido fue sintetizado en un sintetizador peptídico Applied Biosystems Model 433A. Dos miligramos de péptido fueron acoplados a dos miligramos de hemocianina de lapa keyhole limpet activada por maleimido después de los protocolos incluidos en el Kit Imject Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce Chemical). Después de desalinizar, una mitad del conjugado fue emulsionada con un volumen igual del adyuvante completo de Freund (Pierce). Esta emulsión fue inyectada en un conejo Blanco de Nueva Zelanda. Cuatro semanas después de la inoculación inicial, se realizó una estimulación de refuerzo con una emulsión realizada exactamente de la manera que se describió con anterioridad con excepción de la utilización del adyuvante incompleto de Freund (Pierce). Dos semanas después del refuerzo, se llevó a cabo un sangrado de prueba y los títulos de los anticuerpos específicos fueron determinados por medio de ELISA utilizando el péptido inmovilizado. Se realizó un refuerzo subsiguiente un mes después del primer refuerzo.

B) Análisis Western del medio de los cultivos de las células endoteliales

Las células HUVEC y HCEAC fueron cultivadas y estimuladas con PMA de la manera como se describió en el Ejemplo 3C, excepto que las células mencionadas fueron estimuladas con PMA durante 48 horas. Las muestras del medio acondicionado (9 ml) fueron incubadas con 500 \mul de un elemento acuoso al 50% de heparina-Sefarosa CL-6B en solución buffer de fosfato (PBS, 150 mM de cloruro de sodio, 100 mM de fosfato de sodio a un pH de 7.2). La heparina-Sefarosa fue elegida para purificar en forma parcial y concentrar las proteínas LLG debido a la conservación de los residuos de la secuencia de LLGXL que han sido identificados como críticos para la actividad de unión de la heparina de LPL (Ma, Y. Henderson, H.E., Liu, M.S., Zhang, H., Forsythe, I.J., Clarke-Lewis, I., Hayden. M.R., y Brunzell, J.D. J. Lipid Res. 35, 2049-2059; y Fig. 6.). Después de la rotación a 4ºC durante 1 hora, las muestras fueron centrifugadas durante 5 minutos a 150 x g. El medio fue aspirado y la Sefarosa fue lavada con 14 ml de PBS. Después del centrifugado y de la aspiración, los pellets de heparina-Sefarosa fueron suspendidos en 200 \mul de solución buffer de carga 2x SDS (4% de SDS, 20% de glicerol, 2% de \beta-mercaptoetanol, 0.002% de bromofenol azul y 120 mM de Tris a un pH de 6.8). Las muestras se calentaron hasta los 95ºC durante 5 minutos y 40 \mul se cargaron en un gel de Tris-Glicina SDS al 10%. Después de la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 90 minutos, las proteínas fueron transferidas a las membranas de nitrocelulosa por medio de un aparato de electromanchado Novex (210 V, 1 hora). Las membranas fueron bloqueadas durante 30 minutos en una solución buffer bloqueadora al 5% de leche en polvo sin grasas, Tween 20 al 0.1%, 150 mM de cloruro de sodio, 25 mM de Tris a un pH de 7.2). Los antisueros antipeptídicos y el suero normal de conejo se diluyeron a 1 : 5000 en una solución buffer bloqueadora y se incubaron con las membranas durante toda la noche a 4ºC con una agitación suave. Luego, las membranas se lavaron 4x 15 minutos con TBST (Tween 20 al 0.1%, 150 mM de cloruro de sodio, 25 mM de Tris a un pH de 7.2). Antisueros de cabra anti-conejo conjugados con peroxidasa (Boehringer Mannheim) se diluyó a 1 :5000 en una solución buffer bloqueadora y se incubó con la membrana durante 1 hora con agitación. Las membranas se lavaron como se indicó con anterioridad, se sometieron a reacción con un reactivo quimioluminiscente Renaissance (DuPont NEN) y se expusieron a la película Kodak XAR-2. Los resultados se muestran en la Figura 11. Dos especies de proteínas inmunorreactivas están presentes en las muestras de las células HUVEC y HCAEC sin estimulación. Los niveles de la proteína inmunorreactiva de las muestras HCAEC sin estimular son mucho más bajos que los que corresponden a la muestra de HUVEC. Bajo estimulación con PMA, tres proteínas inmunorreactivas son secretadas por medio de los cultivos de las células endoteliales. La exposición a PMA aumentó en gran medida el nivel de las proteínas de LLG producidas por los cultivos de las HCAEC. La inducción de PMA de las proteínas LLG no fue tan significativa en los cultivos de las HUVEC.

Ejemplo 5 Producción de la Proteína LLG Recombinante A) Constructos de la expresión de LLG

Los ADNc que codifican las proteínas LLGN y LLGXL se clonaron en el vector de expresión de mamíferos pCDNA3 ( Invitrogen). Este vector permite la expresión de los genes extraños en muchas células de mamíferos por medio del uso del último promotor principal del citomegalovirus. El producto LLGN 5'RACE fue clonado en el sitio EcoRI de pCDNA3. El ADNc de LLGXL fue digerido con Dral y SrfI para producir un ADNc de 1.55 kb (ver la Figura 4.). El vector fue digerido con la enzima de restricción EcoRV y el vector y la inserción fueron ligados utilizando la ligasa T4 del ADN y los reactivos del Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron productos de ligado para transformar el E. Coli competente. Las colonias resultantes fueron seleccionadas por medio del análisis de restricción y de secuencias para establecer la presencia y la orientación de la inserción en el vector de expresión.

B) Transfección transitoria de LLG en las células COS-7

Los vectores de expresión de LLG se introdujeron en las células COS-7 por medio del uso del reactivo catiónico-lipídico de lipofectamina (GIBCO). Veinticuatro horas antes de la transfección, las células COS-7 fueron extendidas en placas de cultivo tisular de 60 mm a una densidad de 2x10^{5} células / placa. Las células fueron propagadas en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; GIBCO) con un suplemento de suero de feto de ternero al 10%, 100U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina. Un microgramo de ADN de plásmido se agregó a 300 \mul de un medio Optimem I libre de suero (Gibco). Se diluyeron diez microlitros del reactivo Lipofectamina en 300 \mul de medio Optimem I y se combinó con solución de ADN y se dejó asentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. El medio fue eliminado de las placas y las células fueron enjuagadas con 2 ml de medio Optimem. La solución de ADN -Lipofectamina se agregó a las placas junto con 2.7 ml del medio Optimem y las placas fueron incubadas durante 5 horas a 37ºC. Después de la incubación, el medio libre de suero se eliminó y fue reemplazado con DMEM con un suplemento de FBS al 2% y antibióticos. Doce horas después de la transfección, algunos de los cultivos fueron tratados ya sea con 0.25 mM de Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), un inhibidor de proteasa o bien 10 U/ml de heparina. Treinta minutos antes de su recolección, las muestras tratadas con heparina fueron tratadas con un adicional de 40 U/ml de heparina. El medio fue eliminado de las células 60 horas después de la transfección. Se agregó Heparina-Sefarosa CL-4B (200 \mul de un elemento acuoso al 50% en PBS a un pH de 7.2) a 1 ml del medio y se mezcló a 4ºC durante 1 hora. La Sefarosa se transformó en pellets por medio de centrifugado de baja velocidad y se lavó tres veces con 1 ml de PBS frío. La sefarosa se transformó en pellets y se suspendió en 100 \mul de solución buffer de carga 2x. Las muestras se calentaron a 95ºC durante 5 minutos. Se cargaron 40 \mul de cada muestra sobre un gel SDS-PAGE al 10%. La electroforesis y el análisis Western se realizaron utilizando el antisuero anti-LLG tal como se describió con anterioridad. Los resultados correspondientes se muestran en la Figura 12. Las proteínas del medio acondicionado de HCAEC se incluyeron a título de referencia de los tamaños. LLGN migra a aproximadamente 40 kD que corresponde a la banda más baja de HCAEC. El medio de COS, las células transfectadas con ADNc de LLGXL ADNc contienen tanto las especies 68 kD como 40 kD. Cuando estas células fueron tratadas con heparina, tanto la cantidad de las proteínas de 68 kD como de 40 kD recuperadas del medio aumentaron de manera significativa, lo cual indica ya sea la liberación de la proteína unida a los proteoglicanos de la superficie celular o de la estabilización de las proteínas por parte de la heparina. Cuando las células fueron tratadas con el inhibidor de proteasa Pefabloc, la cantidad de proteína de 68 kD aumentó con relación a la de la especie de 40 kD. Esto sugiere que la proteína de menor peso molecular producida por estas células es un producto de proteolisis de la forma más amplia 68 kD. El papel del ARNm identificado por medio de la representación diferencial que codifica a una especia más corta de 40 kD no es conocida. No obstante ello, ha habido un informe de una forma de lipasa hepática en forma de ensamble alternativo que aparentemente se expresa de una manera específica en el tejido y que crearía una proteína
truncada.

Ejemplo 6 LLG en las Especies Animales A) Clonación del Homólogo de LLG de Conejo

Una librería de ADNc lambda disponible comercialmente derivada del tejido pulmonar de conejo (Clontech, Cat. #TL1010b) se utilizó para aislar un fragmento del homólogo de conejo del gen de LLG. Se agregaron cinco microlitros de la librería de stock a 45 \mul de agua y se calentaron a 95ºC durante 10 minutos. Se agregó lo siguiente en un volumen final de 100 \mul: 200 \muM de dNTPs, 20 mM de Tris-HCl a un pH de 8.4, 50 mM de KCl. 1.5 mM de MgCl_{2}, 100 \muM cada cebador DLIP774 y LLGgen2a, y 2.5 U de Taq polimerasa (GIBCO). La reacción fue termociclada 35 veces con los parámetros de: 15 segundos a 94ºC, 20 segundos a 50ºC y 30 segundos a 72ºC. Diez microlitros de la reacción se analizaron por medio de electroforesis por gel de agarosa. Se detectó un producto de aproximadamente 300 pares de bases. Se utilizó una porción de (4 \mul) la mezcla de reacción para clonar el producto por medio del sistema de clonación TA. Se formaron las secuencias de la inserción del clon resultante (SEQ ID NO: 11). Una alineación entre la secuencia de aminoácidos de conejo deducida (SEQ ID NO: 12) y la secuencia correspondiente del ADNc humano también se muestra en la Figura 14. De los nucleótidos que no forman parte de ninguno de los cebadores de amplificación, hay una identidad del 85.8% entre las secuencias de LLG del conejo y las humanas. La proteína predecida codificada por este ADNc de conejo comparte una identidad del 94.6% con la de la proteína humana, con la mayoría de las substituciones de nucleótidos en la tercera posición o en la posición "tambaleante" de los codones. Cabe destacar que esta región se extiende sobre la secuencia "tapa" de las proteínas LLG predecidas y es un dominio variable de la familia genética de la lipasa. Es evidente que existe un alto grado de conservación de este gen entre las
especies.

B) LLG en Otras Especies

Para demostrar la presencia de los genes LLG en otras especies, los ADN genómicos provenientes de varias especies fueron digeridos con restricción con EcoRI, separados por electroforesis en geles de agarosa y manchados sobre las membranas de nitrocelulosa.

Las membranas fueron hibridizadas durante toda la noche a 65ºC con 2.5 x 10^{6} de cpm/ml de una sonda con ^{32}P-LLG o :^{32}P-LPL cebados en forma randomizada (lipoproteína lipasa) en una solución de hibridización de 6X de SSC, sulfato de dextrano al 10%, solución de Dendardt 5 X, SDS al 1% y 5 \mug/ml de ADN de esperma de salmón. Las membranas fueron lavadas con 0.1 X de SSC, SDS al 0.5% durante diez minutos a temperatura ambiente, luego en forma secuencial durante diez minutos a 40ºC, 50ºC y 55ºC. Los autoradiogramas de las manchas se muestran en la Figura 16.

La Figura 16 muestra la presencia de los genes de LLG y LPL con todas las especies examinadas excepto que no se observó ninguna hibridización con la sonda de LLG contra el ADN de rata. Los datos excepcionales de ratas pueden representar una sustancia artificial provocada por la generación de fragmentos de restricción de un tamaño anormal que contengan las secuencias LLG. Tales fragmentos pueden estar fuera del rango de fraccionamiento del gel de agarosa o pueden colorearse de manera ineficiente. Las diferentes bandas detectadas por medio de dos sondas indican que LPL y LLG son genes separados conservados en forma evolutiva.

Ejemplo 7 Actividad enzimática de LLGXL Actividad de la Fosfolipasa

El medio acondicionado de las células COS-7 que expresan de manera transitoria la lipoproteína lipasa (LPL), LLGN, o LLGXL fue sometido a ensayo para determinar la actividad de la fosfolipasa. Se utilizó MEM con un contenido del 10% de FBS (MEM) como el blanco y los medios condicionados de las células COS-7 transfectadas con un plásmido LLGXL antisentido (AS) se utilizaron como un control negativo.

Se elaboró una emulsión de fosfatidilcolina (PC) utilizando 10 \mul de fosfatidilcolina (10 mM), 40 \mul de ^{14}C-fosfatidilcolina, dipalmitoilo (2 \muCi), marcado en las posiciones sn 1 y 2 y 100 \mul de Tris-TCNB [100 mM de Tris, 1% de Triton, 5 mM de CaCl_{2}, 200 mM de NaCl, 0.1% de BSA). La emulsión se evaporó durante 10 minutos, luego se llevó a un volumen final de 1 ml en Tris-TCNB.

Las reacciones se realizaron por duplicado y contuvieron 50 \mul de emulsión PC y 950 \mul del medio. Las muestras se incubaron en un baño de agua agitada durante 2-4 horas a 37ºC. Las reacciones se terminaron mediante la adición de 1 ml 1N de HCl, luego se extrajeron con 4 ml de 2-propanol : hexano (1:1). La capa superior de hexano de 1.8 ml se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice y los ácidos libres de ^{14}C liberados contenidos en la fracción de flujo fueron cuantificados en un contador de centelleos. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 14.

B) Actividad de la Triacil glicerol Lipasa

Los medios acondicionados de las células COS- 7 que expresan de manera transitoria la lipoproteína lipasa (LPL), LLGN. o LLGXL fueron sometidos a ensayo para determinar la actividad de la triacerol lipasa. Se utilizó MEM con un contenido de 10% de FBS como el blanco y los medios acondicionados de las células COS-7 transfectadas con un plásmido LLGXL antisentido (AS) se utilizaron como un control negativo.

Se preparó un substrato concentrado como una emulsión anhidro de trioleína rotulada, [9.10- ^{3}H(N)] y trioleína no rotulada (trioleína total final = 150 mg con 6.25 x de 10^{8} cpm), la cual fue estabilizada agregando 9 mg de lecitina en 100% de glicerol, 0.56 ml de ^{3}H-trioleína, (0.28 mCi) se mezclaron con 0.17 ml de trioleína sin rotular y 90 \mul de lecitina (9 mg). La mezcla se evaporó bajo una corriente de nitrógeno. La mezcla seca de lípidos fue emulsionada en 2.5 ml de glicerol al 100% g por sonicación (nivel 2 de pulsos de 30 segundos seguidos de ciclos de enfriado de 2 segundos durante 5 minutos].

El substrato de ensayo se preparó por medio de la dilución de 1 volumen del substrato concentrado con 4 volúmenes de 0.2M de solución buffer Tris-HCl (pH 8.0) con un contenido del 3% p/v de albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos. El substrato diluido fue agitado en vortex en forma vigorosa durante 5 segundos.

Las reacciones fueron realizadas por duplicado en un volumen total de 0.2 ml con un contenido de 0.1 ml den substrato de ensayo y 0.1 ml de los medios acondicionados indicados. Las reacciones fueron incubadas durante 90 minutos a 37ºC. Las reacciones terminaron por medio de la adición de 3.25 ml de metanol-cloroformheptano 1.41: 1.25: 1 (v/v/v) seguido por 1.05 ml de 0.1M solución buffer de potasio carbonato-borato (pH 10.5). Después de mezclar en forma vigorosa durante 15 segundos, las muestras fueron centrifugada durante 5 minutos a 1000 rpm. Una alícuota de 1.0 ml de la fase superior acuosa se contó en un contador de centelleos. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 15.

Ejemplo 8 Uso del polipéptido LLG para seleccionar Los agonistas y los antagonistas

El LLG recombinante se produjo en las células infectadas con baculovirus. El LLG recombinante es purificado a partir del medio que contiene suero o del medio acondicionado libre de suero por medio de cromatografía sobre heparina - Sefarosa, seguido de cromatografía sobre una resina de intercambio de cationes. Un tercer paso cromatográfico tal como el tamiz molecular se utiliza en la purificación LLG en caso de ser necesario. En el transcurso de la purificación, los anticuerpos antipeptídicos se utilizan para monitorear la proteína LLG y se utiliza el ensayo de fosfolipasa para seguir la actividad de LLG.

En el ensayo fluorescente, las condiciones finales del ensayo son aproximadamente 10 mM de Tris-HCl (pH 7.4). 100 mM de KCl, 2 mM de CaCl_{2}, 5 \muM de C_{6}BD-PC (1-acil-2-[6-(nitro-2.1,3-benzoxadiazol4-il)amino} caproilfosfatidilcolina y la proteína LLG (approximadamente 1-100 ng). La reacción está sujeta a excitación por fluorescencia a 470 nm, y la actividad enzimática, según la medición realizada por medio de la emisión de fluorescencia a 540 nm es monitoreada en forma continua. Los compuestos y / o las substancias que se deben someter a prueba para la estimulación y / o la inhibición de la actividad de LLG se agregan como 10-200 mM de soluciones en dimetilsulfóxido. Los compuestos que estimulan o inhiben la actividad de LLG se identifican como los causantes de una emisión de fluorescencia aumentada o reducida a 540 nm.

En el ensayo tio, las condiciones finales del ensayo son de aproximadamente 25 mM de Tris-HCl (pH 8.5), 100 mM de KCl, 10 mM de CaCl_{2}, 4.24 rmM de Triton X-100, 0.5 mM de 1.2-bis(hexanoiltio)-1,2 dideoxi-sn-glicero-3-fosforilcolirio, 5 mM de 4,4'-ditiobispiridina (de una solución de stock de 50 mM en etanol), y 1.100 ng de LLG recombinante. La actividad de la fosfolipasa se determina por medio de la medición del aumento de la absorción a 342 nm. Los compuestos y/o las substancias que se deben someter a prueba para la estimulación y/o la inhibición de la actividad de LLG se agregan como 10-200 mM de soluciones en dimetilsulfóxido. Los compuestos que estimulan o inhiben la actividad de LLG se identifican como los causantes de una absorción mayor o menor a 342 nm.

Ejemplo 9 Ratón transgénico que expresa LLG humano

Para estudiar luego la función fisiológica de LLG, se generaron ratones transgénicos que expresan el LLG humano.

El fragmento de restricción 1.53 kb DraI/SrfI que codifica LLGXL (ver la Figura 4) fue clonado en un vector plasmídico (pHMG) corriente abajo del promotor para el gen reductasa de la coenzima A (HMG CoA) 3hidroxi-3-metilglutaril expresado en forma oblícua. Se generaron ratones transgénicos que expresan diferentes niveles de LLGXL humano utilizando métodos estándar (ver, por ejemplo G.L.Tromp et al. Gene 1565:199-205, 1995). Los ratones transgénicos son utilizados para determinar el impacto de la sobreexpresión de LLG.XL sobre el perfil de lípidos, la patología vascular, la velocidad de desarrollo y la gravedad de la aterosclerosis y otros parámetros fisiológicos.

Ejemplo 10 Expresión de LLG en los tejidos ateroscleroticos

Se examinó la expresión de LLGXL en la aterosclerosis realizando una reacción en cadena de transcripcionplimerasa inversa (RT-PCR) utilizando ARNm aislado de las biopsias vasculares de cuatro pacientes con aterosclerosis. Las muestras de tejido eran de la pared aórtica (una muestra), la arteria ilíaca (dos muestras), y la arteria carótida (una muestra).

Se recibieron las biopsias de aterosclerosis del Gloucestershire Royal Hospital, Inglaterra y se preparó el ARNm polyA+ y se volvió a suspender en dietilprocarbonato (DEPC) tratado con agua a una concentración de 0.5 \mug/\mul de ARNm. Se realizaron reacciones de transcriptasa inversa de acuerdo con el protocolo GibcoBRL para el Sistema de preamplificación Superscript para la Síntesis de la Primera Línea del ADNc. En síntesis, el ADNc fue sintetizado de la manera siguiente: 2 \mul de cada ARNm se agregó a 1 \mul de cebador de oligo (dT)_{12-18} y 9 \mul de agua DEPC. Los tubos fueron incubados a 70ºC durante 10 minutos y se colocaron sobre hielo durante 1 minuto. Se agregaron los siguientes componentes a cada uno de los tubos: 2 \mul de 10X de solución buffer PCR, 2 \mul de 25 mM MgCl_{2}, 1 \mul de 10 mM de mezcla dNTP y 2 \mul de 0.1M DTT. Después de 5 minutos a 42ºC, se agregó 1 \mul (200 unidades) de Super Script II transcriptasa inversa. Las reacciones se mezclaron con suavidad, luego se incubaron a 42ºC durante 50 minutos. Las reacciones terminaron por incubación a 70ºC durante 15 minutos y luego se colocaron sobre hielo. El ARNm restante se destruyó por medio del agregado de 1 \mul de RNasa H a cada tubo y se incubó durante 20 minutos a 37ºC.

Las amplificaciones PCR se realizaron utilizando 2 \mul de las reacciones del ADNc. A cada tubo se agregó lo siguiente: 5 \mul de solución buffer 10X PCR, 5 \mul de 2 mM dNTPs, 1 \mul del cebador hllg-gspl (20 pmol/ml, ver la Figura 1), 1 \mul del cebador hllg-gsp2a (20 pmol/ml, ver La Figura 1), 1.5 \mul de 50 mM MgCl_{2}, 0.5 \mul de Taq polimerasa (5U/ml) y 34 \mul de agua. Después de sostener las reacciones a 95ºC durante 2 minutos, se realizaron treinta ciclos de PCR de la manera siguiente: 15 segundos a 94ºC, 20 segundos a 52ºC, y 30 segundos 72ºC. Las reacciones terminadas se sostuvieron durante 10 minutos a 72ºC antes del análisis por electroforesis por gel de agarosa. Los cebadores hllg-gsp son específicos para LLG y producen un producto esperado de 300 bp. En un PCR paralelo para mostrar que las reacciones de síntesis del ADNc han sido exitosas, se utilizaron los cebadores específicos para el gen gobernante, G3PDH (gliceraldehído 3 fosfato dehidrogenasa humana) (cada uno 1 \mul a 20 pmol/ml).

Los cebadores G3PDH (ver la Figura 1) produjeron el producto esperado de 983 bp en las cuatro muestras de biopsia vascular. La expresión de LLG se detectó en tres de las cuatro muestras, sin detectarse ninguna expresión en la muestra de la arteria carótida.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

Solicitante: Jaye, Michael C.

\hskip3,1cm Doan, Kim-Anh T.

\hskip3,1cm Krawiec, John A.

\hskip3,1cm Lynch, Kevin J.

\hskip3,1cm Amin, Dilip V.

\hskip3,1cm South, Victoria J.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDOS LLG DE LA FAMILIA DE LA TRIACILGLICEROL LIPASA Y COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA SU USO EN LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA Y LAS TERAPIAS PROTEÍCAS Y GENÉTICAS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

CANTIDAD DE SECUENCIAS: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Domicilio: Rhone-Boulenc Rorer Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Calle: 500 Arcola Rd. 3C43

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Ciudad: Collegeville

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Estado: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

Pais: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

Código: 19426

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR COMPUTADORA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Tipo Medio: Diskette

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Computadora: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Releasse #1.0, Versión # 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Número de Solicitud: US

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Fecha de Registro:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Clasificación

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre: Fehlner Ph.D., Paul F.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Número de Registro: 35,135

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Referencia/Número de Caso : A2582-WO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Teléfono: (610)454-3839

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Fax: (610) 454-3808

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 367 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/Clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Ubicación: 22..180

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 53 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:

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\vskip1.000000\baselineskip

5

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\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1382 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Ubicación: 312...1370

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:

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\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 353 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1382 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Ubicación: 1..1065

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID Nº 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 355 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:

\vskip0.500000\baselineskip

1. Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

2. Ubicación: 1..1065

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID Nº 5

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13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 2565 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Ubicación: 252 1754

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7

15

16

17

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 501 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

100

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Longitud: 1035 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

Hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

1. Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

2. Ubicación: 1..1035

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID Nº 9

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 345 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 225 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.500000\baselineskip

1. Nombre/clave: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

2. Ubicación: 1..225

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID Nº 11

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 75 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

27

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 472 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 499 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 14

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 465 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Hebra:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: poteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xii)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

32

33

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Pro Gu Gly Arg Leu Glu Asp Lys Leu His Lys Pro Lys Ala Thr}

\sac{Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTTTTTTT TGA

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATCAATCGC

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGGACATGC ACAGTGTAAT CTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTGTGCTG GCCACTTCTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACACTCCAG GGACTGAAG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modificada_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 36

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modificada_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /modbase= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modificada_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 41

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modificada_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACÓN: 42

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modificada_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 46

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: modificada_base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 47

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /mod_base= i

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGG NNGGGNNG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACACACAGG CCACGCGTCG ACTAGTAC

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 24:

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCACCATGG AGAGCAAAGC CCTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGTTTCAG CCTGACTTCT TATTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTGTGGAC TCAACGATGT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGTGGGT AGGTACATTT TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGTGACT TCCAGCCAGG CTGTG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTCTGAAA GGCATGCCTG CCCGG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGGTCGG AGTCAACGGA TTTGGT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Oligonucleótido"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 31:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGTGGGCC ATGAGGTCCA CCAC

\hfill

24

Claims (35)

1. Un polipéptido aislado codificado por un gen similar a la lipasa, donde el polipéptido

(a) se une a la heparina,

(b) tiene homología con la lipoproteína lipasa humana y la lipasa hepática y

(c) comprende un dominio catalítico de 39 kD de la familia de la triacilglicerol lipasa.

y donde

i) el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ 10 NO: 8 y un peso molecular aparente de alrededor de 55kD sobre un gel 10% SDS-PAGE, una secuencia de aminoácido de SEQ 10 NO: 8 y un peso molecular aparente de alrededor de 68 kD sobre un gel 10% SDS-PAGE, o una secuencia de aminoácido de SEa ID NO: 6 y un peso molecular aparente de alrededor de 40kD sobre un gel 10% SDS-PAGE; o

ii) el dominio catalítico 39 kD comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 10; o

iii) el polipéptido aislado es de origen de conejo y comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ 10 NO: 12.

2. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8 y un peso molecular aparente de alrededor de 55kD sobre un gel 10% SDS-PAGE, una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 8 y un peso molecular aparente de alrededor de 68kD sobre un gel 10% SDS-PAGE o una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 6 y un peso molecular aparente de alrededor de 40kD sobre un gel de 10% SDS-PAGE.

3. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, donde el dominio catalítico 39 kD comprende la secuencia de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO: 10.

4. El polipéptido aislado de la reivindicación 1, que es de origen de conejo y comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12.

5. El polipéptido aislado de cualquier reivindicación anterior, donde el polipéptido tiene la actividad de la fosfolipasa A.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de cualquier reivindicación anterior.

7. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, que es el ADNc.

8. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 7, donde la secuencia de nucleótidos se selecciona a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 5, 7 y 9.

9. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 8 que comprende los nucleótidos 252-1754 de la SEQ ID NO: 7.

10. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 6, que codifica el polipéptido de la reivindicación 4.

11. El ácido nucleico de la reivindicación 10 que tiene una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 11.

12. Un ácido nucleico aislado que se hibridiza bajo las condiciones de 0.1X SSC, 0.5% SDS a 68ºC hasta un blanco seleccionado a partir del grupo que consiste en los nucleótidos de 44-79 de la SEQ ID NO: 3 y de los nucleótidos de 1036-1065 de la SEQ 10 NO: 5.

13. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de cualquiera de las reivindicaciones 6-12 unidas operativamente a una región regulatoria.

14. El vector de la reivindicación 13 donde la región regulatoria proviene de una fuente heteróloga.

15. El vector de la reivindicación 13 o 14, que es un vector virtual.

16. El vector de la reivindicación 15, que es un vector adenoviral.

17. Una célula huésped recombinante que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 13-16.

18. La célula huésped recombinante de la reivindicación 17 donde la célula es una célula eucariótica.

19. La célula huésped recombinante de la reivindicación 18 donde la célula es una célula COS-7.

20. Un método para preparar un polipéptido que comprende el cultivo de la célula recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17-19 bajo las condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

21. Un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

22. Un anticuerpo de la reivindicación 21, que es capaz de neutralizar la actividad de la fosfolipasa del polipéptido.

23. El anticuerpo de la reivindicación 21 o de la reivindicación 22, que es un anticuerpo monoclonal.

24. El anticuerpo de la reivindicación 22, que es un anticuerpo policlonal.

25. Una célula de hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 23.

26. Una composición que comprende

a) El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5; o

b) el vector de cualquiera de las reivindicaciones 13-16; o

c) el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 21-24;

y un portador farmacéuticamente aceptable.

27. La composición de la reivindicación 26 que comprende el polipéptido y un portador farmacéuticamente aceptable.

28. La composición de la reivindicación 26, que comprende el vector y un portador farmacéuticamente aceptable.

29. La composición de la reivindicación 26, que comprende el anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable.

30. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 26-29, donde el portador farmacéuticamente aceptable es una solución biológicamente compatible.

31. Un método para seleccionar agonistas o antagonistas de la actividad de un polipéptido codificado por un gen similar a la lipasa (LLG) que comprende:

contactar a los agonistas o antagonistas potenciales con el polipéptido y un substrato del polipéptido y

(b) medir la capacidad de los agonistas o los antagonistas potenciales para mejorar o inhibir la actividad del polipéptido, donde el polipéptido es el polipéptido de la reivindicación 2.

32. Un método para la hidrólisis enzimática in vitro de un éster de fosfatidilcolina que comprende el hecho de contactar al mencionado éster de fosfatidilcolina con el polipéptido de las reivindicaciones 2 ó 3.

33. Uso de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en la elaboración de un medicamento para mejorar el perfil de lípidos en suero de un humano u otro animal que tenga un perfil de lípidos no deseado.

34. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 21-24 en la elaboración de un medicamento para mejorar el perfil de lípidos en suero de un humano o de otro animal que tenga un perfil de lípidos no deseado.

35. Un ratón transgénico que expresa el polipéptido de la reivindicación 2 ó 3.