DE69732789T2

DE69732789T2 - Von humanem lipase-ähnlichem gen kodierte polypeptide, sowie zusammensetzungen und methoden

Info

Publication number: DE69732789T2
Application number: DE69732789T
Authority: DE
Inventors: C. Michael JAYE; Thi Kim-Anh DOAN; A. John KRAWIEC; J. Kevin LYNCH; V. Dilip AMIN; J. Victoria SOUTH
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2017-12-06
Also published as: AU5690598A; NO992735D0; SK287687B6; EA003293B1; ATE291080T1; HK1068636A1; JP2010284171A; EP0948609B1; KR100516561B1; WO1998024888A3; US20030108538A1; CZ299055B6; HK1024929A1; CA2273823A1; CN1240000A; KR20000069336A; IL129986A0; AP1313A; US20070101451A1; SK75399A3

Description

SACHGEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Polypeptide der Triacylglycerol-Lipase-Familie, auf Nukleinsäuren, die für die besagten Polypeptide kodieren, auf Antisense-Sequenzen, die sich von den besagten Nukleinsäuren ableiten und auf Antikörper gegen die besagten Polypeptide. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Herstellung der besagten Polypeptide unter Anwendung von Rekombinationstechniken sowie auf die Verwendung der besagten Polypeptide für das Screening nach Agonisten und/oder Antagonisten der besagten Polypeptide. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide wie auch der Nukleinsäuresequenzen, die für solche Polypeptide kodieren, in pharmazeutischen Zusammensetzungen, einschließlich gentherapeutischen Zusammensetzungen, zur Behandlung von Störungen des Lipid- und Lipoproteinstoffwechsels.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
A) Lipide
Lipide sind wasserunlösliche organische Biomoleküle, die wesentlichen Anteil an verschiedene biologischen Funktionen haben, hierunter die Energiespeicherung, der Energietransport und der Energiestoffwechsel sowie die Struktur und Fluidität von Membranen. Lipide leiten sich beim Menschen und bei Tieren von zwei Quellen ab: einige Lipide werden als Lebensmittelfette und -öle aufgenommen, andere Lipide werden vom Menschen beziehungsweise Tier biosynthetisiert. Bei Säugern besteht der Körper zu mindestens 10 Gewichts-% aus Lipiden, wobei der größte Teil dieser Lipide in Form von Triacylglycerolen vorliegt.
Triacylglycerole, auch bekannt als Triglyceride und Triacylglyceride, bestehen aus drei mit Glycerol veresterten Fettsäuremolekülen. Über Nahrungsmittel aufgenommene Triacylglycerole werden als Engergiequelle in Fettgeweben gespeichert oder im Magen-Darm-Trakt durch Triacylglycerol-Lipasen, deren wichtigste die Pankreas-Lipase ist, hydrolysiert. Der Transport der Triacylglycerole zwischen verschiedenen Geweben erfolgt in Form von Lipoproteinen.
Lipoproteine sind Micellen-ähnliche Zusammenschlüsse, die in Plasma gefunden werden und die unterschiedliche Anteile verschiedener Arten von Lipiden und Proteinen (sogenannte Apoproteine) enthalten. Es gibt fünf Hauptklassen von Plasma-Lipoproteinen, deren Hauptfunktion der Lipidtransport ist. Diese Klassen sind – in der Reihenfolge steigender Dichte – Chylomikrone, Lipoproteine mit sehr geringem spezifischem Gewicht (VLDL), Lipoproteine mit mittlerem spezifischem Gewicht (IDL), Lipoproteine mit niedrigem spezifischem Gewicht (LDL) und Lipoproteine mit hohem spezifischem Gewicht (HDL). Obwohl in Verbindung mit jeder Klasse von Lipoproteinen viele Arten von Lipiden gefunden werden, transportiert jede Klasse doch in der Hauptsache nur einen Lipid-Typ: die oben beschriebenen Triacylglycerole werden in Chylomikronen, VLDL und IDL transportiert, während Phospholipide in HDL und Cholesterolester in LDL transportiert werden.
Phospholipide sind Di-Fettsäureester des Glycerolphosphats, die auch eine an das Phosphat gebundene polare Gruppe aufweisen. Phospholipide sind wichtige Strukturkomponenten von Zellmembranen. Phospholipide werden durch als Phospholipasen bezeichnete Enzyme hydrolysiert. Phosphatidylcholin, ein beispielhaftes Phospholipid, ist ein Hauptbestandteil der meisten eukaryotischen Zellmembranen.
Cholesterol ist der metabolische Vorläufer von Steroidhormonen und Gallensäuren sowie ein wesentlicher Bestandteil von Zellmembranen. Beim Menschen wie auch bei Tieren wird Cholesterol zum einen über die Nahrung aufgenommen und zum anderen in der Leber sowie anderen Geweben synthetisiert. Der Transport von Cholesterol zwischen den verschiedenen Geweben erfolgt in Form von Cholesterolestern in LDLs und anderen Lipoproteinen.
Membranen umgeben jede lebende Zelle und dienen als Barriere zwischen den intrazellulären und den extrazellulären Bereichen. Membranen umschließen auch den eukaryotischen Zellkern, bilden das Endoplasmatische Retikulum und erfüllen spezialisierte Funktionen, wie in der Myelinscheide, die Axone umgibt. Eine typische Membran weist einen Lipidgehalt von ungefähr 40% und einen Proteingehalt von ungefähr 60% auf, jedoch besteht hier eine beträchtliche Schwankungsbreite. Die wichtigsten Lipid-Komponenten sind Phospholipide, insbesondere Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin, sowie Cholesterol. Die physikochemischen Eigenschaften von Membranen, wie die Fluidität, können durch Änderung entweder der Fettsäureprofile der Phospholipide oder des Cholesterolgehalts verändert werden. Durch Modulation der Zusammensetzung und Organisation von Membranlipiden werden auch die membranabhängigen zellulären Funktionen, wie die Rezeptoraktivität, die Endozytose und der Cholesterolfluss, verändert.
B) Enzyme
Die Triacylglycerol-Lipasen stellen eine Familie von Enzymen dar, die im Körper verschiedene zentrale Rollen im Lipidstoffwechsel einnehmen. Drei Mitglieder der Familie der humanen Triacylglycerol-Lipasen sind beschrieben worden: die Pankreas-Lipase, die Lipoprotein-Lipase und die hepatische Lipase (Goldberg, I. J., Le, N. -A., Ginsberg, H. N., Krauss, R. M. und Lindgren, F. T., J. Clin. Invest. 81(1988): 561–568; Goldberg, I. J., Le, N., Paterniti, J. R, Ginsberg, H. N., Lindgren, F. T. und Brown, W. V., J. Clin. Invest. 70(1982): 1184–1192; Hide, W. A., Chan, L. und Li, W. -H., J. Lipid Res. 33(1992): 167–178). Die Pankreas-Lipase ist in erster Linie verantwortlich für die Hydrolyse von Nahrungsmittel-Lipiden. Varianten der Pankreas-Lipase sind ebenfalls beschrieben worden, ihre physiologische Bedeutung wurde allerdings nicht aufgeklärt (Giller, T., Buchwald, P., Blum-Kaelin, D. und Hunziker, W., J. Biol. Chem. 267(1992): 16509–16516). Die Lipoprotein-Lipase ist das für die Verteilung und Verwertung von Triglyceriden im Körper hauptverantwortliche Enzym. Die Lipoprotein-Lipase hydrolysiert Triglyceride sowohl in Chylomikronen als auch in VLDL. Die hepatische Lipase hydrolysiert Triglyceride in IDL und HDL und ist verantwortlich für die Lipoprotein-Umgestaltung. Die hepatische Lipase fungiert auch als Phospholipase und hydrolysiert Phospholipide in HDL.
Phospholipasen spielen wichtige Rollen im Katabolismus und bei der Umgestaltung des Phospholipid-Anteils von Lipoproteinen sowie der Phospholipide von Membranen. Des Weiteren spielen Phospholipasen eine Rolle bei der Freisetzung von Arachidonsäure und der darauf folgenden Bildung von Prostaglandinen, Leukotrienen und anderen Lipiden, die an einer Vielzahl von entzündlichen Prozessen beteiligt sind.
Die Lipase-Polypeptide, für die die Gene dieser Lipasen kodieren, weisen eine Länge von ungefähr 450 Aminosäuren und Leader-Signalpeptide zur Begünstigung der Sekretion auf. Die Lipase-Proteine umfassen zwei Haupt-Domänen (Winkler, K., D'Arcy, A, und Hunziker, W., Nature 343(1990): 771–774). Die Amino-terminale Domäne enthält die katalytische Site, während von der Carboxyl-Domäne angenommen wird, dass sie verantwortlich ist für die Substrat-Bindung, die Cofaktor-Assoziation und die Wechselwirkung mit Zellrezeptoren (Wong, H., Davis, R. C., Nikazy, J., Seebart, K. E. und Schotz, M. C., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88(1991): 11290–11294; van Tilbeurgh, H., Roussel, A., Lalouel, J. -M. und Cambillau, C., J. Biol. Chem. 269(1994): 4626–4633; Wong, H., Davis, R. C., Thuren, T., Goers, J. W., Nikazy, J., Waite, M. und Schotz, M. C., J. Biod. Chem. 269(1994): 10319–10323; Chappell, D. A., Inoue, I., Fry, G. L., Pladet, M. W., Bowen, S. L., Iverius, P. -H., Lalouel, J. -M. und Strickland, D. K., J. Biol. Chem. 269(1994): 18001–18006). Das Gesamtmaß der Aminosäure-Homologie zwischen den Mitgliedern der Familie der Phospholipasen liegt bei 22 bis 65%, wobei lokale Regionen mit hoher Homologie strukturellen Homologien entsprechen, die mit der enzymatischen Funktion verbunden sind.
Das natürlich vorkommende Lipoprotein-Lipase-Protein ist glykosyliert, und diese Glykosylierung ist notwendig für die enzymatische Aktivität der LPL (Semenkovich, C. F., Luo, C. -C., Nakanishi, M. K., Chen, S. -H., Smith, L. C. und Chan, L., J. Biol. Chem. 265(1990): 5429–5433). Die hepatische Lipase und die Lipoprotein-Lipase weisen jeweils zwei und die Pankreas-Lipase weist eine Site für N-gebundene Glykosylierung auf. Darüber hinaus bilden vier Cystein-Sätze Disulfidbrücken, die für den Erhalt der struktwellen Integrität in Bezug auf die enzymatische Aktivität notwendig sind (Lo, J. -Y., Smith, L. C. und Chan, L., Biochem. Biophys. Res Commun. 206(1995): 266–271; Brady, L., Brzozowski, A. M., Derewenda, Z. S., Dodson, E., Dodson, G., Tolley, S., Turkenburg, J. P., Christiansen, L., Huge-Jensen, B., Norskov, L., Thim, L. und Menge, U., Nature 343(1990): 767–770).
Die Mitglieder der Familie der Triacylglycerol-Lipasen weisen eine Reihe von gemeinsamen Strukturmerkmalen auf. Eines dieser Merkmale ist das "GXSXG"-Moriv, in dem der zentrale Serinrest einer der drei Reste ist, die die "katalytische Triade" umfassen (Winkler, K., D'Arcy, A. und Hunziker, W., Nature 343(1990): 771–774; Faustinella, F., Smith, L. C. und Chan, L., Biochemistry 31(1992): 7219–7223). Konservierte Aspartat- und Histidinreste gewährleisten das Gleichgewicht der katalytischen Triade. Eine kurze Spanne von 19 bis 23 Aminosäuren (die "Lid-Region") bildet eine amphipathische Helixstruktur und bedeckt die katalytische Tasche des Enzyms (Winkler, K., D'Arcy, A. und Hunziker, W., Nature 343(1990): 771–774). Diese Region unterscheidet sich bei den verschiedenen Mitgliedern der Familie und es wurde kürzlich festgestellt, dass diese Spanne den Enzymen eine Substratspezifität verleiht (Dugi, K. A., Dichek, H. L. und Santamarina-Fojo, S., J. Biod. Chem. 270 (1995): 25396–25401). Vergleiche zwischen der hepatischen Lipase und der Lipoprotein-Lipase haben gezeigt, dass Unterschiede in der Triacylglycerol-Lipase-Aktivität und der Phospholipase-Aktivität der Enzyme teilweise durch diese Lid-Region vermittelt werden (Dugi, K. A., Dichek, H. L. und Santamarina Fojo, S., J. Biol. Chem. 270(1995): 25396–25401).
Die Heparin-Bindungs-Aktivität der Triacylglycerol-Lipasen ist in umerschiedlichem Maße ausgeprägt. Die Lipoprotein-Lipase besitzt die höchste Affinität zu Heparin, wobei diese Bindungsaktivität Abschnitten der Amino-terminalen Domäne, welche positiv geladene Reste aufweisen, zugeordnet worden ist (Ma, Y., Henderson, H. E., Liu, M. -S., Zhang, H., Forsythe, I. J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M. R. und Brunzel (J. D., J. Lipid Res 35: 2049–2059). Die Lokalisation der Lipoprotein-Lipase an der Endothel-Oberfläche (Cheng, C. F., Oosta, G. M., Bensadoun, A. und Rosenberg, R. D., J. Biol. Chem. 256(1981): 12893–12896) beruht in erster Linie auf der Anbindung an Oberflächen-Proteoglykane (Shimada, K., Gil, P. J., Silbert, J. E., Douglas, W. H. J. und Fanburg, B. L., J. Clin. Invest. 68(1981): 995–1002; Saxena, U., Klein, M. G. und Goldberg, I. J., J. Biol. Chem. 266(1991): 17516–17521; Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T, und Vlodavsky, I., J Clip. Invest. 90(1992): 2013–2021). Diese Bindungsaktivität ist der Faktor, der es dem Enzym ermöglicht, die LDL-Auf rahme zu beschleunigen, indem es als Brücke zwischen LDL und der Zelloberfläche fungiert (Mulder, M., Lombardi, P., Jansen, H., vanBerkel, T. J., Frants, R. R. und Havekes, L. M., Biochem. Biophys. Res. Commun. 185(1992): 582–587; Rutledge, J. C. und Goldberg, I. J., J. Lipid Res. 35(1994): 1152–1160; Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, T., Kobayashi, Y., Konno, T. und Tada, K., Int. J. Cancer 26(1984): 171–176).
Sowohl von der Lipoprotein-Lipase als auch von der hepatischen Lipase ist bekannt, dass sie in Verbindung mit Coaktivator-Proteinen fungieren: bei diesen Coaktivator-Proteinen handelt es sich im Falte der Lipoprotein-Lipase um das Apotipoprotein CII und im Falle der Pankreas-Lipase um die Colipase.
Die genetischen Seguenzen, die fur die humane Pankreas-Lipase, die humane hepatische Lipase und die humane Lipoprotein-Lipase kodieren, sind veröffentlicht worden (Genbank-Accession-Nr. M93285, -Nr. 703540 und Nr. M15856). Die Messenger-RNAs der humanen hepatischen Lipase und der humanen Pankreas-Lipase weisen eine Länge von ungefähr 1,7 Kilobasen beziehungsweise ungefähr 1,8 Kilobasen auf. Das humane Lipoprotein-Lipase-Gen erzeugt zwei mRNA Transkripte von 3,6 beziehungsweise 3,2 Kilobasen. Diese beiden Transkripte nutzen alternierende Polyadenylierungs-Signale und unterscheiden sich in ihrer Translationseffizienz (Ranganathan, G., Ong, J. M., Yukht, A, Saghizadeh, M., Simsolo, R. B., Pauer, A. und Kern, P. A., J. Biol. Chem. 270(1995): 7149–7155).
C) Physiotogische Prozesse
Der Lipidstoffwechsel ist verbunden mit der Wechselwirkung von Lipiden, Apoproteinen, Lipoproteinen und Enzymen.
Die hepatische Lipase und die Lipoprotein-Lipase sind multifunktionelle Proteine, die die Bindung, die Aufnahme, den Katabolismus und die Umgestaltung von Lipoproteinen und Phospholipiden vermitteln. Die Funktion der Lipoprotein Lipase und der hepatischen Lipase ist gekoppelt an deren Anbindung an die luminale Oberfläche von Endothelzellen in peripheren Geweben beziehungsweise in der Leber. Beide Enzyme sind am Reversen Cholesteroltransport, der Verlagerung des Cholesterols von peripheren Geweben in die Leber zum Zweck der Ausscheidung aus dem Körper oder des Recyclings, beteiligt. Es ist bekannt, dass Gendefekte sowohl der hepatischen Lipase als auch der Lipoprotein Lipase Ursache familiär gehäufter Störungen des Lipoprotein-Stoffwechsels sind. Ein fehlerhafter Lipoprotein-Stoffwechsel führt zu ernsten Stoffwechselstörungen, einschließlich der Hypercholesterolämie, der Hyperlipidämie und der Arteriosklerose.
Die Arteriosklerose ist eine komplexe, polygene Erkrankung, die sich in histologischen Begriffen durch Ablagerungen von Lipiden (Lipid- oder Fibrolipid- Plaques) oder anderen Blutderivaten in den Blutgefäßwänden, insbesondere in den großen Anerien (Aorta, Koronararterien, Arteria Carotis), auszeichnet. Diese Plaques, die je nach Grad des Fortschreitens des arteriosklerotischen Prozesses mehr oder weniger verkalkt sind, können an Läsionen gekoppelt sein und sind verbunden mit der Akkumulation von Fettablagerungen, die im Wesentlichen aus Cholesterolestern bestehen, in den Gefäßen. Diese Plaques gehen einher mit einer Verdickung der Gefäßwand, einer Hypertrophie des glatten Muskels, dem Auftreten von Schaumzellen (Lipid-beladene Zellen, die aus der unkontrollierten Aufnahme von Cholesterol durch rekrutierte Makrophagen resultieren) und der Akkumulation von fibrösem Gewebe. Die atheromatöse Plaque ragt deutlich aus der Wand hervor und verleiht dieser einen stenotischen Charakter, der verantwortlich ist für vaskuläre Verschlüsse durch Atherome, Thrombosen oder Embolien, die bei den am stärksten betroffenen Patienten auftreten. Diese Läsionen können zu schwerwiegenden kardiovaskulären Krankheitsbildern, wie Infarkt, plötzlichem Herztod, Herzinsuffizienz und Schlaganfall, führen.
Die Rolle der Triacylglycerol-Lipasen bei vaskulären Erkrankungen wie der Arteriosklerose war Gegenstand intensiver Studien (besprochen in Olivecrona, G. und Olivecrona, T., Curr. Opin. Lipid 6(1995): 291–305). Es wird angenommen, dass die Wirkung der Triacylglycerol-Lipasen im Allgemeinen antiatherogener Art ist, weil diese Enzyme die Serum-Triacylglycerol-Spiegel erniedrigen und die HDL-Bildung unterstützen. Transgene Tiere, die humane Lipoprotein-Lipase oder humane hepatische Lipase exprimieren, weisen erniedrigte Plasma-Triglyceridspiegel und einen erhöhten Spiegel an Lipoprotein mit hohem spezifischem Gewicht (HDL) auf (Shimada, M., Shimano, H., Gotoda, T., Yamamoto K., Kawamura, M., Inaba, T., Yazaki, T. und Yamada, N., J. Biol. Chem. 268(1993): 17924–17929; Liu, M. -S., Jirik, F. R, LeBoeuf R. C., Henderson, H., Castellani, L. W., Lusis, A. J., Ma, Y., Forsythe, I. J., Zhang, H., Kirk, E., Brunzell, J. D. und Hayden, M. R., J. Biol. Chem. 269(1994): 11417–11424). Man hat herausgefunden, dass bei Menschen mit Gendefekten, die zu einer Verringerung der Lipoprotein-Lipase-Aktivität führen, zwar eine Hypertriglyceridämie, dabei jedoch kein erhöhtes Risiko koronarer Herzerkrankungen vorliegt. Es wurde berichtet, dass dies auf der mangelnden Produktion von atherogenen Lipoproteinen mittlerer Größe, die im subendothelialen Raum akkumulieren könnten, beruht (Zilversmit, D. B., Circ. Res. 33(1973): 633–638).
Es wird allerdings angenommen, dass im begrenzten Gebiet einer arteriosklerotischen Läsion die erhöhte Lipase-Aktivität den atherogenen Prozess beschleunigt (Zilversmit, D. B., Clin Chem. 41(1995): 153–158; Zambon, A., Tones, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P. J., Hayden, M. R. und Brunzell, J. D., Lancet 341(1993): 1119–1121). Dies könnte auf einer durch Lipasen vermittelten Erhöhung der Bindung und Aufnahme von Lipoproteinen durch das vaskuläre Gewebe beruhen (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T., Vlodavsky, I., J. Clin. Invest. 90 (1992): 2013–2021; Tabas, I., Li, I., Brocia, R. W., Xu, S. W., Swenson, T. L. und Williams, K. J., J. Biol. Chem. 268(1993): 20419–20432; Nordestgaard, B. G. und Nielsen, A. G., Curr. Opin. Lipid 5(1994): 252–257; Williams, K. J. und Tabas, I., Art. Thromb. and Yasc. Biol. 15(1995): 551–561). Des Weiteren kann eine lokale Erhöhung der Lipase-Aktivität dazu führen, dass in Vorstufen arteriosklerotischer Läsionen zytotoxische Fettsäure- und Lysophosphatidylcholinspiegel erzeugt werden.
Wenngleich sich in Bezug auf die Rolle der Lipase-Aktivität bei der Lipid-Homeostase ein gewisses Verständnis herausgebildet hat, besteht auf dem Fachgebiet nichtsdestotrotz die Notwendigkeit der Identifizierung weiterer Gene, die für Proteine kodieren, welche den Lipidstoffwechsel regulieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung eines Lipaseähnlichen Gens (LLG), auf die Polypeptid-Produkte, die dieses exprimiert und auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Anwendung der besagten Polypeptid-Produkte. Das LLG-Polypeptid bindet Heparin, weist eine Homologie zur humanen Lipoprotein-Lipase sowie zur humanen hepatischen Lipase auf und enthält eine 39 kD katalytische Domäne der Triacylglycerol-Lipase-Familie. In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist das Polypeptid eine Phosphplipase-A-Aktivität auf.
Diese Erfindung stellt ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, das die Sequenz der SEQ ID NO. 10 aufweist.
Diese Erfindung stellt des Weiteren ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, das die Sequenz der SEQ ID NO. 8 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 55 kD oder 68 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufweist.
Diese Erfindung stellt auch ein isoliertes Polypeptid zur Verfügung, das die Sequenz der SEQ ID NO. 6 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 40 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufweist.
Die Erfindung stellt ferner ein antigenes Fragment des LLG-Polypeptids zur Verfügung.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, welches die oben genannte Sequenz aufweist.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Vektor, der die oben genannte Nukleinsäure, welche für das besagte Polypeptid kodiert, enthält, wobei diese Nukleinsäure operativ mit einer regulatorischen Region, wie einem Promotor, verknüpft ist.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist eine rekombinante Zelle, die den oben beschriebenen Vektor enthält.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wobei dieses Verfahren dann besteht, rekombinante Zellen, welche die besagte für das Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthalten, unter Bedingungen zu züchten, die die Expression des besagten Polypeptids erlauben.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Antikörper, der befähigt ist, an die erfindungsgemäßen Polypeptide spezifisch anzubinden und/oder deren biologische Aktivität aufzuheben. In der Tat besteht ein weiteres Merkmal eines Polypeptids der Erfindung darin, dass dieses spezifisch an einen Antikörper der Erfindung, z. B. einen für ein LLG-Polypeptid spezifischen Antikörper, anbindet.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid, eine Nukleinsäure, einen Vektor, eine Antisense-Nukleinsäure oder einen Antikörper gemäß der Erfindung sowie einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthält.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zum Screening nach Agonisten oder Antagonisten der enzymatischen Aktivität, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung aufweisen, wobei dieses Verfahren das In-Kontakt-Bringen der potentiellen Agonisten beziehungsweise Antagonisten mit den besagten Polypeptiden und einem Substrat dieser Polypeptide sowie die Bestimmung der Fähigkeit der potentiellen Agonisten beziehungsweise Antagonisten, die besagte Aktivität zu erhöhen beziehungsweise zu inhibieren, umfasst.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse eines Phosphatidylcholinesters, das dann besteht, den besagten Phosphatidylcholinester mit einem Polypeptid gemäß der Erfindung in Kontakt zu bringen.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in den Zeichnungen und in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausgestaltungen der Erfindung näher erläutert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt die Sequenzen der Primer, die in den beispielhaft aufgeführten PCR Amplifikationen verwendet wurden (SEQ ID NOs. 17–31).
2 zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) des Differential Display-RT-PCR-Produkts, das die cDNA des Lipase-ähnlichen Gens enthält. Die den beiden in der Amplifikation verwendeten Primern entsprechenden Sequenzen sind unterstrichen. Das Stop-Kodon und das Polyadenylierungssignal sind eingerahmt. Die GAATTC-Motive und der flankierende Sequenzbereich stammen von dem pCRII-Vektor, in den das Produkt kloniert wurde.
3 zeigt die Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO. 3) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 4) des 5'-RACE-Extensionsprodukts der LLG-cDNA. Die den beiden in der Amplifikation verwendeten Primern entsprechenden Sequenzen sind unterstrichen. Die GAATTC-Motive und der flankierende Sequenzbereich stammen von dem pCRII-Vektor, in den das Produkt kloniert wurde.
4 zeigt die Seguenz (SEQ ID NO. 7) der cDNA, die das vollständige offene Leseraster des Lipase-ähnlichen Gens LLGXL enthält. Das Start-Kodon (ATG) und das Stop-Kodon (TGA) sind eingerahmt. Die für die Konstruktion des Expressionsvektors verwendete DraI-Site (TTTAAA) und SrfI-Site (GCCCGGGC) sind unterstrichen.
5 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 8) des LLGXL-Proteins. Die vorhergesagte Signalsequenz ist unterstrichen.
6 zeigt ein Proteinsequenz-Alignment der Mitglieder der Triacylglycerol-Lipase-Genfamilie (SEQ m NOs. 13–15). Die dunkel hinterlegten Reste sind identisch zum LLGXL-Protein (SEQ ID NO. 8). Um maximale Alignment-Werte zu erhalten, wurden mit Hilfe des Programms CLUSTAL Lücken in die Sequenzen eingefügt.
7 zeigt eine Northern-Analyse der LLG-mRNA in THP-1-Zellen. Die Zellen wurden entweder mit PMA oder mit PMA und oxidiertem LDL (PMA + oxLDL) stimuliert. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Positionen der RNA-Standards (in Kilobasen) an.
8 zeigt eine Northern-Analyse von mRNAs aus verschiedenen humanen Geweben, die mit LLG-, Lipoprotein-Lipase-(LPL-) oder humaner Beta-Actin-cDNA als Sonde markiert waren. Die Position eines 4,4-Kilobasen-RNA-Standards ist links von den LLG- sowie den LPL-Spuren angegeben.
9 zeigt eine Northern-Analyse der LLG- und LPL-Expression in kultivierten humanen Endothelzellen und THP-1-Zellen. Es handelte sich hierbei entweder um unstimulierte Zellen (nicht mit PMA behandelt) oder um PMA-stimulierte Zellen.
10 zeigt die Sequenz des immunisierenden Peptids (SEQ ID NO. 16) und dessen Beziehung zur LLGX–Proteinsequenz. Das Peptid ist in dem dunkel hinterlegten Feld aufgeführt. Das terminale Cystein wurde eingeführt, um die Kopplung des Peptids an das Trägerprotein zu erleichtern.
11 zeigt eine Western-Analyse von mittels Heparin Sepharose konzentrierten Proteinen aus konditionierten Medien von kultivierten Endothelzellen. Der Blot wurde mit anti-LLG-Antiserum als Sonde markiert. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Positionen der Protein-Standards in Kilodaltons an.
12 zeigt eine Western-Analyse von Heparin-Sepharose-gebundenen Proteinen in konditioniertem Medium von COS-7-Zellen, welche transient mit einem Expressionsvektor transfiziert waren, der entweder eine cDNA für LLGN oder LLGXL oder aber keine DNA enthielt (Mock). Zum Größenvergleich wurden Proteine aus PMA stimulierten Endothelzellen (HCAEC + PMA) mit aufgenommen. Die Zahlen auf der linken Seite geben das apparente Molekulargewicht der wichtigsten immunoreaktiven Proteine wie durch Vergleich mit Proteinstandards bestimmt an.
13 zeigt die Sequenz des LLG-PCR-Produkts des Kaninchens (RLLG-SEQ, SEQ ID NO. 11) und das Alignment der Sequenz des LLG-PCR Produkts des Kaninchens und der entsprechenden Sequenz in der humanen cDNA (LLG7742A). Identische Nukleotide sind dunkel hinterlegt.
14 zeigt die Phospholipase A-Aktivität von humanem LPL, LLGN und LLGXL unter Verwendung eines Phophatidylcholin-Substrats.
15 zeigt die Triacylglycerid-Lipase-Aktivität von humanem LPL, LLGN und LLGXL unter Verwendung eines Triolein-Substrats.
16 zeigt die Hybridisierung von LLG- und LPL-Sonden mit genomischen DNAs aus verschiedenen Spezies.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung eines Lipaseähnlichen Gens (LLG) und auf dessen exprimierte Polypeptid-Produkte. Die Polypeptid-Produkte, Mitglieder der Triacylglycerol-Lipase-Familie, enthalten eine katalytische Domäne der Triacylglycerol-Lipase-Familie von ungefähr 39 kD, z. B. die Domäne mit der Sequenz der SEQ ID NO. 10. Eine Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung betrifft das LLGN-Polypeptid, das 354 Aminosäuren aufweist. Eine zweite Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung betrifft das LLGXL–Polypeptid, das 500 Aminosäuren und eine 43%ige Übereinstimmung mit der humanen Lipoprotein-Lipase sowie eine 37%ige Übereinstimmung mit der humanen hepatischen Lipase aufweist. Das LLGXL-Polypeptid weist eine Phospholipase A-Aktivität auf.
Die Erfinder isolierten eine partielle cDNA aus der mRNA von THP-1-Zellen, die mit Phorbolester und oxidierten LDLs behandelt worden waren. Im Anschluss an eine 5'-RACE-Extension dieser partielien cDNA wurde die kleinere, alternativ gesplicete cDNA isoliert. Eine zweite, größere cDNA wurde aus einer humanen Plazema-cDNA-Bank isoliert.
Durch Northern-Analyse wurde gezeigt, dass das LLG-Gen in Endothelzellen exprimiert wird. Antiseren, die gegen ein aus dem offenen Leseraster der cDNA vorhergesagtes Peptid eingesetzt wurden, detektierten Proteine der vorhergesagten Größen sowohl im Falle von LLGN als auch von LLGXL in konditioniertem Medium aus kultivierten Endothelzellen. Die Behandlung von Endothelzellen mit Phorbolestern führte zu einer verstärkten Produktion von LLG sowohl auf mRNA als auch auf Protein-Ebene. Dies ist das erste Mitglied der Triacylglycerol-Lipase-Familie, von dem herausgefunden wurde, dass es von Endothelzellen exprimiert wird.
A) Definitionen
Die folgenden definierten Begriffe werden in der gesamten vorliegenden Beschreibung verwendet und dienen dem Verständnis des Schutzbereichs und der Praxis der vorliegenden Erfindung.
Ein "Polypeptid" ist eine polymere Verbindung, die aus kovalent gebundenen Aminosäureresten besteht. Aminosäuren weisen die folgende allgemeine Struktur auf:
Aminosäuren werden auf der Basis der Seitenkette R in sieben Gruppen eingeteilt: (1) aliphatische Seitenketten, (2) Seitenketten, die eine Hydroxygruppe (OH) aufweisen, (3) Seitenketten, die Schwefelatome aufweisen, (4) Seitenketten, die eine Säure- oder Amidgruppe aufweisen, (5) Seitenketten, die eine basische Gruppe aufweisen, (6) Seitenketten, die einen aromatischen Ring aufweisen und (7) Prolin, eine Iminosäure, in der die Seitenkette mit der Aminogruppe fusioniert ist.
Ein "Protein" ist ein Polypeptid, das in einer lebenden Zelle eine strukturelle oder funktionelle Rolle spielt.
Die Polypeptide und Proteine der Erfindung können glykosyliert oder unglykosyliert sein.
"Homologie" bedeutet Ähnlichkeit der Sequenz, was einen gemeinsamen evolutionären Ursprung anzeigt. Polypeptide beziehungsweise Proteine werden als homolog oder ähnlich bezeichnet, wenn eine beträchtliche Anzahl ihrer Aminosäuren entweder (1) identisch ist oder (2) eine chemisch ähnliche Seitenkette R aufweist. Nukleinsäuren werden als homolog bezeichnet, wenn eine beträchtliche Anzahl ihrer Nukleotide identisch ist.
Ein "isoliertes Polypeptid" oder "isoliertes Protein" ist ein Polypeptid beziehungsweise Protein, das im Wesentlichen frei ist von den Verbindungen, mit denen es in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist (dies sind z. B. andere Proteine oder Polypeptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und Lipide). "Isoliert" ist nicht zu verstehen als ein Begriff, der künstliche oder synthetische Gemische mit anderen Verbindungen oder die Gegenwart von Verunreinigungen, die nicht mit der biologischen Aktivität wechselwirken und die beispielsweise auf Grund von unvollständiger Reinigung, Zugabe von Stabilisatoren oder Verarbeitung in einer pharmazeutisch unbedenklichen Zubereitung vorhanden sein können, ausschließt.
Ein Molekül ist "antigen", wenn es befähigt ist, spezifisch mit einem Antigen-Erkennungsmolekül des Immunsystems, wie einem Immunglobulin (Antikörper) oder einem T-Zell-Antigenrezeptor zu wechselwirken. Ein antigenes Polypeptid enthält mindestens ungefähr 5 und vorzugsweise mindestens ungefähr 10 Aminosäuren. Ein antigener Teil eines Moleküls kann der Teil sein, der für die Antikörper- oder T-Zell-Rezeptor-Erkennung immunodominant ist, oder er kann ein Teil sein, der im Hinblick auf eine Immunisierung zur Erzeugung eines Antikörpers gegen das besagte Molekül genutzt wird, indem dieser antigene Teil mit einem Trägermolekül konjugiert wird. Ein antigenes Molekül muss nicht notwendigerweise selbst immunogen sein, d. h. es muss nicht befähigt sein, ohne einen Träger eine Immunantwort zu hervorzurufen.
"LLGN-Polypeptid" und "LLGN-Protein" stehen für ein Polypeptid, das die Sequenz der SEQ ID NO. 6 aufweist, wobei dieses Polypeptid glykosyliert oder unglykosyliert sein kann.
"LLGXL-Polypeptid" und "LLGXL-Protein" stehen für ein Polypeptid, das die Sequenz der SEQ ID NO. 8 aufweist, wobei dieses Polypeptid glykosyliert oder unglykosyliert sein kann.
"LLG-Polypeptid" beschreibt allgemein sowohl das LLGN- als auch das LLGXL-Polypeptid.
LLG-Polypeptid beziehungsweise LLG-Protein der Erfindung schließt alle von einem LLG-Polypeptid abgeleiteten Analoga, Fragmente, Derivate und Mutanten ein, in denen zumindest eine biologische Eigenschaft des LLG-Polypeptids erhalten ist. In der Natur kommen verschiedene Varianten des LLG-Polypeptids vor. Diese Varianten können allele Variationen sein, die sich durch Unterschiede in den Nukleotidsequenzen des für das Protein kodierenden Strukturgens auszeichnen, oder sie können auf unterschiedlichen Splicings oder post-translatorischen Modifikationen beruhen. Der geschulte Fachmann kann Varianten erzeugen, die einzelne oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen oder -ersetzungen aufweisen. Diese Varianten können unter anderem umfassen: (a) Varianten, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste durch konservative oder nicht-konservative Aminosäuren ersetzt sind, (b) Varianten, in denen dem LLG-Polypeptid eine oder mehrere Aminosäuren hinzugefügt sind, (c) Varianten, in denen eine oder mehrere der Aminosäuren eine Substituentengruppe aufweisen und (d) Varianten, in in denen das LLG-Polypeptid mit einem anderen Polypeptid, wie Serum-Albumin, gekoppelt ist. Zu den weiteren LLG-Polypeptiden der Erfindung zählen Varianten, in denen Aminosäurereste einer Spezies entweder in derselben oder einer anderen Position durch den entsprechenden Rest einer anderen Spezies ersetzt sind. in einer weiteren Ausgestaltung sind Aminosäurereste in veränderten Positionen durch konservative oder nichtkonservative Reste ersetzt. Die Techniken zur Erzeugung dieser Varianten, zu denen gentechnische Verfahren (Suppressionen, Deletionen, Mutationen usw.) sowie chemische und enzymatische Verfahren gehören, sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Führen solche allelen Variationen, Analoga, Fragmente, Derivate, Mutanten und Modifikationen, einschließlich der durch alternatives mRNA-Splicing gebildeten Formen und alternativer post-translatorischer Modifikationsformen, zu Derivaten des LLG-Polypeptids, in dem beliebige biologische Eigenschaften des LLG-Polypeptids erhalten sind, so liegen diese innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
Eine "Nukleinsäure" ist eine polymere Verbindung, die aus kovalent miteinander verbundenen Untereinheiten, den so genannten Nukleotiden, besteht. Zu den Nukleinsäuren gehören die Polyribonukleinsäure (RNA) und die Polydesoxyribonukleinsäure (DNA), die jeweils als Einzel- oder als Doppelstrang vorliegen können. Der Begriff DNA schließt cDNA, genomische DNA, synthetische DNA und semisynthetische DNA ein. Die Nukleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, wird als Sense-Sequenz bezeichnet.
Eine "Antisense-Nukteinsäure" ist eine Nukleotidsequenz, die zu der Sense-Sequenz komplementär ist. Antisense-Nukleinsäuren können verwendet werden, um die Expression des Polypeptids, für welches der Sense-Strang kodiert, herunterzuregulieren oder zu blockieren.
Der Begriff "isolierte Nukleinsäure" bezeichnet eine Nukleinsäure, die im Wesentlichen frei ist von den Verbindungen, mit denen sie in ihrem natürlichen Zustand assoziiert ist. "Isoliert" ist nicht zu verstehen als ein Begriff, der künstliche oder synthetische Gemische mit anderen Verbindungen oder die Gegenwart von Verunreinigungen, die nicht mit der biologischen Aktivität wechselwirken und die beispielsweise auf Grund unvollständiger Reinigung, Zugabe von Stabilisatoren oder Verarbeitung in einer pharmazeutisch unbedenklichen Zubereitung vorhanden sein können, ausschließt.
Der Ausdruck "eine Nukleinsäure, die unter hoher Stringenz hybridisiert" bedeutet, dass die hybridisierten Nukleinsäuren befähigt sind, einem Waschvorgang unter Bedingungen hoher Stringenz standzuhalten. Ein Beispiel für Bedingungen eines Waschvorgangs für DNA-DNA-Hybride unter hoher Stringenz ist 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C. Andere Bedingungen für einen Waschvorgang unter hoher Stringenz sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Der Begriff "Regulatorische Region" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die die Expression einer Nukleinsäure reguliert. Eine regulatorische Region kann Sequenzen enthalten, die natürlicherweise für die Expression einer bestimmten Nukleinsäure (einer homologen Region) verantwortlich sind oder sie kann Sequenzen anderen Ursprungs enthalten (die verantwortlich sind für die Expression anderer Proteine oder sogar synthetischer Proteine). Im Einzelnen kann es sich bei diesen Sequenzen um Sequenzen eukaryotischer oder viraler Gene oder um abgeleitete Sequenzen handeln, die die Transkription eines Gens in spezifischer oder nichtspezifischer Weise und in induzierbarer oder nicht-induzierbarer Weise stimulieren oder unterdrücken. Zu den Regulatorischen Regionen zählen Replikationsstartpunkte, RNA-Splicing-Sites, Enhancer, Transkriptions-Stop-Sequenzen, Signalsequenzen, die das Polypeptid in die Sekretionswege der Zielzelle einschleusen, und Promotoren.
Eine regulatorische Region aus einer "heterologen Quelle" ist eine regulatorische Region, die im natürlichen Zustand nicht mit der exprimierten Nukleinsäure assoziiert ist. Zu den heterologen regulatorischen Regionen gehören regulatorische Regionen aus einer anderen Spezies, regulatorische Regionen aus einem anderen Gen, regulatorische Hybrid-Sequenzen und regulatorische Sequenzen, die nicht in der Natur vorkommen, sondern die von einem Fachmann mit allgemeinem Wissenstand entworfen wurden.
Unter einem "Vektor" ist ein beliebiges Mittel zur Übertragung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine Wirtszelle zu verstehen. Der Begriff "Vektor" schließt sowohl virale als auch nicht-virale Mittel zur Einführung der Nukleinsäure in eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle in vitro, ex vivo oder in vivo ein. Zu den nicht-viralen Vektoren gehören Plasmide, Liposomen, elektrisch geladene Lipide (Cytofektine), DNA-Protein-Komplexe und Biopolymere. Zu den viralen Vektoren gehören retrovirale Vektoren, Adeno-assoziierte virale Vektoren, Pockenvirus-, Baculovirus-, Vaccinia-Virus-, Herpes Simplex-Virus- und Epstein-Barr-Virus-Vektoren sowie adenovirale Vektoren. Neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann ein Vektor auch eine oder mehrere regulatorische Regionen und/oder auswählbare Marker, die von Nutzen sind für die Auswahl, Bestimmung und Überwachung der Ergebnisse des Nukleinsäuretransfers (Übertragung in welche Gewebe, Dauer der Expression usw.), enthalten.
Eine "rekombinante Zelle" ist eine Zelle, die eine Nukleinsäure enthält, welche im natürlichen Zustand nicht in der Zelle vorkommt. Zu den "rekombinanten Zellen" gehören höhere eukaryotische Zellen, wie Mammazellen, niedrigere eukaryotische Zellen, wie Hefezellen, prokaryotische Zellen und archaebakterielle Zellen.
"Pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe" schließen Verdünnungsmittel und Füllstoffe ein, die für den betreffenden Verabreichungsweg pharmazeutisch unbedenklich sind, die steril sind und die wässerige oder fettige Suspensionen sein können, welche unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Wasserrückhaltemittel formuliert werden. Der betreffende pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffund das Verhältnis zwischen aktiver Verbindung und Trägerstoff sind abhängig von der Löslichkeit und den chemischen Eigenschaften der Zusammensetzung, dem jeweiligen Verabreichungsweg und den pharmazeutischen Standardverfahren.
Eine "Lipase" ist ein Protein, das ein Lipid-Substrat enzymatisch spalten kann. Eine "Phospholipase" ist ein Protein, das ein Phospholipid-Substrat enzymatisch spalten kann.
Eine "Triacylglycerol-Lipase" ist ein Protein, das ein Triacylglycerid-Substrat enzymatisch spalten kann.
"Phosphatidylcholin" ist ein Glycerol-Phospholipid, das die folgende Struktur aufweist:
wobei R und R' die Kohlenwasserstoff Seitenketten von Fettsäuren sind. Phosphatidylcholin ist auch als Lecithin bekannt.
Der Begriff "Lipidprofil" steht für einen Satz von Konzentrationen, nämlich die Konzentrationen von Cholesterol, Triglyceriden, Lipoprotein-Cholesterol und anderen Lipiden, im Körper eines Menschen oder eines Tieres.
Ein "nicht wünschenswertes Lipidprofil" beschreibt einen Zustand, in dem die Konzentrationen von Cholesterol, Triglyceriden oder Lipoprotein-Cholesterol außerhalb der alters- und geschlechtsangepassten Referenzbereiche liegen. Im Allgemeinen wird eine Gesamt-Cholesterol-Konzentration > 200 mg/dl, eine Plasma-Triglycerid-Konzentration > 200 mg/dl, eine LDL-Cholesterol-Konzentration > 130 mg/dl, eine HDL-Cholesterol-Konzentration < 39 mg/dl oder ein Verhältnis Gesamtcholesterol/HDL-Cholesterol > 4,0 als nicht wünschenswertes Lipidprofil eingestuft. Ein nicht wünschenswertes Lipidprofil ist verbunden mit einer Vielzahl pathologischer Zustände, einschließlich der Hyperlipidämie, des Hypercholesterolämie-Diabetes, der Arteriosklerose und anderer Erkrankungsformen der Koronararterien.
B) Polypeptide
Die vorliegende Erfindung stellt Polypeptide zur Verfügung, die Mitglieder der Triacylglycerol-Lipase-Familie sind und die eine 39 kD katalytische Domäne der Triacylglycerol-Lipase-Familie enthalten, welche beispielsweise die Sequenz der SEQ ID NO. 10 aufweist. Eine Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes LLG-Polypeptid, das die Sequenz der SEQ ID NO. 6 enthält und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 40 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufweist. Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes LLG-Polypeptid, das die Sequenz der SEQ ID NO. 8 enthält und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 55 kD oder 68 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufweist.
Die Polypeptide und Proteine der vorliegenden Erfindung können rekombinante Polypeptide, natürliche Polypeptide oder synthetische Polypeptide sein und können vom Menschen, vom Kaninchen oder von anderen Tieren stammen. Die Polypeptide zeichnen sich durch ein bestimmtes, reproduzierbares Molekulargewicht und/oder einen Satz mehrerer Molekulargewichte, chromatographischer Signale und Elutionsprofile, ihre Aminosäurezusammensetzung sowie -sequenz und ihre biologische Aktivität aus.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können unter Anwendung der dem Fachmann bekannten Reinigungsverfahren aus natürlichen Quellen, wie Plazenta-Extrakten, humanem Plasma oder konditionierten Medien aus kultivierten Zellen, wie Makrophagen oder Endothelzellen, isoliert werden.
Alternativ hierzu können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung unter Anvendung rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden, die darin besteht, eine für das betreffende Polypeptid kodierende Nukleinsäure mit einem geeigneten Vektor zu kombinieren, den resultierenden Vektor in eine geeignete Wirtszelle einzubringen, das von der resultierenden Wirtszelle produzierte Polypeptid zu isolieren und das isolierte Polypeptid zu reinigen.
C) Nukleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren zur Verfügung, die für LLG-Polypeptide kodieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antisense-Nukleinsäuren zur Verfügung, die dazu verwendet werden können, die Expression von LLG-Polypeptiden in vitro, ex vivo oder in vivo herunterzuregulieren oder zu blockieren.
Die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie sind dem Fachmann mit allgemeinem Wissensstand bekannt. Allgemeine Verfahren zur Klonierung und Expression rekombinanter Moleküle wurden von Maniatis (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) und Ausubel(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1987) beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können an eine oder mehrere regulatorische Regionen gebunden sein. Die Auswahl der geeigneten regulatorischen Region beziehungsweise Regionen ist eine Routineangelegenheit, die zu den üblichen Fertigkeiten auf dem Fachgebiet gehört. Zu den regulatorischen Regionen gehören Promotoren sowie gegebenenfalls auch Enhancer, Suppressoren usw.
Zu den Promotoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören sowohl konstitutive als auch regulierte (induzierbare) Promotoren. In Abhängigkeit vom Wirt kann es sich hierbei um prokaryotische oder um eukaryotische Promotoren handeln. Zu den für die praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung nützlichen prokaryotischen Promotoren (einschließlich der Bakteriophagen-Promotoren) gehören LacI-, LacZ-, T3-, T7-, Lambda-Pr sowie Lambda-Pr und trp-Promotoren. Zu den für die praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung nützlichen eukaryotischen (einschließlich der viralen) Promotoren gehören ubiquitäre Promotoren (z. B. HPRT, Vimentin, Actin und Tubulin), intermediäre Filament-Promotoren (z. B. Desmin, Neurofilamente, Keratin und GFAP), therapeutische Gen-Promotoren (z. B. MDR-Typ, CFTR und Faktor VIII), gewebespezifische Promotoren (z. B. der Actin-Promotor in glatten Muskelzellen und die in Endothelzellen aktiven Flt- und Flk-Promotoren), Promotoren die bevorzugt in sich teilenden Zellen aktiviert werden, Promotoren, die auf einen Stimulus antworten (z. B. der Steroidhormon-Rezeptor und der Retinsäure-Rezeptor), Tetrazyklin-regulierte Transkriptions-Modulatoren, das Immediate-Early-Cytomegalovirus, retrovirales LTR, Metallothionein, SV-40, Ela und MLP-Promotoren. Tetazyklin-regulierte Transkripnons-Modulatoren und CMV-Promotoren sind in WO 96/01313 sowie in US 5,168,062 und 5,385,839 beschrieben, auf deren Inhalte hiermit Bezug genommen wird.
Die in der Gentherapie verwendeten viralen Vektoren sind vorzugsweise replikationsdefekt, das heißt, sie sind nicht in der Lage, in der Zielzelle selbstständig zu replizieren. Im Allgemeinen fehlt dem Genom der im Rahmen des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung verwendeten replikationsdefekten viralen Vektoren mindestens eine für die Replikation des Virus in der infizierten Zelle erforderliche Region. Diese Regionen können entweder (ganz oder teilweise) entfernt werden oder sie können mit Hilfe jedes beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahrens in einen nicht-funktionellen Zustand gebracht werden. Zu diesen Verfahren gehören die vollständige Entfernung, die Substitution (durch andere Sequenzen, insbesondere durch die insertierte Nukleinsäure) und die teilweise Deletion oder Addition einer oder mehrerer Basen in einer (für die Replikation) wesentlichen Region. Solche Verfahren können in vitro (an der isolierten DNA) oder in situ durchgeführt werden, wobei Genmanipulanons-Techniken angewendet werden oder eine Behandlung mit mutagenen Substanzen durchgeführt wird.
Die für die Kapsid-Umhüllung der viralen Teilchen erforderlichen Genomsequenzen sind in dem replikationsdefekten Virus vorzugsweise erhalten.
Die Retroviren sind eindringende Viren, die sich teilende Zellen infizieren. Das Genom des Retrovirus enthält zwei LTRs, eine Sequenz für die Ausbildung der Kapsid-Umhüllung und drei kodierende Regionen (gag, pol und env). Über die Konstruktion rekombinanter retroviraler Vektoren wurde berichtet: es sei hier im Einzelnen verwiesen auf EP 453 242 ; EP 178 220 ; Bernstein et al., Genet. Eng. 7(1985): 235; McCormick, BioTechnology 3(1985): 689, usw. In rekombinanten retroviralen Vektoren sind die gag-, pol- und env-Gene im Allgemeinen vollständig oder teilweise deletiert und durch eine heterologe Nukleinsäuresequenz, an der im betreffenden Fall Interesse besteht, ersetzt. Diese Vektoren können aus verschiedenen Arten von Retroviren, wie MoMuLV ("Moloney-Leukämie-Virus der Maus"), MSV ("Moloney-Sarkoma-Virus der Maus"), HaSV ("Harvey-Sarkoma-Virus"), SNV ("Milz-Nekrose-Virus"), RSV ("Sarkoma-Virus des Huhns) und dem Friend-Virus, konstruiert werden.
Im Allgemeinen wird zur Konstruktion rekombinanter Retroviren, die eine für die erfindungsgemäßen LLG kodierende Sequenz enthalten, ein Plasmid konstruiert, das die LTRs, die Sequenz für die Ausbildung der Kapsid-Umhüllung und die kodierende Sequenz enthält. Dieses Konstrukt wird zur Transfektion einer Verpackungs-Zelllinie verwendet, wobei diese Zelllinie befähigt ist, in trans die retroviralen Funktionen, die im Plasmid nicht vorhanden sind, zur Verfügung zu stellen. Somit sind die Verpackungs-Zellinien im Allgemeinen in der Lage, die gag-, pol- und env-Gene zu exprimieren. Solche Verpackungs-Zelllinien sind im Stand der Technik beschrieben worden, insbesondere die Zelllinie PA317(US 4,861,719); die PsiCRIP-Zelllinie (WO 90/02806) und die GP+envAm-12-Zelllinie (WO 89/07150). Darüber hinaus können die rekombinanten retroviralen Vektoren innerhalb der LTRs Modifikationen zur Suppression der Transkriptionsaktivität sowie umfassende Sequenzen für die Ausbildung der Kapsid-Umhüllung, die einen Teil des gag-Gens umfassen können (Bender et al., J. Virol. 61(1987): 1639), aufweisen. Rekombinante retrovirale Vektoren werden mit Hilfe der Standardtechniken, die dem Fachmann mit allgemeinem Wissensstand bekannt sind, gereinigt.
Die Adeno-assoziierten Viren (AAV) sind DNA-Viren relativ geringer Größe, die in der Lage sind, sich in stabiler und Site-spezifischer Weise in das Genom der Zellen, die sie infizieren, einzufügen. Sie sind befähigt, ein breites Spektrum von Zellen zu infizieren, ohne irgendeinen Einfluss auf das Wachstum, die Morphologie und die Differenzierung der Zellen zu nehmen, und sie scheinen nicht an Erkrankungen des Menschen beteiligt zu sein. Das AAV-Genom ist kloniert, sequenziert und charakterisiert worden. Es umfasst ungefähr 4700 Basen und weist an jedem Ende eine Inverted-Terminal-Repeat-(ITR-)Region von ungefähr 145 Basen auf die als Startpunkt für die Replikation des Virus dient. Der verbleibende Teil des Genoms teilt sich auf in zwei wesentliche Regionen, die die Funktion der Ausbildung der Kapsid-Umhüllung verschlüsseln: der linke Teil des Genoms, der das rep-Gen enthält, welches an der viralen Replikation und der Expression der viralen Gene beteiligt ist, und der rechte Teil des Genoms, der das cap-Gen enthält, welches für die Kapsid-Proteine des Virus kodiert.
Die Verwendung der von AAVs abgeleiteten Vektoren zur Gen-Übertragung in vitro und in vivo ist beschrieben worden (siehe WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368 ; US 5,139,941 und EP 488 528 ). Diese Veröffentlichungen beschreiben verschiedene AAV-abgeleitete Konstrukte, in denen die rep- und/oder cap-Gene deletiert und durch ein Gen, an dem im betreffenden Fall Interesse besteht, ersetzt sind, sowie die Verwendung dieser Konstrukte zur Übertragung des besagten Gens, an dem Interesse besteht, in vitro (in kultivierte Zellen) oder in vivo (direkt in einen Organismus). Die erfindungsgemäßen replikationsdefekten rekombinanten AAVs können durch Cotransfektion einer Zelllinie, die mit einem humanen Helfer-Virus (beispielsweise einem Adenovirus) infiziert ist, mit einem Plasmid, das die betreffende Nukleinsäuresequenz flankiert von zwei AAV-Inverted-Terminal-Repeat-(ITR-) Regionen enthält, und einem Plasmid, das die AAV-Gene für die Ausbildung der Kapsid-Umhüllung (rep- und cap-Gene) enthält, hergestellt werden. Die erzeugten AAV-Rekombinanten werden anschließend mit Hilfe von Standardtechniken gereinigt. Die Erfindung bezieht somit auch auf ein AAV-abgeleitetes rekombinantes Virus, dessen Genom eine für ein LLG-Polypeptid kodierende Sequenz flankiert von den AAV-ITRs umfasst. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Plasmid, das eine für ein LLG-Polypeptid kodierende Sequenz flankiert von zwei ITRs aus einem AAV umfasst. Ein solches Plasmid kann direkt zur Übertragung der LLG-Sequenz verwendet werden, wobei das Plasmid gegebenenfalls in einen liposomalen Vektor (ein Pseudovirus) eingebracht werden kann.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist der Vektor ein adenoviraler Vektor.
Adenoviren sind eukaryotische DNA Viren, die im Hinblick auf eine effiziente Einbringung einer Nukleinsäure der Erfindung in eine Vielzahl von Zelltypen modifiziert sein können.
Es existieren verschiedene Serotypen von Adenoviren. Von diesen Serotypen werden im Rahmen des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung vorzugsweise die humanen Adenoviren des Typs 2 und des Typs 5 (Ad 2 und Ad 5) oder aber von Tieren stammende Adenoviren (siehe WO 94/26914) verwendet. Zu diesen von Tieren stammenden Adenoviren, die im Rahmen des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören die vom Hund, vom Rind, von der Maus (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75(1990): 81), vom Schaf vom Schwein, von der Pute und vom Affen (Beispiel: SAV) stammenden Adenoviren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem von einem Tier stammenden Adenovirus um ein Adenovirus des Hundes und noch bevorzugter um ein CAV2-Adenovirus (z. B. Manhattan oder A26/61-Strang (ATCC VR-800)).
Die replikationsdefekten adenoviralen Vektoren der Erfindung enthalten vorzugsweise die ITRs, eine Sequenz, die die Ausbildung der Kapsid-Umhüllung verschlüsselt, und die betreffende Nukleinsäure. Noch bevorzugter handelt es sich zumindest bei der E1-Region des adenoviralen Vektors um eine nicht-funktionelle Region. In der Sequenz des Ad 5-Adenoviriis erstreckt sich die Deletion in der E1-Region vorzugsweise über die Nukleotide 455 bis 3329. Andere Regionen können ebenfalls modifiziert sein, insbesondere die E3-Region (WO 95/02697), die E2-Region (WO 94/28938), die E4-Region (WO 94128152; WO 94/12649 und WO 95/02697) sowie Regionen in jedem der späten Gene L1-L5. Fehlerhafte retrovirale Vektoren sind in WO 95/02697 offengelegt.
In einer bevorzugten Ausgestaltung weist der adenovirale Vektor eine Deletion in der E1- und der E4-Region auf. In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung weist der adenovirale Vektor eine Deletion in der E1-Region, in die die E4-Region und die für das LLG kodierende Sequenz eingebracht werden, auf (siehe FR 94 13 355 ).
Die erfindungsgemäßen replikationsdefekten rekombinanten Adenoviren können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden (Levrero et al., Gene 101(1991): 195; EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3(1984): 2917). Sie können insbesondere durch homologe Rekombination eines Adenovirus und eines Plasmids, das unter anderem die gewünschte DNA Sequenz trägt, hergestellt werden. Die homologe Rekombination wird im Anschluss an die Cotransfektion des besagten Adenovirus und des besagten Plasmids in eine geeignete Zelllinie durchgeführt. Die hierfür verwendete Zelllinie sollte vorzugsweise (i) durch die besagten Elemente transformierbar sein und (ii) die Sequenzen, die befähigt sind, das nicht vollständige Genom des replikationsdefekten Adenovirus zu ergänzen, einhalten, wobei diese Sequenzen zur Vermeidung von Rekombinationsrisiken vorzugsweise in integrierter Form vorliegen. Beispiele für Zelllinien, die verwendet werden können, sind die humane embryonale Nierenzelllinie 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1977): 59), die den linken Teil des Genoms eines Ad 5-Adenovirus (12%) in sein Genom integriert aufweist, sowie Zelllinien, die befähigt sind, die E1- und E4-Funktionen zu ergänzen wie in den Anmeldungen WO 94/26914 und WO 95/02697 beschrieben. Rekombinante Adenoviren werden unter Anwendung molekularbiologischer Standardverfahren, die dem Fachmann mit allgemeinem Wissensstand wohlbekannt sind, gewonnen und gereinigt.
Die Herunterregulierung der Genexpression mit Hilfe von Antisense-Nukleinsäuren kann auf der Ebene der Translation oder der Transkription erfolgen. Die Antisense-Nukleinsäuren der Erfindung sind vorzugsweise Nukleinsäurefragmente, die befähigt sind, spezifisch mit der gesamten oder mit einem Teil einer für ein LLG kodierenden Nukleinsäure oder der entsprechenden Messenger-RNA zu hybridisieren. Diese Antisense Nukleinsäuren können synthetische Oligonukleotide sein, die gegebenenfalls zur Erhöhung ihrer Stabilität sowie Selektivität modifiziert sind. Es kann sich bei diesen Antisense-Nukleinsäuren auch um DNA-Sequenzen handeln, durch deren Expression in der Zelle eine zur Gesamtheit oder zu einem Teil der LLG-mRNA komplementäre RNA erzeugt wird. Antisense-Nukleinsäuren können wie in EP 140 308 beschrieben durch Expression der gesamten oder eines Teils einer Sequenz, die unter den Sequenzen der SEQ ID NO. 2, der SEQ ID NO. 3, der SEQ ID NO. 7 und der SEQ ID NO. 11 ausgewählt ist, in umgekehrter Richtung hergestellt werden. Für die praktische Anwendung der Erfindung ist jede beliebige Länge einer Antisense-Sequenz geeignet, unter der Voraussetzung, dass diese Antisense-Sequenz in der Lage ist, die LLG-Expression herunterzuregulieren oder zu blockieren. Die Antisense-Sequenz weist vorzugsweise eine Länge von mindestens 20 Nukleotiden auf. Die Herstellung und Verwendung von Antisense-Nukleinsäuren und von DNA, die für Antisense-RNAs kodiert, sowie die Verwendung von oligo- und genetischen Antisense-Produkten ist in WO 92/15680 offengelegt, auf dessen Inhalte hiermit Bezug genommen wird.
D) Antikörper
Die vorliegende Erfindung stellt Antikörper gegen das LLG-Polypeptid zur Verfügung. Diese Antikörper können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung schließt sowohl chimäre, Single-Chain- und humanisierte Antikörper als auch Fab-Fragmente und die Produkte einer Fab-Expressionsbank ein.
Es können polyklonale Antikörper gegen ein antigenes Fragment eines LLG-Poiypeptids hergestellt werden wie in Beispiel 4A beschrieben. Es können auch Antikörper gegen das intakte LLG-Protein beziehungsweise -Polypeptid oder gegen ein Fragment, Derivat oder Epitop des Proteins beziehungsweise Polypeptids erzeugt werden. Die Antikörper können nach Verabreichung des Proteins, Polypeptids, Fragments, Derivats oder Epitops an ein Tier unter Anwendung der auf dem Fachgebiet bekannten Techniken und Verfahrensweisen erhalten werden.
Monoklonale Antikörper können mit Hilfe des Verfahrens von Mishell, B. B. et al., Selected Methods in Cellular Immunology (W. H. Freeman, ed.), San Francisco (1980), hergestellt werden. Kurz dargestellt, wird ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung zur Immunisierung der Milzzellen von Balb/c-Mäusen verwendet. Die immunisierten Milzzellen werden mit Myelomzellen fusioniert. Die fusionierten Zellen, die sowohl Milz- als auch Myelomzellmerkmale aufweisen, werden durch Züchten in HAT-Medium, einem Medium, das beide Ausgangszellen abtötet, den fusionierten Produkten jedoch erlaubt zu überleben und zu wachsen, isoliert.
Um zu verhindern, dass der Wirt eine Immunantwort auf die Antikörper entwickelt, können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung "humanisiert" sein. Ein "humanisierter Antikörper" ist ein Antikörper, in dem die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) und/oder andere Teile des Gefüges der variablen Domäne der Leicht- und/oder Schwerketten von einem nicht-humanen Immunglobulin abgeleitet sind, die übrigen Teile des Moleküls sich jedoch von einem oder mehreren humanen Immunglobulinen ableiten. Zu den humanisierten Antikörpern zählen auch Antikörper, die sich durch eine humanisierte Schwerkette, welche mit einer nicht Donor- oder Akzeptor-modifizierten Leichtkette oder einer chimären Leichtkette assoziiert ist, auszeichnen, sowie die umgekehrten Konstrukte. Die Humanisierung von Antikörpern kann durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren erfolgen (siehe z. B. G. E. Mark and E. A Padlan, "Chapter 4, Humanization of Monoclonal Antibodies", The Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 113, Springer-Verlag, New-York, 1994). Zur Expression humanisierter Antikörper können transgene Tiere verwendet werden.
Die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zur Herstellung von Single-Chain-Antikörpern können zur Herstellung von Single-Chain-Antikörpern gegen die immunogenen Polypeptide und Proteine der vorliegenden Erfindung modifiziert werden.
Die anti-LLG-Antikörper sind von Nutzen in Assays zur Ermittlung und Quantifizierung von LLG-Spiegeln. In einer Ausgestaltung ermöglichen diese Assays die klinische Diagnose und Bestimmung von LLG in verschiedenen Krankheitsstadien und stellen ein Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit der Behandlung zur Verfügung.
E) Verfahren zum Screening nach Agonisten oder Antagonisten
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Screening kleiner Molekülbanken oder natürlicher Substanzquellen nach Agonisten (Enhancern oder Co-Aktivatoren einschließlich proteinöser Co-Aktivatoren) oder Antagonisten (Inhibitoren) der LLGXL-Aktivität zur Verfügung. Ein potentieller Agonist oder Antagonist wird mit dem LLGXL–Protein und einem LLGXL-Substrat in Kontakt gebracht und es wird die Fähigkeit des potentiellen Agonisten beziehungsweise Antagonisten, die LLGXL-Aktivität zu verstärken beziehungsweise zu inhibieren, gemessen.
Das in diesem Verfahren verwendete LLGXL-Protein kann rekombinatorisch in verschiedenen Wirtszellen, einschließlich Mammazellen (wie in Beispiel 7 gezeigt), Baculovirus-infizierten Insektenzellen, Hefezellen und Bakterien, hergestellt werden. Die LLG-Expression in dauerhaft transfizierten CHO-Zellen kann durch Methotrexat- Amplifikation der Zellen optimiert werden. Das LLGXL-Protein kann auch aus natürlichen Quellen, wie humanem Plasma und Plazenta-Extrakten, oder aus konditionierten Medien von kultivierten Endothelzellen, THP-1-Zellen oder Makrophagen aufgereinigt werden.
Die Optimierung der Assay-Parameter, einschließlich pH, Innenkonzentrationen, Temperatur, Substrat-Konzentration und Emulgierungsbedingungen, wird von einem Fachmann mit allgemeinem Wissensstand empirisch durchgeführt.
Die Fettsäuresubstituenten der Substrate können sowohl in der Kettenlänge als auch im Sättigungsgrad sowie der Position der ungesättigten Bindung variieren. Die Substrate können in jeder von verschiedenen Positionen radioaktiv markiert sein. Phospholipidsubstrate wie Phosphatidylcholin können beispielsweise in der Sn-1- oder Sn-2-Position der Fettsäure, im Glycerol- oder Phosphatrest oder aber in der polaren Kopfgruppe (im Falle des Phosphatidylcholins ist dies das Cholin) radioaktiv markiert sein.
Als Alternative zu radioaktiv markierten Substraten stehen für die Screening-Verfahren auch andere Klassen von markierten Substraten, wie fluoreszierende Substrate oder schwefelhaltige Substrate, zur Verfügung.
Fluoreszierende Substrate sind in Screening-Assays von besonderem Nutzen, weil in diesem Falle die enzymatische Katalyse durch Messung der Fluoreszenzstärke kontinuierlich verfolgt werden kann, ohne eine physikalische Abtrennung (Extraktion) der Produkte von den Substraten notwendig zu machen. Ein Beispiel für ein fluoreszierendes Phosphatidylcholinsubstrat ist C₆NBD-PC (1-Acyl-2-[6-(nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-caproyl-phosphatidylcholin.
Zu den schwefelhaltigen Substraten gehört 1,2-Bis-(hexanoylthio)-1,2-didesoxy-sn-glycero-3-phosphorylcholin (Reynolds, L. J., Washburn, W. N., Deems, R. A. und Dennis, E. A., Methods in Enrymology 197(1991): 3–23; Yu, L. und Dennis, E. A., Methods in Enzymology 197(1991): 65–75; Wittenauer, L. A., Shirai, K., Jackson, R. L. und Johnson, J. D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 118(1984): 894–901).
F) Hydrolyse von Phosphatidylcholinestern
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Phosphatidylcholinestern z. B. zur industriellen Verarbeitung, für die Verarbeitung in Lebensmitteln oder in Detergentien für die Wäschepflege zur Verfügung. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur Hydrolyse von Phosphatidylcholinestern in Lösung verwendet werden, die Enzyme können jedoch auch an einen festen Träger gebunden werden, der anschließend mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird. Dieses Verfahren kann zur Herstellung von Lysophospholipiden und freien Fettsäuren eingesetzt werden.
G) Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen in einer biologisch verträglichen (biokompatiblen) Lösung, welche die Polypeptide, Nukleinsäuren, Vektoren und Antikörper der Erfindung enthält, zur Verfügung. Eine biologisch verträgliche Lösung ist eine Lösung, in der das Polypeptid, die Nukleinsäure, der Vektor oder der Antikörper der Erfindung in einer aktiven Form erhalten bleibt, also beispielsweise in einer Form, in der die betreffende Substanz befähigt sind, eine biologische Aktivität auszuüben. So würde beispielsweise ein Polypeptid der Erfindung eine Phospholipase-Aktivität aufweisen, eine Nukleinsäure wäre in der Lage zu replizieren, eine Message zu translatieren oder mit einer komplementären Nukleinsäure zu hybridisieren, ein Vektor wäre in der Lage, eine Zielzelle zu transfizieren und ein Antikörper würde ein Polypeptid der Erfindung binden. Im Allgemeinen wird es sich bei einer solchen biologisch verträglichen Lösung um einen Salzionen enthaltenden wässerigen Puffer, z. B. einen Tris-, Phosphat- oder HEPES-Puffer, handeln. Üblicherweise wird die Konzentration der Salzionen ungefähr im physiologischen Bereich liegen. In einer bestimmten Ausgestaltung ist die biologisch verträgliche Lösung eine pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzung. Biologisch verträgliche Lösungen können Stabilisatoren und Konservierungsstoffe enthalten.
Solche Zusammensetzungen können in einer für die Verabreichung auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, subkutanem oder intraokularem Weg geeigneten Weise formuliert werden. Unter parenteraler Verabreichung sind intravenöse, intramuskuläre und intraarterielle Injektions- sowie Infusionstechniken zu verstehen. Die Zusammensetzung kann parenteral in Dosierungseinheiten von Formulierungen verabreicht werden, die je nach Bedarf wohibekannte nicht-toxische, physiologisch unbedenkliche Standard-Trägerstoffe, -Hilfsstoffe und -Medien enthalten.
Die bevorzugten sterilen injizierbaren Zubereitungen können Lösungen oder Suspensionen in einem nicht-toxischen, für die parenterale Verabreichung unbedenklichen Lösungs- oder Verdünnungsmittel sein. Beispiele für pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoffe sind Salzlösungen, gepufferte Salzlösungen, isotonische Salzlösungen (z. B. Lösungen von Mono- oder Dinatriumphosphat, Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumchlorid oder Gemischen solcher Salze), Ringer-Lösung, Dextrose-Lösung, Wasser, steriles Wasser, Glycerol, Ethanol und deren Gemische. Vorteilhafterweise werden als Lösungsmittel oder Suspensionsmedien 1,3-Butandiol und sterile fette Öle verwendet. Es kann jedes milde fette Öl verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Fettsäuren wie Ölsäure finden bei der Herstellung von injizierbaren Zusammensetzungen ebenfalls Verwendung.
Das Medium der Zusammensetzung kann auch ein aus einem beliebigen biologisch verträglichen oder nicht-zytotoxischen (Homo- oder Hetero-) Polymer hergestelltes Hydrogel sein, wie beispielsweise ein hydrophiles Polyacrylsäure-Polymer, das als medikamentenabsorbierender Schwamm fungieren kann. Solche Polymere sind beispielsweise in der Anmeldung WO 93/08845 beschrieben worden, auf deren gesamte Inhalte hiermit Bezug genommen wird. Bestimmte Vertreter dieser Hydrogele, wie insbesondere die aus Ethylen- und/oder Propylenoxid gewonnenen Hydrogele, sind kommerziell erhältlich. Ein Hydrogel kann beispielsweise während eines chirurgischen Eingriffs direkt auf die Oberfläche des zu behandelnden Gewebes aufgebracht werden.
Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die aus einem replikationsdefekten rekombinanten Virus und Poloxamer besteht. Spezieller bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung, die aus einem replikationsdefekten rekombinanten Virus, welches eine für ein LLG-Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält, und Poloxamer besteht. Ein bevorzugtes Poloxamer ist Poloxamer 407, das kommerziell erhältlich ist (BASF, Parsippany, NJ) und das ein nicht toxisches, biologisch verträgliches Polyol ist, welches höchste Präferenz besitzt. Ein mit rekombinanten Viren imprägniertes Poloxamer kann beispielsweise während eines chirurgischen Eingriffs direkt auf die Oberfläche des zu behandelnden Gewebes aufgebracht werden. Poloxamer besitzt im Wesentlichen dieselben Vorteile wie Hydrogel, weist jedoch eine niedrigere Viskosität auf.
H) Behandlungsmethoden
Die vorliegende Erfindung ist von Nutzen für Behandlungsmethoden, im Rahmen derer einem Menschen oder einem Tier eine wirksame Menge einer Zusammensetzung der Erfindung verabreicht wird.
Die wirksamen Mengen können in Abhängigkeit vom Alter, von der Art und der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, vom Körpergewicht, von der gewünschten Behandlungsdauer, vom Verabreichungsweg und von anderen Parametern variieren. Die wirksamen Mengen werden von einem Arzt oder anderem qualifizierten medizinischen Personal festgesetzt.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden im Allgemeinen in Dosen von ungefähr 0,01 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg, vorzugsweise von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 50 mg/kg und am meisten bevorzugt von ungefähr 1 mg/kg bis ungefähr 10 mg/kg Körpergewicht pro lag verabreicht.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Viren werden im Allgemeinen in Form von Dosen im Bereich von ungefähr 10⁴ bis ungefähr 10¹⁴ pfu formuliert und verabreicht. Im Falle von AAVs und von Adenoviren werden bevorzugt Dosen von ungefähr 10⁶ bis ungefähr 10¹¹ pfu eingesetzt. Der Begriff pfu ("plaque-forming unit") korrespondiert mit dem Infektionsvermögen einer Suspension von Virionen und wird bestimmt durch Infektion einer geeigneten Zellkultur und Ermittlung der Anzahl der gebildeten Plaques. Die Verfahren zur Bestimmung des pfu-Titers einer viralen Lösung sind im Stand der Technik ausführlich dokumentiert.
Die vorliegende Erfindung ist von Nutzen in Verfahren zur Behandlung der Arteriosklerose in den Fällen, in denen die Arteriosklerose die Folge einer übermäßigen, abnormalen oder unzureichenden Expression der LLG-Polypeptid-Aktivität ist.
Die vorliegende Erfindung ist des Weiteren von Nutzen in Verfahren zur Behandlung eines Menschen oder eines Tieres, das ein nicht wünschenswertes Lipidprofil aufweist, in den Fällen, in denen dieses nicht wünschenswerte Lipidprofil die Folge einer abnormal hohen oder unzureichenden Expression der LLG-Polypeptid-Aktivität ist.
Die vorliegende Erfindung ist ferner von Nutzen in Verfahren zur Behandlung des Diabetes, der Hyperlipidämie, der intrahepatischen Cholestase oder anderer metabolischer Störungen in den Fällen, in denen dieser Diabetes beziehungsweise diese Hyperlipidämie, intrahepatische Cholestase oder andere metabolische Störung die Folge einer abnormal hohen oder unzureichenden Expression der LLG-Polypeptid-Aktivität ist.
1) Behandlung von nicht wünschenswerten Lipidprofilen, die mit einer erhöhten Expression des LLG-Polypentids verbunden sind
Als eine unvollständige Auswahl von Verfahren zur Verringerung der LLG-Polypeptid-Expression mit dem Ziel, Zustände, in denen die LLG-Polypeptid-Aktivität zu einer mit einem nicht wünschenswerten Lipidprofil verbundenen Krankheit oder Störung beiträgt, zu verbessern, sind die Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine Antisense-Nukleinsäure enthält, die Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein intrazelluläres Bindungsprotein, wie einen Antikörper, enthält, die Verabreichung einer Zusammensetzung, die das LLGN-Polypeptid oder ein anderes LLG-Fragment enthält, und die Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine für das LLGN-Polypeptid oder ein anderes LLG-Fragment kodierende Nukleinsäure enthält, zu nennen.
In einer Ausgestaltung wird eine Zusammensetzung, die eine Antisense-Nukleinsäure enthält, zur Herunterregulierung beziehungsweise Blockierung der LLG-Expression verwendet. In einer bevorzugten Ausgestaltung kodiert die Nukleinsäure für Antisense-RNA-Moleküle. In dieser Ausgestaltung wird die Nukleinsäure, die operativ mit Signalen verknüpft ist, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen, in eine Zelle eingebracht, wobei diese Einbringung vorzugsweise unter Verwendung rekombinanter Vektorkonstrukte erfolgt, die nach der Einbringung des Vektors in die Zelle die Antisense-Nukleinsäure exprimieren.
Beispiele für geeignete Vektoren sind Plasmide, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Retroviren und Herpes-Viren. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vektor um ein Adenovirus. Unter den Vektoren werden replikationsdefekte Adenoviren, die eine Deletion in der E1- und/oder der E3-Region des Virus aufweisen, am meisten bevorzugt.
In einer anderen Ausgestaltung wird die LLG-Expression herunterreguliert beziehungsweise blockiert, indem eine Nukleinsäuresequenz exprimiert wird, welche für ein intrazelluläres Bindungsprotein kodiert, das wiederum befähigt ist, selektiv mit LLG zu wechselwirken. In WO 94/29446 und WO 94/02610, auf deren Inhalte hiermit Bezug genommen wird, wird die zelluläre Transfektion mit Genen, die für ein intrazelluläres Bindungsprotein kodieren, offengelegt. Ein intrazelluläres Bindungsprotein enthält ein beliebiges Protein, das befähigt ist, in der Zelle, in der es exprimiert wird, selektiv mit LLG zu wechselwirken oder dieses zu binden und die Funktion von gebundenem LLG aufzuheben. Vorzugsweise handelt es sich bei dem intrazellulären Bindungsprotein um einen Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers. Noch bevorzugter handelt es sich bei dem intrazellulären Bindungsprotein um einen Einketten-Antikörper.
In WO 94/02610 wird die Herstellung von Antikörpern und die Identifizierung der für einen bestimmten Antikörper kodierenden Nukleinsäure offengelegt. Unter Verwendung eines LLGs oder eines LLG-Fragments wird mit Hilfe der dem Fachmann bekannten Verfahren ein spezifischer monoklonaler Antikörper hergestellt. Anschließend wird zur Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Vektor hergestellt, der die für ein intrazelluläres Bindungsprotein kodierende Nukleinsäure oder einen Teil einer solchen Nukleinsäure enthält und der befähigt ist, in einer Wirtszelle zu exprimieren.
Alternativ hierzu kann die LLG-Aktivität blockiert werden, indem in den Blutkreislauf ein Antikörper verabreicht wird, der diese LLG-Aktivität neutralisiert. Ein solcher neutralisierender Antikörper kann direkt als Protein verabreicht oder aber (über ein sekretorisches Signal) aus einem Vektor exprimiert werden.
In einer anderen Ausgestaltung wird die LLGXL-Aktivität durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die das LLGN-Polypeptid oder ein anderes LLG-Fragment enthält, inhibiert. Diese Zusammensetzung kann in vorteilhafter Weise verabreicht werden, so beispielsweise auf oralem, topischem, intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subkutanem, intranasalem oder intradermalem Weg. Die Zusammensetzung kann direkt verabreicht werden oder sie kann verkapselt sein (beispielsweise in einem Lipidsystem, in Aminosäure-Mikrosphären oder in globulären Dendrimeren). Das Polypeptid kann in bestimmten Fällen an ein anderes Polymer, wie Serumalbumin oder Polyvinylpyrrolidon, gebunden sein.
In einer anderen Ausgestaltung wird die LLGXL-Aktivität durch Verwendung von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die mit den enzymatischen Eigenschaften von LLGXL wechselwirken oder die die korrekte Erkennung von LLGXL durch zelluläre Bindungsstellen verhindern, inhibiert.
In einer anderen Ausgestaltung wird die LLGXL-Aktivität durch Anwendung von Gentherapie inhibiert, das heißt durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure enthält, welche für die Expression des LLGN-Polypeptids oder eines anderen LLG-Fragments kodiert und diese Expression steuert.
In einer bestimmten Ausgestaltung weist das LLG-Gen der vorliegenden Erfindung auch eine Affinität zu Heparin auf. An extrazelluläres Heparin im Lumen von Blutgefäßen anbindendes LLG-Polypeptid würde, indem es als Brücke zwischen LDL und dem extrazellulären Heparin fungierte, die LLG-Anbindung an LDL und die Beschleunigung der LDL-Aufnahme ermöglichen. Es wird angenommen, dass in dem begrenzten Gebiet einer arteriosklerotischen Läsion eine erhöhte Lipase-Aktivität den atherogenen Prozess beschleunigt (Zilversmit, D. B., Clin. Chem. 41(1995): 153–158; Zambon, A., Torres, A., Bijvoet, S., Gagne, C., Moojani, S., Lupien, P. J., Hayden, M. R. und Brunzell, J. D., Lancet 341(1993): 1119–1121). Dies könnte auf einer durch Lipasen vermittelten verstärkten Anbindung und Aufnahme von Lipoproteinen durch das vaskuläre Gewebe beruhen (Eisenberg, S., Sehayek, E., Olivecrona, T. und Vlodavsky, I., J. Clin. Invest. 90(1992): 2013–2021; Tabas, I., Li, I., Brocia, R. W., Xu, S. W., Swenson, T. L. und Williams, K. J., J. Biol. Chem. 268(1993): 20419–20432; Nordestgaard, B. G. und Nielsen, A. G., Curr. Opin. Lipid 5(1994): 252–257; Williams, K. J. und Tabas, I., Art. Thromb. and Vasc. Biol. 15(1995): 551–561). Darüber hinaus kann eine lokal erhöhte Lipase-Aktivität dazu führen, dass in Vorläufern arteriosklerotischer Läsionen zytotoxische Fettsäure- und Lysophosphatidylcholinspiegel erzeugt werden. Diese spezielle LLG-Aktivität kann zur Entwicklung oder zum Fortschreiten der Arteriosklerose beitragen, dies insbesondere im Zusammenhang mit überhöhten Lipidspiegeln in den Fällen, die durch Ernährungs- oder genetische Faktoren bedingt sind. Somit erlaubt die vorliegende Erfindung die Inhibierung der Lipoprotein-Akkumulation durch Inhibierung der LLG-Polypeptid-Expression oder der Anbindung von LLG an Lipoproteine (z. B. LDL).
2) Behandlung von nicht wünschenswerten Lipidprofilen, die mit einer unzureichenden LLG-Polypeptid-Aktivität verbunden sind
Als eine unvollständige Auswahl von Verfahren zur Erhöhung der LLG-Expression mit dem Ziel, Zustände, in denen die LLG-Polypeptid-Aktivität zu einer mit einem unerwünschten Lipidprofil verbundenen Krankheit oder Störung beiträgt, zuverbessern, sind die Verabreichung einer Zusammensetzung, die das LLGXL- Polypeptid enthält, und die Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine für das LLGXL-Polypeptid kodierende Nukleinsäure enthält, zu nennen.
In einer Ausgestaltung wird das Maß der LLGL-Aktivität durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die das LLGXL-Polypeptid enthält, erhöht. Diese Zusammensetzung kann in einer vorteilhaften Weise, wie beispielsweise auf oralem, topischem, intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem, subkutanem, intranasalem oder intradermalem Weg, verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann direkt verabreicht werden oder sie kann verkapselt sein (beispielsweise in einem Lipidsystem, in Aminosäure-Mikrosphären oder in globuären Dendrimeren). Das Polypeptid kann in bestimmten Fällen an ein anderes Polymer, wie Serumalbumin oder Polyvinylpyrrolidon, gebunden sein.
In einer anderen Ausgestaltung wird der LLGXL-Spiegel durch die Verwendung von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, die die LLGXL-Expression im Stadium der Transkription oder der Translation oder aber posttranslatorisch heraufregulieren können, erhöht.
In einer anderen Ausgestaltung wird der LLGXLSpiegel durch Anwendung von Gentherapie erhöht, das heißt durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure enthält, welche für die Expression des LLGXL-Polypeptids kodiert und diese Expression steuert.
Die intrahepatische Cholestase zeichnet sich durch erhöhte Serum-Cholesterol- und Phospholipidspiegel aus. In einem kürzlich beschriebenen Modell für eine durch ein Phalloidin-Medikament induzierte intrahepatische Cholestase in der Ratte wurde eine deutliche Erhöhung der Serum-Cholesterol- und Phospholipidspiegel nachgewiesen (Ishizaki, K., Kinbara, S., Miyazawa, N., Takeuchi, Y., Hirabayashi, N., Kasai, H. und Araki, T., Toxicol. Letters 90(1997); 29–34). Die Produkte dieser Erfindung können zur Behandlung der intrahepatischen Cholestase bei Patienten eingesetzt werden, die erhöhte Serum-Cholesterol- und/oder Phospholipidspiegel aufweisen. Des Weiteren wurde in dem besagten Modell der Ratte auch eine starke Erniedrigung der biliären Cholesterol-Exkretionsraten gefunden. Das LLG-Polypeptid und die Nukleinsäure-Produkte dieser Erfindung können zur Behandlung von Patienten mit gestörtem biliärem Exkretionssystem eingesetzt werden.
Die intrahepatische Cholestase zeichnet sich auch durch einen gestörten Gallenfluss aus der Leber aus. Kürzlich wurden die Loci für die progressive familiär gehäufte intrahepatische Cholestase (PFIC oder Byler-Krankheit) und die gutartige wiederkehrende intrahepatische Cholestase (BRIC) auf 18q21-q22 kartiert (Carlton, V. E. H., Knisely, A. S. und Freimer, N. B., Hum. Mol. Genet. 4(1995): 1049–1053, beziehungsweise Houwen, R. H., Baharloo, S., Blankenship, K., Raeymaekers, P., Juyn, J., Sandkuijl, L. A. und Freimer, N. B., Nature Genet. 8(1994): 380.386). Da die Kartierung des LLG-Gens innerhalb dieser chromosomalen Region auf 18q21 liegt, können das LLG-Gen oder die Produkte dieser Erfindung zur Behandlung von Patienten mit intrahepatischer Cholestase, die durch eine Mutation oder eine gestörte Expression des/der für die PFIC/BRIC-Krankheit verantwortlichen Gens(Gene) bedingt ist, eingesetzt werden.
In einer anderen Ausgestaltung können die LLG-Gen- beziehungsweise LLG-Polypeptid-Produkte dieser Erfindung zur Behandlung von Patienten mit intrahepatischer Cholestase, die nicht auf einem Defekt in dem(den) für die PFIC/BRIC-Krankheit verantworlichen Gen (Genen) auf 18q21-q22 beruhen, eingesetzt werden. Im Rahmen einer jüngeren Studie ergab sich die Vermutung, dass ein anderer Locus außerhalb der 18q21-q22-Region ebenfalls den PFIC-Phänotyp auslösen kann (Strautnieks, S. S., Kagalwalla, A. F., Tanner, M. S., Gardiner, R. M. und Thompson, R. J., J. Med Genet. 33(1996): 833–836). Nichtsdestotrotz kann durch Verabreichung eines LLG-Polypeptids entweder auf direktem Weg oder mittels Gentherapie diese Form der Erkrankung gelindert werden.
In der Gentherapie werden eine oder mehrere für ein Polypeptid kodierende Nukleinsäuren zusammen mit regulatorischen Regionen, die die Expression dieser Nukleinsäuren steuern, in die Zielzellen eines Menschen oder Tieres überragen. Diese Übertragung erfolgt entweder ex vivo in einem Verfahren, in dem die Nukleinsäure im Labor in Zellen überragen wird und die modifizierten Zellen anschließend dem Menschen oder dem Tier verabreicht werden, oder in vivo in einem Verfahren, in dem die Nukleinsäure direkt in Zellen im Organismus des Menschen oder des Tieres übertragen wird. Die Übertragung von Nukleinsäuren kann unter Verwendung entweder der viralen oder der nicht-viralen Vektoren, die oben beschrieben sind, erfolgen.
Nicht-virale Vektoren können unter Anwendung jedes beliebigen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahrens, einschließlich der Calciumphosphat-Copräzipitation, der Lipofektion (mittels synthetischen anionischen und kationischen Liposomen), des Rezeptor-vermittelten Gentransfers, der Injektion von Nackter DNA, der Elektroporation und der bioballistischen oder Teilchen-Beschleunigung, in Zellen übertragen werden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu beschränken.
BEISPIEL 1
Identifikation einer differentiell exprimierten cDNA
A) RNA-Herstellung
Humane monozytäre THP-1-Zellen (Smith, P. K., Krohn, R. L., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J. und Klenk, D. C., Anal. Biochem. 150(1985): 76–85) wurden in RPMI-1640-Medium (GIBCO) mit 25 mM HEPES, 10% fetales Kälberserum, 100 Einheiten/ml Penicillin G-Natrium und 100 Einheiten/ml Streptomycin-Sulfat gezüchtet. Die Zellen wurden auf 15 cm-Gewebekulturschalen ausplattiert, wobei pro Schale 1,5 × 10⁷ Zellen gesät wurden, und zur Induktion der Zelldifferenzierung 48 h mit 40 ng/ml Phorbol-l2-Myristat-l3-Acetat (Sigma) behandelt. Humane Lipoproteine mit niedrigem spezifischem Gewicht (LDL) wurden von Calbiochem bezogen und bei 4°C vollständig gegen PBS dialysiert. Das LDL wurde anschließend auf 500 μg/ml verdünnt und 16 h bei 37°C gegen 5 μM CuSO₄ in PBS dialysiert. Um die Oxidation zu beenden, wurde das LDL vollständig gegen 150 mM NaCl, 0,3 mM EDTA, dialysiert und anschließend sterilfiltriert. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des BCA-Verfahrens bestimmt (Schuh, J., Fairclough, G. F. und Haschemeyer, R. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978): 3173–3177)(Pierce). Der Oxidationsgrad wurde mittels TBARS bestimmt (Chomczynski, P., Biotechniques 15(1993): 532–537), er lag bei 25 bis 30 nmol MDA-Äquivalenten/mg Protein. Die differenzierten THP-1-Zellen wurden 24 h entweder mit 50 μg/ml oxidiertem LDL oder mit NaCl-EDTA Puffer in RPMI-Medium mit 10% fetalem Lipoprotein-Mangel-Kälberserum (Sigma) behandelt. Um die RNA abzuernten, wurden die Schalen mit 10 ml PBS gespült, anschließend wurden in jede Schale 14 ml TRIZOL (Liang, P. und Pardee, A. B., Science 257(1992): 967–971)(GIBCO) gegeben. Die Lösung wurde zur Vermischung mehrere Male pipettiert, anschließend wurden Mischproben erzeugt, indem jeweils gleiche Mengen der Einzelproben in Zentrifugenröhrchen gegeben wurden, pro Schale 3 ml Chloroform zugegeben wurden und gemischt wurde. Die Röhrchen wurden 15 Minuten bei 12000 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt, es wurden pro Schale 7,5 ml Isopropanol zugegeben und gemischt. Die Röhrchen wurden 20 Minuten bei 12000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden mit eiskaltem 70% Ethanol gespült und bei Raumtemperatur getrocknet. Die Pellets wurden in 500 μl TE (Tris-EDTA) suspendiert und 30 Minuten bei 37°C mit 200 Einheiten RNase-freier DNase I sowie 200 Einheiten des Plazenta RNase-Inhibitors RNasin (Promega) behandelt. Die RNA wurde nacheinander mit Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert, anschließend erfolgte eine Ethanol-Fällung.
B) cDNA Synthese
Die cDNA-Synthese und die PCR-Amplifikation wurden entsprechend den Protokollen des Differential Display Kits, Version 1.0 (Display Systems Biotechnology, Inc.) durchgeführt. Dieses System beruht auf der ursprünglich von Liang und Pardee beschriebenen Technik (Mead, D. A., Pey, N. K., Herrnstadt, C., Marcil, R. A. und Smith, L. M., Bio/Technology 9(1991): 657–663). Die Primer-Paare, aus denen das cDNA-Fragment hervorging, welches die erste Information des Lipase-ähnlichen Gens enthielt, waren der Downstream-Primer #7 und der Upstream-Primer #15. Die cDNA für die Amplifikation wurde unter Verwendung der aus PMA behandelten THP-1-Zellen, welche entweder mit Puffer oder mit oxidiertem LDL behandelt wurden, abgeleiteten RNA folgendermaßen hergestellt: 3 μl 25 μM Downstream-Primer #7 und 7,5 μl Diethylpyrocarbonat-(DEPC-) behandeltes Wasser wurden zu 300 ng (3,0 μl) RNA aus einer der THP-1-RNAProben gegeben. Dieses Gemisch wurde 10 Minuten auf 70°C erhitzt und dann über Eis gekühlt. Zu diesem Röhrchen wurden 3 μl 5 × PCR-Puffer (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl)(GiBCO), 3 μl 25 mM MgCl₂, 3 μl 0,1 M DTT, 1,2 μl 500 μM dNTPs, 0,7 μl RNasin und 5,6 μl DEPC-behandeltes Wasser gegeben. Die Röhrchen wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurden 1,5 μl (300 Einheiten) der Reversen Transkriptase Superscript II RNase H (GIBCO) zugegeben. Die Röhrchen wurden zunächst 2 Minuten bei Raumtemperatur, dann 60 Minuten bei 37°C und schließlich 5 Minuten bei 95°C inkubiert sowie anschließend über Eis gekühlt. Für die PCR-Amplifikation wurde ein Master Mix verwendet, der 117 μl 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 15 mM MgCl₂ und 0,01 % (w/v) Gelatine), 70,2 μl 25 mM MgCl₂, 5,9 μl alpha-³³P-dATP (10 mCi/ml, DuPont NEN), 4,7 μl 500 μM dNTP-Mix, 11 μl AmpliTaq-DNAPolymerase (5 Einheiten/μl, Perkin-Elmer) und 493,3 μl DEPC-behandeltes Wasser enthielt. Für jede Reaktion wurden 2 μl des Downstream-Primers #7, 1 μl cDNA und 5 μl des Upstream-Primers #15 mit 12 μl Master Mix versetzt. Die Reaktionsgemische wurden 1 Minute auf 94°C erhitzt und anschließend 40 Thermozyklen unterzogen, wobei jeder dieser Thermozyklen einen Denaturierungsschritt von 15 Sekunden bei 94°C, einen Anlagerungs("Annealing") Schritt von 1 Minute bei 40°C und einen Verlängerungs-("Extension") Schritt von 30 Sekunden bei 72°C umfasste. Im Anschluss an die 40 Zyklen wurden die Reaktionsansätze 5 Minuten bei 72°C inkubiert und dann bei 10°C gelagert. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Perkin-Elmer-GeneAmp-System 9600-Thermocycler durchgeführt.
Vier Mikroliter des Amplifikationsreaktions-Gemischs wurden mit demselben Volumen eines Ladepuffers (0,2% Bromphenolblau, 0,2% Xylen-Cyanol, 10 mM EDTA pH 8,0 und 20% Glycerol) gemischt. Vier Mikroliter dieses Gemischs wurden bei 1200 Volt (konstante Spannung) einer 3-stündigen Trennung auf einem vorgefer tigten 6%igen nicht-denaturierenden Acrylamid-Sequenzierungs-Gel unterzogen. Das Gel wurde 1,5 Stunden bei 80°C getrocknet und auf einem Kodak XAR-Film abgelichtet. Es wurde ein Amplifikationsprodukt identifiziert, das nur im Falle des Reaktionsansatzes, welcher cDNA aus mit oxidiertem LDL behandelten THP-1-Zellen enthielt, vorhanden war, und dieses Amplifikationsprodukt wurde aus dem Gel exzidiert. Das exzidierte Gel-Fragment wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, mit 100 μl DEPC-behandeltem Wasser versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur sowie anschließend 15 Minuten bei 95°C inkubiert.
Zur erneuten Amplifikation des PCR-Produkts wurde ein Reaktionsansatz, bestehend aus 26,5 μl der eluierten DNA sowie 5 μl 10 × PCR Puffer, 3 μl 25 mM MgCl₂, 5 μl 1500 μM dNTPs, 5 μl 2 μM Downstream-Primer #7, 7,5 μl Upstream-Primer #15 und 0,5 μl Amplitaq-Polymerase, einer Amplifikationsreaktion unterzogen. Es wurde mit denselben PCR Thermozyklisierungsparametern und derselben Apparatur gearbeitet wie oben. Im Anschluss an diese Amplifikation wurden 20 μl des Reamplifikationsprodukts auf einem Agarose-Gel analysiert und 4 μl zur Subklonierung der PCR Produkte in den pCRII-Vektor unter Verwendung des TA-Klonierungssystems (Frohman, M. A, Dush, M. K. und Martin, G. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988): 8998–9002)(Invitrogen) verwendet. Im Anschluss an eine Ligation, die bei 14°C über Nacht durchgeführt wurde, wurden die Ligationsprodukte zur Transformation von E. coli, eingesetzt. Die resultierenden Transformanten wurden pikiert und es wurden für Plasmid-Minipräparationen Übernacht-Kulturen zu 3 ml angesetzt. Die Größen der Inserts wurden mit Hilfe von EcoRI-Verdauung der Plasmide bestimmt, und die Klone, die Inserts von ungefähr derselben Größe enthielten wie sie auch die ursprünglichen PCR Produkte aufwiesen, wurden mit Hilfe von fluoreszierenden Dye-Terminator-Reagenzien (Prism, Applied Biosystems) und eines Applied Biosystems 373 DNA-Sequencers sequenziert. Die Sequenz des PCR Produkts ist in 2 aufgeführt. Die Sequenz der Amplifikations-Primer ist unterstrichen.
C) 5'-RACE-Reaktion
Die Verlängerung der mittels RT-PCR identifizierten cDNA erfolgte unter Verwendung des 5'-RACE-Systems (Loh, E. Y., Eliot, J. F., Cwirla, S., Lanier, L. L. und Davis, M. M., Science 243(1989): 217–219; Simms, D., Guan, N. und Sitaraman, K., Focus 13(1991): 99)(GIBCO). In diesem 5'-RACE-Verfahren wurde 1 μg der THP-1-RNA (mit oxidiertem LDL behandelt), die ursprünglich für die Differential Display-Reaktionen verwendet wurde, eingesetzt: 1 μl (1 μg) RNA wurde mit 3 μl (3 pmol) Primer #2a und 11 μl DEPC-behandeltem Wasser versetzt, 10 Minuten auf 70°C erhitzt und anschließend 1 Minute über Eis gekühlt. Es wurden 2,5 μl 10 × Reaktionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 8,4, 500 mM KCl), 3 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 mM dNTP-Mix und 2,5 μl 0,1 M DTT zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Minuten bei 42°C inkubiert, anschließend wurde 1 μl Superscript II-Reverse Transkriptase zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde weitere 30 Minuten bei 42°C sowie anschließend 15 Minuten bei 70°C und 1 Minute über Eis inkubiert. Das Gemisch wurde mit 1 μl RNase H (2 Einheiten) versetzt und 10 Minuten bei 55°C inkubiert. Die cDNA wurde unter Verwendung der in dem Kit enthaltenen GlassMax-Säulen (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., Molecular Cloning (1989): A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) gereinigt. Die cDNA wurde in 50 μl dH₂O von der Säule eluiert, lyophilisiert und in 21 μl dH₂O resuspendiert. Das Tailing der cDNA erfolgte mit Hilfe der folgenden Reaktion: 7,5 μl dH₂O, 2,5 μl Reaktionspuffer (200 mM Tris-HCl pH 8,4, 500 mM KCl), 1,5 μl 25 mM MgCl₂, 2,5 μl 2 mM dCTP und 10 μl der cDNA wurden 3 Minuten bei 94°C und anschließend 1 Minute über Eis inkubiert. Es wurde 1 μl (10 Einheiten) Terminale Desoxynukleotidyl-Transferase zugegeben und das Gemisch wurde wiederum 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Enzym wurde durch 10-minütige Inkubation bei 70°C Hitze-inaktiviert und das Gemisch auf Eis gestellt. Die PCR-Amplifikation der cDNA wurde in folgenden Schritten durchgeführt: Es wurde ein Reaktionsansatz aus 5 μl der Tailingbehandelten cDNA, 5 μl 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 15 mM MgCl₂ und 0,01% (w/v) Gelatine), 1 μl 10 mM dNTP-Mix, 2 μl (10 pmol) Anker-Primer, I μl (20 pmol) Primer #3a und 35 μl dH₂O bereitet. Dieser Reaktionsansatz wurde 1 Minute auf 95°C erhitzt, anschließend wurden 0,9 μl (4,5 Einheiten) Amplitaq-Polymerase zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde 40 Thermozyklen unterzogen, die unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurden: 5 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 50°C und 30 Sekunden bei 72°C. Ein Mikroliter dieses Reaktionsgemischs wurde zur Erhöhung des Gehalts an spezifischen Produkten für die nachfolgende Isolation einer Nested-Reamplifikation unterzogen. Diese Reamplifikation wurde durchgeführt mit: 1 μl des primären Amplifikationsprodukts, 5 μl 10 × PCR-Puffer, 1 μl 10 mM dNTP-Mix, 2 μl (20 pmol) Universellem Amplifikations-Primer, 2 μl (20 pmol) Primer #4a und 38 μl dH₂O. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Minute auf 95°C erhitzt, anschließend wurden 0,7 μl (3,5 Einheiten) Amplitaq-Polymerase zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde 40 Thermozyklen unterzogen, die unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurden: 5 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 50°C und 30 Sekunden bei 72°C. Die Amplifikationsprodukte wurden mittels Gelelektrophorese über einem 0,8% Agarose-Gel analysiert. Es wurde ein Hauptprodukt von ungefähr 1,2 Kilobasenpaaren gefunden. Zwei Mikroliter der Reaktionsprodukte wurden in den pCRII-Vektor aus dem TA-Klonierungs-Kit (Invitrogen) kloniert und über Nacht bei 14°C inkubiert. Die Ligationsprodukte wurden zur Transformation von E. coli. eingesetzt. Die Größen der Inserts der resultierenden Transformanten wurden durch EcoRI-Verdauung bestimmt. Die Klone, die Inserts von ungefähr derselben Größe enthielten wie sie das PCR-Produkt aufwies, wurden mit Hilfe von fluoreszierenden Dye-Terminator-Reagenzien (Prism, Applied Biosystems) und eines Applied Biosystems 373 DNA-Sequencers sequenziert. Die Sequenz des RACE-Produkts, die auch die EcoRI-Sites aus dem TA-Vektor enthält, ist in 3 aufgeführt. Die Sequenzen der Amplimere (Universeller Amplifikations-Primer und das Komplement zum 5'-RACE-Primer #4a) sind unterstrichen.
BEISPIEL 2
Klonierung und Chromosomale Lokalisation des LLGXL-Gens
A) cDNA-Bank-Screening
Eine humane Plazenta-cDNA-Bank (Oligo-dT- und Random-Primed, Kat.-Nr. 5014b, Lot-Nr. 52033) wurde von Clontech (Palo Alto, CA) erhalten. Zur Erzeugung einer radioaktiv markierten Sonde wurde das Insert eines Plasmids, das das oben beschriebene 5'-RACE-PCR-Reaktionsprodukt enthielt, exzidiert. Die radioaktive Markierung der Sonde erfolgte unter Anwendung des Random-Priming-Verfahrens: Das DNA-Fragment (50–100 ng) wurde mit 1 μg Random-Hexameren (GIBCO) 10 Minuten bei 95°C und anschließend 1 Minute über Eis inkubiert. Bei Raumtemperatur wurden zugegeben: 3 μl 10 × Klenow-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgCl₂, 57 mM Dithiothreitol; New England Biolabs), 3 μl 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP), 100 μCi α-³²PdCTP (3000 Ci/mmol, New England Nuclear) und 1 μl Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (5 Einheiten, GIBCO). Das Reaktionsgemisch wurde 2-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und die Reaktion dann beendet, indem zunächst das Volumen mir TE pH 8,0 auf 100 μl erhöht und dann EDTA zugegeben wurde, bis eine Endkonzentration von 1 mM erreicht war. Die nicht eingebauten Nukleotide wurden entfernt, indem das Volumen des Reaktionsgemischs auf 100 μl erhöht und das Gemisch dann über einer G-50-Spin-Säule (Boehringer Mannheim) chromatographiert wurde. Die so erhaltenen Sonden wiesen eine spezifische Aktivität größer 5 × 10⁸ cpm/μg DNA auf.
Die Markierung der cDNA-Bank mit der Sonde erfolgte mit Hilfe bewährter Verfahren (Walter, P., Gilmore, R und Blobel, G., Cell 38(1984): 5–8). Kurz dargestellt, wurden die Filter 24 Stunden bei 65°C in 4,8 × SSPE (20 × SSPE = 3,6 M NaCl, 0,2 M NaH₂PO₄, 0,02 M EDTA, pH 7,7), 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 × Denhardt's Lösung (100 x = 2% Ficoll 400, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% BSA), 10% Dextransulfat, 0,1% SDS, 100 μg/ml Lachssperma-DNA und 1 × 10⁶ cpm/ml der radioaktiv markierten Sonde hybridisiert. Anschließend wurden die Filter zunächst drei Mal 15 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC (1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH 7,0), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und anschließend drei Mal 15 Minuten bei 65°C in 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Phagen, die mit der Sonde hybridisierten, wurden isoliert und amplifiziert. Die Reinigung der DNA aus den amplifizierten Phagen erfolgte unter Verwendung des LambdaSorb-Reagenzes (Promega) nach Vorschrift des Herstellers. Die Inserts wurden aus der Phagen-DNA durch EcoRI-Verdauung exzidiert. Die Inserts wurden in die EcoRI-Site eines Plasmid-Vektors (Bluescript II SK, Stratagene) subkloniert. Die Sequenz des in dem 2,6 kB-EcoRI-Fragment der cDNA enthaltenen offenen Leserasters wurde mittels automatischer Sequenzierung wie oben beschrieben bestimmt. Die Sequenz ist in 4 dargestellt. Die Aminosäuresequenz des vorhergesagten Proteins, für das das offene Leseraster kodiert, ist in 5 dargestellt und wurde mit der Bezeichnung LLGXL belegt. Es wird davon ausgegangen, dass das erste Methionin von den Nukleotidpaaren 252-254 kodiert wird. Das vorhergesagte Protein weist eine Länge von 500 Aminosäuren auf. Die ersten 18 Aminosäuren bilden eine Sequenz, die charakteristisch ist für ein sekretorisches Signalpeptid (Higgins, D. G. und Sharp, P. M, Gene 73 (1988): 237-244). Für das Propeptid wird ein Molekulargewicht von 56800 Daltons vorhergesagt. Unter der Voraussetzung, dass die Spaltung des Signalpeptids in Position 18 erfolgt, weist das nicht-modifizierte Mature-Frotein ein Molekulargewicht von 54724 Daltons auf.
Die Gesamt-Übereinstimmungen zwischen diesem Protein und den anderen bekannten Mitgliedern der Triacylglycerol-Lipase-Familie sind in 6 und Tabelle 1 erläutert. In dem in 6 dargestellten Alignment ist LLG das Polypeptid (SEQ ID NO. 6), für das die in Beispiel 1 beschriebene cDNA (SEQ ID NO. 5) kodiert, es wird im Folgenden als LLGN bezeichnet. Dieses Protein ist in den 345 Amino-terminalen Resten identisch mit dem LLGXL-Protein. Auf neun spezifische Reste folgt ein Stop-Kodon, was zu einem Propolypeptid von 39,3 kD und einem Mature-Protein von 37,3 kD führt. Die Sequenzen, die sowohl in LLGN als auch in LLGXL vorkommen, sind die Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO. 9 und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 10.
Interessanterweise befindet sich die Position, in der das LLGN- und das LLGXL-Protein voneinander abweichen, in einer Region, die von der Struktur der anderen Lipasen bekannt ist als eine Region, die sich zwischen der Amino-Domäne und der Carboxy-Domäne der Proteine befindet. Somit scheint das LLGN-Protein aus nur einer der beiden Domänen der Triacylglycerol-Lipasen zu bestehen. Diese Sequenz enthält das charakteristische "GXSXG"-Lipase-Motiv in den Positionen 167–171 sowie konservierte katalytische Triadenreste bei Ser 169, Asp 193 und His 274. Konservierte Cystein-Reste (Positionen 64, 77, 252, 272, 297, 308, 311, 316, 463 und 483), die in den anderen Lipasen an Disulfid-Bindungen beteiligt sind, weisen darauf hin, dass das LLGXL-Protein strukturelle Ähnlichkeiten zu den anderen Enzymen aufweist. Es werden fünf N-gebundene-Glycosylierungs-Sites, nämlich in den Aminosäurepositionen 80, 136, 393, 469 und 491, vorhergesagt. Die für die Vergleiche herangezogenen Proteinsequenzen sind die Sequenzen der humanen Lipoprotein-Lipase (LPL, Genbank-Accession-Nr. M15856, SEQ ID NO. 13), der humanen hepatischen Lipase (HL, Genbank-Accession-Nr. 703540, SEQ ID NO. 14), der humanen Pankreas-Lipase (PL, Genbank-Accession-Nr. M93285, SEQ ID NO. 15), des humanen Pankreas-Lipaseverwandten Proteins-1 (PLRP-1, Genbank-Accession-Nr. M93283) und des humanen Pankreas-Lipase-verwandten Proteins-2 (PLRP-2, GenbankAccession-Nr. M93284).
TABELLE 1: Ähnlichkeit innerhalb der Triacylglycerol-Lipase-Genfamilie
Prozentuale Ähnlichkeiten wurden auf Grund von paarweisem Alignment unter Anwendung des Clustal-Algorithmus (Camps, L., Reina, M., Llobera, M., Vilaro, S. und Olivecrona, T., Am. J. Physiol. 258 (1990): C673–C681) im Programm Megalign der Lasergene Biocomputing Software Suite (Dnastar) berechnet.
B) Chromosomale Lokalisation
Die DNA aus einem P1-Klon (Sternberg, N., Ruether, J. und deRiel, K., The New Biologist 2 (1990): 151–162), der genomische LLG-DNA enthielt, wurde durch Nick-Translation mit Digoxigenin UTP markiert. Die markierte Sonde wurde mit fragmentierter ("sheared") DNA kombiniert und in einer Lösung, die 50% Formamid, 10% Dextransulfat und 2 × SSC enthielt, mit PHA-stimulierten Lymphozyten aus dem peripheren Blut eines männlichen Spenders hybridisiert. Die spezifischen Hybridisierungssignale wurden durch Inkubation der hybridisierten Zellen in fluoreszierenden Antidigoxigenin-Antikörpern und anschließende Gegenfärbung mit DAPI detektiert. Dieses erste Experiment führte zu einer spezifischen Markierung eines Chromosoms der E-Gruppe, wobei auf der Basis der DAPI-Färbung angenommen wurde, dass es sich bei diesem um das Chromosom 18 handelte.
In einem zweiten Experiment wurde eine für das Centromer des Chromosoms 18 spezifische Biotin-markierte Sonde mit der LLG-Sonde cohybridisiert. Dieses Experiment führte zu einer spezifischen Markierung des Centromers des Chromosoms 18 (Rotfärbung) und des langen Arms des Chromosoms 18 (Grünfärbung). Die Untersuchung von 11 spezifisch markierten hybridisierten Chromosomen 18 zeigte, dass LLG ein Flter von 0,67 (Franke-Messung von 0,38) aufweist, was dem 18q21-Band entspricht. Von verschiedenen genetisch bedingten Erkrankungen, einschließlich der intrahepatischen Cholestase, der Zapfen-Stäbchen-Dystrophie und der familiär gehäuften expansiven Osteolyse, wird angenommen, dass sie mit Defekten in dieser chromosomalen Region verbunden sind.
BEISPIEL 3
LLG-RNA-Analyse
A) Expression von LLG-RNA in THP-1-Zellen
Die Analyse der mRNA, aus der die cDNA abgeleitet wurde, erfolgte durch Northern-Analyse der THP-1-RNA. Die RNA aus diesen Zellen wurde wie oben beschrieben präpariert. Die mRNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung eines Poly-dT-Magnetic-Bead-Systems (Polyattract System, Promega) aufgereinigt. Drei Mikrogramm der Poly-(A)-enthaltenden mRNA wurden auf einem 1% Agarose-Formaldehyd-Gel elektrophoretisch getrennt. Das Gel wurde 30 Minuten in dH₂O gewaschen. Die RNAs wurden unter Vakuumbedingungen und unter Verwendung eines alkalischen Transferpuffers (3M NaCl, 8 mM NaOH, 2 mM Sarkosyl) auf eine Nylon-Membran übertragen. Nach der Übertragung wurde der Blot durch 5-minütige Inkubation in 200 mM Phosphatpuffer pH 6,8 neutralisiert. Die RNA wurde unter Verwendung einer UV-Crosslinking-Apparatur (Stratagene) an der Membran vernetzt.
Eine Sonde wurde durch Exzidieren des Inserts eines Plasmids, das das oben beschriebene 5'-RACE-PCR-Reaktionsprodukt enthielt, gewonnen. Die Sonde wurde unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Random Priming-Verfahrens radioaktiv markiert.
Die Filter wurden 30 Minuten bei 65°C in QuikHyb-Schnellhybridisierungs-Lösung (Stratagene) prähybridisiert. Die radioaktiv markiere Sonde (1 – 2 × 10⁶ cpm/ml) und mit Ultraschall behandelte Lachs-Sperma-DNA (Endkonzentraion 100 μg/ml) wurden durch 10minütiges Erhitzen auf 95°C denaturiert, über Eis schnellgekühlt und anschließend zu dem Filter in QuikHyb gegeben. Die Hybridisierung erfolgte in 3 Stunden bei 65°C. Die nicht-hybridisierte Sonde wurde entfernt, indem die Filter zwei Mal 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 x SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und anschließend zwei Mal 15 Minuten bei 62°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen wurden. Im Anschluss an die Waschvorgänge wurden die Filter kurz zum Trocknen stehengelassen und dann mit Verstärkungsfolien bei –80°C auf Kodak XAR-2-Film abgelichtet. Die Ergebnisse sind in 7 aufgeführt, die eine mRNA-Hauptspezies von ungefähr 4,5 Kilobasen zeigt. In geringen Anteilen vorliegende Spezies von 4,3 und 1,6 Kilobasen sind ebenfalls vorhanden. Die erwartete Größe der LLGN-cDNA beträgt 1,6 kB. Es wird angenommen, dass die LLGXL-Sequenz von der gefundenen mRNA-Hauptspezies kodiert wird.
B) Expression von LLG-RNA in verschiedenen humanen Geweben
Ein kommerziell hergestellter Filter, der jeweils 3 μg mRNA aus verschiedenen humanen Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse) enthielt, wurde von Clontech erhalten (Katalog-Nr. 7760-1). Dieser Filter wurde mit einer Sonde versehen und weiterbehandelt wie oben beschrieben. Nach Einführung des radioaktiv markierten LLG-Fragments als Sonde und einer Audioradiographie wurde die Sonde durch 2 × 15-minütiges Waschen in kochendem 0,1 × SSC, 0,1% SDS in einem 65°C-Inkubator entfernt. Die Membranen wurden nun mit einem DNA Fragment von 1,4-Kilobasenpaaren, das für die humane Lipoprotein-Lipase kodiert, als Sonde versehen. Dieses Fragment wurde durch RT-PCR der THP-1-RNA (PMA- und oxLDL-behandelt) unter Verwendung der in 1 beschriebenen 5'-LPL- und 3'-LPL-Primer und unter den oben beschriebenen RT-PCR-Bedingungen erhalten. Nach einer Audioradiographie wurden die Membranen erneut von den Sonden befreit und dann wiederum mit einem radioaktiv markierten Fragment der humanen bete-Actin-cDNA als Sonde versehen, um den RNA-Gehalt zu normalisieren. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in 8 dargestellt. Die höchsten LLG-Signal-Werte wurden in der Plazenta-RNA gefunden, während in den RNAs aus Lungen-, Leber- und Nierengewebe niedrigere Werte gefunden wurden. In Übereinstimmung mit früheren, von Anderen durchgeführten Studien (Verhoeven, A. J. M. und Jansen, H., Biochem. Biophys. Acta 1211 (1994): 121–124), wurde in zahlreichen Geweben ein Lipoprotein-Lipase-Signal gemessen, wobei die höchsten Werte im Herz- und im Skelettmuskel-Gewebe gefunden wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen weisen darauf hin, dass sich die Verteilung der LLG-Expression auf die verschiedenen Gewebe von der Verteilung der LPL-Expression stark unterscheidet. Das LLG-Expressionsmuster unterscheidet sich, wie von Anderen berichtet wurde (Wang, C. -S. und Hartsuck, J. A., Biochem. Biophys. Acta 1166(1993): 1–19; Semenkovich, C. F., Chen, S. -W., Wims, M., Luo, C. -C., Li, W. -H. und Chan, L., J. LipidRes. 30(1989): 42331; Adams, M. D., Kerlavage, A. R., Fields, C. und Venter, C., Nature Genet. 4(1993): 256–265), auch von den Expressionsmustern der hepatischen Lipase sowie der Pankreas-Lipase.
Zur Bestimmung des Expressionsmusters in weiteren humanen Geweben wurde eine andere, ebenfalls kommerziell hergestellte Membran mit LLXGL-cDNA als Sonde versehen. Dieser Dot-Blot (Human RNA Master Blot, Clontech Kat.-Nr. 7770-1) enthält 100–500 ng mRNA aus 50 verschiedenen Geweben und ist normalisiert für äquivalente Haushaltsgen-Expression (Chen, L. und Morin, R., Biochem. Biophys. Acta 231(1971): 194–197). Ein 1,6 kB-DraI-SrfI-Fragment der LLGXL-cDNA wurde unter Verwendung eines Oligonukleotid-Random-Primingsystems (Prime It II, Stratagene) und nach Vorschrift des Herstellers mit ³²PdCTP markiert. Nach 30-minütiger Prähybridisierung bei 65°C wurde die Sonde (1,3 × 10⁶ cpm/ml) zu einer QuikHyb-Hybridisierungslösung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte in 2 Stunden bei 65°C. Die nicht-hybridisierte Sonde wurde entfernt, indem die Filter zwei Mal 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) und anschließend zwei Mal 15 Minuten bei 62°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS gewaschen wurden. Im Anschluss an die Waschvorgänge wurden die Filter kurz zum Trocken stehen gelassen und dann bei –80°C mit Verstärkungsfolien und mit unterschiedlichen Belichtungszeiten auf Kodak XAR-2-Film abgelichtet. Die resultierenden Bilder wurden densiometrisch quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die relativen Expressionsgrade in den Geweben, die sowohl im Northern Blot für verschiedene Gewebe als auch im Dot-Blot für mehrere Gewebe vertreten sind, stimmen in etwa überein: die höchsten Werte wurden in der Plazenta gefuden, niedrigere Werte in Lunge, Leber und Niere. In fetalem Leber-, Nieren- und Lungengewebe werden in etwa dieselben Expressionsgrade erreicht wie in den adulten Geweben. Überraschenderweise waren die Expressionsgrade in Schilddrüsengewebe mit einer Expression, die 122% der Expression in Plazenta-Gewebe entspricht, die höchsten der in allen vertretenen Geweben gefundenen Expressionsgrade. Während die Lipase-Expression in der Plazenta bereits bekannt war (Rothwell, J. E. und Elphick, M. C., J. Dev. Physiol. 4 (1982): 153–159; Verhoeven, A. J. M., Carling, D. und Jansen, H., J. Lipid Res. 35 (1994): 966–975; Burton, B. K. und Mueller, H. W., Biochem. Biophys. Acta 618 (1980): 449–460), war von der Schilddrüse bislang keinerlei Lipase-Expression bekannt. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die LLG-Expression an der Versorgung der Plazenta beteiligt sein könnte, wobei LLG der Freisetzung von freien Fettsäuren aus Substraten wie Phospholipiden als einer Energiequelle dienen könnte. Das in der Schilddrüse exprimierte LLG könnte Vorläufer für die Synthese bioaktiver Moleküle durch diese Drüse zur Verfügung stellen.
TABELLE 2: Expression von LLG-mRNA in verschiedenen humanen Geweben
Die aufgeführten Werte sind prozentuale Expressions-Werte, bezogen auf den Wert in Plazenta-Gewebe, der willkürlich als 100%-Marke gewählt wurde.
Die Werte stellen den Durchschnittswert der densiometrischen Messungen von zwei autoradiographischen Belichtungen dar.
n. d. = nicht detektierbar
C) Expression von LLG-RNA in kultivierten Endothelzellen
Endothelzellen aus der humanen Nabelvene ("human umbilical vein endothelial cells", HUVEC) und Endothelzellen aus der humanen Koronararterie ("human coronary arterial endothelial cells", HCAEC) wurden von Clonetics erhalten. Die HUVE-Zellen wurden in einem kommerziell hergestellten Wachstumsmedium für Endothelzellen (EGM, Clonetics), dem 3 mg/ml Rinderhirnextrakt (Maciag, T., Cerundolo, J., Ilsley, S., Kelley, P. R. und Forand, R., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1979), 76: 56745678) (Clonetics) zugesetzt waren, vermehrt, während die HCAE-Zellen in EGM, dem 3 mg/ml Rinderhirnextrakt und 3% fetales Kälberserum (5% Endkonzentration) zugesetzt waren, vermehrt wurden. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, anschließend wurde das Medium durch EGM ohne Rinderhirnextrakt ersetzt. Die Kulturen wurden durch Zugabe von 100 ng/ml Phorbolmyristat (Sigma) stimuliert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die RNAs mit Hilfe des oben beschriebenen Trizol-Verfahrens aus den Zellen extrahiert. Zwanzig Mikrogramm Gesamt-RNA wurden elektrophoretisch getrennt und zur Analyse auf die Membran übertragen. Die Membranen wurden mit LLG- und LPL-Sonden markiert wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Zum Vergleich wurden auf den Blot auch zwanzig Mikrogramm Gesamt-RNA aus PMA-stimulierten THP-1-Zellen aufgegeben. An die LLG-Sonde hybridisierte RNA wurde sowohl in unstimulierten als auch in PMA-stimulierten HUVE-Zellen gefunden. Im Gegensatz hierzu wurden in HCAEC-Kulturen messbare Mengen an LLG-mRNA nur nach Stimulation mit PMA gefunden. In Übereinstimmung mit früheren Studien Anderer wurden in keiner der endothelialen RNAs messbare Mengen an Lipoprotein-Lipase-mRNA gefunden (Verhoeven, A. J. M. und Jansen, H., Biochem. Biophys. Acta 1211(1994): 121–124).
BEISPIEL 4
LLG-Protein-Analyse
A) Antikörper-Herstellung
Es wurden Antiseren gegen Peptide mit Sequenzen, die einer Region des vorhergesagten Proteins, für das das offene Leseraster der LLG-cDNA kodiert, entsprechen, hergestellt. Dieses Peptid wurde auf Grund seines vorhergesagten hohen Antigenizitätsindexes (Jameson, B. A. und Wolf H., Comput. Appdic. in the Biosciences 4 (1988): 181–186) gewählt. Die Sequenz des immunisierenden Peptide wurde in keiner Protein- und keiner translatierten DNASequenz der Genbank-Datenbank gefunden. Die dieser Sequenz entsprechende Position im LLG-Protein ist in 10 dargestellt. Das Carboxy-terminale Cystein des Peptide entspricht nicht dem Rest im mutmaßlichen LLG-Protein, sondern es wurde zur Erleichterung der Kopplung an das Trägerprotein eingeführt. Das Peptid wurde in einem Applied Biosysttems Peptid-Synthesizer Modell 433A synthetisiert. Zwei Milligramm Peptid wurden entsprechend den Protokollen des Imject Activated Immunogen Conjugation Kits (Pierce Chemical) an zwei Milligramm mit Maleimid aktiviertes Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke gekoppelt. Nach dem Entsalzen wurde eine Hälfte des Konjugats mit demselben Volumen an Freund'schem komplettem Adjuvans (Pierce) emulgiert. Dieses emulgierte Konjugat wurde einem Weißen Neuseelandkaninchen injiziert. Vier Wochen nach der ersten Impfung wurde eine Booster-Impfung durchgeführt, bei der ein emulgiertes Konjugat eingesetzt wurde, das genau wie oben beschrieben hergestellt wurde, mit dem einzigen Unterschied allerdings, dass inkomplettes Freund'sches Adjuvans (Pierce) eingesetzt wurde. Zwei Wochen nach der Booster-Impfung wurde eine Blutprobe entnommen und es wurden die Titer spezifischer Antikörper mit Hilfe von ELISA unter Verwendung von immobilisiertem Peptid bestimmt. Eine nachfolgende Booster-Impfung wurde einen Monat nach der ersten Booster-Impfung durchgeführt.
B) Western-Analyse von Endothelzell-Kulturmedium
HUVE- und HCAE-Zellen wurden kultiviert und mit PMA stimuliert wie in Beispiel 3C beschrieben, mit dem einzigen Unterschied, dass die Zellen einer 48-stündigen Stimulation mit PMA unterzogen wurden. Proben des konditionierten Mediums (9 ml) wurden mit 500 μl einer 50% Slurry von Heparin-Sepharose CL-6B in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, 150 mM Natriumchlorid, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2) inkubiert. Für die partielle Reinigung und Aufkonzentration der LLG-Proteine wurde auf Grund der Konservierung der Reste in der LLGXL-Sequenz, die als die für die Heparin-Bindungsaktivität von LPL entscheidenenden Reste identifiziert wurden (Ma, Y., Henderson, H. E., Liu, M. -S., Zhang, H., Forsythe, I. J., Clarke-Lewis, I., Hayden, M. R. und Brunzell, J. D., J. Lipid Res. 35: 2049–2059, sowie 6), Heparin-Sepharose gewählt. Nach 1 Stunde Rotieren bei 4°C wurden die Proben 5 Minuten bei 150 × g zentrifugiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Sepharose mit 14 ml PBS gewaschen. Nach erneutem Zentrifugieren und Absaugen wurde die pellerierte Heparin-Sepharose in 200 μl 2 × SDS-Ladepuffer (4% SDS, 20% Glycerol, 2% β-Mercaptoethanol, 0,002% Bromphenolblau und 120 mM Tris pH 6,8) suspendiert. Die Proben wurden 5 Minuten auf 95°C erhitzt und 40 μl der Proben wurden auf ein 10% Tris-Glycin-SDS-Gel aufgegeben. Nach ungefähr 90-minütiger Elektrophorese bei 140 V wurden die Proteine mit Hilfe einer Novex-Elektroblotting-Apparatur (210 V, 1 Stunde) auf Nitrocellulose-Membranen überragen. Die Membranen wurden 30 Minuten in einem Block-Puffer (5% Magermilchpulver, 0,1% Tween 20, 150 mM Natriumchlorid, 25 mM Tris pH 7,2) blockiert. Die Antipeptid-Antiseren und normales Kaninchenserum wurden 1:5000 mit Block-Puffer verdünnt und unter vorsichtigem Schütteln mit den Membranen über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Membranen wurden nun 4 Mal 15 Minuten mit TBST (0,1% Tween 20, 150 mM Natriumchlorid, 25 mM Tris pH 7,2) gewaschen. Peroxidase-gekoppeltes anti-Kaninchen-Antiserum der Ziege (Boehringer Mannheim) wurde 1:5000 mit Block-Puffer verdünnt und mit der Membran eine Stunde unter Schütteln inkubiert. Die Membranen wurden wie oben gewaschen, mit Renaissance-Chemilumineszenz-Reagenz (DuPont NEN) umgesetzt und auf einem Kodak XAR-2-Film abgelichtet. Die Ergebnisse sind in 11 dargestellt. In den Proben aus unstimulierten HUVE- und HCAE-Zellen liegen zwei Spezies immunoreaktiver Proteine vor. Der Gehalt an immunoreaktivem Protein ist im Falle der unstimulierten HCAEC-Proben wesentlich geringer als im Falle der entsprechenden HUVEC-Proben. Bei PMA-Stimulation werden von den endothelialen Zellkulturen drei immunoreaktive Proteine sekretiert. Unter PMA-Behandlung war der von den HCAEC- Kulturen produzierte LLG-Proteinspiegel stark erhöht. In den HUVEC-Kulturen war die durch PMA induzierte Erhöhung des LLG-Proteinspiegels weniger stark ausgeprägt.
BEISPIEL 5
Produktion von Rekombinantem LLG-Protein
A) Konstrukte für die LLG-Expression
Die für die LLGN- und LLGXL-Proteine kodierenden cDNAs wurden in den Säuger-Expressions-Vektor pCDNA3 (Invitrogen) kloniert. Dieser Vektor ermöglicht durch Verwendung des starken späten Promotors (Major Late Promoter MLP) des Cytomegalovirus die Expression fremder Gene in vielen Säugerzellen. Das LLGN-5'-RACE-Produkt wurde in die EcoRi-Site des pCDNA3-Vektors kloniert. Die LLGXL-cDNA wurde mit DraI und SrfI verdaut, wobei eine 1,55 kB-cDNA erhalten wurde (siehe 4). Der Vektor wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRV verdaut und der Vektor und das Insert wurden unter Verwendung der T4-DNA-Ligase sowie von Reagenzien aus dem Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim) nach Vorschrift des Herstellers ligiert. Die Ligationsprodukte wurden zur Transformation kompetenter E. coli verwendet. Die resultierenden Kolonien wurden mittels Restriktionsanalyse und Sequenzierung nach Vorhandensein sowie Orientierung des Inserts im Expressions-Vektor gescreent.
B) Transiente Transfektion von LLG in COS-7-Zellen
Die LLG-Expressions-Vektoren wurden mit Hilfe des kationischen Lipid-Reagenzes Lipofektamin (GIBCO) in COS-7-Zellen eingeführt. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion wurden die COS-7-Zellen in einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Schale auf 60 mm-Gewebekulturschalen ausplattiert. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM, GIBCO), dem 10% fetales Kälberserum, 10 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin zugesetzt waren, vermehrt. Ein Mikrogramm Plasmid-DNA wurde zu 300 μl serumfreiem Medium Optimem I (Gibco) gegeben. Zehn Mikroliter Lipofektamin-Reagenz wurden mit 300 μl Optimem I-Medium verdünnt, anschließend wurde dieses Gemisch mit der DNA-Lösung vereinigt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Aus den Gewebekultur-Schalen wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 2 ml Optimem-Medium gespült. Die DNA Lipofektamin-Lösung wurde zusammen mit 2,7 ml Optimem-Medium auf die Schalen gegeben, anschließend wurden die Schalen 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde das serumfreie Medium entfernt und durch DMEM, dem 2% fetales Kälberserum und Antibiotika zugesetzt waren, ersetzt. Zwölf Stunden nach der Transfektion wurden einige der Kulturen entweder mit 0,25 mM Pefabloc SC (Boehringer Mannheim), einem Protease-Inhibitor, oder mit 10 U/ml Heparin behandelt. 30 Minuten vor der Ernte wurden die Heparin-behandelten Proben mit weiteren 40 U/ml Heparin behandelt. 60 Stunden nach der Transfektion wurde das Medium von den Zellen entfernt. Heparin-Sepharose CL-4B (200 μl einer 50% Slurry in PBS pH 7,2) wurde zu 1 ml Medium gegeben und es wurde eine Stunde bei 4°C gemischt. Die Sepharose wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert und drei Mal mit 1 ml kaltem PBS gewaschen. Die Sepharose wurde erneut pelletiert und in 100 μl 2 × Ladepuffer suspendiert. Die Proben wurden 5 Minuten auf 95°C erhitzt. 40 μl jeder Probe wurden auf ein 10% SDS-PAGE-Gel aufgegeben. Die Elektrophorese und die Western-Analyse erfolgten unter Verwendung des anti-LLG-Antiserums wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. Die Proteine aus HCAEC- konditioniertem Medium wurden zum Größenvergleich ebenfalls aufgenommen. LLGN migriert bei ungefähr 40 kD, dies entspricht der niedrigsten HCAEC-Bande. Das Medium der mit LLGXL-cDNA transfizierten COS-Zellen enthält sowohl die 68 kD- als auch die 40 kD-Spezies. Wurden diese Zellen mit Heparin behandelt, so stiegen die Mengen des aus dem Medium gewonnenen 68 kD-Proteins wie auch des 40 kD-Proteins drastisch an, was darauf hindeutet, dass entweder an der Zelloberfläche Proteoglycan-gebundenes Protein freigesetzt wird oder die Proteine durch Heparin stabilisiert werden. Wurden die Zellen mit dem Protease-Inhibitor Pefabloc behandelt, so stieg die Menge des 68 kD-Proteins im Verhältnis zur Menge der 40 kD-Spezies an. Dies deutet darauf hin, dass das von diesen Zellen produzierte Protein mit dem niedrigeren Molekulargewicht ein Produkt der Proteolyse der größeren 68 kD-Form ist. Die Rolle der mittels Differential-Display identifizierten mRNA, die für eine kürzere 40 kD-Spezies kodiert, ist nicht bekannt. Es wurde jedoch über eine alternativ gesplicete Form der hepatischen Lipase, die offenbar in gewebespezifischer Weise exprimiert wird und die ein gekürztes Protein erzeugen würde, berichtet.
BEISPIEL 6
LLG in Tier-Spezies
A) Klonierung des LLG-Homologons des Kaninchens
Eine kommerziell erhältliche, vom Lungengewebe des Kaninchens abgeleitete Lambda-cDNA-Bank (Clontech, Katalog-Nr. TL1010b) wurde zur Isolierung eines Fragments des Kaninchen-Homologons des LLG-Gens verwendet. Fünf Mikroliter der Stamm-Bank wurden zu 45 μl Wasser gegeben und 10 Minuten auf 95°C erhitzt. Es wurde folgendes in einem Endvolumen von 100 μl zugegeben: 200 μM dNTPs, 20 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, jeweils 100 μM Primer DLIP774 und LLGgen2a sowie 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (GIBCO). Der Reaktionsansatz wurde 35 Thermozyklen unterzogen, die unter folgenden Bedingungen durchgeführt wurden: 15 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 50°C und 30 Sekunden bei 72°C. Zehn Mikroliter des Reaktionsgemischs wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Es wurde ein Produkt von etwa 300 Basenpaaren gefunden. Ein Teil des Reaktionsgemischs (4 μl) wurde zur Klonierung des Produkts mit Hilfe des TA-Klonierungssystems verwendet. Das Insert eines resultierenden Klons wurde sequenziert (SEQ ID NO. 11). Ein Alignment der abgeleiteten Kaninchen-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 12) und der entsprechenden Sequenz der humanen cDNA ist in 14 ebenfalls dargestellt. Bei den Nukleotiden, die nicht Teil eines der beiden Amplifikations-Primer sind, besteht eine 85,8%ige Übereinstimmung zwischen der humanen LLG-Sequenz und der LLG-Sequenz des Kaninchens. Das vorhergesagte Protein, für das diese Kaninchen-cDNA kodiert, weist eine 94,6%ige Übereinstimmung mit dem humanen Protein auf wobei sich die meisten der Nukleotid-Substitutionen in den dritten beziehungsweise "Wobble"-Positionen der Kodons befinden. Bemerkenswerterweise erstreckt sich diese Region über die "Lid"-Sequenz des vorhergesagten LLG-Proteins, diese stellt in der Lipase-Gen-Familie eine variable Domäne dar. Dies zeigt, dass zwischen den verschiedenen Spezies ein hohes Maß an Konservierung dieses Gens vorliegt.
B) LLG in anderen Spezies
Um die Gegenwart von LLG-Genen in anderen Spezies nachzuweisen, wurden die genomischen DNAs verschiedener Spezies mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut, auf Agarose-Gelen elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose-Membranen geblottet.
Die Membranen wurden in einer Hybridisierungslösung, bestehend aus 6 × SSC, 10% Dextran-Sulfat, 5 × Denhardt's Lösung, 1% SDS und 5 μg/ml Lachssperma-DNA, über Nacht bei 65°C mit 2,5 × 10⁶ cpm/ml einer mittels Random-Priming ³²P-LLG- oder ³²P-LPL- (Lipoprotein-Lipase-) markierten Sonde hybridisiert. Die Membranen wurden zunächst zehn Minuten bei Raumtemperatur und anschließend nacheinander jeweils zehn Minuten bei 40°C, 50°C und 55°C mit 0,1 × SSC, 0,5% SDS gewaschen. Die Autoradiogramme der Blots sind in 16 aufgeführt.
16 zeigt, dass in allen untersuchten Spezies LLG- und LPL-Gene vorhanden sind, mit Ausnahme der Ratte, bei der keine Hybridisierung der LLG-Sonde mit der DNA beobachtet wurde. Die aus dem Rahmen fallenden Ergebnisse für die Ratte könnten ein Artefakt darstellen, bedingt durch die Erzeugung von die LLG-Sequenzen enthaltenden Restriktionsfragmenten abnormaler Größe. Solche Fragmente können außerhalb des Fraktionierungsbereichs des Agarose-Gels liegen oder können zu uneffizientem Blotting führen. Die mit beiden Sonden gefundenen verschiedenen Banden zeigen, dass LPL und LLG separate Gene mit evolutionärer Konservierung sind.
BEISPIEL 7
ENZYMATISCHE AKTIVITÄT VON LLGXL
A) Phospholipase-Aktivität
Die konditionierten Medien von COS-7-Zellen, die transient humane Lipoprotein-Lipase (LPL), LLGN oder LLGXL exprimieren, wurden auf Phospholipase-Aktivität untersucht. MEM, das 10% fetales Kälberserum enthielt (MEM), wurde zur Ermittlung des Substratleerwerts verwendet und die konditionierten Medien von COS-7-Zellen, die mit einem Antisense-LLGXL-Plasmid (AS) transfiziert waren, wurden als negative Kontrollproben verwendet.
Aus 10 μl Phosphatidylcholin (10 mM), 40 μl in sn-1- und sn-2-Position ¹⁴C-markiertem Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin (2 μCi) und 100 μl Tris-TCNB (100 mM Tris, 1% Triton, 5 mM CaCl₂, 200 mM NaCl, 0,1% BSA) wurde eine Phosphatidylcholin-(PC-) Emulsion hergestellt. Die Emulsion wurde 10 Minuten eingeengt und anschließend auf ein Endvolumen von 1 ml in Tris-TCNB eingestellt.
Es wurden jeweils zwei identische Reaktionsansätze aus 50 μl PC-Emulsion und 950 μl Medium hergestellt. Die Proben wurden in einem geschüttelten Wasserbad 2-4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde jeweils durch Zugabe von 1 ml 1 N HCl beendet, anschließend wurde mit 4 ml 2-Propanol:Hexan (1:1) extrahiert. Die obere Phase (Hexan-Phase, 1,8 ml) wurde über einer Kieselgelsäule getrennt und die in der flow-thru-Fraktion enthaltenen freigesetzten ¹⁴C-Fettsäuren wurden in einem Sziritillationszähler quantifiziert. Die Ergebnisse dieser Assays sind in 14 dargestellt.
B) Triacylglycerol-Lipase-Aktivität
Die konditionierten Medien von COS-7-Zellen, die transient humane Lipoprotein-Lipase (LPL), LLGN oder LLGXL exprimieren, wurden auf Triacylglycerol-Lipase-Aktivität untersucht. MEM, das 10% fetales Kälberserum enthielt, wurde zur Ermittlung des Substratleerwerts verwendet und die konditionierten Medien von COS-7-Zellen, die mit einem Antisense-LLGXL-Plasmid (AS) transfiziert waren, wurden als negative Kontrollproben verwendet.
Es wurde ein konzentriertes Substrat in Form einer wasserfreien Emulsion von [9,10-³H(N)]-markiertem und nicht-markiertem Triolein hergestellt (Endgehalt an Gesamt-Triolein = 150 mg mit 6,25 × 10⁸ cpm), die durch Zugabe von 9 mg Lecithin in 100% Glycerol stabilisiert wurde: 0,56 ml ³H-Triolein (0,28 mCi) wurden mit 0,17 ml nicht-markiertem Triolein und 90 μl Lecithin (9 mg) gemischt. Das Gemisch wurde unter Stickstoffstrom eingedampft. Das getrocknete Lipid-Gemisch wurde mittels Ultraschall (aus einem 30-Sekunden-Puls, Stufe 2, und einer anschließenden 2-Sekunden-Abkühlphase bestehende Zyklen über 5 Minuten) in 2,5 ml 100% Glycerol emulgiert.
Das Substrat für den Assay wurde durch Verdünnen von 1 Volumeneinheit des konzentrierten Substrats mit 4 Volumeneinheiten 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 3% (w/v) Fettsäure-freies Rinder-Serumalbumin enthielt, hergestellt. Das verdünnte Substrat wurde 5 Sekunden kräftig geschüttelt.
Es wurden jeweils zwei identische Reaktionsansätze eines Gesamtvolumens von 0,2 ml, bestehend aus 0,1 ml Assay-Substrat und 0,1 ml des betreffenden konditionierten Mediums, hergestellt. Die Reaktionsansätze wurden 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde jeweils beendet, indem zunächst 3,25 ml Methanol:Chloroform: Heptan (1,41:1,25:1, v/v/v) und anschließend 1,05 ml 0,1 M Kaliumcarbonat-Borat-Puffer (pH 10,5) zugegeben wurden. Nach 15 Sekunden kräftigem Vermischen wurden die Proben 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert. Ein 1,0 ml-Aliquot der wässerigen oberen Phase wurde jeweils in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse dieser Assays sind in 15 dargestellt.
BEISPIEL 8
Verwendung des LLG-Polypeptids für das Screening nach Agonisten oder Antagonisten
Rekombinantes LLG wird in Baculovirus-infizierten Insektenzellen produziert. Aus dem konditionierten Medium, das Serum enthalten kann oder das serumfrei sein kann, wird das rekombinante LLG durch Chromatographie auf Heparin-Sepharose und anschließende Chromatographie aus einem Kationenaustauscherharz aufgereinigt. Sofern erforderlich, wird zur Reinigung des LLG ein dritter chromatographischer Reinigungsschritt, wie Molekularsieben, durchgeführt. Während des Reinigungsprozesses werden zur Kontrolle des LLG-Proteins Anti-Peptid-Antikörper eingesetzt, wobei die LLG-Aktivität mit Hilfe des Phospholipase-Assays verfolgt wird.
Im Fluoreszenz-Assay wird ungefähr unter folgenden Endbedingungen gearbeitet: 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 5 μM C₆NBD-PC (1-Acyl-2-[6-(nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)-amino]-caproylphosphatidylcholin und LLG-Protein (ungefähr 1–100 ng). Der Reaktionsansatz wird einer Fluoreszenz-Anregung bei 470 nm unterzogen und die Enzym-Aktivität, die über die Fluoreszenz-Emission bei 540 nm gemessen wird, wird kontinuierlich verfolgt. Die Verbindungen und/oder Substanzen, die auf Stimulation und/oder Inhibition der LLG-Aktivität getestet werden, werden in Form von 10–200 mM Lösungen in Dimethylsulfoxid zugegeben. Verbindungen, die die LLG-Aktivität stimulieren oder inhibieren, werden identifiziert auf Grund der Tatsache, dass sie eine erhöhte oder verringerte Fluoreszenzemission bei 540 nm bewirken.
Im Thio-Assay wird ungefähr unter folgenden Endbedingungen gearbeitet:
25 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 4,24 mM Triton X-100, 0,5 mM 1,2-Bis-(hexanoylthio)-1,2-didesoxy-sn-glycero-3-phosphorylcholin, 5 mM 4,4'-Dithio-bis-pyridin (aus einer 50 mM Stammlösung in Ethanol) und 1–100 ng 1 rekombinantes LLG. Die Phopholipase-Aktivität wird bestimmt, indem die Erhöhung der Absorption bei 342 nm gemessen wird. Die Verbindungen und/oder Substanzen, die auf Stimulation und/oder Inhibition der LLG-Aktivität getestet werden, werden in Form von 10–200 mM Lösungen in Dimethylsulfoxid zugegeben. Verbindungen, die die LLG-Aktivität stimulieren oder inhibieren, werden identifiziert auf Grund der Tatsache, dass sie eine erhöhte oder verringerte Absorption bei 342 nm bewirken.
BEISPIEL 9
TRANSGENE MÄUSE, DIE HUMANES LLG EXPRIMIEREN
Zur genaueren Untersuchung der physiologischen Rolle von LLG wurden transgene Mäuse erzeugt, die humanes LLG exprimieren.
Das für LLGXL kodierende 1,53 kB-DraI/SrfI-Restriktionsfragment (siehe 4) wurde downstream des Promotors für das ubiquitär exprimierte 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-(HMG CoA-) Reduktase-Gen in einen Plasmid-Vektor (pHMG) kloniert. Transgene Mäuse, die in unterschiedlichem Maße humanes LLGXL exprimieren, wurden mit Hilfe von Standardverfahren erzeugt (siehe z. B. Tromp, G. L. et al., Gene 1565 (1995): 199–205). Die transgenen Mäuse wurden zur Bestimmung der Auswirkungen einer LLGXL-Überexpression auf das Lipidprofil, die vaskuläre Pathologie, die Geschwindigkeit der Entwicklung und die Schwere der Arteriosklerose sowie auf andere physiologische Parameter eingesetzt.
BEISPIEL 10
EXPRESSION VON LLG IN ARTERIOSKLEROTISCHEN GEWEBEN
Die LLGXL-Expression im Rahmen der Arteriosklerose wurde untersucht, indem eine Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) durchgeführt wurde, wobei aus vaskulären Biopsien von vier Arteriosklerose-Patienten isolierte mRNA eingesetzt wurde. Die Gewebeproben stammten aus der Aortenwand (eine Probe), der Hüftarterie (zwei Proben) und der Arteria Carotis (eine Probe).
Die Arteriosklerose-Biopsien wurden vom Gloucestershire Royal Hospital, England, erhalten und die PolyA⁺-mRNA wurde in einer Konzentration von 0,5 μg/ml mRNA in Diethylpyrocarbonat- (DEPC-) behandeltem Wasser hergestellt und resuspendiert. Die Reverse Transkriptase-Reaktionen wurden entsprechend dem GibcoBRL-Protokoll für das Superscript Preamplification System für cDNA-Erststrang-Synthese durchgeführt. Kurz dargestellt, wurde die cDNA folgendermaßen synthetisiert: 2 μl jeder mRNA wurden zu 1 μl Oligo-(dT)_12–18-Primer und 9 μl DEPC-Wasser gegeben. Die Röhrchen wurden 10 Minuten bei 70°C inkubiert und anschließend i Minute auf Eis gestellt. In jedes Röhrchen wurden nun 2 μl 10 × PCR Puffer, 2 μl 25 mM MgCl₂, 1 μl 10 mM dNTP-Mix und 2 μl 0,1 M DTT gegeben. Nach 5 Minuten bei 42°C wurde 1 μl (200 Einheiten) Superscript II-Reverse Transkriptase zugegeben. Die Reaktionsansätze wurden vorsichtig gemischt und dann 50 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Reaktionen wurden nun durch 15-minütige Inkubation bei 70°C beendet und die Röhrchen anschließend auf Eis gestellt. Die verbliebene mRNA wurde durch Zugabe von 1 μl RNase H in jedes Röhrchen zerstört und es wurde 20 Minuten bei 37°C inkubiert.
Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden mit jeweils 2 μl des cDNA-Reaktionsgemischs durchgeführt. Zu jedem Röhrchen wurden 5 μl 10 × PCR-Puffer, 5 μl 2 mM dNTPs, 1 μl hllg-gsp1-Primer (20 pmol/ml, siehe 1), 1 μl hllg-gsp2a-Primer (20 pmol/ml, siehe 1), 1,5 μl 50 mM MgCl₂, 0,5 μl Taq-Polymerase (5 Einheiten/ml) und 34 μl Wasser gegeben. Die Reaktionsgemische wurden zunächst 2 Minuten bei 95°C gehalten und dann dreißig PCR-Zyklen unterzogen, die folgendermaßen durchgeführt wurden: 15 Sekunden bei 94°C, 20 Sekunden bei 52°C und 30 Sekunden bei 72°C. Nach beendeter Reaktion wurden die Gemische 10 Minuten bei 72°C gehalten und anschließend durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Die hllg-gsp-Primer sind LLG-spezifisch und liefern ein erwartetes Produkt von 300 bp. Um zu zeigen, dass die cDNA Synthesereaktionen erfolgreich waren, wurden in einer parallel durchgeführten PCR G3PDH-(humanes Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-) Primer eingesetzt, die eine Spezifität für das Haushaltsgen aufweisen (jeweils 1 μl bei einer Konzentration von 20 pmol/ml).
Die G3PDH-Primer (siehe 1) führten in allen vier vaskulären Biopsie-Proben zu dem erwarteten Produkt von 983 bp. Eine LLG-Expression wurde in drei der vier Proben beobachtet, lediglich in der Probe aus der Arteria Carotis wurde keine LLG-Expression gefunden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein von einem Lipase-ähnlichen Gen kodiertes isoliertes Polypeptid, wobei dieses Polypeptid (a) Heparin bindet, (b) eine Homologie zur humanen Lipoprotein-Lipase sowie zur humanen hepatischen Lipase aufweist und (c) eine 39 kD katalytische Domäne der Triacylglycerol-Lipase-Familie aufweist und wobei i) das isolierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 8 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 55 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel, eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 8 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 68 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel oder eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 6 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 40 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufweist oder ii) die 39 kD katalytische Domäne die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 10 aufweist oder iii) das isolierte Polypeptid vom Kaninchen stammt und eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 12 aufweist.
Das isolierte Polypeptid nach Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 8 und ein apparentes Molekulargewicht von 55 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel, eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 8 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 68 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel oder eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 6 und ein apparentes Molekulargewicht von ungefähr 40 kD auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufweist.
Das isolierte Polypeptid nach Anspruch 1, in dem die 39 kD katalytische Domäne die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 10 aufweist.
Das isolierte Polypeptid nach Anspruch 1, das vom Kaninchen stammt und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO. 12 aufweist.
Das isolierte Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid eine Phospholipase-A-Aktivität aufweist.
Eine isolierte Nukleinsäure, die für das Polypeptid nach einem beliebigen der vorhergehenden Ansprüche kodiert.
Die isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 6, die eine cDNA ist.
Die isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 7, in der die Nukleotidsequenz unter den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NOs. 5, 7 und 9 ausgewählt ist.
Die isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 8, die die Nukleotide 252–1754 der SEQ ID NO. 7 enthält.
Die isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 6, die für das Polypeptid nach Anspruch 4 kodiert.
Die Nukleinsäure nach Anspruch 10, die eine Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO. 11 aufweist.
Eine isolierte Nukleinsäure, die unter den Bedingungen von 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68 °C mit einem Target hybridisiert, das unter den Nukleotiden 44–79 der SEQ ID NO. 3 und den Nukleotiden 1036–1065 der SEQ ID NO. 5 ausgewählt ist.
Ein Vektor, der die isolierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 12 enthält, wobei diese isolierte Nukleinsäure operativ mit einer regulatorischen Region verknüpft ist.
Der Vektor nach Anspruch 13, in dem die regulatorische Region heterologen Ursprungs ist.
Der Vektor nach Anspruch 13 oder 14, der ein viraler Vektor ist.
Der Vektor nach Anspruch 15, der ein adenoviraler Vektor ist.
Eine rekombinante Wirtszelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 13 bis 16 enthält.
Die rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei es sich bei dieser Zelle um eine eukaryotische Zelle handelt.
Die rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei es sich bei dieser Zelle um eine COS-7-Zelle handelt.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das darin besteht, die rekombinante Zelle nach einem der Ansprüche 17 bis 19 unter Bedingungen zu züchten, die die Expression des Polypeptids erlauben.
Ein Antikörper, der befähigt ist, spezifisch an das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 anzubinden.
Ein Antikörper nach Anspruch 21, der befähigt ist, die Phospholipase-Aktivität des Polypeptids aufzuheben.
Der Antikörper nach Anspruch 21 oder 22, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Der Antikörper nach Anspruch 21 oder 22, der ein polyklonaler Antikörper ist.
Eine Hybridom-Zelle, die den Antikörper nach Anspruch 23 produziert.
Eine Zusammensetzung, die enthält: a) das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder b) den Vektor nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder c) den Antikörper nach einem der Ansprüche 21 bis 24 und einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 26, die das Polypeptid und einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthält.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 26, die den Vektor und einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthält.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 26, die den Antikörper und einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff enthält.
Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 29, in der der pharmazeutisch unbedenkliche Trägerstoff eine biologisch verträgliche Lösung ist.
Ein Verfahren für das Screening nach Agonisten oder Antagonisten der Aktivität eines von einem Lipase-ähnlichen Gen (LLG) kodierten Polypeptids, wobei dieses Verfahren umfasst: (a) In-Kontakt-Bringen der potentiellen Agonisten oder Antagonisten mit dem Polypeptid und einem Substrat des Polypeptids und (b) Bestimmung der Fähigkeit der potentiellen Agonisten oder Antagonisten, die Aktivität des Polypeptids zu verstärken oder oder zu inhibieren, wobei es sich bei dem Polypeptid um das Polypeptid nach Anspruch 2 handelt.
Ein Verfahren zur enzymatischen in-vitro-Hydrolyse eines Phosphatidylcholinesters, das darin besteht, den besagten Phosphatidylcholinester mit dem Polypeptid nach Anspruch 2 oder 3 in Kontakt zu bringen.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung des Serumlipidprofils beim Menschen oder bei Tieren, die ein ungünstiges Lipidprofil aufweisen.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 21 bis 24 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung des Serumlipidprofils beim Menschen oder bei Tieren, die ein ungünstiges Lipidprofil aufweisen.
Eine transgene Maus, die das Polypeptid nach Anspruch 2 oder 3 exprimiert.