PT667912E - Vectores adenovirais deficientes e utilização em terapia génica - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "VECTORES ADENOVIRAIS DEFICIENTES E UTILIZAÇÃO EM TERAPIA GENICA" A presente invenção refere-se a novos vectores virais, à sua preparação e à sua utilização em terapia génica. Esta refere-se, também, a composições farmacêuticas contendo os referidos vectores virais. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a adenovirus recombinantes como vectores para terapia génica. A terapia génica consiste na correcção de uma deficiência ou de uma anomalia (modificação, expressão aberrante, etc.), por introdução de uma informação genética na célula ou no órgão afectado. Esta informação genética pode ser introduzida in vitro numa célula extraída de um órgão, sendo a célula modificada, depois re-introduzida no organismo ou, directamente in vivo no tecido adequado. Neste segundo caso, existem diferentes técnicas entre as quais, várias técnicas de transfecção, envolvendo complexos de ADN e de DEAE-dextrano (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), de ADN e de proteínas nucleares (Kaneda et al.,

Science 243 (1989) 375), de ADN e de lípidos (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), a utilização de lipossomas (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), etc. Mais recentemente, a utilização de vírus como vectores de transferência de genes surgiu como uma alternativa promissora a estas técnicas de transfecção físicas. Em relação a isto foram testados vários vírus quanto a sua capacidade para infectar determinadas 1 populações celulares. Em particular, os retrovírus (RSV, HMS, MM, etc.), os vírus HSV, os vírus adeno-associados e os adenovírus.

De entre estes vírus, os adenovírus apresentam algumas propriedades interessantes, para uma utilização em terapia génica. Nomeadamente, estes têm um espectro de hospedeiros bastante amplo, são capazes de infectar células quiescentes, não se integram no genoma da célula infectada e não foram associados, até à data, a patologias significativas no homem.

Os adenovírus são vírus com ADN em cadeia dupla linear, com um tamanho de cerca de 36 kb. 0 seu genoma compreende, nomeadamente, uma sequência invertida repetida (ITR) na sua extremidade, uma sequência de encapsulação, genes precoces e genes tardios (Ver a figura 1) . Os genes precoces principais são os genes El (Ela e Elb), E2, E3 e E4. Os principais genes tardios são os genes LI a L5.

Tendo em consideração as propriedades dos adenovírus referidos acima, estes foram já utilizados na transferência de genes in vivo. Com esta finalidade foram preparados diferentes vectores, derivados de adenovírus, incorporando diferentes genes (β-gal, OTC, a-lAT, citocinas, etc.). Em cada destas construções, o adenovírus foi modificado para torná-lo incapaz de replicação na célula infectada. Deste modo, as construções descritas na técnica anterior são adenovírus com as regiões El (Ela e/ou Elb) e, eventualmente, E3 eliminadas, ao nível das quais são inseridas as sequências de adn heterólogo (Levrero et ai., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al.r Gene 50 (1986) 161). O documento WO 93/06223 divulga os adenovírus derivados de d!324 que contêm o gene da beta-galactosidase e têm eliminações 2 das regiões El e E3. No entanto, os vectores descritos na técnica anterior apresentam muitas desvantagens, o que limita a sua exploração em terapia génica. Em particular, todos estes vectores compreendem numerosos genes virais, cuja expressão in vivo não é desejável no âmbito de uma terapia génica. Além disso, estes vectores não permitem a incorporação de fragmentos de ADN de tamanho muito grande que podem ser necessários para determinadas aplicações. A presente invenção permite obviar estes inconvenientes. A presente invenção descreve, de facto, adenovirus recombinantes para terapia génica, capazes de transferir eficazmente ADN (até 30 kb) in vivo, expressar este ADN in vivo em niveis elevados e de um modo estável, limitando qualquer risco de produção de proteínas virais, de transmissão do virus, patogenicidade, etc. Em particular, foi verificado que é possível reduzir, consideravelmente, o tamanho do genoma do adenovirus, sem impedir a formação de uma partícula virai encapsulada. Isto é surpreendente, na medida em que tinha sido verificado, no caso de outros vírus, por exemplo, de retrovírus, que eram necessárias determinadas sequências, distribuídas ao longo do genoma, para uma encapsulação eficaz das partículas virais. Consequentemente, a preparação de vectores possuindo eliminações internas significativas estava, significativamente, limitada. A presente invenção mostra também que a supressão da parte essencial dos genes virais também não impede a formação dessa partícula virai. Além disso, os adenovirus recombinantes obtidos deste modo, conservam as suas propriedades vantajosas de forte capacidade infecciosa, estabilidade in vivo, apesar das modificações significativas da sua estrutura genómica, etc. 3

Os vectores da invenção são, particularmente, vantajosos, uma vez que estes permitem a incorporação de sequências de ADN pretendidas, de tamanho muito grande. É, assim, possível inserir um gene com um comprimento superior a 30 kb. Isto é, particularmente, interessante para determinadas patologias, cujo tratamento requer a co-expressão de diferentes genes ou a expressão de genes muito grandes. Deste modo, por exemplo, no caso da distrofia muscular, não tem sido possível até agora transferir ADNc correspondente ao gene nativo responsável por esta patologia (o gene da distrofina), devido ao seu grande tamanho (14 kb).

Os vectores da invenção são, também, muito vantajosos, uma vez que estes possuem muito poucas regiões virais funcionais e que, por isso, os riscos inerentes à utilização de vírus como vectores em terapia génica, tais como imunogenicidade, patogenicidade, transmissãoa replicação, recombinação, etc., são significativamente reduzidos ou mesmo suprimidos. A presente invenção proporciona, assim, vectores virais particularmente adaptados à transferência e à expressão in vivo de sequências de ADN pretendidas. 0 objectivo da presente invenção refere-se, consequentemente, a compreendendo: um adenovirus deficiente recombinante, as sequências ITR, uma sequência permitindo a encapsulação, uma sequência de ADN heterólogo, 4 uma região contendo o gene E2 e em que: o gene El é não-funcional e pelo menos, o gene E4 é não-funcional.

No âmbito da presente invenção, o termo "adenovírus deficientes" designa um adenovirus incapaz de se replicar de uma forma autónoma na célula alvo. Geralmente, o genoma dos adenovirus deficientes, de acordo com a presente invenção, é consequentemente desprovido, pelo menos, das sequências necessárias à replicação do referido virus na célula infectada. Estas regiões podem ser eliminadas (na totalidade ou em parte) ou tornadas não-funcionais ou serem substituídas por outras sequências e, nomeadamente, pela sequência de ADN heterólogo.

As sequências invertidas repetidas (ITR) constituem a origem da replicação dos adenovírus. Estas estão localizadas nas extremidades 3' e 5' do genoma virai (ver a figura 1), de onde estas podem ser isoladas facilmente, de acordo com as técnicas normais da biologia molecular, conhecidas do especialista na técnica. A sequência nucleotídica das sequências da ITR de adenovírus humano (em particular, dos serotipos Ad2 e Ad5) é descrita na literatura, assim como de adenovírus caninos (nomeadamente, CAVl e CAV2) . No que se refere, por exemplo, aos adenovírus Ad5, a sequência ITR esquerda corresponde à região compreendendo os nucleótidos 1 a 103 do genoma. 5 A sequência de encapsulação (também designada sequência Psi) é necessária à encapsulação do ADN virai. Esta região deve estar consequentemente presente, para permitir a preparação de adenovirus recombinantes deficientes, de acordo com a invenção. A sequência de encapsulação está localizada no genoma do adenovirus, entre a 1TTR esquerda (5') e o gene El (ver a figura 1). Esta pode ser isolada ou sintetizada artificialmente pelas técnicas normais da biologia molecular. A sequência nucleotidica da sequência de encapsulação de adenovirus humanos (em particular dos serotipos Ad2 e Ad5) é descrita na literatura, assim como de adenovirus caninos (nomeadamente, CAVl e CAV2). No que se refere ao adenovirus Ad5, por exemplo, a sequência de encapsulação corresponde à região compreendendo os nucleótidos 194 a 358 do genoma.

Existem diferentes serotipos de adenovirus, cuja estrutura e propriedades variam muito pouco. No entanto, estes virus apresentam uma organização genética comparável e os ensinamentos descritos no presente pedido podem ser facilmente reproduzidos por um especialista na técnica, para qualquer tipo de adenovirus.

Os adenovirus da invenção podem ser de origem humana, animal ou mista (humana e animal).

No que se refere a adenovirus de origem humana, é preferido utilizar os classificados no grupo C. De um modo mais preferido, de entre os diferentes serotipos de adenovirus humano, no âmbito da presente invenção, é preferido utilizar o adenovirus do tipo 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5). 6

Como indicado acima, os adenovirus da invenção podem ser, também, de origem animal ou compreender sequências provenientes de adenovirus de origem animal. A requerente demonstrou de facto que os adenovirus de origem animal são capazes de infectar as células humanas com uma grande eficácia e que estes são incapazes de se propagar nas células humanas em que estes foram testados (ver o pedido FR 9305954) . A requerente demonstrou, também, que os adenovirus de origem animal não são, de modo algum, complementados em trans por adenovirus de origem humana, o que elimina qualquer risco de recombinação e propagação in vivo, na presença de um adenovirus humano, que possa levar à formação de uma partícula infecciosa. A utilização de adenovirus ou de regiões de adenovirus de origem animal é, consequentemente, particularmente vantajosa, uma vez que os riscos inerentes à utilização de vírus como vectores em terapia génica são agora mais baixos.

Os adenovirus de origem animal, utilizáveis no âmbito da presente invenção, podem ser de origem canina, bovina, murina, (exemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovina, suína, aviária ou símia (exemplo: SAVj . Mais particularmente, de entre os adenovirus aviários, podem-se referir os serotipos 1 a 10, acessíveis na ATCC, como, por exemplo, as estirpes Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) ou, ainda, as estirpes ATCC VR-831 a 835 referenciadas. De entre os adenovirus bovinos, podem-se utilizar diferentes serotipos conhecidos e, nomeadamente, os disponíveis na ATCC (tipos 1 a 8) sob as referências ATCC VR-313, 314,

639-642, 768 e 769. Pode-se, também, referir os adenovirus FL (ATCC VR-550) e E20308 (ATCC VR-528) murinos, o adenovirus ovino do tipo 5 (ATCC VR-1343) ou do tipo 6 (ATCC VR-1340); o 7 adenovírus suíno 5359) ou os adenovírus símios, tais como, nomeadamente, os adenovírus referenciados na ATCC sob os números VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.

De um modo preferido, de entre os diferentes adenovírus de origem animal, no âmbito da invenção, utilizam-se adenovírus ou regiões de adenovírus de origem canina e, nomeadamente, todas as estirpes de adenovírus CAV2 [por exemplo, estirpe Manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800)]. Os adenovírus caninos têm sido objecto de muitos estudos estruturais. Deste modo, foram descritos na técnica anterior os mapas de restrição completos dos adenovírus CAV1 e CAV2 (Spibey et al., J. Gen. Virot. 70 (1989) 165) e os genes Ela, E3, assim como as sequências ITR foram clonadas e sequenciadas (ver, nomeadamente, Spibey et al., Vírus Res. 14 (1989) 241; Linné, Vírus Res. 23 (1992) 119, documento WO 91/11525) .

Como indicado acima, os adenovírus da presente invenção compreendem uma sequência de ADN heterólogo. A sequência de ADN heterólogo designa qualquer sequência de ADN introduzida no vírus recombinante, cuja transferência e/ou expressão na célula alvo é pretendida.

Em particular, a sequência de ADN heterólogo pode compreender um ou mais genes terapêuticos e/ou um ou mais genes codificantes para péptidos antigénicos.

Os genes terapêuticos que podem ser, assim, transferidos são quaisquer genes cuja transcrição e, eventualmente, tradução na célula alvo origine produtos com um efeito terapêutico. 8

Em particular podem-se tratar de genes codificantes para produtos proteicos tendo um efeito terapêutico. 0 produto proteico, assim, codificado pode ser uma proteína, um péptido, um aminoácido, etc. Este produto proteico pode ser homólogo em relação à célula alvo (ou seja, um produto que é normalmente expresso na célula alvo, quando esta não apresenta qualquer patologia) . Neste caso, a expressão de uma proteína permite, por exemplo, compensar uma expressão insuficiente na célula ou a expressão de uma proteína inactiva ou pouco activa devido a uma modificação ou, ainda, sobreexpressar a referida proteína. 0 gene terapêutico pode, também, codificar para um mutante de uma proteína celular, tendo uma estabilidade aumentada, uma actividade modificada, etc. 0 produto proteico pode ser, também, heterólogo em relação à célula alvo. Neste caso, uma proteína expressa pode, por exemplo, complementar ou aumentar uma actividade deficiente na célula que permita combater uma patologia.

De entre os produtos terapêuticos no âmbito da presente invenção, podem-se referir, mais particularmente, enzimas, derivados sanguíneos, hormonas, linfocinas: interleucinas, interferões, TNF, etc. (documento FR 9203120), factores de crescimento, neurotransmissores ou os seus precursores ou enzimas de síntese, factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc.; apolipoproteínas: ApoAl, ApoAlV, ApoE, etc. (documento FR 93 05125), distrofina ou minidistrofina (documento FR 9111947), genes supressores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, K-rev, etc. (documento FR 9304745), genes codificantes para factores envolvidos na coagulação: Factores VII, VIII, IX, etc. 9 0 gene terapêutico pode ser, também, um gene ou uma sequência anti-sentido, cuja expressão na célula alvo permite controlar a expressão de genes ou a transcrição de ARNm celulares. Essas sequências podem ser, por exemplo, transcritas, na célula alvo, em ARN complementares de ARNm celulares e bloquear, deste modo, a sua tradução em proteína, de acordo com a técnica descrita na patente EP 140308.

Como indicado acima, a sequência de ADN heterólogo pode compreender, também, um ou mais genes codificantes para um péptido antigénico, capaz de produzir uma resposta imunitária no homem. Nesta forma de realização particular, a invenção permite, consequentemente, a preparação de vacinas permitindo imunizar o homem, nomeadamente, contra microrganismos ou vírus. Estes podem se tratar, nomeadamente, de péptidos antigénicos específicos para o vírus de Epstein barr, vírus HIV, vírus da hepatite B (documento EP 185573), vírus da pseudo-raiva ou, ainda, específicos de tumores (documento EP 259212).

Geralmente, a sequência de ADN heterólogo compreende, também, sequências que permite a expressão do gene terapêutico e/ou do gene codificante do péptido antigénico na célula infectada. Podem-se tratar de sequências que são naturalmente responsáveis pela expressão do gene considerado, quando estas sequências são susceptíveis de funcionar na célula infectada. Podem-se tratar, também, de sequências de origem diferente (responsáveis pela expressão de outras proteínas ou, mesmo, sintéticas) . Nomeadamente, podem-se tratar de sequências promotoras de genes eucariotas ou virais. Por exemplo, podem-se tratar de sequências promotoras, provenientes do genoma da célula que se pretende infectar. Do mesmo modo, podem-se tratar de sequências promotoras, provenientes do genoma de um vírus, 10 incluindo o adenovírus utilizado. A este respeito, podem-se referir, por exemplo, os promotores dos genes ElA, MLP, MVC, RSV, etc. Para além disso, estas sequências de expressão podem ser modificadas pela adição de sequências de activação, regulação, etc. Além disso, quando o gene inserido não compreende sequências da expressão, este pode ser inserido no genoma do vírus deficiente, a jusante de uma dessas sequência.

Para além disso, a sequência de ADN heterólogo pode compreender, também, em particular, a montante do gene terapêutico, um sequência sinal que controla o produto terapêutico sintetizado nas vias de secreção da célula alvo. Este sequência sinal pode ser a sequência sinal natural do produto terapêutico, mas pode-se tratar, também, de qualquer outra sequência sinal funcional ou de um sequência sinal artificial.

Como indicado acima, os vectores da invenção possuem uma região contendo o gene E2 e, pelo menos, o gene El e o gene E4 são não-funcionais. 0 gene virai considerado pode ser tornado não-funcional por qualquer técnica conhecida do especialista na matéria e, nomeadamente, por supressão, substituição, eliminação ou adição de uma ou mais bases, no ou nos gene(s) considerados. Essas modificações podem ser obtidas in vitro (em ADN isolado) ou in situ, por exemplo, utilizando técnicas da engenharia genética ou por tratamento utilizando agentes mutagénicos.

De entre os agentes mutagénicos, podem-se referir, por exemplo, os agentes físicos, tais como a radiações energéticas (raios x, g, ultra-violeta, etc.) ou os agentes químicos capazes de reagir com diferentes grupos funcionais das bases do ADN e, por exemplo, os agentes alquilantes [etilmetanossulfonato (EMS), 11 N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina, N-nitroquinoleína-1-óxido (NQO)], agentes bialquilantes, agentes intercalantes, etc.

Por eliminação, é entendido, no âmbito da invenção, qualquer remoção do gene considerado. Pode-se tratar, nomeadamente, da totalidade ou de parte da região codificante do referido gene e/ou da totalidade ou de parte da região promotora da transcrição do referido gene. A supressão pode ser realizada por digestão, utilizando enzimas de restrição adequadas, seguidas de ligação, de acordo com as técnicas normais da biologia molecular, como ilustrado nos exemplos.

As modificações genéticas podem ser, também, obtidas pela interrupção génica, por exemplo, de acordo com o protocolo inicialmente descrito por Rothstein [Meth. Enzymol. 101 (1983) 202]. Neste caso, a totalidade ou parte da sequência codificante é, de um modo preferido, interrompida para permitir a substituição da sequência genómica, por uma sequência não-funcional ou mutante, por recombinação homóloga,. A ou as referida(s) modificação(ões) genética(s) pode(m) estar localizada(s) na parte codificante do gene em questão ou fora da região codificante e, por exemplo, nas regiões responsáveis pela expressão e/ou a regulação da transcrição dos referidos genes. O carácter não-funcional dos referidos genes pode, consequentemente, manifestar-se pela produção de uma proteína inactiva, devido a modificações estruturais ou da conformação, pela ausência da produção, pela produção de um proteína que tendo uma actividade alterada ou, ainda, pela produção da proteína natural a um nível atenuado ou de acordo com um modo de regulação pretendido. 12

Além disso, determinadas alterações, tal como mutações pontuais são, por natureza, passíveis de serem corrigidas ou atenuadas por mecanismos celulares. Essas alterações genéticas têm, então, um interesse limitado ao nível industrial. É, em consequência, particularmente preferido que o carácter não-funcional seja perfeitamente estável do ponto de vista da segregação e/ou não-reversível.

De um modo preferido, o gene é não-funcional, devido a uma eliminação parcial ou total.

De um modo preferido, os adenovírus recombinantes deficientes da invenção são desprovidos dos genes tardios de adenovírus. São, também, aqui divulgados um adenovírus recombinante deficiente compreendendo: as sequências ITR, uma sequência permitindo a encapsulação, uma sequência de ADN heterólogo e uma região contendo o gene ou parte do gene E2; assim como um adenovírus recombinante deficiente compreendendo: as sequências ITR, uma sequência permitindo a encapsulação, 13 - uma sequência de ADN heterólogo e - uma região contendo o gene ou parte do gene E4.

Num modo particularmente vantajoso, os vectores da invenção possuem, adicionalmente, um gene E3 funcional sob controlo de um promotor heterólogo. De um modo mais preferido, os vectores possuem uma parte do gene E3, permitindo a expressão da proteína gpl9K.

Os adenovírus recombinantes deficientes, de acordo com a invenção, podem ser preparados por diferentes formas.

Um primeiro método consiste em transfectar ADN do vírus recombinante deficiente preparado in vitro (por ligação ou sob a forma de plasmídeo) numa linha celular competente, ou seja, contendo em trans todas as funções necessárias à complementação do vírus deficiente. Estas funções estão, de um modo preferido, integradas no genoma da célula, o que permite evitar os riscos da recombinação e confere uma estabilidade aumentada à linha celular. A preparação dessas linhas celulares é descrita nos exemplos.

Uma segunda abordagem consiste na co-transfecção de ADN do vírus recombinante deficiente, preparado in vitro (por ligação ou sob a forma de plasmídeo) e de ADN de um vírus auxiliador, numa linha celular adequada. De acordo com este método, não é necessário dispor de uma linha celular competente, capaz de complementar todas as funções deficientes do adenovírus recombinante. Uma parte destas funções é, de facto, complementada pelo vírus auxiliador. Este vírus auxiliador deve, por sua vez, ser deficiente e a linha celular conter em trans, 14 as funções necessárias à sua complementação. A preparação de adenovírus recombinantes deficientes da invenção, de acordo com este método é, também, ilustrada nos exemplos.

De entre as linhas celulares utilizáveis no âmbito desta segunda abordagem, podem-se referir, nomeadamente, a linha de rim embrionário humano 293, as células KB, as células Hela, MDCK, GHK, etc. (ver os exemplos).

Em seguida, os vectores multiplicados são recuperados, são purificados e são amplificados, de acordo com as técnicas normais da biologia molecular. A presente invenção refere-se também consequentemente a linhas celulares infectáveis pelos adenovírus, compreendendo as funções necessárias à complementação do adenovírus recombinante deficiente, integradas no seu genoma, tal como descrito anteriormente. Em particular, esta refere-se a linhas celulares contendo as regiões El e E2 (nomeadamente, a região codificante da proteína 72K) e/ou E4 e/ou o gene do receptor dos glucocorticóides, integradas no seu genoma. De um modo preferido, Estas linhas são obtidas a partir da linha 293 ou gm DBP6. A presente invenção refere-se, também, a qualquer composição farmacêutica compreendendo um ou mais adenovírus recombinantes deficientes, como descrito anteriormente. As composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladas tendo em perspectiva uma administração por via tópica, oral, parentérica, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutânea, intra-ocular, transdérmica, etc. 15

De um modo preferido, a composição farmacêutica contém veículos farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação injectável. Podem-se tratar de soluções salinas, nomeadamente, (fosfato monossódico, dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, etc. ou misturas desses sais), estéreis, isotónicas ou composições secas, nomeadamente, liofilizadas, que, pela adição de água esterilizada ou de soro fisiológico, de acordo com o caso, permitem a formação de soluções aquosas injectáveis.

As doses de virus utilizadas para a injecção podem ser adaptadas de acordo com diferentes parâmetros e, nomeadamente, de acordo com o modo de administração utilizada e da patologia em questão, do gene a expressar ou da duração pretendida para o tratamento. De um modo geral, os adenovírus recombinantes de acordo com a invenção são formulados e são administrados sob a forma de doses compreendidas entre 104 e 1014 pfu/mL e, de um modo preferido, 106 para IO10 pfu/mL. 0 termo pfu ("plaque forming unit") corresponde à capacidade infecciosa de uma solução do vírus e é determinada pela infecção de uma cultura celular adequada e é medida, geralmente, após 5 dias, a partir do número de placas de células infectadas. As técnicas da determinação do título pfu de uma solução virai estão documentadas na literatura.

De acordo com a sequência de ADN heterólogo inserida, os adenovírus da invenção podem ser utilizados no tratamento ou na prevenção de várias patologias, incluindo doenças genéticas (distrofia, fibrose quística, etc.), doenças neurodegenerativas (alzheimer, Parkinson, ALS, etc.), cancros, patologias relacionadas com os distúrbios da coagulação ou com as 16 dislipoproteinemias, patologia relacionadas com as infecções virais (hepatite, SIDA, etc.), etc. A presente invenção será mais detalhadamente descrita utilizando os exemplos que se seguem, os quais devem ser considerados como ilustrativos e não limitantes.

Legenda das figuras

Figura 1: Organização genética do adenovirus Ad5. A sequência completa do Ad5 está disponível em bases de dados e permite ao especialista na técnica seleccionar ou criar qualquer local de restrição e, deste modo, isolar qualquer região do genoma.

Figura 2: Mapa de restrição da estirpe Manhattan do adenovirus CAV2 (de acordo com Spibey et al., anteriormente referido).

Figura 3: Construção de vírus deficientes da invenção, por ligação.

Figura 4: Construção de um vírus recombinante contendo o gene E4.

Figura 5: Construção de um vírus recombinante contendo o gene E2 .

Figura 6: Construção e representação do plasmídeo pPY32. Figura 7: Representação do plasmídeo pPY55. 17

Figura 8: Representação do plasmídeo p2.

Figura 9: Representação do plasmídeo intermediário, utilizado para a construção do plasmídeo pITRL5-E4.

Figura 10: Representação do plasmídeo pITRL5-E4. Técnicas gerais de biologia molecular

Os métodos normalmente utilizados na biologia molecular, tais como, extracções preparativas de ADN plasmídico, centrifugação de adn plasmídico em gradiente de cloreto de césio, electroforese em gel de agarose ou acrilamida, purificação de fragmentos de ADN por electroeluição, extracção de proteínas com fenol ou com fenol-clorofórmio, precipitação de ADN em meio salino, com etanol ou com isopropanol, transformação em Escherichia coli, etc. são bem conhecidos do especialista na técnica e estão abundantemente descritos na literatura [Maniatis T et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), “Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1987].

Os plasmídeos do tipo pBR322, pUC e os fagos da série Ml3 são de origem comercial (Bethesda Research Laboratories) .

Para as ligações, os fragmentos de adn podem ser separados de acordo com o seu tamanho, por electroforese em gel de agarose ou acrilamida, ser extraídos com fenol ou com uma mistura fenol/clorofórmio, ser precipitados com etanol e, em seguida, 18 ser incubados na presença de ligase de ADN do fago T4 (Biolabs) de acordo com as recomendações do fornecedor. 0 preenchimento das extremidades 5' proeminentes pode ser realizado pelo fragmento de Klenow da Polimerase I de ADN de E. coli (Biolabs), de acordo com as especificações do fornecedor. A destruição das extremidades 3' proeminentes é realizada na presença de Polimerase de ADN do fago T4 (Biolabs), utilizada de acordo com as recomendações do fabricante. A destruição das extremidades proeminentes 5' é realizada por um tratamento proporcionado pela nuclease Sl. A mutagénese dirigida in vitro, por oligodesoxinucleótidos sintéticos, pode ser realizada de acordo com o método desenvolvido por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764], utilizando o kit distribuído pela Amersham. A amplificação enzimática de fragmentos de ADN, pela técnica conhecida como PCR [Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B e

Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350], pode ser realizada, utilizando um "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus), de acordo com as especificações do fabricante. A verificação das sequências nucleotídicas pode ser realizada pelo método desenvolvido por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463-5467] utilizando o kit distribuído pela Amersham. 19

Linhas celulares utilizadas

Nos exemplos seguintes, foram ou podem ser utilizadas as seguintes linhas celulares:

Linha 293 de rim embrionário humano (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59). Esta linha contém, nomeadamente, integrada no seu genoma, a parte esquerda do genoma do adenovírus humano Ad5 (12%).

Linha KB de células humanas: proveniente de um carcinoma epidérmico humano, esta linha está acessível na ATCC (ref. CCL17), assim como as condições que permitem a sua cultura.

Linha de células humanas Hela: proveniente de um carcinoma do epitélio humano, esta linha está acessível na ATCC (ref. CCL2), assim como as condições que permitem a sua cultura.

Linha MDCK de células caninas: as condições de cultura das células MDCK foram descritas, nomeadamente, por Macatney et al., Science 44 (1988) 9.

Linha de células gm DBP6 (Brough et al., Virology 190 (1992) 624).

Esta linha é constituída por células Hela contendo o gene E2 de adenovírus sob controlo da LTR do MMTV. 20

EXEMPLOS

Exemplo de referência 1:

Este exemplo demonstra a exequibilidade de um adenovírus recombinante desprovido do essencial dos genes virais. Para esta finalidade, foi construída uma série de mutantes de eliminação em adenovírus, por ligação in vítro e cada destes mutantes foi co-transfectado com um vírus auxiliador em células KB. Estas células não permitem a propagação dos vírus deficientes para El, a complementação em trans refere-se á região El.

Foram preparados diferentes mutantes de eliminação, a partir do adenovírus Ad5, por digestão, seguida de ligação in vítro. Para esta finalidade, é isolado ADN virai do Ad5, de acordo com a técnica descrita por Lipp et al. (J. Virol. 63 (1989) 5133), é submetido a digestão, na presença de várias enzimas de restrição (ver a figura 3), em seguida, o produto de digestão é ligado na presença de ligase de ADN de T4. 0 tamanho dos diferentes mutantes de eliminação é, em seguida, verificado num gel de agarose a 0,8% com SDS. Estes mutantes são, em seguida, mapeados (ver a figura 3) . Estes diferentes mutantes contêm as seguintes regiões: mtl: Ligação entre os fragmentos 0-20642 (Saul) e (Saul) 33797-35935 do Ad5 mt2: Ligação entre os fragmentos 0-19549 (Ndel) e (Ndel) 31089-35935 do Ad5 mt3: Ligação entre os fragmentos 0-10754 (Aatll) e (Aatll) 25915-35935 do Ad5 21 mt4: Ligação entre os fragmentos 0-11311 (MluI) e (MluI) 24392-35935 do Ad5 mt5: Ligação entre os fragmentos 0-9462 (Sall) e (Xhol) 29791-35935 do Ad5 mt6: Ligação entre os fragmentos 0-5788 (Xhol) e (Xhol) 29791-35935do Ad5 mt7: Ligação entre os fragmentos 0-3665 (Sphl) e (Sphl) 31224-35935 do Ad5

Cada dos mutantes preparados acima foi co-transfectado, com o ADN virai do Ad.RSVpGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), em células KB, na presença de fosfato de cálcio. As células foram recolhidas 8 dias após a transfecção e os sobrenadantes da cultura foram recolhidos e, em seguida, foram amplificados em células KB, até à obtenção de stocks de 50 caixas para cada transfecção. Foi isolado ADN epissómico a partir de cada amostra e foi separado em gradiente de cloreto de césio. Foram observadas duas bandas distintas de virus, em cada caso, que foram recolhidas e foram analisadas. A mais pesada corresponde ao ADN virai do Ad.RSVpGal e a mais leve ao ADN do virus recombinante produzido por ligação (figura 3). O titulo obtido para este último é de cerca de 108pfu/mL.

Foi construída, por ligação in vitro, uma segunda série de mutantes de eliminação no adenovírus, de acordo com a mesma metodologia. Estes diferentes mutantes compreendem as regiões seguintes: 22 mt8: Ligação entre os fragmentos 0-4623 (Apal) do AdRSVpGal e (Apal) 31909-35935 do Ad5. mt9: Ligação entre os fragmentos 0-10178 (BglII) do

AdRSVpGal e (BamHI) 21562-35935 do Ad5.

Estes mutantes, contendo o gene LacZ sob controlo do promotor LTR do virus RSV, são, seguidamente, co-transfectados em células 293, na presença do ADN virai de H2dl808 (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833), cuja região E4 foi eliminada. De acordo com esta segunda técnica, a complementação em trans refere-se a E4 e, já não, a El. Esta técnica permite, assim, produzir, como descrito acima, virus recombinantes que possuem apenas a região E4 como gene virai.

Exemplo de referência 2:

Este exemplo descreve a preparação de adenovírus recombinantes deficientes, por co-transfecção do ADN do vírus recombinante incorporado num plasmídeo, com um vírus auxiliador.

Para esta finalidade, foi construído um plasmídeo contendo as ITR de junção do Ad5, a sequência de encapsulação, o gene E4, sob controlo do seu próprio promotor e, como gene heterólogo, o gene LacZ, sob controlo do promotor LTR do vírus RSV (figura 4). Este plasmídeo, designado pE4Gal, foi obtido por clonagem e ligação dos fragmentos seguintes (ver a figura 4): fragmento HindIII-SacII proveniente do plasmídeo pFG144 (Graham et al., EMBO J. 8 (1989) 2077). Este fragmento 23 contém as sequências da ITR do Ad5 em tandem e a sequência de encapsulação: fragmento Hindlll (34920)-Sacll (352). fragmento do Ad5, compreendido entre os locais Sacll (localizado ao nivel do par de bases 3827) e PstI (localizado ao nivel do par de bases 4245); fragmento de pSP 72 (Promega), compreendido entre os locais PstI (pb 32) e Sall (pb 34); fragmento Xhol-Xbal do plasmideo pAdLTR GalIX, descrito em Stratf ord-Perricaudet et al. (JCI 90 (1992) 626). Este fragmento contém o gene LacZ sob controlo da LTR do virus RSV. fragmento Xbal (pb 40) - Ndel (pb 2379) do plasmideo pSP 72; fragmento Ndel (pb 31089) - Hindlll (pb 34930) do Ad5. Este fragmento, localizado na extremidade direita do genoma do Ad5, contém a região E4, sob controlo do seu próprio promotor. Esta foi clonada ao nível dos locais Ndel (2379) do plasmideo pSP 72 e Hindlll do primeiro fragmento.

Este plasmideo foi obtido por clonagem de diferentes fragmentos nas regiões indicadas do plasmideo pSP 72. É entendido pelo especialista na técnica que podem ser obtidos fragmentos equivalentes, a partir de outras fontes. O plasmideo pE4Gal é, seguidamente, co-transfectado com o ADN do vírus H2dl808 em células 293, na presença de fosfato de cálcio. O vírus recombinante é, em seguida, preparado como 24 descrito no exemplo 1. Este vírus contém, como gene virai, apenas, o gene E4 do adenovírus Ad5 (figura 4). 0 seu genoma tem um tamanho de, cerca de, 12 kb, o que permite a inserção de ADN heterólogo de tamanho muito grande (até 20 kb) . Deste modo, o especialista na técnica pode substituir, facilmente, o gene LacZ por qualquer outro gene terapêutico, tais como os referidos acima. Para além disso, este vírus contém determinadas sequências provenientes do plasmídeo pSP 72 que podem ser eliminadas pelas técnicas normais da biologia molecular, se necessário.

Exemplo 3

Este exemplo descreve a preparação de um outro adenovírus recombinante deficiente, de acordo com a invenção, por co-transfecção do ADN do vírus recombinante incorporado num plasmídeo, com um vírus auxiliador.

Para esta finalidade, foi construído um plasmídeo contendo as ITR de junção do Ad5, a sequência de encapsulação, o gene E2 do Ad2, sob controlo do seu próprio promotor e, como gene heterólogo, o gene LacZ, sob controlo do promotor LTR do vírus RSV (figura 5) . Este plasmídeo, designado pE2Gal foi obtido por clonagem e ligação dos fragmentos seguintes (ver a figura 5): fragmento HindIII-SacII, proveniente do plasmídeo pFG144 (Graham et al., EMBO J. 8 (1989) 2077). Este fragmento contém as sequências da ITR do Ad5 em tandem e a sequência de encapsulação: fragmento HindIII (34920)-SacII (352). Este foi clonado, com o fragmento seguinte, ao nível dos locais HindIII (16) - PstI (32) dos plasmídeo pSP 72. 25 fragmento do Ad5, compreendido entre os locais SacII (localizado ao nível do par de bases 3827) e PstI (localizado ao nível do par de bases 4245) . Este fragmento foi clonado ao nível do local SacII do fragmento anterior e do local PstI (32) do plasmídeo pSP 72. fragmento pSP 72 (Promega), compreendido entre os locais PstI (pb 32) e Sall (pb 34); fragmento Xhol-Xbal do plasmídeo pAdLTR GalIX descrito em Stratford-Perricaudet et al. (JCI 90 (1992) 626). Este fragmento contém o gene LacZ sob controlo da LTR do vírus RSV. Este foi clonado ao nível dos locais Sall (34) e Xbal do plasmídeo pSP 72. fragmento pSP 72 (Promega), compreendido entre os locais Xbal (pb 34) e BamHI (pb 46); fragmento BamHI (pb 21606) - Smal (pb 27339) do Ad2. Este fragmento do genoma do Ad2 contém a região E2 sob controlo do seu próprio promotor. Esta foi clonada ao nível dos locais BamHI (46) e EcoRV do plasmídeo pSP 72. fragmento EcoRV (pb 81) - HindIII (pb 16) do plasmídeo pSP 72.

Este plasmídeo foi obtido por clonagem de diferentes fragmentos nas regiões indicadas do plasmídeo pSP 72. É entendido que podem ser obtidos fragmentos equivalentes, pelo especialista na técnica, a partir de outras fontes. 26 0 plasmídeo pE2Gal é, em seguida, co-transfectado com o ADN do vírus H2dl802 desprovido da região E2 (Rice et al. J. Virol. 56 (1985) 767) em células 293, na presença de fosfato de cálcio. 0 vírus recombinante é, em seguida, preparado como descrito no exemplo 1. Este vírus contém, como único gene virai, o gene E2 do adenovírus Ad2 (figura 5). 0 seu genoma tem um tamanho de, cerca de, 12 kb, o que permite a inserção de ADN heterólogo de tamanho muito grande (até 20 kb) . Deste modo, o especialista na técnica pode substituir, facilmente, o gene LacZ por qualquer outro gene terapêutico, tal como os referidos acima. Além disso, este vírus compreende determinadas sequências provenientes do plasmídeo intermediário, que podem ser eliminadas, se necessário, pelas técnicas normais de biologia molecular.

Exemplo 4

Este exemplo descreve a construção de linhas celulares complementadoras para as regiões El, E2 e/ou E4 do adenovírus. Estas linhas permitem a construção de adenovírus recombinantes, de acordo com a invenção, com estas regiões eliminadas, sem recorrer a um vírus auxiliador. Estes vírus são obtidos por recombinação in vivo e podem conter sequências heterólogas significativas.

Nas linhas celulares descritas, as regiões E2 e E4, potencialmente citotóxicas, são colocadas sob controlo de um promotor induzível: a LTR do MMTV (Pharmacia) que é induzida pela dexametasona, natural ou na forma mínima descrita em pnas 90 (1993) 5603; ou o sistema repressível pela tetraciclina descrita por Gossen e Bujard (PNAS 89 (1992) 5547). É entendido que podem ser utilizados outros promotores e, nomeadamente, 27 variantes da LTR do MMTV, contendo, por exemplo, regiões heterólogas de regulação (nomeadamente, região "enhancer"). As linhas da invenção foram construídas por transfecção das células correspondentes, na presença de fosfato de cálcio, por um fragmento de ADN contendo os genes indicados (regiões de adenovírus e/ou do gene do receptor dos glucocorticóides), sob controlo de um promotor da transcrição e de um terminador (local de poliadenilação). 0 terminador pode ser, quer o terminador natural do gene transfectado, quer um terminador diferente, como, por exemplo, o terminador do mensageiro precoce do vírus SV40. Vantajosamente, o fragmento de ADN contém, também, um gene, permitindo a selecção das células transformadas e, por exemplo, o gene da resistência à geneticina. 0 gene de resistência pode ser, também, contido num fragmento de ADN diferente, co-transfectado com o primeiro.

Após a transfecção, são seleccionadas as células transformadas e o seu ADN é analisado, para verificar a integração do fragmento de ADN no genoma.

Esta técnica permite obter as linhas celulares seguintes: 1. Células 293 possuindo o gene 72K da região E2 do Ad5, sob controlo da LTR do MMTV; 2. Células 293 possuindo o gene 72K da região E2 do Ad5, sob controlo da LTR do MMTV e o gene do receptor dos glucocorticóides; 3. Células 293 possuindo o gene 72K da região E2 do Ad5, sob controlo da LTR do MMTV e a região E4, sob controlo da LTR do MMTV; 28 4. Células 293 possuindo o gene 72K da região E2 do Ad5, sob controlo da LTR do MMTV, a região E4, sob controlo da LTR do MMTV e o gene do receptor dos glucocorticóides; 5. Células 293 possuindo a região E4, sob controlo da LTR do MMTV; 6. Células 293 possuindo a região E4, sob controlo da LTR do MMTV e o gene do receptor dos glucocorticóides; 7. Células gm DBP6 possuindo as regiões EIA e E1B, sob controlo do seu próprio promotor; 8. Células gm DBP6 possuindo as regiões EIA e E1B, sob controlo do seu próprio promotor e a região E4, sob controlo da LTR do MMTV.

Exemplo 5

Este exemplo descreve a preparação de adenovirus recombinantes deficientes, de acordo com a invenção, de cujo genoma são eliminados os genes El, E3 e E4. De acordo com uma forma de realização vantajosa, ilustrada neste exemplo e, nomeadamente, no exemplo 3, o genoma do adenovirus recombinante invenção é modificado, de forma a que, pelo menos, os genes El e E4 sejam não-funcionais. Esses adenovirus possuem, desde logo, uma capacidade significativa de incorporação de genes heterólogos. Além disso, estes vectores apresentam uma segurança aumentada, devido à eliminação da região E4, a qual está envolvida na regulação da expressão de genes tardios, na 29 estabilidade dos ARN nucleares tardios, na extinção da expressão de proteínas da célula hospedeira e na eficácia da replicação do ADN virai. Estes vectores possuem, consequentemente, um ruido de fundo da transcrição e uma expressão de genes virais muito reduzida. Finalmente, de um modo particularmente vantajoso, estes vectores podem ser produzidos com títulos comparáveis aos dos adenovírus selvagens.

Estes adenovírus foram preparados a partir do plasmídeo pPY55, contendo a parte direita modificada do genoma do adenovírus Ad5, por co-transfecção com um plasmídeo auxiliador (ver, também, os exemplos 1, 2 e 3), ou utilizando uma linha complementadora (exemplo 4). 5.1 Construção do plasmídeo pPY55 a) Construção do plasmídeo pPY32 0 fragmento AvrlI-BcII do plasmídeo pFG144 [F.L. Graham et al. EMBO J. 8 (1989) 2077-2085], correspondendo à extremidade direita do genoma do adenovírus Ad5, foi inicialmente clonada entre os locais Xbal e BamHI do vector pIC19H, preparado a partir de um contexto dam-. Isto origina o plasmídeo pPY23. Uma característica interessante do plasmídeo pPY23 consiste no local Sall proveniente do local de clonagem múltipla do vector pIC19H permanecer único e em este estar localizado ao lado da extremidade direita do genoma do adenovírus Ad5. Foi, então, clonado o fragmento Haem-Sali do plasmídeo pPY23 que contém a extremidade direita do genoma do adenovírus Ad5, a partir do local HaelII, localizado na posição 35614, entre os locais EcoRV e Xhol do vector pIC20H, o que origina o plasmídeo pPY29. Uma 30 característica interessante deste plasmídeo consiste nos locais Xbal e Ciai provenientes do local de clonagem múltipla do vector plC20H estarem localizados ao lado da junção EcoRV/Haelll, resultante da clonagem. Além disso, esta junção modifica o contexto nucleotidico imediatamente adjacente ao local Ciai, que fica, então, metilável num contexto dam+. 0 fragmento xbal (30470) - MaelI (32811) do genoma do adenovirus Ad5 foi, seguidamente, clonado entre os locais Xbal e Ciai do plasmideo pPY29, preparado a partir de um contexto dam-, o que origina o plasmídeo pPY30. Foi, finalmente, clonado o fragmento SstI do plasmídeo pPY30, que corresponde à sequência do genoma do adenovirus Ad5, do local SstI, na posição 30556, até à extremidade direita, entre os locais SstI do vector plC20H, 0 que origina o plasmídeo pPY31, cujo mapa de restrição da inserção localizada entre os locais HindIII, é fornecido na Figura 6 . O plasmídeo pPY32 foi obtido após digestão parcial do plasmídeo pPY31 com BglII, seguida por digestão total com BamHI, seguida de re-ligação. O plasmídeo pPY32 corresponde, consequentemente, à eliminação do genoma do adenovirus Ad5, localizado entre o local BamHI do plasmídeo pPY31 e o local BglII localizado na posição 30818. Na Figura 6 é fornecido um mapa de restrição do fragmento HindIII do plasmídeo pPY32. Uma característica do plasmídeo pPY32 consiste em este possuir locais Sall e Xbal únicos. b) Construção do plasmídeo pPY47

O fragmento BamHI (21562)-Xbal (28592) do genoma do adenovirus Ad5 foi, inicialmente, clonado entre os locais BamHI 31 e Xbal do vector plC19H, preparado a partir de um contexto dam-, o que origina o plasmideo pPYl7. Este plasmideo, contém, consequentemente, um fragmento HindIII (26328)-BglII (28133) do genoma do adenovirus Ad5, que pode ser clonado entre os locais HindIII e BglII do vector pIC20R, para originar o plasmideo pPY34. Uma caracteristica deste plasmideo consiste no local BamHI proveniente do local de clonagem múltipla estar localizado na proximidade imediata do local HindIII (26328) do genoma do adenovirus Ad5.

Foi, em seguida, clonado o fragmento BamHI (21562)-HindIII(26328) do genoma do adenovirus Ad5, proveniente do plasmideo pPYl7, entre os locais BamHI e HindIII do plasmideo pPY34, o que origina o plasmideo pPY39. Foi, em seguida, clonado o fragmento BamHI - Xbal do plasmideo pPY39, preparado a partir de um contexto dam-, contendo a parte do genoma do adenovirus Ad5 compreendida entre os locais BamHI (21562) e BglII (28133), entre os locais BamHI e Xbal do vector pIC19H, preparado a partir de um contexto dam-. Isto origina o plasmideo pPY47, cuja caracteristica interessante consiste no local proveniente do local de clonagem múltipla, estar localizado na proximidade do local HindIII (figura 7). c) Construção do plasmideo pPY55

Foi clonado o fragmento Sall Xbal do plasmideo pPY47, preparado a partir de um contexto dam- e que contém a parte do genoma do adenovirus Ad5 que vai do local BamHI (21562) até ao local BglII (28133), entre os locais Sall e Xbal do plasmideo pPY32, o que origina o plasmideo pPY55. Este plasmideo é utilizável, directamente, para a obtenção de adenovirus 32 recombinantes com, pelo menos, uma eliminação da região E3 (eliminação entre os locais BglII, localizados nas posições 28133 e 30818 do genoma do adenovirus Ad5) e da região E4 na sua totalidade (eliminação entre os locais MaelI (32811) e HaelII (35614) do genoma do adenovirus Ad5 (figura 7). 5.2 Preparação do adenovirus compreendendo, pelo menos, uma eliminação na região E4, e, de um modo preferido, pelo menos nas regiões El e E4. a) Preparação por co-transfecção com um virus auxiliador E4 em células 293 O principio baseia-se na complementação em trans entre "mini-vírus" (vírus auxiliador) expressando a região E4 e um vírus recombinante com, pelo menos, E3 e E4 eliminados. Estes vírus são obtidos por ligação in vitro ou após recombinação in vivo, de acordo com as estratégias seguintes: (i) O ADN do vírus Ad-dl324 (Thimmappaya et ai., Cell 31 (1982) 543) e o plasmídeo pPY55, ambos digeridos com BamHl, são inicialmente ligados in vitro e, em seguida, são co-transfectados, com o plasmídeo pEAGal (descrito no exemplo 2), nas células 293. (ii) O ADN do vírus Ad-dl324 digerido com EcoRI e o plasmídeo pPY55 digerido com BamHl são co-transfectados, com o plasmídeo pE4Gal, nas células 293. 33 (iii) 0 ADN do adenovírus Ad5 e do plasmídeo pPY55, ambos digeridos com BamHl, são ligados e, em seguida, são co-transfectados com o plasmideo pE4Gal, nas células 293. (iv) 0 ADN do adenovírus Ad5 digerido com EcoRI e o plasmídeo pPY55 digerido com BamHl são co-transfectados com pEAGal nas células 293.

As estratégias (i) e (ii) permitem produzir um adenovírus recombinante com as regiões El, E3 e E4 eliminadas; as estratégias (iii) e (iv) permitem produzir um adenovírus recombinante com as regiões E3 e E4 eliminadas. Obviamente, pode ser utilizado o ADN de um vírus recombinante com a região El eliminada, mas expressando qualquer transgene, em lugar do ADN do vírus Ad-dl324, de acordo com as estratégias (i) ou (II), com o objectivo de produzir um vírus recombinante com as regiões El, E3 e E4 eliminadas e expressando o referido transgene. b) Preparação utilizando linhas celulares complementando em trans as funções El e E4 0 princípio baseia-se aqui no facto de uma linha celular derivada de uma linha expressando a região El, por exemplo, a linha 293 e expressando, também, pelo menos, as grelhas de leitura abertas 0RF6 e ORF6/7 da região E4 do adenovírus Ad5, sob controlo de um promotor induzível, por exemplo, ser capaz de complementar em trans, simultaneamente, as regiões El e E4 do adenovírus Ad5. Essas linhas foram descritas no exemplo 4.

Um vírus recombinante com as regiões El, E3 e E4 eliminadas pode ser, consequentemente, obtido por ligação in vitro ou 34 recombinação in vivo, de acordo com os protocolos descritos acima. Qualquer que seja o protocolo utilizado para produzir os virus eliminados, pelo menos, para a região E4, foi verificado um efeito citopático (indicando a produção de vírus recombinantes), após a transfecção nas células utilizadas. As células foram, em seguida, recolhidas, rebentadas por três ciclos de congelação-descongelação no seu sobrenadante e, seguidamente, foram centrifugadas a 4000 rpm, durante 10 minutos. 0 sobrenadante, deste modo, obtido foi, em seguida, amplificado numa cultura celular fresca (células 293 para os protocolos a) e células 293 expressando a região E4 para o protocolo b)) . Os virus foram, então, purificados a partir das placas e o seu ADN é analisado de acordo com o método de Hirt (anteriormente referido). São, então, preparados stocks de vírus em gradiente de cloreto de césio.

Exemplo 6

Este exemplo descreve a preparação de adenovírus recombinantes deficientes, de acordo com a invenção, de cujo genoma foram eliminados os genes El, E3, L5 e E4. Estes vectores são, particularmente, vantajosos, uma vez que a região L5 codifica para a fibra que é uma proteína extremamente tóxica para a célula.

Estes adenovírus foram preparados a partir do plasmídeo p2, contendo a parte direita modificada do genoma do adenovírus Ad5, por co-transfecção com diferentes plasmídeos auxiliadores. Estes podem ser, também, preparados utilizando uma linha complementadora. 35 6.1 Construção do plasmídeo p2

Este plasmídeo contém a totalidade da região direita do genoma do adenovírus Ad5, a partir do local BamHI (21562), da qual foi eliminado o fragmento compreendido entre os locais Xbal (28592) e Avrll (35463), contendo os genes E3, L5 e E4. 0 plasmídeo p2 foi obtido por clonagem e ligação dos fragmentos seguintes, no plasmídeo pIC19R linearizado com BamHI e desfosforilado (ver a figura 8): fragmento do genoma do adenovirus Ad5 compreendido entre os locais BamHI (21562) e Xbal (28592) e extremidade direita do genoma do adenovirus Ad5 (contendo a ITR direita), a partir do local Avrll (35463), até ao local Bell (compatível com BamHI). 6.2. Construção de um plasmídeo auxiliador (pITRL5-E4) contendo o gene L5 0 plasmídeo auxiliador pITRL5-E4 apresenta os genes E4 e L5 em trans. Este corresponde ao plasmídeo pE4Gal descrito no exemplo 2, contendo adicionalmente a região L5, codificante para a fibra, sob controlo do promotor MLP do adenovírus Ad2. 0 plasmídeo pITRL5-E4 foi construído do modo seguinte (figuras 9 e 10) :

Foi sintetizado um oligonucleótido com 58 pb, contendo, no sentido 5'-3', um local HindIII, o ATG da fibra e a sequência codificante da fibra, até o local Ndel na posição 36 31089 do genoma do adenovírus Ad5. A sequência deste oligonucleótido é fornecida abaixo, com a orientação 5'-3':

AAGCTTATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTAACCCCGTGTATCCATATG

Os locais Hindlll, em 5' e Ndel, em 3', estão sublinhados com uma linha simples, o ATG da fibra está sublinhado com uma linha dupla. Foi isolado um fragmento SspI-HindIII, contendo a sequência do promotor MLP, seguida pelo lider tripartido do adenovírus Ad2, a partir do plasmídeo pMLPlO (Ballay et al., (1987) Symposia UCLA on molecular and cellular biology, New series, Vol 70, Robinson et al. (Eds) Nova Iorque, 481). Este fragmento foi inserido, com o oligonucleótido com 58 pb, descrito acima, entre os locais Ndel e EcoRV do plasmídeo pIC19P, para originar um plasmídeo intermediário (ver a figura 9) . Foi, em seguida, introduzido o fragmento SacII (tornado rombo) - Ndel do plasmídeo pE4Gal (exemplo 2), no plasmídeo intermediário, entre os locais SspI e Nddel, para produzir o plasmídeo pITRL5-E4 (figura 10). 6.3 Preparação de adenovírus recombinantes deficientes, compreendendo um eliminação nas regiões El, E3, L5 e E4. a) Preparação por co-transfecção com um vírus auxiliador em células 293 O princípio baseia-se na complementação em trans entre um "mini-vírus " (vírus auxiliador) expressando a região L5 ou as regiões E4 e L5 e um vírus recombinante com, pelo menos, E3, E4 e L5 eliminadas. 37

Estes vírus foram obtidos por ligação in vitro ou após recombinação in vivo, de acordo com as estratégias seguintes: (i) 0 ADN do vírus Ad-dl324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) e o plasmídeo p2, ambos digeridos com BamHl, foram, inicialmente, ligados in vitro e, seguidamente, foram co-transfectados, com o plasmídeo auxiliador pITRL5-E4 (exemplo 6.2.), nas células 293. (ii) 0 ADN do vírus Ad-dl324 digerido com EcoRI e o plasmídeo p2, digerido com BamHl são co-transfectados, com o plasmídeo pITRL5-E4, nas células 293. (iii) 0 ADN do adenovírus Ad5 e o plasmídeo p2, ambos digeridos com BamHl são ligados e são, em seguida, co-transfectados, com o plasmídeo plTRL5-E4, nas células 293. (iv) 0 ADN do adenovírus Ad5, digerido com EcoRI e o plasmídeo p2, digerido com BamHl são co-transfectados com o plTRL5-E4 nas células 293.

As estratégias (i) e (ii) permitem produzir um adenovírus recombinante com as regiões El, E3, L5 e E4 eliminadas; as estratégias (iii) e (iv) permitem produzir um adenovírus recombinante com as regiões E3, L5 e E4 eliminadas. Obviamente, pode ser utilizado o ADN de um vírus recombinante com a região El eliminada, mas expressando um qualquer transgene, em lugar do ADN do virus Ad-dl324, de acordo com as estratégias (i) ou (II), com o objectivo de produzir um virus recombinante com as regiões El, E3, L5 e E4 eliminadas e expressando o referido transgene. 38

Os protocolos descritos acima podem ser, também, realizados com um vírus auxiliador contendo, apenas, a região L5, utilizando uma linha celular capaz de expressar as regiões El e E4 do adenovírus, tal como descrito no exemplo 4.

Além disso, é, também, possível utilizar uma linha complementadora, capaz de expressar as regiões El, E4 e L5, de forma a evitar, completamente, a utilização de um vírus auxiliador.

Após a transfecção, os vírus produzidos são recuperados, amplificados e são purificados, sob as condições descritas no exemplo 5.

Lisboa, 2 de Outubro de 2008 39

Claims (16)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Adenovírus recombinante deficiente caracterizado por compreender: - as sequências ITR, - uma sequência permitindo a encapsulação, - uma sequência ADN heterólogo - uma região contendo o gene E2 e - na qual o gene El e, pelo menos, o gene E4 são não-funcionais
2. 2. Adenovírus de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender um gene E3 funcional, sob controlo de um promotor heterólogo.
3. 3. Adenovírus de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de ADN heterólogo conter um ou mais genes terapêuticos e/ou vários genes codificantes para péptidos antigénicos
4. 4. Adenovírus de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o gene terapêutico ser seleccionado de entre genes codificantes para enzimas, derivados de sangue, hormonas, linfocinas (interleucinas, interferões, TNF, etc.), factores de crescimento, neurotransmissores ou os seus precursores ou enzimas de síntese, factores tróficos (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc.), 1 apolipoproteínas (ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc.), distrofina ou minidistrofina, genes supressores de tumores ou genes codificantes para factores envolvidos na coagulação (Factores VH, VM, IX, etc.)
5. 5. Adenovírus de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o gene terapêutico ser um gene ou uma sequência anti-sentido, cuja expressão na célula alvo permite controlar a expressão de genes ou a transcrição de ARNm celulares
6. 6. Adenovírus de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o gene codificar para um péptido antigénico, capaz de produzir uma resposta imunitária contra microrganismos ou vírus, em humanos.
7. 7. Adenovírus de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o gene codificar para um péptido antigénico específico do vírus de Epstein Barr, vírus MV, vírus da hepatite B ou vírus da pseudo-raiva.
8. 8. Adenovírus de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o gene codificar um péptido antigénico, específico de tumores.
9. 9. Adenovírus de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de ADN heterólogo compreender, também, sequências que permite a expressão do gene terapêutico e/ou do gene codificante para o péptido antigénico na célula infectada.
10. 10. Adenovírus de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a sequência de ADN heterólogo compreender, a montante do gene terapêutico, uma sequência 2 sinal controlando o produto terapêutico sintetizado nas vias de secreção da célula alvo.
11. 11. Linha celular que pode ser infectada por um adenovírus e que compreende, integradas no seu genoma, funções necessárias à complementação de um adenovirus recombinante deficiente, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizada por esta conter no seu genoma, pelo menos, os genes EI e E4 de um adenovírus e por o gene E4 ser colocado sob controlo de um promotor induzível.
12. 12. Linha celular de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por esta manter, adicionalmente, o gene do receptor dos glucocorticóides.
13. 13. Linha celular de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por o promotor induzível ser o promotor LTR do MMTV.
14. 14. Linha celular de acordo com as reivindicações 11 a 13, caracterizada por ser obtida a partir da linha 293.
15. 15. Composição farmacêutica compreendendo, pelo menos, um adenovirus recombinante deficiente, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10.
16. 16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15, compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável, para uma formulação injectável Lisboa, 2 de Outubro de 2008 3 1/9 L5 L4 L3 —-► L2 -► L1 Ε1 E3

    I _I_I_I_I_I_I_I_I_I Ο 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Figura 1 2/9 C JK A G e I F _LU_I_I_U_ B D _i 1H Pet I i B Sal I I C E F GH A J_I_1_L_U_ B D _i_ £ Sma I Figura 2 3/9 Eliminação mtl Eliminação mt2 Eliminação mt3 i*·—— Eliminação mt4 Eliminação mt5 Eliminação mt6 Eliminação mt7 4/9

    X H2dl808 ι

    Figura 4 5/9

    XH2dl802

    Figura 5 6/9 B Sm Κ Sst G Sp j_iL H pPY31

    digestão parcial com BglII digestão total com BamHI religação H Sp P S Xb, sp H i ^Sst N H, 32811 (Maell) \/ ITR 30818 (BglU) 35614 (Haelll) pPY32 Figura 6 7/9

    Figura 7 8/9

    Figura 8 9/9

    Figura 10 Ndei