JP2009544731A - 腫瘍治療のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
Nucleic Acids Symp. Ser., 27: 15-6 (1992); Taira et al., Nucleic Acids Res., 19: 5125-30 (1991); Ventura et al., Nucleic Acids Res., 21, 3249-55 (1993) )。
本実施例は、TRAILが介在するアポトーシスに対する抵抗にCore1が関与していることの発見について説明する。
マウスE14cDNAライブラリーの機能的な遺伝子スクリーニングは、TRAIL誘導アポトーシスに感受性であることが知られる細胞株のHCT116結腸腫瘍細胞株を用いて行った(図1A)。スクリーニングによって、Core1をコードするUQCRC1が、TRAIL介在アポトーシスに対する抵抗に関与することが確認された。
HCT116細胞(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)及び293EBNAパッケージング細胞株(Invitrogen)は、別々に、加熱不活化牛胎児血清(FBS)(10%)及びペニシリン−ストレプトマイシン(1%)(Gibco)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、37℃、5%CO2で培養した。
マウス胎齢14日のレトロウイルスcDNAライブラリー(George Daley, MIT, Cambridge, Massachusetts からの寄贈)は、pEYKレトロウイルス・ベクターにクローニングし、上記の293EBNAパッケージング細胞にリポフェクトアミン(Invitrogen)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後48〜72時間に、上清を採集した。上清は、ポリブレン(polybene)(10mg/mL)と混合し、感染の48時間前に平板培養していた上記のHCT116細胞の感染に使用した。感染後48時間に、1.0×106細胞を15cmディッシュにプレートし、組み換えヒトTRAIL(200ng/mL)(BioMol, Plymouth Meeting, Pennsylvania)用い、48時間ごとに新鮮培地及びTRAILを添加して、10日間処理した。TRAIL誘導アポトーシスに抵抗性の個々のクローンを収穫した。
ゲノムDNAは、細胞を消化緩衝液(NaCl(100nM)、Tris(10mM)pH8、EDTA(25mM)、SDS(0.5%))に再懸濁し、続いて50℃で12時間のプロテイナーゼK(最終濃度:100μg/mL)処理によって、抵抗性クローンから単離した。試料は、フェノール−クロロホルム及びエタノール沈殿によって抽出した。次いで、候補のcDNAをライブラリー特異的プライマーを用いて増幅させるか、又は回収したレトロウイルス・プラスミドをそのまま別のくり返しスクリーニングに使用した。TRAIL誘導アポトーシスに対する強い抵抗性を与えることが認められた1つの興味ある候補cDNAは、ユビキノールシトクロムCレダクターゼ・コアサブユニット1(UQCRC1)のcDNAであり、それはCore1をコードする(図1B)。
TRAIL誘導アポトーシスに対して保護するCore1の能力をさらに特徴付けるために、スクリーニングで単離したUQCRC1の部分的なcDNAを含むpEYKベクターを、HCT116細胞に直接感染させるために使用した。TRAIL受容体からのシグナルを阻害するドミナントネガティブFADD(dnFADD)を発現する細胞を、コントロールとして使用した。細胞は、TRAIL(0,10又は50ng/mL)で48時間処理し、アポトーシスの初期マーカーのアネキシンVをアッセイした(図2A)。dnFADDの発現は、50ng/mLのTRAILで78%の細胞がアネキシンV陰性で、又は非アポトーシスで、TRAIL誘導アポトーシスを阻害した。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する細胞では、50ng/mLでのアネキシンV陰性細胞は僅か2%であり、Core1発現細胞の14.5%に比較して、TRAIL誘導アポトーシスからの保護は7倍増加していた。これは、部分的なCore1タンパク質の発現がある程度の保護はするが、TRAIL誘導アポトーシスを完全には阻害しないことを示唆する。
Core1はミトコンドリア呼吸複合体IIIのサブユニットであるので、Core1の発現が、ミトコンドリア介在アポトーシスの重要な工程であるミトコンドリアの脱分極を保護するかどうかを測定する検討を行った。TRAIL処理中のミトコンドリア膜電位の変化を、JC−1 Assay Kit(Molecular Probes)を用いて検討した。JC−1(5,5’,6,6’−テトラクロロ−1,1’,3,3’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニン)は、細胞質内に拡散性の緑色蛍光を有するカチオン性色素である。インタクトで、分極したミトコンドリアに依存する、ミトコンドリアへのJC−1の蓄積は、赤色蛍光凝集体を形成する。上記実施例2に記載した細胞について、赤色蛍光に対する緑色蛍光の比を蛍光活性化細胞選別装置(FACS)によって分析した。FACは、特異的な細胞表面マーカー(例えば、赤色又は緑色蛍光)に基づいて細胞を選別する方法である。上記の比は、分極したミトコンドリアのパーセントとしてプロットした。
dnFADDの発現は、TRAILの全ての濃度で、ミトコンドリアの脱分極を完全に保護したが、GFP発現細胞は、TRAIL(50ng/mL)で僅か7%の分極ミトコンドリアの残存しか示さなかった。部分的Core1の発現は、38%の分極ミトコンドリアを示し、ミトコンドリアの脱分極からGFPの5倍以上保護した(図2B)。従って、Core1は、ミトコンドリアの脱分極に対しても同様に保護する。
部分的Core1タンパク質で観察された保護が、その機能を表わすことを確認するために、完全長のヒトCore1タンパク質をpLentiベクター(HAタグを含む)中にクローニングし、Core1を発現する安定した細胞株を得るための、HCT116への感染に使用した。コントロール細胞は、同様に、黄色蛍光タンパク質(YFP)を発現するように調製した。完全長Core1のタンパク質発現を確認するため、細胞を均質化してミトコンドリア溶解物及び細胞質溶解物を調製し、Core1に対する抗体でウェスタンブロットを行った(図2C)。内在性のCore1は、YFP及びCore1発現細胞の両者のミトコンドリア画分に検出された。外来的に発現されたCore1はHAタグで標識され、高い泳動バンドとしてミトコンドリア画分並びに細胞質画分に検出された。この発現パターンは、COX1(複合体IVサブユニットI)がミトコンドリア画分のみに検出されたのに対し、細胞質マーカーであるSOD1(スーパーオキシドジスムターゼ1)は、細胞質タンパク質をミトコンドリア画分に検出しないので、ミトコンドリアタンパク質が細胞質画分に混入した結果ではない。完全長Core1がTRAIL誘導アポトーシスに対して同様に保護するかを測定するために、細胞をTRAILで処理し、アネキシンV陽性又は陰性の細胞についてFACS分析によってアポトーシスをアッセイした。Core1発現細胞は、50ng/mLでTRAIL誘導アポトーシスに対して2.5倍の保護を示した(図2D)。これらのデータは、HCT116におけるCore1の発現が、TRAIL誘導アポトーシス及びミトコンドリアの脱分極に対して保護することを示す。
この実施例は、カスパーゼ8、9及び3の活性に及ぼすCore1の阻害効果を示す。
YFP又はヒト完全長Core1を安定に発現する細胞を、TRAIL(200ng/mL)で24時間処理し、溶解し、そして数種のカスパーゼに対する抗体でウェスタンブロットを行った。カスパーゼの活性化は、完全長のプロカスパーゼの、より小さな活性型への切断によって検出した。ヒト完全長Core1を発現するHCT116は、YFP発現細胞に比べて、TRAIL刺激をすると低いカスパーゼ8活性を示した(図3A)。その上、Core1の発現は同じ様に、カスパーゼ9及び3の両者の活性化を低下させた。従って、Core1の発現は、TRAIL刺激によるカスパーゼ8、9及び3の完全な活性化を阻害する。
この実施例は、ミトコンドリアからシトクロムCの放出に及ぼすCore1の効果を示す。
YFP又はヒト完全長Core1を安定に発現するHCT116細胞を、TRAIL(100ng/mL)で24時間処理した。YFP又はヒト完全長Core1を発現するコントロール細胞は、TRAILによる処理をしなかった。その後、細胞を収穫した。浮遊した細胞を含む培地を最初に新しい試験管に除いた。残存する付着細胞は、氷冷したPBS中で細胞掻器を用いて剥離し、浮遊細胞を含む培地に加えた。細胞は、4℃、1000×gで10分間遠心してペレットにし、等浸透圧の緩衝液(ショ糖(0.3M)、Tris(10mM)pH7.5、EDTA(1mM)、EDTA不含プロテアーゼ錠)に再懸濁させた。氷上で5分間インキュベーションした後、細胞を、約90%の原形質膜が溶解するまでダウンスホモジナイザーを用いて溶解した。これは、細胞質画分を分離するために行った。細胞溶解の程度は、10μLの溶解物をトリパンブルーと混合し、血球計数板上で観測することでモニターした。上清は新しい試験管に移し、4℃、8000×gで10分間遠心し、ペレット状のミトコンドリアにした。溶解物の濃度は、BioRad DC protein assay (BioRad)又はBCA法(Pierce, Rockford, Illinois)のいずれかを用いて測定した。シトクロムC濃度を定量的に検出するために、溶解物を、Function ELISA cytochrome c kit(Active Motif, Carlsbad, California)を用いてシトクロムCについてアッセイした(図3B)。未処理の細胞で、細胞質におけるシトクロムCの低いベースライン濃度を検出した。TRAILによる処理によって、YFPを発現する細胞は、細胞質画分へのシトクロムCの放出量が10培増加したが、Core1を発現する細胞のシトクロムCの放出は僅か半量であった(図3B)。この検討結果は、Core1の発現が、同様に、TRAIL処理によってミトコンドリアから細胞質ゾルへ放出されるシトクロムCの量を減少させることを示唆する。
Core1は、TRAILによって誘導されたアポトーシスに対して保護したのか又は他の経路によるアポトーシスに対して保護したのかを測定するために、数種の異なるアポトーシス誘導物質で細胞を処理し、細胞の生存率をアッセイした。死受容体を介してシグナルを送るTNFαファミリー構成メンバーでもあるFasリガンド(FasL)は、カスパーゼの活性化及びアポトーシスを誘導するために同じアダプター・タンパク質のFADDを使用する。黄色蛍光タンパク質(YFP)又はヒト完全長Core1を安定に発現する細胞を、TRAIL(100ng/mL)又はFasL(16ng/mL)で24時間処理した。細胞生存率は、生存能力の指標である細胞の代謝能の測定に指示色素レサズリンの変化を使用するCell-Titer Blue assayを用いてアッセイした。Core1の発現は、FasL誘導のアポトーシスから、TRAILと同様、約3倍保護した(図3C)。これは、Core1が、死受容体シグナリングによって誘導されるアポトーシスに対して防御できることを示唆する。
この実施例は、Core1の発現を阻害するためのsiRNAの使用について説明する。
内在性のCore1を含有する(そして、外来性のCore1を含まない)HCT116細胞を、トランスフェクションする前に、6ウェルディッシュ当たり1×105細胞で、ペニシリン/ストレプトマイシン不含の培地で24時間平板培養した。細胞に、リポフェクトアミン2000(Invitrogen)を製造元のプロトコルに従ってトランスフェクションした。細胞は、リポフェクトアミン単独(コントロール細胞)、UQCRC1に対するsiRNA(3.75nM)(SMARTpool)、又は非標的(Null)siRNA(3.75nM)(Dharmacon, Lafayette, CO)を含むトランスフェクション混合物と72時間インキュベーションした。タンパク質濃度は、溶解物を調製し、Core1に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって測定した(図4A)。ローディングコントロールとして、ブロットを再度剥ぎ取りチューブリンに対する抗体で再検出した。Core1siRNAのトランスフェクションは、90%のCore1タンパク質減少を起こしたが、リポフェクトアミン単独又はNullsiRNAの移入は、Core1タンパク質レベルに影響を及ぼさなかった(図4B)。
この実施例は、化合物がCore1の活性を阻害するかどうかを測定するためのアッセイについて説明する。
アッセイしようとする化合物は、好適な担体(例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール、緩衝化生理食塩水)中の10μMの濃度で、Core1DNAを予め感染させたHCT116細胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)に添加した。次に、細胞を、10%FBSを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で、適切な濃度のTRAIL(最大で200ng/mL)の存在下で生育させ、24時間保持した。化合物を、同様に10μMの濃度で、Core1DNAを予め感染させたHCT116細胞に加えた。次に、細胞を10%FBSを含むDMEMで、TRAILの非存在下(コントロール)で生育させ、24時間保持した。
Claims (44)
- (A)複合体IIIタンパク質の活性を阻害する阻害剤、及び(B)担体を含む組成物。
- 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項1に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質の発現を阻害するアンチセンス核酸である、請求項1に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸をコードする核酸である、請求項1に記載の組成物。
- 核酸がプロモーター領域を含む、請求項4に記載の組成物。
- 核酸がベクターに含まれる、請求項4に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害するsiRNAである、請求項1に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質に結合し、且つその活性を低下させることができる抗体である、請求項1に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質に結合し、且つその活性を低下させることができる抗体をコードする核酸である、請求項1に記載の組成物。
- 核酸がプロモーターを含む、請求項9に記載の組成物。
- 核酸がベクターに含まれる、請求項9に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質の発現を低下させることができるリボザイムである、請求項1に記載の組成物。
- 阻害剤が複合体IIIタンパク質の発現を低下させることができるリボザイムをコードする核酸である、請求項1に記載の組成物。
- 核酸がプロモーターを含む、請求項13に記載の組成物。
- 核酸がベクターに含まれる、請求項13に記載の組成物。
- 腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 構成メンバーがTRAILである、請求項16に記載の組成物。
- 構成メンバーがFasリガンドである、請求項16に記載の組成物。
- 患者の腫瘍を治療する方法であって、複合体IIIタンパク質の活性を阻害する阻害剤及び担体を含む組成物を該患者に投与する処置を含む方法。
- 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項19に記載の方法。
- 組成物が腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーの活性を阻害する阻害剤を含む、請求項19に記載の方法。
- 構成メンバーがTRAILである、請求項21に記載の方法。
- 構成メンバーがFasリガンドである、請求項21に記載の方法。
- 腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーの投与をさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 構成メンバーがTRAILである、請求項21に記載の方法。
- 構成メンバーがFasリガンドである、請求項21に記載の方法。
- 複合体IIIタンパク質の活性を阻害する阻害剤及び担体を含む組成物を製造する方法であって、該阻害剤を該担体と混合することを含む方法。
- 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項27に記載の方法。
- 複合体IIIタンパク質の活性を阻害する阻害剤、担体及び腫瘍壊死因子スーパーファミリーの構成メンバーを含む組成物を製造する方法であって、該阻害剤、該担体及び該構成メンバーを混合することを含む方法。
- 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項29に記載の方法。
- 化合物が複合体IIIタンパク質のTNF抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、複合体IIIタンパク質を発現する細胞で、TNFスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させ、かつ化合物と接触させている細胞(A)の生存率と、同様に該複合体IIIタンパク質を発現する同じ細胞株由来の細胞で、TNFスーパーファミリーの構成メンバーを存在させないで生育させ、かつ化合物と接触させている、細胞(B)の生存率を比較することを含む方法。
- 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項31に記載の方法。
- 細胞がHCT116細胞株由来であり、Core1タンパク質をコードする外因性の導入遺伝子でトランスフェクションされている細胞である、請求項32に記載の方法。
- 導入遺伝子がヒトである、請求項33に記載の方法。
- 細胞がHCT116細胞株由来であり、Core1タンパク質の一部をコードする外来導入遺伝子がトランスフェクションされている細胞である、請求項32に記載の方法。
- TNFスーパーファミリーの構成メンバーがTRAILである、請求項31に記載の方法。
- 化合物が複合体IIIタンパク質のTNF抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、
(A)化合物を、上記タンパク質を発現する細胞で、TNFスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させている細胞と、所定の時間接触させること;
(B)化合物を、そのタンパク質を発現する細胞で、TNFスーパーファミリーの構成メンバーを存在させないで生育させている上記と同じ細胞株由来の細胞と、所定の時間接触させること;および
(C)上記(B)由来の細胞の生存率を上記(A)由来の細胞の生存率と比較すること;を含む方法。 - 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項37に記載の方法。
- 化合物が複合体IIIタンパク質の活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、
(A)細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、TNFスーパーファミリーの構成メンバーの存在下で生育させること;
(B)同じ細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、TNFスーパーファミリーの構成メンバーを存在させないで生育させること;
(C)化合物を、上記(A)の細胞と接触させること;
(D)化合物を、上記(B)の細胞と接触させること;および、
(E)所定の時間後、上記(B)の細胞の生存率を上記(A)の細胞の生存率と比較すること;
を含む方法。 - 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項39に記載の方法。
- 化合物が複合体IIIタンパク質のTNF抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、該タンパク質を発現する細胞で、TNFスーパーファミリーの構成メンバー及び化合物の両者と接触させている細胞の生存率を、該タンパク質を発現する同じ細胞株由来の細胞で、化合物と接触させたがTNFスーパーファミリーの構成メンバーと接触させない細胞の生存率を、比較することを含む方法。
- 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項41に記載の方法。
- 化合物が複合体IIIタンパク質のTNF抑制活性の阻害剤であるかどうかを測定するためのアッセイを行う方法であって、
(A)細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、TNFスーパーファミリーの構成メンバー及び化合物と接触させること;
(B)同じ細胞株由来の上記タンパク質を発現する細胞を、化合物と接触させるがTNFスーパーファミリーの構成メンバーと接触させないこと;および
(C)上記(B)由来の細胞の生存率を上記(A)由来の細胞の生存率と比較すること;を含む方法。 - 複合体IIIタンパク質がCore1である、請求項36に記載の方法。
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